CN113528659A - 肾癌和膀胱癌的风险评估装置 - Google Patents
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Abstract
一种膀胱癌和肾癌肾癌和膀胱癌的风险评估装置，包括：收集装置用于收集外泌体溶液；核酸提取装置用于提取外泌体溶液的RNA，得到样品RNA溶液；检测装置用于定量检测样品RNA溶液中目标区域的表达量，数据获取及分析装置用于获取目标区域的表达量，将表达量形成数据集并建立风险评估模型，通过所述风险评估模型得出AUC值，AUC值反映发生肾癌或膀胱癌的概率，肾癌的AUC值大于或等于90.0％时，判断发生肾癌，膀胱癌的AUC值大于或等于89.9％时，判断发生膀胱癌。本发明提供的基于外泌体的膀胱癌和肾癌的风险评估装置肾癌和膀胱癌为无创液态活检，有很高灵活性和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种肾癌和膀胱癌的风险评估装置。
背景技术
在全球范围内，肾癌和膀胱癌在男性中是发病率仅次于肺癌的恶性肿瘤。近些年伴随着人口老龄化、饮食及生活方式的改变、诊疗技术的提升及健康观念的增强，肾癌和膀胱癌的发病率及诊出率出现了较为显著的上升。早期诊断对于肾癌和膀胱癌是极其重要的一环，但一直以来都缺乏相关的诊断工具来区分高级别和低级别的肾癌和膀胱癌。但目前的检测方法无论是假阳性率还是假阴性率都很高，因而并无法准确预测侵袭性疾病的存在。而且存在过度治疗的风险，过度治疗常带来例如感染，败血症甚至死亡等并发症，而不必要的侵入式治疗也会有副作用，同时患者的心理负担也会大大增加。
因此，需要一种基于非侵入性手段的液体活检测试，能够准确地预测肾癌和膀胱癌的侵袭性，避免对低风险或良性患者进行不必要的活检。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种肾癌和膀胱癌的风险评估装置。
本发明提供的一种肾癌和膀胱癌的风险评估装置，包括收集装置、核酸获取装置、检测装置以及数据获取及分析装置。
所述收集装置用于收集测试者的外泌体溶液。
所述核酸获取装置用于提取所述外泌体溶液的RNA，得到样品RNA溶液。
所述检测装置用于定量检测所述样品RNA溶液中目标区域，所述目标区域包括表1或表2中的全部基因。
所述数据获取及分析装置用于获取所述目标区域的表达量，将所述表达量形成数据集并建立风险评估模型。
其中，所述数据获取及分析装置通过将所述数据集分为训练集和验证集，在所述训练集中使用随机森林模型得到优选集，所述优选集中的基因数小于或等于所述目标区域的基因数，将所述优选集在所述训练集中建立所述风险评估模型，通过所述风险评估模型得出所述验证集的AUC值，所述AUC值反映发生肾癌或膀胱癌的概率，肾癌的所述AUC值大于或等于90.0％时，判断发生肾癌，膀胱癌的所述AUC值大于或等于89.9％时，判断发生膀胱癌。
本申请实施方式中，所述训练集与所述验证集的数量比为4:1。
本申请实施方式中，在所述训练集中使用随机森林模型得到优选集的方法包括：
在所述随机森林模型中采用五倍交叉验证，对每一所述训练集进行交叉验证，得到交叉验证误差曲线。
对所有所述交叉验证误差曲线取平均值，得到平均曲线。
取所述平均曲线中的最小误差和所述最小误差对应的标准偏差，所述最小误差和所述标准偏差之和作为临界值。
列出每一所述训练集中误差小于所述临界值的所述目标区域，得到对应的标记集，其中，所述标记集中含有所述目标区域的数量最少的作为所述优选集。
本申请实施方式中，所述检测装置包括测序装置，所述目标区域的测序长度为120～180PE。
本申请实施方式中，所述核酸提取装置提取所述外泌体溶液中的所述样品RNA溶液的方法包括：
向所述外泌体溶液中加入600～800μl Trizol溶液，18-25℃下孵育匀浆3～5min后，加入100～220μl氯仿，晃动混匀10～20s，在2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液进行RNA纯化，得到样品RNA溶液。
本申请实施方式中，所述检测装置为扩增装置。
本申请实施方式中，所述扩增装置为荧光定量PCR装置，所述荧光定量PCR装置对所述样品RNA溶液的扩增方法包括：
将样品RNA溶液加入qRT-PCR扩增体系中，先在30℃～50℃条件下，扩增10min～30min，再在90℃～95℃条件下，扩增2min～10min。
进一步在90℃～95℃条件下，扩增10s～30s，最后在55℃～65℃条件下，扩增30s～60s，此步骤循环30次～50次，得到PCR产物。
在55℃～65℃扩增的步骤采集荧光信号。
本申请实施方式中，所述收集装置还用于对所述外泌体溶液进行前处理，所述前处理包括提纯所述外泌体溶液。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：通过直接从人体尿液中提取外泌体，尿液不需要DRE预收集或特殊处理，并对外泌体中含有的RNA进行测序，通过特定的基因组表达和特定算法计算出患有肾癌和膀胱癌的概率，本装置具有很高的灵敏度和特异性，膀胱癌的AUC为89.8％,肾癌AUC为90.0％；在癌症早期也可以适用；而且本装置为无创检测，不需要组织穿刺或者抽血，极大减小检测者的心理负担。
附图说明
图1是本发明提供的一实施例中肾癌的ROC曲线。
图2是本发明提供的一实施例中膀胱癌的ROC曲线。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
下面将结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的技术手段的名称只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明提供一种肾癌和膀胱癌的风险评估装置，包括收集装置、核酸获取装置、检测装置和数据获取及分析装置。
所述收集装置用于收集测试者的外泌体溶液。
本实施方式中，收集5～50mL以上测试者的尿液，利用超滤法提取出其中的外泌体溶液，滤膜的孔径为20nm。除了超滤法之外，还可以采用超速离心，膜亲和，聚合物沉降，排阻色谱，免疫捕获等方式来提纯和浓缩外泌体溶液。最后获得100～500μl纯化的外泌体溶液。
所述核酸获取装置用于提取所述外泌体溶液的RNA，得到样品RNA溶液。
本实施方式中，使用miRNeasy小型试剂盒(Qiagen)从纯化的外泌体中提取去除核糖体RNA的所有外泌体RNA。
具体步骤包括：向所述外泌体溶液中加入600～800μl Trizol溶液，18-25℃下孵育匀浆3～5min后，加入100～220μl氯仿，晃动混匀10～20s，在2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液置于RNeasy微型柱上进行RNA纯化，得到样品RNA溶液。
所述检测装置用于定量检测所述样品RNA溶液中目标区域，所述目标区域包括表1或表2中的全部基因。
本实施方式中，所述检测装置可以是测序装置，通过对所述目标区域进行基因序列测定，得到相关基因的表达量。
具体地测序过程包括：对纯化的所述样品RNA溶液中的外泌体RNA进行测序，利用Clontech公司的SMART技术生成RNA序列库(LncRNA)。测序文库汇集在一起后，在IlluminaHiSeq平台上进行测序。测序长度为120～180PE。在一个通道中同时测80个样本，平均每个样本获得3000万次读取。测序结果用HISAT2进行比对，并从GENCODE数据库中检索RNA类型的注释。
另外，除了测序装置外，也可以使用扩增装置(例如荧光定量PCR或者数字PCR)来获得相关基因的表达量。
本实施方式中，采用本申请所述装置，尿液不需要DRE预收集或特殊处理，采用比较成熟的RT-PCR法，多重一步法检测，简单快速，无创液态活检，只需收集尿液样本，有很高依从性。
本实施方式中，实时PCR技术采用的qRT-PCR扩增体系包括引物混合液、PCR缓冲液、PCR反应液和酶混液。
引物混合液是根据表1和表2所示基因设计相关引物和探针，并将相关引物与探针组成混合液用于扩增反应，其中表1中的基因为与肾癌的发生和发展密切相关的基因，表2中的基因是与膀胱癌的发生和发张密切相关的基因。
表1
表2
PCR缓冲液包含表3所示组分：
表3
| 组分 | 浓度 | PH |
| Tris-HCl | 50mM～800mM | 7.5～9.0 |
| KCl | 50mM～800mM | / |
| 硫酸铵 | 50mM～500mM | / |
| H<sub>2</sub>O | / | / |
PCR反应液包含表4所示组分：
表4
| 组分 | 浓度 |
| PCR缓冲液 | 1～10 |
| MgCl<sub>2</sub> | 1mM～6mM |
| 甘油 | 0.5wt％～5wt％ |
| PC300 | 0.1～1 |
| H<sub>2</sub>O | / |
酶混液包含表5所示组分：
表5
上述qRT-PCR扩增反应的步骤包括：
第一步：在PCR仪中，先30～50℃，扩增10～50min，再90～95℃，扩增2～10min；
第二步：再90～95℃，扩增10～30s，再55～65℃，扩增30～60s，此步骤循环35～50次，得到PCR产物。
其中，在55～65℃扩增的步骤采集荧光信号，得到所述目标区域的表达量。
本发明还提供一种使用上述肾癌和膀胱癌的风险评估装置检测目标区域表达量的方法，包括以下步骤：
S1、收集测试者的尿液，并从尿液中提纯出外泌体溶液。
本实施方式中，收集5～50mL以上测试者的尿液，利用超滤法提取出其中的外泌体溶液，滤膜的孔径为20nm。除了超滤法之外，还可以采用超速离心，膜亲和，聚合物沉降，排阻色谱，免疫捕获等方式来提纯和浓缩外泌体溶液。最后获得100～500μl纯化的外泌体溶液。
S2、提取S1得到的外泌体溶液的RNA，得到样品RNA溶液。
本实施方式中，使用miRNeasy小型试剂盒(Qiagen)从纯化的外泌体中提取去除核糖体RNA的所有外泌体RNA。
具体步骤包括：通过向样品外泌体溶液中添加200～1000μl的Trizol来裂解外泌体溶液，室温(18-25℃)下孵育匀浆2～15min，上下颠倒晃动混匀10～60s，在2～8℃、8000～14000rpm条件下离心5～20min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液置于RNeasy微型柱上进行RNA纯化，得到样品RNA溶液。
S3、取S2中得到的样品RNA溶液，通过实时PCR技术定量检测样品RNA溶液中目标区域的表达量，所述目标区域为表1或表2中的基因。
所述数据获取及分析装置用于获取所述目标区域的表达量，将所述表达量形成数据集并建立风险评估模型。
其中，所述数据获取及分析装置通过将所述数据集分为多个训练集和多个验证集，在每一所述训练集中使用随机森林模型得到优选集，所述优选集中的基因数小于或等于所述目标区域的基因数，将所述优选集在所述训练集中建立所述风险评估模型，通过所述风险评估模型得出所述验证集的AUC值，所述AUC值反映发生肾癌或膀胱癌的概率，肾癌的所述AUC值大于或等于90.0％时，判断发生肾癌，膀胱癌的所述AUC值大于或等于89.9％时，判断发生膀胱癌。两AUC值都具有非常高的判断价值。通过上述模型，可以非常灵敏地判断待检测者是否患有肾癌或膀胱癌，针对肾癌或膀胱癌的早期筛查同样适用，有很高的灵敏度和特异性。
本实施方式中，所述训练集与所述验证集的数量比为4:1。
本实施方式中，在所述训练集中使用随机森林模型得到优选集的具体方法包括：
第一步，在所述随机森林模型中采用五倍交叉验证，对每一所述训练集进行交叉验证，得到交叉验证误差曲线。
第二步，对所有所述交叉验证误差曲线取平均值，得到平均曲线。
第三步，取所述平均曲线中的最小误差和所述最小误差对应的标准偏差，所述最小误差和所述标准偏差之和作为临界值。
第四步，列出每一所述训练集中误差小于所述临界值的所述目标区域，得到对应的标记集，其中，所述标记集中含有所述目标区域的数量最少的作为所述优选集。
以下通过具体实施例对本申请的所述肾癌和膀胱癌的风险评估装置用于检测目标区域表达量以及发生肾癌或膀胱癌概率的评估的方法进行具体说明，其中所述检测装置采用扩增装置来对目标区域进行表达量的测定。本实施方式中，样本来源于113名测试者，其中包括35名膀胱癌患者，27名肾癌患者，和51名对照。
实施例1
S1、收集测试者尿液，从尿液中提纯外泌体溶液。
收集5mL测试者的尿液，利用超滤法提取出其中的外泌体溶液，滤膜的孔径为20nm，最后获得200μl纯化的外泌体溶液。
S2、提取S1得到的外泌体溶液的RNA，得到样品RNA溶液。
通过向样品RNA溶液中添加750μl的Trizol来裂解外泌体溶液，室温(18-25℃)下孵育匀浆5min，上下颠倒晃动混匀15s，在5℃、12000rpm条件下离心10min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液置于RNeasy微型柱上进行RNA纯化，得到样品RNA溶液。
S3、取S2中得到的样品RNA溶液，加入到qRT-PCR扩增体系中，先50℃，扩增30min，再95℃，扩增5min；
再95℃，扩增10s，再60℃，扩增30s，此步骤循环45次，得到PCR产物。
其中，在60℃扩增的步骤采集荧光信号，得到目标区域的表达量。
本实施方式中，实时PCR技术采用的qRT-PCR扩增体系包括引物混合液、PCR缓冲液、PCR反应液和酶混液。
引物混合液是根据表1和表2所示基因设计相关引物和探针，并将相关引物与探针组成混合液用于扩增反应，其中表1中的基因为与肾癌的发生和发展密切相关的基因，表2中的基因是与膀胱癌的发生和发张密切相关的基因。
PCR缓冲液包含表3所示组分：
表3
PCR反应液包含表4所示组分：
表4
| 组分 | 起始浓度 | 终浓度 | 体积(μl) |
| PCR缓冲液 | 10× | 1× | 2 |
| MgCl<sub>2</sub> | 25mM | 2mM | 1.6 |
| 50％甘油 | 50.0％ | 1.5％ | 0.6 |
| PC300 | 10× | 0.1× | 0.1 |
| H<sub>2</sub>O | / | / | 5.7 |
| 总计 | / | / | 10 |
酶混液包含表5所示组分：
表5
| 组分 | 起始浓度 | 终浓度 | 体积(μl) |
| Taq-HS | 5U/ul | 2.5U/T | 0.5 |
| RTase | 200U/ul | 10U/T | 0.05 |
| Taq Buffer | / | / | 1.5 |
| dNTPs | 25mM | 0.4 | 0.32 |
| PC300 | 10× | 1× | 0.5 |
| H<sub>2</sub>O | / | / | 2.13 |
| 总计 | / | / | 5 |
步骤4，所述数据获取及分析装置获取所述目标区域的表达量，将所述表达量形成数据集并建立风险评估模型。
具体地，将所述数据集分为多个训练集和多个验证集，在所述随机森林模型中采用五倍交叉验证，对每一所述训练集进行交叉验证，得到交叉验证误差曲线。每个所述训练集的差异基因表达分析采用DESeq2 R软件包进行。KEGG路径、WikiPathways路径和GO术语富集分析采用WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)利用费舍尔精确检验(Fisher’sexact)的过度代表性(overrepresentation analysis)分析。其中，富集分析的参数如下：(1)5类中的最小识别数，(2)2000类中的最大识别数，(3)BH的FDR方法，(4)显著性水平为“前10”；当p值<0.05时，功能项和通路具有统计学意义。在随机森林模型(R3.6.0，randomForest 4.6-14软件包)上使用训练集中的DEG的fpkm矩阵进行五倍交叉验证。
对所有所述交叉验证误差曲线取平均值，得到平均曲线。
取所述平均曲线中的最小误差和所述最小误差对应的标准偏差，所述最小误差和所述标准偏差之和作为临界值。
列出每一所述训练集中误差小于所述临界值的所述目标区域，得到对应的标记集，并筛选出所述标记集中含有所述目标区域的数量最少作为优选集。以训练队列为基础，使用所述优选集计算癌症发生的概率，并构建ROC曲线(r3.6.0，pROC软件包)，本申请关于肾癌的ROC曲线如图1所示，其中AUC值为90.0％，关于膀胱癌的ROC曲线如图2所示，其中AUC值为89.9％，两AUC值都具有非常高的判断价值。
综上所述，本发明的有益效果在于：通过直接从人体尿液中提取外泌体，尿液不需要DRE预收集或特殊处理，并对外泌体中含有的RNA进行测序，通过特定的基因组表达和特定算法计算出患有肾癌和膀胱癌的概率，本装置具有很高的灵敏度和特异性，膀胱癌的AUC为89.8％,肾癌AUC为90.0％；在癌症早期也可以适用；而且本装置为无创检测，不需要组织穿刺或者抽血，极大减小检测者的心理负担。
以上实施例和对比例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；另外，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术构思做出其它各种相应的改变与变形，而所有这些改变与变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种肾癌和膀胱癌的风险评估装置，其特征在于，包括：
收集装置，用于收集测试者的外泌体溶液；
核酸获取装置，用于提取所述外泌体溶液的RNA，得到样品RNA溶液；
检测装置，用于定量检测所述样品RNA溶液中目标区域，所述目标区域包括表1或表2中的全部基因；
数据获取及分析装置，用于获取所述目标区域的表达量，将所述表达量形成数据集并建立风险评估模型，
其中，所述数据获取及分析装置通过将所述数据集分为训练集和验证集，在所述训练集中使用随机森林模型得到优选集，所述优选集中的基因数小于或等于所述目标区域的基因数，将所述优选集在所述训练集中建立所述风险评估模型，通过所述风险评估模型得出所述验证集的AUC值，所述AUC值反映发生肾癌或膀胱癌的概率，肾癌的所述AUC值大于或等于90.0％时，判断发生肾癌，膀胱癌的所述AUC值大于或等于89.9％时，判断发生膀胱癌。
2.根据权利要求1所述的肾癌和膀胱癌的风险评估装置，其特征在于，所述训练集与所述验证集的数量比为4:1。
3.根据权利要求1所述的肾癌和膀胱癌的风险评估装置，其特征在于，在所述训练集中使用随机森林模型得到优选集的方法包括：
在所述随机森林模型中采用五倍交叉验证，对每一所述训练集进行交叉验证，得到交叉验证误差曲线；
对所有所述交叉验证误差曲线取平均值，得到平均曲线；
取所述平均曲线中的最小误差和所述最小误差对应的标准偏差，所述最小误差和所述标准偏差之和作为临界值；
列出每一所述训练集中误差小于所述临界值的所述目标区域，得到对应的标记集，其中，所述标记集中含有所述目标区域的数量最少的作为所述优选集。
4.根据权利要求1所述的肾癌和膀胱癌的风险评估装置，其特征在于，所述检测装置包括测序装置，所述目标区域的测序长度为120～180PE。
5.根据权利要求1所述的肾癌和膀胱癌的风险评估装置，其特征在于，所述核酸提取装置提取所述外泌体溶液中的所述样品RNA溶液的方法包括：
向所述外泌体溶液中加入600～800μl Trizol溶液，18-25℃下孵育匀浆3～5min后，加入100～220μl氯仿，晃动混匀10～20s，在2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液进行RNA纯化，得到样品RNA溶液。
6.根据权利要求1所述的肾癌和膀胱癌的风险评估装置，其特征在于，所述检测装置为扩增装置。
7.根据权利要求6所述的肾癌和膀胱癌的风险评估装置，其特征在于，所述扩增装置为荧光定量PCR装置，所述荧光定量PCR装置对所述样品RNA溶液的扩增方法包括：
将样品RNA溶液加入qRT-PCR扩增体系中，先在30℃～50℃条件下，扩增10min～30min，再在90℃～95℃条件下，扩增2min～10min；
进一步在90℃～95℃条件下，扩增10s～30s，最后在55℃～65℃条件下，扩增30s～60s，此步骤循环30次～50次，得到PCR产物；
其中，在55℃～65℃扩增的步骤采集荧光信号。
8.根据权利要求1所述的肾癌和膀胱癌的风险评估装置，其特征在于，所述收集装置还用于对所述外泌体溶液进行前处理，所述前处理包括提纯所述外泌体溶液。
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