BR112016002716A2 - coortes de biomarcador de urina, assinaturas de expressão gênica e métodos de uso das mesmas - Google Patents

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Abstract

resumo “coortes de biomarcador de urina, assinaturas de expressão gênica e métodos de uso das mesmas” a presente invenção se refere, em geral, ao campo da análise de biomarcador, particularmente, à determinação de assinaturas de expressão gênica a partir de amostra de urinas. a divulgação fornece composições, kits e métodos para diagnosticar um transtorno da próstata, tal como câncer de próstata, em um sujeito do sexo masculino.

Description

“COORTES DE BIOMARCADOR DE URINA, ASSINATURAS DE EXPRESSÃO GÊNICA E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS”
PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N2 61/862.630, depositado em 6 de Agosto de 2013, os conteúdos do qual são integralmente incorporados neste relatório como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção se refere, em geral, ao campo da análise de biomarcador, particularmente, à determinação de assinaturas de expressão gênica a partir de amostras de urina.
FUNDAMENTOS [003] O conhecimento crescente das mudanças genéticas e epigenéticas que ocorrem em células de câncer fornece uma oportunidade para detectar, caracterizar e monitorar tumores através da análise de sequências e perfis de ácidos nucléicos relacionados ao tumor. Estas mudanças podem ser observadas através da detecção de uma variedade de biomarcadores relacionados ao câncer. Vários ensaios de diagnóstico molecular são usados para detectar estes biomarcadores e produzir informação valiosa para pacientes, médicos e pesquisadores. Até o momento, estes ensaios, primeiramente, foram realizados em células de câncer derivadas de cirurgicamente tecido de tumor removido ou a partir de tecido obtido através de biópsia.
[004] Entretanto, a capacidade de realizar estes testes usando uma amostra de fluido corpóreo é, muitas vezes, mais desejável do que usar uma amostra de tecido do paciente. Uma abordagem menos invasiva usando uma amostra de fluido corpóreo tem diversas implicações em termos de bem-estar do paciente, a capacidade de conduzir monitoramento de doença longitudinal e a capacidade de obter perfis de expressão mesmo quando as células de tecido não são facilmente
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2/92 acessíveis, por exemplo, na glândula da próstata. Para estas amostras, os métodos de coleta previamente divulgados, frequentemente, exigiram um exame retal digital (DRE) ou massagem da próstata para permitir que fluido celular derivado da próstata suficiente entre na urina. Amostras coletadas sem DRE ou massagem da próstata mostraram uma taxa de detecção menor destes biomarcadores.
[005] Consequentemente, existe uma necessidade quanto a novos métodos não invasivos de detecção de biomarcadores, por exemplo, biomarcadores nas microvesículas urinárias, para auxiliar no diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia para uma doença ou outra condição médica da glândula da próstata. Em particular, existe uma necessidade quanto a métodos não invasivos que não exigem DRE ou massagem da próstata antes da coleta de amostra de urina e não exigem uma etapa de preparação de amostra que envolve o isolamento de uma pelota celular a partir das amostras de urina.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] A presente invenção fornece métodos para detectar um ou mais biomarcadores em microvesículas de urina para auxiliar no diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia para uma doença, tal como, por exemplo, câncer, particularmente uma doença ou outra condição médica da glândula da próstata em um sujeito. O método inclui obter uma amostra de urina aleatória a partir de um sujeito; extrair o mRNA a partir da amostra, detectar o nível de expressão de mRNA de PCA3 e ERG; e normalizar o nível de expressão de mRNA de PCA3 e ERG em KLK3 ou SPDEF. O método compreende ainda computar um valor de saída para os níveis de expressão de mRNA normalizados de PCA3 e ERG usando uma fórmula pré-determinada; e comparar o valor de saída a um valor de corte predeterminado que foi determinado usando uma curva ROC gerada com base em uma combinação de PCA3 e ERG para distinguir um sujeito em um alto risco para câncer a partir de um sujeito com um baixo risco para câncer. Além disso, estes métodos
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3/92 incluem a identificação de um sujeito em alto risco de um câncer de próstata com escore de Gleason (GS) alto (por exemplo, um escore de Gleason (GS) > 6), em comparação a um sujeito em baixo risco de um câncer de próstata com GS alto. Por exemplo, sujeitos que apresentam um valor de saída que é maior do que ou, em algumas formas de realização, igual ao valor de corte pré-determinado que foi determinado usando uma curva ROC gerada com base em uma combinação de PCA3 e ERG, estão em alto risco para um câncer de próstata com GS alto, enquanto sujeitos que apresentam um valor de saída que é menor do que o valor de corte pré-determinado estão em um baixo risco para um câncer de próstata com GS alto. Assim, estes métodos são úteis para distinguir sujeitos em alto risco para um câncer de próstata com GS alto de sujeitos em um baixo risco de um câncer de próstata com GS alto.
[007] A invenção fornece um método para diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia em um sujeito em necessidade do mesmo, consistindo das etapas de obter uma amostra de urina aleatória a partir do sujeito; extrair um ou mais mRNAs a partir da amostra; detectar um nível de expressão de mRNAs de PCA3 e ERG; normalizar o nível de expressão de mRNAs de PCA3 e ERG em um gene de referência; computar um valor de saída através da aplicação dos níveis de expressão normalizados de PCA3 e ERG mRNAs a uma fórmula prédeterminada; e comparar o valor de saída a um valor de corte pré-determinado que foi determinado usando uma curva ROC gerada com base em uma combinação de mRNA de PCA3 e mRNA de ERG para distinguir um sujeito com um alto risco de recorrência de câncer a partir de um sujeito com um baixo risco de recorrência de câncer.
[008] Os métodos da divulgação usam uma amostra de urina a partir de um sujeito do sexo masculino, por exemplo, uma amostra entre 25 a 40 mL da primeira urina coletada. Os métodos da divulgação não exigem um exame retal digital (DRE)
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4/92 e, preferivelmente, as amostras de urina usadas nestes métodos são amostras a partir de pacientes que não foram submetidos ao DRE.
[009] Em algumas formas de realização, o nível de PSA do paciente é detectado. Em algumas formas de realização, os métodos são usados para analisar amostras a partir de pacientes na “zona cinzenta” de PSA que apresentam um nível de PSA que está entre 2 a 10 ng/mL. Em algumas formas de realização, o paciente é um sujeito do sexo masculino humano que apresenta pelo menos 50 anos de idade.
[010] Em algumas formas de realização, a amostra do paciente é analisada usando o seguinte algoritmo:
Escore de
EXO106
--------------------- Ir 1OR-T-----------------------f- 16.92) * 1.83 [011] Em algumas formas de realização, o escore de EXO106 é usado para prognosticar se um paciente está em um baixo risco de câncer de próstata ou um alto risco de câncer de próstata. Por exemplo, pacientes que apresentam um escore de EXO106 que é menor do que 10 calculado usando o algoritmo acima são identificados como aqueles que apresentam um baixo risco de câncer de próstata, e pacientes que apresentam um escore de EXO106 que é 10 ou maior são identificados como aqueles que apresentam um risco de câncer de próstata maior.
[012] Em algumas formas de realização, o escore de EXO106 é usado para prognosticar se um paciente está em um baixo risco de um câncer de próstata com escore de Gleason (GS) alto ou um alto risco de um câncer de próstata com GS alto. Por exemplo, pacientes que apresentam um escore de EXO106 que é menor do que 10 calculado usando o algoritmo acima são identificados como aqueles que apresentam um baixo risco de um câncer de próstata com GS alto e pacientes que apresentam um escore de EXO106 que é 10 ou maior são identificados como aqueles que apresentam um risco maior de um câncer de próstata com GS alto.
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5/92 [013] Em algumas formas de realização, os métodos da presente invenção ainda incluem isolar a fração de uma microvesícula a partir da amostra de urina aleatória e extrair os ácidos nucléicos a partir da fração de microvesícula.
[014] Em algumas formas de realização, o método compreende ainda detectar o nível de expressão de AMACR, BIRC5, HOXC6 e/ou SPARCL1. Em algumas formas de realização, o método compreende ainda detectar o nível de expressão de AMACR, BIRC5, HOXC6 e/ou SPARCL1 e computar o valor de saída com base na combinação de PCA3, ERG e AMACR, BIRC5, HOXC6, e/ou SPARCL1.
[015] Em qualquer um dos métodos precedentes, uma quantidade conhecida de partículas de Q-beta é adicionada à amostra de urina antes da extração de ácido nucléico. O nível de expressão do gene alvo Q-beta é detectado e o nível de expressão detectado é comparado à quantidade conhecida de partículas de Q-beta.
[016] A invenção fornece um método para diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia para uma condição médica em um sujeito, compreendendo as etapas de: (a) obter a fração de uma microvesícula a partir de uma amostra de urina a partir de um sujeito; (b) extrair um ou mais ácidos nucléicos a partir da fração de microvesícula; e (c) analisar os ácidos nucléicos extraídos para detectar a presença, ausência ou nível de expressão de PCA3 e ERG. Estes marcadores são detectáveis em um nível estável em amostras de urina frescas, assim como amostras de urina que foram previamente congeladas e descongeladas. Preferivelmente, as amostras de urina são de 40 mL ou 20 mL. Mais preferivelmente, as amostras de urina são os primeiros 40 mL esvaziados a partir da bexiga ou os primeiros 20 mL esvaziados a partir da bexiga. A detecção destes marcadores é reproduzível através das amostras a partir do mesmo paciente, assim como através de amostras a partir de vários pacientes.
[017] A invenção também fornece um método compreendendo
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6/92 adicionalmente a etapa de detectar um nível de expressão de um gene de referência e determinar um nível de expressão relativo e normalizado dos biomarcadores, em que o nível de expressão relativo dos biomarcadores é uma razão entre o nível de expressão do biomarcador para o nível de expressão do gene de referência, e em que o sujeito é identificado como aquele que sofre de, ou está em um risco aumentado para uma condição médica, tal como câncer, quando o nível de expressão relativo do biomarcador é maior do que um nível de corte de expressão do biomarcador. Em algumas formas de realização, o biomarcador é pelo menos ERG e PCA3. Em algumas formas de realização, o biomarcador é pelo menos ERG e PCA3 e pelo menos um outro biomarcador selecionado a partir do grupo que consiste de AMACR, BIRC5, HOXC6, SPARCL1 e combinações dos mesmos. Em algumas formas de realização, o gene de referência é um gene específico da próstata. Em algumas formas de realização, o gene de referência é KLK3 ou SPDEF, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, o gene de referência é KLK3. Em algumas formas de realização, o gene de referência é um gene de manutenção, tal como, por exemplo, GAPDH.
[018] Em algumas formas de realização, a Área sob a Curva (AUC) derivada da curva de Característica de Operação do Receptor (ROC) para cada nível de biomarcador ou um escore criado por uma combinação de biomarcadores é computado usando resultados de biomarcador a partir de controles e pacientes com doença. Em algumas formas de realização preferidas, o valor de AUC derivado da curva ROC para cada nível de biomarcador ou um escore criado por uma combinação de biomarcadores é maior do que 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8. Preferivelmente, o valor de AUC é maior do que 0,7. Uma pessoa habilitada na técnica seria prontamente capaz de maximizar a precisão de diagnóstico do nível de biomarcador ou combinação de biomarcadores através da implementação de uma análise de corte que inclui a sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (NPV), valor
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7/92 preditivo positivo (PPV), razão de probabilidade positiva (PLR) e razão de probabilidade negativa (NLR) necessários para utilidade clínica. Resultados de biomarcador ou uma combinação de resultados de biomarcador são analisados em diversas maneiras. Em algumas formas de realização, os resultados são analisados usando uma análise univariada ou de variável única (SV). Em algumas formas de realização, os resultados são analisados usando análise multivariada (MV). Exemplos de análises SV e MV de biomarcadores e/ou coortes de biomarcador são mostrados nas Tabelas abaixo.
[019] Em algumas formas de realização, o gene de referência é um gene específico da próstata. Em algumas formas de realização, o gene de referência é KLK3 ou SPDEF ou uma combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, o gene de referência é um gene de manutenção, por exemplo, GAPDH.
[020] Os biomarcadores e combinações de biomarcadores (também referidas neste relatório como coortes de biomarcador) são úteis nos métodos de diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia para uma condição médica, tal como cânceres, incluindo cânceres agressivos. Em algumas formas de realização, os biomarcadores e combinações de biomarcadores são úteis na correlação da expressão de biomarcador e/ou coorte com a probabilidade de que o sujeito esteja sofrendo de ou em risco para sofrer de um câncer agressivo com base no nível de expressão e/ou padrão de expressão detectada. Em algumas formas de realização, os biomarcadores e combinações de biomarcadores são úteis na correlação da expressão de biomarcador e/ou coorte com a probabilidade de que o sujeito esteja sofrendo de ou em risco para sofrer de uma recorrência de um câncer com base no nível de expressão e/ou padrão de expressão detectada. Em algumas formas de realização, os biomarcadores e combinações de biomarcadores são úteis na correlação da expressão de biomarcador e/ou coorte com a probabilidade de que o sujeito esteja sofrendo de ou em risco para sofrer de um câncer de próstata
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8/92 agressivo com base no nível de expressão e/ou padrão de expressão detectada. Os biomarcadores e combinações de biomarcadores são úteis na correlação da expressão de biomarcador e/ou coorte com o escore de Gleason de um sujeito. Por exemplo, o nível de expressão de um biomarcador e/ou coorte pode ser usado para identificar um escore de Gleason do sujeito com base no nível de expressão e/ou padrão de expressão detectada. Por exemplo, o nível de expressão de um PCA3 e ERG pode ser usado para identificar que um escore de Gleason do sujeito é maior do que 6. Os biomarcadores e combinações de biomarcadores são úteis na correlação da expressão de biomarcador e/ou coorte com a probabilidade de que o sujeito necessitará de uma prostatectomia radical com base no nível de expressão e/ou padrão de expressão detectada.
[021] Em algumas formas de realização, a condição médica é câncer. Por exemplo, o câncer é câncer de próstata. Em algumas formas de realização, o câncer é um câncer urogenital, por exemplo, um câncer de próstata, um câncer renal, um câncer de bexiga ou um câncer metastático que se propagou para os órgãos urogenitais. Em algumas formas de realização, o câncer é um câncer agressivo. Por exemplo, em algumas formas de realização, a condição médica é um câncer de próstata agressivo, um câncer renal agressivo ou um câncer de bexiga agressivo.
[022] O sujeito em necessidade do mesmo está sofrendo de ou em risco de sofrer de câncer, por exemplo, um câncer agressivo. Em algumas formas de realização, o sujeito está sofrendo de ou está em risco de sofrer de câncer de próstata. Em algumas formas de realização, o sujeito não está em risco de sofrer de câncer de próstata. Em algumas formas de realização, o sujeito tem câncer de próstata e foi determinado com um escore de Gleason particular. Por exemplo, em algumas formas de realização, o sujeito foi determinado com um escore de Gleason que é maior do que ou igual a 7. Em algumas formas de realização, o sujeito foi determinado com um escore de Gleason que é maior do que ou igual a 1,2, 3, 4, 5,
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6, 7, 8 ou 9. Em algumas formas de realização, o sujeito foi determinado com um escore de Gleason que está na faixa de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, a 3, 1 a 2, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, a 7, 5 a 6, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 10, 8 a 9 ou 9 a 10.
Em algumas formas de realização, o sujeito sofreu uma prostatectomia, por exemplo, uma prostatectomia radical ou está em risco de sofrer uma prostatectomia, por exemplo, uma prostatectomia radical.
[023] O sujeito é, por exemplo, um sujeito do sexo masculino com suspeita clínica para câncer de próstata, por exemplo, com base em um resultado de teste de PSA e/ou um DRE suspeito. Em algumas formas de realização, o sujeito apresenta um histórico clínico de biópsia negativa. Em algumas formas de realização, o sujeito não apresenta um histórico clínico de biópsia negativa. Em algumas formas de realização, o sujeito foi recomendado para uma repetição de biópsia. Em algumas formas de realização, o sujeito foi recomendado para uma biópsia inicial.
[024] Em algumas formas de realização, o sujeito foi recomendado ou programado para prostatectomia. Em algumas formas de realização, o sujeito apresenta câncer de próstata tipo acinar (isto é, típico) histologicamente confirmado. Em algumas formas de realização, o câncer de próstata é localizado. Em algumas formas de realização, o câncer de próstata é localmente avançado.
[025] Em algumas formas de realização, o sujeito não está sofrendo de, e/ou não está em suspeita de sofrer de uma doença, tal como uma doença infecciosa, por exemplo, hepatite (todos os tipos) e/ou HIV. Em algumas formas de realização, o sujeito não apresenta histórico de tumor renal e/ou de bexiga concorrente. Em algumas formas de realização, o sujeito não recebeu previamente ou não está recebendo concorrentemente qualquer forma de terapia neoadjuvante ou focal para câncer de próstata. Em algumas formas de realização, o sujeito não recebeu
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10/92 previamente ou não está recebendo concorrentemente qualquer forma de terapia neoadjuvante ou focal, incluindo terapia de derivação androgênica, dentro de seis meses do fornecimento da amostra de urina.
[026] Os marcadores e/ou combinações de marcadores descritos neste relatório são úteis em uma variedade de kits, por exemplo, um kit de diagnóstico que pode ser usado para testar amostras de urina a partir de diversos pacientes. Em algumas formas de realização, a amostra de urina é concentrada, por exemplo, usando uma etapa de concentração por filtração, antes de testar a amostra com o kit. Os resultados podem ser processados usando diversos métodos, incluindo aparelhos para leitura de qPCR rápida.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [027] As Figuras 1A e 1B são uma série de ilustrações esquemáticas que representam o fluxo de trabalho de laboratório para a análise as amostras da Coorte 7 de Paciente no Dia 1 (Figura 1 A) e Dia 2 (Figura 1B).
[028] A Figura 2A é um gráfico que representa a distribuição de densidade de valores Qbeta Ct detectados para 258 amostras da Coorte 7. O eixo Y representa a densidade e o eixo X representa o valor Ct.
[029] A Figura 2B é uma representação gráfica de caixa que mostra a distribuição de densidade de valores Qbeta Ct detectados para as 258 amostras da Coorte 7. O eixo X representa o valor Ct.
[030] As Figuras 3A e 3B são dois gráficos que representam a correlação de valores de PCA3 AUC quando normalizados para KLK3 ao volume de amostra para cada paciente na Coorte 7. Na Figura 3A, o eixo Y representa valores de AUC e o eixo X representa cada amostra na Coorte 7. Na Figura 3B, o eixo Y mostra o volume de amostra e o eixo X representa cada amostra na Coorte 7. A legenda designa os sítios clínicos onde cada amostra é originada. As Figuras 3A e 3B demonstram que PCA3 AUC (normalizada para KLK3) melhora de <0,65 para >0,7
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11/92 quando os volumes de doação são restritos apenas a 20 mL. Estas figuras demonstram que a AUC foi altamente dependente do volume de amostra.
[031] As Figuras 4A e 4B são dois gráficos que representam curvas ROC com base na análise normalizada para KLK3 (não imputada, Figura 4A) e PCA3 (Figura 4B) expressão análise de expressão de ERG normalizada para KLK3 com as amostras a partir da Coorte 7 de Paciente em que o volume de amostra foi menor do que ou igual a 100 mL (N=236). Nas duas figuras, o eixo X representa especificidade; o eixo Y representa sensibilidade.
[032] As Figuras 5A e 5B são dois gráficos que representam curvas ROC com base na análise de expressão de ERG normalizada para KLK3 (não imputada, Figura 5A) e análise de expressão de PCA3 (Figura 5B) normalizada para KLK3 com as amostras a partir da Coorte 7 de Paciente em que o volume de amostra foi menor do que ou igual a 40 mL (N = 189). Nas duas figuras, o eixo X representa especificidade; o eixo Y representa sensibilidade.
[033] As Figuras 6A e 6B são dois gráficos que representam curvas ROC com base na análise de expressão de ERG normalizada para KLK3 (não imputada, Figura 6A) e análise de expressão de PCA3 (Figura 6B) normalizada para KLK3 com as amostras a partir da Coorte 7 de Paciente em que o volume de amostra foi menor do que ou igual a 20 mL (N = 122). Nas duas figuras, o eixo X representa especificidade; o eixo Y representa sensibilidade.
[034] A Figura 7 é um gráfico que representa curvas ROC com base na análise de expressão de ERG e PCA3 normalizada para KLK3 com as amostras a partir da Coorte 7 de Paciente em que o volume de amostra foi menor do que ou igual a 100 mL (N = 236). A análise de expressão de ERG foi imputada. O eixo X representa especificidade; o eixo Y representa sensibilidade.
[035] A Figura 8 é um gráfico que representa curvas ROC com base na análise de expressão de ERG e PCA3 normalizada para KLK3 com as amostras a
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12/92 partir da Coorte 7 de Paciente em que o volume de amostra foi menor do que ou igual a 40 mL (N = 189). A análise de expressão de ERG foi imputada. O eixo X representa especificidade; o eixo Y representa sensibilidade.
[036] A Figura 9 é um gráfico que representa curvas ROC com base na análise de expressão de ERG e PCA3 normalizada para KLK3 com as amostras a partir da Coorte 7 de Paciente em que o volume de amostra foi menor do que ou igual a 20 mL (N = 122). A análise de expressão de ERG foi imputada. O eixo X representa especificidade; o eixo Y representa sensibilidade.
[037] A Figura 10 é uma série de quatro tabelas que mostram a análise 2x2 dos dados da Coorte 7 usando a fórmula pré-determinada e valores do limite de corte modelo que foram aplicados aos dados da Coorte 5 prévios. (Sens = sensibilidade; Spec = especificidade; NPV = valor preditivo negativo; PPV = valor preditivo positivo; C5 = Coorte 5; C7 = Coorte 7). Os pesos ajustados aos dados em C5 apresentaram desempenho satisfatório quando aplicados a C7, não obstante várias mudanças entre C5 e C7, tais como, por exemplo, protocolo de extração e química de sonda. Os volumes da coorte C5, em geral, foram menores do que em C6, com mais amostras do volume de 40 mL.
[038] A Figura 11 é um representação gráfica de caixa que mostra a distribuição de valores Ct para os genes detectados (AMACR, BIRC5, ERG, HOXC6, KLK3, PCA4, QBETA, SPARCL1 e SPDEF) em cada grupo de amostra (German pool = amostras de agrupamento controle, Pacientes = pacientes Coorte 7, Referência = controles de referência e RT-controles = transcriptase reversa controles).
[039] A Figura 12 é um gráfico que compara os valores de AUC gerada por análise univariada de cada um entre os genes indicados (PCA3, ERG, AMACR, BIRC5, HOXC6, SPARCL1 e SPDEF) em amostras de pequeno volume (20 mL) com os valores de AUC de todas as amostras. Cl todas e Cl 20 mL indica o Intervalo
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13/92 de Confiança de 95 % para as AUCs para “Todas as amostras” e “amostras de 20 mL”, respectivamente. O eixo Y representa os valores de AUC; o eixo X representa cada um entre os genes testados.
[040] A Figura 13 é um gráfico que mostra os valores de AUC gerada por análise univariada de cada um entre os genes indicados (AMACR, BIRC5, ERG, HOXC6, KLK3, PCA3, SPARCL1 e SPDEF) e compara os valores de AUC entre os seguintes subconjuntos: normalizados para SPDEF ou KLK3; imputados e normalizados para SPDEF ou KLK3; todos os volumes de amostra para amostras de baixo volume; e números de cópia para valores Ct.
[041] A Figura 14 é dois gráficos que mostram a comparação da análise da Coorte 5 (C5) e Coorte 7 (C7) através de três análises de gene. O gráfico da esquerda mostra a comparação de C5 com C7 para todas as amostras. O gráfico da direita mostra a comparação de C5 com C7 para amostras de baixo volume. FTO = 3 modelos de gene que não usa PCA3. FTO se refere a 3 modelos de gene que não usam PCA3.
[042] A Figura 15 é um gráfico que mostra os valores de AUC gerada por análise de 3 modelos de gene da combinação indicada dos seguintes genes: AMACR, BIRC5, ERG, HOXC6, KLK3, PCA3, SPARCL1 e SPDEF; e compara os valores de AUC entre os seguintes subconjuntos: normalizados para SPDEF ou KLK3; imputados e normalizados para SPDEF ou KLK3; todos os volumes de amostras para amostras de baixo volume; e números de cópia para valores Ct.
[043] A Figura 16 é um gráfico que representa uma distribuição de Escore de EXO106 exemplar em uma coorte de paciente onde n = 453 amostras, média PSA = 5,3 ng/mL e 80 % das amostras 2 < PSA < 10 ng/mL.
[044] A Figura 17 é um gráfico que representa a AUC para Desempenho de EXO106 em pacientes com qualquer escore de Gleason em comparação à AUC para padrão de tratamento (SOC).
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14/92 [045] As Figuras 18A e 18B são uma série de gráficos que representam o desempenho de EXO106 por quartil, isto é, a porcentagem de amostras identificadas como positivas por biópsia através de quartil de escore de EXO106.
[046] A Figura 19 é um gráfico que representa o desempenho do Escore de EXO106 para câncer de próstata alto grau, por exemplo, um escore de Gleason maior do que 6.
[047] A Figura 20 é um gráfico que representa uma quebra do desempenho de Escore de EXO106 com base nos subgrupos de escore de Gleason.
DESCRIÇÃO DETALHADA [048] Os biomarcadores relacionados ao câncer incluem, por exemplo, mutações específicas nas sequências de gene (Cortez e Calin, 2009; Diehl et al., 2008; Network, 2008; Parsons et al., 2008), supra e infrarregulação de mRNA e expressão de miRNA (Cortez e Calin, 2009; Itadani et al., 2008; Novakova et al., 2009), variações de splicing de mRNA, mudanças nos padrões de metilação de DNA (Cadieux et al., 2006; Kristensen e Hansen, 2009), amplificação e deleção de regiões genômicas (Cowell e Lo, 2009) e expressão anormal de sequências de DNA repetidas (Ting et al., 2011). Vários ensaios de diagnóstico molecular, tais como análise mutacional, estado de metilação de DNA genômico e análise de expressão gênica podem detectar estes biomarcadores e produzem informação valiosa para pacientes, médicos e pesquisadores. Até o momento, estes ensaios primeiramente foram realizados em células de câncer derivadas de tecido de tumor cirurgicamente removido ou a partir de tecido obtido por biópsia. Por exemplo, PCA3, TMPRSS2:ERG e ERG foram previamente mostrados através de análise de biópsia, os quais são diferencialmente expressados no câncer de próstata em comparação aos tecidos de próstata normais (Bussemakers et al., 1999; Petrovics et al., 2005; Tomlins et al., 2005).
[049] Entretanto, a capacidade de realizar estes testes usando uma amostra
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15/92 de fluido corpóreo é muitas vezes mais desejável do que o uso de uma amostra de tecido do paciente. Um método menos invasivo usando uma amostra de fluido corpóreo tem implicações variadas em termos de bem-estar do paciente, da capacidade de conduzir monitoramento de doença longitudinal e da capacidade de obter perfis de expressão mesmo quando as células de tecido não são facilmente acessíveis, por exemplo, na glândula da próstata.
[050] A detecção de marcadores de câncer de próstata, tais como PSA (também chamado KLK3), PCA3, TMPRSS2:ERG, e ERG usando amostras de urina foi previamente investigada (Hessels etal., 2007; Laxman etal., 2008; Laxman etal., 2006; Nguyen etal., 2011; Rice etal., 2010; Rostad etal., 2009; Salami etal., 2011; Tomlins et al., 2005). Entretanto, os métodos de coleta de amostra previamente divulgados exigiram um exame retal digital (DRE) ou massagem da próstata para permitir que fluido celular derivado da próstata suficiente entre na urina. As amostras coletadas sem DRE ou massagem da próstata mostraram uma taxa de detecção menor destes biomarcadores. Por exemplo, a taxa de detecção para TMPRSS2:ERG foi de cerca de 69 % com DRE, mas apenas cerca de 24 % sem DRE (Rostad etal., 2009).
[051] De fato, métodos de coleta de amostra atuais para análise de urina de biomarcadores de câncer de próstata exigem o uso de um DRE com uma aplicação sistemática de pressão digital suave sobre a superfície apalpada total da próstata, pressão digital à próstata com 3 varreduras de cada lobo lateral, pressão firme à próstata a partir da base ao ápice e a partir da lateral à linha mediana de cada lobo, ou pressão firme à próstata a partir da base ao ápice e a partir da lateral à linha mediana (onde a depressão da superfície da próstata se apresentou entre 0,5 a 1 cm) de cada lobo três vezes (Deras et al., 2008; Hessels et al., 2007; Laxman etal., 2008; Laxman et al., 2006; Nguyen et al., 2011; Rice et al., 2010; Salami et al., 2011).
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16/92 [052] Além disso, os métodos de preparação da amostra previamente divulgados exigem o isolamento de pelotas celulares a partir da amostra de urina pós-DRE através de centrifugação (Hessels et al., 2007; Laxman et al., 2008; Laxman et al., 2006; Nguyen et al., 2011; Rostad et al., 2009; Salami et al., 2011).
[053] Muitos estudos anteriores sugerem que um DRE é uma etapa crítica para permitir que material de RNA suficiente seja coletado para análise de gene da próstata não invasivo (Deras et al., 2008; Hessels et al., 2007; Laxman et al., 2008; Laxman et al., 2006; Nguyen et al., 2011; Rice et al., 2010; Rostad et al., 2009; Salami et al., 2011; Tomlins et al., 2011). Em alguns destes estudos, as amostras de urina são exigidas, as quais são processadas dentro de 4 horas da coleta (Deras et al., 2008; Tomlins etal., 2011).
[054] Ao contrário destes métodos de coleta de amostra prévia e detecção de biomarcador urinário, os métodos fornecidos neste relatório não exigem um DRE ou massagem da próstata antes da coleta de amostra de urina, nem estes métodos exigem uma etapa de preparação de amostra que envolve o isolamento de uma pelota celular a partir das amostras de urina. Estes novos métodos não invasivos usam microvesículas urinárias para detectar biomarcadores no auxílio de diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia para uma doença ou outra condição médica da glândula da próstata. As microvesículas liberadas por células de tumor podem ser usadas para determinar o estado genético do tumor (Skog et al., 2008). Veja também o WO 2009/100029, WO 2011/009104, WO 2011 /031892 e WO 2011 /031877.
[055] As microvesículas são desprendidas por célula eucarióticas ou são derivadas da membrana do plasma para o exterior da célula. Estas vesículas de membrana são heterogêneas em tamanho com diâmetros que variam de cerca de 10 nm a cerca de 5000 nm. Todas as vesículas de membrana desprendidas por células que são menores do que 0,8 pm em diâmetro são referidas neste relatório
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17/92 coletivamente como “microvesículas”.
[056] A presente invenção é fundamentada na descoberta surpreendente de que as microvesículas de urina contêm biomarcadores para uma doença ou outra condição médica da glândula da próstata em um sujeito. Assim, uma amostra de urina do paciente pode ser avaliada para a detecção de biomarcadores para uma doença ou outra condição médica da glândula da próstata em um sujeito.
[057] Nos métodos fornecidos neste relatório, as amostras de urina aleatórias a partir de sujeitos são coletadas sem o uso de um exame retal digital (DRE) ou massagem prostática antes da coleta de urina. As amostras de urina são de 60 mL, 50 mL, 40 mL, 30 mL, 20 mL, 15 mL ou 10 mL. Em algumas formas de realização preferidas, as amostras de urina são de 40 mL ou 20 mL. Em algumas formas de realização, as amostras de urina podem ser de 1 a 40 mL, 1 a 35 mL, 1 a 30 mL, 1 a 25 mL, 1 a 20 mL, 1 a 15 mL, 1 a 10 mL, 1 a 5 mL, 5 a 40 mL, 5 a 35 mL, 5 a 30 mL, 5 a 25 mL, 5 a 20 mL, 5 a 15 mL, 5 a 10 mL, 10 a 40 mL, 10 a 35 mL, 10 a 30 mL, 10 a 25 mL, 10 a 20 mL, 10 a 15 mL, 15 a 40 mL, 15 a 35 mL, 15 a 30 mL, 15 a 25 mL, 15 a 20 mL, 20 a 40 mL, 20 a 35 mL, 20 a 30 mL, 20 a 25 mL, 25 a 40 mL, 25 a 35 mL, 25 a 30 mL, 30 a 40 mL, 30 a 35 mL ou 35 a 40 mL.
[058] Em uma forma de realização preferida, a amostra de urina é a urina que é primeiro esvaziada a partir da bexiga, também conhecida como “primeira urina coletada”. A primeira urina esvaziada contém a concentração mais alta de microvesículas derivadas da próstata e, portanto, a análise da primeira urina esvaziada fornece sinal mais alto a partir dos biomarcadores da próstata. Conforme mostrado neste relatório, a precisão de diagnóstico de biomarcadores úteis no diagnóstico e prognóstico de câncer de próstata aumenta conforme o volume de amostra da primeira amostra de urina esvaziada é diminuído. As descobertas descritas neste relatório demonstram que 40 mL ou 20 mL da primeira urina esvaziada exibem maior precisão de diagnóstico (isto é, valores de AUC).
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Consequentemente, em uma forma de realização preferida, as amostras de urina são os primeiros 40 mL ou menos esvaziados a partir da bexiga. Por exemplo, as amostras de urina são os primeiros 20 mL esvaziados a partir da bexiga.
[059] As amostras de urina que não são adequadas para o uso nos kits e/ou métodos da divulgação incluem amostras onde a amostra não foi corretamente armazenada e/ou transportada. Por exemplo, as amostras não devem ser mantidas na temperatura ambiente (por exemplo, 15 a 25 °C) durante períodos de tempo prolongados. Em algumas formas de realização, as amostras não devem ser mantidas na temperatura ambiente (por exemplo, 15 a 25 °C) durante mais do que 24 horas. Em algumas formas de realização, as amostras não devem ser mantidas na temperatura ambiente (por exemplo, 15 a 25 °C) durante mais do que 36 horas. Em algumas formas de realização, as amostras não devem ser mantidas na temperatura ambiente (por exemplo, 15 a 25 °C) durante mais do que 48 horas. As amostras não devem ser mantidas em uma temperatura refrigerada (por exemplo, 2 a 8 °C) durante períodos de tempo prolongados. Por exemplo, as amostras não devem ser mantidas em uma temperatura refrigerada (por exemplo, 2 a 8 °C) durante mais do que 21 dias. Em algumas formas de realização, as amostras não devem ser mantidas em uma temperatura refrigerada (por exemplo, 2 a 8 °C) durante mais do que 30 dias. Tipicamente, as amostras podem ser congeladas (por exemplo, < 70 °C) indefinidamente. As amostras devem ser transportadas em pacotes gelados ou em gelo seco se a amostra for congelada.
[060] As amostras de urina que não são adequadas para o uso nos kits e/ou métodos da divulgação incluem amostras excessivamente hemorrágicas.
[061] O momento para a coleta das amostras de urina também pode variar dependendo de aplicações diferentes. Uma amostra pode ser coletada em qualquer momento como uma amostra de urina local. A urina local pode ser suficiente para análises de biomarcador quando a quantidade de biomarcador nas microvesículas
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19/92 que será analisada não flutua muito durante o dia. Em outros casos, uma amostra de urina de 24 horas é coletada quando existe flutuação da quantidade do biomarcador nas microvesículas que serão analisadas e uma coleta de 24 horas podem mitigar o efeito de flutuação. Ainda em outros casos, uma série de amostras de urina é coletada para estudar a flutuação da quantidade de biomarcadores nas microvesículas. A série de coletas pode ser realizada em um determinado intervalo de tempo, por exemplo, a cada 6 horas, ou em um intervalo de cenário, por exemplo, antes e depois de uma intervenção terapêutica.
[062] Nos métodos fornecidos neste relatório, as amostras de urina são primeiro pré-processadas através do uso de um método compreendendo pelo menos uma etapa de filtração. Por exemplo, um filtro grosseiro (0,8 micron) é utilizado para remover células e resíduos celulares. Esta filtração pode ser acompanhada por uma etapa de ultrafiltração para remover solvente e pequenos análitos de molécula, embora conservando as microvesículas. Os filtros usados na filtração inicial podem ser de qualquer tamanho que é suficiente para remover as células e resíduos celulares, por exemplo, qualquer tamanho maior do que 0,22 micron. Para isolar as microvesículas de urina, as amostras pré-processadas depois são submetidas a uma etapa de concentração por filtração, em que um filtro que apresenta um corte de peso molecular é utilizado para reter e concentrar as microvesículas que são maiores do que 10 nm em diâmetro. Por exemplo, a amostra depois é concentrada a um volume menor do que 1 mL, preferivelmente, 100 a 200 pL. Por exemplo, o corte de peso molecular é de pelo menos 100 kDa.
[063] Em algumas formas de realização, o método para pré-processar e processar uma amostra de urina inclui as seguintes etapas. Primeiro, uma porção da amostra de urina, por exemplo, pelo menos 20 mL, é processada usando um filtro de 0,8 pm. Por exemplo, quando o volume de amostra é < 50 mL, pelo menos 20 mL são extraídos em uma seringa que é fixada a um filtro de 0,8 pm e depois
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20/92 expressado em um vaso limpo, por exemplo, um tubo de 50 mL limpo. Quando o volume de urina da amostra é > 50 mL, a amostra é filtrada usando uma unidade de filtro de frasco de 0,8 pm e, em algumas formas de realização, sucção é usada para extrair a amostra através da unidade de filtro de frasco. Em seguida, independentemente do volume de amostra inicial, a urina filtrada no vaso limpo depois é submetida a vórtex de pulso durante alguns segundos, por exemplo, 1 a 2 segundos. A urina filtrada depois é armazenada até que a concentração do filtrado esteja pronta para começar.
[064] Uma porção da urina filtrada, por exemplo, 15 mL, depois é processada usando um concentrador de filtro (FC). Uma vez que a urina filtrada é pipetada na câmara de FC (isto é, a câmara de topo do vaso de FC), um controle interno, por exemplo, um controle interno de bacteriófago Qbeta (Attostar, Catálogo #BAC200), pode ser adicionado na concentração apropriada. O vaso de FC depois é centrifugado, por exemplo, em uma centrífuga de rotor de caçamba móvel, e girado durante 5 minutos em 4.500 x g na temperatura ambiente (por exemplo, 20 a 25 °C). Se a amostra falha completamente na filtração (>500 pL de retentato remanescente no FC), então o FC deve ser novamente centrifugado durante 2 a 5 minutos. As amostras que mostram sinais mínimos de filtração (>10 mL de retentato remanescente no FC) devem ser descartadas.
[065] A amostra depois é removida da centrífuga e o filtrado (isto é, o fluido no fundo do vaso de FC) é descartado. O retentato depois é recolocado em suspensão com 5 mL da urina filtrada remanescente e PBS 10 mL 1X. A amostra é uniformemente misturada, por exemplo, invertendo o vaso de FC 3 a 4 vezes. O vaso de FC depois é centrifugado, por exemplo, em uma centrífuga de rotor de caçamba móvel, e girado durante 5 minutos em 4.500 x g na temperatura ambiente (por exemplo, 20 a 25 °C). A amostra depois é removida da centrífuga e o filtrado é descartado.
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21/92 [066] Na primeira etapa de lavagem, o retentato é recolocado em suspensão em PBS 15 mL 1X. A amostra é uniformemente misturada, por exemplo, invertendo o vaso de FC 3 a 4 vezes. O vaso de FC depois é centrifugado, por exemplo, em uma centrífuga de rotor de caçamba móvel, e girado durante 5 minutos em 4.500 x g na temperatura ambiente (por exemplo, 20 a 25 °C).
[067] Na segunda etapa de lavagem, o retentato é recolocado em suspensão em PBS 15 mL 1X. A amostra é uniformemente misturada, por exemplo, invertendo o vaso de FC 3 a 4 vezes. O vaso de FC depois é centrifugado, por exemplo, em uma centrífuga de rotor de caçamba móvel, e girado durante 7 minutos em 4.500 x g na temperatura ambiente (por exemplo, 20 a 25 °C). O volume de retenção esperado é de 100 a 200 pL. Se o volume de amostra é maior do que 250 pL, então o vaso de FC é centrifugado durante 5 minutos adicionais em 4,500 x g na temperatura ambiente.
[068] Depois do isolamento e concentração das microvesículas de urina, as amostras são pré-tratadas com um inibidor de RNase, antes da extração de ácido nucléico, para prevenir a digestão de RNA extraído e realçar a qualidade da extração. Opcionalmente, as amostras podem ser lavadas pelo menos uma vez usando o tampão apropriado para ainda enriquecer ou purificar a fração de microvesícula. Em algumas formas de realização, as amostras são lavadas duas vezes usando o tampão apropriado para ainda enriquecer ou purificar a fração de microvesícula. O RNA é extraído das microvesículas através de um método compreendendo lise das microvesículas, processamento do lisato através de uma coluna de ligação ao RNA, e eluição do RNA a partir da coluna de ligação ao RNA, sob condições apropriadas designadas para obter preparações de RNA de alta qualidade. Opcionalmente, as microvesículas concentradas são lisadas sobre o filtro usado na etapa de pré-processamento. Estas preparações de RNA de alta qualidade fornecem diagnósticos moleculares com base em urina para câncer de próstata e
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22/92 outros transtornos da próstata.
[069] Em algumas formas de realização, 4 μΙ_ de um Inibidor de RNase são adicionados à câmara superior do vaso de FC. O vaso depois é agitado lateralmente para garantir que o inibidor de RNase seja satisfatoriamente colocado em suspensão. A amostra depois é incubada com o Inibidor de RNase durante 2 a 3 minutos na temperatura ambiente (por exemplo, 15 a 25 °C). Um tampão de lise de RNA, por exemplo, Tampão de Lise de RNA Promega (Catálogo #Z3051) contendo 1 -triglicerol a 2 % depois é adicionado em um volume de 250 μΙ a cada amostra. A amostra depois é brevemente submetida a vórtex e incubada na temperatura ambiente durante 1 minuto.
[070] Uma pipeta depois é colocada no fundo do vaso de FC (com cuidado para não tocar ou arranhar os lados do vaso ou do filtro) e 150 μΙ de solução (isto é, amostra + inibidor de RNase) são transferidos para um tubo livre de RNase de 2 mL. Esta etapa é repetida até que toda a amostra tenha sido removida e transferida para o tubo livre de RNase de 2 mL. A fração de microvesícula isolada depois está pronta para a extração de ácido nucléico, por exemplo, extração de RNA.
[071] Isopropanol depois é adicionado ao tubo de 2 mL em um volume de 150 μΙ e a solução é misturada por pipeta. O lisato é transferido para a coluna de extração e a coluna de extração é centrifugada durante 30 segundos em 13.000 x g. A coluna de extração depois é transferida para um novo tubo de coleta e a centrífuga durante 30 segundos 13.000 x g e a transferência a partir da coluna de extração para o novo tubo de coleta é repetida até que todo o lisato tenha sido transferido. A Solução de Lavagem de RNA (Tampão RWA) a partir da Promega (Catálogo #Z309B-C) depois é adicionada em um volume de 500 μΙ ao tubo de coleta e o tubo é centrifugado durante 30 segundos em 13.000 x g. A amostra depois é transferida para um novo tubo de coleta, 300 μΙ de Tampão RWA são adicionados ao tubo de coleta e o tubo de coleta depois é centrifugado durante 2
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23/92 minutos em 13.000 x g. A amostra depois é transferida para um novo tubo de coleta e o tubo de coleta depois é centrifugado durante 2 minutos em 13.000 x g. Os conteúdos do tubo de coleta depois são transferidos para um tubo Eppendorf® de 1,5 mL que é livre de RNase DNase. Os conteúdos do tubo depois são eluídos usando 16 pl de água livre de nuclease, por exemplo, Água Livre de Nuclease Promega (Catálogo #P119E) e centrifugados durante 1 minuto em 13.000 x g.
[072] O RNA extraído a partir da fração de microvesícula depois pode ser armazenado a < -70 °C em um congelador ultra-baixo.
[073] Os métodos descritos neste relatório podem incluir o uso de um partícula controle para determinar ou avaliar a qualidade do isolamento da microvesícula e/ou extração de ácido nucléico da microvesícula. Partículas controle coletivamente se referem às partículas da faixa de tamanho das microvesículas que são adicionadas em algum ponto durante o processo de isolamento da microvesícula ou extração de ácido nucléico, em que as partículas contêm ácidos nucleicos controle, tais como DNA ou RNA. Especificamente, os ácidos nucleicos controle compreendem pelo menos um gene alvo que será avaliado ou medido para determinar a quantidade de recuperação da partícula controle durante o processo de isolamento ou extração.
[074] Preferivelmente, a partícula controle é um bacteriófago Q-beta, referido neste relatório como “partícula Q-beta”. A partícula Q-beta usada nos métodos descritos neste relatório pode ser uma partícula de vírus de ocorrência natural ou pode ser um vírus recombinante ou construído, em que pelo menos um componente da partícula de vírus (por exemplo, uma porção do genoma ou proteína de revestimento) é sintetizado por técnicas de DNA recombinante ou biologia molecular conhecidas no ramo. Q-beta é um membro da família leviviridae, caracterizada por um genoma de RNA linear de fita única que consiste de 3 genes que codificam quatro proteínas virais: uma proteína de revestimento, uma proteína de maturação,
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24/92 uma proteína de lise e RNA replicase. Devido ao seu tamanho similar às microvesículas médias, Q-beta pode ser facilmente purificada a partir de uma amostra biológica usando os mesmos métodos de purificação usados para isolar as microvesículas, conforme descrito neste relatório. Além disso, a baixa complexidade da estrutura do gene de fita única viral Q-beta é vantajosa para seu uso como um controle nos ensaios de ácido nucléico com base na amplificação. A partícula Q-beta contém um gene alvo controle ou sequência alvo controle que será detectado ou medido para a quantificação da quantidade de partícula Q-beta em uma amostra. Por exemplo, o gene alvo controle é o gene da proteína de revestimento Q-beta. Depois da adição das partículas de Q-beta à amostra de urina ou microvesículas derivadas de urina isolada, os ácidos nucléicos a partir da partícula Q-beta são extraídos junto com os ácidos nucléicos a partir das microvesículas e/ou amostra de urina usando os métodos de extração descritos neste relatório. A detecção do gene alvo controle Q-beta pode ser determinada por análise RT-PCR, por exemplo, simultaneamente com os biomarcadores de interesse (isto é, BIRC5, ERG e SPARCL1). Uma curva padrão de pelo menos 2, 3 ou 4 concentrações conhecidas em diluição 10 vezes de um gene alvo controle pode ser usada para determinar um número de cópias. O número de cópias detectado e a quantidade de partícula Qbeta adicionada podem ser comparados para determinar a qualidade do processo de isolamento e/ou extração.
[075] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação usam uma partícula Q-beta que inclui pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo
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25/92 menos 500 nucleotldeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 1: AAACGGTTCTTGTGACCCATCCGTTACTCGCCAGGCATATGCTGACGTGACCTT TTCGTTCACGCAGTATAGTACCGATGAGGAACGAGCTTTTGTTCGTACAGAGCT TGCTGCTCTGCTCGCTAGTCCTAGCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAGATTCTTG GACCAACAAGTAGCCGCCTTGCAAATCCAGGCAGTGGCCAGATCCAGCTTTGG CAGTTCCTCCTGGAGCTCCTGTCGGACAGCTCCCGGTCGGATGTGCTGCTGGA GCCCTTCCGCCGCGGTGTCATGGAGAAACTCCAGCTGGGCCCAGAGATTCTGC AGCGGGAAAACCTGTCCGTGACGTGGATTGGTGCTGCACCCCTCATCCTGTCT CGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGTGCT TGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGT GGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGT CGGCACAGC (SEQ ID NO: 1) [076] Em algumas formas de realização, as partículas de Q-beta são adicionadas à amostra de urina antes da extração de ácido nucléico. Por exemplo, as partículas de Q-beta são adicionadas à amostra de urina antes da ultrafiltração e/ou depois da etapa de pré-filtração.
[077] Em algumas formas de realização, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1.000 ou 5.000 cópias de partículas de Q-beta são adicionadas a uma amostra de urina. Em algumas formas de realização, 100 cópias de partículas de Q-beta são adicionadas a uma amostra de urina. O número de cópias de partículas de Q-beta pode ser calculado com base na capacidade de o bacteriófago Q-beta infectar as células alvo. Assim, o número de cópias de partículas de Q-beta está correlacionado às unidades formadoras de colônia do bacteriófago Q-beta.
[078] Os métodos fornecidos neste relatório são úteis em sujeitos com suspeita de câncer de próstata, por exemplo, devido a um PSA elevado, DRE suspeito ou qualquer outra técnica reconhecida no ramo para diagnóstico de câncer
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26/92 de próstata. Em algumas formas de realização, os métodos fornecidos neste relatório são úteis em sujeitos que não apresentaram qualquer teste de diagnóstico anterior, tal como teste de PSA, DRE, ou qualquer outra técnica reconhecida no ramo para diagnóstico de câncer de próstata.
[079] Os métodos fornecidos neste relatório demonstram a associação de biomarcadores em microvesículas de urina com a descoberta de câncer de próstata, conforme determinado por uma biópsia da próstata. A biópsia da próstata é o padrão corrente para o diagnóstico de câncer de próstata, mas os riscos associados com a biópsia da próstata são significantes, especialmente quando se considera que um milhão de biópsias são realizadas nos Estados Unidos, anualmente. Dor, hemorragia, retenção urinária e infecções do trato urinário não são incomuns e sérias infecções potencialmente letais também podem ocorrer.
[080] Os métodos descritos neste relatório fornecem métodos da análise não invasiva dos níveis de expressão de RNA de transcritos associados ao câncer em amostras de urina ou microvesículas urinárias. Em particular, os métodos são usados para detectar a expressão de mRNA de pelo menos PCA3 e ERG em amostras de urina. mRNAs de ERG podem incluir uma ou mais isoformas de ERG e incluem ERG1, ERG2, ERG3, ERG4, ERG5, ERG6, ERG7, ERG8, ERG9, Isoforma 1 específica do câncer de próstata ERG (EPC1) e Isoforma 2 específica do câncer de próstata ERG (EPC2). Conforme demonstrado neste relatório, a detecção dos níveis de expressão de PCA3 e ERG em microvesículas urinárias fornece sensibilidade e especificidade excelentes como biomarcadores de câncer de próstata e outros transtornos relacionados à próstata em sujeitos que sofreram previamente uma biópsia da próstata (referida neste relatório como a coorte de biópsia ou coorte de paciente). Em algumas formas de realização, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais biomarcadores são detectados em combinação.
[081] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação
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27/92 são usados para detectar mRNA de ERG que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos e/ou pelo menos 250 nucleotídeos ou mais da seguinte sequência de ácidos nucleicos: CAGTCGAAAGCTGCTCAACCATCTCCTTCCACAGTGCCCAAAACTGAAGACCAG CGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAGATTCTTGGACCAACAAGTAGCCGCCTTGCA AATCCAGGCAGTGGCCAGATCCAGCTTTGGCAGTTCCTCCTGGAGCTCCTGTC GGACAGCTCCAACTCCAGCTGCATCACCTGGGAAGGCACCAACGGGGAGTTCA AGATGACGGATCCCGACGAGGTGGCCCGGCGCTGGGGAGAGCGGAAGAGCAA ACCCAACATGAACTACGATAAGCTCAGCCGCGCC (SEQ ID NO: 2) [082] Conforme mostrado neste relatório, PCA3 e ERG foram analisados através de análise univariada e demonstraram que cada gene sozinho (quando normalizado para um gene de referência, tal como KLK3) apresentou alta precisão de diagnóstico (valores de AUC maiores do que 0,6). A análise divulgada neste relatório mostra que PCA3 e ERG apresentaram valor mais diagnóstico quando o nível de expressão normalizado de ambos foi determinado em conjunto e não sozinho.
[083] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar mRNA de PCA3 que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos e/ou pelo menos 450 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos de
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GGGAGACGAAUUGGGCCCUCUAGAUGCAUGCUCGAGCGGCCGCCAGUGUGA UGGAUAUCUGCAGAAUUCGCCCUUAUUGUCUCCUCAGUGACACAGGGCUGGA UCACCAUCGACGGCACUUUCUGAGUACUCAGUGCAGCAAAGAAAGACUACAG ACAUCUCAAUGGCAGGGGUGAGAAAUAAGAAAGGCUGCUGACUUUACCAUCU GAGGCCACACAUCUGCUGAAAUGGAGAUAAUUAACAUCACUAGAAACAGCAAG AUGACAAUAUAAUGUCUAAGUAGUGACAUGUUUUUGCACAUUUCCAGCCCCU UUAAAUAUCCACACACACAGGAAGCACAAAAGGAAGCACAGAGAUCCCUGGGA GAAAUGCCCGGCCACCUGCGGCCGCAAGCUUGGAUCCGAAUUCCUGUGUGAA AUUGUUAUCCGCUCACAAUUCCACACAACAUACGAGCCGGAAGCAUAAAGUGU AAAGCCUGGGGUGCCUAAUGA (SEQ ID NO: 3) [084] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar o mRNA de ERG que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos e/ou pelo menos 250 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO: 2 e mRNA de PCA3 que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos e/ou pelo menos 450 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO: 3.
[085] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar o mRNA de ERG que apresenta a sequência de ácidos nucléicos de comprimento total da SEQ ID NO: 2 e o mRNA de PCA3 que apresenta a sequência de ácidos nucléicos de comprimento total da SEQ ID NO: 3.
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29/92 [086] Combinações de biomarcador adicionais podem ser usadas com PCA3 e ERG, em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais genes adicionais podem apresentar alto valor diagnóstico como biomarcadores para câncer, tal como cânceres agressivos ou câncer de próstata. Exemplos destes genes adicionais incluem AMACR, BIRC5, HOXC6 e SPARCL1.
[087] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar o mRNA de AMACR que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38:
AMACR Humano, variante do transcrito 1, mRNA (SEQ ID NO: 4) GGGGCGTGGCGCCGGGGATTGGGAGGGCTTCTTGCAGGCTGCTGGGCTGGG GCTAAGGGCTGCTCAGTTTCCTTCAGCGGGGCACTGGGAAGCGCCATGGCACT GCAGGGCATCTCGGTCGTGGAGCTGTCCGGCCTGGCCCCGGGCCCGTTCTGT GCTATGGTCCTGGCTGACTTCGGGGCGCGTGTGGTACGCGTGGACCGGCCCG GCTCCCGCTACGACGTGAGCCGCTTGGGCCGGGGCAAGCGCTCGCTAGTGCT GGACCTGAAGCAGCCGCGGGGAGCCGCCGTGCTGCGGCGTCTGTGCAAGCGG TCGGATGTGCTGCTGGAGCCCTTCCGCCGCGGTGTCATGGAGAAACTCCAGCT GGGCCCAGAGATTCTGCAGCGGGAAAATCCAAGGCTTATTTATGCCAGGCTGA GTGGATTTGGCCAGTCAGGAAGCTTCTGCCGGTTAGCTGGCCACGATATCAACT ATTTGGCTTTGTCAGGTGTTCTCTCAAAAATTGGCAGAAGTGGTGAGAATCCGTA TGCCCCGCTGAATCTCCTGGCTGACTTTGCTGGTGGTGGCCTTATGTGTGCACT GGGCATTATAATGGCTCTTTTTGACCGCACACGCACTGGCAAGGGTCAGGTCAT
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TGATGCAAATATGGTGGAAGGAACAGCATATTTAAGTTCTTTTCTGTGGAAAACT CAGAAATTGAGTCTGTGGGAAGCACCTCGAGGACAGAACATGTTGGATGGTGG AGCACCTTTCTATACGACTTACAGGACAGCAGATGGGGAATTCATGGCTGTTGG AGCAATAGAACCCCAGTTCTACGAGCTGCTGATCAAAGGACTTGGACTAAAGTC TGATGAACTTCCCAATCAGATGAGCATGGATGATTGGCCAGAAATGAAGAAGAA GTTTGCAGATGTATTTGCAGAGAAGACGAAGGCAGAGTGGTGTCAAATCTTTGA CGGCACAGATGCCTGTGTGACTCCGGTTCTGACTTTTGAGGAGGTTGTTCATCA TGATCACAACAAGGAACGGGGCTCGTTTATCACCAGTGAGGAGCAGGACGTGA GCCCCCGCCCTGCACCTCTGCTGTTAAACACCCCAGCCATCCCTTCTTTCAAAA GGGATCCTTTCATAGGAGAACACACTGAGGAGATACTTGAAGAATTTGGATTCA GCCGCGAAGAGATTTATCAGCTTAACTCAGATAAAATCATTGAAAGTAATAAGGT AAAAGCTAGTCTCTAACTTCCAGGCCCACGGCTCAAGTGAATTTGAATACTGCAT TTACAGTGTAGAGTAACACATAACATTGTATGCATGGAAACATGGAGGAACAGTA TTACAGTGTCCTACCACTCTAATCAAGAAAAGAATTACAGACTCTGATTCTACAG TGATGATTGAATTCTAAAAATGGTTATCATTAGGGCTTTTGATTTATAAAACTTTG GGTACTTATACTAAATTATGGTAGTTATTCTGCCTTCCAGTTTGCTTGATATATTT GTTGATATTAAGATTCTTGACTTATATTTTGAATGGGTTCTAGTGAAAAAGGAATG ATATATTCTTGAAGACATCGATATACATTTATTTACACTCTTGATTCTACAATGTA GAAAATGAGGAAATGCCACAAATTGTATGGTGATAAAAGTCACGTGAAACAGAG TGATTGGTTGCATCCAGGCCTTTTGTCTTGGTGTTCATGATCTCCCTCTAAGCAC ATTCCAAACTTTAGCAACAGTTATCACACTTTGTAATTTGCAAAGAAAAGTTTCAC CTGTATTGAATCAGAATGCCTTCAACTGAAAAAAACATATCCAAAATAATGAGGA AATGTGTTGGCTCACTACGTAGAGTCCAGAGGGACAGTCAGTTTTAGGGTTGCC TGTATCCAGTAACTCGGGGCCTGTTTCCCCGTGGGTCTCTGGGCTGTCAGCTTT CCTTTCTCCATGTGTTTGATTTCTCCTCAGGCTGGTAGCAAGTTCTGGATCTTAT ACCCAACACACAGCAACATCCAGAAATAAAGATCTCAGGACCCCCCAGCAAGTC GTTTTGTGTCTCCTTGGACTGAGTTAAGTTACAAGCCTTTCTTATACCTGTCTTTG
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ACAAAGAAGACGGGATTGTCTTTACATAAAACCAGCCTGCTCCTGGAGCTTCCC TGGACTCAACTTCCTAAAGGCATGTGAGGAAGGGGTAGATTCCACAATCTAATC CGGGTGCCATCAGAGTAGAGGGAGTAGAGAATGGATGTTGGGTAGGCCATCAA TAAGGTCCATTCTGCGCAGTATCTCAACTGCCGTTCAACAATCGCAAGAGGAAG GTGGAGCAGGTTTCTTCATCTTACAGTTGAGAAAACAGAGACTCAGAAGGGCTT CTTAGTTCATGTTTCCCTTAGCGCCTCAGTGATTTTTTCATGGTGGCTTAGGCCA AAAGAAATATCTAACCATTCAATTTATAAATAATTAGGTCCCCAACGAATTAAATA TTATGTCCTACCAACTTATTAGCTGCTTGAAAAATATAATACACATAAATAAAAAA ATATATTTTTCATTTCTATTTCATTGTTAATCACAACTACTTACTAAGGAGATGTAT GCACCTATTGGACACTGTGCAACTTCTCACCTGGAATGAGATTGGACACTGCTG CCCTCATTTTCTGCTCCATGTTGGTGTCCATATAGTACTTGATTTTTTATCAGATG GCCTGGAAAACCCAGTCTCACAAAAATATGAAATTATCAGAAGGATTATAGTGCA ATCTTATGTTGAAAGAATGAACTACCTCACTAGTAGTTCACGTGATGTCTGACAG ATGTTGAGTTTCATTGTGTTTGTGTGTTCAAATTTTTAAATATTCTGAGATACTCTT GTGAGGTCACTCTAATGCCCTGGGTGCCTTGGCACAGTTTTAGAAATACCAGTT GAAAATATTTGCTCAGGAATATGCAACTAGGAAGGGGCAGAATCAGAATTTAAG CTTTCATATTCTAGCCTTCAGTCTTGTTCTTCAACCATTTTTAGGAACTTTCCCAT AAGGTTATGTTTTCCAGCCCAGGCATGGAGGATCACTTGAGGCCAAGAGTTCGA GACCAGCCTGGGGAACTTGGCTGGACCTCCGTTTCTACGAAATAAAAATAAAAA AATTATCCAGGTATGGTGGTGTGTGCCTGTAGTCCTATCTACTCAAGGGTGGGG CAGGAGGATCACTTGAGCCCAGGAATTTGAGGCCACAGTGAATTAGGATTGCAC CACTGCACTCTAGCCCAGGCAACAGAACAAGAACCTGTCTCTAAATAAATAAATA AAAATAATAATAATAAAAAAGATGTTTTCCCTACAA (SEQ ID NO: 4)
AMACR Humana, variante do transcrito 1, mRNA (SEQ ID NO: 37) GGGGCGTGGCGCCGGGGATTGGGAGGGCTTCTTGCAGGCTGCTGGGCTGGG GCTAAGGGCTGCTCAGTTTCCTTCAGCGGGGCACTGGGAAGCGCCATGGCACT GCAGGGCATCTCGGTCGTGGAGCTGTCCGGCCTGGCCCCGGGCCCGTTCTGT
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GCTATGGTCCTGGCTGACTTCGGGGCGCGTGTGGTACGCGTGGACCGGCCCG GCTCCCGCTACGACGTGAGCCGCTTGGGCCGGGGCAAGCGCTCGCTAGTGCT GGACCTGAAGCAGCCGCGGGGAGCCGCCGTGCTGCGGCGTCTGTGCAAGCGG TCGGATGTGCTGCTGGAGCCCTTCCGCCGCGGTGTCATGGAGAAACTCCAGCT GGGCCCAGAGATTCTGCAGCGGGAAAATCCAAGGCTTATTTATGCCAGGCTGA GTGGATTTGGCCAGTCAGGAAGCTTCTGCCGGTTAGCTGGCCACGATATCAACT ATTTGGCTTTGTCAGGTGGAAGGAACAGCATATTTAAGTTCTTTTCTGTGGAAAA CTCAGAAATTGAGTCTGTGGGAAGCACCTCGAGGACAGAACATGTTGGATGGT GGAGCACCTTTCTATACGACTTACAGGACAGCAGATGGGGAATTCATGGCTGTT GGAGCAATAGAACCCCAGTTCTACGAGCTGCTGATCAAAGGACTTGGACTAAAG TCTGATGAACTTCCCAATCAGATGAGCATGGATGATTGGCCAGAAATGAAGAAG AAGTTTGCAGATGTATTTGCAGAGAAGACGAAGGCAGAGTGGTGTCAAATCTTT GACGGCACAGATGCCTGTGTGACTCCGGTTCTGACTTTTGAGGAGGTTGTTCAT CATGATCACAACAAGGAACGGGGCTCGTTTATCACCAGTGAGGAGCAGGACGT GAGCCCCCGCCCTGCACCTCTGCTGTTAAACACCCCAGCCATCCCTTCTTTCAA AAGGGATCCTTTCATAGGAGAACACACTGAGGAGATACTTGAAGAATTTGGATT CAGCCGCGAAGAGATTTATCAGCTTAACTCAGATAAAATCATTGAAAGTAATAAG GTAAAAGCTAGTCTCTAACTTCCAGGCCCACGGCTCAAGTGAATTTGAATACTG CATTTACAGTGTAGAGTAACACATAACATTGTATGCATGGAAACATGGAGGAACA GTATTACAGTGTCCTACCACTCTAATCAAGAAAAGAATTACAGACTCTGATTCTA CAGTGATGATTGAATTCTAAAAATGGTTATCATTAGGGCTTTTGATTTATAAAACT TTGGGTACTTATACTAAATTATGGTAGTTATTCTGCCTTCCAGTTTGCTTGATATA TTTGTTGATATTAAGATTCTTGACTTATATTTTGAATGGGTTCTAGTGAAAAAGGA ATGATATATTCTTGAAGACATCGATATACATTTATTTACACTCTTGATTCTACAAT GTAGAAAATGAGGAAATGCCACAAATTGTATGGTGATAAAAGTCACGTGAAACA GAGTGATTGGTTGCATCCAGGCCTTTTGTCTTGGTGTTCATGATCTCCCTCTAAG CACATTCCAAACTTTAGCAACAGTTATCACACTTTGTAATTTGCAAAGAAAAGTTT
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CACCTGTATTGAATCAGAATGCCTTCAACTGAAAAAAACATATCCAAAATAATGA GGAAATGTGTTGGCTCACTACGTAGAGTCCAGAGGGACAGTCAGTTTTAGGGTT GCCTGTATCCAGTAACTCGGGGCCTGTTTCCCCGTGGGTCTCTGGGCTGTCAG CTTTCCTTTCTCCATGTGTTTGATTTCTCCTCAGGCTGGTAGCAAGTTCTGGATC TTATACCCAACACACAGCAACATCCAGAAATAAAGATCTCAGGACCCCCCAGCA AGTCGTTTTGTGTCTCCTTGGACTGAGTTAAGTTACAAGCCTTTCTTATACCTGT CTTTGACAAAGAAGACGGGATTGTCTTTACATAAAACCAGCCTGCTCCTGGAGC TTCCCTGGACTCAACTTCCTAAAGGCATGTGAGGAAGGGGTAGATTCCACAATC TAATCCGGGTGCCATCAGAGTAGAGGGAGTAGAGAATGGATGTTGGGTAGGCC ATCAATAAGGTCCATTCTGCGCAGTATCTCAACTGCCGTTCAACAATCGCAAGA GGAAGGTGGAGCAGGTTTCTTCATCTTACAGTTGAGAAAACAGAGACTCAGAAG GGCTTCTTAGTTCATGTTTCCCTTAGCGCCTCAGTGATTTTTTCATGGTGGCTTA GGCCAAAAGAAATATCTAACCATTCAATTTATAAATAATTAGGTCCCCAACGAATT AAATATTATGTCCTACCAACTTATTAGCTGCTTGAAAAATATAATACACATAAATA AAAAAATATATTTTTCATTTCTATTTCATTGTTAATCACAACTACTTACTAAGGAGA TGTATGCACCTATTGGACACTGTGCAACTTCTCACCTGGAATGAGATTGGACAC TGCTGCCCTCATTTTCTGCTCCATGTTGGTGTCCATATAGTACTTGATTTTTTATC AGATGGCCTGGAAAACCCAGTCTCACAAAAATATGAAATTATCAGAAGGATTATA GTGCAATCTTATGTTGAAAGAATGAACTACCTCACTAGTAGTTCACGTGATGTCT GACAGATGTTGAGTTTCATTGTGTTTGTGTGTTCAAATTTTTAAATATTCTGAGAT ACTCTTGTGAGGTCACTCTAATGCCCTGGGTGCCTTGGCACAGTTTTAGAAATA CCAGTTGAAAATATTTGCTCAGGAATATGCAACTAGGAAGGGGCAGAATCAGAA TTTAAGCTTTCATATTCTAGCCTTCAGTCTTGTTCTTCAACCATTTTTAGGAACTT TCCCATAAGGTTATGTTTTCCAGCCCAGGCATGGAGGATCACTTGAGGCCAAGA GTTCGAGACCAGCCTGGGGAACTTGGCTGGACCTCCGTTTCTACGAAATAAAAA TAAAAAAATTATCCAGGTATGGTGGTGTGTGCCTGTAGTCCTATCTACTCAAGGG TGGGGCAGGAGGATCACTTGAGCCCAGGAATTTGAGGCCACAGTGAATTAGGA
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TTGCACCACTGCACTCTAGCCCAGGCAACAGAACAAGAACCTGTCTCTAAATAA ATAAATAAAAATAATAATAATAAAAAAGATGTTTTCCCTACAA (SEQ ID NO: 37) AMACR Humana, variante do transcrito 1, mRNA (SEQ ID NO: 38) GGGGCGTGGCGCCGGGGATTGGGAGGGCTTCTTGCAGGCTGCTGGGCTGGG GCTAAGGGCTGCTCAGTTTCCTTCAGCGGGGCACTGGGAAGCGCCATGGCACT GCAGGGCATCTCGGTCGTGGAGCTGTCCGGCCTGGCCCCGGGCCCGTTCTGT GCTATGGTCCTGGCTGACTTCGGGGCGCGTGTGGTACGCGTGGACCGGCCCG GCTCCCGCTACGACGTGAGCCGCTTGGGCCGGGGCAAGCGCTCGCTAGTGCT GGACCTGAAGCAGCCGCGGGGAGCCGCCGTGCTGCGGCGTCTGTGCAAGCGG TCGGATGTGCTGCTGGAGCCCTTCCGCCGCGGTGTCATGGAGAAACTCCAGCT GGGCCCAGAGATTCTGCAGCGGGAAAATCCAAGGCTTATTTATGCCAGGCTGA GTGGATTTGGCCAGTCAGGAAGCTTCTGCCGGTTAGCTGGCCACGATATCAACT ATTTGGCTTTGTCAGGTGTTCTCTCAAAAATTGGCAGAAGTGGTGAGAATCCGTA TGCCCCGCTGAATCTCCTGGCTGACTTTGCTGGTGGTGGCCTTATGTGTGCACT GGGCATTATAATGGCTCTTTTTGACCGCACACGCACTGGCAAGGGTCAGGTCAT TGATGCAAATATGGTGGAAGGAACAGCATATTTAAGTTCTTTTCTGTGGAAAACT CAGAAATTGAGTCTGTGGGAAGCACCTCGAGGACAGAACATGTTGGATGGTGG AGCACCTTTCTATACGACTTACAGGACAGCAGATGGGGAATTCATGGCTGTTGG AGCAATAGAACCCCAGTTCTACGAGCTGCTGATCAAAGGACTTGGACTAAAGTC TGATGAACTTCCCAATCAGATGAGCATGGATGATTGGCCAGAAATGAAGAAGAA GTTTGCAGATGTATTTGCAGAGAAGACGAAGGCAGAGTGGTGTCAAATCTTTGA CGGCACAGATGCCTGTGTGACTCCGGTTCTGACTTTTGAGGAGGTTGTTCATCA TGATCACAACAAGGAACGGGGCTCGTTTATCACCAGTGAGGAGCAGGACGTGA GCCCCCGCCCTGCACCTCTGCTGTTAAACACCCCAGCCATCCCTTCTTTCAAAA GGGATCCTTTCATAGGAGAACACACTGAGGAGATACTTGAAGAATTTGGATTCA GCCGCGAAGAGATTTATCAGCTTAACTCAGATAAAATCATTGAAAGTAATAAGGC TGGTAGCAAGTTCTGGATCTTATACCCAACACACAGCAACATCCAGAAATAAAGA
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TCTCAGGACCCCCCAGCAAGTCGTTTTGTGTCTCCTTGGACTGAGTTAAGTTAC AAGCCTTTCTTATACCTGTCTTTGACAAAGAAGACGGGATTGTCTTTACATAAAA CCAGCCTGCTCCTGGAGCTTCCCTGGACTCAACTTCCTAAAGGCATGTGAGGAA GGGGTAGATTCCACAATCTAATCCGGGTGCCATCAGAGTAGAGGGAGTAGAGA ATGGATGTTGGGTAGGCCATCAATAAGGTCCATTCTGCGCAGTATCTCAACTGC CGTTCAACAATCGCAAGAGGAAGGTGGAGCAGGTTTCTTCATCTTACAGTTGAG AAAACAGAGACTCAGAAGGGCTTCTTAGTTCATGTTTCCCTTAGCGCCTCAGTG ATTTTTTCATGGTGGCTTAGGCCAAAAGAAATATCTAACCATTCAATTTATAAATA ATTAGGTCCCCAACGAATTAAATATTATGTCCTACCAACTTATTAGCTGCTTGAAA AATATAATACACATAAATAAAAAAATATATTTTTCATTTCTATTTCATTGTTAATCA CAACTACTTACTAAGGAGATGTATGCACCTATTGGACACTGTGCAACTTCTCACC TGGAATGAGATTGGACACTGCTGCCCTCATTTTCTGCTCCATGTTGGTGTCCATA TAGTACTTGATTTTTTATCAGATGGCCTGGAAAACCCAGTCTCACAAAAATATGA AATTATCAGAAGGATTATAGTGCAATCTTATGTTGAAAGAATGAACTACCTCACT AGTAGTTCACGTGATGTCTGACAGATGTTGAGTTTCATTGTGTTTGTGTGTTCAA ATTTTTAAATATTCTGAGATACTCTTGTGAGGTCACTCTAATGCCCTGGGTGCCT TGGCACAGTTTTAGAAATACCAGTTGAAAATATTTGCTCAGGAATATGCAACTAG GAAGGGGCAGAATCAGAATTTAAGCTTTCATATTCTAGCCTTCAGTCTTGTTCTT CAACCATTTTTAGGAACTTTCCCATAAGGTTATGTTTTCCAGCCCAGGCATGGAG GATCACTTGAGGCCAAGAGTTCGAGACCAGCCTGGGGAACTTGGCTGGACCTC CGTTTCTACGAAATAAAAATAAAAAAATTATCCAGGTATGGTGGTGTGTGCCTGT AGTCCTATCTACTCAAGGGTGGGGCAGGAGGATCACTTGAGCCCAGGAATTTG AGGCCACAGTGAATTAGGATTGCACCACTGCACTCTAGCCCAGGCAACAGAACA AGAACCTGTCTCTAAATAAATAAATAAAAATAATAATAATAAAAAAGATGTTTTCC CTACAA (SEQ ID NO: 38) [088] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar o mRNA de BIRC5 que apresenta pelo menos uma
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36/92 porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40:
BIRC5 Humano, Variante do transcrito 1, mRNA (SEQ ID NO: 5) CCCAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACAT GCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCGGGACCCGTTGGCA GAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCC CTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGG CTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCC ACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAA GGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGG TTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTT TTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAAT AAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGGAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCA GCTGGCTGCCATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCTGCCTGGTCCCAGAGTG GCTGCACCACTTCCAGGGTTTATTCCCTGGTGCCACCAGCCTTCCTGTGGGCC CCTTAGCAATGTCTTAGGAAAGGAGATCAACATTTTCAAATTAGATGTTTCAACT GTGCTCTTGTTTTGTCTTGAAAGTGGCACCAGAGGTGCTTCTGCCTGTGCAGCG GGTGCTGCTGGTAACAGTGGCTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTGGGGGCT CATTTTTGCTGTTTTGATTCCCGGGCTTACCAGGTGAGAAGTGAGGGAGGAAGA AGGCAGTGTCCCTTTTGCTAGAGCTGACAGCTTTGTTCGCGTGGGCAGAGCCTT CCACAGTGAATGTGTCTGGACCTCATGTTGTTGAGGCTGTCACAGTCCTGAGTG TGGACTTGGCAGGTGCCTGTTGAATCTGAGCTGCAGGTTCCTTATCTGTCACAC
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CTGTGCCTCCTCAGAGGACAGTTTTTTTGTTGTTGTGTTTTTTTGTTTTTTTTTTTT TGGTAGATGCATGACTTGTGTGTGATGAGAGAATGGAGACAGAGTCCCTGGCTC CTCTACTGTTTAACAACATGGCTTTCTTATTTTGTTTGAATTGTTAATTCACAGAA TAGCACAAACTACAATTAAAACTAAGCACAAAGCCATTCTAAGTCATTGGGGAAA CGGGGTGAACTTCAGGTGGATGAGGAGACAGAATAGAGTGATAGGAAGCGTCT GGCAGATACTCCTTTTGCCACTGCTGTGTGATTAGACAGGCCCAGTGAGCCGC GGGGCACATGCTGGCCGCTCCTCCCTCAGAAAAAGGCAGTGGCCTAAATCCTT TTTAAATGACTTGGCTCGATGCTGTGGGGGACTGGCTGGGCTGCTGCAGGCCG TGTGTCTGTCAGCCCAACCTTCACATCTGTCACGTTCTCCACACGGGGGAGAGA CGCAGTCCGCCCAGGTCCCCGCTTTCTTTGGAGGCAGCAGCTCCCGCAGGGCT GAAGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTGATTCGCCCTCCTCCCTGTCATAGAGCT GCAGGGTGGATTGTTACAGCTTCGCTGGAAACCTCTGGAGGTCATCTCGGCTG TTCCTGAGAAATAAAAAGCCTGTCATTTCAAACACTGCTGTGGACCCTACTGGGT TTTTAAAATATTGTCAGTTTTTCATCGTCGTCCCTAGCCTGCCAACAGCCATCTG CCCAGACAGCCGCAGTGAGGATGAGCGTCCTGGCAGAGACGCAGTTGTCTCTG GGCGCTTGCCAGAGCCACGAACCCCAGACCTGTTTGTATCATCCGGGCTCCTT CCGGGCAGAAACAACTGAAAATGCACTTCAGACCCACTTATTTCTGCCACATCT GAGTCGGCCTGAGATAGACTTTTCCCTCTAAACTGGGAGAATATCACAGTGGTT TTTGTTAGCAGAAAATGCACTCCAGCCTCTGTACTCATCTAAGCTGCTTATTTTT GATATTTGTGTCAGTCTGTAAATGGATACTTCACTTTAATAACTGTTGCTTAGTAA TTGGCTTTGTAGAGAAGCTGGAAAAAAATGGTTTTGTCTTCAACTCCTTTGCATG CCAGGCGGTGATGTGGATCTCGGCTTCTGTGAGCCTGTGCTGTGGGCAGGGCT GAGCTGGAGCCGCCCCTCTCAGCCCGCCTGCCACGGCCTTTCCTTAAAGGCCA TCCTTAAAACCAGACCCTCATGGCTACCAGCACCTGAAAGCTTCCTCGACATCT GTTAATAAAGCCGTAGGCCCTTGTCTAAGTGCAACCGCCTAGACTTTCTTTCAGA TACATGTCCACATGTCCATTTTTCAGGTTCTCTAAGTTGGAGTGGAGTCTGGGAA GGGTTGTGAATGAGGCTTCTGGGCTATGGGTGAGGTTCCAATGGCAGGTTAGA
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GCCCCTCGGGCCAACTGCCATCCTGGAAAGTAGAGACAGCAGTGCCCGCTGCC
CAGAAGAGACCAGCAAGCCAAACTGGAGCCCCCATTGCAGGCTGTCGCCATGT GGAAAGAGTAACTCACAATTGCCAATAAAGTCTCATGTGGTTTTATCTAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 5)
BIRC5 Humano, Variante do transcrito 2, mRNA (SEQ ID NO: 39)
CCCAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACAT GCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCGGGACCCGTTGGCA GAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCC CTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGG CTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCC
ACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAA GGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAA GAATTTGAGGAAACTGCGGAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGC CATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCTGCCTGGTCCCAGAGTGGCTGCACCAC TTCCAGGGTTTATTCCCTGGTGCCACCAGCCTTCCTGTGGGCCCCTTAGCAATG TCTTAGGAAAGGAGATCAACATTTTCAAATTAGATGTTTCAACTGTGCTCTTGTTT TGTCTTGAAAGTGGCACCAGAGGTGCTTCTGCCTGTGCAGCGGGTGCTGCTGG TAACAGTGGCTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTGGGGGCTCATTTTTGCTGT TTTGATTCCCGGGCTTACCAGGTGAGAAGTGAGGGAGGAAGAAGGCAGTGTCC CTTTTGCTAGAGCTGACAGCTTTGTTCGCGTGGGCAGAGCCTTCCACAGTGAAT GTGTCTGGACCTCATGTTGTTGAGGCTGTCACAGTCCTGAGTGTGGACTTGGCA GGTGCCTGTTGAATCTGAGCTGCAGGTTCCTTATCTGTCACACCTGTGCCTCCT CAGAGGACAGTTTTTTTGTTGTTGTGTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTGGTAGATGCA TGACTTGTGTGTGATGAGAGAATGGAGACAGAGTCCCTGGCTCCTCTACTGTTT AACAACATGGCTTTCTTATTTTGTTTGAATTGTTAATTCACAGAATAGCACAAACT ACAATTAAAACTAAGCACAAAGCCATTCTAAGTCATTGGGGAAACGGGGTGAAC TTCAGGTGGATGAGGAGACAGAATAGAGTGATAGGAAGCGTCTGGCAGATACT
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CCTTTTGCCACTGCTGTGTGATTAGACAGGCCCAGTGAGCCGCGGGGCACATG CTGGCCGCTCCTCCCTCAGAAAAAGGCAGTGGCCTAAATCCTTTTTAAATGACT TGGCTCGATGCTGTGGGGGACTGGCTGGGCTGCTGCAGGCCGTGTGTCTGTCA GCCCAACCTTCACATCTGTCACGTTCTCCACACGGGGGAGAGACGCAGTCCGC CCAGGTCCCCGCTTTCTTTGGAGGCAGCAGCTCCCGCAGGGCTGAAGTCTGGC GTAAGATGATGGATTTGATTCGCCCTCCTCCCTGTCATAGAGCTGCAGGGTGGA TTGTTACAGCTTCGCTGGAAACCTCTGGAGGTCATCTCGGCTGTTCCTGAGAAA TAAAAAGCCTGTCATTTCAAACACTGCTGTGGACCCTACTGGGTTTTTAAAATAT TGTCAGTTTTTCATCGTCGTCCCTAGCCTGCCAACAGCCATCTGCCCAGACAGC CGCAGTGAGGATGAGCGTCCTGGCAGAGACGCAGTTGTCTCTGGGCGCTTGCC AGAGCCACGAACCCCAGACCTGTTTGTATCATCCGGGCTCCTTCCGGGCAGAA ACAACTGAAAATGCACTTCAGACCCACTTATTTCTGCCACATCTGAGTCGGCCT GAGATAGACTTTTCCCTCTAAACTGGGAGAATATCACAGTGGTTTTTGTTAGCAG AAAATGCACTCCAGCCTCTGTACTCATCTAAGCTGCTTATTTTTGATATTTGTGTC AGTCTGTAAATGGATACTTCACTTTAATAACTGTTGCTTAGTAATTGGCTTTGTAG AGAAGCTGGAAAAAAATGGTTTTGTCTTCAACTCCTTTGCATGCCAGGCGGTGA TGTGGATCTCGGCTTCTGTGAGCCTGTGCTGTGGGCAGGGCTGAGCTGGAGCC GCCCCTCTCAGCCCGCCTGCCACGGCCTTTCCTTAAAGGCCATCCTTAAAACCA GACCCTCATGGCTACCAGCACCTGAAAGCTTCCTCGACATCTGTTAATAAAGCC GTAGGCCCTTGTCTAAGTGCAACCGCCTAGACTTTCTTTCAGATACATGTCCACA TGTCCATTTTTCAGGTTCTCTAAGTTGGAGTGGAGTCTGGGAAGGGTTGTGAAT GAGGCTTCTGGGCTATGGGTGAGGTTCCAATGGCAGGTTAGAGCCCCTCGGGC CAACTGCCATCCTGGAAAGTAGAGACAGCAGTGCCCGCTGCCCAGAAGAGACC AGCAAGCCAAACTGGAGCCCCCATTGCAGGCTGTCGCCATGTGGAAAGAGTAA CTCACAATTGCCAATAAAGTCTCATGTGGTTTTATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAA (SEQ ID NO: 39)
BIRC5 Humano, Variante do transcrito 3, mRNA (SEQ ID NO: 40)
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CCCAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACAT GCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCGGGACCCGTTGGCA GAGGTGGCGGCGGCGGCATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCC CTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGG CTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCC ACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAA GGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATTGGGCCGGGCACGGTGGCTTACGCCT GTAATACCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGAGAGGAACAT AAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAAT TAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTG CAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGGAGAAAGTGC GCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGAGGCCTCTGGCCGGAGCT GCCTGGTCCCAGAGTGGCTGCACCACTTCCAGGGTTTATTCCCTGGTGCCACC AGCCTTCCTGTGGGCCCCTTAGCAATGTCTTAGGAAAGGAGATCAACATTTTCA AATTAGATGTTTCAACTGTGCTCTTGTTTTGTCTTGAAAGTGGCACCAGAGGTGC TTCTGCCTGTGCAGCGGGTGCTGCTGGTAACAGTGGCTGCTTCTCTCTCTCTCT CTCTTTTTTGGGGGCTCATTTTTGCTGTTTTGATTCCCGGGCTTACCAGGTGAGA AGTGAGGGAGGAAGAAGGCAGTGTCCCTTTTGCTAGAGCTGACAGCTTTGTTC GCGTGGGCAGAGCCTTCCACAGTGAATGTGTCTGGACCTCATGTTGTTGAGGC TGTCACAGTCCTGAGTGTGGACTTGGCAGGTGCCTGTTGAATCTGAGCTGCAG GTTCCTTATCTGTCACACCTGTGCCTCCTCAGAGGACAGTTTTTTTGTTGTTGTG TTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTGGTAGATGCATGACTTGTGTGTGATGAGAGAATGG AGACAGAGTCCCTGGCTCCTCTACTGTTTAACAACATGGCTTTCTTATTTTGTTT GAATTGTTAATTCACAGAATAGCACAAACTACAATTAAAACTAAGCACAAAGCCA TTCTAAGTCATTGGGGAAACGGGGTGAACTTCAGGTGGATGAGGAGACAGAATA GAGTGATAGGAAGCGTCTGGCAGATACTCCTTTTGCCACTGCTGTGTGATTAGA CAGGCCCAGTGAGCCGCGGGGCACATGCTGGCCGCTCCTCCCTCAGAAAAAG
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GCAGTGGCCTAAATCCTTTTTAAATGACTTGGCTCGATGCTGTGGGGGACTGGC TGGGCTGCTGCAGGCCGTGTGTCTGTCAGCCCAACCTTCACATCTGTCACGTTC TCCACACGGGGGAGAGACGCAGTCCGCCCAGGTCCCCGCTTTCTTTGGAGGCA GCAGCTCCCGCAGGGCTGAAGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTGATTCGCCCT CCTCCCTGTCATAGAGCTGCAGGGTGGATTGTTACAGCTTCGCTGGAAACCTCT GGAGGTCATCTCGGCTGTTCCTGAGAAATAAAAAGCCTGTCATTTCAAACACTG CTGTGGACCCTACTGGGTTTTTAAAATATTGTCAGTTTTTCATCGTCGTCCCTAG CCTGCCAACAGCCATCTGCCCAGACAGCCGCAGTGAGGATGAGCGTCCTGGCA GAGACGCAGTTGTCTCTGGGCGCTTGCCAGAGCCACGAACCCCAGACCTGTTT GTATCATCCGGGCTCCTTCCGGGCAGAAACAACTGAAAATGCACTTCAGACCCA CTTATTTCTGCCACATCTGAGTCGGCCTGAGATAGACTTTTCCCTCTAAACTGGG AGAATATCACAGTGGTTTTTGTTAGCAGAAAATGCACTCCAGCCTCTGTACTCAT CTAAGCTGCTTATTTTTGATATTTGTGTCAGTCTGTAAATGGATACTTCACTTTAA TAACTGTTGCTTAGTAATTGGCTTTGTAGAGAAGCTGGAAAAAAATGGTTTTGTC TTCAACTCCTTTGCATGCCAGGCGGTGATGTGGATCTCGGCTTCTGTGAGCCTG TGCTGTGGGCAGGGCTGAGCTGGAGCCGCCCCTCTCAGCCCGCCTGCCACGG CCTTTCCTTAAAGGCCATCCTTAAAACCAGACCCTCATGGCTACCAGCACCTGA AAGCTTCCTCGACATCTGTTAATAAAGCCGTAGGCCCTTGTCTAAGTGCAACCG CCTAGACTTTCTTTCAGATACATGTCCACATGTCCATTTTTCAGGTTCTCTAAGTT GGAGTGGAGTCTGGGAAGGGTTGTGAATGAGGCTTCTGGGCTATGGGTGAGGT TCCAATGGCAGGTTAGAGCCCCTCGGGCCAACTGCCATCCTGGAAAGTAGAGA CAGCAGTGCCCGCTGCCCAGAAGAGACCAGCAAGCCAAACTGGAGCCCCCATT GCAGGCTGTCGCCATGTGGAAAGAGTAACTCACAATTGCCAATAAAGTCTCATG TGGTTTTATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 40) [089] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar o mRNA de HOXC6 que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo
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42/92 menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 41:
HOXC6 Humano, Variante do transcrito 1, mRNA (SEQ ID NO: 6) 1TTTTGTCTGTCCTGGATTGGAGCCGTCCCTATAACCATCTAGTTCCGAGTACAA ACTGGAGACAGAAATAAATATTAAAGAAATCATAGACCGACCAGGTAAAGGCAA AGGGATGAATTCCTACTTCACTAACCCTTCCTTATCCTGCCACCTCGCCGGGGG CCAGGACGTCCTCCCCAACGTCGCCCTCAATTCCACCGCCTATGATCCAGTGA GGCATTTCTCGACCTATGGAGCGGCCGTTGCCCAGAACCGGATCTACTCGACT CCCTTTTATTCGCCACAGGAGAATGTCGTGTTCAGTTCCAGCCGGGGGCCGTAT GACTATGGATCTAATTCCTTTTACCAGGAGAAAGACATGCTCTCAAACTGCAGAC AAAACACCTTAGGACATAACACACAGACCTCAATCGCTCAGGATTTTAGTTCTGA GCAGGGCAGGACTGCGCCCCAGGACCAGAAAGCCAGTATCCAGATTTACCCCT GGATGCAGCGAATGAATTCGCACAGTGGGGTCGGCTACGGAGCGGACCGGAG GCGCGGCCGCCAGATCTACTCGCGGTACCAGACCCTGGAACTGGAGAAGGAAT TTCACTTCAATCGCTACCTAACGCGGCGCCGGCGCATCGAGATCGCCAACGCG CTTTGCCTGACCGAGCGACAGATCAAAATCTGGTTCCAGAACCGCCGGATGAA GTGGAAAAAAGAATCTAATCTCACATCCACTCTCTCGGGGGGCGGCGGAGGGG CCACCGCCGACAGCCTGGGCGGAAAAGAGGAAAAGCGGGAAGAGACAGAAGA GGAGAAGCAGAAAGAGTGACCAGGACTGTCCCTGCCACCCCTCTCTCCCTTTCT CCCTCGCTCCCCACCAACTCTCCCCTAATCACACACTCTGTATTTATCACTGGCA CAATTGATGTGTTTTGATTCCCTAAAACAAAATTAGGGAGTCAAACGTGGACCTG AAAGTCAGCTCTGGACCCCCTCCCTCACCGCACAACTCTCTTTCACCACGCGCC TCCTCCTCCTCGCTCCCTTGCTAGCTCGTTCTCGGCTTGTCTACAGGCCCTTTT
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CCCCGTCCAGGCCTTGGGGGCTCGGACCCTGAACTCAGACTCTACAGATTGCC CTCCAAGTGAGGACTTGGCTCCCCCACTCCTTCGACGCCCCCACCCCCGCCCC CCGTGCAGAGAGCCGGCTCCTGGGCCTGCTGGGGCCTCTGCTCCAGGGCCTC AGGGCCCGGCCTGGCAGCCGGGGAGGGCCGGAGGCCCAAGGAGGGCGCGCC TTGGCCCCACACCAACCCCCAGGGCCTCCCCGCAGTCCCTGCCTAGCCCCTCT GCCCCAGCAAATGCCCAGCCCAGGCAAATTGTATTTAAAGAATCCTGGGGGTCA TTATGGCATTTTACAAACTGTGACCGTTTCTGTGTGAAGATTTTTAGCTGTATTTG TGGTCTCTGTATTTATATTTATGTTTAGCACCGTCAGTGTTCCTATCCAATTTCAA AAAAGGAAAAAAAAGAGGGAAAATTACAAAAAGAGAGAAAAAAAGTGAATGACG TTTGTTTAGCCAGTAGGAGAAAATAAATAAATAAATAAATCCCTTCGTGTTACCCT CCTGTATAAATCCAACCTCTGGGTCCGTTCTCGAATATTTAATAAAACTGATATTA TTTTTAAAACTTTA (SEQ ID NO: 6)
HOXC6 Humano, Variante do transcrito 2, mRNA (SEQ ID NO: 41) AACTTTTTATTGTGGTTTGTCCGTTCCGAGCGCTCCGCAGAACAGTCCTCCCTG TAAGAGCCTAACCATTGCCAGGGAAACCTGCCCTGGGCGCTCCCTTCATTAGCA GTATTTTTTTTAAATTAATCTGATTAATAATTATTTTTCCCCCATTTAATTTTTTTTC CTCCCAGGTGGAGTTGCCGAAGCTGGGGGCAGCTGGGGAGGGTGGGGATGG GAGGGGAGAGACAGAAGTTGAGGGCATCTCTCTCTTCCTTCCCGACCCTCTGG CCCCCAAGGGGCAGGAGGAATGCAGGAGCAGGAGTTGAGCTTGGGAGCTGCA GATGCCTCCGCCCCTCCTCTCTCCCAGGCTCTTCCTCCTGCCCCCTTCTTGCAA CTCTCCTTAATTTTGTTTGGCTTTTGGATGATTATAATTATTTTTATTTTTGAATTT ATATAAAGTATATGTGTGTGTGTGTGGAGCTGAGACAGGCTCGGCAGCGGCAC AGAATGAGGGAAGACGAGAAAGAGAGTGGGAGAGAGAGAGGCAGAGAGGGAG AGAGGGAGAGTGACAGCAGCGCTCGGACGTCCTCCCCAACGTCGCCCTCAATT CCACCGCCTATGATCCAGTGAGGCATTTCTCGACCTATGGAGCGGCCGTTGCC CAGAACCGGATCTACTCGACTCCCTTTTATTCGCCACAGGAGAATGTCGTGTTC AGTTCCAGCCGGGGGCCGTATGACTATGGATCTAATTCCTTTTACCAGGAGAAA
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GACATGCTCTCAAACTGCAGACAAAACACCTTAGGACATAACACACAGACCTCA ATCGCTCAGGATTTTAGTTCTGAGCAGGGCAGGACTGCGCCCCAGGACCAGAA AGCCAGTATCCAGATTTACCCCTGGATGCAGCGAATGAATTCGCACAGTGGGGT CGGCTACGGAGCGGACCGGAGGCGCGGCCGCCAGATCTACTCGCGGTACCAG ACCCTGGAACTGGAGAAGGAATTTCACTTCAATCGCTACCTAACGCGGCGCCG GCGCATCGAGATCGCCAACGCGCTTTGCCTGACCGAGCGACAGATCAAAATCT GGTTCCAGAACCGCCGGATGAAGTGGAAAAAAGAATCTAATCTCACATCCACTC TCTCGGGGGGCGGCGGAGGGGCCACCGCCGACAGCCTGGGCGGAAAAGAGG AAAAGCGGGAAGAGACAGAAGAGGAGAAGCAGAAAGAGTGACCAGGACTGTCC CTGCCACCCCTCTCTCCCTTTCTCCCTCGCTCCCCACCAACTCTCCCCTAATCA CACACTCTGTATTTATCACTGGCACAATTGATGTGTTTTGATTCCCTAAAACAAAA TTAGGGAGTCAAACGTGGACCTGAAAGTCAGCTCTGGACCCCCTCCCTCACCG CACAACTCTCTTTCACCACGCGCCTCCTCCTCCTCGCTCCCTTGCTAGCTCGTT CTCGGCTTGTCTACAGGCCCTTTTCCCCGTCCAGGCCTTGGGGGCTCGGACCC TGAACTCAGACTCTACAGATTGCCCTCCAAGTGAGGACTTGGCTCCCCCACTCC TTCGACGCCCCCACCCCCGCCCCCCGTGCAGAGAGCCGGCTCCTGGGCCTGC TGGGGCCTCTGCTCCAGGGCCTCAGGGCCCGGCCTGGCAGCCGGGGAGGGC CGGAGGCCCAAGGAGGGCGCGCCTTGGCCCCACACCAACCCCCAGGGCCTCC CCGCAGTCCCTGCCTAGCCCCTCTGCCCCAGCAAATGCCCAGCCCAGGCAAAT TGTATTTAAAGAATCCTGGGGGTCATTATGGCATTTTACAAACTGTGACCGTTTC TGTGTGAAGATTTTTAGCTGTATTTGTGGTCTCTGTATTTATATTTATGTTTAGCA CCGTCAGTGTTCCTATCCAATTTCAAAAAAGGAAAAAAAAGAGGGAAAATTACAA AAAGAGAGAAAAAAAGTGAATGACGTTTGTTTAGCCAGTAGGAGAAAATAAATAA ATAAATAAATCCCTTCGTGTTACCCTCCTGTATAAATCCAACCTCTGGGTCCGTT CTCGAATATTTAATAAAACTGATATTATTTTTAAAACTTTAAAA (SEQ ID NO: 41) [090] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar o mRNA de SPARCL1 que apresenta pelo menos uma
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45/92 porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44:
SPARCL1 Humano, Variante do transcrito 1, mRNA (SEQ ID NO: 7)
AAAAATGCATAAAGAGCCAAGTGCTTATATTCTGGCCAAGTTATGAGGCTCTGA GAACAAGAGCTTGAGGGGAAGACTGTTAACCCCATCCACGCCACCAGAATTAG CTCTTTCCCTTTTGGTTTGCAAGCACTGCCTGTAAAGCCCTCGCATGAGAGGCC AGCCTGCTAGGGAAATCCAGGAATCTGCAACAAAAACGATGACAGTCTGAAATA CTCTCTGGTGCCAACCTCCAAATTCTCGTCTGTCACTTCAGACCCCCACTAGTT GACAGAGCAGCAGAATTTCAACTCCAGTAGACTTGAATATGCCTCTGGGCAAAG AAGCAGAGCTAACGAGGAAAGGGATTTAAAGAGTTTTTCTTGGGTGTTTGTCAA ACTTTTATTCCCTGTCTGTGTGCAGAGGGGATTCAACTTCAATTTTTCTGCAGTG GCTCTGGGTCCAGCCCCTTACTTAAAGGCCATAAGATGTTTTATTGAAAGAAACT TTCAATATCAAGTAATCCAACCAACCTTCTAAGATAAGCCTTTTCCTTCAACACAA AGAAGTGCATTTTGCCAAATCTGGAAAGCATGAAGACTGGGCTTTTTTTCCTATG TCTCTTGGGAACTGCAGCTGCAATCCCGACAAATGCAAGATTATTATCTGATCAT TCCAAACCAACTGCTGAAACGGTAGCACCTGACAACACTGCAATCCCCAGTTTA AGGGCTGAAGCTGAAGAAAATGAAAAAGAAACAGCAGTATCCACAGAAGACGAT TCCCACCATAAGGCTGAAAAATCATCAGTACTAAAGTCAAAAGAGGAAAGCCAT GAACAGTCAGCAGAACAGGGCAAGAGTTCTAGCCAAGAGCTGGGATTGAAGGA TCAAGAGGACAGTGATGGTCACTTAAGTGTGAATTTGGAGTATGCACCAACTGA AGGTACATTGGACATAAAAGAAGATATGAGTGAGCCTCAGGAGAAAAAACTCTC AGAGAACACTGATTTTTTGGCTCCTGGTGTTAGTTCCTTCACAGATTCTAACCAA
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CAAGAAAGTATCACAAAGAGAGAGGAAAACCAAGAACAACCTAGAAATTATTCA CATCATCAGTTGAACAGGAGCAGTAAACATAGCCAAGGCCTAAGGGATCAAGGA AACCAAGAGCAGGATCCAAATATTTCCAATGGAGAAGAGGAAGAAGAAAAAGAG CCAGGTGAAGTTGGTACCCACAATGATAACCAAGAAAGAAAGACAGAATTGCCC AGGGAGCATGCTAACAGCAAGCAGGAGGAAGACAATACCCAATCTGATGATATT TTGGAAGAGTCTGATCAACCAACTCAAGTAAGCAAGATGCAGGAGGATGAATTT GATCAGGGTAACCAAGAACAAGAAGATAACTCCAATGCAGAAATGGAAGAGGAA AATGCATCGAACGTCAATAAGCACATTCAAGAAACTGAATGGCAGAGTCAAGAG GGTAAAACTGGCCTAGAAGCTATCAGCAACCACAAAGAGACAGAAGAAAAGACT GTTTCTGAGGCTCTGCTCATGGAACCTACTGATGATGGTAATACCACGCCCAGA AATCATGGAGTTGATGATGATGGCGATGATGATGGCGATGATGGCGGCACTGAT GGCCCCAGGCACAGTGCAAGTGATGACTACTTCATCCCAAGCCAGGCCTTTCT GGAGGCCGAGAGAGCTCAATCCATTGCCTATCACCTCAAAATTGAGGAGCAAAG AGAAAAAGTACATGAAAATGAAAATATAGGTACCACTGAGCCTGGAGAGCACCA AGAGGCCAAGAAAGCAGAGAACTCATCAAATGAGGAGGAAACGTCAAGTGAAG GCAACATGAGGGTGCATGCTGTGGATTCTTGCATGAGCTTCCAGTGTAAAAGAG GCCACATCTGTAAGGCAGACCAACAGGGAAAACCTCACTGTGTCTGCCAGGAT CCAGTGACTTGTCCTCCAACAAAACCCCTTGATCAAGTTTGTGGCACTGACAAT CAGACCTATGCTAGTTCCTGTCATCTATTCGCTACTAAATGCAGACTGGAGGGG ACCAAAAAGGGGCATCAACTCCAGCTGGATTATTTTGGAGCCTGCAAATCTATT CCTACTTGTACGGACTTTGAAGTGATTCAGTTTCCTCTACGGATGAGAGACTGG CTCAAGAATATCCTCATGCAGCTTTATGAAGCCAACTCTGAACACGCTGGTTATC TAAATGAGAAGCAGAGAAATAAAGTCAAGAAAATTTACCTGGATGAAAAGAGGC TTTTGGCTGGGGACCATCCCATTGATCTTCTCTTAAGGGACTTTAAGAAAAACTA CCACATGTATGTGTATCCTGTGCACTGGCAGTTTAGTGAACTTGACCAACACCC TATGGATAGAGTCTTGACACATTCTGAACTTGCTCCTCTGCGAGCATCTCTGGT GCCCATGGAACACTGCATAACCCGTTTCTTTGAGGAGTGTGACCCCAACAAGGA
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TAAGCACATCACCCTGAAGGAGTGGGGCCACTGCTTTGGAATTAAAGAAGAGGA CATAGATGAAAATCTCTTGTTTTGAACGAAGATTTTAAAGAACTCAACTTTCCAGC ATCCTCCTCTGTTCTAACCACTTCAGAAATATATGCAGCTGTGATACTTGTAGAT TTATATTTAGCAAAATGTTAGCATGTATGACAAGACAATGAGAGTAATTGCTTGA
CAACAACCTATGCACCAGGTATTTAACATTAACTTTGGAAACAAAAATGTACAATT AAGTAAAGTCAACATATGCAAAATACTGTACATTGTGAACAGAAGTTTAATTCATA GTAATTTCACTCTCTGCATTGACTTATGAGATAATTAATGATTAAACTATTAATGA TAAAAATAATGCATTTGTATTGTTCATAATATCATGTGCACTTCAAGAAAATGGAA TGCTACTCTTTTGTGGTTTACGTGTATTATTTTCAATATCTTAATACCCTAATAAA GAGTCCATAAAAATCCAAATGCTT (SEQ ID NO: 7)
SPARCL1 Humano, Variante do transcrito 2, mRNA (SEQ ID NO: 42)
AAAAATGCATAAAGAGCCAAGTGCTTATATTCTGGCCAAGTTATGAGGCTCTGA GAACAAGAGCTTGAGGGGAAGACTGTTAACCCCATCCACGCCACCAGAATTAG CTCTTTCCCTTTTGGTTTGCAAGCACTGCCTGTAAAGCCCTCGCATGAGAGGCC AGCCTGCTAGGGAAATCCAGGAATCTGCAACAAAAACGATGACAGTCTGAAATA CTCTCTGGTGCCAACCTCCAAATTCTCGTCTGTCACTTCAGACCCCCACTAGTT GACAGAGCAGCAGAATTTCAACTCCAGTAGACTTGAATATGCCTCTGGGCAAAG AAGCAGAGCTAACGAGGAAAGGGATTTAAAGAGTTTTTCTTGGGTGTTTGTCAA ACTTTTATTCCCTGTCTGTGTGCAGAGGGGATTCAACTTCAATTTTTCTGCAGTG GCTCTGGGTCCAGCCCCTTACTTAAAGATCTGGAAAGCATGAAGACTGGGCTTT TTTTCCTATGTCTCTTGGGAACTGCAGCTGCAATCCCGACAAATGCAAGATTATT ATCTGATCATTCCAAACCAACTGCTGAAACGGTAGCACCTGACAACACTGCAAT CCCCAGTTTAAGGGCTGAAGCTGAAGAAAATGAAAAAGAAACAGCAGTATCCAC AGAAGACGATTCCCACCATAAGGCTGAAAAATCATCAGTACTAAAGTCAAAAGA GGAAAGCCATGAACAGTCAGCAGAACAGGGCAAGAGTTCTAGCCAAGAGCTGG GATTGAAGGATCAAGAGGACAGTGATGGTCACTTAAGTGTGAATTTGGAGTATG CACCAACTGAAGGTACATTGGACATAAAAGAAGATATGAGTGAGCCTCAGGAGA
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AAAAACTCTCAGAGAACACTGATTTTTTGGCTCCTGGTGTTAGTTCCTTCACAGA TTCTAACCAACAAGAAAGTATCACAAAGAGAGAGGAAAACCAAGAACAACCTAG AAATTATTCACATCATCAGTTGAACAGGAGCAGTAAACATAGCCAAGGCCTAAG GGATCAAGGAAACCAAGAGCAGGATCCAAATATTTCCAATGGAGAAGAGGAAGA AGAAAAAGAGCCAGGTGAAGTTGGTACCCACAATGATAACCAAGAAAGAAAGAC AGAATTGCCCAGGGAGCATGCTAACAGCAAGCAGGAGGAAGACAATACCCAAT CTGATGATATTTTGGAAGAGTCTGATCAACCAACTCAAGTAAGCAAGATGCAGG AGGATGAATTTGATCAGGGTAACCAAGAACAAGAAGATAACTCCAATGCAGAAA TGGAAGAGGAAAATGCATCGAACGTCAATAAGCACATTCAAGAAACTGAATGGC AGAGTCAAGAGGGTAAAACTGGCCTAGAAGCTATCAGCAACCACAAAGAGACA GAAGAAAAGACTGTTTCTGAGGCTCTGCTCATGGAACCTACTGATGATGGTAAT ACCACGCCCAGAAATCATGGAGTTGATGATGATGGCGATGATGATGGCGATGAT GGCGGCACTGATGGCCCCAGGCACAGTGCAAGTGATGACTACTTCATCCCAAG CCAGGCCTTTCTGGAGGCCGAGAGAGCTCAATCCATTGCCTATCACCTCAAAAT TGAGGAGCAAAGAGAAAAAGTACATGAAAATGAAAATATAGGTACCACTGAGCC TGGAGAGCACCAAGAGGCCAAGAAAGCAGAGAACTCATCAAATGAGGAGGAAA CGTCAAGTGAAGGCAACATGAGGGTGCATGCTGTGGATTCTTGCATGAGCTTCC AGTGTAAAAGAGGCCACATCTGTAAGGCAGACCAACAGGGAAAACCTCACTGTG TCTGCCAGGATCCAGTGACTTGTCCTCCAACAAAACCCCTTGATCAAGTTTGTG GCACTGACAATCAGACCTATGCTAGTTCCTGTCATCTATTCGCTACTAAATGCAG ACTGGAGGGGACCAAAAAGGGGCATCAACTCCAGCTGGATTATTTTGGAGCCT GCAAATCTATTCCTACTTGTACGGACTTTGAAGTGATTCAGTTTCCTCTACGGAT GAGAGACTGGCTCAAGAATATCCTCATGCAGCTTTATGAAGCCAACTCTGAACA CGCTGGTTATCTAAATGAGAAGCAGAGAAATAAAGTCAAGAAAATTTACCTGGAT GAAAAGAGGCTTTTGGCTGGGGACCATCCCATTGATCTTCTCTTAAGGGACTTT AAGAAAAACTACCACATGTATGTGTATCCTGTGCACTGGCAGTTTAGTGAACTTG ACCAACACCCTATGGATAGAGTCTTGACACATTCTGAACTTGCTCCTCTGCGAG
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CATCTCTGGTGCCCATGGAACACTGCATAACCCGTTTCTTTGAGGAGTGTGACC CCAACAAGGATAAGCACATCACCCTGAAGGAGTGGGGCCACTGCTTTGGAATTA AAGAAGAGGACATAGATGAAAATCTCTTGTTTTGAACGAAGATTTTAAAGAACTC AACTTTCCAGCATCCTCCTCTGTTCTAACCACTTCAGAAATATATGCAGCTGTGA TACTTGTAGATTTATATTTAGCAAAATGTTAGCATGTATGACAAGACAATGAGAGT AATTGCTTGACAACAACCTATGCACCAGGTATTTAACATTAACTTTGGAAACAAA AATGTACAATTAAGTAAAGTCAACATATGCAAAATACTGTACATTGTGAACAGAA GTTTAATTCATAGTAATTTCACTCTCTGCATTGACTTATGAGATAATTAATGATTA AACTATTAATGATAAAAATAATGCATTTGTATTGTTCATAATATCATGTGCACTTC AAGAAAATGGAATGCTACTCTTTTGTGGTTTACGTGTATTATTTTCAATATCTTAA TACCCTAATAAAGAGTCCATAAAAATCCAAATGCTT (SEQ ID NO: 42)
SPARCL1 Humano, Variante do transcrito 3, mRNA (SEQ ID NO: 43)
AAAAATGCATAAAGAGCCAAGTGCTTATATTCTGGCCAAGTTATGAGGCTCTGA GAACAAGAGCTTGAGGGGAAGACTGTTAACCCCATCCACGCCACCAGAATTAG CTCTTTCCCTTTTGGTTTGCAAGCACTGCCTGTAAAGCCCTCGCATGAGAGGCC AGCCTGCTAGGGAAATCCAGGAATCTGCAACAAAAACGATGACAGTCTGAAATA CTCTCTGGTGCCAACCTCCAAATTCTCGTCTGTCACTTCAGACCCCCACTAGTT GACAGAGCAGCAGAATTTCAACTCCAGTAGACTTGAATATGCCTCTGGGCAAAG AAGCAGAGCTAACGAGGAAAGGGATTTAAAGAGTTTTTCTTGGGTGTTTGTCAA ACTTTTATTCCCTGTCTGTGTGCAGAGGGGATTCAACTTCAATTTTTCTGCAGTG GCTCTGGGTCCAGCCCCTTACTTAAAGATCTGGAAAGCATGAAGACTGGGCTTT TTTTCCTATGTCTCTTGGGAACTGCAGCTGCAATCCCGGTGAAAAGGAGATAAG AAGCAAAGGAGCAAACCAAACCTAATATGAATCCTGTACTTTGGCCAGAAGCCG TGGCTCACATCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGACAAATGCAAGATTA TTATCTGATCATTCCAAACCAACTGCTGAAACGGTAGCACCTGACAACACTGCAA TCCCCAGTTTAAGGGCTGAAGCTGAAGAAAATGAAAAAGAAACAGCAGTATCCA CAGAAGACGATTCCCACCATAAGGCTGAAAAATCATCAGTACTAAAGTCAAAAG
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AGGAAAGCCATGAACAGTCAGCAGAACAGGGCAAGAGTTCTAGCCAAGAGCTG GGATTGAAGGATCAAGAGGACAGTGATGGTCACTTAAGTGTGAATTTGGAGTAT GCACCAACTGAAGGTACATTGGACATAAAAGAAGATATGAGTGAGCCTCAGGAG AAAAAACTCTCAGAGAACACTGATTTTTTGGCTCCTGGTGTTAGTTCCTTCACAG ATTCTAACCAACAAGAAAGTATCACAAAGAGAGAGGAAAACCAAGAACAACCTA GAAATTATTCACATCATCAGTTGAACAGGAGCAGTAAACATAGCCAAGGCCTAA GGGATCAAGGAAACCAAGAGCAGGATCCAAATATTTCCAATGGAGAAGAGGAA GAAGAAAAAGAGCCAGGTGAAGTTGGTACCCACAATGATAACCAAGAAAGAAAG ACAGAATTGCCCAGGGAGCATGCTAACAGCAAGCAGGAGGAAGACAATACCCA ATCTGATGATATTTTGGAAGAGTCTGATCAACCAACTCAAGTAAGCAAGATGCAG GAGGATGAATTTGATCAGGGTAACCAAGAACAAGAAGATAACTCCAATGCAGAA ATGGAAGAGGAAAATGCATCGAACGTCAATAAGCACATTCAAGAAACTGAATGG CAGAGTCAAGAGGGTAAAACTGGCCTAGAAGCTATCAGCAACCACAAAGAGACA GAAGAAAAGACTGTTTCTGAGGCTCTGCTCATGGAACCTACTGATGATGGTAAT ACCACGCCCAGAAATCATGGAGTTGATGATGATGGCGATGATGATGGCGATGAT GGCGGCACTGATGGCCCCAGGCACAGTGCAAGTGATGACTACTTCATCCCAAG CCAGGCCTTTCTGGAGGCCGAGAGAGCTCAATCCATTGCCTATCACCTCAAAAT TGAGGAGCAAAGAGAAAAAGTACATGAAAATGAAAATATAGGTACCACTGAGCC TGGAGAGCACCAAGAGGCCAAGAAAGCAGAGAACTCATCAAATGAGGAGGAAA CGTCAAGTGAAGGCAACATGAGGGTGCATGCTGTGGATTCTTGCATGAGCTTCC AGTGTAAAAGAGGCCACATCTGTAAGGCAGACCAACAGGGAAAACCTCACTGTG TCTGCCAGGATCCAGTGACTTGTCCTCCAACAAAACCCCTTGATCAAGTTTGTG GCACTGACAATCAGACCTATGCTAGTTCCTGTCATCTATTCGCTACTAAATGCAG ACTGGAGGGGACCAAAAAGGGGCATCAACTCCAGCTGGATTATTTTGGAGCCT GCAAATCTATTCCTACTTGTACGGACTTTGAAGTGATTCAGTTTCCTCTACGGAT GAGAGACTGGCTCAAGAATATCCTCATGCAGCTTTATGAAGCCAACTCTGAACA CGCTGGTTATCTAAATGAGAAGCAGAGAAATAAAGTCAAGAAAATTTACCTGGAT
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GAAAAGAGGCTTTTGGCTGGGGACCATCCCATTGATCTTCTCTTAAGGGACTTT
AAGAAAAACTACCACATGTATGTGTATCCTGTGCACTGGCAGTTTAGTGAACTTG ACCAACACCCTATGGATAGAGTCTTGACACATTCTGAACTTGCTCCTCTGCGAG CATCTCTGGTGCCCATGGAACACTGCATAACCCGTTTCTTTGAGGAGTGTGACC CCAACAAGGATAAGCACATCACCCTGAAGGAGTGGGGCCACTGCTTTGGAATTA AAGAAGAGGACATAGATGAAAATCTCTTGTTTTGAACGAAGATTTTAAAGAACTC AACTTTCCAGCATCCTCCTCTGTTCTAACCACTTCAGAAATATATGCAGCTGTGA TACTTGTAGATTTATATTTAGCAAAATGTTAGCATGTATGACAAGACAATGAGAGT AATTGCTTGACAACAACCTATGCACCAGGTATTTAACATTAACTTTGGAAACAAA AATGTACAATTAAGTAAAGTCAACATATGCAAAATACTGTACATTGTGAACAGAA GTTTAATTCATAGTAATTTCACTCTCTGCATTGACTTATGAGATAATTAATGATTA AACTATTAATGATAAAAATAATGCATTTGTATTGTTCATAATATCATGTGCACTTC AAGAAAATGGAATGCTACTCTTTTGTGGTTTACGTGTATTATTTTCAATATCTTAA TACCCTAATAAAGAGTCCATAAAAATCCAAATGCTT (SEQ ID NO: 43)
SPARCL1 Humano, Variante do transcrito 4, mRNA (SEQ ID NO: 44)
AAAAATGCATAAAGAGCCAAGTGCTTATATTCTGGCCAAGTTATGAGGCTCTGA GAACAAGAGCTTGAGGGGAAGACTGTTAACCCCATCCACGCCACCAGAATTAG CTCTTTCCCTTTTGGTTTGCAAGCACTGCCTGTAAAGCCCTCGCATGAGAGGCC AGCCTGCTAGGGAAATCCAGGAATCTGCAACAAAAACGATGACAGTCTGAAATA CTCTCTGGTGCCAACCTCCAAATTCTCGTCTGTCACTTCAGACCCCCACTAGTT GACAGAGCAGCAGAATTTCAACTCCAGTAGACTTGAATATGCCTCTGGGCAAAG AAGCAGAGCTAACGAGGAAAGGGATTTAAAGAGTTTTTCTTGGGTGTTTGTCAA ACTTTTATTCCCTGTCTGTGTGCAGAGGGGATTCAACTTCAATTTTTCTGCAGTG GCTCTGGGTCCAGCCCCTTACTTAAAGATCTGGAAAGCCATGAACAGTCAGCAG AACAGGGCAAGAGTTCTAGCCAAGAGCTGGGATTGAAGGATCAAGAGGACAGT GATGGTCACTTAAGTGTGAATTTGGAGTATGCACCAACTGAAGGTACATTGGAC ATAAAAGAAGATATGAGTGAGCCTCAGGAGAAAAAACTCTCAGAGAACACTGAT
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TTTTTGGCTCCTGGTGTTAGTTCCTTCACAGATTCTAACCAACAAGAAAGTATCA CAAAGAGAGAGGAAAACCAAGAACAACCTAGAAATTATTCACATCATCAGTTGAA CAGGAGCAGTAAACATAGCCAAGGCCTAAGGGATCAAGGAAACCAAGAGCAGG ATCCAAATATTTCCAATGGAGAAGAGGAAGAAGAAAAAGAGCCAGGTGAAGTTG GTACCCACAATGATAACCAAGAAAGAAAGACAGAATTGCCCAGGGAGCATGCTA ACAGCAAGCAGGAGGAAGACAATACCCAATCTGATGATATTTTGGAAGAGTCTG ATCAACCAACTCAAGTAAGCAAGATGCAGGAGGATGAATTTGATCAGGGTAACC AAGAACAAGAAGATAACTCCAATGCAGAAATGGAAGAGGAAAATGCATCGAACG TCAATAAGCACATTCAAGAAACTGAATGGCAGAGTCAAGAGGGTAAAACTGGCC TAGAAGCTATCAGCAACCACAAAGAGACAGAAGAAAAGACTGTTTCTGAGGCTC TGCTCATGGAACCTACTGATGATGGTAATACCACGCCCAGAAATCATGGAGTTG ATGATGATGGCGATGATGATGGCGATGATGGCGGCACTGATGGCCCCAGGCAC AGTGCAAGTGATGACTACTTCATCCCAAGCCAGGCCTTTCTGGAGGCCGAGAG AGCTCAATCCATTGCCTATCACCTCAAAATTGAGGAGCAAAGAGAAAAAGTACAT GAAAATGAAAATATAGGTACCACTGAGCCTGGAGAGCACCAAGAGGCCAAGAAA GCAGAGAACTCATCAAATGAGGAGGAAACGTCAAGTGAAGGCAACATGAGGGT GCATGCTGTGGATTCTTGCATGAGCTTCCAGTGTAAAAGAGGCCACATCTGTAA GGCAGACCAACAGGGAAAACCTCACTGTGTCTGCCAGGATCCAGTGACTTGTC CTCCAACAAAACCCCTTGATCAAGTTTGTGGCACTGACAATCAGACCTATGCTA GTTCCTGTCATCTATTCGCTACTAAATGCAGACTGGAGGGGACCAAAAAGGGGC ATCAACTCCAGCTGGATTATTTTGGAGCCTGCAAATCTATTCCTACTTGTACGGA CTTTGAAGTGATTCAGTTTCCTCTACGGATGAGAGACTGGCTCAAGAATATCCTC ATGCAGCTTTATGAAGCCAACTCTGAACACGCTGGTTATCTAAATGAGAAGCAG AGAAATAAAGTCAAGAAAATTTACCTGGATGAAAAGAGGCTTTTGGCTGGGGAC CATCCCATTGATCTTCTCTTAAGGGACTTTAAGAAAAACTACCACATGTATGTGT ATCCTGTGCACTGGCAGTTTAGTGAACTTGACCAACACCCTATGGATAGAGTCT TGACACATTCTGAACTTGCTCCTCTGCGAGCATCTCTGGTGCCCATGGAACACT
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GCATAACCCGTTTCTTTGAGGAGTGTGACCCCAACAAGGATAAGCACATCACCC TGAAGGAGTGGGGCCACTGCTTTGGAATTAAAGAAGAGGACATAGATGAAAATC TCTTGTTTTGAACGAAGATTTTAAAGAACTCAACTTTCCAGCATCCTCCTCTGTTC TAACCACTTCAGAAATATATGCAGCTGTGATACTTGTAGATTTATATTTAGCAAAA TGTTAGCATGTATGACAAGACAATGAGAGTAATTGCTTGACAACAACCTATGCAC CAGGTATTTAACATTAACTTTGGAAACAAAAATGTACAATTAAGTAAAGTCAACAT ATGCAAAATACTGTACATTGTGAACAGAAGTTTAATTCATAGTAATTTCACTCTCT GCATTGACTTATGAGATAATTAATGATTAAACTATTAATGATAAAAATAATGCATT TGTATTGTTCATAATATCATGTGCACTTCAAGAAAATGGAATGCTACTCTTTTGTG GTTTACGTGTATTATTTTCAATATCTTAATACCCTAATAAAGAGTCCATAAAAATC CAAATGCTT (SEQ ID NO: 44) [091] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar (i) mRNA de ERG que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos e/ou pelo menos 250 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 2, (ii) mRNA de PCA3 que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos e/ou pelo menos 450 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 3 e (iii) pelo menos uma porção de pelo menos um outro mRNA selecionado a partir do grupo que consiste de (1) mRNA de AMACR que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30
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54/92 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38; (2) mRNA de BIRC5 que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40; (3) mRNA de HOXC6 que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 41; e (4) mRNA de SPARCL1 que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:
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7, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.
[092] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação são usados para detectar o mRNA de ERG que apresenta a sequência de ácidos nucleicos de comprimento total da SEQ ID NO: 2, o mRNA de PCA3 que apresenta a sequência de ácidos nucleicos de comprimento total da SEQ ID NO: 3 e pelo menos um outro mRNA selecionado a partir do grupo que consiste de mRNA de AMACR que apresenta a sequência de ácidos nucleicos de comprimento total da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38, mRNA de BIRC5 que apresenta a sequência de ácidos nucleicos de comprimento total da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40, mRNA de HOXC6 que apresenta a sequência de ácidos nucleicos de comprimento total da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 41 e mRNA de SPARCL1 que apresenta a sequência de ácidos nucleicos de comprimento total da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.
[093] O nível de expressão de mRNA é detectado usando qualquer diversas técnicas reconhecidas no ramo. Por exemplo, os valores Ct (limite de ciclo) para cada biomarcador nas microvesículas de urina são determinados por análise RTqPCR. Em um ensaio de PCR em tempo real, uma reação positiva é detectada pelo acúmulo de um sinal fluorescente. O valor Ct é definido como o número de ciclos exigidos para o sinal fluorescente para cruzar o limite (isto é, excede o nível do fundo). Os níveis de Ct são inversamente proporcionais à quantidade de ácido nucleico alvo na amostra (isto é, quanto menor o nível de Ct, maior a quantidade de ácido nucleico alvo na amostra).
[094] Em algumas formas de realização, o número de cópias dos genes detectados (isto é, PCA3 e ERG) é calculado. O número de cópias também pode ser quantificado usando análise RT-qPCR de um ou mais ácidos nucleicos extraídos a partir das microvesículas de urina. O técnico habilitado pode facilmente determinar o número de cópias usando métodos conhecidos na técnica, tal como através do uso
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56/92 de uma curva de calibração.
[095] Para gerar uma curva de calibração, uma série de diluições de números de cópias conhecidos de cDNA de uma sequência de RNA sintética idêntica aos genes detectados é analisada na mesma placa das amostras analisadas para aqueles mesmos genes. Através da comparação dos valores Ct de amostras aos valores Ct da curva de calibração, o número de cópias exato das sequências nas amostras analisadas pode ser determinado. Através da relação dos valores Ct da amostra às curvas de calibração na mesma placa, o processo é “normalizado” para diferenças no desempenho do ensaio devido às variações na inexatidão da pipeta, desempenho do componente do ensaio (por exemplo, enzimas, sondas, primers, dNTPs, etc.), desempenho do instrumento do termociclador de qPCR (por exemplo, filtros, temperatura, etc.) e outra variação entre placas que possa ocorrer.
[096] Nos métodos fornecidos neste relatório, tais genes, cujos níveis de expressão são usados para calcular níveis de expressão relativos, são referidos coletivamente como “genes de referência”. Um gene de referência usado para determinar a suficiência da amostra de urina para RNA derivado de microvesícula são genes que são tipicamente encontrados nas microvesículas de urina, tais como genes de manutenção ou genes específicos da próstata. O nível de expressão de tais genes de referência é usado para normalizar a quantidade de sinal detectado para controlar a variabilidade na quantidade de microvesículas isoladas entre as amostras. Por exemplo, nos métodos fornecidos neste relatório, o gene de referência usado para normalização da expressão de PCA3 e ERG pode ser KLK3, o gene que codifica ou antígeno específico da próstata (PSA) ou SPDEF. O gene de referência pode ser um gene específico da próstata. Em algumas formas de realização, o gene de referência pode ser um gene de manutenção específico de não tecido, por exemplo, GAPDH. Nos métodos fornecidos neste relatório, a análise
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57/92 de expressão relativa ou normalização é realizada através da subtração do valor Ct para o gene marcador específico da próstata (por exemplo, KLK3) dos valores Ct obtidos para PCA3 e ERG com o resultado referido como ACt. Os números de cópias são calculados através do ajuste de uma curva da seguinte fórmula
Ct = b + a*log10(Calibração_Cópias) aos pontos de calibração conhecidos na série de diluições na placa para obter a “curva de calibração”. Os números de cópia para as amostras depois são calculados pela fórmula:
Amostra_Cópias = 10A((Ct_Amostra - b)/a).
Este cálculo de número de cópias é feito independentemente para cada gene marcador (por exemplo, PCA3 e/ou ERG), assim como para o gene de referência (por exemplo, KLK3 ou SPDEF). A “normalização” do sinal resultante a partir de um gene marcador (por exemplo, PCA3 e/ou ERG) depois é obtida através da divisão do número de cópias do gene marcador pelo número de cópias do gene de referência (por exemplo, ERG/SPDEF, ERG/KLK3, PCA3/SPDEF e ERG/SPDEF).
[097] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação usam um gene de referência compreendendo um mRNA de KLK3 que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos e/ou pelo menos 250 nucleotídeos ou mais da seguinte sequência de ácidos nucléicos: TTGTCTTCCTCACCCTGTCCGTGACGTGGATTGGTGCTGCACCCCTCATCCTGT CTCGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGTG CTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCA GTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGG
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GTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCC ACAGCTTCCCACACCCGCTCTACGATATGAGCC (SEQ ID NO: 8) [098] Em algumas formas de realização, os kits e/ou métodos da divulgação usam um gene de referência compreendendo um mRNA de SPDEF que apresenta pelo menos uma porção, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 150 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 250 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 350 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 450 nucleotídeos e/ou pelo menos 500 nucleotídeos ou mais da sequência de ácidos nucléicos da seguinte sequência de ácidos nucléicos: GGGAGACGAAUUGGGCCCUCUAGAUGCAUGCUCGAGCGGCCGCCAGUGUGA UGGAUAUCUGCAGAAUUCGCCCUUAUUUAAGUAGUGACAUGUUUUUGCACAU UUCCAGCCCCUUUAAAUAUCCACACACACAGGAAGCACAAAAGGAAGCACAGA GAUCCCUGGGAGAAAUGCCCGGCCCUGGGUGGGGAUGUGCUGCACGCCCAC CUGGACAUCUGGAAGUCAGCGGCCUGGAUGAAAGAGCGGACUUCACCUGGG GCGAUUCACUACAAAUCUGGAAAGCAUGAAGACUGGGCUUUUUUUCCUAUGU CUCUUGGGAACUGCAGCUGCAAUCCCGACAAAUGCAAGAUUAUUAUCUGAUC AUUCCAAACCAACUGCUGAAACGGUAGCACCAGUUGCCCAGAUAACUGUGAC GAUGGACUAUGCACCAAUGGUUGCAAGUACGAAGAUCUCUAUAGUAACUGUA AAAGUUUGAAGCUCACAUUAACCUGUAAACAUCAGUUGGUCAGGGACAGUUG CAAAAGGACCACCGCAUCUCUACAUUCAAGAACUGGCCCUUCUUGGAGGGCU GCGCCUGCACCCCGGAGCGGAUGGCCGAGGCUGGCUUCAUCCACUGCCCCA CUGAGAACGAGCCAGACUUGACCUGCGGCCGCAAGCUUGGAUCCGAAUUCCU GUGUGAAAUUGUUAUCCGCUCACAAUUCCACACAACAUACGAGCCGGAAGCA UAAAGUGUAAAGCCUGGGGUGCCUAAUGA (SEQ ID NO: 9) [099] Os níveis de expressão relativos ou normalizados de PCA3 e ERG e
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59/92 do gene de referência também podem ser analisados e comparados usando diversas técnicas reconhecidas no ramo. Por exemplo, a análise de Características de Operação do Receptor (ROC) pode ser conduzida para PCA3 e ERG e opcionalmente pelo menos um outro biomarcador, em que os níveis de expressão dos biomarcadores medidos produzem um valor de Área Sob a Curva (AUC) para cada biomarcador medido. As análises de ROC dos biomarcadores podem ser individualmente conduzidas, isto é, como biomarcadores individuais, ou combinadas para análise de regressão linear. Combinações de biomarcadores com alto valor diagnóstico como biomarcadores, conforme descrito neste relatório, com alto poder diagnóstico têm valores de AUC derivados de curvas ROC que são maiores do que 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8. Preferivelmente, o biomarcador ou combinação de biomarcadores têm um valor de AUC maior do que 0,7. Por exemplo, a combinação de PCA3 e ERG produz um valor de AUC maior do que 0,7.
[0100]A curva ROC é uma ferramenta amplamente usada para avaliar o poder discriminative e diagnóstico de um biomarcador. Quando o valor do biomarcador está ausente por algumas observações, a análise de ROC com base somente em casos completos perde eficiência por causa do tamanho da amostra reduzido, e com mais importância, está sujeita à inclinação potencial. Assim, métodos de imputação são implementados nos casos quando um valor de biomarcador está ausente.
[0101 ]A Área Sob a Curva (AUC) derivada da curva de Característica de Operação do Receptor (ROC) para cada nível de biomarcador ou um escore criado por uma combinação de biomarcadores é computado usando os resultados de biomarcador a partir dos controles e pacientes com doença. Uma pessoa habilitada na técnica seria prontamente capaz de maximizar a precisão de diagnóstico do nível de biomarcador ou combinação de biomarcadores através de uma análise de corte que inclui a sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (NPV), valor
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60/92 preditivo positivo (PPV), razão de probabilidade positiva (PLR) e razão de probabilidade negativa (NLR) necessários para a utilidade clínica.
[0102]A geração de curvas ROC e análise de uma população de amostras são usadas para estabelecer a valor de corte usado para distinguir subgrupos de sujeitos diferentes. Por exemplo, o valor de corte pode distinguir sujeitos com um alto risco de recorrência de câncer de um baixo risco de recorrência de câncer. Em algumas formas de realização, o valor de corte pode distinguir sujeitos que têm câncer de sujeitos que não têm câncer. Em algumas formas de realização, o valor de corte pode distinguir sujeitos com um câncer não agressivo de um câncer agressivo. Em algumas formas de realização, o valor de corte pode distinguir sujeitos com um câncer de próstata com alto escore de Gleason (por exemplo, GS > 6) de um câncer com baixo escore de Gleason.
[0103]Conforme descrito neste relatório, os níveis de expressão normalizados de PCA3 e ERG determinados a partir de uma amostra de urina de um sujeito são computados em um valor de saída para comparação com o valor de corte para distinguir subgrupos de sujeitos. Em algumas formas de realização, os níveis de expressão normalizados de PCA3 e ERG são determinados usando KLK3 como o gene de referência, como segue:
ACtERG = CtERG - CtKLK3
ACtPCA3 = CtPCA3 - CtKLK3
Os valores ACt para ERG e PCA3 depois são aplicados em uma fórmula matemática para gerar um valor de saída. Uma fórmula de exemplo para gerar o valor de saída é a seguinte:
Valor de saída = (ACíerg x 0,233) + (ACtpcA3 x 0,446) [0104]No caso de números de cópia, o Valor de Saída de um teste é calculado, como segue:
Valor de saída = CópiapcA3/CópiaKLK3 ou spdef x Coef + CópiaERG/CópiaKLK3 ou
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SPDEF x Coef, onde os coeficientes podem ser iguais, por exemplo, 1 (um). No caso onde os coeficientes são iguais, todos os genes têm a mesma contribuição relativa ao valor de saída. Em algumas formas de realização, os coeficientes são diferente para cada gene marcador, o que indica que cada gene marcador tem contribuições diferentes ao valor de saída e, desse modo, à probabilidade de uma biópsia positiva. Em uma abordagem, os coeficientes podem ser definidos através de ajuste da equação
Valor de saída = CópiapcA3/CópiaKLK3 ou spdef x Coef + CópiaERG/CópiaKLK3 ou spdef x Coef para um ajuste de dados existente por regressão linear.
[0105]Conforme mostrado nos exemplos fornecidos neste relatório, a combinação de PCA3 e ERG pode se diferenciar especificamente entre sujeitos biópsia negativa e biópsia positiva com 77,8 % de sensibilidade e 61,8 % de especificidade. Estes valores demonstram a concentração das combinações de gene biomarcador divulgadas neste relatório como biomarcadores diagnósticos sensíveis e específicos para câncer, tal como câncer de próstata.
[0106]O termo “sujeito” é intencionado a incluir todos os animais mostrados às, ou esperados ter microvesículas contendo ácido nucléico e/ou ácidos nucléicos circulantes na urina. Em formas de realização particulares, o sujeito é um mamífero; por exemplo, um primata humano ou não humano, um cão, um gato, um cavalo, uma vaca ou um outro animal de criação ou um roedor (por exemplo, um camundongo, rato, porquinho da índia, etc.).
AQUISIÇÃO DA FRAÇÃO DE UMA MICROVESÍCULA A PARTIR DE UMA AMOSTRA DE URINA [0107]Os métodos para procurar uma fração de uma microvesícula a partir de uma amostra de urina são descritos neste pedido, assim como em publicações científicas e pedidos de patente (Chen et al., 2010; Miranda et al., 2010; Skog et al.,
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2008). Veja também o WO 2009/100029, WO 2011 /009104, WO 2011 /031892 e WO 2011/031877. Estas publicações são incorporadas neste relatório como referência quanto às suas divulgações pertencentes ao isolamento da microvesícula ou métodos e técnicas de procura de fração. Estes métodos podem incluir as etapas para avaliar a integridade do RNA de uma fração de microvesícula isolada, por exemplo, através da detecção do nível de expressão de RNA de 18S e 28S na fração.
[0108]Por exemplo, os métodos de procura de microvesícula através de centrifugação diferencial são descritos em um papel por Raposo etal. (Raposo etal., 1996), um papel por Skog et a/.(Skog et al., 2008) e um papel por Nilsson et a/.(Nilsson et al., 2009). Os métodos de troca aniônica e/ou cromatografia de permeação em gel são descritos nas Patentes U.S. N22 6.899.863 e 6.812.023. Os métodos de gradientes de densidade de sacarose ou eletroforese de organelas são descritos na Patente U.S. N2 7.198.923. Um método de separador celular ativado magnético (MACS) é descrito em um papel por Taylor e Gercel-Taylor (Taylor e Gercel-Taylor, 2008). Um método de concentração de ultrafiltração por nanomembrana é descrito em um papel por Cheruvanky et al. (Cheruvanky et al., 2007). Além disso, as microvesículas podem ser identificadas e isoladas a partir de um fluido corpóreo do sujeito por uma tecnologia de microchip que usa uma plataforma microfluídica para separar microvesículas derivadas de tumor (Chen et al., 2010). Cada uma das referências precedentes é incorporada como referência neste relatório quanto aos seus ensinamentos destes métodos.
[0109]Em uma forma de realização dos métodos descritos neste relatório, as microvesículas isoladas da urina são enriquecidas para aquelas que se originam da próstata ou células de tumor. Pelo fato de que as microvesículas frequentemente carregam moléculas de superfície, tais como antígenos a partir de suas células doadoras, moléculas de superfície podem ser usadas para identificar, isolar e/ou
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63/92 enriquecer as microvesículas a partir de um tipo celular doador específico (AlNedawi et al., 2008; Taylor e Gercel-Taylor, 2008). Deste modo, as microvesículas que se originam de populações celulares distintas podem ser analisadas quanto ao seu teor de ácido nucléico. Por exemplo, microvesículas de tumor (maligno e não maligno) carregam antígenos de superfície associados ao tumor e podem ser detectadas, isoladas e/ou enriquecidas por intermédio destes antígenos de superfície associados ao tumor específicos. Em um exemplo, o antígeno de superfície é molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), que é específica às microvesículas a partir de carcinomas de pulmão, colorretal, de mama, próstata, cabeça e pescoço e origem hepática, mas não de origem celular hematológica (Balzar etal., 1999; Went etal., 2004).
[0110]Adicionalmente, microvesículas específicas de tumor podem ser caracterizadas pela falta de marcadores de superfície, tais como CD80 e CD86. Nestes casos, as microvesículas com os marcadores, tais como CD80 e CD86, podem ser excluídas para análise adicional de marcadores específicos de tumor. A exclusão pode ser obtida através de vários métodos, por exemplo, exclusão por afinidade.
[0111 ]A procura de frações de microvesícula a partir da próstata pode ser realizada, por exemplo, através do uso de anticorpos, aptâmeros, análogos de aptâmero ou polímeros molecularmente imprimidos específicos para um antígeno de superfície desejado. Em algumas formas de realização, o antígeno de superfície é específico para um tipo de câncer. Em algumas formas de realização, o antígeno de superfície é específico para um tipo celular que não é necessariamente canceroso.
[0112]Um exemplo de um método de separação de microvesícula com base em antígeno de superfície celular é fornecido na Patente U.S. N2 7.198.923. Conforme descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. N22 5.840.867 e 5.582.981, WO/2003/050290 e uma publicação de Johnson et al. (Johnson et al., 2008),
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64/92 aptâmeros e seus análogos se ligam especificamente às moléculas de superfície e podem ser usados como uma ferramenta de separação para recuperar microvesículas específicas do tipo celular. Polímeros molecularmente imprimidos também reconhecem especificamente as moléculas de superfície, conforme descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. N22 6.525.154, 7.332.553 e 7.384.589 e uma publicação de Bossi etal. (Bossi et al., 2007) e são uma ferramenta para recuperar e isolar as microvesículas específicas do tipo celular. Cada uma das referências precedentes é incorporada neste relatório quanto ao seu ensinamento destes métodos.
[0113]Nos métodos descritos neste relatório, uma amostra de urina pode ser pré-processada através de uma ou mais etapas de filtração ou centrifugação para remover os resíduos celulares e outra matéria sem microvesícula. Por exemplo, a amostra de urina pode ser filtrada através de um filtro de 0,8 pm. Opcionalmente, o filtrado adquirido a partir do filtro de 0,8 pm pode ser adicionalmente filtrado através de um filtro de 0,22 pm. Para isolar as microvesículas de urina, as amostras préprocessadas depois são concentrados usando uma etapa de concentração por filtração. Esta etapa compreende utilizar um filtro que apresenta um corte molecular para reter e concentrar as microvesículas que são maiores do que 10 nm em diâmetro. Por exemplo, a amostra depois é concentrada em um volume menor do que 1 mL, preferivelmente 100 a 200 pL. Por exemplo, o corte de peso molecular é de pelo menos 100 kDa. Preferivelmente, o corte de peso molecular é de 100 kDa.
EXTRAÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO A PARTIR DAS MICROVESÍCULAS [0114]Os métodos para extração de ácido nucléico são, em geral, com base em procedimentos bem conhecidos na técnica. Pessoas de habilidade selecionarão um procedimento de extração particular, conforme apropriado, para a amostra biológica particular. Exemplos de procedimentos de extração são fornecidos nas publicações de patente WO 2009/100029, US 201/00196426, US 2011/0003704, US
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2011/0053157, WO 2011/009104 e WO 2011/031892. Estas publicações são incorporadas neste relatório como referência quanto a sua divulgação pertencente à métodos e técnicas extração de ácido nucléico da microvesícula.
[0115]Nos métodos descritos neste relatório, um inibidor de RNase é adicionado à amostra depois do isolamento e purificação da microvesícula, mas antes da lise da microvesícula e extração de ácido nucléico para o propósito de prevenir degradação indesejável dos ácidos nucleicos depois da extração. As microvesículas são lisadas no presente inibidor de RNase. O lisato depois é adicionado a uma coluna de ligação ao RNA, sob tais condições conhecidas na técnica, de modo que o RNA da microvesícula se liga à coluna. Opcionalmente, a coluna é lavada para aumentar a qualidade e rendimento do RNA. Em seguida, o RNA é eluído sob condições conhecidas na técnica, tal que RNA de alta qualidade é coletado.
[0116]Em algumas formas de realização, a qualidade dos ácidos nucleicos extraídos pode ser avaliada através da detecção de RNA ribossômico de 18S e 28S e determinação da razão. A razão de rRNA 18S:28S é, preferivelmente, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2; mais preferivelmente, de aproximadamente 1:2.
[0117]Em algumas formas de realização, os ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir das amostras de urina sem isolamento ou purificação da fração de uma microvesícula.
DETECÇÃO DE BIOMARCADORES DE ÁCIDO NUCLÉICO [0118]A detecção do biomarcador pode ser realizada nos ácidos nucleicos extraídos em diversas maneiras e constitui muitos aspectos. Em algumas formas de realização, a detecção de biomarcadores de ácido nucléico a partir de uma ou mais amostras de urina ocorre para obter um perfil de todos ou porções dos ácidos nucleicos extraídos.
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66/92 [0119]Um perfil, conforme o termo é usado neste relatório, se refere a uma representação de características particulares de uma coleta de ácidos nucleicos, que pode ser determinada através da análise quantitativa ou qualitativa de um ou mais ácidos nucleicos contidos nas microvesículas ou fração de uma microvesícula isolada a partir de uma amostra de urina a partir de um sujeito. Um perfil de referência é definido neste relatório como um perfil obtido a partir de um sujeito independente ou um grupo de sujeitos, ou a partir do mesmo sujeito em um tempo no ponto diferente.
[0120]Os ácidos nucleicos nas microvesículas podem ser um ou mais tipos de ácidos nucleicos, exemplos dos quais são fornecidos neste relatório.
[0121]Os ácidos nucleicos podem ser RNA. O RNA pode ser RNA codificante, por exemplo, RNA mensageiro, que pode codificar proteínas. O RNA também pode ser RNA não codificante (ncRNA), por exemplo, RNA ribossômico, RNA de transferência, microRNA e outros transcritos não codificantes que podem se originar a partir de DNA genômico. Este transcritos de RNA não codificante podem incluir transcritos que são transcritos a partir de repetições satélite; e transposons que podem ser transposons ou retrotransposons de DNA. Preferivelmente, os ácidos nucleicos são mRNAs.
[0122]Os ácidos nucleicos podem ser DNA. O DNA pode ser DNA de fita única que é transcrito reverso a partir do RNA, por exemplo, cDNA. A transcrição reversa é usualmente mediada por transcriptase reversa codificada por um gene de transcriptase reversa em uma célula. O DNA também pode ser DNA de fita única que é gerado durante a replicação de DNA. O DNA genômico se replica no núcleo, enquanto a célula está se dividindo. Alguns dos DNAs replicados podem sair de seu molde, podem ser exportados para fora do núcleo e empacotados em microvesículas. O DNA pode ser adicionalmente fragmentos de DNA de fita dupla.
[0123]Além disso, o DNA pode ser DNA não codificante (ncDNA). O genoma
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67/92 humano contém apenas cerca de 20.000 genes codificantes de proteína, representando menos do que 2 % do genoma. A razão de sequências de DNA não codificantes para codificantes de proteína aumenta como uma função de complexidade de desenvolvimento (Mattick, 2004). Procariontes apresentam menos do que 25 % de ncDNA, eucariontes simples apresentam entre 25 a 50 % organismos multicelulares mais complexos como plantas e animais apresentam mais do que 50 % de ncDNA, com seres humanos apresentando cerca de 98,5 % de ncDNA (Mattick, 2004).
[0124]Alguns dos ncDNAs a partir do genoma são transcritos em ncRNAs. NcRNAs foram implicados em muitos processos importantes na célula, por exemplo, enzimas (ribozimas), que se ligam especificamente às proteínas (aptâmeros) e regulam a atividade do gene nos níveis transcricionais e pós-transcricionais.
[0125]Um perfil de ácidos nucleicos pode ser obtido através da análise dos ácidos nucleicos obtidos a partir das microvesículas isoladas, de acordo com protocolos padrão na técnica. Por exemplo, a análise do DNA pode ser realizada através de um ou mais métodos conhecidos na técnica, incluindo análise de microarranjo para determinar a espécie de ácido nucléico no extrato, PCR quantitativa para medir os níveis de expressão de genes, sequenciamento de DNA para detectar mutações em genes e ensaios de metilação de bissulfito para detectar o padrão de metilação de genes.
[0126]Para obter perfis, em alguns exemplos, a análise de dados pode ser realizada. Tal análise de dados pode ser realizada, por exemplo, através da Análise de Agrupamento, Análise do Componente de Princípio, Análise Discriminante Linear, Análise da Curva de Característica de Operação do Receptor, Análise Binária, Análise do Risco Proporcional de Cox, Máquinas de Vetor de Suporte e Eliminação de Característica Recursive (SVM-RFE), Classificação ao Centroide Mais Próximo, Análise com base em Evidência ou uma combinação de qualquer uma entre as
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68/92 técnicas analíticas precedentes.
[0127]Para um outro exemplo, a análise de RNA pode ser realizada usando o método de análise de Expressão Gênica Digital (DGE) (Lipson et al., 2009). Ainda para um outro exemplo de análise de RNA, o RNA pode ser digerido e convertido em cDNA de fita única que depois pode estar sujeito à análise de sequenciamento em uma máquina de sequenciamento de DNA, por exemplo, o Sequenciador de Molécula Única HeliScope™ a partir da Helicos BioSciences, conforme descrito em uma publicação por Ting etal. (Ting etal., 2011).
[0128]Em outros exemplos, o RNA pode ser transcrito reverso em DNA complementar (cDNA) antes da amplificação adicional. Tal transcrição reversa pode ser realizada sozinha ou em combinação com uma etapa de amplificação. Um exemplo de um método que combina transcrição reversa e etapas de amplificação é reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), que ainda pode ser modificada para ser quantitativa, por exemplo, quantitativo RT-PCR, conforme descrito na Patente U.S. N2 5.639.606, que é incorporada neste relatório como referência quanto ao seu ensinamento. Um outro exemplo do método compreende duas etapas separadas: uma primeira etapa de transcrição reversa para converter RNA em cDNA e uma segunda etapa de quantificação da quantidade de cDNA usando PCR quantitativa.
[0129]Os métodos de amplificação de ácido nucléico incluem, sem limitação, reação em cadeia da polimerase (PCR) (Patente U.S. N2 5.219.727) e suas variantes, tais como reação em cadeia da polimerase in situ (Patente U.S. N2 5.538.871), reação em cadeia da polimerase quantitativa (Patente U.S. N2 5.219.727), reação em cadeia da polimerase aninhada (Patente U.S. N2 5.556.773), replicação de sequência autossustentada e suas variantes (Guatelli et al., 1990), sistema de amplificação transcricional e suas variantes (Kwoh et al., 1989), Qb Replicase e suas variantes (Miele et al., 1983), PCR a frio (Li et al., 2008), BEAMing
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69/92 (Li et al., 2006) ou quaisquer outros métodos de amplificação de ácido nucléico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando técnicas bem conhecidas àqueles de habilidade no ramo. Especialmente úteis são aqueles esquemas de detecção designados para a detecção de moléculas de ácido nucléico, se tais moléculas estão presentes em números muito baixos. As referências precedentes são incorporadas neste relatório quanto aos seus ensinamentos destes métodos.
[0130]Em algumas formas de realização, a etapa de amplificação de ácido nucléico não é realizada. Os ácidos nucléicos não amplificados podem ser analisados por PCR quantitativa (RT-PCR) ou diretamente analisados, por exemplo, através de sequenciamento de próxima geração ou tecnologia NanoString.
[0131 ]A análise de ácidos nucléicos presentes nas microvesículas isoladas pode ser quantitativa e/ou qualitativa. Para a análise quantitativa, os níveis de expressão, relativos ou absolutos, de ácidos nucléicos de interesse específicos nas microvesículas isoladas são medidos com os métodos conhecidos na técnica e descritos neste relatório. Para análise qualitativa, a espécie de ácidos nucléicos de interesse nas microvesículas isoladas, se do tipo selvagem ou variantes, são identificados com os métodos conhecidos na técnica.
[0132]Em algumas formas de realização, a detecção de biomarcadores de ácido nucléico envolve a detecção da presença ou ausência de um ou uma coleta de anomalias genéticas. O termo “anomalia genética” é usado neste relatório para se referir às quantidades de ácido nucléico, assim como variantes de ácido nucléico dentro das microvesículas contendo ácido nucléico. Especificamente, anomalias genéticas incluem, sem limitação, superexpressão de um gene (por exemplo, um oncogene) ou um painel de genes, infraexpressão de um gene (por exemplo, um gene supressor de tumor, tal como p53 ou RB) ou um painel de genes, produção alternativa de variantes de ligação de um gene ou um painel de genes, variantes de número de cópia de gene (CNV) (por exemplo, minutos de DNA duplo) (Hahn,
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1993), modificações de ácido nucleico (por exemplo, metilação, acetilação e fosforilações), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) (por exemplo, polimorfismos em elementos Alu), rearranjos cromossômicos (por exemplo, inversões, deleções e duplicações) e mutações (inserções, deleções, duplicações, mudanças missentido, sem sentido, sinônimas ou quaisquer outras mudanças de nucleotídeos) de um gene ou um painel de genes, as mutações, em muitos casos, afetam basicamente a atividade e função dos produtos de gene, levam às variantes de ligação transcricionais alternativas e/ou mudanças de nível de expressão de gene ou combinações de qualquer um entre os precedentes.
[0133]Anomalias genéticas podem ser encontradas em muitos tipos de ácidos nucleicos. A determinação de tais anomalias genéticas pode ser realizada através de uma variedade de técnicas conhecidas ao técnico habilitado. Por exemplo, os níveis de expressão de ácidos nucleicos, variantes de ligação alternativas, reagrupamento de cromossomo e números de cópia de gene podem ser determinados através de análise de microarranjo (veja, por exemplo, as Patente U.S. N— 6.913.879, 7.364.848, 7.378.245, 6.893.837 e 6.004.755) e PCR quantitativa. Mudanças no número de cópias podem ser detectadas, por exemplo, com o ensaio de genotipagem de genoma total Illumina Infinium II ou Microarranjo de Genoma CGH Humano Agilent (Steemers etal., 2006).
[0134]Modificações de ácido nucleico podem ser avaliadas por métodos descritos, por exemplo, na Patente U.S. N2 7.186.512 e publicação de patente WO/2003/023065. Perfis de metilação podem ser determinados, por exemplo, através de Painel de Câncer de Metilação de DNA OMA003 Illumina.
[0135]SNPs e mutações podem ser detectados por hibridização com sondas específicas do alelo, detecção de mutação enzimática, divagem química de heteroduplex pareado erroneamente (Cotton et al., 1988), divagem de ribonuclease de bases pareadas erroneamente (Myers et al., 1985), espectrometria de massas
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71/92 (Patentes U.S. N22 6.994.960, 7.074.563 e 7.198.893), sequenciamento de ácido nucleico, polimorfismo de conformação de fita única (SSCP) (Orita et al., 1989), eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) (Fischer e Lerman, 1979a; Fischer e Lerman, 1979b), eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE) (Fischer e Lerman, 1979a; Fischer e Lerman, 1979b), polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) (Kan e Dozy, 1978a; Kan e Dozy, 1978b), ensaio de ligação de oligonucleotídeos (OLA), PCR específica do alelo (ASPCR) (Patente U.S. N2 5.639.611), reação em cadeia de ligação (LCR) e suas variantes (Abravaya et al., 1995; Landegren et al., 1988; Nakazawa et al., 1994), análise de heteroduplex com fluxo citométrico (WO/2006/113590) e combinações/modificações dos mesmos.
[0136]Em algumas formas de realização, a detecção de mutações é realizada através do uso de uma enzima de restrição que apenas digere uma variante do biomarcador, mas não digere outras variantes do biomarcador. Conforme é conhecido na técnica, enzimas de restrição reconhecem fielmente estiramentos particulares de polinucleotídeos e a mudança de um ou mais nucleotídeos no estiramento de polinucleotídeos, mais provavelmente, tornará a polinucleotídeo não reconhecível e indigerível pela enzima. Como tal, a detecção de uma variante de um biomarcador pode ser auxiliada pela digestão de algumas ou todas as outras variantes que podem ser reconhecidas pela enzima. A variante que será detectada pode ser uma variante do tipo selvagem ou uma variante mutante.
[0137]Os níveis de expressão de gene podem ser determinados pela análise em série da técnica de expressão gênica (SAGE) (Velculescu et al., 1995), PCR quantitativa, PCR com transcrição reversa quantitativa, análise de microarranjo, e sequenciamento de DNA de próxima geração, conforme conhecido na técnica.
[0138]Em geral, os métodos para analisar as anomalias genéticas são relatados em diversas publicações, não limitadas àquelas citadas neste relatório, e
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72/92 estão disponíveis aos técnicos habilitados. O método apropriado de análise dependerá dos objetivos específicos da análise, da condição/histórico do paciente e dos cânceres específicos, doenças ou outras condições médicas que serão detectadas, monitoradas ou tratadas.
BIOMARCADORES ASSOCIADOS COM DOENÇAS OU OUTRAS CONDIÇÕES MÉDICAS [0139]Muitos biomarcadores podem estar associados com a presença ou ausência de uma doença ou outra condição médica em um sujeito. Portanto, a detecção da presença ou ausência de tais biomarcadores em uma extração de ácido nucléico a partir das microvesículas isoladas, de acordo com os métodos divulgados neste relatório, pode auxiliar no diagnóstico, prognóstico ou monitoramento do progresso ou reocorrência da doença ou outra condição médica no sujeito.
[0140]ERG, como usado neste relatório, se refere a um gene também conhecido como homólogo do oncogene do vírus E26 de eritroblastose v-ets e quaisquer isoformas identificadas. Por exemplo, isoformas de ERG incluem ERG1, ERG2, ERG3, ERG4, ERG5, ERG6, ERG7, ERG8 e ERG9. ERG também pode se referir à isoforma 1 específica do câncer de próstata de ERG (EPC1) e isoforma 2 específica do câncer de próstata de ERG (EPC2). ERG ou qualquer uma entre as isoformas de ERG pode ser usado como um biomarcador para câncer de próstata.
[0141]PCA3, conforme usado neste relatório, também se refere ao gene também conhecido como DD3 e quaisquer isoformas identificadas e é útil como um biomarcador para câncer de próstata.
[0142]Muitos biomarcadores também foram descobertos influenciar a seleção de terapia para um paciente particular. A detecção da presença ou ausência de tais biomarcadores em uma extração de ácido nucléico a partir das microvesículas isoladas, de acordo com os métodos divulgados neste relatório, pode auxiliar na seleção de terapia em um dado paciente.
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SUBGRUPOS DE PACIENTE [0143]A presente invenção fornece métodos para detectar um ou mais biomarcadores em amostras de urina a partir de um sujeito para auxiliar no diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia para uma doença, tal como, por exemplo, câncer, particularmente, um câncer agressivo.
[0144]A seleção de um indivíduo a partir do qual as microvesículas são isoladas é realizada pelo técnico habilitado com base na análise de uma variedade de fatores. Tais fatores para consideração são se o sujeito apresenta um histórico de família de uma doença específica (por exemplo, um câncer), apresenta uma predisposição genética para tal doença, apresenta um risco aumentado para tal doença, apresenta sintomas físicos que indicam uma predisposição ou razões ambientais. Razões ambientais incluem estilo de vida, exposição aos agentes que causam ou contribuem para a doença, tais como no ar, terra, água ou dieta. Outras razões para selecionar um indivíduo para realizar os métodos divulgados neste relatório incluem histórico prévio com a doença, correntemente diagnosticado com a doença antes da terapia ou depois da terapia, correntemente tratado para a doença (que passa por terapia) ou em remissão ou recuperação da doença.
[0145]O câncer diagnosticado, monitorado ou, de outro modo, avaliado com os métodos nesta invenção, podem ser qualquer tipo de câncer ou condição précancerosa. Isto inclui, sem limitação, cânceres de células epiteliais, tais como cânceres de pulmão, ovário, cervicais, endometriais, de mama, cérebro, cólon e próstata. Também incluídos são câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer do sistema nervoso, câncer de retina, câncer de pele, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer renal, câncer genital e câncer de bexiga, melanoma e leucemia. Além disso, os métodos e composições da presente invenção são igualmente aplicáveis à detecção, diagnóstico e prognóstico de tumores não malignos em um indivíduo (por exemplo,
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74/92 neurofibromas, meningiomas e schwannomas). O câncer pode ser qualquer câncer agressivo. Em algumas formas de realização, o câncer é um câncer urogenital, tal como câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer renal e câncer metastático que se espalharam para o trato urogenital.
[0146]A presente invenção fornece biomarcadores que são de valor diagnóstico e prognóstico significante em subgrupos de paciente diferentes. Os pacientes apresentam câncer, por exemplo, câncer de próstata. Em algumas formas de realização, um ou mais biomarcadores são detectados em pacientes que sofreram prostatectomia radical. Em algumas formas de realização, um ou mais biomarcadores são detectados em pacientes que foram determinados com um escore de Gleason particular. Em algumas formas de realização, um ou mais biomarcadores são detectados em pacientes que expressam ERG ou pacientes nos quais o câncer é determinado para ser acionado por expressão de ERG. Estes pacientes são referidos neste relatório como “Expressadores de ERG”. A presença de ERG ou expressão de ERG em um certo limite pré-determinado determina cânceres acionados pela expressão de ERG. Em algumas formas de realização, um ou mais biomarcadores são detectados em pacientes que não expressam ERG ou pacientes nos quais o câncer é determinado para não ser acionado pela expressão de ERG. Estes pacientes são referidos neste relatório como “Não expressadores de ERG”.
[0147]O sistema de Classificação de Gleason é comumente usado na técnica como um parâmetro de prognóstico, frequentemente usado em combinação com outros fatores ou testes prognósticos para câncer de próstata. As amostras de biópsia da próstata são examinadas, por exemplo, através de microscópio, e um escore de Gleason é determinado por um patologista com base no padrão arquitetônico do tumor de próstata. O escore de Gleason é determinado com base no grau de perda da arquitetura de tecido glandular normal (isto é, forma, tamanho e
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75/92 diferenciação das glândulas). A amostra é determinada com um grau ao padrão de tumor mais comum e um segundo grau ao próximo padrão de tumor mais comum. Pode ser um padrão primário ou mais comum e depois um segundo padrão mais comum ou secundário que pode ser identificado; alternativamente, pode ser apenas um grau único. Os padrões de Gleason estão associados com as seguintes características:
• Padrão 1 - A próstata cancerosa se assemelha ao tecido de próstata normal. As glândulas são pequenas, bem formadas e de forma compacta.
• Padrão 2 - O tecido ainda apresenta glândulas bem formadas, mas elas são maiores e apresentam mais tecido entre as mesmas.
• Padrão 3 - O tecido ainda apresenta glândulas reconhecíveis, mas as células são mais escuras. Em alta ampliação, algumas destas células deixaram as glândulas e estão começando a invadir o tecido adjacente.
• Padrão 4 - O tecido apresenta algumas glândulas reconhecíveis. Muitas células estão invadindo o tecido adjacente.
• Padrão 5 - O tecido não apresenta glândulas reconhecíveis. Existem frequentemente apenas folhas de células em todo o tecido adjacente.
[0148]As duas classificações são adicionadas em conjunto para fornecer um Escore de Gleason, também conhecido como uma soma de Gleason. Os escores de 2 a 4 são muito baixos na escala de agressão do câncer. Os escores de 5 a 6 são suavemente agressivos. Um escore de 7 indica que o câncer é moderadamente agressivo. Os escores de 8 a 10 indicam que o câncer é altamente agressivo.
[0149]Outros sistemas de classificação para estratificar cânceres não agressivos de cânceres agressivos para outros cânceres, tal como câncer de bexiga ou câncer renal, são conhecidos na técnica.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: MATERIAIS E MÉTODOS
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76/92 [0150]Sequências de Pr/mer/Sonda: Os kits e métodos para detectar coortes de biomarcador de urina usam as seguintes sequências de pr/mer/sonda. AS seguintes abreviações são usadas na Tabela 1 abaixo: sondas a partir da Integrated DNA Technologies são designadas como “IDT,” 5’-FAM se refere a um corante repórter 5’, “3IABkFQ” se refere a um supressor 3’-lowaBlack e “ZEN” se refere a um supressor em sequência-ZEN™ a partir da IDT.
Tabela 1. Sequências de or/mer/sonda
Alvo Designação Sequência/Modificações
SPDEF 0881_SPDEF_e3 - 4_f F IDT CCACCTGGACATCTGGAAG (SEQ ID NO: 10)
SPDEF 0884 SPDEF e3 - 4 r1 IDT AATCGCCCCAGGTGAAGT (SEQ ID NO: 11)
SPDEF 0883_SPDEF_e3 - 4_p_ZEN /56-FAM/CGG CCT GGA/ZEN/TGA AAG AGC G/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 12)
ERG 0498_ERG_ex11 - 12JDTJ (ERG LDT F1) GCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAG (SEQ ID NO: 13)
ERG 0499_ERG_ex12 - 13 IDT R (ERG LDT R1) CTGGCCACTGCCTGGATT (SEQ ID NO: 14)
ERG 0500_ERG_ex12IDTFAM ZEN probe /56-FAM/CTT GGA CCA/ZEN/ACA AGT AGC CGC CTT GC/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 15)
PCA3 0539_PCA3_ex3 - 4 maliq IDT f GCA CAT TTC CAG CCC CTT TA (SEQ ID NO: 16)
PCA3 0540_PCA3_ex3 - 4 maliq IDT r GGC ATT TCT CCC AGG GAT CT (SEQ ID NO: 17)
PCA3 0541_PCA3_ex3 - 4_malig_IDT_FAM_ZEN_ probe /56-FAM/CAC ACA GGA/ZEN/AGC ACA AAA GGA AGC/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 18)
Qbeta 0545_Qbeta_P3_IDT_f AAC GGT TCT TGT GAC CCA TC (SEQ ID NO: 19)
Qbeta 0546_Qbeta_P3_IDT_r CGA ACA AAA GCT CGT TCC TC (SEQ ID NO: 20)
Qbeta 0547_Qbeta_P3_Tm69_l DT FAM ZEN probe /56-FAM/CGC CAG GCA/ZEN/TAT GCT GAC GTG/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 21)
KLK3 0535_KLK3_LDT_ex1 - 2 P3 f (KLK3 LDT F1) CCTGTCCGTGACGTGGAT (SEQ ID NO: 22)
KLK3 0536_KLK3_LDT_ex1 - 2 P3 r (KLK3 LDT R) CAGGGTTGGGAATGCTTCT (SEQ ID NO: 23)
KLK3 0538_KLK3_ex1 - 2_P3_Tm70_FAM_ZEN_ probe /56-FAM/CGG ATT GTG/ZEN/GGA GGC TGG GA/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 24)
TMPRSS: ERG 0949_TMPRSS-ERG_SL_F GCC TGG AGC GCG GCA G (SEQ ID NO: 25)
TMPRSS: ERG 0951 TMPRSS- ERG SL R2 GCA CAC TCA AAC AAC GAC TG (SEQ ID NO: 26)
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77/92
TMPRSS: ERG 0955 TMPRSS- ERG SL P1 /56-FAM/AGC CTT ATC/ZEN/AGT TGT GAG TGA GGA C/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 27)
AMACR 0508_AMACR_ex1 - 2 LDT f GCCGCGGTGTCATGG (SEQ ID NO: 28)
AMACR 0509 AMACR ex2 LDT r TTTCCCGCTGCAGAATCTC (SEQ ID NO: 29)
AMACR 0510_AMACR_353_IDT_ FAM ZEN probe /56-FAM/AGA AAC TCC/ZEN/AGC TGG GCC CA/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 30)
BIRC5 0582_BIRC5_P3_e1 -2_F GGA CCA CCG CAT CTC TAC AT (SEQ ID NO: 31)
BIRC5 0583_BIRC5_P3_e1 -2_R GTC TGG CTC GTT CTC AGT GG (SEQ ID NO: 32)
BIRC5 0584_BIRC5_P3_e1-2_ IDT FAM ZEN probe /56-FAM/CTT CTT GGA/ZEN/GGG CTG CGC CT/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 33)
SPARCL1 0585_SPARCL1_P3-2_f TCT GGA AAG CAT GAA GAC TGG (SEQ ID NO: 34)
SPARCL1 0586 SPARCL1P3-2R TGC TAC CGT TTC AGC AGT TG (SEQ ID NO: 35)
SPARCL1 0587_SPARCL1_P3-2_ IDT FAM ZEN probe /56-FAM/CTG CAG CTG/ZEN/CAA TCC CGA CA/3IABkFQ/(SEQ ID NO: 36)
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DE COORTE 7 DE PACIENTE [0151]Uma coorte de amostras de paciente foi usada para identificar biomarcadores úteis para detectar câncer de próstata a partir de ácidos nucléicos extraídos das microvesículas derivadas de urina. Uma coorte de paciente de 258 sujeitos, referida como “coorte 7” neste exemplo, foi arrolada neste estudo. Entre os 258 sujeitos, 196 apresentaram sua primeira biópsia e 59 apresentaram biópsias repetidas. Entre os pacientes de biópsia primária, 87 apresentaram resultados de biópsia positiva e 109 apresentaram resultados de biópsia negativa. Entre os pacientes de biópsia repetida, 15 apresentaram resultados de biópsia positiva e 44 apresentaram resultados de biópsia negativa.
[0152]Volumes de amostra de urina variaram de 20 a 100 mL. A distribuição do volume inicial das amostras de urina a partir dos pacientes foi a seguinte: volume de amostra (V) é igual a 20 mL (isto é, V = 20 mL), 21 % dos pacientes (n = 55); volumes de amostra são maiores do que 20 mL, mas menores do que ou iguais a 40 mL (isto é, 20 mL < V <,40 mL), 27 % dos pacientes (n = 70); ou os volumes de amostra são maiores do que 40 mL (isto é, V > 40 mL), 52 % dos pacientes (n = 133).
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78/92 [0153]As amostras de urina a partir da coorte 7 foram analisados, conforme representado nas Figuras 1A e 1B. Por exemplo, as amostras de urina foram coletadas e filtradas através de um filtro de 0,8 pm para separar as células e outros resíduos celulares das microvesículas e as frações enriquecidas de microvesícula foram congeladas a -80 °C. Uma primeira alíquota a partir de cada amostra (S1) foi adicionalmente processada. Etapas de processamento adicionais podem incluir centrifugação, concentração através de um concentrador de filtração, 1 a 2 etapas de lavagem e/ou adição de inibidor de RNase. Opcionalmente, partículas controle, tais como partículas de Q-beta, podem ser adicionadas às amostras antes do isolamento da microvesícula ou extração de ácido nucléico para determinar a qualidade do isolamento ou extração de ácido nucléico. Por exemplo, 18 sujeitos foram removidos do estudo, devido às falhas de Q-beta controle.
[0154]Especificamente, a amostra de urina é primeiro filtrada e o filtrado é descartado. Q-beta controle é adicionada na concentração apropriada (por exemplo, 100 cópias) a uma alíquota das amostras de urina filtradas (por exemplo, 15 mL). A alíquota depois é processada através de um concentrador de filtro e o filtrado é descartado. O retentato é recolocado em suspensão com uma segunda alíquota de amostras de urina filtradas (por exemplo, 5 mL de urina filtrada) e processado através de um concentrador de filtro. O retentato depois é lavado pelo menos uma vez (por exemplo, duas vezes) e novamente girado no concentrador de filtro. O inibidor de RNase é adicionado ao retentato localizado na câmara superior do concentrador de filtro e incubado na temperatura ambiente, por exemplo, durante 2 a 3 minutos. Tampão de lise depois é adicionado à amostra diretamente e incubado durante 1 minuto. O lisato depois é transferido para um outro recipiente para continuar com a extração de ácido nucléico.
[0155]As amostras depois são submetidas à extração de ácido nucléico usando métodos bem conhecidos na técnica e condições adequadas para produzir
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RNA de alta qualidade. 12 μΙ do RNA extraído são analisados pelo BioAnalyzer Profile. O RNA extraído é transcrito reverso em cDNA (Kit de Síntese de cDNA SUPERSCRIPT® VILO, Life Technologies). PCR em tempo real quantitativa foi realizada nas amostras de cDNA para determinar a expressão gênica de PCA3, ERG, KLK3 e Qbeta (2 μΙ por gene). Uma curva de calibração padrão foi apresentada em cada placa de qPCR.
[0156]Sequências de primer e sonda podem ser encontradas na Tabela 1.
EXEMPLO 3: ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA DE PCA3 E ERG [0157]Múltiplas análises foram realizadas usando os resultados de expressão gênica a partir do experimento de qPCR. As curvas ROC foram geradas com base em delta Ct ou número de cópias em relação ao gene normalizador KLK3. A imputação pode ser usada para obter valores ausentes. A análise de ROC de PCA3, usando KLK3 como o gene normalizador, gerou um valor de AUC de 0,727 (Figura 3). A análise da curva ROC de PCA3 e ERG produziu um valor de AUC aumentado de 0,756 (Figura 4). Em outros experimentos, o gene normalizador utilizado foi SPDEF (Figura 13) e valores de AUC gerados a partir da análise usando normalização de SPDEF mostraram que KLK3 e SPDEF apresentaram desempenho equivalente.
[0158]Valores modelo ou de saída para a expressão gênica de PCA3 e ERG também foram calculados para cada amostra usando a seguinte fórmula, que foi determinada a partir da análise de dados de uma coorte de paciente diferente (Coorte 5):
Valor Modelo = (ACtERG x 0,233) + (ACtpcA3 x 0,446)
Onde ACtERG = CtERG - CtKLK3; ACtPOA3 = CtPOA3 - CtKLK3
Um valor de corte modelo foi escolhido, por exemplo, o valor de corte usado neste exemplo foi de 4,7 e a precisão de diagnóstico de uso da combinação de PCA3 e ERG com um valor modelo de corte de 4,7 foi determinado através da
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80/92 análise 2 x 2 e análise de Gleason (Figura 10).
[0159]Os resultados da análise 2x2 usando expressão gênica de PCA3 e
ERG para cada subgrupo de volume de amostra da coorte 7 são resumidos nas
Tabelas 2a, 3a e 4a. A combinação de PCA3 e ERG maior do que 84 % de
sensibilidade para identificar câncer de próstata em amostras que foram
identificadas como positivas através de biópsia. Em particular, os dados
demonstraram que volumes de amostra de urina de 20 mL forneceram melhor
precisão de diagnóstico, com sensibilidade em 83,6 % e especificidade em 58,7 %. Este método também apresentou um alto valor preditivo negativo de 79,4 % e um valor preditivo positivo de 53,4 %.
[0160]Análise adicional incluiu estratificação das amostras através de seus escores de Gleason, conforme mostrado nas Tabelas 2b, 3b e 4b e análise de quartil, conforme mostrado nas Tabelas 2d, 2e, 3d, 3e, 4d e 4e. Especificamente, as amostras de pacientes com escores de Gleason de 6 ou maiores foram corretamente identificadas 70 % das amostras.
EXEMPLO 4: MODELOS DE TRÊS GENES INCLUINDO PCA3 [0161]A análise multivariada foi realizada usando grupos de gene, incluindo PCA3. Conforme mostrado na Figura 15, modelos contendo PCA3 (isto é, PCA3 e ERG com um gene adicional, tal como AMACR, BIRC5, HOXC6 e SPARCL1) superaram consistentemente modelos de três genes FTO que não contêm PCA3. Os genes de referência usados podem ser KLK3 ou SPDEF, conforme mostrado pelos valores de AUC compatíveis usando qualquer gene para normalização na Figura 15.
[0162]Também foi mostrado que os modelos de três genes apresentam valores de AUC aperfeiçoados quando do uso de amostras de baixo volume (isto é, 20 mL) em comparação a todas as amostras (Figura 15).
EXEMPLO 5: VOLUME DE AMOSTRA DE URINA IDEAL [0163]As amostras de urina a partir da Coorte 7 de paciente variaram de 20
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81/92 a 100 mL. A distribuição das amostras com volumes em 20 mL ou menos, 40 mL ou menos, mas maiores do que 20 mL, e maiores do que 40 mL na coorte 7 é mostrada na Figura 1.
[0164]As microvesículas foram isoladas, o RNA foi extraído e a expressão do gene biomarcador foi determinada, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. A análise bioestatística dos biomarcadores (isto é, PCA3, ERG) na coorte 7 foi realizada através da geração de representações gráficas de AUC e ROC com base no número de cópias e expressão gênica normalizada em KLK3 para todas as amostras na coorte. A Figura 3 mostra que a AUC gerada a partir da análise de expressão de PCA3 é altamente dependente do volume de amostra. Por exemplo, amostras que geraram uma AUC maior do que 0,70 foram a partir das amostras onde o volume de amostra foi menor do que 40 mL. Reciprocamente, as amostras que geraram AUCs na faixa de 0,60 a 0,65 apresentaram um volume de amostra de 40 mL ou maior. A Figura 12 mostra a análise univariada de cada gene indicado (PCA3, ERG, AMACR, BIRC5, HOXC6, SPARCL1 e SPDEF) e as AUCs geradas para as amostras que foram de 20 mL ou menos em comparação às AUCs geradas para todas as amostras. Estes resultados mostram que as amostras de 20 mL ou menos resultam em valores de AUC aumentados, indicando que o poder diagnóstico do gene único é aumentado em amostras de urina de menor volume. SPDEF é um gene de referência utilizado para normalização e, portanto, valores de AUC não são aperfeiçoados com menor volume de amostra.
[0165]A análise de expressão do biomarcador quanto ao número de cópias ao invés dos valores Ct também mostra que as amostras com menores volumes (20 mL) forneceram valores de AUC aperfeiçoados em comparação a todas as amostras (Figura 13).
EXEMPLO 6. ESCORE DE AMOSTRAS DE PACIENTE E VALIDAÇÃO ESTATÍSTICA DAS MESMAS
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82/92 [0166]Nos estudos descritos neste relatório, as amostras foram usadas, se elas satisfazem os seguintes critérios: (i) apenas primeira biópsia; (ii) idade do paciente > 50 anos; (iii) nível de “zona cinzenta” de PSA na faixa de 2 a 10 ng/mL; e (iv) volume de doação de urina entre 20 a 49 mL. Amostras de paciente na zona cinzenta de PSA são selecionadas porque pacientes com altos níveis de PSA quase sempre serão submetidos à biópsia e pacientes com baixos níveis de PSA são apenas tipicamente recomendados para biópsia por outras razões que não PSA.
[0167]As amostras de paciente são submetidas ao escore, de acordo com um escore de teste desenvolvido em laboratório (LDT) referido neste relatório como o Escore de EXO106 usando o seguinte algoritmo:
Escore de EXO106 = (icsg.?----------—-flog,-----------2— onde os números de cópias são calculados usando o software RGQ (Qiagen) para cada gene usando as curvas de calibração em placa e onde o corte é de 10. Um escore de EXO106 menor do que 10 é um escore associado com um menor risco de câncer de próstata. Um escore de EXO106 que é maior do que ou igual a 10 é um escore associado com um maior risco de câncer de próstata.
[0168]Deve ser observado que o escore foi dimensionado através da multiplicação por 1,83 e compensado através da adição de 16,92 para transformar o escore de EXO106 em uma faixa mais interessante e legível. Esta classificação e compensação, entretanto, não apresentam efeito sobre o desempenho do teste. A transformação do Escore de EXO106 coloca a maioria dos dados na faixa de 0 a 30, mas sem uma cobertura no escore em qualquer extremidade (isto é, amostras individuais podem apresentar escore fora desta faixa). O algoritmo para o Escore de EXO106 foi configurado, tal que o valor preditivo negativo (NPV) do Escore de EXO106 no valor de corte de 10 é maior do que o NPV do Calculador Câncer de próstata de Risco do Experimento Preventivo (PCPTRC), onde o corte de NPVpcptrc
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83/92 é escolhido, tal que ele prediz pelo menos 30 % dos pacientes como negativo. O algoritmo para o Escore de EXO106 também foi designado, tal que a fração de pacientes prognosticados negativos (isto é, Escore de EXO106 menor do que 10) é de pelo menos 30 %.
[0169]Uma distribuição de Escore de EXO106 exemplar em uma coorte de paciente referida neste relatório como Coorte 8 (isto é, C8, n = 453 amostras, PSA médio = 5,3 ng/mL e 80 % das amostras 2 < PSA < 10 ng/mL) é mostrada na Figura
16. A AUC para Desempenho de EXO106 em pacientes com qualquer escore de Gleason em comparação à AUC para padrão de tratamento (SOC) é mostrada na Figura 17, onde a AUC para SOC = 0,595; AUC para EXO106 = 0,738; e AUC para EXO106 + SOC = 0,764. A coorte de paciente usada na Figura 17 apresentou as seguintes características: todas as amostras foram apresentadas na zona cinzenta de PSA, foram apresentadas apenas a partir da primeira biópsia e foram apresentadas a partir de amostras de urina de baixo volume. O desempenho de EXO106 por quartil, isto é, a porcentagem de amostras identificadas como positivas através de biópsia por quartil de escore de EXO106, é mostrado nas Figuras 18A e 18B. Novamente, estas amostras foram apresentadas a partir de pacientes com qualquer escore de Gleason.
[0170]O desempenho do Escore de EXO106 para câncer de próstata alto grau, por exemplo, um escore de Gleason maior do que 6, é mostrado na Figura 19, e uma quebra do desempenho do Escore de EXO106 com base nos subgrupos de escore de Gleason é mostrada na Figura 20.
[0171]Assim, o escore de EXO106 é útil na determinação do prognóstico de uma doença próstata alto grau, por exemplo, uma doença que apresenta um escore de Gleason maior do que 6. Tipicamente, as amostras a partir da primeira biópsia e a partir das populações de biópsia repetida são muito diferentes e devem ser separadamente analisadas.
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84/92 [0172]Embora a presente invenção tenha sido divulgada com referência a certas formas de realização, diversas modificações, alterações e mudanças nas formas de realização descritas são possíveis sem divergir do espírito e escopo da presente invenção, conforme descrito acima, e nas reivindicações anexas. Consequentemente, é intencionado que a presente invenção não seja limitada às formas de realização especificamente descritas, mas que seja fornecido o escopo total ao qual se tem direito ao abrigo da lei.
Tabela 2a. Análise 2 x 2 da Coorte 7 (V < 100 mL, N = 236)
Model Cutoff 8.5
BX POS BX NEG
TEST POS 72 69 51.1% PPV
TEST NEG 21 74 77.9% NPV
77.4% SENS 51.7% SPEC
Legenda da Tabela acima - Modelo corte
Tabela 2b. Análise do Escore de Gleason da Coorte 7 (V < 100 mL, N = 236)
Gleason* # Missed % Missed Detected
6 11 29% 27
3+4 = 7 6 21% 22
4+3 = 7 2 13% 13
8 0 0% 3
9 1 13% 7
10 1 100% 0
Legenda da Tabela acima - Ausente - Detectado
Tabela 2c. Análise da Coorte 7 (V < 100 mL, N = 236)
% TEST POS 59.7%
% TEST NEG 40.3%
Tabela 2d. Análise de quartil da Coorte 7 (V < 100 mL, N = 236)
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85/92
Gleason Group % Biopsy Positive
Quartile 1 Quartile 2 Quartile 3 Quartile 4
0.40 to 6.70 6.70 to 8.20 8.20 to 9.40 9.40 to 13.60
Percent N Percent N Percent N Percent N
6 39.5% 15 26.3% 10 21.1% 8 13.2% 5
3+4 = 7 35.7% 10 39.3% 11 7.1% 2 17.9% 5
4+3 = 7 60.0% 9 26.7% 4 6.7% 1 6.7% 1
8 0.0% 0 66.7% 2 33.3% 1 0.0% 0
9 62.5% 5 0.0% 0 25.0% 2 12.5% 1
10 0.0% 0 0.0% 0 0.0% 0 100.0% 1
Legenda da Tabela acima - Grupo Gleason - % de Biópsia Positiva - Quartil
- Porcentagem
Tabela 2e. Análise de quartil da Coorte 7 (V < 100 mL, N = 236)
Quartile 1 Quartile 2 Quartile 3 Quartile 4
0.40 to 6.70 6.70 to 8.20 8.20 to 9.40 9.40 to 13.60
% Bx POS N % Bx POS N % Bx POS N % Bx POS N
60.9% 64 46.6% 58 26.9% 52 21.0% 62
Legenda da Tabela acima - Quartil
Tabela 3a. Análise 2 x 2 da Coorte 7 (V < 40 mL, N = 189)
Model Cutoff 8.5 BXNEG 54.0% 77.6% PPV NPV
TEST POS TEST NEG BX POS
61 52
17 59
78.2% 53.2%
SENS SPEC
Legenda da Tabela acima - Modelo Corte
Tabela 3b. Análise do Escore de Gleason da Coorte 7 (V < 40 mL, N = 189)
Gleason # Missed % Missed Detected
6 8 26% 23
3+4 = 7 6 24% 19
4+3 = 7 2 17% 10
8 0 0% 2
9 0 0% 7
10 1 100% 0
Legenda da Tabela acima - Ausente- Detectado
Tabela 3c. Análise da Coorte 7 (V < 40 mL, N = 189)
% TEST POS 59.8%
% TEST NEG 40.2%
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86/92
Tabela 3d. Análise de quartil da Coorte 7 (V < 40 mL, N = 189)
Gleason Group % Biopsy Positive
Quartile 1 Quartile 2 Quartile 3 Quartile 4
0.70 to 6.70 6.70 to 8.20 8.20 to 9.70 9.70 to 13.60
Percent N Percent N Percent N Percent N
6 38.7% 12 29.0% 9 19.4% 6 12.9% 4
3+4 = 7 32.0% 8 40.0% 10 8.0% 2 20.0% 5
4+3 = 7 58.3% 7 25.0% 3 8.3% 1 8.3% 1
8 0.0% 0 50.0% 1 50.0% 1 0.0% 0
9 71.4% 5 0.0% 0 28.6% 2 0.0% 0
10 0.0% 0 0.0% 0 0.0% 0 100.0% 1
Legenda da Tabela acima - Grupo Gleason - % de Biópsia Positiva - Quartil
- Porcentagem
Tabela 3e. Análise de quartil da Coorte 7 (V < 40 mL, N = 189)
Quartile 1 Quartile 2 Quartile 3 Quartile 4
0.70 to 6.70 6.70 to 8.20 8.20 to 9.70 9.70 to 13.60
% Bx POS N % Bx POS N % Bx POS N % Bx POS N
65.3% 49 50.0% 46 24.0% 50 25.0% 44
Legenda da Tabela acima - Quartil
Tabela 4a. Análise 2 x 2 da Coorte 7 (V < 20 mL, N = 122)
Model Cutoff §11
TEST POS TEST NEG BX POS BX NEG
42 26 61.8% 77.8% PPV NPV
12 42
77.8% 61.8%
SENS SPEC
Legenda da Tabela acima - Modelo Corte
Tabela 4b. Análise do Escore de Gleason da Coorte 7 (V < 20 mL, N = 122)
Gleason # Missed % Missed Detected
6 7 28% 18
3+4 = 7 3 20% 12
4+3 = 7 2 25% 6
8 0 0% 1
9 0 0% 5
10 0 #DIV/0! 0
Legenda da Tabela acima - Ausente - Detectado
Tabela 4c. Análise da Coorte 7 (V < 20 mL, N = 122)
Petição 870170055983, de 04/08/2017, pág. 92/122
87/92
% TEST PCS 55.7%
% TEST NEG 44.3%
Tabela 4d. Análise de quartil da Coorte 7 (V < 20 mL, N = 122)
Gleason Group % Biopsy Positive
Quartile 1 Quartile 2 Quartile 3 Quartile 4
2.20 to 6.70 6.70 to 8.20 8.20 to 9.40 9.40 to 13.60
Percent N Percent N Percent N Percent N
6 40.0% 10 28.0% 7 20.0% 5 12.0% 3
3+4 = 7 26.7% 4 46.7% 7 13.3% 2 13.3% 2
4+3 = 7 62.5% 5 12.5% 1 12.5% 1 12.5% 1
8 0.0% 0 0.0% 0 100.0% 1 0.0% 0
9 80.0% 4 0.0% 0 20.0% 1 0.0% 0
10 ’'ttDIV/O! 0 #DIV/0! 0 f #DIV/0! 0 '#DIV/0! 0
Legenda da Tabela acima - Grupo Gleason - % de Biópsia Positiva - Quartil
- Porcentagem
Tabela 4e. Análise de quartil da Coorte 7 (V < 20 mL, N = 122)
Quartile 1 Quartile 2 Quartile 3 Quartile 4
2.20 to 6.70 6.70 to 8.20 8.20 to 9.40 9.40 to 13.60
% Bx POS N % Bx POS N % Bx POS N % Bx POS N
79.3% 29 50.0% 30 35.7% 28 17.1% 35
Legenda da Tabela acima - Quartil
REFERÊNCIAS
Al-Nedawi, K., B. Meehan, J. Micallef, V. Lhotak, L. May, A. Guha, and J. Rak. 2008. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvlll by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10:619-24.
Balzar, M., M.J. Winter, C.J. de Boer, and S.V. Litvinov. 1999. The biology of the
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Claims (20)

1. Método para o diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia para câncer de próstata em um sujeito em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
a. obter uma amostra de urina aleatória a partir de um sujeito;
b. extrair um ou mais mRNAs a partir da amostra;
c. detectar o nível de expressão de mRNA de PCA3 e ERG;
d. normalizar o nível de expressão de mRNA de PCA3 e ERG em SPDEF;
e. computar um valor de saída para os níveis de expressão de mRNA normalizados de PCA3 e ERG usando a fórmula:
.... maxiés-s) . tnax casses) . .
(tog,----:: -F log,----:----------—- -F16.92)
1.83 para gerar um
Escore de EXO106; e
f. comparar o Escore de EXO106 a um valor de corte pré-determinado que foi determinado usando uma curva ROC gerada com base em uma combinação de PCA3 e ERG para distinguir um sujeito em um alto risco para câncer de próstata a partir de um sujeito com um baixo risco para câncer de próstata.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de urina aleatória é os primeiros 40 mL esvaziados a partir da bexiga.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de urina aleatória é os primeiros 20 mL esvaziados a partir da bexiga.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o valor de corte pré-determinado é um Escore de EXO106 de 10, onde um Escore de EXO106 de 10 ou maior indica que o sujeito está em alto risco para câncer de próstata.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (a) compreende ainda isolar uma fração de microvesícula a partir da amostra de urina aleatória e extrair um ou mais ácidos
2/4 nucléicos a partir da fração de microvesícula.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de isolar a fração de microvesícula compreende processar a amostra para remover células e resíduos celulares e concentrar a fração de microvesícula através da exposição da fração de microvesícula à ultrafiltração ou a um concentrador de filtração, e lavar a fração de microvesícula antes de extrair um ou mais ácidos nucléicos a partir da fração de microvesícula.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda adicionar um inibidor de RNase à fração de microvesícula antes de extrair um ou mais ácidos nucléicos a partir da fração de microvesícula.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende detectar o nível de expressão de um ou mais genes selecionados a partir de: AMACR, BIRC5, HOXC6, e SPARCL1, na etapa (d).
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que uma quantidade conhecida de partículas de Qbeta é adicionada à amostra de urina antes da etapa (b), e em que o nível de expressão do gene alvo Q-beta é detectado na etapa (c), e em que o nível de expressão detectado é comparado à quantidade conhecida.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer agressivo.
11. Método para o diagnóstico, prognóstico, monitoramento ou seleção de terapia para um câncer de próstata com escore de Gleason alto que apresenta um escore de Gleason maior do que 6 em um sujeito em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
a. obter uma amostra de urina aleatória a partir de um sujeito;
b. extrair um ou mais mRNAs a partir da amostra;
3/4
c. detectar o nível de expressão de mRNA de PCA3 e ERG;
d. normalizar o nível de expressão de mRNA de PCA3 e ERG em SPDEF;
e. computar urn valor de saída para os níveis de expressão de mRNA normalizados de PCA3 e ERG usando a fórmula:
maxí . max (1^^40 cesses) . .
(log,----::---- 4- log,----:----------—- 4- 16.92 j
1.83 para gerar um
Escore de EXO106; e
f. comparar o Escore de EXO106 a um valor de corte pré-determinado que foi determinado usando uma curva ROC gerada com base em uma combinação de PCA3 e ERG para distinguir um sujeito em um alto risco para um câncer de próstata com escore de Gleason alto que apresenta um escore de Gleason maior do que 6 a partir de um sujeito com um baixo risco para um câncer de próstata com escore de Gleason alto que apresenta um escore de Gleason maior do que 6.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de urina aleatória é os primeiros 40 mL esvaziados a partir da bexiga.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de urina aleatória é os primeiros 20 mL esvaziados a partir da bexiga.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o valor de corte pré-determinado é um Escore de EXO106 de 10, onde um Escore de EXO106 de 10 ou maior indica que o sujeito está em alto risco para um câncer de próstata com escore de Gleason alto que apresenta um escore de Gleason maior do que 6.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 14,
CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (a) compreende ainda isolar uma fração de microvesícula a partir da amostra de urina aleatória e extrair um ou mais ácidos nucleicos a partir da fração de microvesícula.
4/4
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de isolar a fração de microvesícula compreende processar a amostra para remover células e resíduos celulares e concentrar a fração de microvesícula através da exposição da fração de microvesícula à ultrafiltração ou a um concentrador de filtração, e lavar a fração de microvesícula antes de extrair um ou mais ácidos nucléicos a partir da fração de microvesícula.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda adicionar um inibidor de RNase à fração de microvesícula antes de extrair um ou mais ácidos nucléicos a partir da fração de microvesícula.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendendo detectar o nível de expressão de um ou mais genes selecionados a partir de: AMACR, BIRC5, HOXC6 e SPARCL1, na etapa (d).
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que uma quantidade conhecida de partículas de Qbeta é adicionada à amostra de urina antes da etapa (b), e em que o nível de expressão do gene alvo Q-beta é detectado na etapa (c), e em que o nível de expressão detectado é comparado à quantidade conhecida.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer agressivo.
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