BR112016015647B1 - Método para detecção e/ou identificação e/ou enumeração de pelo menos um microorganismo alvo em uma amostra suscetível de contê-lo, dispositivo que compreende um suporte poroso e seus usos - Google Patents

Abstract

método para detecção, identificação e enumeração de micro-organismos em um suporte poroso impregnado a seco com meio de reação desidratado a presente invenção refere-se a um método para detecção, identificação e enumeração de micro-organismos em um suporte poroso que compreende pó de um meio de reação através de toda a sua espessura, o referido suporte tendo sido impregnado a seco através de toda a sua espessura com um meio de reação desidratado. a presente invenção também se refere a um dispositivo que pode ser usado para realizar o método, e para o uso do dispositivo.

Description

[001] A presente invenção refere-se de modo geral ao campo da análise microbiológica. Mais particularmente, refere-se a um método para a detecção, a identificação e/ou a enumeração de micro organismos em um suporte poroso impregnado a seco através de toda a sua espessura por um meio de reação desidratado.

[002] Nos campos do controle microbiológico industrial e de diag nóstico clínico, no campo do processamento de alimentos, nos cam pos farmacêutico ou de cosméticos, os meios de cultura gelificados em placas de Petri, mais frequentemente os meios de ágar, têm sido uma ferramenta indispensável na detecção e na identificação de micro organismospatogênicos desde o final do século XIX.

[003] Vários produtos têm sido tornados disponíveis comercial mente para substituir um meio de cultura de placa de Petri. Um destes, o sistema PetrifilmTM, que compreende nutrientes reidratáveis, é muito amplamente usado. Outro sistema desenvolvido pela Nissui Pharma ceutical, Compact DryTM, também consiste de um meio desidratado. Estes meios de cultura têm a vantagem de que podem ser preserva dos por mais tempo do que um meio de cultura de ágar pronto para uso. Além disso, podem ser, como é o caso para o PetrifilmTM, de ta manho pequeno e deste modo ocupar uma pequena quantidade do espaço de incubação.

[004] Deste modo, de uma maneira geral, existem dois modos de obter um meio de cultura reidratável:

[005] o primeiro consiste em colocar o meio de cultura sob uma forma líquida dentro do suporte, e em seguida secar todo o conjunto, e

[006] o segundo consiste em aderir o meio de cultura em forma desidratada a um suporte, de modo a obter imediatamente um meio de cultura reidratável.

[007] O primeiro método, a saber a obtenção de meios nutritivos reidratáveis fabricados incluindo uma fase para impregnação a úmido dos nutrientes, foi o objeto de vários requerimentos de patente. Deste modo, o requerimento de patente No. CN102337324 descreve um mé todo no qual o caldo nutritivo é misturado com um componente quími co o qual evapora rapidamente. O documento de patente internacional No. WO 2005/061013 descreve um marcador dissolvido em um sol vente e depositado sobre uma camada absorvente, de modo a detec tar vaginite. Mais recentemente, o requerimento de patente dos Esta dos Unidos No. US 2013/0089887 descreve um suporte, a saber uma membrana delgada impregnada com substratos cromogênicos e/ou fluorogênicos dissolvidos em um solvente, posta em contato com um meio de ágar.

[008] Não obstante, este método para dissolução em água ou em um solvente tem um impacto negativo sobre a extensão de tempo pela qual o meio de cultura reidratável pode ser preservado. Na verdade, a colocação de alguns produtos frágeis tais como enzimas ou substratos enzimáticos ou metabólicos ou antibióticos em suspensão pode ter um impacto severo sobre sua estabilidade total. O calor necessário para secar o meio de cultura também pode desnaturar, e tornar ineficaz, os componentes do meio de reação sensíveis ao calor. Este método em fase aquosa também não torna possível controlar e variar a localiza ção do meio de reação e/ou os vários aditivos necessários para visua lização bacteriana.

[009] De modo a superar as desvantagens dos meios de cultura obtidos por este método, o segundo método propõe colocar o pó nutri tivo diretamente sobre o suporte sem uma fase anterior de dissolução do pó referido.

[0010] Deste modo, 3M propõe um meio nutritivo desidratado re vestido com adesivo e colocado sobre um filme sem ter passado por uma fase anterior de dissolução do meio. Este dispositivo consiste de duas partes, um filme inferior e um filme superior, revestido em sua superfície por alguns componentes do meio de cultura desidratado. No momento da análise, a amostra é colocada entre estes dois filmes.

[0011] Este dispositivo e o método de detecção associado, con forme descrito no requerimento de patente internacional No. WO 2009/082667, tem várias desvantagens.

[0012] Em primeiro lugar, este dispositivo necessita, para sua fa bricação, de uma etapa de adesão dos nutrientes desidratados sobre os filmes os quais devem ter sido previamente revestidos com adesivo. Depois disto, o meio de cultura não pode formar de fato uma estrutura tridimensional da qual pode ser variada a altura e concentrações das camadas, uma vez que está aderido a um filme. Somente uma peque na camada superficial de meio está, portanto, disponível. O volume da amostra líquida requerida para análise microbiológica, portanto, não pode exceder 1 ou 2 ml, o que impacta o limiar para a sensibilidade de detecção. Em seguida, o acondicionamento do PetrifilmTM requer a fa bricação conjunta do filme inferior e do filme superior. Além disso, não torna possível ter vários meios de cultura diferentes sobre o mesmo dispositivo. Além disso, este dispositivo tem aplicações limitadas e não pode ser utilizado, por exemplo, para recolha de toalhetes (swabs) ou como um curativo. Finalmente, o PetrifilmTM requer obrigatoriamente a ajuda de um operador externo proporcionando a amostra aquosa.

[0013] Por outro lado, em um requerimento de patente francesa anterior No. FR1257047, o requerente propõe um método para o iso lamento, a partir de uma amostra a ser analisada, sobre um meio de cultura que é reidratável in situ, o qual torna possível a obtenção de colônias isoladas. Este meio reidratável é coberto com uma membrana que permite o isolamento das colônias. Deste modo, o meio de cultura permanece estéril e as colônias se desenvolvem sobre a membrana a qual se encontra logo acima do meio referido.

[0014] No entanto, o isolamento de colônias, sobre um suporte de ágar ou não-ágar, algumas vezes é visto como uma limitação e fre-quentementeé incompatível com experimentos realizados fora do la boratório e/ou por pessoas que tenham pouco conhecimento e tecno logia no campo da microbiologia.

[0015] À luz de todos os problemas referidos acima, a presente invenção propõe um novo método para a detecção, a identificação e a enumeração de micro-organismos suscetíveis de estarem contidos em uma amostra.

[0016] Deste modo, um objetivo da presente invenção é proporci onar um dispositivo que compreende um meio desidratado melhorando a sensibilidade de detecção.

[0017] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um mé todo para a detecção, a identificação e a enumeração de micro organismos sem precisar recorrer ao isolamento.

[0018] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um dis positivo e um método que permite multidetecção, e deste modo obter, a partir da mesma amostra a ser analisada e sem a realização de iso lamento, culturas isoladas, identificáveis e contáveis sobre meios de reação diferentes presentes sobre o mesmo dispositivo.

[0019] Um objetivo da invenção é também proporcionar um méto do e dispositivo particularmente flexível. O meio de reação pode ser um meio mais ou menos complexo, o qual é cromogênico, por exem plo, ou pode ser muito simples, isto é, contendo exclusivamente um número limitado de substratos (antibióticos, substratos metabólicos, etc.). O dispositivo e o método também podem ter modos de uso muito variados, tais como um toalhete, ou um meio absorvente para a visua lização de contaminações microbianas em curativos, em absorventes higiênicos ou no acondicionamento de produtos alimentícios.

[0020] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um dis positivo o qual pode ser usado por pessoas que tenham pouco conhe cimento em microbiologia. Deste modo, o dispositivo pode ser reidra- tado de uma só vez pelo operador no momento da análise da amostra. Além disso pode ser realizada reidratação in situ sem o input do ope rador, especialmente se a amostra a ser testada for colocada em pro ximidade com o meio de reação reidratável, permitindo sua reidratação gradual. A amostra a ser analisada pode ser, por exemplo, um feri mento exudativo ou um pedaço de carne e pode produzir um líquido suscetível de conter os micro-organismos a serem detectados.

[0021] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um dis positivo o qual serve por si só para a coleta da amostra, tal como um toalhete.

[0022] Um objetivo da presente invenção é proporcionar um dispo sitivo, cujas produção e venda são facilitadas pelo fato de que o supor te poroso impregnado a seco por um meio de reação é produzido de modo independente de sua embalagem.

[0023] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um dis positivo no qual é criado um gradiente de concentração dos substratos da reação, deste modo permitindo que seja limitada a quantidade des tes substratos, e que seja limitado o custo de produção do dispositivo.

[0024] Outros objetivos se tornarão evidentes depois da leitura do presente requerimento de patente.

[0025] A presente invenção, portanto, tem por objetivo realizar to dos ou alguns dos objetivos supracitados.

[0026] Por conseguinte, um objeto da presente invenção é um mé todo para a detecção e/ou a identificação e/ou a enumeração de pelo menos um micro-organismo alvo em uma amostra suscetível de contê- lo, compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecimento de um dispositivo para a detecção e/ou a identificação e/ou a enumeração de micro-organismos compreendendo um suporte poroso que compreende pó de meio de reação através de toda a sua espessura, o referido suporte poroso tendo sido impregna do a seco através de toda a sua espessura por um meio de reação de sidratado, (b) colocação de uma amostra em contato com o suporte poroso, (c) incubação do dispositivo, (d) detecção e/ou identificação e/ou enumeração da colônia ou colônias de micro-organismos dentro do suporte poroso, quando os micro-organismos pesquisados estão presentes na amostra.

[0027] De acordo com a invenção, o dispositivo é impregnado a seco através de toda a sua espessura por um meio de reação desidra tado. A incorporação de materiais pulverulentos dentro de suportes porosos pode ser realizada de acordo com pelo menos quatro técni cas: - uso de uma bomba a vácuo conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. US 5.213.843; - vibração mecânica do próprio suporte poroso, em que o pó foi colocado, por qualquer sistema de vibração, as vibrações tor nandopossível fazer o pó penetrar mais ou menos profundamente; - uso de um campo eletrostático; - vibração ultrassônica, simultânea à aplicação do pó, usando um gerador de ultrassom o qual faz com que um sonotrodo vibre, conforme descrito no requerimento de patente francesa No. FR 2866578. Quando o produto poroso passa sob o sonotrodo, a ação do último vibra as partículas de pó, e em seguida penetram dentro das cavidades da substância porosa.

[0028] Preferencialmente, o método para fabricação do suporte poroso impregnado a seco através de toda a sua espessura compre ende uma etapa de vibração das partículas de pó por meio de um campo elétrico. Preferencialmente, este é um campo elétrico alterna do. A Patente Europeia No. EP 1.028.836 descreve a impregnação de têxteis (não tecidos, tecidos, etc.) por aplicação de um campo elétrico alternado entre dois sistemas de eletrodos, entre os quais o têxtil co berto de pó é localizado. As partículas de pó, as quais se tornam ele tricamente carregadas, começam a vibrar na frequência do campo al ternado. Deste modo, surpreendentemente, esta técnica pode ser usado para impregnar a seco um suporte poroso com um meio de rea ção desidratado. Os movimentos das partículas, portanto, permite sua penetração dentro dos poros do suporte. As partículas penetraram no suporte poroso em profundidade, através de toda a espessura do su porte.

[0029] Deste modo, as zonas do suporte que são impregnadas com meio são impregnadas através de toda a espessura do suporte, uma vez que o pó passou através da espessura do suporte poroso. Deste modo, pelo menos todo ou parte do suporte poroso compreende um meio de reação em forma de pó através de toda a sua espessura, com algumas zonas sobre o suporte não obstante sendo capaz de ser destituído de qualquer meio, tal como por exemplo o perímetro do su porte.

[0030] O grau de impregnação das partículas através da espessu ra do suporte pode ser controlado, por exemplo, homogeneamente, em uma maneira localizada ou como um gradiente, dependendo das características dos materiais presentes (suportes e pós), mas também as características do método empregado (intensidade do campo elétri co, tempo de tratamento, frequência, etc.).

[0031] O suporte pode ser impregnado sequencialmente ao longo do tempo, o qual permite melhor impregnação. Deste modo, a impreg nação com agente de gelificação pode ocorrer antes da impregnação com meio de reação.

[0032] A impregnação a seco de um meio desidratado através de toda a espessura de um suporte poroso não requer o uso de água e permite que seja controlada a localização das partículas. Além disso, possibilita flexibilidade através da espessura da camada impregnada permitindo que diferentes zonas sejam definidas através da espessura, as quais estão em diferentes quantidades e são de diferentes nature zas.

[0033] Vantajosamente, é criado um gradiente de concentração dos substratos da reação no suporte poroso, deste modo tornando possível limitar a quantidade destes substratos e limitar o custo de produção do dispositivo. Também pode ser escolhido para ter um su porte poroso que compreende um tipo de substrato distribuído homo geneamente e outro tipo de substrato distribuído em um gradiente. Vantajosamente, o suporte é impregnado através de toda a sua es pessura por um meio nutritivo e superficialmente por substratos cro- mogênicos. Em outra modalidade, os substratos são encapsulados, permitindo sua liberação sequencial depois de incubação do dispositi vo. Deste modo, esta modalidade tem a vantagem de limitar o uso dos substratos evitando sua diluição no meio nutricional durante reidrata- ção do meio.

[0034] De modo similar, um agente seletivo tal como um antibiótico também pode ser encapsulado. Esta modalidade é particularmente vantajosa uma vez que torna possível postergar a colocação dos con teúdos (compreendendo uma pequena quantidade de micro organismos alvo, se os últimos estiverem presentes) em contato com o agente seletivo pretendido de modo a orientar o crescimento dos mi cro-organismos para o dos micro-organismos sendo pesquisados. Deste modo, os micro-organismos na fase de stress microbiano não são colocados diretamente em contato com o agente seletivo, o último carregando um risco, neste estágio, de ou tornar mais lento o cresci mento dos referidos micro-organismos e deste modo aumentar o tem po necessário para análise, ou inibir completamente o crescimento dos referidos micro-organismos e deste modo evitar sua detecção / identi ficação. Isto porque se diz que os micro-organismos alvo são "estres sados" quando estão presentes na amostra a ser analisada. Os micro organismos (incluindo os micro-organismos alvo) necessitam de uma determinada quantidade de tempo para se adaptarem às condições existentes dentro do suporte poroso. Em seu estado "estressado", os micro-organismos alvo são particularmente sensíveis, especialmente à presença de agentes seletivos tais como antibióticos.

[0035] Deste modo, o suporte poroso pode compreender meios de reação diferentes. Estes meios de reação estão localizados em dife rentes zonas do suporte. Estas zonas podem corresponder a zonas verticais e, portanto, à espessura do suporte, e/ou corresponder a zo nas horizontais do suporte. O suporte poroso pode ter, portanto, em uma zona, vários meios de reação, tais como por exemplo, um meio de cultura e um meio de visualização. O dispositivo também pode ter um ou mais meios de reação arranjados em diferentes zonas de um ou mais suportes porosos, cada uma destas zonas tendo meio de reação distribuído através de toda a espessura do suporte.

[0036] Na prática, vários parâmetros podem influenciar a realiza ção deste método, tais como, principalmente: - a textura da rede de fibras ou filamentos, ou de modo ge ral do suporte poroso usado; - as propriedades físico-químicas dos pós, tais como a na tureza ou o tamanho de partícula do pó; - a duração do tratamento, a intensidade do campo elétrico e também a frequência do campo elétrico.

[0037] Portanto vai ser necessário adaptar estes parâmetros de modo a possibilitar impregnação a seco satisfatória do meio de reação no suporte poroso.

[0038] Preferencialmente, a quantidade de meio de reação, em forma de pó, impregnado no suporte poroso é entre 0,01 g/cm3 e 0,1 g/cm3, preferencialmente entre 0,02 g/cm3 e 0,09 g/cm3, de modo mais preferencial entre 0,03 g/cm3 e 0,06 g/cm3.

[0039] Preferencialmente, quando o meio de reação compreende um meio de cultura e opcionalmente um meio de visualização, a quan tidade de meio de reação impregnado, em forma de pó, é entre 0,01 g/cm3 e 0,09 g/cm3, de modo mais preferencial entre 0,03 g/cm3 e 0,06 g/cm3. Deste modo, uma vantagem da presente invenção é permitir o crescimento otimizado, especialmente devido à quantidade em exces so de meio de cultura o qual deste modo alivia problemas de competi ção de nutrientes entre os micro-organismos.

[0040] Preferencialmente, quando o meio de reação compreende um meio de visualização sem meio de cultura, a quantidade de meio de reação impregnado, em forma de pó, é muito menor e é entre 0,10 mg/cm3 e 10 mg/cm3.

[0041] De acordo com a invenção, o suporte poroso é colocado em contato com a amostra.

[0042] Em uma modalidade da invenção, a amostra é aquosa e vai permitir a reidratação do meio de reação contido no suporte poroso.

[0043] De acordo com outra modalidade, um volume adequado de líquido é adicionado à amostra e/ou ao suporte poroso de modo a rei- dratar o meio de reação, quando a amostra não é aquosa ou é insufi cientemente aquosa.

[0044] Na prática, os versados na técnica vão escolher o volume adequado de líquido ou de amostra aquosa em função de sua viscosi dade e do diâmetro do suporte poroso, de modo a reidratar o meio e permitir o crescimento dos micro-organismos.

[0045] Vantajosamente, a reidratação do suporte poroso requer um volume de líquido ou de amostra aquosa de mais de 2 ml, prefe-rencialmente mais de 3 ml, de modo ainda mais preferencial mais de 4 ml, o qual torna possível aprimorar a sensibilidade de detecção quan do os micro-organismos estão em uma baixa concentração na amos tra.

[0046] De acordo com a presente invenção, a amostra pode com preender uma etapa anterior de preparação, concentração ou diluição da amostra.

[0047] De acordo com a invenção, reidratação do suporte pode ser realizada com ou sem intervenção do operador.

[0048] A amostra aquosa pode ser adicionada manualmente por meio de uma pipeta ou automaticamente dentro do dispositivo. Tam bém pode ser contida em pelo menos um reservatório integrado no dispositivo e/ou em canais permitindo reidratação do suporte poroso. Em seguida se propaga através do suporte simplesmente pressionan do sobre o reservatório.

[0049] Vantajosamente, a amostra é colocada em contato com o suporte poroso colocando este sob o suporte poroso. Deste modo, ocorre reidratação através da porção inferior e/ou lateral, preferencial menteatravés da porção inferior. Este procedimento operacional per mite hidratação homogênea do suporte poroso inteiro e especialmente evita que nutrientes e/ou substratos sejam extraídos, pelo líquido ou pela amostra aquosa, para dentro da porção inferior do dispositivo. Vantajosamente, este procedimento operacional permite que o método de acordo com a invenção seja realizado no espaço resolvendo o pro blema ligado à ausência de gravidade para a amostra e/ou o líquido.

[0050] Em uma modalidade, não existe nenhuma intervenção hu mana e a amostra aquosa se origina diretamente de uma zona que produz o líquido a ser testado. Esta pode ser, por exemplo, um feri mento exudativo ou gêneros alimentícios os quais liberam líquidos du rante seu armazenamento. A amostra, por sua própria natureza, vai liberar alguns de seus líquidos constituintes os quais, com o tempo, vão se embeber no suporte poroso. A zona que produz a amostra a ser testada também pode ser uma zona perineal de seres humanos ou animais excretora de urina. O suporte poroso é em seguida colocado em proximidade com esta zone e é impregnado gradualmente pela amostra aquosa produzida.

[0051] Em outra modalidade, a amostra é colocada em contato com o suporte poroso tomando a amostra usando o suporte poroso. O suporte poroso é, portanto, usado como um toalhete e o operador de ve colocar o último em um tubo contendo uma quantidade adequada de líquido se a amostra não for aquosa ou for insuficientemente aquo sa.

[0052] O dispositivo é em seguida incubado in situ (no caso de cu rativos, absorventes higiênicos, etc.) ou em uma incubadora por uma extensão de tempo suficiente de modo a permitir a detecção de colô nias microbianas dentro do suporte poroso.

[0053] De acordo com uma modalidade preferencial, o método de acordo com a invenção é um método de detecção o qual pode ser rea lizado por leitura visual ou ótica do suporte poroso.

[0054] A invenção também se refere a um dispositivo que compre ende um suporte poroso impregnado a seco através de toda a sua es pessura com um meio de reação desidratado permitindo a visualização de colônias de micro-organismos dentro do referido suporte, o referido suporte poroso sendo calandrado.

[0055] O suporte poroso foi impregnado a seco através de toda a sua espessura, isto equivale a dizer que quando um meio de reação está presente em uma localização do suporte, está presente nesta zo na através de toda a espessura do suporte.

[0056] O suporte poroso foi submetido a uma operação de calan- dragem. A calandragem, através da pressão e da temperatura de aquecimento gerada, permite manutenção estável e retenção ao longo do tempo do meio de reação desidratado no suporte poroso assegu rando a retenção dos diferentes elementos tais como elementos nutri tivos no suporte poroso. Também torna possível obter uma superfície superior completamente lisa e planar do suporte poroso.

[0057] Preferencialmente, a calandragem é realizada em uma temperatura maior do que a temperatura ambiente, preferencialmente em uma temperatura de entre 30°C e 60°C. Uma temperatura de me nos de 60°C evita a desnaturação dos componentes termolábeis.

[0058] Além da aceleração da reidratação do suporte poroso com parado com um suporte poroso não calandrado, a calandragem permi te a compressão das fibras que constituem o suporte poroso. Esta compressão, combinada com a presença do meio desidratado dnetro do suporte poroso, possibilita simultânea reidratação através de todas as zonas do suporte as quais são dispostas horizontalmente, e deste modo preserva a distribuição escolhida (homogênea ou em um gradi ente) das substâncias.

[0059] A calandragem, portanto, torna possível manter o meio de reação dentro do suporte e possibilita fácil manipulação do mesmo.

[0060] O suporte compreende pelo menos um meio de reação de sidratado em forma de pó distribuído através de toda a espessura do suporte poroso, o referido suporte poroso tendo uma espessura de en tre 0,5 e 2 mm depois da calandragem. Preferencialmente, o suporte poroso tem uma espessura de a partir de 0,8 mm até 1,8 mm, de mo do ainda mais preferencial ainda a partir de 1 até 1,5 mm. A área su perficial do suporte poroso tem entre 1 cm2 e 40 cm2, preferencialmen te entre 10 cm2 e 30 cm2, de modo mais preferencial entre 15 cm2 e 25 cm2.

[0061] O suporte poroso é capaz de reter um volume de água mais de 2 ml, preferencialmente mais de 3 ml. Deste modo, um suporte po roso com uma área superficial de 25 cm2 e uma espessura de 1 mm depois da calandragem vai ser capaz de reter um volume de água de 3 ml.

[0062] O dispositivo de acordo com a invenção, através da pre sença de meio de cultura através de toda a sua espessura, portanto tem a vantagem de permitir aprimorada sensibilidade através de sua capacidade para reter um alto volume de amostra líquida.

[0063] Preferencialmente, a quantidade de meio de reação em forma de pó impregnado no suporte poroso é entre 0,01 g/cm3 e 0,1 g/cm3, preferencialmente entre 0,01 g/cm3 e 0,09 g/cm3, de modo mais preferencial entre 0,03 g/cm3 e 0,06 g/cm3. Preferencialmente, quando o meio de reação compreende um meio de cultura e opcionalmente um meio de visualização, a quantidade de meio de reação em forma de pó impregnado é entre 0,01 g/cm3 e 0,09 g/cm3, de modo mais pre ferencial entre 0,03 g/cm3 e 0,06 g/cm3. Deste modo, uma vantagem da presente invenção é permitir crescimento otimizado, especialmente devido à quantidade em excesso de meio de cultura o qual deste mo do alivia problemas de competição de nutrientes entre os micro-organismos. Surpreendentemente, a detecção de algumas cepas é portanto mais rápida do que sobre meio de ágar.

[0064] Preferencialmente, o dispositivo de acordo com a invenção compreende pelo menos um antibiótico e/ou pelo menos um composto sensível ao calor tal como um substrato enzimático ou metabólico. Portanto tem a vantagem de ter estabilidade aumentada devido ao fato de que este composto não foi colocado em suspensão durante a fabri- cação do dispositivo e/ou não foi submetido ao calor necessário para desidratar um meio de cultura.

[0065] De acordo com uma modalidade, o dispositivo compreende um suporte poroso que compreende pelo menos um meio de reação em forma de pó homogeneamente distribuído através da espessura do suporte poroso. De acordo com outra modalidade, pelo menos um meio de reação em forma de pó é distribuído em uma maneira gradu adaatravés da espessura do suporte poroso.

[0066] Outra modalidade propõe pelo menos dois meios de reação diferentes em forma de pó distribuídos em pelo menos duas camadas, o referido suporte compreendendo, em um determinado ponto através da espessura, um meio de cultura e/ou o outro.

[0067] De acordo com a invenção, o dispositivo compreende uma pluralidade de meios de reação.

[0068] Preferencialmente, o dispositivo compreende uma camada de proteção superior. A camada de proteção é arranjada sobre o su porte poroso e nenhuma outra camada é arranjada entre o suporte po roso e a camada de proteção. Preferencialmente, a camada de prote ção é colocada diretamente sobre o suporte poroso.

[0069] A camada de proteção pode ser translúcida ou transparen te, permitindo que as colônias sejam visualizadas através desta cama-da.Também torna possível evitar contaminações durante a incubação. É impermeável a bactérias e limita a perda de vapor d’água. Na verda de, o dispositivo é incubado por um período de tempo predeterminado e em uma temperatura predeterminada, permitindo o crescimento dos micro-organismos de modo independente das condições de umidade do ambiente. Deste modo, a natureza da camada superior é escolhida de modo a permitir as permutas gasosas necessárias para o cresci mento dos micro-organismos, ao mesmo tempo que permitindo a hi drataçãolocal.

[0070] Preferencialmente, o dispositivo compreende um receptácu lo para conter a amostra aquosa e/ou o líquido. Preferencialmente, o receptáculo também compreende o suporte poroso o qual em seguida preferencialmente é reidratado através de sua porção inferior.

[0071] Vantajosamente, o dispositivo compreende uma camada inferior e à prova d’água. Preferencialmente, esta camada inferior é rígida, permitindo melhor manipulação do dispositivo. É fabricada a partir de compostos tais como poliéster, polipropileno e poliestireno. Preferencialmente, é fabricada a partir de celulose. Pode ser papelão ou papel combinado com um filme à prova d’água. Pode conter canais termoformados os quais vão servir para a apropriada reidratação do suporte poroso.

[0072] Vantajosamente, as diferentes camadas do dispositivo são fabricadas a partir de materiais recicláveis.

[0073] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a camada inferior é translúcida ou transparente.

[0074] De acordo com uma modalidade particular da invenção, o dispositivo também compreende um código de identificação tais como códigos de barras ou etiquetas RFID.

[0075] De acordo com a presente invenção, também é possível combinar, dentro do mesmo dispositivo, meios de reação diferentes arranjados um ao lado do outro os quais vão ser reidratados simulta neamente com a mesma amostra a ser testada.

[0076] Em uma modalidade, o dispositivo compreende uma haste, em cuja extremidade o suporte poroso, impregnado a seco por um meio de reação desidratado, é fixado.

[0077] A fixação pode ser realizada por qualquer meio de conhe cimento dos versados na técnica, tais como, por exemplo, ligação por adesivo ou ainda vedação por calor.

[0078] O suporte poroso fixado a uma haste deste modo pode agir como um toalhete.

[0079] Vantajosamente, o dispositivo também compreende um tu bo transparente à prova d’água o qual pode receber o toalhete, e uma tampa hermética para o tubo.

[0080] Depois de tomar a amostra usando o toalhete, o último é colocado dentro do tubo o qual contém a água necessária para reidra- tar o suporte poroso colocado em sua porção apical. O tubo é em se guida tampado e incubado.

[0081] Em outra modalidade, o suporte poroso é integrado em um curativo, em uma bandagem, em um absorvente higiênico ou em um item de acondicionamento de produtos alimentícios.

[0082] Preferencialmente, o dispositivo compreende, sob o suporte poroso, uma camada mais abaixo, porosa, a qual é posta em contato com a amostra a ser analisada.

[0083] Ainda de modo ainda mais preferencial, o dispositivo tam bém compreende uma camada superior, transparente e impermeável sobre pelo menos uma porção.

[0084] A invenção também se refere ao uso de um dispositivo de acordo com a invenção para a detecção e/ou a identificação e/ou a enumeração de pelo menos um micro-organismo alvo em uma amos-trasuscetível de contê-lo.

[0085] Vantajosamente, a invenção refere-se ao uso de um dispo sitivo que compreende uma haste, no final da qual o referido suporte poroso é fixado, como um toalhete.

[0086] Em outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de um dispositivo de acordo com a invenção como um curativo.

[0087] De acordo com outra modalidade, a invenção também se refere ao uso de um dispositivo de acordo com a invenção como um absorvente higiênico.

[0088] Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de um dispositivo de acordo com a invenção como acondicionamento pa ra gêneros alimentícios.

[0089] O termo "amostra" se destina a indicar uma pequena por ção ou pequena quantidade separada a partir de uma entidade por uma ação subtrativa geralmente denominada amostragem, para fins de análise. A amostra pode ser de origem biológica, humana, animal, vegetal ou ambiental. Pode ser referir a um produto no curso de um processo industrial ou um produto acabado, por exemplo, um produto alimentício. Portanto pode corresponder a uma amostra de fluido bio lógico (sangue total, soro, plasma, urina, líquido cefalorraquidiano, se creção orgânica), uma amostra de tecido ou células isoladas. Pode ser de origem industrial, isto é, de acordo com uma lista não exaustiva, uma amostra de ar, uma amostra de água, uma amostra colhida a par tir de uma superfície, um pedaço ou um produto no curso de tratamen to ou manufatura, um produto de origem alimentar. Entre amostras de origem alimentar, pode ser feita menção de forma não exaustiva de uma amostra de produtos lácteos (iogurtes, queijos, etc.), carne, peixe, ovos, frutos, legumes e verduras, água, bebidas (leite, sucos de fruta, refrigerante, etc.) e os produtos constituintes ou auxiliares do produto acabado. Uma amostra de alimento pode ser finalmente obtida a partir de ração destinada para animais, tal como em especial farinha como ração animal. Antes de ser analisada, esta amostra pode ser submeti da a preparação tal como enriquecimento, extração, concentração, pu rificação, por métodos de conhecimento geral dos versados na técnica.

[0090] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "micro organismo" cobre bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, leve duras, mofos, amebas e, de modo mais geral, organismos unicelula res,invisíveis a olho nu, os quais podem ser manipulados e multiplica dos no laboratório.

[0091] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, o micro-organismo é uma bactéria Gram-negativa ou Gram-positiva, ou uma levedura.

[0092] A título de bactérias Gram-positivas, pode ser feita menção das bactérias dos gêneros que se seguem: Enterococcus, Streptococ cus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Mycobacteria, Nocardia, Corynebacteria, Micrococcus e Deinococcus.

[0093] A título de bactérias Gram-negativas, pode ser feita menção das bactérias dos gêneros que se seguem: Salmonella, Escherichia coli e Pseudomonas.

[0094] A título de leveduras, pode ser feita menção das leveduras dos gêneros que se seguem: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces e Trichosporon.

[0095] A título de mofos, pode ser feita menção ds mofos dos gê neros que se seguem: Aspergillus, Penicillium e Cladosporium.

[0096] O termo "suporte poroso" se destina a indicar um volume com porosidade adaptada, sob a forma de tecido ou não tecido, tendo uma rede fibrosa ou filamentosa de espuma de poros abertos. Isto é um suporte tridimensional, no qual as partículas do meio de reação penetraram, em uma determinada zona do suporte poroso, através de toda a sua espessura.

[0097] O suporte pode ser à base de vários compostos absorven tes com uma capacidade de retenção de água muito elevada, tais co mo viscose, rayon, algodão, fibras de celulose natural ou fibras de ce lulose quimicamente modificadas tais como carboximetil celulose, po límeros químicos absorventes ou superabsorventes tais como sais de poliacrilato ou copolímeros de acrilato / acrilamida. Preferencialmente, o suporte poroso vai ter uma base em peso de entre 50 g/m2 e 150 g/m2, preferencialmente entre 90 g/m2 e 110 g/m2.

[0098] O termo "meio de reação"se destina a indicar um meio que compreende todos os elementos necessários para a sobrevivência e/ou para o crescimento dos micro-organismos. Este meio de reação ou pode servir exclusivamente como meio de visualização, ou servir como meio de cultura e meio de visualização. No primeiro caso, a cul tura dos micro-organismos ocorre antecipadamente, e no segundo ca so, o meio de reação também é o meio de cultura.

[0099] Deste modo, o meio de reação do dispositivo de acordo com a invenção é um meio de visualização e/ou um meio de cultura.

[00100] O termo "meio de visualização"se destina a indicar qual quer meio que contenha uma molécula capaz de acoplar com os mi cro-organismos ou os parceiros de ligação dos referidos micro organismos e permitindo, através de suas propriedades de transdução (fluorescência, coloração, radioatividade, etc.), a visualização da pre sença dos referidos micro-organismos. Esta visualização da presença dos micro-organismos alvo pode ser obtida especialmente por visuali zação (a olho nu) ou por leitura ótica da coloração ou da fluorescência sobre todo o suporte ou sobre uma porção do suporte.

[00101] O termo "meio de cultura" se destina a indicar um meio que compreende todos os elementos necessários para a sobrevivência e/ou para o crescimento dos micro-organismos. Na prática, os versa dos na técnica vão escolher o meio de cultura em função dos micro organismos alvo, de acordo com critérios perfeitamente conhecidos de modo geral e dentro do âmbito destas pessoas versadas na técnica.

[00102] O meio de reação de acordo com a invenção por conter adi tivos opcionais tais como, por exemplo: peptonas, um ou mais fatores de crescimento, carboidratos, um ou mais agentes seletivos, tampões, corantes, um ou mais agentes de gelificação, hidrogéis, agentes visco sos, etc.

[00103] Preferencialmente, o meio de reação do dispositivo de acordo com a invenção compreende pelo menos um agente de gelifi- cação, cuja quantidade é entre 1 mg/cm2 e 2 mg/cm2. O agente de ge- lificação pode ser escolhido entre os agentes de gelificação de conhe cimento geral dos versados na técnica, tais como ágar, ágarose, po- loxâmeros, goma guar ou xantano.

[00104] Deste modo, o suporte poroso e os agentes de gelificação tornam possível limitar a difusão dos substratos e dos micro organismos, e participar na formação de colônias microbianas isola das.

[00105] O termo "pó"se destina a indicar partículas que têm um tamanho de partícula a partir de 1 até 200 micrômetros. É possível a micronização dos compostos minoritários tais como os substratos e os antibióticos, de modo a aperfeiçoar a homogenização do pó.

[00106] Dentro do contexto da presente invenção, "pelo menos um micro-organismo alvo" se destina a indicar pelo menos um micro organismo o qual se deseja detectar e/ou identificar e/ou contar.

[00107] Dentro do contexto da presente invenção, a definição de "sensibilidade de detecção" é idêntica à definição que é comumente aceita na técnica anterior, a saber, a capacidade de proporcionar um resultado positivo (aparecimento de uma reação colorida e/ou fluores cente) quando a cepa bacteriana alvo está presente na amostra.

Descrição dos desenhos:

[00108] A Figura 1 é uma representação esquemática inteiramente não limitante da invenção.

[00109] A Figura 1 representa esquematicamente um suporte poro so 10 contido em um dispositivo de acordo com a invenção compreen dendo uma pluralidade de meios de reação 11 em diferentes zonas, cada uma destas zonas em seguida tendo um meio de reação distribu ído através de toda a espessura do suporte.

[00110] A Figura 1b corresponde a uma vista da planta do suporte poroso 10 de acordo com a invenção.

[00111] A Figura 1c corresponde a uma vista da planta de acordo com outra modalidade na qual o suporte poroso é impregnado por meios de reação em zonas formando círculos sobre a superfície, cada uma destas zonas tendo então meio de reação distribuído através de toda a espessura do suporte.

[00112] Exemplo 1: preparação de um suporte poroso de acordo com a invenção, compreendendo pó de meio de cultura distribuído homogeneamente dentro do suporte Material: - 95 g/m2 de suportes não tecidos (ref: 95NN81, SCA Life) de 25 cm2 de tamanho e 2 mm de espessura (antes da calandragem): - 0,13 g de meio de cultura ChromID CPS 3 desidratado (600-04595, bioMérieux) + 0,06 g de xantano (ref: 4452073479, goma Alliance) Protocolo:

[00113] 0,2 g de pó é aspergido homogeneamente sobre o suporte em seguida o suporte é colocado entre dois eletrodos com aplicação de uma voltagem de 3200 V/mm por 15 segundos em uma umidade relativa de entre 35 e 45%.

[00114] O suporte é calandrado a 60°C por aplicação de uma pres são de 3x105 Pa/cm2.

[00115] Os suportes são deste modo passados através do pó de meio de cultura.

[00116] Exemplo 2: preparação de um suporte poroso de acordo com a invenção, compreendendo pó de meio de reação distribuído homogeneamente dentro do suporte e pó de meio de reação distribuí do exclusivamente na superfície. Material: - 95 g/m2 de suportes não tecidos de 25 cm2 de tamanho e 2 mm de espessura (antes da calandragem) (ref: 95NN81, SCA Life) - Meio 1: meio de cultura ChromID CPS 3 desidratado (0,13 g) (600-04595, bioMérieux) + 0,06 g de xantano (ref: 4452073479, go ma Alliance) - Meio 2: meio de cultura ChromID CPS 3 desidratado (0,13 g) (600-04595, bioMérieux) + 0,06 g de xantano (ref: 4452073479, go ma Alliance) + monoidrato de imipenem micronizado (sp2129, Merck e Co)

[00117] Uma primeira face é impregnada com meio de reação ho-mogeneamente de acordo com o protocolo do exemplo 1. Em seguida, o suporte é virado e a segunda face é impregnada com um meio de reação compreendendo um antibiótico, imipenem, por meio de um campo elétrico mais fraco do que 1050 V/mm por 15 segundos, de modo que o pó penetra menos e permanece mais sobre a superfície. A calandragem é realizada conforme descrito no exemplo 1.

[00118] Exemplo 3: preparação de um suporte poroso de acordo com a invenção, compreendendo pó de meio de reação distribuído homogeneamente dentro do suporte e pó de meio de reação distribuí do em um gradiente dentro do suporte. Material: idêntico ao exemplo 2.

[00119] Uma primeira face é impregnada homogeneamente com o meio 1 de acordo com o protocolo do exemplo 1. Em seguida, o supor teé virado, e a segunda face é impregnada com o segundo meio com o mesmo campo elétrico forte (3169 V/mm).

[00120] É, portanto, obtido um gradiente de impregnação do segun do meio de reação dentro de uma distribuição homogênea do primeiro meio de reação.

[00121] Exemplo 4: preparação de um suporte poroso de acordo com a invenção, compreendendo diferentes meios de reação distribuí dos dentro do suporte em duas camadas.

[00122] Uma primeira face é impregnada homogeneamente com o meio de reação com um campo elétrico intermediário (1408 V/mm). Em seguida, o suporte é virado e a segunda face é impregnada com um segundo meio de reação com o mesmo campo elétrico intermediá rio (1408 V/mm).

[00123] São, portanto, obtidas duas camadas separadas de meios de reação, e toda a espessura do suporte poroso compreende pó de meio de reação.

[00124] Exemplo 5: Detecção de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa com um dispositivo de acordo com a invenção compreen dendo 1 mg/l de imipenem como antibiótico Material: 1. Reagentes usados • ágar CPS3 (bioMérieux, ref: 43549, 22002) • meio seco Chrom ID CPS3 (bioMérieux, ref: 600-04595) • frasco de sal de Triptona de 9 ml, (AES, ref: 111499, lote 327601) • Xantano (Alliance Gum FF Pharma, lote FF 2524429), ta manho de partícula <75 μm • Imipenem (bioMérieux INC, ref: 066259-1) 2. Cepas usadas • E.coli ATCC 25922, MIC (concentração inibitória mínima) de 0,12 mg/ml • Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, MIC 2 mg/ml Método:

[00125] De modo a produzir os meios de ágar, um litro de água é adicionado à amostra de teste do meio seco, isto é, 38,3 g para ChromID CPS3. O meio seco é em seguida dissolvido com agitação, trazido até a ebulição e em seguida esterilizado por autoclavagem. Depois de arrefecimento do meio de ágar até 55°C, o imipenem esteri lizado por filtração é adicionado em uma concentração de 1 mg/l. De modo a realizar impregnação de acordo com a presente invenção do meio seco Chrom ID CPS3, é tomada uma amostra de teste do meio seco correspondente à fabricação de um litro de meio, isto é, 26 g, à qual são adicionados xantano da amostra de teste (20 g) e imipenem (1 g). Em seguida todos os constituintes são misturados juntos em um turbula®. Os suportes porosos são em seguida impregnados pelo pó dos meios de cultura produzido conforme descrito acima e esterilizado por radiação gama entre 10 e 17 kGy. Resultados: ágar ChromID CPS3

UFC: Unidade Formadora de Colônia Suporte poroso de acordo com a invenção

Conclusão

[00126] Foram testadas duas cepas: E.coli ATCC 25922 (MIC 0.12) e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (MIC 2mg/l).

[00127] Os resultados obtidos com os suportes porosos de acordo com a invenção e com os meios de ágar ChromID CPS3 são consis tentes com o crescimento da cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 tendo uma MIC de 2 mg/l na presença de 1 mg/l de imipenem e com a ausência de crescimento da cepa de E.coli ATCC 25922 tendo uma MIC de 0,12 mg/l na presença de 1 mg/l de imipenem.

[00128] Exemplo 6: Detecção de Proteus e de Pseudomonas com um dispositivo de acordo com a invenção compreendendo 1,5 mg/l de ciprofloxacino como antibiótico Material: - base de pó Mueller Hinton 2 (bioMérieux, ref: 8301143, lote 1002661760) - Ágar Americano (ROKO SA, ref: 11000301) - Ágar Europeu (SETEXAM, ref: TMN2) - Ciprofloxacino (HCL TOKU-E COMPANY, ref: C032) - ágar ChromID CPS3 (bioMérieux, ref: 43549, 22002) - meio seco Chrom ID CPS3 (bioMérieux, ref: 600-04595) - frasco de sal de Triptona de 9 ml (AES, ref: 111499, lote 327601) - ágar Pre-cast MH2 (Muller Hinton 2) (bioMérieux, ref: 43301) - ágar TSA (bioMérieux, ref: 43011) - Xantano (Alliance Gum FF Pharma, lote FF 2524429), ta manho de partícula <75 μm - Ciprofloxacino (HCL, ref: 00743041)

[00129] Os suportes porosos foram impregnados pelos meios que se seguem: - MH2 (Muller Hinton 2) + xantano alliance gum pharma - MH2 + xantano alliance gum pharma + 1,5 mg/l de cipro- floxacino - MH2 + xantano alliance gum pharma - CPS3 + xantano alliance gum pharma - CPS3 + xantano alliance gum pharma + 1,5 mg/l de cipro- floxacino Cepas testadas: - Proteus mirabilis API 8803099, ADM AP3, MIC: 0,125 - Proteus mirabilis API 8803080, ADM JS10, MIC: 0,25 - Proteus mirabilis API 9406037, bioMérieux collection, MIC: 4 - Proteus vulgaris API 8803017, ADM CQ11, MIC: 0,125 - Pseudomonas aeruginosa API 9405061, bioMérieux collection, MIC: 0,125 - Pseudomonas aeruginosa API 7509005, ATCC 25853, MIC: 0,5 - Pseudomonas aeruginosa API 9410075, MIC: 16 - Pseudomonas aeruginosa API 9405063, MIC: 4

Método:

[00130] De modo a produzir os meios de ágar, um litro de água é adicionado à amostra de teste do meio seco, isto é, 38,3 g para ChromID CPS3 e 41,57 g para o meio Muller Hinton 2. O meio seco é em seguida dissolvido com agitação magnética, trazido até a ebulição e em seguida esterilizado por autoclavagem. Depois de arrefecimento do meio de ágar até 55°C, o ciprofloxacino esterilizado por filtração é adicionado ao meio de ágar em uma concentração de 1,5 mg/l.

[00131] De modo a realizar impregnação de acordo com a presente invenção dos meios secos MH2 e Chrom ID CPS3, é tomada uma amostra de teste do meio seco correspondente à fabricação de um litro de meio, isto é, 26 g para Chrom ID CPS3 e 26,07 g para o meio Mul ler Hinton 2, à qual são adicionados xantano da amostra de teste (20 g) e, caso apropriado, ciprofloxacino (1,5 g). Em seguida todos os constituintes são misturados juntos em um turbula®. Os suportes po rosossão em seguida impregnados com os pós dos meios de cultura conforme descrito acima e esterilizados por radiação gama entre 10 e 17 kGy. Resultados:

Conclusão

[00132] Neste exemplo, os meios de ágar Muller Hinton e ChromID CPS3 com ou sem 1,5 g/l de ciprofloxacino foram comparados com os suportes porosos de acordo com a presente invenção impregnados com os mesmos meios com ou sem 1,5 g/l de ciprofloxacino para três cepas de Proteus mirabilis, uma cepa de Proteus vulgaris e quatro ce pas de Pseudomonas aeruginosa. Todas estas cepas tinham uma MIC em torno do valor de 1,5 mg/l de ciprofloxacino. As cepas com uma MIC de menos de 1,5 mg/l (Proteus mirabilis: API 8803099, Proteus mirabilis: API 8803080, Proteus vulgaris: API 8803017, Pseudomonas aeruginosa: API 9405061, Pseudomonas aeruginosa: API 7509005) não crescem sobre meios de ágar MH2 + substratos + ciprofloxacino (1,5 mg/l) e ChromID CPS3 com ciprofloxacino adicionado (1,5 mg/l). De modo similar, estas cepas "sensíveis a ciprofloxacino", para uma MIC de 1,5 mg/l, não crescem ou sobre os suportes porosos impreg nados com meios ChromID CPS3 e MH2 + substrato na presença de 1,5 mg/l de ciprofloxacino. Os resultados obtidos sobre meios de ágar e sobre suportes porosos impregnados de acordo com a presente in venção são portanto consistentes uns com os outros. Todas estas ce pas crescem sobre MH2 + substrato ou meios de ágar ChromID CPS3 e sobre suportes porosos impregnados por MH2 + substrato e meios ChromID CPS3.

[00133] As cepas com uma MIC de mais de 1,5 mg/l (Proteus mira- bilis: API 9406037, Pseudomonas aeruginosa: API 9410075, Pseudo monas aeruginosa: API 940506) crescem sobre todos os meios de ágar ou impregnados, com ou sem ciprofloxacino (1,5 g/l). Estes resul tados confirmam que é possível produzir meios de cultura de acordo com a presente invenção contendo pequenas quantidades de agentes ativos tais como substratos cromogênicos ou antibióticos.

Claims (16)

1. Método para detecção e/ou identificação e/ou enumera ção de pelo menos um micro-organismo alvo em uma amostra susce tível de contê-lo, caracterizado pelo fato de que compreende as se guintes etapas: (a) fornecer um dispositivo para detecção e/ou identificação e/ou enumeração de micro-organismos compreendendo um suporte poroso que compreende pó de meio de cultura com pelo menos um antibiótico e/ou pelo menos um composto sensível ao calor, tal como um substrato enzimático ou metabólico, através de toda a sua espes sura, o referido suporte poroso tendo sido impregnado a seco através de toda a sua espessura pelo referido meio de cultura, (b) colocar uma amostra em contato com o suporte poroso, o meio de cultura sendo reidratado por uma amostra aquosa ou volu me de líquido adequado quando a amostra não é aquosa ou é insufici entemente aquosa; (c) incubar o dispositivo, (d) detectar e/ou identificar e/ou enumerar a colônia ou co lônias de micro-organismos dentro do suporte poroso, quando os mi cro-organismos pesquisados estão presentes na amostra.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa anterior de preparação, dilui ção ou concentração da amostra.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri zado pelo fato de que a amostra é colocada em contato com uma por ção inferior do suporte poroso.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri zado pelo fato de que a etapa (b) é realizada tomando a amostra usando o suporte poroso.

5. Dispositivo, caracterizado pelo fato de que compreende um suporte poroso compreendendo pelo menos um meio de cultura em forma de pó distribuído através de toda a espessura do suporte poroso, o referido meio de cultura compreendendo pelo menos um antibiótico e/ou pelo menos um composto sensível ao calor, tal como um substrato enzimático ou metabólico, e o referido suporte poroso apresentando uma espessura en tre 0,5 e 2 mm e sendo calandrado.

6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do pelo fato de que pelo menos um meio de cultura em forma de pó é homogeneamente distribuído através da espessura do suporte poroso.

7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do pelo fato de que pelo menos um meio de cultura em forma de pó é distribuído em uma maneira graduada através da espessura do supor te poroso.

8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 7, caracteriza do pelo fato de que compreende pelo menos dois meios de cultura di-ferentes em forma de pó distribuídos em pelo menos duas camadas, o referido suporte compreendendo, em um determinado ponto através da espessura, um ou o outro meio de cultura.

9. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 5 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compre ende pelo menos um agente de gelificação, cuja quantidade está entre 1 mg/cm2 e 2 mg/cm2.

10. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 5 a 9, caracterizado pelo fato de que a quantidade de meio de cultura impregnado no suporte poroso está entre 0,10 mg/cm3 e 0,1 g/cm3, preferencialmente, entre 0,01 g/cm3 e 0,09 g/cm3.

11. Dispositivo, caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de suportes porosos como definidos em qualquer uma das reivindicações 5 a 10.

12. Uso de um dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de ser para detec ção e/ou identificação e/ou enumeração de pelo menos um micro organismo alvo em uma amostra suscetível de contê-lo.

13. Uso de um dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de ser como um cu rativo.

14. Uso de um dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de ser como um ab-sorventehigiênico.

15. Uso de um dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de ser como acondi cionamento para gêneros alimentícios.

16. Uso de um dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de ser como um toa- lhete.

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