RU2298036C2 - Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента - Google Patents
Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента Download PDFInfo
- Publication number
- RU2298036C2 RU2298036C2 RU2004132319/13A RU2004132319A RU2298036C2 RU 2298036 C2 RU2298036 C2 RU 2298036C2 RU 2004132319/13 A RU2004132319/13 A RU 2004132319/13A RU 2004132319 A RU2004132319 A RU 2004132319A RU 2298036 C2 RU2298036 C2 RU 2298036C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sorption
- sorbent
- microbe
- test
- toxicant
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных сорбентов (например, аппликационных, используемых для лечения ран), а именно к оценке уровня сорбционной активности сорбентов в отношении микробных токсинов. Сущность способа сводится к тому, что в стационарных условиях питательной среды для культуры клеток проводится в течение 1 часа прединкубация сорбента и тест-штамма микроорганизма в присутствии (опыт) и в отсутствии (контроль) токсиканта (например, бактериальной коллагеназы), после чего в течение следующего 1 часа проводят совместную инкубацию контрольной и опытной суспензий тест-микроорганизма с монослоем культуры клеток. Уровень сорбции микробного токсина оценивается по разнице показателей адгезии тест-микроба к культуре клеток в опыте с токсикантом и в контроле без токсиканта. Способ обеспечивает повышение точности и скорости выявления уровня сорбции микробных токсинов за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных сорбентов (например, аппликационных, используемых для лечения ран), а именно к оценке уровня сорбционной активности сорбентов в отношении микробных токсинов.
Сущность способа сводится к тому, что в стационарных условиях питательной среды для культуры клеток проводится в течение 1 часа прединкубация сорбента и тест-штамма микроорганизма в присутствии (опыт) и в отсутствии (контроль) токсиканта (например, бактериальной коллагеназы), после чего в течение следующего 1 часа проводят совместную инкубацию контрольной и опытной суспензий тест-микроорганизма с монослоем культуры клеток, затем уровень сорбции микробного токсина оценивается по разнице показателей адгезии тест-микроба к культуре клеток в опыте с токсикантом и в контроле без токсиканта.
Методы изучения уровня сорбционной активности (эффективности) сорбентов зависят от типа сорбента и предполагаемой области применения в медицине. Аппликационные сорбенты, как правило, используются для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных процессов в различных областях медицины. Изучение эффективности аппликационных сорбентов проводят в эксперименте на адекватных биологических моделях соответствующих заболеваний и патологических состояний. С этой целью используются различные виды лабораторных животных. Исследуемые показатели изучаются в динамике в течение длительного времени (2-4 недели) [1]: выживаемость, продолжительность жизни, скорость заживления ран, уменьшение активности протеолиза. При этом неселективные аппликационные сорбенты исследуются на влагопоглощение (по количеству впитываемой и удерживаемой влаги), атравматичность (по адгезии модельной раневой поверхности), сорбцию белков (по кинетике сорбции бычьего сывороточного альбумина, фибриногена, трипсина), сорбцию микроорганизмов (по сорбции и задержке роста золотистого стафилококка, синегнойной палочки, кишечной палочки на твердой питательной среде). Селективные и биоактивные аппликационные сорбенты исследуются на сорбцию токсических метаболитов, экофакторов (по изотерме и кинетике сорбции соответствующих токсикантов), на специфическую биологическую активность (гемостатическая, бактерицидная и др. - по проявлению регламентирующих свойств).
Особенность биологии патогенных бактерий свидетельствует о том, что способность вызывать инфекционные заболевания формировалась у них в направлении приобретения функций, позволяющих им проникать в организм хозяина, противостоять его защитным системам, а также вызывать нарушения деятельности физиологически важных систем. Факторы патогенности с инвазивной функцией и функцией защиты от фагоцитоза можно объединить в одну группу факторов, обеспечивающих развитие начальной, часто клинически не выраженной стадии инфекционного процесса. К другой группе факторов патогенности можно отнести биологически активные вещества (токсиканты), обусловливающие синдром заболевания с выраженной клинической картиной и возможную смерть хозяина [2].
К сожалению, вышеизложенные методы оценки специфической активности сорбентов часто не позволяют выявлять перспективные препараты, предназначенные для предупреждения и лечения инфекционно-воспалительных процессов.
Аналогами предлагаемого способа являются следующие методы.
Для аппликационных сорбентов сорбция белков изучается путем анализа кинетических кривых сорбции трипсина. Сорбция белков проводится из водных растворов в статическом режиме в течение 4-х часов, при этом остаточная концентрация белка определяется по методу Лоури. Способ имеет ряд существенных недостатков. Он предполагает использовать в качестве сорбирующего агента протеолитический фермент животного происхождения трипсин. Этот фермент не входит в патогенетическую цепь вышеназванных ферментов, от которых зависит развитие и глубина инфекционно-восстановительного процесса в тканях. Кроме того, методика занимает много времени, т.к. после 4-х часов экспозиции фермента с сорбентом определение остаточной концентрации белка занимает 6-7 часов. Кроме того, условия опыта очень далеки от условий макроорганизма.
Сорбция микроорганизмов из суспензии проводится с твердой питательной среды. Изучается динамика роста колоний. Для оценки сорбции микроорганизмов с поверхности твердой питательной среды используются суточные культуры E.coli и S.aureus в концентрациях соответственно 103 и 106 КОЕ/мл (по стандарту мутности Мак-Фарланда). По 0,5 и 0,05 мл суспензии соответствующих микробов высевается на чашки Петри с питательной средой (мясопептонный агар). Через 15 минут на поверхности агара плотно укладывается слой сорбента определенной площади или массы, увлажненный 0,9% раствором хлорида натрия. Через 30, 60 мин, 2, 4, 6, 12 и 24 часа сорбент удаляется. Чашки помещаются в термостат и инкубируются при 37°С в течение 24 часов. Затем проводится подсчет колоний в контроле и после аппликации сорбента и расчет сорбционной емкости материала, которая выражается в КОЕ на 1 см2 и коэффициент сорбции (%). Способ имеет ряд существенных недостатков. Он длителен по времени (48 часов) и не отражает условий макроорганизма. Кроме того, он недостаточно стандартизован, его результаты зависят от штаммных различий и условий культивирования (рН среды, качества питательных сред и т.д.).
Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого способа является также способ оценки сорбции бактериальных липополисахаридов (эндотоксинов). Сорбция эндотоксинов изучается путем построения кинетических кривых в течение 3-х часов. Остаточная концентрация эндотоксина определяется через 1-180 минут по содержанию колитозы, отщепляющейся от молекулы липополисахарида (ЛПС) при гидролизе в присутствии серной кислоты [1]. Способ имеет ряд существенных недостатков. По времени он занимает 5-6 часов и не отражает условий макроорганизма. Самый главный недостаток состоит в том, что ЛПС не являются истинным токсином, до настоящего времени их патологическая функция еще полностью не выяснена. С одной стороны, их нельзя отнести безоговорочно к истинным токсинам, а с другой - они не укладываются полностью в группу факторов с антифагоцитарным действием [2].
Техническим результатом изобретения является повышение точности и скорости способа выявления уровня сорбции микробных токсинов за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма.
Результат изобретения достигается за счет того, что проводят в течение 1 часа прединкубацию сорбента, тест-микроорганизма в присутствии или отсутствии токсиканта (например, бактериальной коллагеназы), а уровень сорбционной активности оценивают по разнице показателей адгезии тест-микроба к культуре клеток в опыте с токсикантом и в контроле без токсиканта.
Способ осуществляется следующим образом.
Предварительно для оценки уровня сорбции микроорганизмов по степени уменьшения адгезии тест-микроорганизма в стерильную пробирку с 1,8 мл поддерживающей среды Игла добавляют 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 108 КОЕ/мл. Затем в пробирку помещают исследуемый сорбент (1 г или 1 см2).
Для оценки уровня сорбции токсиканта в стерильную пробирку с 1,8 мл токсиканта в требуемой концентрации (разведение на среде Игла) добавляют 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 108 КОЕ/мл. Затем в пробирку помещают исследуемый сорбент (1 г или 1 см2).
Через 1 час совместного инкубирования сорбент удаляют и 1,8 мл оставшейся жидкости помещают в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем кожно-мышечных (ФКЭЧ) или легочных фибробластов (ФЛЭЧ) эмбриона человека, полученным по [3]. Пробирку инкубируют 1 час при 37°С, затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой среды Игла, фиксируют 96° этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимза и исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА·ПК%. Процент сорбции микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%. Процент сорбции токсиканта определяют по разнице между процентом сорбции смеси микроба с токсикантом и процентом сорбции микроба без токсиканта.
Пример 1. Определение сорбционной активности углеволокнистого сорбента (УВС) и хитозана (ХС) на тест-штамме S.aureus 209 и культуре клеток ФКЭЧ (КК). Среда для культивирования стафилококка - мясопептонный бульон, для культивирования фибробластов - питательная среда Игла.
В стерильную пробирку с 1,8 мл среды Игла помещали исследуемый сорбент (1 см2) и 0,2 мл суточной культуры S.aureus 209 в дозе 108 КОЕ/мл. Через 1 час совместного инкубирования сорбент удаляли и 1,8 мл оставшейся жидкости помещали в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирку инкубировали 1 час при 37°С, клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент сорбции микроба по сравнению с соответствующим контролем без сорбента по показателю микробной нагрузки (таблицы 1, 2).
Пример 2. Определение сорбционной активности углеволокнистого сорбента (УВС) и хитозана (ХС) на тест-штамме S.aureus 209 и культуре клеток ФКЭЧ (КК) в присутствии токсиканта - фермента коллагеназы - одного из основных факторов патогенности микроорганизмов. Среда для культивирования стафилококка - мясопептонный бульон, для культивирования фибробластов - питательная среда Игла. Тестировали три различные дозы коллагеназы 300, 600 и 900 КЕ в виде стандартного коммерческого препарата "Коллализин" (коллагеназа Clostridium histolyticum), разведенного на среде Игла до соответствующих концентраций.
В стерильную пробирку с 1,8 мл коллагеназы в соответствующей дозе помещали исследуемый сорбент (1 см2) и 0,2 мл суточной культуры S.aureus 209 в дозе 108 КОЕ/мл. Через 1 час совместного инкубирования сорбент удаляли и 0,2 мл оставшейся жидкости помещали в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирку инкубировали 1 час при 37°С, клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент сорбции смеси микроба с коллагеназой по сравнению с соответствующими контролями без сорбента по показателю микробной нагрузки (таблицы 3, 4).
Процент сорбции токсиканта определяли по разнице между процентом сорбции смеси микроба с коллагеназой и процентом сорбции микроба без токсиканта по данным таблиц 1 и 2.
Таблица 1 | ||||
Уровень сорбции микроорганизма (патогенного стафилококка золотистого) в присутствии углеволокнистого сорбента (УВС) | ||||
Тест-объект | ИА | % ПК | МН | % сорбции микроба, А |
контроль: | ||||
ФКЭЧ + микроб | 6 | 20 | 120 | - |
опыт: | ||||
микроб + УВС: (1 час), затем микроб + ФКЭЧ | 5 | 18 | 90 | 25 |
Таблица 2 | ||||
Уровень сорбции микроорганизма (патогенного стафилококка золотистого) в присутствии хитозана (ХС) | ||||
Тест-объект | ИА | % ПК | МН | % сорбции микроба, В |
контроль: | ||||
ФКЭЧ + микроб | 6 | 20 | 120 | - |
опыт: | ||||
микроб + ХС: (1 час), затем микроб + ФКЭЧ | 5 | 16 | 80 | 33 |
Таблица 3 | |||||
Уровень сорбции токсиканта (бактериальной коллагеназы) в присутствии углеволокнистого сорбента (УВС) | |||||
Тест-объект | ИА | % ПК | МН | % сорбции смеси микроба и токсиканта, С | % сорбции токсиканта, D=C-A |
1. контроли: | |||||
1.1. ФКЭЧ + микроб | 6 | 20 | 120 | - | - |
1.2. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 300 | 12 | 20 | 240 | - | - |
1.3. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 600 | 14 | 25 | 350 | - | - |
1.4. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 900 | 18 | 30 | 540 | - | - |
2. опыт: | |||||
2.1. микроб + УВС + коллагеназа 300 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 300 (1 час) | 7 | 16 | 112 | 53,3 | 28,3 |
2.2. микроб + УВС + коллагеназа 600 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 600 (1 час) | 10 | 22 | 220 | 37,1 | 12,1 |
2.3. микроб + УВС + коллагеназа 900 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 900 (1 час) | 15 | 24 | 360 | 33,3 | 8,3 |
Таблица 4 | |||||
Уровень сорбции токсиканта (бактериальной коллагеназы) в присутствии хитозана (ХС) | |||||
Тест-объект | ИА | % ПК | МН | % сорбции смеси микроба и токсиканта, Е | % сорбции токсиканта, F=E-B |
1. контроли: | |||||
1.1. ФКЭЧ + микроб | 6 | 20 | 120 | - | - |
1.2. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 300 | 12 | 20 | 240 | - | - |
1.3. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 600 | 14 | 25 | 350 | - | - |
1.4. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 900 | 18 | 30 | 540 | - | - |
2. опыт: | |||||
2.1. микроб + ХС + коллагеназа 300 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 300 (1 час) | 6 | 14 | 84 | 65,0 | 32,0 |
2.2. микроб + ХС + коллагеназа 600 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 600 (1 час) | 9 | 20 | 180 | 48,6 | 15,6 |
2.3. микроб + ХС + коллагеназа 900 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 900 (1 час) | 13 | 22 | 286 | 47,0 | 14,0 |
Литература.
1. МУ МЗ Украины "Разработка и доклиническая оценка сорбентов медицинского назначения", Киев, 1992. С.21.
2. Езенчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Наука, 1977, с.215.
3. Грабовская К.Б., Тотолян А.А. Журн. Микробиол. - 1977. - №2. - С.32-36.
Claims (2)
1. Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента, отличающийся тем, что проводят предынкубацию сорбента с тест-микроорганизмом в присутствии (опыт) или отсутствии (контроль) токсиканта в течение 1 ч, далее сорбент удаляют, а полученные опытные и контрольные суспензии тест-микроорганизма инкубируют с монослоем культуры клеток, после инкубирования определяют степень адгезии тест-микроорганизма к культуре клеток и оценивают уровень сорбционной активности сорбента по уменьшению степени адгезии тест-микроорганизма в опыте по сравнению с контролем.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве токсиканта используют бактериальную коллагеназу.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004132319/13A RU2298036C2 (ru) | 2004-11-04 | 2004-11-04 | Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004132319/13A RU2298036C2 (ru) | 2004-11-04 | 2004-11-04 | Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004132319A RU2004132319A (ru) | 2006-04-10 |
RU2298036C2 true RU2298036C2 (ru) | 2007-04-27 |
Family
ID=36458944
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004132319/13A RU2298036C2 (ru) | 2004-11-04 | 2004-11-04 | Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2298036C2 (ru) |
-
2004
- 2004-11-04 RU RU2004132319/13A patent/RU2298036C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
МУ МЗ УКРАИНЫ, Разработка и доклиническая оценка сорбентов медицинского назначения, Киев, 1992, с.21. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2004132319A (ru) | 2006-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Spooner et al. | Chapter IV Laboratory assessment of antibacterial activity | |
de Breij et al. | Three-dimensional human skin equivalent as a tool to study Acinetobacter baumannii colonization | |
Wiegand et al. | In vitro assessment of the antimicrobial activity of wound dressings: influence of the test method selected and impact of the pH | |
Pieper et al. | Herd characteristics and cow-level factors associated with Prototheca mastitis on dairy farms in Ontario, Canada | |
MXPA05006193A (es) | Materiales basados en gelatina como hisopos. | |
EP2918672B1 (en) | Method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances | |
CN101111278A (zh) | 用氧化氮治疗创伤的装置和方法 | |
Coquet et al. | Resistance of artificial biofilms of Pseudomonas aeruginosa to imipenem and tobramycin. | |
Fairbrother et al. | A Text-book of Bacteriology | |
RU2455355C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Pseudomonas aeruginosa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ОСНОВЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АСЕПТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ | |
RU2298036C2 (ru) | Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента | |
Shokri et al. | Occurrence of Malassezia species in Persian and domestic short hair cats with and without otitis externa | |
RU2296163C2 (ru) | Способ оценки специфической активности бактериофагов | |
RU2818369C1 (ru) | Способ оценки сохранения жизнеспособности лактобактерий при воздействии различных концентраций антисептика | |
RU2628063C1 (ru) | Способ прогнозирования транслокации E.coli из кишечника при некультивируемом типе инфекционного процесса в эксперименте на кроликах | |
Mahdi et al. | Eradication of Biofilm Produced by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa in Wound Infection by Using Proteinase K Enzyme. | |
RU2650760C1 (ru) | Способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам | |
Traub et al. | Detection of fibrinolytic and elastase activity among clinical isolates of Serratia marcescens | |
CN116114711B (zh) | 一种室内环境微生物清洁剂及其应用 | |
RU2485182C1 (ru) | Способ косвенной оценки вирулентности штаммов патогенных буркхольдерий по признаку цитопатогенности | |
CN103547684B (zh) | 杀微生物组合物及其生产方法和用途 | |
CN111206067B (zh) | 湿纸巾防腐效果的评价方法 | |
Ali | The Effects of Enzyme Nanoparticles on Adhesion of Pathogenic Bacteria | |
SU1729515A1 (ru) | Способ дезинфекции животноводческих помещений | |
RU2665761C1 (ru) | Способ подавления роста микроорганизмов антигенами-экстрактами из гельминтов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20061105 |