BR112016002182B1 - Formulação vesicular, método para preparar a formulação e uso de uma formulação vesicular - Google Patents

Formulação vesicular, método para preparar a formulação e uso de uma formulação vesicular Download PDF

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Abstract

FORMULAÇÃO VESICULAR, MÉTODO PARA FAZER DITA FORMULAÇÃO E USO DE UMA FORMULAÇÃO VESICULA. A presente invenção refere-se a formulações vesiculares para utilização na administração tópica de um agente de interesse ("AOI") terapêutico, metabólico, cosmético ou estrutural e métodos de administração de um AOI.

Description

[001] A presente invenção refere-se a formulações vesiculares para utilização na administração tópica de um agente de interesse ("AOI") terapêutico, metabólico, cosmético ou estrutural e métodos de administração de um AOI.
[002] A Patente US N° 6.165.500 descreve uma preparação para a aplicação de agentes que são fornecidos com estruturas de tipo membranar que consistem de uma ou várias camadas de moléculas anfifílicas, ou uma substância de suporte anfifílico, em particular para o transporte do agente para dentro e através de barreiras naturais, tais como pele e materiais similares. Estes Transfersomes™ consistem de um ou vários componentes, mais vulgarmente uma mistura de substâncias de base, uma ou várias substâncias de borda ativa, e agentes.
[003] Publicação do Pedido de Patente US N° US 2004/0071767 descreve formulações de fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) baseados em agregados de complexos com pelo menos três componentes anfipáticos em suspensão num meio farmaceuticamente aceitável.
[004] Publicação do Pedido de Patente US N° US 2004/0105881 descreve agregados superficiais estendidos, em suspensão num meio líquido adequado e compreendendo pelo menos três componentes (compostos anfifílicos) e sendo capazes de melhorar o transporte de ativos através das barreiras semi-permeáveis, tais como a pele, especialmente para a aplicação de drogas não invasivas in vivo por meio de penetração da barreira por tais agregados. O documento WO 2010/140061 descreve o uso de formulações vesiculares "vazias" para o tratamento da dor de tecidos profundos. O documento WO 2011/022707 descreve o uso de outras formulações de vesículas "vazias" para distúrbios relacionados com a deficiência de ácidos graxos e tratamento inter alia distúrbios relacionados com a inflamação. Formulações vesiculares a que entidades terapêuticas podem ser anexadas são descritas em WO2011/022707 e WO2010/140061.
[005] Estes documentos não divulgam nem ensinam formulações vesiculares para a utilização na administração tópica de um AOI, que nem um AOI pode ser covalentemente ligada a um componente da vesícula de tal modo que a maioria dos AOI é externa à vesícula. A citação de qualquer referência nesta seção do pedido não é uma admissão de que a referência é a técnica anterior à invenção. As publicações acima notadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
[006] Vesículas lipossômicas têm sido utilizadas no passado em tentativas de entrega de compostos ativos (AOIs) para dentro do corpo.
[007] Formas flexíveis de lipossomas ("Transfersomes®") são vesículas feitas de uma combinação de uma gordura (por exemplo, fosfatidilcolina de soja) e um ácido graxo ou agente surfactante (por exemplo, Tween) que pode passar através da superfície da pele. O polietilenoglicol ("PEG") no surfactante destas vesículas é higroscópico e penetra poros da pele ao longo de um gradiente de água. Estas vesículas foram testadas como veículos para o transporte de outros AOIs para dentro do corpo através da via transdérmica, quer através da colocação do AOI para ser transportada para dentro do lúmen da vesícula ou incorporando o AOI na membrana da vesícula, como um dos componentes da membrana.
[008] Qualquer um desses métodos deve contar com alguma forma de perturbação da vesícula, a fim de liberar o AOI.
[009] Além disso, existem produtos que se possa desejar para o transporte através da pele, que são demasiado grandes para serem incorporados no Transfersome desta maneira, ou que possuem uma química que é incompatível com a química normal dessas vesículas.
[0010] Além disso, onde alguns dos componentes surfactantes contendo PEG são substituídos com o AOI, esta afeta a flexibilidade da vesícula e remove alguma da energia motriz.
[0011] A presente invenção contorna os problemas ligando fisicamente um AOI para a vesícula, de modo que a vesícula atua meramente como um dispositivo mecânico, puxando o AOI desejado abaixo da superfície da pele.
[0012] Estas vesículas da presente invenção podem ser utilizadas para o transporte de outros fragmentos/AOI para dentro do corpo através da via transdérmica, por anexar tais frações ou o AOI a um componente da vesícula, de tal modo que o AOI se encontra fora da vesícula.
[0013] Por conseguinte, a presente invenção proporciona, num primeiro aspecto, uma formulação vesicular que compreende um lipídio, um surfactante e um AOI, em que o AOI é ligado a um componente da vesícula de tal modo que pelo menos uma porção do AOI está na superfície exterior da vesícula, e é externo à membrana da vesícula. De preferência, o componente ao qual se encontra ligado o AOI é um lipídio e/ou um componente surfactante. Pelo menos uma porção significa que do total AOI que é externo à vesícula pelo menos, 5%, 10% ou 20%, adequadamente 40%, ou mais de 50% de cada molécula (em termos de tamanho ou volume da molécula) é externo à membrana do transfersome. De preferência, a maioria dos AOI, mais preferencialmente, a molécula inteira do AOI é externo à vesícula. o AOI pode ser ligado covalentemente a um componente de tal modo que apresenta na superfície exterior da vesícula.
[0014] Pelo AOI que é externo à vesícula, que se destina àqueles que estão AOI 'virado para fora". Durante a fabricação das vesículas, em que o componente surfactante ou lipídio que se encontra ligado ao AOI é misturado com os componentes não modificados, a orientação da molécula modificada não pode ser controlada. Assim, aproximadamente 50% das moléculas às quais o AOI está ligado será na orientação "incorreta", o que significa que uma porção do AOI estará presente no lúmen da vesícula. Das moléculas modificadas que estão na orientação "correta" de tal modo que o AOI é externo à vesícula, pelo menos 50% a própria molécula do AOI, em termos de tamanho físico/volume, é externo à membrana vesicular. O processo de fabricação pode resultar em uma proporção menor do AOI sendo externo à vesícula, ou seja, a concentração externa do AOI pode situar-se entre 1% a 10% (incluindo 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7 %, 8% ou 9%) 10% a 50%, 15% a 45%, 20% a 40% ou 25% a 30% (p/v) do total AOI na formulação. Por concentração externa entende-se a concentração de AOI, que está disponível para a libertação e/ou a exercer a sua atividade terapêutica uma vez que as vesículas têm penetrado na pele.
[0015] O benefício da formulação vesicular da invenção relaciona-se com a velocidade, a profundidade e a quantidade de AOI e do tamanho e natureza de que AOI que penetra na pele, quando o AOI é ligado à vesícula e topicamente aplicado.
[0016] A formulação pode ser um creme, loção, pomada, gel, solução, pulverização, lacas, mousse ou película de solução de formação.
[0017] A formulação vesicular pode ou não pode conter qualquer agente terapêutico conhecido, diferente do AOI ligado às vesículas. A formulação vesicular compreendendo um AOI pode ou não pode estar livre de qualquer produto ativo mais biologicamente ativo ou farmaceuticamente. Um agente ativo biologicamente ou farmaceuticamente ativo é aqui definido como um agente que tem atividade farmacológica, imunológica ou metabólica.
[0018] A invenção abrange formulações vesiculares que compreendem um ou mais fosfo ou sulfolipídios e um ou mais agentes surfactantes que são eficazes para a entrega de um AOI. O surfactante pode ser não iônico.
[0019] A formulação vesicular da invenção é capaz (sem se pretender ficar limitado pela teoria) para realizar a sua função através das propriedades únicas de vesículas, que são vesículas de bicamada compostas do surfactante e lipídio, tais como fosfatidilcolina de soja. A singularidade das vesículas deriva da inclusão na formulação de uma quantidade específica de agente surfactante não iônico, o qual modifica a membrana de fosfolipídio, de tal forma que as vesículas resultantes estão num estado permanente cristalino líquido e, uma vez que o surfactante também confere membrana estabilidade, as vesículas são ultra deformável e estável (tendo reduzido a rigidez sem quebrar).
[0020] A formulação vesicular compreende/formas em vesículas suspensa em, por exemplo, um tampão aquoso que é aplicado topicamente. As vesículas da formulação vesicular compreendem uma bicamada ou membrana unilamelar, em torno de um núcleo vazio. Variam em tamanho de 60 nm de diâmetro de 200 nm de diâmetro, e pode variar entre 100 nm e 150 nm de diâmetro. As vesículas são altamente hidrofílicas e esta propriedade, juntamente com a sua ultra deformabilidade, é a chave para a sua capacidade para ser transportado através da pele. Quando a formulação da invenção é aplicada à pele e deixou-se secar, a força de re-hidratação de condução das vesículas combinadas com a sua capacidade de deformação dá origem a movimento das vesículas a áreas de elevado teor em água e abaixo da barreira de permeabilidade da pele. Isso leva o seu movimento através de poros da pele e lacunas intracelulares. A proporção específica de agente surfactante para surfactante não iônico facilita a entrega transdérmica de vesículas. O movimento das vesículas através dos poros e lacunas intracelulares puxa ou transportam com elas o AOI.
[0021] Uma vez que eles passam através da pele, as vesículas da presente invenção, eventualmente, como vesículas intactas. Remoção eficiente de vesículas não ocorre através da microvasculatura de sangue cutâneo (capilares), devido ao seu tamanho relativamente grande, mas a hipótese de que eles estão sendo transportados com o fluido intersticial para outras e/ou mais profundas dos tecidos abaixo do local de aplicação dérmica. Um estudo pré-clínico realizado com vesículas da invenção marcada com uma molécula de marcador (cetoprofeno) mostrou que as vesículas não entraram na vasculatura por causa da aplicação tópica após altas concentrações de molécula do marcador serem observadas localmente com baixa absorção sistêmica.
[0022] O AOI pode estar ligado a um componente surfactante ou a um componente lipídico de uma vesícula. Alternativamente, tanto um componente de lipídio e um componente surfactante de uma vesícula pode ter um AOI a eles ligado.
[0023] Uma vesícula da formulação pode ter um único ou uma pluralidade de AOIs ligados à sua superfície externa. Em que uma pluralidade de AOIs está ligada, os AOIs podem ser todos do mesmo, isto é, homogêneo, ou os AOIs podem ser diferentes, ou seja, heterogêneo.
[0024] O AOI pode ser um elemento, um íon, uma molécula pequena, um carboidrato, um lipídio, um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, uma macromolécula ou uma molécula macrocíclico. O AOI pode ser um micronutriente.
[0025] O AOI pode ser uma proteína estrutural da pele (tais como o colágeno ou a elastina), uma proteína terapêutica, ou cromóforo de porfirina contendo macromolécula, uma vitamina, dióxido de titânio, óxido de zinco, de melanina ou de um análogo de melanina. O AOI pode ser um peptídeo ou um fármaco anti- inflamatório, tal como um NSAID. Especificamente, o AOI pode ser tetrapeptídeo-7, tripeptídeo 1, ácido ascórbico, naproxeno ou diclofenaco.
[0026] O AOI para ser ligado pode ser ligado covalentemente ou de outra forma ligada diretamente, quer o componente fosfolipídio ou surfactante da vesícula ou o componente lipídio da vesícula. Pode ser desejável utilizar uma ligação ou ponte que está covalentemente ligada a ou de outra forma, tanto o ácido graxo, surfactante ou componente lipídico e o AOI. Em um exemplo, se um AOI inorgânico devesse ser adicionado (por exemplo, um sal de metal ou óxido), um ligante adicional, por exemplo, um agente quelante de metais tal como EDTA possam ser primeiramente conjugados com o componente da vesícula. Num outro exemplo, pode ser desejável para utilizar uma molécula maior, por exemplo, um polímero (tal como polietileno-glicol; PEG), a fim de facilitar a eficácia do processo de colagem e/ou a eficácia do AOI ligado. Essas moléculas ligantes/em ponte mais longa será particularmente benéfica quando é desejável manter um AOI a uma distância tal a partir das vesículas de modo a evitar que interfiram com a própria membrana. Isto pode ocorrer se o AOI é particularmente hidrofóbico.
[0027] As grandes moléculas ou macromoléculas podem ser ligadas de forma covalente ao componente (s) da vesícula. Exemplos incluem proteínas estruturais da pele, como colágeno e elastina; proteínas terapêuticas; e enzimas.
[0028] Uma pluralidade de AOIs pode ser ligada a um componente lipídio ou agente surfactante para apresentar na superfície exterior da vesícula de modo que, uma vez feita através da pele, eles continuam a apresentar na superfície da vesícula. Exemplos incluem antioxidantes; vitaminas; compostos inorgânicos, tais como TiO2 e ZnO; moléculas de porfirina para utilização na terapia fotodinâmica.
[0029] Transportar vitaminas no corpo através da pele pode substituir a falta de capacidade da geração de vitamina (por exemplo, a vitamina D), aprimorar a capacidade de proteger e reparar-se (por exemplo, as vitaminas C e E), melhorar a pele (de qualquer outro órgão), ou tratamento dérmico ou outras condições, tais como a dermatite seborreica (por exemplo, vitamina B7). A referência à pele inclui a pele geral do corpo e qualquer outro tegumento externo, tal como o epitélio do ouvido, nariz, garganta e do olho, incluindo a esclerótica do olho, e outras membranas mucosas, tais como a vagina e ânus/reto.
[0030] A vitamina D é, na verdade, um grupo de compostos solúveis em gordura responsável por aumentar a absorção intestinal de cálcio e fosfato. O mais importante deste grupo são D3 (colecalciferol) e D2 (ergocalciferol). A deficiência de vitamina D provoca osteomalácia (raquitismo em crianças) e baixos níveis foram associados à baixa densidade mineral óssea.
[0031] Pele de mamífero produz vitamina D3 através da ação de radiação UV sobre o seu precursor, 7-desidrocolesterol, e fornece cerca de 90 por cento da nossavitamina D. A proteção solar absorve luz ultravioleta e impede-o de atingir a pele. Tem sido relatado que o filtro solar com um fator de proteção solar (FPS) de 8 com base no espectro de UVB pode diminuir a capacidade sintética de vitamina D por 95 por cento, enquanto que a proteção solar com um SPF de 15 pode reduzir a capacidade sintética por 98 por cento.
[0032] Mais recentemente, tem havido uma tendência de aumento do uso de protetores solares FPS maior (entre 25 SPF e 50 SPF) e produtos de protetor solar completos como a sensibilização do público para os perigos do bronzeamento tem crescido. Além disso, tanto para produtos cosméticos da pele e cosméticos da cor tiveram protetores solares de 15, 20 e 25 SPF adicionado à sua formulação para fornecer um grau de proteção solar.
[0033] Quando a formulação compreende a vitamina D3 (que não é para dizer que também não compreende a vitamina C e/ou E e/ou B7) a formulação pode ser incorporada num produto de filtro solar, um produto de bloqueador solar, um produto depois do sol ou outros produtos para a pele ou produto cosmético para completar os níveis baixos de vitamina D. Os baixos níveis de vitamina D podem ser causados por condições de baixa luminosidade, ou o uso de filtro solar, o que pode impedir a produção de vitamina D no corpo.
[0034] Assim, a presente invenção pode associar-se a vitamina D3/colecalciferol transdérmico com uma vesícula flexível, ou seja, uma formulação que compreende um lipídio e o agente surfactante, a vitamina amarrada a sua superfície externa. A formulação resultante pode então ser incluída em protetores solares, formulações pós-sol e produtos cosméticos que incluem protetor solar. Esta "combinação vesícula/vitamina D" vai penetrar na pele e entregar sua carga útil para as camadas de estrato basal e estrato espinhoso na epiderme.
[0035] No corpo, o colecalciferol (vitamina D3) é convertido em primeiro lugar para calcidiol no fígado. A circulação do calcidiol é então covertida em calcitriol, a forma biologicamente ativa da vitamina D, nos rins. Calcidiol arterial baixa (25-hidroxi-vitamina D) pode resultar de evitar o sol. A invenção inclui, portanto, a associação quer calcidiol ou calcitriol com uma vesícula transdérmica, por meio de colagem ou amarração para um componente das vesículas.
[0036] Certas vitaminas, por exemplo, vitamina C e vitamina E, têm importantes propriedades antioxidantes e por isso foram incorporados em produtos para a pele para reduzir os sinais de envelhecimento e os danos da pele.
[0037] A forma mais biologicamente ativa da vitamina E é a α- tocoferol solúvel em gordura e uma modalidade da presente invenção antecipa a associação de α-tocoferol com um componente das vesículas para incorporação em preparações para a pele, incluindo protetores solares e produtos pós-sol para amenizar os danos do sol.
[0038] A vitamina C (ácido ascórbico solúvel em água) é um cofator em muitas reações enzimáticas, incluindo reações de síntese de vários colágenos. Estas reações são importantes na cicatrização de feridas e na prevenção de sangramento dos capilares. Portanto, a presente invenção inclui associar com um componente de ascorbato de vesícula, tanto para incorporação em preparações para a pele e do cuidado solar para melhorar danos de colágeno, e para incorporação em produtos de cuidados de feridas.
[0039] Assim, quando o micronutriente compreende vitamina C e/ou vitamina E, a formulação pode ser incorporada num produto de filtro solar, um produto de bloqueador solar, um produto pós- sol ou outros produtos para a pele ou um produto cosmético para complementar a vitamina C e/ou vitamina E epidérmica e dérmica e prevenir ou auxiliar na reparação da pele danificada pelo sol ou envelhecimento.
[0040] Vitamina B7 (solúvel em água biotina) é uma coenzima de enzimas carboxilase. A deficiência em biotina pode causar uma dermatite sob a forma de um precipitado. Em pacientes de adição com fenilcetonúria (uma incapacidade para quebrar fenilalanina) apresentam formas de eczema e dermatite seborreica, que pode ser melhorada pelo aumento de biotina dietética.
[0041] Assim, quando o micronutriente compreende vitamina B7, a formulação pode ser incorporada num produto filtro solar, um produto bloqueador solar, um produto pós-solar ou outro produto para cuidados da pele ou produto cosmético para complementar a vitamina B7 epidérmica e dérmica e melhorar as dermatoses associadas a uma deficiência de vitamina presente.
[0042] Peptídeos, tais como o tetrapeptídeo-7 ou tripeptídeo- 1, podem ser ligado a um componente de ácido graxo ou surfactante da membrana da vesícula. Tetrapeptídeo-7 pode ser útil no combate a inflamação e atua para estimular a regeneração da pele por meio da produção de colágeno. Isto significa que é particularmente útil em cuidados da pele e produtos antienvelhecimento. Tripeptídeo-1 tem uma ação similar. Entrega eficiente através da camada externa da pele pode proporcionar efeitos elevados em mais baixos níveis/concentrações minimizando assim possíveis efeitos colaterais resultantes da supressão de interleucinas.
[0043] Medicamentos anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs) são agentes analgésicos geralmente usados para aliviar os sintomas da osteoartrite, esportes associados a dor nas articulações, dor nas costas, dores de cabeça e dor de dente. Exemplos de NSAIDs são a aspirina, ibuprofeno, diclofenaco e naproxeno. Mais uma vez, a entrega eficaz e eficiente de tais drogas diretamente no local de dor e inflamação pode resultar na utilização de dosagens mais baixas e/ou específicas e, assim, a redução ou eliminação de efeitos colaterais, tais como problemas gastrointestinais, problemas renais e problemas cardíacos.
[0044] A invenção pode incluir a ligação de um número maior de pequenas, AOIs inativas para a superfície da vesícula, de modo que uma vez sob a pele se torna ancorada e a longevidade das vantagens da presença da própria vesícula, por exemplo, de retenção de água, estrutura de suporte, pode ser prorrogado.
[0045] O AOI pode ser ligado (ou ligadas ou amarradas) para o componente surfactante da vesícula. A ligação para o surfactante pode ser diretamente sobre o surfactante por ligação de éster, se a molécula tem um grupo hidroxil. Um método alternativo de ligação é para substituir um átomo ou grupo funcional do surfactante (por exemplo, no caso de Tween, um polímero de polietileno-glicol) com o AOI. Um terceiro método de ligação é diretamente a um ácido graxo, opcionalmente através de uma ligação éster. Se o AOI é uma molécula inorgânica, em seguida, uma molécula de ligação pode ainda ser primeiramente conjugada com o componente de vesículas, por exemplo, um agente quelante de metais tal como EDTA, no caso de um sal de metal. Se é desejoso que o AOI seja realizado a uma certa distância a partir da vesícula de forma a maximizar a sua eficácia (por exemplo, para expor um local ativo de um AOI, que é uma enzima), em seguida, uma molécula de ligação, por exemplo, uma cadeia de polímero (por exemplo polietileno glicol) pode ser ligado a um componente da vesícula e do AOI.
[0046] O AOI pode ser ligado (ligada ou conectada) para o componente lipídio da vesícula. A ligação para o lipídio pode ser alcançada através de qualquer um dos grupos hidroxil de glicerol através de uma ligação éster, por exemplo, por eliminação de um ácido graxo e substituindo com o AOI. Alternativamente, o método de fixação pode ser por substituição da fração de fosfatidil de tal modo que a molécula final tem duas cadeias de ácido graxo em conjunto com o AOI preso. As inserções de lipídios modificados na região alifática como normal e com a rotação livre disponível no modelo de glicerol, o AOI amarrado seria localizada do lado de fora da vesícula. Uma ligação de amida pode ser utilizada para uma alternativa mais estável caso seja exigido que o AOI seja amarrado à vesícula para uma maior duração. Isto pode ser desejável, por exemplo, se o alvo para o AOI é profundo do tecido, tais como juntas, em vez de as camadas superiores da derme. Uma combinação de ligações menos estáveis e mais estáveis pode ser utilizada (por exemplo, éster e de amida, respectivamente) para alcançar uma libertação escalonada do AOI.
[0047] O método de ligação de qualquer componente pode ser hidrolisável ou não hidrolisável. Se for desejável que o AOI deve ser destacado uma vez, dentro ou sob a pele, a ligação deve ser hidrolisável. Se for desejável que o AOI ligado deve permanecer ligado à vesícula de uma vez, dentro ou sob a pele, a ligação deve ser não hidrolisável.
[0048] O AOI pode ser ligado covalentemente ou conjugada com um componente da membrana; a ligação pode ser hidrofílica ou hidrofóbica ou hidrostática; a ligação pode ser uma ligação de hidrogênio, uma ligação iônica.
[0049] Os termos "ligação", "fixação" e "amarração" são aqui usados permutavelmente para abranger todas as ligações acima referidas.
[0050] A presente invenção pode ser utilizada para administrar um AOI à pele de um mamífero. Qualquer mamífero pode ser incluído, incluindo os seres humanos, cães, gatos, cavalos, animais de produção de alimentos e animais de estimação. o AOI pode ser uma entidade terapêutica ou uma entidade cosmética ou de uma entidade não terapêutica ou não cosmética, em alternativa ou além disso, o AOI pode ser metabólica e/ou estrutural.
[0051] Por conseguinte, um segundo aspecto da invenção proporciona uma formulação vesicular que compreende um lipídio, um surfactante e um AOI, em que o AOI é ligado ou acoplado a um componente da vesícula de tal modo que a maioria do AOI, que é externo à vesícula. Para uso na entrega do AOI através da pele de um sujeito, em que a formulação é aplicada topicamente.
[0052] Um terceiro aspecto da invenção proporciona um método de entregar um AOI através da pele de um sujeito, o método que compreende a aplicação tópica na pele do paciente da formulação vesicular da invenção numa quantidade suficiente para penetrar na pele para entregar o AOI.
[0053] A invenção também proporciona um método de entrega de mais de um AOI através da pele do paciente, o método compreendendo a aplicação tópica, quer a formulação vesicular da invenção, em que as vesículas têm uma pluralidade heterogênea de AOIs a eles ligado e/ou a aplicação da formulação vesicular da invenção em que a formulação é uma mistura de vesículas, cada formulação com vesículas que têm diferentes pluralidades únicas ou homogêneas de AOIs a eles ligado.
[0054] O lipídio nas formulações vesiculares pode ser um fosfolipídio. Um segundo lipídio pode estar presente, o qual pode ser um lisofosfolipídio. O lipídio pode ser um sulfolipídio. O surfactante pode ser um surfactante não iônico.
[0055] As formulações da invenção formam vesículas ou outros agregados superficiais estendidos (ESAs), em que as preparações vesiculares têm uma melhor capacidade de permeação através das barreiras semi-permeáveis, tal como a pele. O tamanho da vesícula impede a penetração na vasculatura e, como resultado impede a libertação sistêmica. Apesar de não estar limitado a qualquer mecanismo de ação, as formulações da invenção são capazes de formar vesículas caracterizadas pela sua capacidade de deformação e/ou a adaptabilidade.
[0056] A composição específica da formulação vesicular vai determinar que a camada de pele do AOI pode ser entregue. Certas formulações penetrarão apenas as camadas superiores da pele, enquanto outras formulações viajarão para camadas mais profundas. A formulação vesicular será escolhida dependendo do AOI a ser entregue. Por exemplo, se o colágeno é o AOI a ser entregue em profundidade na pele, ele vai ser ligado à formulação vesicular que é capaz de penetrar nas camadas mais profundas da pele.
[0057] Como um quarto aspecto, a invenção proporciona um método de fabricação de uma formulação vesicular de acordo com o primeiro ao terceiro aspectos da invenção. O método compreende a ligação de um AOI a um componente vesicular, a mistura do AOI/componente com um fosfolipídio não modificado e surfactante para formar as formulações vesiculares da invenção.
[0058] Um quinto aspecto da invenção relaciona-se com a formulação vesicular do primeiro aspecto para ser utilizado no tratamento da doença. A doença a ser tratada dependerá do AOI, que fica preso às vesículas.
[0059] A invenção proporciona uma formulação vesicular de acordo com o primeiro aspecto, em que o AOI é uma vitamina, tais como vitamina C, vitamina E, vitamina D, ou vitamina A, para utilização num produto para cuidados da pele, para utilização num produto antienvelhecimento ou para utilização em produtos de proteção solar (proteção UV).
[0060] Também é fornecida uma formulação vesicular de acordo com a invenção, em que o AOI é um peptídeo, tal como tetra- peptídeo 7 ou tri-peptídeo 1, para utilização em produtos anti- envelhecimento, para utilização no estímulo ou aumentar a produção de colágeno, ou para usar nos cosméticos.
[0061] Também é fornecida uma formulação vesicular de acordo com a invenção, em que o AOI é um NSAID, tal como naproxeno ou diclofenaco, para utilização no tratamento de osteoartrite, para uso no tratamento de dor articular artrítica, para utilização no tratamento de dores musculares, para utilização no tratamento da tensão muscular ou para uso no tratamento de inflamação.
[0062] Como será apreciado, outros AOIs podem ser amarrados com as vesículas da presente invenção, a fim de tratar uma grande variedade de doenças.
[0063] Todas as características do primeiro aspecto da invenção aplicam-se ao segundo a quinto aspectos, mutatis mutandis.
[0064] Durante a fabricação das vesículas, a proporção de componentes modificados (ou seja, com AOIs anexas) para os componentes não modificados (ou seja, sem AOIs ligado) é ajustada para controlar tanto o grau com que múltiplos componentes modificados (e, portanto, AOIs) são incorporados nas vesículas e também o número de vesículas que contêm pelo menos um AOI. Quando uma proporção de vesículas permanece não modificada na preparação final, estes irão complementar a ação "puxar" das formas modificadas, seguindo estes para dentro dos poros da pele e "empurrar" a partir de trás. A porcentagem de vesículas modificadas (como uma proporção do total de vesículas) na preparação final pode variar de 0,1% a 100%, ou de 1% a 100%, de 10% a 90%, de 25% a 75% ou 50%.
[0065] Para garantir que uma proporção elevada de vesículas tem o AOI desejado ligada, ou tem múltiplos AOIs anexados, 100% de surfactante modificado pode ser usado para misturar com o lipídio (ou vice-versa). No outro extremo da escala, para um efeito mais diluído, em que apenas algumas vesículas têm um AOI ligado ou apenas um único AOI é ligado às vesículas, por exemplo, uma mistura de 5% modificada a 95% de surfactante não modificado é utilizada. Geralmente, no entanto, entre 80% e 10% do lipídio ou surfactante é substituído com um lipídio modificado ou componente surfactante. Entre 75% e 15% do componente lipídio ou componente surfactante pode ser substituído. De um modo adequado, entre cerca de 70%, 65%, 60%, 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ou 10%, ou qualquer intervalo entre estes valores, quer do componente lipídio ou o componente surfactante pode ser substituído com um lipídio modificado ou componente surfactante modificado, ligado à AOI, respectivamente, uma proporção de ambos os lipídios e os componentes de surfactantes podem ser substituídos. Refinamento adicional pode ser realizado pela extração das vesículas modificadas e misturá-las em uma "dose" precisa com vesículas não modificadas puras, ou por mistura com vesículas modificadas com um AOI diferente. Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais em química orgânica, química medicinal, farmacologia descritos aqui são bem conhecidos e vulgarmente empregues na técnica. A menos que definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento, geralmente, têm o mesmo significado como comumente compreendido por um versado na técnica ao qual pertence esta divulgação.
[0066] Tal como aqui utilizado, uma "quantidade suficiente", "quantidade eficaz para" ou uma "quantidade suficiente para" alcançar um resultado particular refere-se a uma quantidade da formulação da presente invenção que seja eficaz para produzir um efeito desejado, que é, opcionalmente, um efeito terapêutico (isto é, por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz). Alternativamente referido, uma quantidade "terapeuticamente eficaz" é uma quantidade que proporciona algum alívio, mitigação e/ou diminuição em pelo menos um sintoma clínico. Os sintomas clínicos associados com o distúrbio que pode ser tratado pelos métodos da invenção são bem conhecidos dos versados na técnica. Além disso, os versados na técnica apreciarão que os efeitos terapêuticos não necessitam de ser completos ou curativos, contanto que algum benefício é fornecido ao indivíduo.
[0067] Tal como aqui utilizado, os termos "tratar", "tratando" ou "tratamento" significam que a gravidade do estado de um sujeito é reduzida ou, pelo menos, parcialmente melhorada ou melhorada e/ou que algum alívio, mitigação ou diminuição em pelo menos um sintoma clínico é conseguido e/ou se houver uma inibição ou atraso da progressão da doença e/ou o atraso na progressão do início da doença ou enfermidade. Os termos "tratar", "tratando" ou "tratamento de" também significam a gestão do estado de doença. "Prevenção", significa o tratamento profilático.
[0068] Tal como aqui utilizado, o termo "farmaceuticamente aceitável", quando utilizado em referência às formulações da presente invenção indica uma formulação que não resulta em níveis inaceitáveis de irritação no sujeito ao qual a formulação é administrada. De preferência, este nível será suficientemente baixo para proporcionar uma formulação adequada para aprovação pelas entidades reguladoras.
[0069] Tal como aqui utilizado no que diz respeito aos valores numéricos, o termo "cerca de" significa uma gama em torno de um valor numérico particular que inclui aquela que seria de esperar como resultado de erro experimental normal em fazer uma medição. Por exemplo, em certas modalidades, o termo "cerca de", quando utilizado em ligação com um meio particular valor numérico +20%, a menos que especificamente indicado para ser +-1%, +-2%, +-3%, +-4%, +-5%, +-10%. +-15%, ou +-20% do valor numérico.
[0070] A formulação da invenção aqui fornecida compreende pelo menos um lipídio, de preferência um fosfo ou sulfolipídio, pelo menos, um surfactante, preferivelmente um surfactante não iônico, opcionalmente em suspensão num meio farmaceuticamente aceitável, de preferência uma solução aquosa, de preferência tendo um pH variando de 3,5 a 9,0, de preferência de 4 a 7,5. A formulação da invenção pode conter, opcionalmente, tampões, antioxidantes, conservantes, microbicidas. Antimicrobianos, emolientes, co-solventes e/ou espessantes. A formulação da invenção pode compreender uma mistura de mais do que um lipídio, de preferência mais de um fosfolipídio. A formulação da invenção pode consistir essencialmente de, pelo menos, um lipídio, preferencialmente um fosfolipídio, pelo menos, um surfactante, preferivelmente um surfactante não iônico, um veículo farmaceuticamente aceitável, e tampões, antioxidantes, conservantes, microbicidas, antimicrobianos, emolientes, co- solventes, opcionalmente e/ou espessantes. A formulação da invenção pode ser constituída por, pelo menos, um lipídio, preferencialmente um fosfolipídio, pelo menos, um surfactante, preferivelmente um surfactante não iônico, um veículo farmaceuticamente aceitável, e um ou mais dos seguintes: tampões, antioxidantes, conservantes, microbicidas, antimicrobianos, emolientes, co-solventes, e espessantes.
[0071] A Tabela 1 lista os fosfolipídios preferidos de acordo com a invenção. Tabela 1:
Figure img0001
[0072] Os lipídios preferidos no contexto da presente memória descritiva são não carregados e estáveis, formam bicamadas bem hidratadas; fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolamina e esfingomielinas são os representantes mais proeminentes desses lipídios. Qualquer daqueles pode ter cadeias, conforme listado na Tabela 1; aqueles que formam bicamadas de fase fluida, em que as cadeias de lipídios estão em estado desordenado, sendo preferido.
[0073] Lipídios diferentes carregados negativamente, isto é, aniônicos, podem também ser incorporados em camadas duplas de lipídios vesiculares. Exemplos atraentes desses lipídios cobrados sãofosfatidilglicerol, fosfatidilinositóis e, um pouco menos preferido, ácido fosfatídico (e seu éster de alquil) ou fosfatidilserina. Será compreendido por qualquer versado na técnica que é menos recomendável fazer apenas a partir das vesículas de lipídios carregados do que a utilizá-los em combinação com componente (s) de elétron de duas camadas neutras. No caso de se utilizar lipídios com carga, a composição do tampão e/ou de cuidados de pH deve selecionado de modo a assegurar o desejado grau de ionização do grupo de lipídio principal e/ou o grau desejado de interação eletrostática entre as, opostamente, moléculas carregadas de drogas e de lipídios. Além disso, assim como lipídios neutros, os componentes lipídios da bicamada carregada pode, em princípio, ter qualquer uma das cadeias dos fosfolipídios como listado na Tabela 1. As cadeias que formam bicamadas de lipídio da fase fluida são claramente preferidas, no entanto, tanto devido ao aumento da adaptabilidade do papel da vesícula de aumentar a fluidez da cadeia graxo e devido a melhor capacidade de lipídios em fase fluida para misturar uns com os outros.
[0074] A cadeia derivada de álcool graxo ou ácido graxo de um lipídio é tipicamente selecionada entre os tipos básicos de cadeia alifática abaixo:
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[0075] Outras combinações de ligação dupla ou posições são possíveis também.
[0076] Um lipídio preferido da invenção é, por exemplo, uma fosfatidilcolina natural, que costumava ser chamado lecitina. Ele pode ser obtido a partir de ovos (rico em ácido palmítico, C16:0, e oleico, C18:1, mas também compreendendo esteárico, C18:0, palmitoleico, C16:1, linolênico, C18:2, e araquidônico, C20:4 (M, radicais), soja (rico em cadeias C18 insaturados, mas também contendo algum radical palmítico, entre alguns outros), coco (rico em cadeias saturadas), azeitonas (ricos em cadeias monoinsaturadas), açafrão (cártamo) e girassóis (ricos em n-6 ácido linoleico), linhaça (rica em n-3 ácido linolênico), a partir de gordura de baleia (rico em cadeias monoinsaturadas n- 3), a partir de prímula ou primrose (rica em cadeias n-3). Preferido, etanolamina de fosfatidil naturais (costumava ser chamado cefalinas) frequentemente se originam de ovo ou soja. Esfingomielinas preferidas de origem biológica são tipicamente preparadas a partir de ovos ou tecido cerebral. Fosfatidilserinas preferidas também originam tipicamente a partir do material cerebral enquanto que fosfatidilglicerol é preferencialmente extraído a partir de bactérias, tais como E. coli, ou então preparados por meio de transfosfatidilação, utilizando fosfolipase D, começando com uma fosfatidilcolina natural. Os fosfatidilinositóis preferencialmente utilizados são isolados a partir de fosfolipídios de soja comerciais ou extratos de fígado bovino. O preferido é o ácido fosfatídico, quer extraído a partir de qualquer uma das fontes mencionadas ou preparados utilizando fosfolipase D de uma fosfatidilcolina adequada.
[0077] Além disso, pode ser utilizadofosfatidilcolinas sintéticas.
[0078] A quantidade de lipídio na formulação é de cerca de 1% a cerca de 12%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 4%, cerca de 4% a cerca de 7% ou cerca de 7% a cerca de 10% em peso. O lipídio pode ser um fosfolipídio. O fosfolipídio pode ser uma fosfatidilcolina.
[0079] O lipídio na formulação não pode compreender um lisofosfolipídio alquil-. O lipídio na formulação não podem compreender um polienilfosfatidilcolina.
[0080] O termo "surfactante" tem o seu significado usual. Uma lista de surfactantes relevantes e relacionados com as definições de surfactantes é fornecida na EP 0 475 160 Al (ver, por exemplo, p. 6, 1. 5 a p.14. 1,17) e Pat. U.S. No. 6.165.500 (ver, por exemplo, col. 7, 1. 60 a col. 19, 1. 64), cada uma aqui incorporada por referência na sua totalidade, e no surfactante ou manuais farmacêuticos adequados, tais como Handbook of Surfactants industriais ou US Pharmacopoeia, Pharm. Eu. Em algumas modalidades, os surfactantes são os descritos nas Tabelas 1-18 Publicação do Pedido de Patente No.US 2002/0012680 Al, publicado em 31 de janeiro de 2002, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A lista a seguir, portanto, apenas oferece uma seleção, que é de nenhuma maneira completa ou exclusiva, de várias classes de surfactantes que são particularmente comuns ou úteis em conjunto com o pedido de patente presente. Os surfactantes preferidos para serem utilizados de acordo com a invenção incluem aqueles com um HLB superior a 12. A lista inclui ácidos graxos de cadeia longa ionizadas ou álcoois graxos de cadeia longa, sais de amônio graxos de cadeia longa, tais como alquil- ou alquenoil-trimetil- , -dimetil- e - os sais de metil-amônio, sais de alquil- ou alquenoil-sulfato, aminoxidos-dimetil graxos de cadeia longa, tais como alquil- ou alquenoil-dimetil-aminoxidos, graxos de cadeia longa, por exemplo, alcanoil, dimetil-aminoxidos e especialmente dodecil dimetil-aminoxido, graxo de cadeia longa, por exemplo, alquil-N-metilglucamida- s e alcanoil-N- metilglucamidas. tais como MEGA-8, MEGA-9 e MEGA-IO, N-graxo de cadeia longa-N,N-dimetilglicinas, por exemplo, N-alquil-N,N- dimetilglicinas, 3-(graxode cadeia longa-dimetilamônio)-alcano- sulfonatos, por exemplo 3- (acildimetilamônio) sulfonatos de alcano, graxos derivados de cadeia longa, sais de sulfosuccinato, tais como bis(2-etilalquil), sais de sulfosuccinato, graxos de sulfobetaínas de cadeia longa, por exemplo acil-sulfobetainas, graxos de betainas de cadeia longa, tais como EMPIGEN BB ou ZWITTERGENT-3-16, -3-14, -3-12, -3-10, ou -3-8, ou éteres acilfenil polietileno-glicol, éter fenílico especialmente nonaetileno-glicol-octil-, graxos de éteres de polietileno de cadeia longa, éteres especialmente de polietileno-acil, tais como éter nonaetileno-decil, éter nonaetileno-dodecil ou éter de octaetileno-dodecil, éteres de polietilenoglicol-isoacil, tais como éter octaetileneglicol- isotridecil, ésteres graxos de polietilenoglicol-sorbitano de cadeias longas, por exemplo ésteres de polietilenoglicol- sorbitano-acil e especialmente o monolaurato de polioxietileno (por exemplo, polissorbato 20 ou Tween 20), monolaurato de polioxietileno sorbitano-mono-oleato (por exemplo, polissorbato 80 ou Tween 80), polioxietileno-sorbitano-monolaurato, polioxietileno - sorbitano-monopetroselinato, polioxietileno - sorbitano- monoelaidato, polioxietileno -sorbitano- miristoleilato, polioxietileno sorbitano-palmitoleinilato, monolaurato de polioxietileno sorbitano-palmitoleinilato, polioxietileno- sorbitano-p- etroselinilato, graxos de éteres de poli-hidroxi de cadeia longa de etileno, por exemplo éteres polihidroxietileno-acil, tais como éteres de polihidroxietileno- laurílico, éteres de polihidroxietileno-miristoil, earil de polihidroxietileno-cetilst-, éteres de polihid roxietileno- palmitoleoil, éteres de polihidroxietileno-oleoil, palmitoleoil polihidroxietileno- leil polihidroxietileno-lino-, polihidroxietileno -4, ou 6, ou 8, ou 10, ou 12-lauril, miristoil, palmitoil, palmitoleil, oleoil ou éteres de linoeil (série de Brij), ou nos ésteres correspondentes, de polihidroxietileno-laurato, -miristato, -palmitato, -estearato ou -oleato, especialmente polihidroxietileno-8-estearato (Myrj 45) e polihidroxietileno-8-oleato, óleo de rícino polietoxilado 40 (Cremophor EL), cadeia longa de graxo de sorbitano mono, por exemplo alquilato (série de Arlacel ou Span), especialmente como sorbitano -monolaurate (Arlacel 20, Span 20), graxo de cadeia longa, por exemplo acil-N-metilglucamidas, alcanoil-N- metilglucamidas, especialmente decanoil-N-metilglucamida, dodecanoil-N-metilglucamida, graxos sulfatos de cadeia longa, por exemplo alquil- sulfatos, sais de sulfato de alquil, tais como lauril-sulfato (SDS), oleoil-sulfato: graxos de tioglucosídeos de cadeia longa, tais como alquiltioglucosídeos e, especialmente, heptil-, octil- e nonil-beta-D- tioglucopiranosídeo; graxos de cadeia longa derivados de vários carboidratos, tais como pentoses, hexoses e disacarídeos, especialmente alquil-glucosídeos e maltosídeos, tais como hexil, heptil-, octil-, nonil- e decil-beta-D-glucopiranosídeo ou maltopiranosídeo D-; adicionalmente um sal, especialmente um sal de sódio, de colato, desoxicolato, glicocolato, glicodcoxicolato, taurodesoxicolato, taurocolato, um sal de ácido graxo, especialmente oleato, elaidato, linoleato, laurato, ou miristato, na maioria das vezes na forma de sódio, lisofosfolipídios, n-octadecileno ácido -glicerofosfatídico, octadecileno- fosforilglicerol, octadecileno-fosforilserina, N- ácidos graxos de cadeia longa de glicero-fosfatidicos, tais como os ácidos N-acil-glicero-fosfatidicos, especialmente ácidos de glicero-fosfatídico, ácido lauril-oleoil-glicero fosfatídico, n-gordos de glicerol de cadeia longa-fosforilo, tais como N- acil-fosforilglicerol, especialmente lauril-, myristoil-, oleoil- ou palmitoeloil- fosforilglicerol, n-graxo de cadeia longa-fosforilserina, tal como n-acil-fosforilserina, especialmente lauril-, miristoil-, oleoil- ou palmitoeloil- fosforilserina, ácido fosfatídico-n-tetradecil-glicero, n- tetradecil-fosforilglicerol, n-tetradecil-fosforilserina, correspondendo-, elaidoil-, vacenil-lisofosfolipídios, correspondendo fosfolipídios de cadeia curta, bem como todas as superfícies ativas e, portanto, polipeptídeos de membrana desestabilizadora. Cadeias de surfactante são tipicamente escolhidas para estar em um estado fluido ou pelo menos para ser compatível com a manutenção do estado de cadeia fluida em agregados transportadores.
[0081] O surfactante pode ser um surfactante não iônico. O surfactante pode estar presente na formulação em cerca de 0,2 a 10%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 7% ou cerca de 2% a 5% em peso. O surfactante não iônico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: sorbitanos de polioxietileno (surfactantes de polissorbato), estearatos de poli-hidroxietileno ou poli-hidroxietileno de lauriléter (surfactantes Brij). O surfactante pode ser um mono-oleato de polioxietileno-sorbitano (por exemplo, polissorbato 80 ou Tween 80) ou Tween 20, 40 ou 60. O polissorbato pode ter qualquer cadeia com 12 a 20 átomos de carbono. O polisorbato pode ser fluido na formulação, a qual pode conter uma ou mais ligações duplas, ramificação ou ciclo-grupos.
[0082] O surfactante pode ser modificado com moléculas de PEG adicionais ou outras unidades hidrofílicas.
[0083] As formulações da invenção podem compreender apenas um lipídio e apenas um agente surfactante, para além do surfactante lipídio ou modificado. Alternativamente, as formulações da invenção podem compreender mais do que um lipídio e apenas um agente surfactante, por exemplo, dois, três, quatro, ou mais lipídio e um agente surfactante. Alternativamente, as formulações da presente invenção podem compreender apenas um lipídio e mais do que um surfactante, por exemplo, dois, três, quatro, ou mais agentes surfactantes e um lipídio. As formulações da invenção podem compreender mais do que um lipídio e mais do que um surfactante, por exemplo, dois, três, quatro, ou mais lipídios e dois, três, quatro, ou mais agentes surfactantes.
[0084] As formulações da invenção podem ter uma gama de proporções de lipídio ao surfactante (inclusive o lipídio e/ou surfactante que está ligado ao AOI). As proporções podem ser expressas em termos de termos molares (mol de lipídio/mol de surfactante). A proporção molar de lipídio para surfactantes nas formulações pode ser de cerca de 1: 3 a cerca de 30: 1, de cerca de 1: 2 a cerca de 30: 1, de cerca de 1: 1 a cerca de 30: 1, de cerca de 2: 1 a cerca de 20: 1, de cerca de 5: 1 a cerca de 30: 1, de cerca de 10: 1 a cerca de 30: 1, de cerca de 15: 1 a cerca de 30: 1, ou de cerca de 20: 1 a cerca de 30:1. A proporção molar de lipídio para surfactante nas formulações da invenção pode ser de cerca de 1: 2 a cerca de 10: 1. A proporção pode ser de cerca de 1: 1 a cerca de 2: 1, de cerca de 2: 1 a cerca de 3: 1, de cerca de 3: 1 a cerca de 4: 1, de cerca de 4: 1 a cerca de 5: 1 ou de cerca de 5: 1 a cerca de 10: 1. A proporção molar pode estar compreendida entre cerca de 10,1 e cerca de 30: 1, de cerca de 10: 1 a cerca de 20: 1, de cerca de 10: 1 a cerca de 25: 1, e de cerca de 20: 1 a cerca de 25: 1. O lipídio à relação de surfactante pode ser de cerca de 1,0: 1,0, cerca de 1,25: 1,0, cerca de 1,5/1,0, cerca de 1,75/1,0, cerca de 2,0/1,0, cerca de 2,5/1,0, cerca de 3,0/1,0 ou cerca de 4,0/1,0. As formulações da invenção podem também ter diferentes quantidades da quantidade total dos seguintes componentes: agente surfactante e lipídio combinado (TA). A quantidade de TA pode ser expressa em termos de porcentagem em peso da composição total. O TA pode ser de cerca de 1% a cerca de 40%, cerca de 5% a cerca de 30%, cerca de 7,5% a cerca de 15%, cerca de 6% a cerca de 14%, cerca de 8% a cerca de 12%, cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 10% a cerca de 20% ou cerca de 20% a cerca de 30%. O TA pode ser 6%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 15% ou 20%.
[0085] Intervalos selecionados, para as quantidades totais de lipídios e de proporções de lipídios/surfactante (mol/mol) para as formulações da invenção são descritos na Tabela seguinte: Tabela 2: Valor Total e Lipídio para Proporções de Surfactante
Figure img0004
[0086] As formulações da invenção podem opcionalmente conter um ou mais dos seguintes ingredientes: co-solventes, agentes quelantes, tampões, antioxidantes, conservantes, microbicidas, emolientes, umectantes, lubrificantes e espessantes. As quantidades preferidas de componentes opcionais são descritas a seguir.
Figure img0005
* Como uma porcentagem da quantidade total de lipídio
[0087] As formulações da invenção podem incluir um tampão para ajustar o pH da solução aquosa para uma gama de pH 3,5 a pH 9, de pH 4 a pH 7,5, ou pH 6 a pH 7. Exemplos de tampões incluem, mas não estão limitados a: tampões de acetato, tampões de lactato, tampões de fosfato, tampões de propionato.
[0088] As formulações da presente invenção são tipicamente formuladas em meios aquosos. As formulações podem ser formuladas com ou sem co-solventes, tais como álcoois inferiores. As formulações da invenção podem compreender pelo menos 20% em peso de água. As formulações da invenção podem compreender cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60% cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% em peso de água. A formulação pode compreender de cerca de 70% a cerca de 80% em peso de água.
[0089] Um agente "microbicida" ou '"antimicrobiano" é geralmente adicionado para reduzir a contagem de bactérias em formulações farmacêuticas. Alguns exemplos de microbicidas são álcoois de cadeia curta, incluindo álcool etílico e álcool isopropílico, clorobutanol, álcool benzílico, álcool clorbenzil, álcool diclorobenzil, hexaclorofeno; compostos fenólicos, tais como cresol, 4-cloro-m-cresol, p-cloro-m-xilenol. Diclorofeno, hexaclorofeno, povidon- iodo; parabenos. especialmente alquil- parabenos tais como metil-, etil-, propil-, ou butil- parabeno, benzil-parabeno; ácidos, tais como ácido sórbico, ácido benzoico e os seus sais; compostos de amônio quaternário, tais como sais de alcônio, por exemplo, um brometo, sais de benzalcônio, como um cloreto ou um brometo, os sais de cetil, por exemplo, um brometo, sais fenol-cecínio, tais como brometo de fenododecínio, cloreto de cetilpiridínio e outros sais; além disso, compostos de mercúrio, tais como acetato de fenilmercúrio, borato, ou nitrato, tiomersal, clorexidina ou seu gluconato, ou quaisquer compostos antibioticamente ativos de origem biológica, ou qualquer sua mistura adequada.
[0090] Exemplos de "antioxidantes" são hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT) e di-terc-butilfenol (LY178002, LY256548, HWA-131, BF-389, CI-986, PD-127443, o E-51 ou 19, BI-L-239XX, etc.), butilhidroquinona terciária (TBHQ), propilgalato (PG), I-O-hexil-2,3,5-trimetilhidroquinona (HTHQ); aminas aromáticas (difenilamina, p-alquiltio-o-anisidina, os derivados de etilenodiamina, carbazol, tetrahidroindenoindol); fenóis e ácidos fenólicos (guaiacol, hidroquinona, vanilina, ácidos gálico e os seus ésteres, ácido protocatecuico, ácido quínico, ácido siríngico, ácido elágico, ácido salicílico, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), eugenol); tocoferóis (incluindo tocoferóis (alfa, beta, gama, delta) e seus derivados, tais como tocoferol-acilato (e. g -acetato. -laurato. miristato, - palmitato, -oleato, -linoleato. etc, ou um outro y lipoato tocoferil- adequado). Tocoferil-POE-succinato; trolox e amida correspondente e tiocarboxamida análogas; ácido ascórbico e seus sais, isoascorbatos, ácidos (2 ou 3 ou 6)-o-alquil ascórbicos, ésteres de ascorbil (por exemplo, 6-o-lauroil, miristoil, palmitoil-, oleoil, linoleoil, ou ácido-L-ascórbico, etc) . Também são úteis os compostos preferencialmente oxidados, tais como bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, tioureia; agentes de quelação, tais como EDTA, GDTA, desferral: variados sistemas de defesa endógenos, tais como a transferrina, lactoferrina, ferritina, cearuloplasmina, haptoglobion, heamopexina, albumina, glicose, ubiquinol-10); antioxidantes enzimáticos, tais como a superóxido dismutase e complexos de metal com uma atividade semelhante, catalase, glutationa- peroxidase, e as moléculas menos complexas, tais como beta- caroteno, bilirrubina, ácido úrico; flavonoides (flavonas, flavonóis, flavononas, flavanonals, chaconas, antocianinas). N- acetilcisteína, mesna. glutationa, derivados tiohistidina, triazóis; taninas, ácido cinâmico, ácidos hidroxicinamáticos e os seus ésteres (ácidos cumárico e ésteres, ácido cafeico e seus ésteres, ácido ferúlico, (iso) de ácido clorogênico, ácido sinápico); extratos de especiarias (por exemplo, de cravo, canela, sálvia, alecrim, mace, orégano, pimenta da Jamaica, noz- moscada); ácido carnósico, carnosol, ácido carsólico; ácido rosmarínico, rosmaridifenol, ácido gentísico, ácido ferúlico; extratos de farinha de aveia, como avenantramida 1 e 2; tioéteres, sulfóxidos, ditioéteres, dissulfuretos tetraetiltiuram; ácido fítico, derivados de esteroides (por exemplo, U74006F); metabolitos do triptofano (por exemplo, 3- hidroxiquinurenina, ácido 3-hidroxiantranico), e organocalcogenetos.
[0091] "Espessantes" são usados para aumentar a viscosidade de formulações farmacêuticas para e pode ser selecionado de entre polímeros hidrofílicos farmaceuticamente aceitáveis selecionados, tais como derivados de celulose parcialmente eterificados, compreendendo carboximetil-, hidroxietil-, hidroxipropil, hidroxipropilmetilcelulose ou metil-celulose; completamente polímeros hidrófilos sintéticos que compreendem poliacrilatos, polimetacrilatos, poli (hidroxietil)-, poli(hidroxipropil)-, poli (hidroxipropilmetil)metacrilato, poliacrilonitrilo, metalil- sulfonato, polietilenos, polioxietilenos, polietileno-glicóis, polietileno glicol lactídeo, polietileno glicol diacrilato-, polivinilpirrolidona, álcoois polivinílicos, poli (propilmetacrilamida), poli(propileno-co-fumarato de etileno glicol), poloxâmeros, poliaspartamida. (Hidrazina reticulada) de ácido hialurônico, de silicone; gomas naturais compreendendo alginatos, carragenano, goma de guar-, gelatina, tragacanto, (amidada) pectina, xantano, quitosano colágeno, agarose; misturas e derivados adicionais ou os co-polímeros e/ou outros polímeros farmaceuticamente, ou, pelo menos, biologicamente, aceitáveis.
[0092] As formulações da presente invenção podem também compreender um meio líquido polar. As formulações da invenção podem ser administradas em um meio aquoso. As formulações da presente invenção podem estar na forma de uma solução, suspensão, emulsão, creme, loção, pomada, gel, spray, solução de formação de película ou laca.
[0093] Apesar de não estar limitado a qualquer mecanismo de ação ou a qualquer teoria, as formulações da invenção podem formar vesículas ou AES caracterizados pela sua adaptabilidade, deformabilidade, ou penetrabilidade. Vesículas semelhantes (sem uma entidade terapêutica ligada) são descritas ambas em WO 2010/140061 e em WO 2011/022707.
[0094] As formulações da invenção são úteis na prevenção ou tratamento de uma variedade de doenças ou condições, dependendo do AOI, como mencionada acima.
[0095] Por exemplo, as formulações vesiculares da presente invenção podem compreender uma, duas ou três das vitaminas D3, C, E ou B7. A formulação pode ser usada sozinha ou como um ingrediente ou componente de um produto de cuidado de pele mais complexo, tal como um filtro solar, protetor solar, hidratante, soro ou cosméticos. A formulação ou produto final de cuidados da pele podem estar na forma de um creme, gel, loção, pulverização ou mousse.
[0096] Proporcionado pela invenção é uma formulação vesicular para uso conforme definido acima, em que o micronutriente é vitamina D3 a formulação pode ser incorporada num produto de filtro solar, um produto de bloqueador solar, um pós-solar ou outros cuidados da pele ou produtos cosméticos para completar os níveis baixos de vitamina D; em que o micronutriente é a vitamina C ou a vitamina E, a formulação pode ser incorporada num produto filtro solar, um produto bloqueador solar, um produto pós-sol ou outros produtos para a pele ou um produto cosmético para complementar a vitamina C ou a vitamina E epidérmica e dérmica e auxiliar na prevenção ou reparação da pele danificada pelo sol ou envelhecimento; em que o micronutriente é a vitamina B7 a formulação pode ser incorporada num produto filtro solar, um produto bloqueador solar, um produto pós-sol ou outros produtos para a pele ou produto cosmético para reduzir ou eliminar as dermatoses associadas com uma falta deste micronutriente.
[0097] A formulação vesicular da invenção pode ser fornecida em um produto de cicatrização de feridas para ser aplicado topicamente. Assim, a presente invenção proporciona a formulação do primeiro aspecto para ser utilizado no tratamento de uma ferida da pele, caracterizado pelo AOI é o ácido ascórbico (vitamina C).
[0098] A invenção é descrita abaixo com referência aos seguintes exemplos e figuras não limitativos, nos quais: A Figura 1 mostra a concentração de substrato araquidônico plotados contra a velocidade de reação para as vesículas amarradas ao naproxeno ou diclofenaco; A Figura 2 mostra o (Lineweaver Burk) plot recíproco da Figura 1; A Figura 3 mostra a concentração de substrato araquidônico plotados contra a velocidade de reação para vesículas amarradas ao naproxeno ou diclofenaco após uma Montagem CMA; e A Figura 4 mostra a (Lineweaver Burk) plot recíproco da Figura 3.
Formulações do Exemplo Formulações Vesiculares Exemplares Formulação do Exemplo 1
[0099] Formulação 1 compreende esfingomielina (cérebro) (47,944 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (42.05mg/g) como um surfactante, tampão de lactato (pH 4). álcool benzílico ou parabeno (5,000 mg/g), como um agente antimicrobiano, BHT (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,0500 mg/g) como antioxidantes, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (30,000 mg/g).
Formulação do Exemplo 2
[00100] Formulação 2 compreende esfingomielina (cérebro) (53,750 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (31,250 mg/g) na forma de um surfactante, tampão de lactato (pH 4), álcool benzílico ou parabeno (5,000 mg/g), como um agente antimicrobiano, BHT (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) como antioxidantes, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (15,000 mg/g).
Formulação do Exemplo 3
[00101] Formulação 3 compreende esfingomielina (cérebro) (90.561 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (79.439 /g) como um surfactante, tampão de lactato (pH 4). álcool benzílico ou parabeno (5,000 mg/g), como um agente antimicrobiano, BHT (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) como antioxidantes, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (30,000 mg/g).
Formulação do Exemplo 4
[00102] Formulação 4 compreende fosfatidilcolina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (8,500 mg/g), como um surfactante, tampão de fosfato (pH 7,5), BHT (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) como antioxidantes, álcool benzílico ou parabeno (5,000 mg/g) como um antimicrobiano, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (1,000 mg/g) como um agente quelante, e etanol (36,51 mg/g).
Formulação do Exemplo 5
[00103] Formulação 5 compreende fosfatidilcolina (71,460 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (4,720 mg/g) na forma de um surfactante, de tampão de fosfato (pH 7,8). BHA (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) como antioxidantes, álcool benzílico ou parabeno (5,000 mg/g) como um antimicrobiano, glicerol (15,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (35,000 mg/g).
Formulação do Exemplo 6
[00104] Formulação 6 compreende fosfatidilcolina (71,460 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (4,720 mg/g) na forma de um surfactante, tampão de fosfato (pH 7,8), BHA (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) antioxidantes, como o glicerol (50,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (15,000 mg/g).
Formulação do Exemplo 7
[00105] Formulação 8 compreende fosfatidilcolina (71,4600 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (4,720 mg/g) na forma de um surfactante, tampão de fosfato (pH 7,5), BHA (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) antioxidantes, como o glicerol (50,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (35,000 mg/g).
Formulação do Exemplo 8
[00106] Formulação 8 compreende fosfatidilcolina (64,516 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (35,484 mg/g) na forma de um surfactante, tampão de fosfato (pH 6,7), BHA (0,200 mg/g) como antioxidante, álcool benzílico ou parabeno (4,200 mg/g), como um antimicrobiano, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (30,000 mg/g).
Formulação do Exemplo 9
[00107] Fosfatidilcolina (64,516 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (35,484 mg/g) na forma de um surfactante, tampão de fosfato (pH 6,7), BHA (0,200 mg/g), como um antioxidante, álcool benzílico (5,250 mg/g) ou parabeno (4,200 mg/g) como um solvente, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (30,000 mg/g).
Formulação do Exemplo 10
[00108] Fosfatidil colina (71,460 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (4,720 mg/g) na forma de um surfactante, tampão de fosfato (pH 6,7), BHA (0,200 mg/g) como antioxidante, álcool benzílico ou parabeno (10,000 mg/g ) como um solvente, glicerol (50,000 mg/g), EDTA (3,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (30,000 mg/g).
Formulações Vesiculares Exemplares com um AOI anexada Formulação do Exemplo 11
[00109] Formulação 9 compreende fosfatidilcolina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (8,500 mg/g), como um surfactante, fosfatidilcolina de colagenil (1 mg/g) como um AOI, tampão de fosfato (pH 7,5), BHT (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) como antioxidantes, álcool benzílico ou parabeno (5,000 mg/g) como um antimicrobiano, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (1,000 mg/g) como um agente quelante, e etanol (36,51 mg/g).
Formulação do Exemplo 12
[00110] Formulação 10 compreende fosfatidilcolina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (8,500 mg/g), como um surfactante, fosfatidilcolina colagenil (0,5 mg/g) como um AOI, tampão de fosfato (pH 7,5), BHT (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) como antioxidantes, álcool benzílico ou parabeno (5,000 mg/g) como um antimicrobiano, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (1,000 mg/g) como um agente quelante, e etanol (36,51 mg/g).
Formulação do Exemplo 13
[00111] Formulação 11 compreende fosfatidilcolina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (8,500 mg/g), como um surfactante, Tween colagenil (0,5 mg/g), tampão de fosfato (pH 7,5), BHT (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) como antioxidantes, álcool benzílico ou parabeno (5,000 mg/g) como um antimicrobiano, glicerol (30,000 mg/g), EDTA (1,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (36,51 mg/g).
Exemplo 14 e fabricação e teste dos mesmos
[00112] Formulação 14 compreende fosfatidilcolina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (6.800mg/g) na forma de um surfactante, de palmitato de ascorbil (0,530 mg/g) como um AOI, tampão de fosfato citrato (pH 5,4), BHT (0,200 mg/g) e metabissulfito de sódio (0,500 mg/g) como antioxidantes, EDTA (1,000 mg/g) como um agente quelante, e de etanol (48,87 mg/g).
SUMÁRIO
[00113] Uma preparação Transfersome foi fabricada com sucesso para conter ácido ascórbico ligado covalentemente a 20% de polissorbato 80 substituição molar. Os resultados dos testes mostraram que a distribuição de tamanho, características de deformabilidade e de carga dos transfersomes não foi afetado pela inclusão do ácido ascórbico, que o éster de L-palmitato de ascorbil foi acessível na superfície externa do transfersome para uma enzima carboxilesterase, que o palmitato de ascorbil de transfersomes estavam ativos em um Fe3+ reduzindo ensaio e que eles mantiveram a sua redução da atividade após deformando a passar através de poros que foram menores do que seu tamanho médio.
MANUFATURA
[00114] Transfersomes foram preparados utilizando fosfatidilcolina de soja (Lipoid SPC S-100) e polissorbato 80, contendo palmitato de L-ascorbil (Sigma 7618). Um lote de transfersomes de controle foi também feito. Butil- hidroxitolueno, EDTA e metabissulfito de sódio foram adicionados aos transfersomes para minimizar a oxidação da L-ascorbil palmitato.
PREPARAÇÃO DE TRANSFERSOMES DE PALMITATO DE LASCORBIL
[00115] Um lote de 50 g de transfersomes palmitato de L- ascorbil foi preparado com fosfatidilcolina de soja: polissorbato 80: Proporções molares de palmitato de L-ascorbil de 13,3: 0,8: 0,2
[00116] Usando aquecimento suave e sob agitação, fosfatidilcolina de soja (3,44 g), polissorbato 80 (0,34 g), butil-hidroxitolueno (0,01 g) e palmitato de L-ascorbil (0.0265g) foram dissolvidos em etanol para se obter um peso total de 6,26 g.
[00117] 25 mM de tampão de fosfato citrato de PH5.4, com 0,1% de EDTA e de metabissulfito de sódio a 0,05%, (43.74g) foi agitado vigorosamente a 35°C, enquanto que a preparação de fosfatidilcolina de soja foi adicionada a partir de uma seringa equipada com uma agulha de calibre grande. A mistura foi agitada durante aproximadamente 15 minutos.
[00118] Os transfersomes foram preparados por extrusão através de um filtro de 0,2 μm, seguido por um filtro de 0,1 μm e um filtro de 0,1 μm adicional utilizando um sistema de filtro Sartorius de 47 milímetros a 35°C com nitrogênio à pressão de 4 bar. Cada filtro de fibra de vidro tinha um pré-filtro no topo. Transfersomes foram armazenados no escuro a +5°C.
PREPARAÇÃO DE TRANSFERSOMES DE CONTROLE
[00119] Um lote de 50 g de transfersomes de controle foi preparado com uma fosfatidilcolina de soja: polissorbato 80 com proporção molar de 13,3: 1
[00120] Usando aquecimento suave e sob agitação, fosfatidilcolina de soja (3,44 g), polisorbato 80 (0,425 g) e butil-hidroxitolueno (0,01 g) foram dissolvidos em etanol para se obter um peso total de 6,26 g.
[00121] 25 mM de tampão de fosfato citrato de PH5.4, com 0,1% de EDTA e de metabissulfito de sódio a 0,05%, (43.74g) foi agitada vigorosamente a 35°C, enquanto que a preparação de fosfatidilcolina de soja foi adicionada a partir de uma seringa equipada com uma agulha de calibre grande. A mistura foi agitada durante aproximadamente 15 minutos.
[00122] Os transfersomes de controle foram submetidos a extrusão como descrito para o transfersome de palmitato de Lascorbil lote PD-14-0035. Transfersomes foram armazenados no escuro a +5°C.
MÉTODOS ANALÍTICOS TAMANHO DE MEDIÇÃO DE PARTÍCULAS
[00123] O tamanho médio de partícula e a distribuição do tamanho de partícula para as preparações foram determinados transfersomes por dispersão de luz dinâmica usando um espectrômetro de correlação de fóton. Quando a luz coerente é passada através de uma suspensão de partículas, a luz é espalhada em todas as direções. Por medição e correlação da intensidade da luz dispersa de uma suspensão de partículas, é possível determinar o tamanho e a distribuição de tamanho das partículas na suspensão.
[00124] O tamanho de partícula e distribuição de tamanho de partícula média para cada amostra foi determinado utilizando um ALV-5000/espectrômetro de correlação de fotões E. As amostras foram diluídas em água desionizada para se obter um sinal detectável dentro do intervalo de 50 - 500 kHz, e, em seguida, analisada mais de seis medições, cada um dos 30 segundos de duração. A temperatura foi controlada a 25°C. Os dados foram submetidos à análise de um ajuste de segunda ordem cumulativa regularizada para se obter o tamanho de partícula média (relatado como r ou raio médio), bem como a distribuição de partículas de tamanhos para a amostra (reportado como w ou largura). O raio médio foi multiplicado por 2 para se obter o diâmetro médio (nm).
[00125] O índice de polidispersibilidade (PDI) para cada amostra foi calculada de acordo com a seguinte equação:
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onde: w = largura e r = raio médio.
ADAPTABILIDADE DO ENSAIO DA MEMBRANA CONTÍNUA
[00126] A adaptabilidade da membrana contínua (CMA) de pressão de ensaio utilizado para fornecer energia de ativação para transfersomes para permitir deformar e passar através de um filtro de poro que é menor do que o tamanho médio dos transfersomes aplicados.
[00127] Um filtro de membrana Anodisc 13 (tamanho de poro de 20 nm), foi montado sobre um suporte de filtração na base de um dispositivo de filtragem e o tambor de aço inoxidável superior foi ligado. 3 ml de amostra transfersome pré-equilibrada a 25°C, foi colocada no tubo de barril e de transmissão de calor ligado a um termocirculador (25°C) foi envolvido em torno dela. O tambor foi ligado a um tubo de pressão ligado a um cilindro de nitrogênio. Usando uma série de válvulas, o sistema foi iniciado com ponto de ajuste de 9.5bar pressão para dar 7.5bar de pressão inicial. O dispositivo de filtração foi colocado sobre um recipiente de coleta situado em uma balança de precisão de pesagem que foi ligado a um programa de computador Excel. Um controlador de pressão Bronkhurst foi usado para monitorar e controlar a pressão e quando as válvulas do sistema foram abertas e o tempo começou, o aumento da massa de transfersome filtrado recolhido no equilíbrio foi registrado contra o tempo e diminuindo a pressão crescente.
[00128] O tempo, a pressão, os dados de massa foram avaliados em um programa MathCAD para determinar um valor de P *. P * é uma medida da pressão de ativação necessária para a penetração dos poros e, portanto, uma medida da rigidez da membrana transfersome e deformabilidade. O tamanho médio das partículas dos transfersomes foi medido por espectroscopia de correlação do fóton antes e após a filtração CMA.
ENSAIO ASCÓRBICO
[00129] Concentrações de palmitato de ascorbil e ácido ascórbico foram medidas usando um Kit de ensaio do ácido ascórbico (Abcam ab65656). Neste ensaio, Fe3+ é reduzido ao Fe2+ na presença de antioxidantes tais como ácido ascórbico. O Fe2+ é quelado com uma sonda colorimétrica para produzir um produto com a absorvância a 593nm.
[00130] Para determinar a concentração total de palmitato de ascorbil, transfersomes foram solubilizados por diluição 1: 7: 2 v/v de etanol e com 5% de Triton X-100. Uma curva padrão de palmitato de ascorbil foi preparada pela diluição inicial em etanol a uma gama de concentrações de 0,0125 a 0,25 mM, em seguida, diluiu-se ainda mais 7: 1: 2 v/v em água e 5% de Triton X-100 para uma gama de concentração final de 0,01 a 0,175 nM. A palmitato de ascorbil de 0mM em branco foi incluído. Padrões e amostras foram carregados numa placa de microtitulação e misturou-se 1: 1 v/v, com uma mistura de reação contendo tampão de kit, Fe3+ e sonda colorimétrica. Após incubação de 1 minuto, à temperatura ambiente, a placa foi lida a 593nm. A 0 mM de palmitato de ascorbil em branco foi subtraído de todas as amostras e padrões e a absorvância para o controle de Transfersomes 'vazio' foi subtraído a partir dos transfersomes de palmitato de ascorbil. A absorvância final foi comparada com a curva padrão palmitato de ascorbil para obter a concentração total de palmitato de ascorbil (ácido ascórbico) (mM).
[00131] Para determinar a concentração de ácido ascórbico externa, uma curva padrão de ácido ascórbico foi preparada por diluição de ácido ascórbico em água a uma gama de concentrações de 0,025 a 0,2 mM. Padrões e amostras de transfersomes foram carregadas numa placa de microtitulação e misturou-se 1: 1 v/v, com uma mistura de reação contendo tampão de kit, Fe3+ e sonda colorimétrica. Após incubação de 1 minuto, à temperatura ambiente, a placa foi lida a 593nm. A placa em branco foi subtraída de todas as amostras e padrões e a absorvância para o controle de Transfersomes 'vazio' foi subtraído a partir dos transfersomes de palmitato de ascorbil. A absorvância final foi comparada com a curva padrão de ácido ascórbico para obter a concentração de ácido ascórbico. A concentração foi comparada com a concentração do palmitato de ascorbil total (ácido ascórbico) para calcular a % do ácido ascórbico amarrado na superfície externa dos transfersomes de palmitato de ascorbil.
DIGESTÃO DE CARBOXILESTERASE e RP-HPLC
[00132] A libertação de ácido ascórbico a partir de transfersomEs contendo palmitato de ascorbil foi realizada por digestão enzimática do éster usando Carboxilesterase 1 da isoforma B (Sigma E0287). Foram adicionadas 960 unidades de enzima por ml de transfersomes, antes de incubação a +37°C. As amostras foram tomadas a 2 e 4 horas e o ácido ascórbico libertado do ácido ascórbico extraído pela adição de 1 volume de acetonitrilo/metanol/ácido fórmico (80V/20V/0.2V), seguido por sonicação durante 5 minutos e centrifugação para os componentes insolúveis de pelete. As amostras de sobrenadante foram então filtradas através de uma membrana de 0,2 μm antes de se diluir 1 em 10 com ultra-água de pureza elevada.
[00133] As amostras foram analisadas por uma cromatografia de fase reversa de alta pressão de líquido (RP-HPLC) utilizando um método Luna C18(2) 100A 5μm 4.6x250mm de coluna e módulo de separação de águas 2695 a +25°C e um método de gradiente de acordo com a tabela abaixo, onde eluente A era 20mM de fosfato de potássio pH 3,0 e o eluente B era acetonitrilo. A detecção foi realizada a um comprimento de onda de 260 nm utilizando um detector de águas 2487.
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[00134] Além disso, uma curva-padrão de ácido ascórbico na gama de 0,4 a 100μg/ml foi analisada utilizando o mesmo método de RP-HPLC. O pico do ácido ascórbico foi integrado nos cromatogramas resultantes para as amostras e padrões. As áreas dos picos dos padrões foram analisadas por regressão linear para produzir uma equação para a curva padrão. As áreas dos picos para as amostras foram então usadas para determinar a concentração de ácido ascórbico a partir da equação para a curva padrão, tendo em conta a diluição do método de extração. A concentração foi comparada com a concentração de ácido ascórbico total para calcular a % do ácido ascórbico libertado a partir da superfície externa dos transfersomes de palmitato de ascorbil.
ELETROFERESE EM PAPEL
[00135] As características de carga de preparações de transfersomes foram investigadas usando eletroforese em papel, onde uma tira de papel foi suspensa entre dois reservatórios preenchidos com tampão, a amostra de teste foi aplicada na tira e uma corrente elétrica aplicada através da tira. Partículas carregadas migraram através da tira, com a direção e distância percorrida sendo determinada pela carga líquida das partículas no tampão pH.
[00136] Os volumes (100μl) de cada amostra de teste foram aplicadas no centro das tiras de filtro Whatman individuais 2 x 20cm (pré-molhadas em tampão de corrida; cloreto de sódio 2.3mg/ml, cloreto de cálcio 1,5 mg/ml, 1,3 mg/ml glicil de glicina, 25mg/ml de manitol, 10 mg/ml de sacarose e 0,5 mg/ml de metionina no pH5.75) e executado a 130V, durante 2 horas. Cada tira foi corada por PEG (um componente de polissorbato 80) com 5% p/v de cloreto de bário e iodo 0,05M e em seguida seca. A extensão da deslocação dos transfersomes de distância a partir do ponto central para cada amostra foi medida por ambos os lados do ânodo e cátodo da tira para determinar a carga líquida de vesículas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[00137] Os resultados estão resumidos na Tabela 4. As amostras dos transfersomes de palmitato de ascorbil foram esterilizadas por filtração de 0,2 μm e retestados pós-filtração, a fim de verificar novamente a integridade das amostras de informação. Tabela 4 Controle e Análise de Transfersomes de Palmitato de Ascorbil
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TAMANHO DE MEDIÇÃO DE PARTÍCULAS
[00138] O índice médio de diâmetro de partícula e polidispersidade foram semelhantes para os transfersomes de controle e para aqueles contendo palmitato de ascorbil. Isto indicou que 20% de substituição de polissorbato 80 com o éster nos transfersomes não afetaram as características de tamanho. Não houve alteração significativa no tamanho de 0,2μm pós- filtração estéril.
ADAPTABILIDADE DO ENSAIO DA MEMBRANA CONTÍNUA
[00139] O valor de deformabilidade P * foi praticamente o mesmo para os transfersomes contendo o palmitato de ascorbil e os transfersomes de controle, indicando que a substituição de 20% de polissorbato 80 com o éster não afetou significativamente as propriedades de deformabilidade dos transfersomes. A % da recuperação de filtração foi ligeiramente mais elevada para os transfersomes de controle o que poderia indicar que a inclusão de palmitato de ascorbil teve um ligeiro efeito de reforço sobre a membrana da vesícula.
[00140] O diâmetro das partículas de filtração pós-CMA médio diminuiu quase 50% em comparação com o pré-filtração para ambos os transfersomes de controle e para os transfersomes contendo o éster de palmitato de ascorbil. O índice de polidispersidade foi ligeiramente mais elevado, indicando uma distribuição de tamanho mais alargado. Estas características são conforme o esperado para vesículas transfersomes.
ENSAIO ASCÓRBICO
[00141] A concentração total de palmitato de ascorbil em transfersomes do palmitato de ascorbil foi determinada como 0.61mM. Isso equivale a 253μg/ml de palmitato de ascorbil ou 107μg/ml de ácido ascórbico. A concentração foi de aproximadamente 50% do que no início do processo de fabricação, indicando que tinha ocorrido perdas, provavelmente através de uma combinação de filtração e oxidação do ácido ascórbico. No entanto, os resultados mostraram que o ácido ascórbico ativo capaz de reduzir Fe3+ estava presente na preparação transfersome final.
[00142] A concentração de ácido ascórbico que reagiu na superfície externa dos transfersomes de palmitato de ascorbil foi determinado como 0,13 mM. Isto equivale a 23μg/ml ou 21% da concentração de ácido ascórbico total sejam externamente presas.
[00143] Não houve alteração significativa na pós-concentração de ácido ascórbico de 0,2μm total de filtração estéril ou externa.
[00144] A concentração total de transfersomes de palmitato de ascorbil que tinha sido submetida ao ensaio de adaptabilidade da membrana contínua (CMA) foi ligeiramente superior ao pré-CMA. A concentração de ácido ascórbico externa foi praticamente a mesma pré/pós-CMA. Isto mostrou que os transfersomes que tinham deformado para passar através de um tamanho de poro que era menor do que o seu diâmetro médio de não perder qualquer uma da sua atividade redutora.
DIGESTÃO DE CARBOXILESTERASE e RP-HPLC
[00145] A incubação de transfersomes contendo éster de palmitato de ascorbil com carboxilesterase de 1 enzima resultou na libertação de 15% (16μg/ml) do total de ácido ascórbico, após 2 horas de incubação a 37°C e 36% (38μg/ml) depois de 4 horas a 37°C. O ácido ascórbico, que foi preso à superfície externa da transfersome foi, portanto, acessível para a enzima. As concentrações obtidas por ácido ascórbico externo foram semelhantes aos obtidos no ensaio de ácido ascórbico.
[00146] Transfersomes que tinham sido submetidos ao ensaio de filtração de deformabilidade CMA foram também incubados com carboxilesterase de 1 enzima resultando na libertação de 9% (13μg/ml) do total de ácido ascórbico, após 2 horas de incubação a 37°C e 19% (26μg/ml) Após 4 horas a 37°C. Não está claro porque a porcentagem de libertação foi mais baixa pós CMA, mas possivelmente a alteração no tamanho das vesículas reduzida a acessibilidade do palmitato de ascorbil para a enzima.
ELETROFERESE EM PAPEL
[00147] Transfersomes de controle e transfersomes contendo palmitato de ascorbil tanto migrado para o cátodo do aparelho de eletroforese, demonstrando uma carga positiva líquida. A presença de palmitato de ascorbil, portanto, não altera as características de carga dos transfersomes.
Exemplo de Formulação 15 e fabricação e teste dos mesmos
[00148] Formulação 15 compreende quer a fosfatidilcolina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (7.66mg/g) como um surfactante, palmitoil tripeptídeo 1 (0,370 mg/g) como um AOI, tampão de fosfato (pH 7,7) e etanol (48,10 mg/g), ou fosfatidil colina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (7.66mg/g) como um surfactante, palmitoil tetrapeptídeo 7 (0,450 mg/g) como um AOI, tampão de fosfato (pH 7,7) e etanol (48,40 mg/g).
SUMÁRIO
[00149] Preparações Transfersomes foram fabricadas com sucesso para conter peptídeos ligados de forma covalente; tetrapeptídeo- 7 e tripeptídeo-1; em 10% de polissorbato 80 substituição molar. Os resultados dos testes mostraram que a distribuição de tamanho, características de deformabilidade e de carga dos transfersomes não foi afetada pela inclusão de peptídeos.
MANUFATURA
[00150] Transfersomes foram preparados utilizando fosfatidilcolina de soja (Lipoid SPC S-100) e polissorbato 80 contendo ou tetrapeptídeo palmitoil-7 (PAL-GQPR) ou palmitoil tripeptídeo-1 (PAL-GHK) (Sinoway Industrial Co. Ltd). Um lote de transfersomes de controle foi também feito.
PREPARAÇÃO DE TRANSFERSOMES DO PEPTÍDEO PALMITOIL
[00151] Um lote de 50 g de transfersomes de palmitoil de tetrapeptídeo-7 e um lote de 50 g de transfersomes de palmitoil de tripeptídeo-1 foram preparados com fosfatidilcolina de soja: polissorbato 80: proporções molares de palmitoil do peptídeo 13,3: 0,9: 0,1
[00152] Usando o calor suave e agitação, fosfatidilcolina de soja (3,44 g), polissorbato 80 (0,383 g) e TANTO palmitoil tetrapeptídeo-7 (0.0224g) palmitoil tripeptídeo-1 (0.0186g) foram dissolvidos em etanol para se obter um peso total de 6,26 g.
[00153] Tampão de fosfato, pH 7,7 (43.74g) foi agitado vigorosamente a 35°C, enquanto que a preparação de fosfatidilcolina de soja foi adicionada a partir de uma seringa equipada com uma agulha de calibre grande. A mistura foi agitada durante aproximadamente 15 minutos.
[00154] Os transfersomes foram preparados por extrusão através de um filtro de 0,2μm, seguido por um filtro de 0,1μm e um filtro de 0,1μm adicional utilizando um sistema de filtro Sartorius de 47 milímetros a 35°C com nitrogênio à pressão de 4 bar. Cada filtro de fibra de vidro tinha um pré-filtro no topo. Transfersomes foram armazenados no escuro a +5°C.
PREPARAÇÃO DE TRANSFERSOMES DE CONTROLE
[00155] Um lote de 50 g de transfersomes de controle foi preparado com uma fosfatidilcolina de soja: polissorbato 80 com proporção molar de 13,3: 1.
[00156] Usando aquecimento suave e sob agitação, fosfatidilcolina de soja (3,44 g) e polisorbato 80 (0,425 g) foram dissolvidos em etanol para se obter um peso total de 6,26 g.
[00157] Tampão de fosfato, pH 7,7 (43.74g) foi agitado vigorosamente a 35°C, enquanto que a preparação de fosfatidilcolina de soja foi adicionada a partir de uma seringa equipada com uma agulha de calibre grande. A mistura foi agitada durante aproximadamente 15 minutos.
[00158] Os transfersomes de controle foram submetidos à extrusão como descrito para os lotes de transfersomes de palmitoil de peptídeo. Transfersomes foram armazenados no escuro a +5°C.
MÉTODOS ANALÍTICOS TAMANHO DE MEDIÇÃO DE PARTÍCULAS
[00159] O tamanho médio de partícula e a distribuição do tamanho de partícula para as preparações foram determinados transfersomes por dispersão de luz dinâmica usando um espectrômetro de correlação de fóton. Quando a luz coerente é passada através de uma suspensão de partículas, a luz é espalhada em todas as direções. Por medição e correlação da intensidade da luz dispersa de uma suspensão de partículas, é possível determinar o tamanho e a distribuição de tamanho das partículas na suspensão.
[00160] O tamanho de partícula e distribuição de tamanho de partícula média para cada amostra foram determinados utilizando um ALV-5000/espectrômetro de correlação de fotões E. As amostras foram diluídas em água desionizada para se obter um sinal detectável dentro do intervalo de 50 - 500 kHz, e, em seguida, analisada mais de seis medições, cada um dos 30 segundos de duração. A temperatura foi controlada a 25°C. Os dados foram submetidos a análise de um ajuste de segunda ordem cumulativa regularizada para se obter o tamanho de partícula média (relatado como r ou raio médio), bem como a distribuição de partículas de tamanhos para a amostra (reportado como w ou largura). O raio médio foi multiplicado por 2 para se obter o diâmetro médio (nm).
[00161] O índice de polidispersibilidade (PDI) para cada amostra foi calculada de acordo com a seguinte equação:
Figure img0012
onde: w = largura e r = raio médio.
ADAPTABILIDADE DO ENSAIO DA MEMBRANA CONTÍNUA
[00162] A adaptabilidade da membrana contínua (CMA) de pressão de ensaio utilizado para fornecer energia de ativação para transfersomes para permitir deformar e passar através de um filtro de poro que é menor do que o tamanho médio dos transfersomes aplicados.
[00163] Um filtro de membrana Anodisc 13 (tamanho de poro de 20 nm) foi montado sobre um suporte de filtração na base de um dispositivo de filtragem e o tambor de aço inoxidável superior foi ligado. 3 ml de amostra transfersome pré-equilibrada a 25°C, foi colocada no tubo de barril e de transmissão de calor ligado a um termocirculador (25°C) foi envolvido em torno dela. O tambor foi ligado a um tubo de pressão ligado a um cilindro de nitrogênio. Usando uma série de válvulas, o sistema foi iniciado com ponto de ajuste de 9.5bar pressão para dar 7.5bar de pressão inicial. O dispositivo de filtração foi colocado sobre um recipiente de coleta situado em uma balança de precisão de pesagem que foi ligado a um programa de computador Excel. Um controlador de pressão Bronkhurst foi usado para monitorar e controlar a pressão e quando as válvulas do sistema foram abertas e o tempo começou, o aumento da massa de transfersome filtrado recolhido no equilíbrio foi registado contra o tempo e diminuindo a pressão crescente.
[00164] O tempo, a pressão, os dados de massa foram avaliados em um programa MathCAD para determinar um valor de P *. P * é uma medida da pressão de ativação necessária para a penetração dos poros e, portanto, uma medida da rigidez da membrana transfersome. O tamanho médio das partículas dos transfersomes foi medido por espectroscopia de correlação do fóton antes e após a filtração CMA.
ENSAIO DA CONCENTRAÇÃO DE PEPTÍDEO (CBQCA)
[00165] A concentração da porção de peptídeo de palmitoil tripeptídeo-1 com a sequência de aminoácidos de glicina- histidina-lisina foi medida por derivatização do grupo amina primária do aminoácido lisina com o reagente 3-(4- carboxibenzoil)-quinolona-2-carboxaldeído (CBQCA) para produzir um produto fluorescente.
[00166] Amostras de transfersomes de palmitoil tripeptídeo-1 e transfersomes de controle foram diluídas em um intervalo de 1 em 400 a 1 em 3200 em 0,1 mM de tampão de borato de sódio pH 9,3. Uma vez que não foi possível solubilizar palmitoil tripeptídeo 1 em condições aquosas adequadas para este ensaio; a determinação da concentração de um tripeptídeo em transfersomes foi feita contra uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA). BSA de concentração conhecida foi preparada para produzir uma gama de 6.7μg/ml a 0.33mg/ml. Derivatização de aminas primárias dos padrões e das amostras foi realizado num formato de micro-placa à temperatura ambiente com o reagente CBQCA na presença de cianeto de potássio durante 1 hora. A medição foi realizada por leitura com um fluorômetro BMG Fluostar Optima com 485 nm de comprimento de onda de excitação e emissão de fluorescência de comprimento de onda 520 nm.
[00167] A leitura de fluorescência de uma amostra em branco do tampão de borato de sódio 0,1 mM pH 9,3 foi subtraída de todos os dados. A medição de fluorescência resultante a partir dos padrões de BSA foi analisada por meio de regressão linear para produzir uma equação para a curva padrão. A quantidade de peptídeo nos transfersomes de palmitoil de tripeptídeo-1 em relação à curva de BSA foi então determinada após a subtração da fluorescência dos transfersomes na diluição de controle equivalente.
ELETROFERESE EM PAPEL
[00168] As características de carga de preparações de transfersomes foram investigadas usando eletroforese em papel, onde uma tira de papel foi suspensa entre dois reservatórios preenchidos com tampão, a amostra de teste foi aplicada na tira e uma corrente elétrica aplicada através da tira. Partículas carregadas migraram através da tira, com a direção e distância percorrida sendo determinada pela carga líquida das partículas no tampão pH.
[00169] Os volumes (100μl) de cada amostra de teste foram aplicadas no centro das tiras de filtro Whatman individuais 2 x 20cm (pré-molhadas em tampão de corrida; cloreto de sódio 2.3mg/ml, cloreto de cálcio 1,5 mg/ml, 1,3 mg/ml glicil de glicina, 25mg/ml de manitol, 10 mg/ml de sacarose e 0,5 mg/ml de metionina no pH5.75) e executado a 130V, durante 2 horas. Cada tira foi corada por PEG (um componente de polissorbato 80) com 5% p/v de cloreto de bário e iodo 0,05M e em seguida seca. A extensão da deslocação dos transfersomes de distância a partir do ponto central para cada amostra foi medido por ambos os lados do ânodo e cátodo da tira para determinar a carga líquida de vesículas. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5 Análise de Transfersome de Palmitoil de Peptídeo
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Figure img0015
TAMANHO DE MEDIÇÃO DE PARTÍCULAS
[00170] O índice médio de diâmetro de partícula e polidispersidade foram semelhantes para os transfersomes de controle e para aqueles contendo palmitoil de peptídeos. Isto indicou que 10% de substituição de polissorbato 80 com um palmitoil de peptídeo nos transfersomes não afetaram as características de tamanho.
ADAPTABILIDADE DO ENSAIO DA MEMBRANA CONTÍNUA
[00171] O valor da deformabilidade P * foi semelhante para os transfersomes de controle e para aqueles que contêm os palmitoil de peptídeos. O valor para os transfersomes de palmitoil tetrapeptídeos 7 foi ligeiramente mais baixo, indicando que 10% de substituição de polissorbato 80 com o éster pode ter tido um ligeiro efeito amaciador sobre a membrana tornando as vesículas mais deformáveis. No entanto, isto não foi evidenciado na % da filtração de recuperação, que foi semelhante para os transfersomes de palmitoil de peptídeos em comparação com o controle, de modo que o P* inferior não é possivelmente significativo.
[00172] O diâmetro das partículas de filtração pós-CMA médio diminuiu quase 50% em comparação com o pré-filtração para ambos os transfersomes de controle e para os transfersomes contendo palmitoil de peptídeo. O índice de polidispersidade foi ligeiramente mais elevado, indicando uma distribuição de tamanho mais alargado. Estas características são conforme o esperado para vesículas transfersomes.
ENSAIO DA CONCENTRAÇÃO DE PEPTÍDEO (CBQCA)
[00173] Transfersomes de palmitoil tetrapeptídeos 7 não produzem um resultado no ensaio CBQCA devido a uma falta de resíduos de lisina na sequência de reagir com o reagente. No entanto, palmitoil tripeptídeo 1 foi detectável uma vez que ele contém uma lisina. Uma vez que não foi possível solubilizar palmitoil tripeptídeo 1 em condições aquosas adequadas para o ensaio; a determinação da concentração de um transfersomes de tripeptídeo 1 tiveram de ser feitas com um padrão de albumina de soro bovino (BSA). A BSA é uma proteína de 66 kDa com 58 resíduos de lisina; ~ 1 por 1138Da de peptídeo. O peptídeo contém uma lisina na 340Da. O peptídeo foi detectado e foi feita uma tentativa para quantificar a quantidade de correção para a diferença na concentração de lisinas entre BSA e peptídeo, no entanto, o peptídeo total ainda pareceu ser subestimada; 424μg/mL em comparação com teórica 221μg/ml.
ELETROFERESE EM PAPEL
[00174] Transfersomes de controle e transfersomes contendo um palmitoil peptídeo todos migrado para o cátodo do aparelho de eletroforese, demonstrando uma carga positiva líquida. A presença de palmitoil tetrapeptídeo 7 ou palmitoil tripeptídeo 1 não altera, pois, as características de carga dos transfersomes.
Exemplo de Formulação 16 e fabricação e teste dos mesmos
[00175] Formulação 16 compreende quer a fosfatidilcolina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (6.55mg/g) na forma de um surfactante, o polissorbato-naproxeno (2,195 mg/g) como um AOI, tampão de fosfato (pH 7,7) e etanol ( 47,56 mg/g), ou fosfatidil-colina (68,700 mg/g) como um lipídio, Tween 80 (5.80mg/g) como um surfactante, diclofenaco-polissorbato (2,96 mg/g) como um AOI, tampão de fosfato (pH 7,7) e etanol (47,54 mg/g).
SUMÁRIO
[00176] Preparações de transfersomes foram fabricadas com sucesso para conter ligado covalentemente, fármacos anti- inflamatórios não esteroides (NSAIDs); Naproxeno e diclofenaco; a 20% de polissorbato 80 substituição molar. Os resultados dos testes mostraram que a distribuição de tamanho, características de deformabilidade e de carga dos transfersomes não foi afetado pela inclusão dos NSAIDs, que os ésteres de NSAID foram acessíveis sobre a superfície externa do transfersome para uma enzima carboxilesterase e que os transfersomes NSAID têm maior efeito inibidor num ensaio de inibição da enzima COX-1 do que os transfersomes de controle sozinho. Transfersomes NSAID mantiveram a sua atividade inibidora depois deformando a passer através de poros que foram menores do que a sua dimensão média.
MANUFATURA
[00177] Transfersomes foram preparados utilizando fosfatidilcolina de soja (Lipoid SPC S-100) e polissorbato 80, contendo naproxeno polissorbato 80-éster (Key Organics DK-0035- 3) ou polissorbato 80 Diclofenaco-éster (Key Organics DK-0036- 3). Um lote de transfersomes de controle foi também feito.
TRANSFERSOMES DE PREPARAÇÃO DE NSAID
[00178] Um lote de 20 g de transfersomes de polissorbato- naproxeno e um lote de 20 g de transfersomes de diclofenaco polissorbato foram preparados com fosfatidilcolina de soja: polissorbato 80: NSAID-polisorbato de proporções molares 80 de 13,3: 0,8: 0,2 (correspondendo a pureza do NSAID-ésteres de polissorbato 80).
[00179] Usando o calor suave e agitação, fosfatidilcolina de soja (1.374g) com AMBOS polisorbato 80 (0,131 g) e naproxenopolissorbato (0.0439g) OU polisorbato 80 (0,116 g) e Diclofenacopolissorbato (0.0592g) foram dissolvidos em etanol para se obter um peso total de 2,50 g.
[00180] Tampão de fosfato, pH 7,7 (17.50g) foi agitado vigorosamente a 35°C, enquanto que a preparação de fosfatidilcolina de soja foi adicionada a partir de uma seringa equipada com uma agulha de calibre grande. A mistura foi agitada durante aproximadamente 15 minutos.
[00181] Os transfersomes foram preparados por extrusão através de um filtro de 0,2 μm, seguido por um filtro de 0,1 μm e um filtro de 0,1 μm adicional utilizando um sistema de filtro Sartorius de 47 milímetros a 35°C com nitrogênio à pressão de 4 bar. Cada filtro de fibra de vidro tinha um pré-filtro no topo. Transfersomes foram armazenados no escuro a +5°C.
PREPARAÇÃO DE TRANSFERSOMES DE CONTROLE
[00182] Um lote de 50 g de transfersomes de controle foi preparado com uma fosfatidilcolina de soja: polissorbato 80 com proporção molar de 13,3: 1
[00183] Usando aquecimento suave e sob agitação, fosfatidilcolina de soja (3,44 g) e polisorbato 80 (0,425 g) foram dissolvidos em etanol para se obter um peso total de 6,26 g.
[00184] Tampão de fosfato, pH 7,7 (17.50g) foi agitado vigorosamente a 35°C, enquanto que a preparação de fosfatidilcolina de soja foi adicionada a partir de uma seringa equipada com uma agulha de calibre grande. A mistura foi agitada durante aproximadamente 15 minutos.
[00185] Os transfersomes de controle foram submetidos à extrusão como descrito para os lotes de transfersomes de NSAID. Transfersomes foram armazenados no escuro a +5°C.
MÉTODOS ANALÍTICOS TAMANHO DE MEDIÇÃO DE PARTÍCULAS
[00186] O tamanho médio de partícula e a distribuição do tamanho de partícula para as preparações foram determinados transfersomes por dispersão de luz dinâmica usando um espectrômetro de correlação de fóton. Quando a luz coerente é passada através de uma suspensão de partículas, a luz é espalhada em todas as direções. Por medição e correlação da intensidade da luz dispersa de uma suspensão de partículas, é possível determinar o tamanho e a distribuição de tamanho das partículas na suspensão.
[00187] O tamanho de partícula e a distribuição de tamanho de partícula média para cada amostra foram determinados utilizando um ALV-5000/espectrômetro de correlação de fotões E. As amostras foram diluídas em água desionizada para se obter um sinal detectável dentro do intervalo de 50 - 500 kHz, e, em seguida, analisada mais de seis medições, cada um dos 30 segundos de duração. A temperatura foi controlada a 25°C. Os dados foram submetidos a análise de um ajuste de segunda ordem cumulativa regularizada para se obter o tamanho de partícula média (relatado como r ou raio médio), bem como a distribuição de partículas de tamanhos para a amostra (reportado como w ou largura). O raio médio foi multiplicado por 2 para se obter o diâmetro médio (nm).
[00188] O índice de polidispersibilidade (PDI) para cada amostra foi calculada de acordo com a seguinte equação:
Figure img0016
onde: w = largura e r = raio médio.
ADAPTABILIDADE DO ENSAIO DA MEMBRANA CONTÍNUA
[00189] A adaptabilidade da membrana contínua (CMA) de pressão de ensaio utilizado para fornecer energia de ativação para transfersomes para permitir deformar e passar através de um filtro de poro que é menor do que o tamanho médio dos transfersomes aplicados.
[00190] Um filtro de membrana Anodisc 13 (tamanho de poro de 20 nm), foi montado sobre um suporte de filtração na base de um dispositivo de filtragem e o tambor de aço inoxidável superior foi ligado. 3 ml de amostra transfersome pré-equilibrada a 25°C, foi colocada no tubo de barril e de transmissão de calor ligado a um termocirculador (25°C) foi envolvido em torno dela. O tambor foi ligado a um tubo de pressão ligado a um cilindro de Nitrogênio. Usando uma série de válvulas, o sistema foi iniciado com ponto de ajuste de 9.5bar pressão para dar 7.5bar de pressão inicial. O dispositivo de filtração foi colocado sobre um recipiente de coleta situado em uma balança de precisão de pesagem que foi ligado a um programa de computador Excel. Um controlador de pressão Bronkhurst foi usado para monitorar e controlar a pressão e quando as válvulas do sistema foram abertas e o tempo começou, o aumento da massa de transfersome filtrado recolhido no equilíbrio foi registado contra o tempo e diminuindo a pressão crescente.
[00191] O tempo, a pressão, os dados de massa foram avaliados em um programa MathCAD para determinar um valor de P *. P * é uma medida da pressão de ativação necessária para a penetração dos poros e, portanto, uma medida da rigidez da membrana transfersome e deformabilidade. O tamanho médio das partículas dos transfersomes foi medido por espectroscopia de correlação do fóton antes e após a filtração CMA.
DIGESTÃO DE CARBOXILESTERASE e RP-HPLC
[00192] A libertação das drogas anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDs) cativos; Diclofenaco ou Naproxeno; a partir da superfície externa de transfersomes contendo polissorbato 80 ésteres de qualquer um dos dois compostos foi realizada por digestão enzimática do éster usando carboxilesterase 1 isoforma B (Sigma E0287). Foram adicionadas 960 unidades de enzima por ml de transfersomes, antes de incubação a +37°C. As amostras foram tomadas a 4 horas e o NSAID libertado do ácido ascórbico extraído pela adição de 1 volume de acetonitrilo/metanol/ácido fórmico (80V/20V/0.2V), seguido por sonicação durante 5 minutos e centrifugação para os componentes insolúveis de pelete. As amostras de sobrenadante foram então filtradas através de uma membrana de 0,2 μm antes de se diluir 1 em 10 com ultra-água de pureza elevada.
[00193] As amostras foram analisadas por um método de cromatografia de fase reversa de alta pressão de líquido (RP- HPLC) utilizando uma coluna Kinetex C18 5μm 100A 4.6x150mm e módulo de separação de Águas 2695, entre +25°C e um método gradiente de acordo com a tabela abaixo, onde eluente A foi de 0,1 % de ácido trifluoroacético em água de pureza ultra-elevada e o eluente B foi 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrilo. Detecção para ambos os NSAIDs foram realizados a um comprimento de onda de 254 nm utilizando um detector de Águas 2487.
Figure img0017
[00194] Além disso, uma curva padrão de cada um dos NSAIDs na gama de 0,4 a 91μg/ml foi analisada utilizando o mesmo método de RP-HPLC. Os picos de NSAIDs foram integrados nos cromatogramas resultantes para as amostras e padrões. As áreas dos picos dos padrões foram analisadas por regressão linear para produzir equações para as curvas padrões. As áreas dos picos para as amostras foram então usadas para determinar a concentração de NSAID liberada a partir da equação para a curva padrão respectiva, tendo em conta a diluição do método de extração. A concentração foi comparada com a concentração teórica total de NSAID para calcular a % NSAID libertada a partir da superfície externa dos transfersomes de NSAID.
ENSAIO DE INIBIÇÃO DE CICLO-OXIGENASE-1
[00195] O ensaio de inibição da ciclo-oxigenase 1 (COX-1) mede a capacidade dos fármacos NSAIDs, tais como para inibir a atividade da enzima COX-1. COX-1 catalisa a conversão do ácido araquidônico em prostaglandina H2. Durante a reação a enzima consome o oxigênio. A velocidade de consumo de oxigênio (nmol/mL/min) é uma medida da velocidade da reação e é reduzida na presença de inibidores.
[00196] O ensaio de inibição da COX foi criado usando um sistema Hansatech Oxygraph que compreendia um elétrodo de oxigênio de Clark calibrado ligado ao software Oxygraph Plus. Uma mistura de reação contendo 0,1 mM de fosfato de potássio pH 7,2, 2,0 mM de fenol, 1 μM de hematina foi agitada na câmara de reação a 37°C, até uma linha de base estável de oxigênio foi atingida. 340unidades de enzima COX-1 (Cayman Chemicals CAY60100) foi adicionado e deixado a equilibrar durante 1 minuto antes da adição do substrato de ácido araquidônico. Uma série de reações de controle foi realizada usando ácido araquidônico em concentrações finais 8, 16, 32 e 64μM. Para cada reação, a velocidade de reação máxima foi medida na curva de oxigênio Oxygraph.
[00197] Para determinar o efeito inibitório de amostras de transfersomes; controle, transfersomes Naproxeno ou Diclofenaco foram pré-misturados com o ácido araquidônico durante 10 minutos à temperatura ambiente antes da adição de ácido araquidônico a mistura para a reação. As concentrações foram escolhidas de modo a que as concentrações finais de ácido araquidônico na reação foram de 8, 16, 32 e 64μM.
[00198] A concentração de ácido araquidônico foi registada em relação à velocidade de reação (nmol Oxigênio/ml/min) para o controle, Transfersomes de controlo e reações de transfersomes NSAID e um valor foi calculado para inibição da % por transfersomes através da comparação da velocidade de reação em quatro concentrações de substrato e fazendo a média a diminuição da taxa. Plots Lineweaver-Burk recíprocos (1/concentração do ácido araquidônico contra 1/ velocidade de reação) também foram plotados.
[00199] O ensaio de inibição da COX-1 também foi realizado em amostras de transfersomes que tinham sido transformados no ensaio da adaptabilidade da membrana contínua (CMA) que utilizou a pressão aplicada para fornecer a energia de ativação para ativar as vesículas para deformar e passar através dos poros que foram menores do que o seu diâmetro médio.
ELETROFERESE EM PAPEL
[00200] As características de carga de preparações de transfersomes foram investigadas usando eletroforese em papel, onde uma tira de papel foi suspensa entre dois reservatórios preenchidos com tampão, a amostra de teste foi aplicada na tira e uma corrente elétrica aplicada através da tira. Partículas carregadas migraram através da tira, com a direção e distância percorrida sendo determinada pela carga líquida das partículas no tampão pH.
[00201] Os volumes (100μl) de cada amostra de teste foram aplicadas no centro das tiras de filtro Whatman individuais 2 x 20cm (pré-molhadas em tampão de corrida; cloreto de sódio 2.3mg/ml, cloreto de cálcio 1,5 mg/ml, 1,3 mg/ml glicil de glicina, 25mg/ml de manitol, 10 mg/ml de sacarose e 0,5 mg/ml de metionina no pH5.75) e executado a 130V, durante 2 horas. Cada tira foi corada por PEG (um componente de polissorbato 80) com 5% p/v de cloreto de bário e iodo 0,05M e em seguida seca. A extensão da deslocação dos transfersomes de distância a partir do ponto central para cada amostra foi medida por ambos os lados do ânodo e cátodo da tira para determinar a carga líquida de vesículas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[00202] Os resultados estão resumidos na Tabela 6. Tabela 6 Controlo e Anál _ise de Transfersomes NSAID
Figure img0018
Figure img0019
TAMANHO DE MEDIÇÃO DE PARTÍCULAS
[00203] O índice médio de diâmetro de partícula e polidispersidade foram semelhantes para os transfersomes de controle e para os que contêm um 80 éster de polissorbato NSAID. Isto indicou que 20% de substituição de polissorbato 80 ou com Naproxenopolissorbato 80 ou Diclofenacopolissorbato nos transfersomes não tinha afetado as características de tamanho.
ADAPTABILIDADE DO ENSAIO DA MEMBRANA CONTÍNUA
[00204] A deformabilidade do valor P * foi ligeiramente mais baixa para os transfersomes contendo um éster de NSAID- polissorbato do que para os transfersomes de controle, indicando que 20% de substituição de polissorbato 80 com naproxeno- polisorbato 80 ou diclofenaco-polissorbato teve um ligeiro efeito de amolecimento da membrana, tornando as vesículas mais deformáveis. Esta foi também evidenciada na recuperação da % de filtração que aumentou para os transfersomes de Naproxeno ou diclofenaco em comparação com o controle.
[00205] O diâmetro das partículas de filtração pós-CMA médio diminuiu quase 50% em comparação com o pré-filtração para ambos os transfersomes de controle e para os transfersomes contendo o éster de NSAID-polissorbato. O índice de polidispersidade foi ligeiramente mais elevado, indicando uma distribuição de tamanho mais alargada. Estas características são conforme o esperado para vesículas transfersomes.
DIGESTÃO DE CARBOXILESTERASE e RP-HPLC
[00206] A incubação de transfersomes contendo um éster de NSAID-polissorbato com uma enzima carboxilesterase 1 resultou na libertação de entre 3 e 6% da concentração total de NSAID, o que indica que uma pequena proporção do naproxeno ou diclofenaco que foi preso à superfície externa da transfersomes que estava acessível à enzima.
ENSAIO DE INIBIÇÃO DE CICLO-OXIGENASE-1
[00207] Os transfersomes contendo um éster de NSAID- polissorbato inibiu a velocidade de reação da ciclo-oxigenase 1 (COX-1) de enzima, numa porcentagem maior do que os transfersomes de controle. Transfersomes de controle foram esperados para inibir a enzima COX-1 e amarrar os inibidores conhecidos COX-1, Naproxeno ou Diclofenaco, para a superfície externa do transfersomes que tem reforçado o efeito inibitório.
[00208] As Figuras 1 e 2 mostram a concentração de substrato araquidônico plotados contra a velocidade de reação e os plots recíprocos (Lineweaver Burk) respectivamente.
[00209] Transfersomes que tinha deformado para passar através de um poro que era menor do que o seu tamanho médio no ensaio de adaptabilidade de membrana contínua (CMA) mantiveram a capacidade para inibir a enzima COX-1.
[00210] As Figuras 3 e 4 mostram a concentração do substrato araquidônico plotados contra a velocidade de reação e os plots recíprocos (Lineweaver Burk) respectivamente, para as amostras de pós-CMA.
[00211] A % de inibição da enzima COX-1 foi ligeiramente mais baixa do ensaio pós-CMA para todas as 3 preparações de transfersomes. Este foi colocado a hipótese para ser devido a uma diminuição na concentração de transfersomes e NSAIDs associados causados por filtração, em vez de uma perda da atividade de NSAID. Uma indicação da concentração transfersome comparativo foi adquirida com espectrometria de correlação de fótons. A intensidade do sinal de frequência para as amostras de pós-CMA tinha diminuído, em comparação com amostras pré-CMA, mas verificou-se ser semelhante para controle e transfersomes NSAID, apesar da filtração variando recuperações pós-CMA.
ELETROFERESE EM PAPEL
[00212] Transfersomes de controle e transfersomes contendo um éster de NSAID-polissorbato todos migrados para o cátodo do aparelho de eletroforese, demonstrando uma carga positiva líquida. A presença de Naproxeno ou Diclofenaco não alteram, portanto, as características de carga dos transfersomes.

Claims (15)

1. Formulação vesicular caracterizada pelo fato de compreender vesículas deformáveis compreendendo um fosfolipídio, um surfactante não iônico e um componente modificado compreendendo um ou mais de um agente de interesse (AOI) selecionado a partir de tetrapeptídeo-7, tripeptídeo 1, ácido ascórbico, naproxeno ou diclofenaco, em que o componente modificado é um lipídio amarrado ao AOI ou um surfactante amarrado ao AOI ou ambos; e o AOI é amarrado de tal modo que o todo de cada molécula do AOI é externo à membrana vesicular quando o AOI está na superfície externa da vesícula; em que o fosfolipídio é uma fosfatidilcolina; e o surfactante não iônico é selecionado a partir do grupo que consiste em: sorbitanos de polioxietileno, estearatos de poli- hidroxietileno e poli-hidroxietileno de lauriléter.
2. Formulação vesicular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o componente modificado é o surfactante amarrado ao AOI.
3. Formulação vesicular, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o componente modificado é o lipídio amarrado ao AOI.
4. Formulação vesicular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o componente modificado é ambos, o surfactante e o lipídio.
5. Formulação vesicular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o componente modificado compreende um único AOI.
6. Formulação vesicular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o componente modificado compreende uma pluralidade de AOIs.
7. Formulação vesicular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o AOI é amarrado ao componente modificado através de uma ligação covalente.
8. Formulação vesicular, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os AOIs são homogêneos.
9. Formulação vesicular, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os AOIs são heterogêneos.
10. Formulação vesicular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a formulação é aplicada topicamente.
11. Formulação vesicular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de ser para a utilização em cuidados da pele, ou cosméticos.
12. Método para preparar a formulação vesicular conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de compreender combinar o componente fosfolipídio, o componente surfactante não iônico e o componente modificado compreendendo o AOI em um meio farmaceuticamente aceitável.
13. Uso de uma formulação vesicular, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para o tratamento de osteoartrite, dor articular artrítica, dores musculares, tensão muscular, ou inflamação.
14. Uso de uma formulação vesicular, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento, para administrar um AOI através da pele de um paciente, para o tratamento de osteoartrite, dor articular artrítica, dores musculares, tensão muscular, ou inflamação, o referido uso compreendendo a aplicação tópica na pele do paciente da formulação vesicular.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a formulação vesicular contém uma mistura de vesículas conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, cada uma com um AOI diferente.
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