JP2016529242A - ベシクル - Google Patents
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Abstract
本発明は、治療上、代謝上、化粧上、または構造上、関心のある作用物質(「AOI」)の局所投与で使用するためのベシクル製剤、及びAOIの投与方法に関する。【選択図】図1
Description
本発明は、治療上、代謝上、化粧上または構造上関心のある作用物質(「AOI」)の局所投与での使用のためのベシクル製剤及びAOIの投与方法に関する。
US6,165,500は、特に皮膚及び類似の物質のような天然のバリアの中に及びそれを通って作用物質を輸送するための、両親媒性分子または両親媒性キャリア物質の一層または数層から成る膜様構造が提供される作用物質の塗布にための調製を記載している。これらのTransfersome(商標)(トランスファーサム)は、1または幾つかの成分、最も一般的には基本物質と1または幾つかの末端活性物質と作用物質との混合物から成る。
US2004/0071767は、薬学上許容可能な媒体に懸濁された少なくとも3つの両親媒性成分を伴った複雑な凝集体に基づいた非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)の製剤を記載している。
US2004/0105881は、特に、凝集体によるバリア浸透によって生体内で非侵襲性の薬剤を適用するための、好適な液状媒体に懸濁可能であり、少なくとも3つの両親媒性物質(両親媒性成分)を含み、皮膚のような半透過性バリアを通る活性物質の輸送を改善することが可能である拡張表面凝集体を記載している。WO2010/140061は深部組織疼痛の治療のための「空の」ベシクル製剤の使用を記載している。WO2011/022707は脂肪酸欠乏に関連する障害、及びとりわけ、炎症に関連する障害を治療するための「空の」ベシクルの他の製剤の使用を記載している。治療実体を連結することができるベシクル製剤はWO2011/022707及びWO2010/140061にて記載されている。
これらの文書は、AOIの局所投与における使用のためのベシクル製剤を開示または教示していないし、AOIの大半がベシクルの外にあるようにAOIがベシクルの成分に共有結合され得ることも開示または教示していない。本出願のこの節における参考文献の引用は、参考文献が本発明にとって従来技術であるという承認ではない。上記で言及した出版物はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
リポソームベシクルは、生体に有効成分(AOI)を送達する試みでこれまで使用されている。
リポソームの柔軟形態(「Transfersome(登録商標)」)は、皮膚表面を通過することができる脂肪(たとえば、大豆のホスファチジルコリン)と脂肪酸または界面活性剤(たとえば、Tween)との組み合わせから作製されたベシクルである。これらのベシクルの界面活性剤におけるポリエチレングリコール(「PEG」)は吸湿性であり、水の勾配に沿って毛穴に浸透する。これらのベシクルは、膜成分の1つとしてベシクルの内腔の中に輸送されるAOIを入れることまたはベシクルの膜にAOIを組み込むことによって経皮経路を介して生体に他のAOIを輸送するためのベシクルとして調べられている。
これらの方法のいずれかは、AOIを解放するためにベシクルの崩壊の何らかの形態を当てにしなければならない。
さらに、この方法でTransfersomeに組み込むには大きすぎるまたはこれらのベシクルの通常の化学的性質とは不適合である化学的性質を持つ、皮膚を通って輸送したい成品がある。
さらに、PEGを含有する界面活性剤成分の一部をAOIで置き換える場合、これがベシクルの柔軟性に影響を与え、原動力の一部を排除する。
本発明は、AOIをベシクルに物理的に連結するので、ベシクルは純粋に機械的装置として作用し、所望のAOIを皮膚表面の下に引き寄せることによってこれらの課題を回避する。
本発明のベシクルは、他の部分またはAOIをベシクルの成分に連結するのでAOIがベシクルの外側にあることによって経皮経路を介してそのような部分/AOIを生体に輸送するのに使用することができる。
従って、本発明は、第1の態様にて、液体と界面活性剤とAOIとを含むベシクル製剤を提供し、その際、AOIの少なくとも一部はベシクルの外表面上にあり、ベシクル膜の外にあるようにAOIはベシクルの成分に結合される。好ましくは、AOIが結合する成分は液体及び/または界面活性剤成分である。少なくとも一部は、ベシクルの外にあるAOI全体のうちの各分子の少なくとも5%、10%または20%、好適には40%がまたは50%を超えるものが(分子のサイズまたは容積という点で)、Transfersomeの膜の外にあることを意味する。好ましくは、AOIの大半が、さらに好ましくはAOI全体の分子がベシクルの外にある。AOIはそれがベシクルの外表面に存在するように成分に共有結合され得る。
ベシクルの外にあるAOIによって、「外側を向いている」それらAOIを意味する。AOIに結合する界面活性剤成分または液体成分が未修飾の成分と混合される、ベシクルの製造の間に、修飾された分子の配向は制御することができない。従って、AOIが連結される分子のおよそ50%が「正しくない」配向にあるだろうということは、AOIの一部がベシクルの内腔に存在するであろうことを意味する。AOIがベシクルに対して外にあるように「正しい配向」にある修飾された分子のうちで、少なくとも50%のAOI分子自体が物理的なサイズ/容積という点でベシクル膜の外にある。製造工程は、ベシクルの外にあるAOIの低い比率を生じ得る、すなわち、AOIの外側濃度は、製剤におけるAOI全体の1%〜10%(2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%を含む)、10%〜50%、15%〜45%、20%〜40%または25%〜30%(重量/容積)の間であり得る。外側濃度によって、ベシクルがいったん皮膚に浸透すると解放に利用できる及び/または治療活性を発揮すべきであるAOIの濃度を意味する。
本発明のベシクル製剤の恩恵は、AOIをベシクルに結合し、局所で塗布した場合、皮膚に浸透するAOIの速度、深さ及び量並びにそのAOIのサイズ及び性質に関係する。
製剤は、クリーム、ローション、軟膏、ジェル、溶液、スプレー、ヘアスプレー、ムースまたは成膜溶液であってもよい。
ベシクル製剤は、ベシクルに結合させたAOI以外の既知の治療剤を含有してもよいし、または含有しなくてもよい。AOIを含むベシクル製剤は、さらに生物学的に活性のあるまたは薬学上活性のある製品を含まなくてもよいし、または含んでもよい。生物学的に活性のあるまたは薬学上活性のある作用物質はここでは、薬学上、代謝上または免疫的な活性を有する作用物質として定義される。
本発明は、AOIの送達に有効であるリン脂質またはスルホ脂質と1以上の界面活性剤とを含むベシクル製剤を包含する。界面活性剤は非イオン性であってもよい。
本発明のベシクル製剤は(理論によって束縛されるのを望まないで)、界面活性剤と大豆ホスファチジルコリンのような脂質とで構成される二重層ベシクルであるベシクルの独特の特性を介してその機能を達成することができる。ベシクルの独特性は、得られるベシクルが永続性の液状結晶状態であるような程度にリン脂質膜を修飾する特定の量の非イオン性界面活性剤の製剤における包含に由来し、界面活性剤は膜安定性も付与するので、ベシクルは超可変形であり、且つ安定である(破損することなく低下した剛性を有する)。
ベシクル製剤は、たとえば、局所塗布される水性緩衝液に懸濁されたベシクルを含む/を成す。ベシクル製剤のベシクルは、空のコアを取り囲む二重層または単層の膜を含む。それらは直径60nmから直径200nmのサイズ範囲であり、直径100nm〜150nmの範囲であってもよい。ベシクルは高度に親水性であり、この特性は超可変形性と一緒に、皮膚を横切って輸送されるその能力にとって重要である。本発明の製剤を皮膚に塗布し、乾燥させると、その可変形性と合わせたベシクルの再水和駆動力が皮膚透過性バリアの上下での高水分の領域へのベシクルの動きを生じさせる。これは毛穴及び細胞内間隙を介したその動きを駆動する。界面活性剤の非イオン性界面活性剤に対する特定の比はベシクルの経皮送達を促進する。ベシクルの孔及び細胞内間隙を介した動きはAOIを運び、またはそれと共にAOIを引き寄せる。
それらがいったん皮膚を通過すると、本発明のベシクル製剤は最終的にはインタクトなベシクルとして存在する。ベシクルの効率的なクリアランスはその相対的に大きなサイズの故に皮膚の血液微細血管構造(毛細血管)を介しては起きないが、それらは、皮膚塗布の部位の下の他の及び/または深部の組織に間質液と共に輸送されると仮定されている。マーカー分子(ケトプロフェン)で標識した本発明のベシクルで行った前臨床試験は、局所塗布に続いて高濃度のマーカー分子が低い全身性吸収と共に局所的に観察されたので、ベシクルは血管構造に入らないことを示した。
AOIはベシクルの界面活性剤成分または脂質成分に結合させてもよい。或いは、ベシクルの脂質成分及び界面活性剤成分の双方がそれに結合したAOIを有してもよい。
製剤のベシクルは、その外表面に結合した単一のまたは複数のAOIを有してもよい。複数のAOIが結合される場合、AOIはすべて同一であってもよく、すなわち、均質であってもよく、またはAOIは異なってもよく、すなわち、非均質であってもよい。
AOIは元素、イオン、小分子、炭水化物、脂質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、高分子または大環状分子であってもよい。AOIは微量栄養素であってもよい。
AOIは、皮膚の構造タンパク質(たとえば、エラスチンまたはコラーゲン)、治療用タンパク質、ポルフィリンまたは発色団含有の高分子、ビタミン、二酸化チタン、酸化亜鉛、メラニンまたはメラニン類似体であってもよい。AOIはペプチドまたはNSAIDのような抗炎症薬であってもよい。具体的には、AOIはテトラペプチド−7、トリペプチド−1、アスコルビン酸、ナプロキセンまたはジクロフェナクであってもよい。
結合されるAOIは、ベシクルのリン脂質成分若しくは界面活性剤成分のいずれかまたはベシクルの脂質成分に共有結合してもよいし、またはさもなければ直接結合してもよい。脂肪酸成分、界面活性剤成分または脂質成分とAOIとの双方に共有結合するまたはさもなければ結合する連結または架橋を使用することが望ましくてもよい。一例では、無機AOIが付加されるべきであったなら(たとえば、金属塩または酸化物)、追加のリンカー、たとえば、EDTAのような金属キレート剤が先ずベシクル成分に抱合されてもよい。別の例では、長い分子、たとえば、ポリマー(たとえば、ポリエチレングリコール、PEG)を用いて結合過程の有効性及び/または結合したAOIの有効性を高めることが望まれてもよい。そのようなリンカー/長い架橋分子は、それが膜自体を干渉するのを防ぐためにベシクルからのそのような距離でAOIを保持することが望ましい場合、特に有効であろう。AOIが特に疎水性であるならばこれが生じ得る。
大きな分子または高分子をベシクル成分に共有結合させてもよい。例には、たとえば、コラーゲンやエラスチンのような皮膚の構造タンパク質、治療用タンパク質;及び酵素が挙げられる。
複数のAOIが脂質成分または界面活性剤成分に結合されて、いったん皮膚を通過するとそれらがベシクルの表面に存在し続けるようにベシクルの外表面に存在してもよい。例には、抗酸化剤、ビタミン、TiO2やZnOのような無機化合物、光線力学療法で使用するためのポルフィリン分子が挙げられる。
皮膚を介して体内にビタミンを輸送することは、失われたビタミン生成能(たとえば、ビタミンD)を置き換え、それ自体を保護し、修復する皮膚(または他の臓器)の能力を高め(たとえば、ビタミンC及びE)、または脂漏性皮膚炎のような皮膚の病気若しくは他の病気を治療し得る(たとえば、ビタミンB7)。皮膚への参照には、生体の一般的な皮膚並びに眼の強膜及び膣や肛門/直腸のような他の粘膜を含む耳、鼻、喉及び眼の上皮のような他の外皮が含まれる。
ビタミンDは実際、カルシウム及びリン酸塩の腸内吸収を高めることに関与する脂溶性化合物の群である。この群の最も重要なのはD3(コレカルシフェロール)及びD2(エルゴカルシフェロール)である。ビタミンD欠乏は骨軟化症(子供のくる病)の原因となり、低レベルは低い骨塩密度に関連している。
哺乳類の皮膚は、その前駆体、7−デヒドロコレステロールにてUV照射の作用を介してビタミンD3を作り、我々のビタミンDの約90パーセントを供給する。日焼け止め剤は紫外線を吸収し、それが皮膚に達するのを妨げる。UVBスペクトルに基づく8の太陽光保護指数(SPF)を持つ日焼け止め剤はビタミンD合成能を95%低下させることができるのに対して15のSPFを持つ日焼け止め剤は合成能を98%低下させることができることが報告されている。
さらに最近、さらに高いSPFの日焼け止め剤(25SPF〜50SPFの間)の使用が増える傾向があり、日焼けの脅威の社会認識として完全な日焼け止め製品が育っている。加えて、化粧品スキンケア及びカラー化粧品の双方がその製剤に加えた15、20及び25SPFの日焼け止め剤を有してある程度の日焼け止めを提供している。
製剤がビタミンD3を含む場合(ビタミンC及び/またはE及び/またはB7を含まないというわけではない)、製剤は、日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品、または低ビタミンDレベルを補完する他のスキンケア若しくは化粧品に組み込まれてもよい。低ビタミンDレベルは低い光条件または日焼け止め剤の使用が原因で生じてもよく、それは体内でのビタミンDの製造を妨げることができる。
従って、本発明は、ビタミンをその外表面につなぎ止めることによって、ビタミンD3/コレカルシフェロールを柔軟性の経皮ベシクル、すなわち、脂質及び界面活性剤を含む製剤に関連付けてもよい。次いで得られる製剤が日焼け止め剤、日焼け後製剤及び日焼け止め剤を含む化粧品に含まれ得る。この「ベシクル/ビタミンDの併用」は皮膚に浸透し、そのペイロードを表皮における基底層及び有棘層に送達する。
体内では、コレカルシフェロール(ビタミンD3)は肝臓で先ずカルシジオールに変換される。次いで循環するカルシジオールは腎臓でビタミンDの生物学的に活性のある形態であるカルシトリオールに変換される。血中の低いカルシジオール(25−ヒドロキシ−ビタミンD)は太陽を避けることから生じ得る。従って、本発明はベシクル成分に結合するまたはつなぎ止めることによってカルシジオールまたはカルシトリオールを経皮ベシクルに関連付けることを含む。
特定の他のビタミン、たとえば、ビタミンC及びビタミンEは重要な抗酸化特性を有し、これは、加齢の兆候及び皮膚の損傷を減らすためにそれらがスキンケア製品に組み込まれていることで分かっている。
ビタミンEの最も生物学的に活性のある形態は脂溶性のα−トコフェロールであり、本発明の一実施形態は、日焼け止め剤及び日焼け後製品を含むスキンケア調製物に組み込むためにα−トコフェロールをベシクル成分に関連付けることを期待する。
ビタミンC(水溶性のアスコルビン酸塩)は、幾つかのコラーゲン合成反応を含む多数の酵素反応における補因子である。これらの反応は創傷治癒及び毛細血管からの出血を防ぐことで重要である。従って、本発明には、コラーゲンへの損傷を改善するようにスキンケア及びスキンケア調製物双方に組み込むために、及び創傷ケア製品に組み込むために、アスコルビン酸塩をベシクル成分に関連付けることが含まれる。
従って、微量栄養素がビタミンC及び/またはビタミンEを含む場合、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品または他のスキンケアまたは化粧品に組み込まれて上皮及び真皮のビタミンC及び/またはビタミンEを補完し、日焼けで損傷した皮膚または加齢の皮膚を防ぐまたはその修復を助けてもよい。
ビタミンB7(水溶性ビオチン)はカルボキシラーゼ酵素の補酵素である。ビオチンの欠乏は皮疹の形態での皮膚炎の原因になり得る。加えて、フェニルケトン尿症(フェニルアラニンを分解することができない)の患者は、食物のビオチンを増やすことによって改善することができる湿疹及び脂漏性皮膚炎の形態を呈する。
従って、微量栄養素がビタミンB7を含む場合、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品または他のスキンケアまたは化粧品に組み込まれて上皮及び真皮のビタミンB7を補完し、このビタミンの欠乏に関連する皮膚病を改善してもよい。
ペプチド、たとえば、テトラペプチド−7またはトリペプチド−1はベシクル膜の脂肪酸または界面活性剤の成分に結合されてもよい。テトラペプチド−7は感染症と闘うのに有用であってもよく、コラーゲン産生を手段として皮膚再生を刺激するように作用する。これは、それがスキンケア及び老化防止の製品で特に有用であることを意味する。トリペプチド−1は同様の作用を有する。皮膚の外層を介した効率的な送達は低レベル/濃度で高い効果を提供するので、インターロイキンの抑制から生じる考えられる副作用を出来るだけ抑える。
非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)は、変形性関節症、スポーツ関連の関節痛、背痛、頭痛及び歯痛の症状を和らげるのに一般的に使用される鎮痛剤である。NSAIDの例は、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク及びナプロキセンである。再び、疼痛及び炎症の部位への直接的なそのような薬剤の有効で且つ効率的な送達は、低い投与量及び/または標的化された投与量の使用を生じるので、たとえば、消化管の問題、腎臓の問題及び心臓の問題のような副作用の軽減または排除を生じる。
本発明は、多数の小さな不活性のAOIをベシクル表面に結合することを含んでもよいので、いったん皮膚の下にあると、それが係留されるようになり、ベシクル自体の存在の恩恵の寿命、たとえば、水の保持、構造の支持が延長され得る。
AOIはベシクルの界面活性剤成分に結合されてもよい(または連結されまたはつなぎ止められてもよい)。界面活性剤への結合は、分子がヒドロキシル基を有するのであればエステル結合によって界面活性剤に直接的であってもよい。結合の代替の方法は、界面活性剤の原子または官能基(たとえば、Tweenの場合、ポリエチレングリコールポリマー)をAOIで置換することである。結合の第3の方法は任意でエステル結合を介した脂肪酸への直接的なものである。AOIが無機分子である場合、そのときは、さらなる連結分子が先ずベシクル成分に抱合され得る、たとえば、金属塩の場合におけるEDTAのような金属キレート剤。その効率(たとえば、酵素であるAOI上の活性部位を暴露するために)を最大化するためにベシクルから若干の距離でAOIを保持することが望まれるのであれば、そのときは、連結分子、たとえば、ポリマー鎖(たとえば、ポリエチレングリコール)をベシクルの成分とAOIの双方に結合させてもよい。
AOIはベシクルの脂質成分に連結され(結合されまたはつなぎ止められ)てもよい。脂質への結合は、たとえば、脂肪酸を排除し、AOIで置き換えることによってエステル結合によりグリセロールのヒドロキシル基のいずれかを介して達成され得る。或いは、連結の方法は、最終的な分子がつなぎ止められたAOIと一緒に2つの脂肪酸鎖を有するようにホスファチジル部分の置き換えによってもよい。修飾された脂質が、いつものように且つグリセロール鋳型で利用可能な自由回転で脂肪族領域に挿入し、つなぎ止められたAOIはベシクルの外側に位置することになる。AOIがベシクルに長い間つなぎ止められることが求められるのであれば、さらに安定な代替にはアミド結合が使用され得る。たとえば、AOIの標的が深部組織、たとえば、上部真皮層ではなく関節であるならば、これが望ましくてもよい。あまり安定ではない結合とさらに安定な結合の組み合わせを用いて(たとえば、それぞれエステル及びアミド)、AOIの交互の解放を達成してもよい。
任意の成分に結合する方法は加水分解性または非加水分解性であってもよい。AOIが皮膚内でまたは皮下で一度脱離すべきであることが望ましいのであれば、連結は加水分解性であるべきである。結合したAOIが皮膚内でまたは皮下でいったんベシクルに結合したままであることが望ましいのであれば、連結は非加水分解性であるべきである。
AOIは膜成分に共有結合で結合または抱合されてもよく;結合は親水性または疎水性または静水圧であってもよく;結合は水素結合、イオン結合であってもよい。
用語「結合」、「連結」及び「つなぎ止め」は本明細書にて至る所で相互交換可能に使用されて上記で言及された結合すべてを包含する。
本発明を用いてAOIを哺乳類の皮膚に投与することができる。ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、家畜及びペットを含むどんな哺乳類も含むことができる。AOIは治療実体または化粧実体または非治療実体または非化粧実体であってもよく、代わりにまたは加えて、AOIは代謝性及び/または構造的であってもよい。
従って、本発明の第2の態様は脂質と界面活性剤とAOIとを含むベシクル製剤を提供し、その際、AOIは、対象の皮膚を介してAOIを送達するのに使用するために、AOIの大半がベシクルの外にあるようにベシクルの成分に結合されまたは連結され、製剤は局所に塗布される。
本発明の第3の態様は、対象の皮膚を介してAOIを送達する方法を提供し、該方法は、皮膚に浸透してAOIを送達するのに十分な量で本発明のベシクル製剤を患者の皮膚に局所塗布することを含む。
本発明は患者の皮膚を介して1を超えるAOIを送達する方法も提供し、該方法は、ベシクルがそれに結合させた不均質な複数のAOIを有する本発明のベシクル製剤のいずれかを局所塗布すること及び/または製剤がベシクルの混合物であり、各製剤がそれに結合させた異なる単一のまたは均質な複数のAOIを有するベシクルを有する本発明のベシクル製剤を塗布することを含む。
ベシクル製剤における脂質はリン脂質であってもよい。リゾリン脂質であってもよい第2の脂質が存在してもよい。脂質はスルホ脂質であってもよい。界面活性剤は非イオン性界面活性剤であってもよい。
本発明の製剤はベシクルまたは他の拡張表面凝集体(ESA)を形成し、その際、ベシクル調製物は皮膚のような半透過性バリアを介した改善された透過能を有する。ベシクルのサイズは血管系への浸透を妨げ、その結果、全身性の送達を妨げる。作用のどんなメカニズムにも限定されない一方で、本発明の製剤はその可変形性及び/または適応性を特徴とするベシクルを形成することができる。
ベシクル製剤の特定の組成は、皮膚のどの層にAOIを送達することができるかを決定するであろう。特定の製剤は皮膚の上部層のみに浸透する一方で、他の製剤は深部層に移動するであろう。送達されるAOIに応じてベシクル製剤が選択されるであろう。たとえば、コラーゲンが皮膚に深く送達されるAOIであるならば、それは皮膚の深部層に浸透することができるベシクル製剤に連結されるであろう。
第4の態様として、本発明は本発明の第1〜第3の態様に従ってベシクル製剤を作製する方法を提供する。該方法は、AOIをベシクル成分に連結することと、AOI/成分を未修飾のリン脂質及び界面活性剤と混合して本発明のベシクル製剤を形成することとを含む。
本発明の第5の態様は、疾患を治療するのに使用するための第1の態様のベシクル製剤に関する。治療される疾患はベシクルにつなぎ止められるAOIによって決まるであろう。
本発明は第1の態様に従ってベシクル製剤を提供し、その際、AOIは、スキンケア製品で使用するための、老化防止製品で使用するための、または日焼け止め(UV保護)製品で使用するための、ビタミン、たとえば、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンDまたはビタミンAである。
提供されるのはまた、本発明に係るベシクル製剤であり、その際、AOIは、老化防止製品で使用するための、コラーゲン産生を促すまたは強化するのに使用するための、または化粧品で使用するためのペプチド、たとえば、テトラペプチド−7またはトリペプチド−1である。
提供されるのはまた、本発明に係るベシクル製剤であり、その際、AOIは、変形性関節炎を治療するのに使用するための、関節炎の関節痛を治療するのに使用するための、筋肉痛を治療するのに使用するための、肉離れを治療するのに使用するための、または炎症を治療するのに使用するための、NSAID、たとえば、ナプロキセンまたはジクロフェナクである。
十分に理解されるであろうように、他のAOIが、多種多様な疾患を治療するために本発明のベシクルにつなぎ止められてもよい。
本発明の第1の態様の特徴すべては変更するところは変更して第2〜第5の態様に適用される。
ベシクルの製造の間に、修飾された成分(すなわち、連結されたAOIを伴った)の未修飾の成分(すなわち、連結されたAOIを伴わない)に対する比を調整して、複数の修飾された成分(従ってAOI)がベシクルに組み込まれる程度及び少なくとも1つのAOIを含有するベシクルの数の双方を制御する。未修飾のベシクルの比率が最終調製物にてそのままである場合、これらは、これらに続いて毛穴に入り、後から「押す」ことによって修飾された形態の「引き寄せ」作用を補完するであろう。最終調製物における修飾されたベシクルの比率(ベシクル全部の比率として)0.1%〜100%または1%〜100%、10%〜90%、25%〜75%、または50%の範囲であってもよい。
高い比率のベシクルが確実に、連結された所望のAOIを有するまたは連結された複数のAOIを有するように、100%修飾された界面活性剤を用いて脂質と混合してもよい(逆もまた同様)。尺度の反対側では、さらに薄い効果について、2、3のベシクルのみが連結されたAOIを有するまたは単一のAOIのみがベシクルに連結される場合、5%の修飾された界面活性剤から95%の未修飾の界面活性剤までの混合物が使用される。しかしながら、一般に、80%〜10%の間の脂質または界面活性剤は修飾された脂質または界面活性剤の成分で置き換えられる。75%〜15%の間の脂質成分または界面活性剤成分が置き換えられてもよい。好適には、脂質成分または界面活性剤成分のいずれかの約70%、65%、60%、50%、40%、35%、30%、25%、20%、15%または10%の間またはこれらの間の範囲が、それぞれAOIに結合された修飾された脂質成分または修飾された界面活性剤成分で置き換えられてもよい。脂質成分及び界面活性剤成分双方の比率が置き換えられてもよい。修飾されたベシクルを抽出し、純粋な未修飾のベシクルとそれらを正確な「用量」に混合することによって、または修飾されたベシクルを異なるAOIと混合することによってさらなる改良を行うことができる。一般に、本明細書で使用される命名法並びに本明細書で記載される有機化学、医化学及び薬理学における実験手順は周知のものであり、当該技術で一般的に採用される。特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は一般に本開示が属する技術の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用されるとき、特定の成績を達成するのに「十分な量」、「に有効な量」または「に十分な量」は、任意で治療効果である所望の効果を生じる(すなわち、治療上有効な量の投与によって)のに有効である本発明の製剤の量を指す。代わりに言及すれば、「治療上有効な」量は、少なくとも1つの臨床症状で何らかの緩和、軽減及び/または低下を提供する量である。本発明の方法によって治療することができる障害に関連する臨床症状は当業者に周知である。さらに、当業者は、治療効果は、何らかの利益が対象に提供される限り、完全であるまたは治癒する必要はないことを十分に理解するであろう。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、対象の状態の重症度が低下するまたは少なくとも部分的に改善される若しくは改良される、及び/または少なくとも1つの臨床症状の何らかの緩和、軽減または低下が達成される、及び/または状態の進行に抑制または遅延がある、及び/または疾患若しくは病気の発症の進行における遅延を意味する。用語「治療する」、「治療すること」または「治療」はまた、病状を管理することも意味する。「予防」は予防的な治療を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学上許容可能な」は本発明の製剤を参照するのに使用される場合、製剤が、製剤を投与される対象にて許容できないレベルの刺激を生じないことを意味する。好ましくは、そのようなレベルは規制当局による認可に好適な製剤を提供するために十分に低いであろう。
数値に関して本明細書で使用されるとき、用語「約」は、測定を行うことにおける正常な実験誤差から生じると予想されるものを含む特定の数値を取り囲む範囲を意味する。たとえば、特定の実施形態では、用語「約」は、特定の数値と関連して使用される場合、数値の±20%、特に言及されない限り、数値の±1%、±2%、±3%、±4%、±5%、±10%、±15%、または±20%を意味する。
本明細書で提供される本発明の製剤は、任意で、薬学上許容可能な媒体、好ましくは3.5〜9.0に及ぶpH、好ましくは4〜7.5のpHを有する好ましくは水溶液に懸濁される、少なくとも1つの脂質、好ましくはリン脂質またはスルホ脂質と、少なくとも1つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤とを含む。本発明の製剤は任意で、緩衝液、抗酸化剤、保存剤、殺菌剤、抗菌剤、皮膚軟化剤、共溶媒及び/または増粘剤を含有してもよい。本発明の製剤は1を超える脂質、好ましくは1を超えるリン脂質の混合物を含んでもよい。本発明の製剤は、少なくとも1つの脂質、好ましくはリン脂質と少なくとも1つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と薬学上許容可能なキャリアと、任意で緩衝液、抗酸化剤、保存剤、殺菌剤、抗菌剤、皮膚軟化剤、共溶媒及び/または増粘剤から本質的に成ってもよい。本発明の製剤は、少なくとも1つの脂質、好ましくはリン脂質と少なくとも1つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と薬学上許容可能なキャリアと、以下:緩衝液、抗酸化剤、保存剤、殺菌剤、抗菌剤、皮膚軟化剤、共溶媒及び増粘剤の1以上とから成ってもよい。
表1は、本発明に係る好まれるリン脂質を列挙している。
表1は、本発明に係る好まれるリン脂質を列挙している。
本開示の文脈で好まれる脂質は、非荷電であり、安定なよく水和される二重層を形成し;ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びスフィンゴミエリンはそのような脂質の最も優れた代表である。これらのいずれかが表1でリストにしたような鎖を有することができ;脂質鎖が無秩序な状態にある流体相の二重層を形成するものが好まれる。
異なる負に荷電する、すなわち、アニオン性脂質もベシクルの脂質二重層に組み込むことができる。そのような荷電脂質の魅力的な例はホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールであり、やや好ましさの低いのは、ホスファチジン酸(及びそのアルキルエステル)またはホスファチジルセリンである。電気的に中性の二重層成分との組み合わせでそれらを使用することよりも荷電した脂質だけでベシクルを作ることがあまり称賛されることではないことが当業者によって実感されるであろう。荷電した脂質を使用する場合、脂質頭基のイオン化の所望の程度及び/または反対に荷電した薬剤と脂質分子の間での静電相互作用の所望の程度を確保するように緩衝液組成及びpH調整を選択しなければならない。さらに、中性脂質と同様に、荷電した二重層脂質成分は表1でリストにしたようなリン脂質の鎖のいずれかを原則として有することができる。しかしながら、脂肪鎖の流動性を高める役割を高めるベシクルの適応性の故に且つ互いに混合する流体相における脂質のさらに良好な能力の故に、流体相の脂質二重層を形成する鎖が明らかに好まれる。
脂質の脂肪酸または脂肪アルコールに由来する鎖は通常、以下の塩基性の脂肪族鎖の型の間で選択される。
他の二重結合の組み合わせまたは位置も同様に可能である。
本発明の好まれる脂質は、たとえば、以前はレシチンと呼ばれていた天然のホスファチジルコリンである。それは、卵(パルミチン酸、C16:0、及びオレイン酸、C18:1が豊富であるが、ステアリン酸、C18:0、パルミトレイン酸、C16:1、リノレン酸、C18:2、及びアラキドン酸、C20:4(M、ラジカル)も含む)、大豆(不飽和C18鎖が豊富であるが、2、3のその他の間で一部のパルミチン酸ラジカルも含有する)、ココナッツ(飽和鎖が豊富)、オリーブ(モノ不飽和鎖が豊富)、サフラン(ベニバナ)及びヒマワリ(n6のリノレン酸が豊富)、亜麻仁(n3のリノレン酸が豊富)から、クジラ脂肪(モノ不飽和n3鎖が豊富)から、プリムローズまたはサクラソウ(n3鎖が豊富)から得ることができる。好まれる天然のホスファチジルエタノールアミン(以前セファリンと呼ばれていた)は卵または大豆を起源とすることが多い。生物起源の好まれるスフィンゴミエリンは通常、卵または脳組織から調製される。好まれるホスファチジルセリンは通常脳物質を起源とするのに対して、ホスファチジルグリセロールは大腸菌のような細菌から優先的に抽出され、または天然のホスファチジルコリンから出発してホスホリパーゼDを用いてトランスホスファチジル化によって調製される。好ましく使用されるホスファチジルイノシトールは市販の大豆リン脂質またはウシ肝臓抽出物から単離される。好まれるホスファチジン酸は、言及された供給源のいずれかから抽出されるまたは好適なホスファチジルコリンからホスホリパーゼDを用いて調製される。
さらに、合成のホスファチジルコリンを使用してもよい。
製剤における脂質の量は、重量で約1%〜約12%、約1%〜約10%、約1%〜約4%、約4%〜約7%または約7%〜約10%である。脂質はリン脂質であってもよい。リン脂質はホスファチジルコリンであってもよい。
製剤における脂質はアルキル−リゾリン脂質を含まなくてもよい。製剤における脂質はポリエネイルホスファチジルコリンを含まなくてもよい。
用語「界面活性剤」はその普通の意味を有する。関連する界面活性剤のリスト及び界面活性剤に関連する定義は、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるEP 0 475 160 Al(たとえば、p.6,1.5〜p.14.1.17を参照)及びUS6,165,500(たとえば、col.7,1.60〜col.19,1.64を参照)にて、及び、たとえば、Handbook of Industrial SurfactantsまたはUS Pharmacopoeia,Pharm.Euのような適当な界面活性剤または医薬の教科書にて提供されている。一部の実施形態では、界面活性剤は、その開示が全体として参照によって本明細書に組み入れられる2002年1月31日に公開されたUS2002/0012680の表1〜18に記載されたものである。従って、以下のリストは、本特許出願と併せて特に一般的であるまたは有用である幾つかの界面活性剤の部類の、決して完全ではないまたは排他的ではない選択を提供するだけである。本開示に従って使用される好まれる界面活性剤は12を超えるHLBを持つものが挙げられる。リストには、イオン化された長鎖脂肪酸または長鎖脂肪アルコール、長鎖脂肪アンモニウム塩、たとえば、アルキル−またはアルケノイル−トリメチル−、−ジメチル−及び−メチル−アンモニウム塩、アルキル−またはアルケノイル−硫酸塩、長い脂肪鎖ジメチル−アミノオキシド、たとえば、アルキル−またはアルケノイル−ジメチル−アミノオキシド、長い脂肪鎖、たとえば、アルカノイル、ジメチル−アミノオキシド及び特に、ドデシルジメチル−アミノオキシド、長い脂肪鎖、たとえば、アルキル−N−メチルグルカミド及びアルカノイル−N−メチルグルカミド、たとえば、MEGA−8、MEGA−9及びMEGA−IO、N−長い脂肪鎖−N、N−ジメチルグリシン、たとえば、N−アルキル−N,N−ジメチルグリシン、3−(長い脂肪鎖−ジメチルアンモニオ)−アルカン−スルホネート、たとえば、3−(アシルジメチルアンモニオ)−アルカンスルホネート、スルホコハク酸塩の長い脂肪鎖誘導体、たとえば、ビス(2−エチルアルキル)スルホコハク酸塩、長い脂肪鎖−スルホベタイン、たとえば、アシル−スルホベタイン、長い脂肪鎖ベタイン、たとえば、EMPIGEN BBまたはZWITTERGENT−3−16、−3−14、−3−12、−3−10、または−3−8、またはポリエチレン−グリコール−アシルフェニルエーテル、特に、ノナエチレン−グリコール−オクチル−フェニルエーテル、ポリエチレン−長い脂肪鎖−エーテル、特に、ポリエチレン−アシルエーテル、たとえば、ノナエチレン−デシルエーテル、ノナエチレン−ドデシルエーテルまたはオクタエチレン−ドデシルエーテル、ポリエチレングリコール−イソアシルエーテル、たとえば、オクタエチレングリコール−イソトリデシルエーテル、ポリエチレングリコール−ソルビタン−長い脂肪鎖エステル、たとえば、ポリエチレングリコール−ソルビタン−アシルエステル及び特に、ポリオキシエチレン−モノラウレート(たとえば、ポリソルベート20またはTween20)、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノオレエート(たとえば、ポリソルベート80またはTween80)、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノラウロレイレート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノペトロセリネート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノエライデート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−ミリストレイレート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−パルミトレイニレート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−p−エトロセリニデート、ポリヒドロキシエチレン−長い脂肪鎖エーテル、たとえば、ポリヒドロキシエチレン−アシルエーテル、たとえば、ポリヒドロキシエチレン−ラウリルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−ミリストイルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−セチルスト−エアリル、ポリヒドロキシエチレン−パルミチルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−オレオイルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−パルミトオレオイルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−リノレイル、ポリヒドロキシエチレン−4、または6、または8、または10、または12−ラウリル、ミリストイル、パルミトイル、パルミトレイル、オレオイルまたはリノエイルエーテル(Brijシリーズ)、または相当するエステルにおける、ポリヒドロキシエチレン−ラウレート、−ミリステート、−パルミテート、−ステアレートまたは−オレエート、特に、ポリヒドロキシエチレン−8−ステアレート(Myrj45)及びポリヒドロキシエチレン−8−オレエート、ポリエトキシ化ヒマシ油40(CremophorEL)、ソルビタン−モノ長い脂肪鎖、たとえば、アルキレート(ArlacelまたはSpanシリーズ)、特に、ソルビタン−モノラウレート(Arlacel20、Span20)として、長い脂肪鎖、たとえば、アシル−N−メチルグルカミド、アルカノイル−N−メチルグルカミド、特に、デカノイル−N−メチルグルカミド、ドデカノイル−N−メチルグルカミド、長い脂肪鎖サルフェート、たとえば、アルキル−サルフェート、アルキル硫酸塩、たとえば、ラウリル−硫酸塩(SDS)、オレオイル−硫酸塩:長い脂肪鎖チオグルコシド、たとえば、アルキルチオグルコシド及び特に、ヘプチル−、オクチル−及びノニル−β−D−チオグルコピラノシド;種々の炭水化物の長い脂肪鎖誘導体、たとえば、ペントース、ヘキソース、二糖類、特に、アルキル−グルコシド及びマルトシド、たとえば、ヘキシル−、ヘプチル−、オクチル−、ノニル−及びデシル−β−D−グルコピラノシドまたはD−マルトピラノシド;さらに塩、特に、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロコール酸のナトリウム塩、脂肪酸塩、特に、最も多くはナトリウム塩の形態でのオレエート、エライデート、リノレート、ラウレート、またはミリステート、リゾリン脂質、n−オクタデシレングリセロホスファチジン酸、オクタデシレン−ホスホリルグリセロール、オクタデシレン−ホスホリルセリン、n−長い脂肪鎖−グリセロ−ホスファチジン酸、たとえば、n−アシル−グリセロ−ホスファチジン酸、特に、ラウリルグリセロ−ホスファチジン酸、オレオイル−グリセロ−ホスファチジン酸、n−長い脂肪鎖−ホスホリルグリセロール、たとえば、n−アシル−ホスホリルグリセロール、特に、ラウリル−、ミリストイル−、オレオイル−またはパルミトエロイル−ホスホリルグリセロール、n−長い脂肪鎖−ホスホリルセリン、たとえば、n−アシル−ホスホリルセリン、特に、ラウリル−、ミリストイル−、オレオイル−またはパルミトエロイル−ホスホリルセリン、n−テトラデシル−グリセロ−ホスファチジン酸、n−テトラデシル−ホスホリルグリセロール、n−テトラデシル−ホスホリルセリン、相当する−、エライドイル−、バクセニル−リゾリン脂質、相当する短鎖リン脂質、と同様に、すべての表面活性のある、従って、膜不安定化ポリペプチドが含まれる。界面活性剤の鎖は通常、流体状態であるように、またはキャリア凝集体における流体鎖状態の維持に少なくとも適合性であるように選択される。
界面活性剤は非イオン性界面活性剤であってもよい。界面活性剤は重量で約0.2〜10%、約1%〜約10%、約1%〜約7%または約2%〜5%にて製剤に存在してもよい。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン(ポリソルベート界面活性剤)、ステアリン酸ポリヒドロキシエチレンまたはポリヒドロキシエチレンラウリルエーテル(Brij界面活性剤)から選択されてもよい。界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノオレエート(たとえば、ポリソルベート80またはTween80)またはTween20、40、または60であってもよい。ポリソルベートは12〜20の炭素原子を持つ任意の鎖を有してもよい。ポリソルベートは製剤にて流体であってもよく、それは1以上の二重結合、分岐または環状基を含有してもよい。
界面活性剤は、追加のPEG分子または他の親水性部分で修飾されてもよい。
本発明の製剤は、修飾された脂質または界面活性剤に加えて、たった1つの脂質及びたった1つの界面活性剤を含んでもよい。或いは、本発明の製剤は、1を超える脂質とたった1つの界面活性剤を、たとえば、2、3、4以上の脂質と1つの界面活性剤を含んでもよい。或いは、本発明の製剤は、1つの脂質と1を超える界面活性剤を、たとえば、2、3、4以上の界面活性剤と1つの脂質を含んでもよい。本発明の製剤は、1を超える脂質と1を超える界面活性剤を、たとえば、2、3、4以上の脂質と2、3、4以上の界面活性剤を含んでもよい。
本発明の製剤は、様々な脂質の界面活性剤に対する比(AOIに結合される脂質及び/または界面活性剤を含む)を有してもよい。比はモル表現(脂質のモル/界面活性剤のモル)という点で表現されてもよい。製剤における脂質の界面活性剤に対するモル比は、約1:3〜約30:1、約1:2〜約30:1、約1:1〜約30:1、約2:1〜約20:1、約5:1〜約30:1、約10:1〜約30:1、約15:1〜約30:1、または約20:1〜約30:1であってもよい。本発明の製剤における脂質の界面活性剤に対するモル比は約1:2〜約10:1であってもよい。比は、約1:1〜約2:1、約2:1〜約3:1、約3:1〜約4:1、約4:1〜約5:1または約5:1〜約10:1であってもよい。モル比は、約10:1〜約30:1、約10:1〜約20:1、約10:1〜約25:1及び約20:1〜約25:1であってもよい。脂質の界面活性剤に対する比は約1.0:1.0、約1.25:1.0、約1.5/1.0、約1.75/1.0、約2.0/1.0、約2.5/1.0、約3.0/1.0または約4、0/1.0であってもよい。本発明の製剤は、種々の量の以下の成分:組み合わせた脂質と界面活性剤の総量(TA)も有してもよい。TA量は、組成物全体の重量パーセントという点で述べられてもよい。TAは、約1%〜約40%、約5%〜約30%、約7.5%〜約15%、約6%〜約14%、約8%〜約12%、約5%〜約10%、約10%〜約20%または約20%〜約30%であってもよい。TAは6%、8%、9%、10%、12%、14%、15%または20%であってもよい。
本発明の製剤についての脂質総量及び脂質/界面活性剤の比(モル/モル)の選択された範囲を以下の表に記載する。
表2.総量及び脂質の界面活性剤に対する比
表2.総量及び脂質の界面活性剤に対する比
本発明の製剤は任意で1以上の以下の成分:共溶媒、キレート剤、緩衝液、抗酸化剤、保存剤、殺菌剤、皮膚柔軟剤、保湿剤、潤滑剤及び増粘剤を含有してもよい。任意の成分の好まれる量は以下のように記載される。
*脂質総量の比率として
本発明の製剤は、pH3.5〜pH9、pH4〜pH7.5またはpH6〜pH7の範囲に水溶液のpHを合わせるための緩衝液を含んでもよい。緩衝液の例には、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液及びプロピオン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の製剤は通常、水性媒体で製剤化される。製剤は、低級アルコールのような共溶媒と共にまたはそれを伴わずに製剤化されてもよい。本発明の製剤は少なくとも20重量%の水を含んでもよい。本発明の製剤は、重量で約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%の水を含んでもよい。製剤は約70〜約80重量%の水を含んでもよい。
「殺菌」剤または「抗菌」剤は一般に医薬製剤における細菌数を減らすために添加される。殺菌剤の一部の例は、エチルアルコール及びプロピルアルコールを含む短鎖アルコール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、クロロベンジルアルコール、ジクロロベンジルアルコール、ヘキサクロロフェン;フェノール化合物、たとえば、クレゾール、4−クロロ−m−クレゾール、p−クロロ−m−キシレノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、ポビドン−ヨウ素;パラベン、特に、アルキル−パラベン、たとえば、メチル−、エチル−、プロピル−、またはブチル−パラベン、ベンジルパラベン;酸、たとえば、ソルビン酸、安息香酸及びそれらの塩;四級アンモニウム化合物、たとえば、アルコニウム塩、たとえば、臭化物、ベンザルコニウム塩、たとえば、塩化物または臭化物、セトリモニウム塩、たとえば、臭化物、フェノアルケシニウム塩、たとえば、臭化フェノドデシニウム、塩化セチルピリジニウム及び他の塩;さらに、水銀化合物、たとえば、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀または硝酸フェニル水銀、チオメサール、クロロヘキシジンまたはそのグルコン酸塩、または生物起源の抗生剤活性のある化合物、またはそれらの好適な混合物である。
「抗酸化剤」の例は、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)及びジ−tert−ブチルフェノール(LY178002、LY256548、HWA−131、BF−389、CI−986、PD−127443、E−51または19、BI−L−239XX、等)、3級ブチルヒドロキノン(TBHQ)、没食子酸プロピル(PG)、l−O−ヘキシル−2,3,5−トリメチルヒドロキノン(HTHQ);芳香族アミン(ジフェニルアミン、p−アルキルチオ−o−アニシジン、エチレンジアミン誘導体、カルバゾール、テトラヒドロインデノインドール);フェノール及びフェノール酸(グアイアコール、ヒドロキノン、バニリン、没食子酸及びそのエステル、フォトカテク酸、キナ酸、シリング酸、エラグ酸、サリチル酸、ノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)、ユーゲノール);トコフェロール(トコフェロール(α、β、γ、δ)及びその誘導体、たとえば、トコフェリル−アシレート(たとえば、−アセテート、−ラウレート、ミリステート、−パルミテート、−オレエート、−リノレエート等、または他の好適なトコフェリル−リポエートを含む)、トコフェリル−POE−コハク酸;トロロックス及び相当するアミド及びチオカルボキサミド類似体;アスコルビン酸及びその塩、イソアスコルビン酸塩、(2または3または6)−o−アルキルパルミチン酸アスコルビルエステル(たとえば、6−o−ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル−、オレイル、またはリノレオイル−L−アスコルビン酸等)である。有用なのはまた、優先的に酸化される化合物、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、チオ尿素;キレート剤、たとえば、EDTA、GDTA、デスフェラール:種々雑多な内在性の防御系、たとえば、トランスフェリン、ラクトフェリン、フェリチン、セアルロプラスミン、ハプトグロビン、ヘモペキアイン、アルブミン、グルコース、ユビキノール−10);酵素性抗酸化剤、たとえば、スーパーオキシドジスムターゼ及び類似の活性を持つ金属錯体、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、及びあまり複雑ではない分子、たとえば、β−カロテン、ビリルビン、尿酸を含む;フラボノイド(フラボン、フラボノール、フラボノン、フラバノナール、カコン、アントシアニン)、N−アセチルシステイン、メスナ、グルタチオン、チオヒスチジン誘導体、トリアゾール;タンニン、桂皮酸、ヒドロキシ桂皮酸及びそのエステル(クマル酸及びエステル、コーヒー酸及びそのエステル、フェルラ酸、(イソ−)クロロゲン酸、シナプ酸);香辛料抽出物(たとえば、丁子、シナモン、セージ、ローズマリー、ナツメグ、オレガノ、オールスパイス、ナツメグから);カルノシン酸、カルノソール、カルソリン酸;ロスマリン酸、ロスマリンジフェノール、ゲンチジン酸、フェルラ酸;エンバク粉の抽出物、たとえば、アベナンスラマイド1及び2;チオエーテル、ジチオエーテル、スルホキシド、テトラアルキルチウラムジスルフィド;フィチン酸、ステロイド誘導体(たとえば、U74006F);トリプトファン代謝産物(たとえば、3−ヒドロキシキヌレニン、3−ヒドロキシアントラニル酸)、及びオルガノカルコゲニドである。
「増粘剤」を用いて医薬製剤の粘度を高めるが、増粘剤は、薬学上許容可能な親水性ポリマー、たとえば、カルボキシムエチル−、ヒドロキシエチル−、ヒドロキシプロピル−、ヒドロキシプロピルメチル−またはメチル−セルロースを含む部分的にエーテル化したセルロース誘導体;ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ(ヒドロキシエチル)−、ポリ(ヒドロキシプロピル)−、ポリ(ヒドロキシプロピルメチル)メタクリレート、ポリアクリロニトリル、メタリル−スルホネート、ポリエチレン、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ラクチド、ポリエチレングリコール−ジアクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ(プロピルメタクリルアミド)、ポリ(プロピレンフマレート−co−エチレングリコール)、ポロキサマー、ポリアスパルトアミド(ヒドラジン架橋した)ヒアルロン酸、シリコーンを含む完全に合成の親水性ポリマー;アルギネート、カラーギーナン、グアーゴム、ゼラチン、トラガカント、(アミド化した)ペクチン、キサンタン、キトサンコラーゲン、アガロースを含む天然ゴム;それらの混合物及びさらなる誘導体またはコポリマー及び/または他の薬学上許容可能な若しくは少なくとも生物学的に許容可能なポリマーから選択される。
本発明の製剤は、極性の液状媒体も含んでもよい。本発明の製剤は、水性媒体で投与されてもよい。本発明の製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、ローション、軟膏、ジェル、スプレー、成膜溶液またはヘアスプレーの形態であってもよい。
作用のメカニズムまたは理論に限定されない一方で、本発明の製剤は、その適応性、可変形性または浸透性を特徴とするベシクルまたはESAを形成してもよい。類似のベシクル(結合した治療上の実体を伴わない)はWO2010/140061及びWO2011/022707の双方にて記載されている。
本発明の製剤は、上記で言及されたようなAOIに応じて種々の疾患または病気の予防または治療にて有用である。
たとえば、本発明のベシクル製剤は、ビタミンD3、C、EまたはB7の1つ、2つまたは3つを含んでもよい。製剤は単独で使用してもよく、またはさらに複雑なスキンケア製品、たとえば、日焼け止め、日焼け阻止、保湿剤、美容液または化粧品の構成成分または成分として使用してもよい。製剤または最終的なスキンケア製品はクリーム、ジェル、ローション、ムースまたはスプレーの形態であってもよい。
本発明によって提供されるのは、上記で定義されたような用途のためのベシクル製剤であり、その際、微量栄養素がビタミンD3であり、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品、または他のスキンケアまたは化粧品製品に組み込まれて低レベルのビタミンDを補完してもよく;微量栄養素がビタミンCまたはビタミンEであり、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品、または他のスキンケアまたは化粧品製品に組み込まれて表皮及び真皮のビタミンCまたはビタミンEを補完し、太陽で損傷された皮膚または加齢皮膚の保護または修復を支援してもよく;微量栄養素がビタミンB7であり、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品、または他のスキンケアまたは化粧品製品に組み込まれてこの微量栄養素の欠如に関連する皮膚病を軽減または排除してもよい。
本発明のベシクル製剤は、局所に塗布される創傷治癒製品で提供されてもよい。従って、本発明は皮膚の創傷を治療するのに使用するための第1の態様の製剤を提供し、AOIはアスコルビン酸(ビタミンC)である。
以下の非限定の実施例及び図面を参照して本発明を以下で記載する。
実施例製剤
実施例ベシクル製剤
実施例製剤1
製剤1は、脂質としてのスフィンゴミエリン(脳)(47.944mg/g)、界面活性剤としてのTween80(42.05mg/g)、乳酸緩衝液(pH4)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)を含む。
実施例ベシクル製剤
実施例製剤1
製剤1は、脂質としてのスフィンゴミエリン(脳)(47.944mg/g)、界面活性剤としてのTween80(42.05mg/g)、乳酸緩衝液(pH4)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)を含む。
実施例製剤2
製剤2は、脂質としてのスフィンゴミエリン(脳)(53.750mg/g)、界面活性剤としてのTween80(31.250mg/g)、乳酸緩衝液(pH4)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(15.000mg/g)を含む。
製剤2は、脂質としてのスフィンゴミエリン(脳)(53.750mg/g)、界面活性剤としてのTween80(31.250mg/g)、乳酸緩衝液(pH4)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(15.000mg/g)を含む。
実施例製剤3
製剤3は、脂質としてのスフィンゴミエリン(脳)(90.561mg/g)、界面活性剤としてのTween80(79.439mg/g)、乳酸緩衝液(pH4)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)を含む。
製剤3は、脂質としてのスフィンゴミエリン(脳)(90.561mg/g)、界面活性剤としてのTween80(79.439mg/g)、乳酸緩衝液(pH4)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)を含む。
実施例製剤4
製剤4は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(8.500mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(36.51mg/g)を含む。
製剤4は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(8.500mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(36.51mg/g)を含む。
実施例製剤5
製剤5は、脂質としてのホスファチジルコリン(71.460mg/g)、界面活性剤としてのTween80(4.720mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.8)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(15.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(35.000mg/g)を含む。
製剤5は、脂質としてのホスファチジルコリン(71.460mg/g)、界面活性剤としてのTween80(4.720mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.8)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(15.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(35.000mg/g)を含む。
実施例製剤6
製剤6は、脂質としてのホスファチジルコリン(71.460mg/g)、界面活性剤としてのTween80(4.720mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.8)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(50.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(15.000mg/g)を含む。
製剤6は、脂質としてのホスファチジルコリン(71.460mg/g)、界面活性剤としてのTween80(4.720mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.8)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(50.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(15.000mg/g)を含む。
実施例製剤7
製剤8は、脂質としてのホスファチジルコリン(71.4600mg/g)、界面活性剤としてのTween80(4.720mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(50.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(35.000mg/g)を含む。
製剤8は、脂質としてのホスファチジルコリン(71.4600mg/g)、界面活性剤としてのTween80(4.720mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、グリセロール(50.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(35.000mg/g)を含む。
実施例製剤8
製剤8は、脂質としてのホスファチジルコリン(64.516mg/g)、界面活性剤としてのTween80(35.484mg/g)、リン酸緩衝液(pH6.7)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(4.200mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)を含む。
製剤8は、脂質としてのホスファチジルコリン(64.516mg/g)、界面活性剤としてのTween80(35.484mg/g)、リン酸緩衝液(pH6.7)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(4.200mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)を含む。
実施例製剤9
脂質としてのホスファチジルコリン(64.516mg/g)、界面活性剤としてのTween80(35.484mg/g)、リン酸緩衝液(pH6.7)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)、溶媒としてのベンジルアルコール(5.250mg/g)またはパラベン(4.200mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)。
脂質としてのホスファチジルコリン(64.516mg/g)、界面活性剤としてのTween80(35.484mg/g)、リン酸緩衝液(pH6.7)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)、溶媒としてのベンジルアルコール(5.250mg/g)またはパラベン(4.200mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)。
実施例製剤10
脂質としてのホスファチジルコリン(71.460mg/g)、界面活性剤としてのTween80(4.720mg/g)、リン酸緩衝液(pH6.7)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)、溶媒としてのベンジルアルコールまたはパラベン(10.000mg/g)、グリセロール(50.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)。
脂質としてのホスファチジルコリン(71.460mg/g)、界面活性剤としてのTween80(4.720mg/g)、リン酸緩衝液(pH6.7)、抗酸化剤としてのBHA(0.200mg/g)、溶媒としてのベンジルアルコールまたはパラベン(10.000mg/g)、グリセロール(50.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(3.000mg/g)及びエタノール(30.000mg/g)。
連結したAOIを伴った実施例ベシクル製剤
実施例製剤11
製剤9は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(8.500mg/g)、AOIとしてのコラーゲニルホスファチジルコリン(1mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(36.51mg/g)を含む。
実施例製剤11
製剤9は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(8.500mg/g)、AOIとしてのコラーゲニルホスファチジルコリン(1mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(36.51mg/g)を含む。
実施例製剤12
製剤10は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(8.500mg/g)、AOIとしてのコラーゲニルホスファチジルコリン(0.5mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(36.51mg/g)を含む。
製剤10は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(8.500mg/g)、AOIとしてのコラーゲニルホスファチジルコリン(0.5mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(36.51mg/g)を含む。
実施例製剤13
製剤11は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(8.500mg/g)、コラーゲニルTween(0.5mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(36.51mg/g)を含む。
製剤11は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(8.500mg/g)、コラーゲニルTween(0.5mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.5)、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン(5.000mg/g)、グリセロール(30.000mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(36.51mg/g)を含む。
実施例14及びその製造及び試験
製剤14は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g))、界面活性剤としてのTween80(6.800mg/g)、AOIとしてのパルミチン酸アスコルビル(0.530mg/g)、クエン酸リン酸(pH5.4)緩衝液、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(48.87mg/g)を含む。
製剤14は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g))、界面活性剤としてのTween80(6.800mg/g)、AOIとしてのパルミチン酸アスコルビル(0.530mg/g)、クエン酸リン酸(pH5.4)緩衝液、抗酸化剤としてのBHT(0.200mg/g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(0.500mg/g)、キレート剤としてのEDTA(1.000mg/g)及びエタノール(48.87mg/g)を含む。
要約
20%のポリソルベート80のモル置換で共有結合したアスコルビン酸を含有するようにTransfersome調製物を上手く製造した。試験結果は、アスコルビン酸の包含によってtransfersomeのサイズ分布、可変形特性及び電荷は影響されないこと、パルミチン酸L−アスコルビルエステルは、transfersomeの外表面でカルボキシルエステラーゼにアクセス可能であること、パルミチン酸アスコルビルtransfersomeはFe3+還元アッセイで活性があること、及びその平均サイズより小さな孔を通って変形した後、それらはその還元活性を保持することを示した。
20%のポリソルベート80のモル置換で共有結合したアスコルビン酸を含有するようにTransfersome調製物を上手く製造した。試験結果は、アスコルビン酸の包含によってtransfersomeのサイズ分布、可変形特性及び電荷は影響されないこと、パルミチン酸L−アスコルビルエステルは、transfersomeの外表面でカルボキシルエステラーゼにアクセス可能であること、パルミチン酸アスコルビルtransfersomeはFe3+還元アッセイで活性があること、及びその平均サイズより小さな孔を通って変形した後、それらはその還元活性を保持することを示した。
製造
パルミチン酸L−アスコルビル(Sigma7618)を含有する、大豆ホスファチジルコリン(Lipoid SPC S−100)とポリソルベート80を用いてTransfersomeを調製した。transfersomeの対照バッチも作製した。ブチルヒドロキシトルエン、EDTA及びメタ亜硫酸水素ナトリウムをtransfersomeに加えてパルミチン酸L−アスコルビルの酸化を出来るだけ抑えた。
パルミチン酸L−アスコルビル(Sigma7618)を含有する、大豆ホスファチジルコリン(Lipoid SPC S−100)とポリソルベート80を用いてTransfersomeを調製した。transfersomeの対照バッチも作製した。ブチルヒドロキシトルエン、EDTA及びメタ亜硫酸水素ナトリウムをtransfersomeに加えてパルミチン酸L−アスコルビルの酸化を出来るだけ抑えた。
パルミチン酸L−アスコルビルTransfersome(登録商標)の調製
大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80:パルミチン酸L−アスコルビルの13.3:0.8:0.2のモル比で50gバッチのパルミチン酸L−アスコルビルtTransfersomeを調製した。
大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80:パルミチン酸L−アスコルビルの13.3:0.8:0.2のモル比で50gバッチのパルミチン酸L−アスコルビルtTransfersomeを調製した。
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン(3.44g)とポリソルベート80(0.34g)とブチルヒドロキシトルエン(0.01g)とパルミチン酸L−アスコルビル(0.0265g)をエタノールに溶解して6.26gの総重量を得た。
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、0.1%EDTAと0.05%メタ亜硫酸水素ナトリウムを伴った25mMのクエン酸リン酸緩衝液(pH5.4)(43.74g)を35℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ15分間撹拌した。
4バール圧の窒素によって35℃にてSartorius47mmフィルターシステムを用いて、0.2μmのフィルター、その後0.1μmのフィルター、さらに0.1μmのフィルターを介して押し出すことによりtransfersomeを調製した。各フィルターは上にグラスファイバーのプレフィルターを有した。Transfersomeを暗所にて+5℃で保存した。
対照Transfersomeの調製
大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80の13.3:1のモル比で50gバッチの対照transfersomeを調製した。
大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80の13.3:1のモル比で50gバッチの対照transfersomeを調製した。
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン(3.44g)とポリソルベート80(0.425g)とブチルヒドロキシトルエン(0.01g)をエタノールに溶解して6.26gの総重量を得た。
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、0.1%EDTAと0.05%メタ亜硫酸水素ナトリウムを伴った25mMのクエン酸リン酸緩衝液(pH5.4)(43.74g)を35℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ15分間撹拌した。
パルミチン酸L−アスコルビルtransfersomeバッチPD−14−0035について記載したように対照transfersomeを押し出した。Transfersomeを暗所にて+5℃で保存した。
分析方法
粒度の測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってtransfersome調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
粒度の測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってtransfersome調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
ALV−5000/E光子相関分光計を用いて各試料の平均粒度及び粒度分布を測定した。試料を脱イオン水で希釈して50〜500kHzの範囲内で検出可能なシグナルを得、次いで各30秒の持続時間で6回の測定にわたって分析した。温度は25℃で制御した。正規化適合累積二次分析にデータを供して試料の粒度分布(wまたは幅として報告された)と同様に平均粒度(rまたは平均半径として報告された)を得た。平均半径に2を乗じて平均直径(nm)を得た。
各試料についての多分散指数(PDI)は以下の方程式:
(式中、w=幅、r=平均半径)
に従って算出した。
(式中、w=幅、r=平均半径)
に従って算出した。
連続膜適応性アッセイ
連続膜適応性(CMA)アッセイは印加された圧力を用いてtransfersomeに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、transfersomeの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
連続膜適応性(CMA)アッセイは印加された圧力を用いてtransfersomeに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、transfersomeの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
濾過装置の基底部における濾過サポートにAnodisc13膜フィルター(孔サイズ20nm)を装填し、上部のステンレススチールのバレルを連結した。25℃で予備平衡化した3mlのtransfersome試料をバレルに入れ、熱循環装置(25℃)に接続した熱伝導チューブがその周りに巻き付けられた。窒素シリンダーに接続した圧力チューブにバレルを接続した。一連の弁を用いて、9.5バール圧の設定点でシステムの事前準備を行って7.5バールの出発圧を得た。エクセルコンピュータプログラムに接続した正確な秤量バランス上に置かれた回収容器上に濾過装置を置いた。Bronkhurst圧力コントローラを用いて圧力を制御し、モニターし、且つ、システムの弁が開放され、計時が開始した場合、バランス上で回収されたtransfersome濾液の増加する質量を低下する圧力と増加する時間に対して記録した。
MathCADプログラムで時間、圧力、質量データを評価してP*値を決定した。P*は、孔の浸透に必要とされる活性化圧力の基準なので、transfersome膜の剛性及び可変形性の基準である。transfersomeの平均粒度はCMA濾過の前後で光子相関分光計によって測定した。
アスコルビン酸アッセイ
アスコルビン酸アッセイキット(Abcam、ab65656)を用いてパルミチン酸アスコルビル及びアスコルビン酸の濃度を測定した。このアッセイでは、アスコルビン酸のような抗酸化剤の存在下でFe3+がFe2+に還元される。Fe2+は比色分析プローブによってキレートされて593nmにて吸収を持つ生成物を生じる。
アスコルビン酸アッセイキット(Abcam、ab65656)を用いてパルミチン酸アスコルビル及びアスコルビン酸の濃度を測定した。このアッセイでは、アスコルビン酸のような抗酸化剤の存在下でFe3+がFe2+に還元される。Fe2+は比色分析プローブによってキレートされて593nmにて吸収を持つ生成物を生じる。
パルミチン酸アスコルビルの総濃度を決定するために、transfersomeをエタノールと5%TritonX−100によって1:7:2v/vに希釈することにより可溶化した。濃度範囲0.0125〜0.25mMへのエタノールにおける当初の希釈、次いで0.01〜0.175mMの最終濃度範囲への水及び5%TritonX−100における7:1:2v/vの希釈によってパルミチン酸アスコルビルの検量線を作成した。0mMのパルミチン酸アスコルビルのブランクも含めた。標準と試料をマイクロタイタープレートに負荷し、キットの緩衝液とFe3+と比色分析プローブとを含有する反応混合物と1:1v/vで混合した。室温での1分間のインキュベート後、プレートを593nmで読み取った。標準及び試料のすべてから0mMのパルミチン酸アスコルビルのブランクを差し引き、対照の「空の」transfersomeについての吸光度をパルミチン酸アスコルビルのそれから差し引いた。最終的な吸光度をパルミチン酸アスコルビルの検量線に対して比較し、パルミチン酸アスコルビル(アスコルビン酸)の総濃度(mM)を得た。
外部アスコルビン酸濃度を決定するために、アスコルビン酸を水で0.025〜0.2mMの濃度範囲に希釈することによってアスコルビン酸の検量線を作成した。標準及びtransfersome試料をマイクロタイタープレートに負荷し、キット緩衝液、Fe3+、比色分析プローブを含有する反応混合物と1:1v/vで混合した。室温での1分間のインキュベートの後、プレートを593nmで読み取った。プレートのブランクを標準及び試料すべてから差し引き、対照の「空の」transfersomeの吸光度をパルミチン酸アスコルビルのtransfersomeの吸光度から差し引いた。最終的な吸光度をアスコルビン酸の検量線と比較してアスコルビン酸の濃度を得た。濃度をパルミチン酸アスコルビル(アスコルビン酸)の総濃度と比べて、パルミチン酸アスコルビルtransfersomeの外表面につなぎ止められた%アスコルビン酸を算出した。
カルボキシルエステラーゼ消化及びRP−HPLC
パルミチン酸アスコルビルを含有するtransfersomeからのアスコルビン酸の解放は、カルボキシルエステラーゼ1アイソフォームB(SigmaE0287)を用いたエステルの酵素的消化によって行った。transfersomeのml当たり960単位の酵素を加え、その後、+37℃にてインキュベートした。試料を2時間及び4時間で採取し、解放されたアスコルビン酸を、1容量のアセトニトリル/メタノール/ギ酸(80v/20v/0.2v)を加えることによって抽出し、その後、5分間の超音波処理及び遠心分離を行って不溶性成分を沈殿させた。次いで0.2μmの膜を介して上清試料を濾過し、その後、超純水によって1/10に希釈した。
パルミチン酸アスコルビルを含有するtransfersomeからのアスコルビン酸の解放は、カルボキシルエステラーゼ1アイソフォームB(SigmaE0287)を用いたエステルの酵素的消化によって行った。transfersomeのml当たり960単位の酵素を加え、その後、+37℃にてインキュベートした。試料を2時間及び4時間で採取し、解放されたアスコルビン酸を、1容量のアセトニトリル/メタノール/ギ酸(80v/20v/0.2v)を加えることによって抽出し、その後、5分間の超音波処理及び遠心分離を行って不溶性成分を沈殿させた。次いで0.2μmの膜を介して上清試料を濾過し、その後、超純水によって1/10に希釈した。
+25℃にてLunaC18(2)100A、5μm、4.6×250mmのカラムとWaters2695分離モジュールを用いた逆相高圧液体クロマトグラフィ(RP−HPLC)及び溶離液Aが20mMのリン酸カリウム、pH3.0及び溶離液Bがアセトニトリルである以下の表のような勾配法によって試料を分析した。Waters2487検出器を用いて260nmの波長にて検出を行った。
加えて、同じRP−HPLC法を用いて0.4〜100μg/mlの範囲でアスコルビン酸の検量線を分析した。アスコルビン酸のピークは試料及び標準について得られたクロマト図において積分した。標準のピーク面積を線形回帰によって解析して検量線のための方程式を作出した。次いで試料のピーク面積を用いて、抽出法からの希釈を考慮に入れる検量線の方程式からアスコルビン酸の濃度を決定した。濃度をアスコルビン酸の総濃度と比較して、パルミチン酸アスコルビルtransfersomeの外表面から解放された%アスコルビン酸を算出した。
濾紙電気泳動
2つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてtransfersome調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のpHでの粒子の正味電荷によって決定される。
2つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてtransfersome調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のpHでの粒子の正味電荷によって決定される。
各試験試料の容量(100μl)を個々の2×20cmのWhatman濾紙片(pH5.75での泳動緩衝液:2.3mg/mlの塩化ナトリウム、1.5mg/mlの塩化カルシウム、1.3mg/mlのグリシルグリシン、25mg/mlのマンニトール、10mg/mlのスクロース及び0.5mg/mlのメチオニンによって事前に濡らした)の中央の載せ、130Vで2時間泳動した。PEG(ポリソルベート80の成分)について5%w/vの塩化バリウム及び0.05Mのヨウ素によって各濾紙片を染色し、その後乾燥させた。各試料の中心点から離れたtransfersomeの移動の程度を濾紙片の陽極側及び陰極側の双方で測定し、ベシクルの正味電荷を決定した。
結果及び考察
結果を表4にて要約する。パルミチン酸アスコルビルtransfersomeの試料は、情報のための試料の完全性を再チェックするために0.2μmの無菌フィルターで濾過し、濾過後再試験した。
表4対照及びパルミチン酸アスコルビルのTransfersomeの分析
結果を表4にて要約する。パルミチン酸アスコルビルtransfersomeの試料は、情報のための試料の完全性を再チェックするために0.2μmの無菌フィルターで濾過し、濾過後再試験した。
表4対照及びパルミチン酸アスコルビルのTransfersomeの分析
粒度測定
対照のtransfersomeについて及びパルミチン酸アスコルビルを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、transfersomeにおけるポリソルベート80のエステルによる20%の置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。0.2μmの無菌フィルターで濾過した後、サイズに有意な変化はなかった。
対照のtransfersomeについて及びパルミチン酸アスコルビルを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、transfersomeにおけるポリソルベート80のエステルによる20%の置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。0.2μmの無菌フィルターで濾過した後、サイズに有意な変化はなかった。
連続膜適応性アッセイ
可変形性P*値がパルミチン酸アスコルビルを含有するtransfersome及び対照のtransfersomeで実際上同じであったということは、ポリソルベート80のエステルによる20%の置換がtransfersomeの可変形性特性に有意には影響しなかったことを示している。濾過の%回収は対照のtransfersomeでやや高かったが、それはパルミチン酸アスコルビルの包含がベシクル膜に対してごくわずかな硬直効果を有したことを示し得る。
可変形性P*値がパルミチン酸アスコルビルを含有するtransfersome及び対照のtransfersomeで実際上同じであったということは、ポリソルベート80のエステルによる20%の置換がtransfersomeの可変形性特性に有意には影響しなかったことを示している。濾過の%回収は対照のtransfersomeでやや高かったが、それはパルミチン酸アスコルビルの包含がベシクル膜に対してごくわずかな硬直効果を有したことを示し得る。
対照のtransfersomeについて及びパルミチン酸アスコルビルエステルを含有するtransfersomeについての双方で、CMA濾過後の平均粒径は濾過前に比べてほぼ50%低下した。多分散指数がやや高かったことは、広いサイズ分布を示している。これらの特性はTransfersomeベシクルについて予想されたとおりである。
アスコルビン酸アッセイ
パルミチン酸アスコルビルtransfersomeにおけるパルミチン酸アスコルビルの総濃度は0.61mMと測定された。これは253μg/mlのパルミチン酸アスコルビル及び107μg/mlのアスコルビン酸と同じである。濃度が製造工程の出発での濃度のおよそ50%だったということは、たぶん、濾過とアスコルビン酸の酸化の組み合わせを介して損失が生じたことを示している。しかしながら、結果は、Fe3+を還元することができる活性のあるアスコルビン酸が最終的なtransfersome調製物に存在することを示した。
パルミチン酸アスコルビルtransfersomeにおけるパルミチン酸アスコルビルの総濃度は0.61mMと測定された。これは253μg/mlのパルミチン酸アスコルビル及び107μg/mlのアスコルビン酸と同じである。濃度が製造工程の出発での濃度のおよそ50%だったということは、たぶん、濾過とアスコルビン酸の酸化の組み合わせを介して損失が生じたことを示している。しかしながら、結果は、Fe3+を還元することができる活性のあるアスコルビン酸が最終的なtransfersome調製物に存在することを示した。
パルミチン酸アスコルビルtransfersomeの外表面で反応したアスコルビン酸の濃度は0.13mMと測定された。これは、外部につなぎ止められているアスコルビン酸の23μg/mlまたは総濃度の21%と同じである。
0.2μmの無菌フィルターで濾過した後のアスコルビン酸の総濃度または外部濃度に有意な変化はなかった。
連続膜適応性アッセイ(CMA)に供されたtransfersomeのパルミチン酸アスコルビルの総濃度はCMA前よりもやや高かった。アスコルビン酸の外部濃度は実際上、CMA前後で同じだった。これは、その平均径より小さい孔サイズを変形して通過したtransfersomeがその還元活性を失っていないことを示していた。
カルボキシルエステラーゼ消化及びRP−HPLC
パルミチン酸アスコルビルエステルを含有するtransfersomeのカルボキシルエステラーゼ1酵素とのインキュベートは、37℃での2時間のインキュベート後15%(16μg/ml)の、及び37℃での4時間のインキュベート後36%(38μg/ml)の総アスコルビン酸の解放を生じた。従って、transfersomeの外表面につなぎ止められたアスコルビン酸は酵素にアクセス可能だった。外部アスコルビン酸について得られた濃度はアスコルビン酸アッセイで得られたものに類似していた。
パルミチン酸アスコルビルエステルを含有するtransfersomeのカルボキシルエステラーゼ1酵素とのインキュベートは、37℃での2時間のインキュベート後15%(16μg/ml)の、及び37℃での4時間のインキュベート後36%(38μg/ml)の総アスコルビン酸の解放を生じた。従って、transfersomeの外表面につなぎ止められたアスコルビン酸は酵素にアクセス可能だった。外部アスコルビン酸について得られた濃度はアスコルビン酸アッセイで得られたものに類似していた。
CMA可変形性濾過アッセイに供されたtransfersomeをカルボキシルエステラーゼI酵素ともインキュベートして37℃での2時間のインキュベート後9%(13μg/ml)の、及び37℃での4時間のインキュベート後19%(26μg/ml)の総アスコルビン酸の解放を生じた。CMA後、解放の比率が何故低いのかは不明瞭であるが、たぶん、ベシクルサイズの変化が酵素へのパルミチン酸アスコルビルのアクセス性を低下させた。
濾紙電気泳動
対照transfersome及びパルミチン酸アスコルビルを含有するtransfersomeが双方とも電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは、正の正味電荷を明らかにしている。従って、パルミチン酸アスコルビルの存在はtransfersomeの電荷特性を変えなかった。
対照transfersome及びパルミチン酸アスコルビルを含有するtransfersomeが双方とも電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは、正の正味電荷を明らかにしている。従って、パルミチン酸アスコルビルの存在はtransfersomeの電荷特性を変えなかった。
実施例製剤15及びその製造と試験
製剤15は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(7.66mg/g)、AOIとしてのパルミトイルトリペプチド1(0.370mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.7)、及びエタノール(48.10mg/g);または脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(7.66mg/g)、AOIとしてのパルミトイルテトラペプチド7(0.450mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.7)、及びエタノール(48.40mg/g)のいずれかを含む。
製剤15は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(7.66mg/g)、AOIとしてのパルミトイルトリペプチド1(0.370mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.7)、及びエタノール(48.10mg/g);または脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(7.66mg/g)、AOIとしてのパルミトイルテトラペプチド7(0.450mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.7)、及びエタノール(48.40mg/g)のいずれかを含む。
要約
10%のポリソルベート80のモル置換にて共有結合したペプチド:テトラペプチド−7及びトリペプチド−1を含有するようにTransfersome調製物を上手く製造した。試験結果は、transfersomeのサイズ分布、可変形性特性及び電荷がペプチドの包含によって影響を受けないことを示した。
10%のポリソルベート80のモル置換にて共有結合したペプチド:テトラペプチド−7及びトリペプチド−1を含有するようにTransfersome調製物を上手く製造した。試験結果は、transfersomeのサイズ分布、可変形性特性及び電荷がペプチドの包含によって影響を受けないことを示した。
製造
大豆ホスファチジルコリン(Lipoid SPC S−100)とパルミトイルテトラペプチド−7(PAL−GQPR)またはパルミトイルトリペプチド−1(PAL−GHK)(Sinoway Industrial社)を含有するポリソルベート80を用いてTransfersomeを調製した。transfersomeの対照バッチも作製した。
大豆ホスファチジルコリン(Lipoid SPC S−100)とパルミトイルテトラペプチド−7(PAL−GQPR)またはパルミトイルトリペプチド−1(PAL−GHK)(Sinoway Industrial社)を含有するポリソルベート80を用いてTransfersomeを調製した。transfersomeの対照バッチも作製した。
パルミトイルペプチドTransfersomeの調製
13.3:0.9:0.1の大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80:パルミトイルペプチドのモル比で50gバッチのパルミトイルテトラペプチド−7transfersome及び50gバッチのパルミトイルトリペプチド−1transfersomeを調製した。
13.3:0.9:0.1の大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80:パルミトイルペプチドのモル比で50gバッチのパルミトイルテトラペプチド−7transfersome及び50gバッチのパルミトイルトリペプチド−1transfersomeを調製した。
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン(3.44g)とポリソルベート80(0.383g)とEITHERパルミトイルテトラペプチド−7(0.0224g)またはパルミトイルトリペプチド−1(0.0186g)のいずれかとをエタノールに溶解して6.26gの総重量を得た。
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、リン酸緩衝液pH7.7(43.74g)を35℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ15分間撹拌した。
4バール圧の窒素によって35℃にてSartorius47mmフィルターシステムを用いて、0.2μmのフィルター、その後0.1μmのフィルター、さらに0.1μmのフィルターを介して押し出すことによりtransfersomeを調製した。各フィルターは上にグラスファイバーのプレフィルターを有した。Transfersomeを暗所にて+5℃で保存した。
対照Transfersomeの調製
大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80の13.3:1のモル比で50gバッチの対照transfersomeを調製した。
大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80の13.3:1のモル比で50gバッチの対照transfersomeを調製した。
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン(3.44g)とポリソルベート80(0.425g)をエタノールに溶解して6.26gの総重量を得た。
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、リン酸緩衝液(pH7.7)(43.74g)を35℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ15分間撹拌した。
パルミトイルペプチドtransfersomeのバッチについて記載したように対照transfersomeを押し出した。Transfersomeを+5℃で暗所に保存した。
分析方法
粒度測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってtransfersome調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
粒度測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってtransfersome調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
ALV−5000/E光子相関分光計を用いて各試料の平均粒度及び粒度分布を測定した。試料を脱イオン水で希釈して50〜500kHzの範囲内で検出可能なシグナルを得、次いで各30秒の持続時間で6回の測定にわたって分析した。温度は25℃で制御した。正規化適合累積二次分析にデータを供して試料の粒度分布(wまたは幅として報告された)と同様に平均粒度(rまたは平均半径として報告された)を得た。平均半径に2を乗じて平均直径(nm)を得た。
各試料についての多分散指数(PDI)は以下の方程式:
(式中、w=幅、r=平均半径)
に従って算出した。
(式中、w=幅、r=平均半径)
に従って算出した。
連続膜適応性アッセイ
連続膜適応性(CMA)アッセイは印加された圧力を用いてtransfersomeに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、transfersomeの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
連続膜適応性(CMA)アッセイは印加された圧力を用いてtransfersomeに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、transfersomeの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
濾過装置の基底部における濾過サポートにAnodisc13膜フィルター(孔サイズ20nm)を装填し、上部のステンレススチールのバレルを連結した。25℃で予備平衡化した3mlのtransfersome試料をバレルに入れ、熱循環装置(25℃)に接続した熱伝導チューブがその周りに巻き付けられた。窒素シリンダーに接続した圧力チューブにバレルを接続した。一連の弁を用いて、9.5バール圧の設定点でシステムの事前準備を行って7.5バールの出発圧を得た。エクセルコンピュータプログラムに接続した正確な秤量バランス上に置かれた回収容器上に濾過装置を置いた。Bronkhurst圧力コントローラを用いて圧力を制御し、モニターし、且つ、システムの弁が開放され、計時が開始した場合、バランス上で回収されたtransfersome濾液の増加する質量を低下する圧力と増加する時間に対して記録した。
MathCADプログラムで時間、圧力、質量データを評価してP*値を決定した。P*は、孔の浸透に必要とされる活性化圧力の基準なので、transfersomeの膜の剛性の基準である。transfersomeの平均粒度はCMA濾過の前後で光子相関分光測定によって測定した。
ペプチド濃度(CBQCA)アッセイ
アミノ酸配列、グリシン−ヒスチジン−グリシンを伴ったパルミトイルトリペプチド−1のペプチド部分の濃度は、3−(4−カルボキシベンゾイル)キノロン−2−カルボキシアルデヒド(CBQCA)によってリジンアミノ酸の1級アミノ基を誘導体化して蛍光生成物を得ることにより測定した。
アミノ酸配列、グリシン−ヒスチジン−グリシンを伴ったパルミトイルトリペプチド−1のペプチド部分の濃度は、3−(4−カルボキシベンゾイル)キノロン−2−カルボキシアルデヒド(CBQCA)によってリジンアミノ酸の1級アミノ基を誘導体化して蛍光生成物を得ることにより測定した。
パルミトイルトリペプチド−1transfersome及び対照transfersomeの試料を0.1mMのホウ酸ナトリウム緩衝液、pH9.3にて1/400〜1/3200の範囲で希釈した。このアッセイに適合した水性条件にパルミトイルトリペプチド−1を可溶化することは可能ではないので;transfersomeにおけるトリペプチド−1の濃度の測定はウシ血清アルブミン(BSA)の検量線に対して行った。既知の濃度のBSAを調製して6.7μg/ml〜0.33μg/mlLの範囲を得るように調製した。標準及び試料の一次アミンの誘導体化は、シアン化カリウムの存在下で1時間室温にてCBQCA試薬によるマイクロプレート方式で行った。測定は、励起波長485nm及び蛍光放射波長520nmによるBMG Fluostar Optima蛍光計で読み取ることによって行った。
0.1mMのホウ酸ナトリウム緩衝液、pH9.3のブランク試料の蛍光読み取りをデータすべてから差し引いた。BSA標準から得られた蛍光測定を線形回帰によって分析して検量線のための方程式を作出した。次いで、同等の希釈での対照transfersomeの蛍光を差し引いた後、BSA曲線と比べたパルミトイルトリペプチド−1transfersomeにおけるペプチドの量を決定した。
濾紙電気泳動
2つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてtransfersome調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のpHでの粒子の正味電荷によって決定される。
2つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてtransfersome調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のpHでの粒子の正味電荷によって決定される。
各試験試料の容量(100μl)を個々の2×20cmのWhatman濾紙片(pH5.75での泳動緩衝液:2.3mg/mlの塩化ナトリウム、1.5mg/mlの塩化カルシウム、1.3mg/mlのグリシルグリシン、25mg/mlのマンニトール、10mg/mlのスクロース及び0.5mg/mlのメチオニンによって事前に濡らした)の中央の載せ、130Vで2時間泳動した。PEG(ポリソルベート80の成分)について5%w/vの塩化バリウム及び0.05Mのヨウ素によって各濾紙片を染色し、その後乾燥させた。各試料の中心点から離れたtransfersomeの移動の程度を濾紙片の陽極側及び陰極側の双方で測定し、ベシクルの正味電荷を決定した。
結果及び考察
結果を表5にて要約する。
表5パルミトイルペプチドTransfersomeの分析
結果を表5にて要約する。
表5パルミトイルペプチドTransfersomeの分析
粒度測定
対照のtransfersomeについて及びパルミトイルペプチドを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、transfersomeにおけるポリソルベート80のパルミトイルペプチドによる10%の置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。
対照のtransfersomeについて及びパルミトイルペプチドを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、transfersomeにおけるポリソルベート80のパルミトイルペプチドによる10%の置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。
連続膜適応性アッセイ
可変形性P*値は、対照transfersomeについて及びパルミトイルペプチドを含有するものについて類似していた。パルミトイルテトラペプチド−7transfersomeについての値がやや低かったということは、ポリソルベート80のエステルによる10%の置換がベシクルをさらに可変形にする膜に対する軽い軟化効果を有し得たことを示している。しかしながら、これは、対照に比べてパルミトイルペプチドtransfersomeについて類似していた濾過%回収では明らかにされなかったので、低いP*はたぶん有意ではない。
可変形性P*値は、対照transfersomeについて及びパルミトイルペプチドを含有するものについて類似していた。パルミトイルテトラペプチド−7transfersomeについての値がやや低かったということは、ポリソルベート80のエステルによる10%の置換がベシクルをさらに可変形にする膜に対する軽い軟化効果を有し得たことを示している。しかしながら、これは、対照に比べてパルミトイルペプチドtransfersomeについて類似していた濾過%回収では明らかにされなかったので、低いP*はたぶん有意ではない。
CMA濾過後の平均粒径は対照transfersomeについて及びパルミトイルペプチドを含有するtransfersomeについての双方で濾過前に比べて約50%低下した。多分散指数がやや高かったということは、広いサイズ分布を示している。これらの特性はtransfersomeベシクルについて予想された通りである。
ペプチド濃度(CBQCA)アッセイ
パルミトイルテトラペプチド−7は、試薬と反応する配列にてリジン残基を欠如するためにCBQCAアッセイにおける結果を生じなかった。しかしながら、パルミトイルトリペプチド−1はリジンを含有するので検出可能だった。アッセイに適合した水性条件にてパルミトイルトリペプチド−1を可溶化することはできなかったので、transfersomeにおけるトリペプチド−1の濃度の測定はウシ血清アルブミン(BSA)標準に対して行わなければならなかった。BSAは58のリジン残基を伴った66kDaのタンパク質で1138Daのペプチド当たり約1個のリジンである。当該ペプチドは340Daにて1つのリジンを含有する。BSAとペプチドの間でのリジンの濃度の差異を補正することによって量を提供する試みを行ったが、総ペプチドは依然として過剰見積もりされると思われ、理論上の221μg/mlに比べて424μg/mlだった。
パルミトイルテトラペプチド−7は、試薬と反応する配列にてリジン残基を欠如するためにCBQCAアッセイにおける結果を生じなかった。しかしながら、パルミトイルトリペプチド−1はリジンを含有するので検出可能だった。アッセイに適合した水性条件にてパルミトイルトリペプチド−1を可溶化することはできなかったので、transfersomeにおけるトリペプチド−1の濃度の測定はウシ血清アルブミン(BSA)標準に対して行わなければならなかった。BSAは58のリジン残基を伴った66kDaのタンパク質で1138Daのペプチド当たり約1個のリジンである。当該ペプチドは340Daにて1つのリジンを含有する。BSAとペプチドの間でのリジンの濃度の差異を補正することによって量を提供する試みを行ったが、総ペプチドは依然として過剰見積もりされると思われ、理論上の221μg/mlに比べて424μg/mlだった。
濾紙電気泳動
対照transfersome及びパルミトイルペプチドを含有するtransfersomeはすべて電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは正の正味電荷を明らかにしている。従って、パルミトイルテトラペプチド−7またはパルミトイルトリペプチド−1の存在はtransfersomeの電荷特性を変えなかった。
実施例製剤16及びその製造と試験
対照transfersome及びパルミトイルペプチドを含有するtransfersomeはすべて電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは正の正味電荷を明らかにしている。従って、パルミトイルテトラペプチド−7またはパルミトイルトリペプチド−1の存在はtransfersomeの電荷特性を変えなかった。
実施例製剤16及びその製造と試験
製剤16は、脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g)、界面活性剤としてのTween80(6.55mg/g)、AOIとしてのナプロキセン/ポリソルベート(2.195mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.7)、及びエタノール(47.56mg/g);または脂質としてのホスファチジルコリン(68.700mg/g))、界面活性剤としてのTween80(5.80mg/g)、AOIとしてのジクロフェナク/ポリソルベート(2.96mg/g)、リン酸緩衝液(pH7.7)、及びエタノール(47.54mg/g)のいずれかを含む。
要約
20%のポリソルベート80のモル置換で共有結合した非ステロイド性抗炎症剤(NSAID):ナプロキセン及びジクロフェナクを含有するようにTransfersome調製物を上手く製造した。試験結果は、transfersomeのサイズ分布、可変形性特性及び電荷はNSAIDの包含によって影響されないこと、NSAIDエステルはtransfersomeの外表面上でカルボキシルエステラーゼ酵素にアクセス可能であること、及びNSAIDtransfersomeは対照transfersome単独よりもCOX−1酵素阻害アッセイにて大きな阻害効果を有することを示した。NSAIDtransfersomeは、変形してその平均サイズよりも小さい孔を通った後、その阻害活性を保持した。
20%のポリソルベート80のモル置換で共有結合した非ステロイド性抗炎症剤(NSAID):ナプロキセン及びジクロフェナクを含有するようにTransfersome調製物を上手く製造した。試験結果は、transfersomeのサイズ分布、可変形性特性及び電荷はNSAIDの包含によって影響されないこと、NSAIDエステルはtransfersomeの外表面上でカルボキシルエステラーゼ酵素にアクセス可能であること、及びNSAIDtransfersomeは対照transfersome単独よりもCOX−1酵素阻害アッセイにて大きな阻害効果を有することを示した。NSAIDtransfersomeは、変形してその平均サイズよりも小さい孔を通った後、その阻害活性を保持した。
製造
大豆ホスファチジルコリン(Lipoid SPC S−100)と、ナプロキセン/ポリソルベート80(Key Organics DK−0035−3)またはジクロフェナク/ポリソルベート80(Key Organics DK−0036−3)のいずれかを含有するポリソルベート80とを用いてTransfersomeを調製した。transfersomeの対照バッチも作製した。
大豆ホスファチジルコリン(Lipoid SPC S−100)と、ナプロキセン/ポリソルベート80(Key Organics DK−0035−3)またはジクロフェナク/ポリソルベート80(Key Organics DK−0036−3)のいずれかを含有するポリソルベート80とを用いてTransfersomeを調製した。transfersomeの対照バッチも作製した。
NSAIDのTransfersomeの調製
13.3:0.8:0.2の大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80:NSAID/ポリソルベート80のモル比(NSAID/ポリソルベート80エステルの純度を構成する)で20gバッチのナプロキセン/ポリソルベートtransfersome及び20gバッチのジクロフェナク/ポリソルベートtransfersomeを調製した。
13.3:0.8:0.2の大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80:NSAID/ポリソルベート80のモル比(NSAID/ポリソルベート80エステルの純度を構成する)で20gバッチのナプロキセン/ポリソルベートtransfersome及び20gバッチのジクロフェナク/ポリソルベートtransfersomeを調製した。
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン(1.374g)をポリソルベート80(0.131g)とナプロキセン/ポリソルベート(0.0439g)またはポリソルベート80(0.116g)とジクロフェナク/ポリソルベート(0.0592g)と共にエタノールに溶解し、2.50gの総重量を得た。
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、リン酸緩衝液(pH7.7)(17.50g)を35℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ15分間撹拌した。
4バール圧の窒素によって35℃にてSartorius47mmフィルターシステムを用いて、0.2μmのフィルター、その後0.1μmのフィルター、さらに0.1μmのフィルターを介して押し出すことによりtransfersomeを調製した。各フィルターは上にグラスファイバーのプレフィルターを有した。Transfersomeを暗所にて+5℃で保存した。
対照Transfersomeの調製
13.3:1の大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80のモル比で50gバッチの対照transfersomeを調製した。
13.3:1の大豆ホスファチジルコリン:ポリソルベート80のモル比で50gバッチの対照transfersomeを調製した。
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン(3.44g)とポリソルベート80(0.425g)をエタノールに溶解し、6.26gの総重量を得た。
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、リン酸緩衝液(pH7.7)(43.74g)を35℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ15分間撹拌した。
NSAIDのtransfersomeについて記載されたように対照transfersomeを押し出した。Transfersomeを暗所にて+5℃で保存した。
分析法
粒度測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってtransfersome調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
粒度測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってtransfersome調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
ALV−5000/E光子相関分光計を用いて各試料の平均粒度及び粒度分布を測定した。試料を脱イオン水で希釈して50〜500kHzの範囲内で検出可能なシグナルを得、次いで各30秒の持続時間で6回の測定にわたって分析した。温度は25℃で制御した。正規化適合累積二次分析にデータを供して試料の粒度分布(wまたは幅として報告された)と同様に平均粒度(rまたは平均半径として報告された)を得た。平均半径に2を乗じて平均直径(nm)を得た。
各試料についての多分散指数(PDI)は以下の方程式:
(式中、w=幅、r=平均半径)
に従って算出した。
(式中、w=幅、r=平均半径)
に従って算出した。
連続膜適応性アッセイ
連続膜適応性(CMA)アッセイは印加された圧力を用いてtransfersomeに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、transfersomeの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
連続膜適応性(CMA)アッセイは印加された圧力を用いてtransfersomeに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、transfersomeの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
濾過装置の基底部における濾過サポートにAnodisc13膜フィルター(孔サイズ20nm)を装填し、上部のステンレススチールのバレルを連結した。25℃で予備平衡化した3mlのtransfersome試料をバレルに入れ、熱循環装置(25℃)に接続した熱伝導チューブがその周りに巻き付けられた。窒素シリンダーに接続した圧力チューブにバレルを接続した。一連の弁を用いて、9.5バール圧の設定点でシステムの事前準備を行って7.5バールの出発圧を得た。エクセルコンピュータプログラムに接続した正確な秤量バランス上に置かれた回収容器上に濾過装置を置いた。Bronkhurst圧力コントローラを用いて圧力を制御し、モニターし、且つ、システムの弁が開放され、計時が開始した場合、バランス上で回収されたtransfersome濾液の増加する質量を低下する圧力と増加する時間に対して記録した。
MathCADプログラムで時間、圧力、質量データを評価してP*値を決定した。P*は、孔の浸透に必要とされる活性化圧力の基準なので、transfersomeの膜の剛性及び可変形性の基準である。transfersomeの平均粒度はCMA濾過の前後で光子相関分光計によって測定した。
カルボキシルエステラーゼ消化及びRP−HPLC
カルボキシルエステラーゼ1アイソフォームB(SigmaE0287)を用いたエステルの酵素消化によって、2つの化合物のいずれかのポリソルベート80エステルを含有するtransfersomeの外表面から、つなぎ止められた非ステロイド性抗炎症薬(NSAID):ジクロフェナクまたはナプロキセンの解放を行った。transfersomeのml当たり960単位の酵素を添加し、その後+37℃でインキュベートした。4時間で試料を採取し、1容量のアセトニトリル/メタノール/ギ酸(80v/20v/0.2v)を加えることによって、解放されたNSAIDを抽出し、その後、5分間の超音波処理と遠心分離を行って不溶性成分を沈殿させた。次いで、上清試料を0.2μmの膜を介して濾過し、その後、超純水で1/10に希釈した。
カルボキシルエステラーゼ1アイソフォームB(SigmaE0287)を用いたエステルの酵素消化によって、2つの化合物のいずれかのポリソルベート80エステルを含有するtransfersomeの外表面から、つなぎ止められた非ステロイド性抗炎症薬(NSAID):ジクロフェナクまたはナプロキセンの解放を行った。transfersomeのml当たり960単位の酵素を添加し、その後+37℃でインキュベートした。4時間で試料を採取し、1容量のアセトニトリル/メタノール/ギ酸(80v/20v/0.2v)を加えることによって、解放されたNSAIDを抽出し、その後、5分間の超音波処理と遠心分離を行って不溶性成分を沈殿させた。次いで、上清試料を0.2μmの膜を介して濾過し、その後、超純水で1/10に希釈した。
+25℃でのKinetex C18 5μm、100A、4.6×150mmカラム及びWaters2695分離モジュールと、溶離液Aが超純水における0.1%トリフルオロ酢酸であり、溶離液Bがアセトニトリルにおける0.1%トリフルオロ酢酸である以下の表のような勾配法とを用いた逆相高圧クロマトグラフィ(RP−HPLC)法によって試料をアッセイした。NSAID双方の検出は、Waters2487検出器を用いて254nmの波長で行った。
加えて、同じRP−HPLC法を用いて0.4〜91μg/mlの範囲でのNSAIDそれぞれの検量線を分析した。試料及び標準について得られたクロマト図にてNSAIDのピークをまとめた。標準のピーク面積を線形回帰によって解析し、検量線のための方程式を作出した。次いで試料のピーク面積を用いて、抽出法からの希釈を考慮に入れる各検量線の方程式から、解放されたNSAIDの濃度を決定した。その濃度を理論上のNSAIDの総濃度と比較してNSAIDのtransfersomeの外表面から解放された%NSAIDを算出した。
シクロオキシゲナーゼ−1阻害アッセイ
シクロオキシゲナーゼ1(COX−1)阻害アッセイは、COX−1酵素の活性を阻害するNSAIDのような薬剤の能力を測定する。COX−1はアラキドン酸のプロスタグランジンH2への変換を触媒する。反応の間に酵素は酸素を消費する。酸素消費の速度(ナノモル/分)は反応速度の基準であり、阻害剤の存在下で低下する。
シクロオキシゲナーゼ1(COX−1)阻害アッセイは、COX−1酵素の活性を阻害するNSAIDのような薬剤の能力を測定する。COX−1はアラキドン酸のプロスタグランジンH2への変換を触媒する。反応の間に酵素は酸素を消費する。酸素消費の速度(ナノモル/分)は反応速度の基準であり、阻害剤の存在下で低下する。
Oxygraphプラスソフトウエアに接続された較正したClark酸素電極を含むHansatech Oxygraphシステムを用いてCOX阻害アッセイを設定した。0.1mMのリン酸カリウム、pH7.2、2.0mMのフェノール、1μMのヘマチンを含有する反応混合物を37℃の反応チャンバーにて安定な酸素のベースラインが達成されるまで撹拌した。340単位のCOX−1酵素(Cayman Chemicals CAY60100)を加え1分間平衡化させた後、アラキドン酸基質を加えた。最終濃度8、16、32及び64μMのにてアラキドン酸を用いて一連の対照反応を行った。各反応について、Oxygraphの酸素曲線上で最大反応速度を測定した。
transfersome試料の阻害効果を測定するために、対照、ナプロキセンまたはジクロフェナクのtransfersomeを室温で10分間アラキドン酸と事前混合し、その後、アラキドン酸混合物を反応に加えた。反応におけるアラキドン酸の最終濃度が8、16、32及び64μMになるように濃度を選択した。
対照、対照transfersome及びNSAIDtransfersomeの反応の反応速度(酸素のナノモル/ml/分)に対してアラキドン酸の濃度をプロットし、4つの基質濃度での反応速度を比較し、速度の低下を平均することによって%阻害について値を算出した。ラインウィーバー・バークの逆数プロット(1/反応速度に対する1/アラキドン酸濃度)もプロットした。
ベシクルが変形してその平均径より小さい孔を通過するのを可能にする活性化エネルギーを提供する印加圧を用いる連続膜適応性(CMA)アッセイで処理されたtransfersomeの試料においてもCOX−1阻害アッセイを行った。
濾紙電気泳動
2つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてtransfersome調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のpHでの粒子の正味電荷によって決定される。
2つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてtransfersome調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のpHでの粒子の正味電荷によって決定される。
各試験試料の容量(100μl)を個々の2×20cmのWhatman濾紙片(pH5.75での泳動緩衝液:2.3mg/mlの塩化ナトリウム、1.5mg/mlの塩化カルシウム、1.3mg/mlのグリシルグリシン、25mg/mlのマンニトール、10mg/mlのスクロース及び0.5mg/mlのメチオニンによって事前に濡らした)の中央の載せ、130Vで2時間泳動した。PEG(ポリソルベート80の成分)について5%w/vの塩化バリウム及び0.05Mのヨウ素によって各濾紙片を染色し、その後乾燥させた。各試料の中心点から離れたtransfersomeの移動の程度を濾紙片の陽極側及び陰極側の双方で測定し、ベシクルの正味電荷を決定した。
結果及び考察
結果を表6にて要約する。
表6対照及びNSAIDのTransfersomeの分析
結果を表6にて要約する。
表6対照及びNSAIDのTransfersomeの分析
粒度測定
対照transfersomeについて及びNSAID/ポリソルベート80エステルを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、transfersomeにおけるナプロキセン/ポリソルベート80またはジクロフェナク/ポリソルベート80のいずれかによるポリソルベート80の20%置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。
対照transfersomeについて及びNSAID/ポリソルベート80エステルを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、transfersomeにおけるナプロキセン/ポリソルベート80またはジクロフェナク/ポリソルベート80のいずれかによるポリソルベート80の20%置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。
連続膜適応性アッセイ
可変形性P*値は、対照transfersomeよりもNSAID/ポリソルベートエステルを含有するtransfersomeの方がやや低かったということは、ナプロキセン/ポリソルベート80またはジクロフェナク/ポリソルベートのいずれかによるポリソルベート80の20%置換が、ベシクルをさらに可変形にする軽い軟化効果を膜に対して有していたことを示している。このことは、対照に比べてナプロキセンまたはジクロフェナクのtransfersomeについての方が増加していた濾過%回収においても明らかだった。
可変形性P*値は、対照transfersomeよりもNSAID/ポリソルベートエステルを含有するtransfersomeの方がやや低かったということは、ナプロキセン/ポリソルベート80またはジクロフェナク/ポリソルベートのいずれかによるポリソルベート80の20%置換が、ベシクルをさらに可変形にする軽い軟化効果を膜に対して有していたことを示している。このことは、対照に比べてナプロキセンまたはジクロフェナクのtransfersomeについての方が増加していた濾過%回収においても明らかだった。
CMA濾過後の平均粒径は、濾過前にくらべて対照transfersomeについて及びNSAID−ポリソルベートエステルを含有するtransfersomeについての双方でほぼ50%低下した。多分散指数がやや高かったということは広いサイズ分布を示している。これらの特性はtransfersomeベシクルについて予想どおりである。
カルボキシルエステラーゼ消化及びRP−HPLC
NSAID/ポリソルベートエステルを含有するtransfersomeのカルボキシルエステラーゼ1酵素とのインキュベートはNSAID総濃度の3〜6%の間の解放を生じたということは、transfersomeの外表面につなぎ止められたナプロキセンまたはジクロフェナクの少ない割合が酵素にアクセス可能であることを示している。
NSAID/ポリソルベートエステルを含有するtransfersomeのカルボキシルエステラーゼ1酵素とのインキュベートはNSAID総濃度の3〜6%の間の解放を生じたということは、transfersomeの外表面につなぎ止められたナプロキセンまたはジクロフェナクの少ない割合が酵素にアクセス可能であることを示している。
シクロオキシゲナーゼ−1阻害アッセイ
NSAID/ポリソルベートエステルを含有するTransfersomeは、対照transfersomeよりも大きな比率でシクロオキシゲナーゼ−1(COX−1)酵素の反応の速度を阻害した。対照transfersomeはCOX−1酵素を阻害すると予想されたが、既知のCOX−1阻害剤であるナプロキセンまたはジクロフェナクをtransfersomeの外表面につなぎ止めることはその阻害効果をさらに高めた。
NSAID/ポリソルベートエステルを含有するTransfersomeは、対照transfersomeよりも大きな比率でシクロオキシゲナーゼ−1(COX−1)酵素の反応の速度を阻害した。対照transfersomeはCOX−1酵素を阻害すると予想されたが、既知のCOX−1阻害剤であるナプロキセンまたはジクロフェナクをtransfersomeの外表面につなぎ止めることはその阻害効果をさらに高めた。
図1及び図2はそれぞれ、反応の速度に対してプロットしたアラキドン酸基質の濃度及び逆数(ラインウィーバー・バーク)プロットを示す。
連続膜適応性(CMA)アッセイにてその平均サイズよりも小さい穴を通過するように変形したTransfersomeはCOX−1酵素を阻害する能力を保持していた。
図3及び図4はCMA後の試料についてそれぞれ、反応の速度に対してプロットしたアラキドン酸基質の濃度及び逆数(ラインウィーバー・バーク)プロットを示す。
COX−1酵素の%阻害は3種のtransfersome調製物すべてについてCMAアッセイ後やや低かった。このことは、NSAIDの活性の損失ではなく濾過によって生じたtransfersomeと会合したNSAIDの濃度の低下によるものであると仮定された。匹敵するtransfersomeの濃度の指示は光子相関分光分析から得られた。CMA後の試料についての周波数シグナルの強度はCMA前に比べて低下していたが、CMA後の様々な濾過回収にもかかわらず、対照とNSAIDのtransfersomeについて類似することが見いだされた。
濾紙電気泳動
対照transfersome及びNSAID/ポリソルベートエステルを含有するtransfersomeはすべて電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは、正の正味電荷を明らかにしている。従って、ナプロキセンまたはジクロフェナクの存在はtransfersomeの電荷特性を変えなかった。
対照transfersome及びNSAID/ポリソルベートエステルを含有するtransfersomeはすべて電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは、正の正味電荷を明らかにしている。従って、ナプロキセンまたはジクロフェナクの存在はtransfersomeの電荷特性を変えなかった。
Claims (18)
- 脂質と界面活性剤と関心のある作用物質(AOI)とを含むベシクル製剤であって、
各AOI分子の一部がベシクルの外側にあり、ベシクル膜の外にあるよう前記AOIがベシクルの成分に結合される、前記ベシクル製剤。 - 前記AOIが前記ベシクルの界面活性剤成分に結合する、請求項1に記載の製剤。
- 前記AOIが前記ベシクルの脂質成分に結合する、請求項1または2に記載の製剤。
- ベシクルの界面活性剤成分及び脂質成分双方が、それらに結合するAOIを有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製剤。
- 単一のAOIがベシクル成分に結合する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製剤。
- 複数のAOIがベシクル成分に結合する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記結合が共有結合である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記AOIが均質である、請求項6に記載の製剤。
- 前記AOIが不均質である、請求項6に記載の製剤。
- 前記AOIが元素、イオン、無機塩、小分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、微量栄養素、高分子または大環状分子から成る群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記AOIが、皮膚の構造タンパク質(たとえば、エラスチンまたはコラーゲン)、治療用タンパク質、炭水化物、発色団含有の高分子(たとえば、ポルフィリン)、ビタミン、金属または金属塩、非金属元素または非金属塩、メラニンまたはメラニン類似体、または抗炎症剤(たとえば、NSAID)から成る群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の製剤。
- 患者の皮膚を介してAOIを送達するのに使用するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記製剤が局所に塗布される、請求項12に記載の製剤。
- 患者の皮膚を介したAOIの送達方法であって、前記方法が、皮膚に浸透してAOIを送達するのに十分な量にて請求項1〜11のいずれか1項に記載のベシクル製剤を患者の皮膚に局所で塗布することを含む、前記送達方法。
- 前記ベシクル製剤が、それぞれ異なるAOIを伴った、請求項8〜11に記載のものであり、または請求項1〜6または10または11に記載のベシクルの混合物を含む製剤である、請求項14に記載のAOIの送達方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の製剤の作製方法であって、前記方法が、AOIの一部がベシクルの外側にあり、ベシクル膜の外にあるようにAOIをベシクル成分に連結することを含む、前記作製方法。
- 疾患を治療するのに使用するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のベシクル製剤。
- スキンケアまたは化粧品で使用するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のベシクル製剤。
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