BR112016001975B1

BR112016001975B1 - Método para processar biomassa lignocelulósica

Info

Publication number: BR112016001975B1
Application number: BR112016001975-0A
Authority: BR
Inventors: Jan Larsen; Martin Dan Jeppesen; Kit Kellebjerg Mogensen; Niels Nielsen Poulsen
Original assignee: Inbicon A/S
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2021-09-14
Also published as: ZA201501344B; PL2880172T3; PH12015500080A1; US20240102064A1; CN104540956B; CN105492615A; CA2919521A1; DK2880172T3; MX2016001366A; EP2880172A1; ES2687688T3; IN2015DN00118A; MY178574A; KR20150041796A; AU2013299022A1; WO2014019589A1; AP3964A; EA026271B9; CN104540956A; AU2013299022B2

Abstract

método para processar biomassa lignocelulósica a presente invenção se refere a um método para processar biomassa que compreende: - fornecer matéria-prima de biomassa lignocelulósica mole, - pré-tratar a matéria-prima em ph dentro da faixa de 3,5 a 9,0 em um pré-tratamento hidrotérmico pressurizado de estágio único em severidade em log ro 3,75 ou menor de modo a produzir uma pasta fluida de biomassa pré-tratada em que os sólidos não dissolvidos compreendem pelo menos 5,0% em peso de xilano, e hidrolisar a biomassa pré-tratada com ou sem a adição de teor de água suplementar com o uso de hidrólise enzimática por pelo menos 24 horas catalisada por uma mistura de enzimas que compreende atividades de endoglucanase, exoglucanase, beta-glicosidase, endoxilanase e beta-xilosidase em níveis de atividade em nkat/g de glucano de endoglucanase de pelo menos 1.100, exoglucanase de pelo menos 280, beta-glicosidase de pelo menos 3.000, endoxilanase de pelo menos 1.400 e ? -xilosidase de pelo menos 75, de modo a produzir um hidrolisado em que o rendimento de monômeros c5 é pelo menos 55% do teor original de xilose e arabinose da matéria-prima antes do pré-tratamento.

Description

CAMPO

[001] A invenção refere-se, em geral, a métodos para processar biomassa lignocelulósica em açúcares fermentáveis e, em particular, a métodos que se baseiam em pré-tratamento hidrotérmico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A confiança histórica em petróleo e outros combustíveis fósseis tem sido associada a aumentos drásticos e alarmantes em níveis atmosféricos de gases do efeito estufa. Esforços internacionais estão a caminho para mitigar a acumulação de gases do efeito estufa, suportados por diretrizes de política formais em muitos países. Um foco central desses esforços de mitigação tem sido o desenvolvimento de processos e tecnologias para a utilização de biomassa vegetal renovável para substituir o petróleo como uma fonte de precursores para combustíveis e outros produtos químicos. O crescimento anual de biomassa derivada de planta na terra é estimado em aproximadamente 1 x 1011 toneladas métricas por ano em peso seco. Consultar Lieth e Whittaker (1975). A utilização de biomassa é, assim, um objetivo final no desenvolvimento de economia sustentável.

[003] O etanol combustível produzido a partir de açúcar e materiais vegetais à base de amido, tal como a cana-de-açúcar, raiz e safras de grão, já está em amplo uso, com a produção global atualmente superando 73 bilhões de litros por ano. O etanol sempre foi considerado uma alternativa aceitável aos combustíveis fósseis, sendo facilmente usável como um aditivo em mesclas de combustíveis ou mesmo diretamente como combustível para automóveis pessoais. No entanto, o uso de etanol produzido por essas tecnologias de bioetanol de "primeira geração" não atinge realmente uma redução drástica em emissão de gases do efeito estufa. As economias líquidas são apenas cerca de 13% em comparação com o petróleo, quando as entradas de combustível fóssil totais para as saídas de etanol finais são todas consideradas. Consultar Farrell et al. (2006). Além disso, objeções tanto econômicas como morais têm sido levantadas em relação ao mercado de bioetanol de "primeira geração". O mesmo efetivamente coloca a demanda por safras como alimento humano em competição direta com a demanda por automóveis pessoais. E, de fato, a demanda de etanol combustível tem estado associada a preços de grão elevados que se mostraram problemáticos para países pobres que importam grãos.

[004] Tem surgido um grande interesse no desenvolvimento de sistemas de conversão de biomassa que não consomem safras alimentícias - assim chamado biorrefino de "segunda geração", segundo o qual o bioetanol e outros produtos podem ser produzidos a partir de biomassa lignocelulósica, tal como refugos de safra (caules, espigas, caroços, troncos, carcaças, cascas, etc...), gramas, palhas, lascas de madeira, papel de refugo e similares. Na tecnologia de "segunda geração", açúcares de 6 carbonos (C6) fermentáveis derivados principalmente de celulose e açúcares de 5 carbonos (C5) fermentáveis derivados de hemicelulose são liberados de cadeias poliméricas de polissacarídeo de biomassa por hidrólise enzimática ou, em alguns casos, por hidrólise química pura. Os açúcares fermentáveis obtidos a partir da conversão de biomassa em uma biorrefinaria de "segunda geração" podem ser usados para produzir etanol combustível ou, alternativamente, outros combustíveis, tal como butanol, ou monômeros de ácido láctico para uso em bioplásticos, ou muitos outros produtos.

[005] O rendimento total de ambos os açúcares C5 e C6 é uma consideração central na comercialização de processamento de biomassa lignocelulósica. No caso da produção de etanol, e também da produção de lactato ou outras substâncias químicas, pode ser vantajoso combinar ambas as correntes de processo de açúcar C5 e C6 em uma solução de açúcar. Estão agora disponíveis organismos fermentadores modificados que podem consumir de modo eficaz ambos os açúcares C5 e C6 na produção de etanol. Consultar, por exemplo, Madhavan et al. (2012); Dumon et al. (2012); Hu et al. (2011); Kuhad et al. (2011); Ghosh et al. (2011); Kurian et al. (2010); Jojima et al. (2010); Sanchez et al. (2010); Bettiga et al. (2009); Matsushika et al. (2009).

[006] Devido às limitações de sua estrutura física, a biomassa lignocelulósica não pode ser convertida de modo eficaz em açúcares fermentáveis por hidrólise enzimática sem algum processo de pré-tratamento. Uma ampla variedade de diferentes esquemas de pré-tratamento tem sido relatada, em que cada um oferece diferentes vantagens e desvantagens. Para análise, consultar Agbor et al. (2011); Girio et al. (2010); Alvira et al. (2010); Taherzadeh e Karimi (2008). A partir de uma perspectiva ambiental e de "capacidade de renovação", os pré-tratamentos hidrotérmicos são especialmente atrativos. Esses utilizam água quente em vapor/líquido pressurizada em temperaturas na ordem de 160 a 230 °C para fundir suavemente a lignina hidrofóbica que está associada de modo complexo com filamentos de celulose, para solubilizar um componente principal de hemicelulose, rico em açúcares C5 e para romper os filamentos de celulose de modo a aprimorar a acessibilidade à ligação enzimática produtiva. Os pré- tratamentos hidrotérmicos podem ser convenientemente integrados com instalações de geração de energia elétrica alimentadas por carvão e biomassa existentes para utilizar de modo eficaz o vapor de turbina e a capacidade de produção de energia "em excesso".

[007] No caso de processos hidrotérmicos, é bem conhecido na técnica e tem sido amplamente discutido que o pré-tratamento precisa ser otimizado entre propósitos conflitantes. Por outro lado, o pré-tratamento deve preservar idealmente o teor de açúcar da hemicelulose, de modo a maximizar o rendimento final de açúcares derivados de hemicelulose monomérica. Ainda, ao mesmo tempo, o pré- tratamento deve expor e pré-condicionar de modo suficiente as cadeias de celulose à suscetibilidade de hidrólise enzimática de modo que rendimentos razoáveis de açúcares derivados de celulose monomérica possam ser obtidos com consumo mínimo de enzima. O consumo de enzima é também uma consideração central na comercialização de processamento de biomassa, que oscila à margem de “rentabilidade econômica” no contexto de “economias de mercado globais” conforme são atualmente definidos. Não obstante os aprimoramentos drásticos nos últimos anos, o alto custo de preparações enzimáticas comercialmente disponíveis permanece um dos custos operacionais mais altos na conversão de biomassa.

[008] Conforme as temperaturas de pré- tratamento hidrotérmico e tempos de residência no reator são aumentados, uma proporção maior de açúcares C5 derivados de hemicelulose é irrecuperavelmente perdida devido à transformação química em outras substâncias, incluindo furfural e produtos de reações de condensação. Temperaturas e tempos de residência ainda mais altos são exigidos a fim de condicionar de modo apropriado as fibras de celulose para hidrólise enzimática eficaz em glicose de 6 carbonos monomérica.

[009] Na técnica anterior, um parâmetro frequentemente usado de “severidade” de pré-tratamento hidrotérmico é “Ro,” que é tipicamente referido como um valor em log. Ro reflete uma medida compósita de temperatura de pré-tratamento e tempo de residência em reator de acordo com a equação: Ro= tEXP[T-100/14,75], em que t é o tempo de residência em minutos e T é a temperatura de reação em graus centígrados.

[010] A otimização das condições de pré- tratamento para qualquer dada matéria-prima de biomassa inerentemente exige alguma concessão entre demandas por altos rendimentos de açúcar C5 monomérico a partir de hemicelulose (baixa severidade) e as demandas por altos rendimentos de açúcar C6 monomérico a partir de celulose (alta severidade).

[011] Uma variedade de diferentes estratégias de pré-tratamento hidrotérmico foram relatadas para maximizar os rendimentos de açúcar a partir tanto de hemicelulose como de celulose e para minimizar a inibição de xilo-oligômero da catálise de celulase. Em alguns casos, ácidos ou bases exógenos são adicionados a fim de catalisar a degradação de hemicelulose (ácido; pH < 3,5) ou solubilização de lignina (base; pH > 9,0). Em outros casos, o pré-tratamento hidrotérmico é conduzido com o uso apenas de ácido acético muito brando a partir da própria lignocelulose (pH 3,5 a 9,0). Os pré-tratamentos hidrotérmicos sob essas condições de pH brando foram chamados de processos de “auto-hidrólise”, devido ao fato de que o ácido acético liberado dos próprios ésteres de hemicelulose catalisa adicionalmente a hidrólise de hemicelulose.

[012] Os pré-tratamentos hidrotérmicos catalisados por ácido, conhecidos como tratamentos de “ácido diluído” ou “impregnação com ácido”, tipicamente fornecem altos rendimentos de açúcares C5, já que solubilização de hemicelulose comparável pode ocorrer em temperaturas mais baixas na presença de catalisador ácido. Os rendimentos totais de açúcar C5 após o pré-tratamento com ácido diluído seguido por hidrólise enzimática são tipicamente na ordem de 75% ou mais do que poderia teoricamente ser liberado a partir de qualquer dada matéria-prima de biomassa. Consultar, por exemplo, Baboukaniu et al. (2012); Won et al. (2012); Lu et al. (2009); Jeong et al. (2010); Lee et al. (2008); Sassner et al. (2008); Thomsen et al. (2006); Chung et al. (2005).

[013] Os pré-tratamentos hidrotérmicos de auto- hidrólise, em contraste, tipicamente fornecem rendimentos muito mais baixos de açúcares C5, já que pré-tratamento em temperatura mais alta é exigido na ausência de catalisador ácido. Com exceção de pré-tratamento de auto-hidrólise conduzido em teor de matéria seca comercialmente irreal, os tratamento de auto-hidrólise tipicamente fornecem rendimentos de açúcar C5 <40% de recuperação teórica. Consultar, por exemplo, Diaz et al. (2010); Dogaris et al. (2009). Rendimentos de C5 a partir de auto-hidrólise tão altos quanto 53% foram relatados em casos em que tempos de reação comercialmente irreais e doses de enzima altas extremas foram usados. Porém, mesmo esses rendimentos de C5 muito altos permanecem bem abaixo dos níveis normalmente obtidos com o uso de pré-tratamento com ácido diluído. Consultar, por exemplo, Lee et al. (2009); Ohgren et al. (2007).

[014] Como uma consequência de rendimentos de C5 mais baixos obtidos com a auto-hidrólise, a maioria dos relatórios que se referem ao pré-tratamento hidrotérmico em sistemas de conversão de biomassa comerciais tem focado em processo com ácido diluído. Rendimentos de açúcar C5 derivado de hemicelulose na ordem de 85% foram atingidos através do uso de assim chamados pré-tratamentos com ácido diluído de “dois estágios”. Em pré-tratamentos de dois estágios, uma temperatura inicial mais baixa é usada para solubilizar a hemicelulose, em seguida a fração líquida rica em C5 é separada. No segundo estágio, uma temperatura mais alta é usada para condicionar as cadeias de celulose. Consultar, por exemplo, Mesa et al. (2011); Kim et al. (2011); Chen et al. (2010); Jin et al. (2010); Monavari et al. (2009); Soderstrom et al. (2005); Soderstrom et al. (2004); Soderstrom et al. (2003); Kim et al. (2001); Lee et al. (1997); Paptheofanous et al. (1995). Um sistema de pré-tratamento com ácido diluído de ”dois estágios” elaborado relatado pelo US National Renewable Energy Laboratory (NREL) alega ter atingido rendimentos de C5 na ordem de 90% com o uso de palha de milho como matéria-prima. Consultar Humbird et al. (2011).

[015] Não obstante os rendimentos de C5 mais baixos que fornece, a auto-hidrólise continua a oferecer vantagens competitivas em relação aos pré-tratamentos com ácido diluído em escala comercial.

[016] A mais notável dentre as vantagens dos processos de auto-hidrólise é que a lignina não hidrolisada residual tem valor de mercado altamente intensificado em comparação à lignina recuperada de processos com ácido diluído. Em primeiro lugar, o ácido sulfúrico tipicamente usado em pré-tratamento com ácido diluído confere um teor de enxofre residual. Isso torna a lignina resultante não atrativa para instalações de energia comerciais que poderia de outro modo estar inclinadas a consumir péletes de combustível de lignina sem enxofre obtidos a partir de auto- hidrólise como uma alternativa “verde” ao carvão. Em segundo lugar, a sulfonação de lignina que ocorre durante os pré- tratamentos hidrotérmicos catalisados por ácido sulfúrico torna a mesma comparativamente hidrofílica, aumentando, assim, sua capacidade de retenção de água. Essa hidrofilicidade tanto aumenta o custo de secagem da lignina para uso comercial como também torna a mesma pouco adequada para armazenamento externo, dada sua propensão a absorver hidratação. Os assim chamados “modelos tecno-econômicos” de processo de NREL para conversão de biomassa lignocelulósica, com pré-tratamento com ácido diluído, não consideram nem mesmo a lignina como um produto de consumo passível de venda - apenas como uma fonte interna de combustível para vapor de processo. Consultar Humbird et al. (2011). Em contraste, a “rentabilidade econômica” de esquemas de processo que se baseiam em auto-hidrólise inclui uma contribuição significativa de venda robusta de péletes de lignina secos e limpos. Isso é especialmente significativo pelo fato de que as matérias-primas de biomassa lignocelulósica mole típicas compreendem uma grande proporção de lignina, entre 10 e 40% de teor de matéria seca. Assim, mesmos nos casos em que os rendimentos de açúcar de processo de sistemas de auto- hidrólise podem ser diminuídos em relação aos sistemas com ácido diluído, a “rentabilidade” geral pode permanecer equivalente ou ainda melhor.

[017] Os processos de auto-hidrólise também evitam outras desvantagens bem conhecidas de ácido diluído. A exigência de ácido sulfúrico diverge de uma orientação fisiológica que favorece processamento “verde”, introduz um custo operacional substancial para o ácido como entrada de processo e cria uma necessidade de elaboração de sistemas de tratamento de água de refugo e também de equipamento anticorrosivo dispendioso.

[018] A auto-hidrólise é também vantajosamente escalonável a cenários de processamento modestos. O processo com ácido diluído descrito por NREL é tão complexo e elaborado que não pode ser realisticamente estabelecido em uma escala menor - apenas em uma escala gigantesca na ordem de 100 toneladas de matéria-prima de biomassa por hora. Tal escala é apenas apropriada em cenários de processamento de biomassa hipercentralizados. Consultar Humbird et al. (2011). O processamento de biomassa hipercentralizado de palha de milho pode ser bem apropriado nos EUA, que têm uma abundância de milho geneticamente modificado cultivado em hiperprodução quimicamente intensificada. Porém, tal sistema é menos relevante em outras partes do mundo. Tal sistema é inapropriado para cenários de processamento de biomassa modestos, por exemplo, processamento no local em campos de cana-de-açúcar ou dendezeiro ou sorgo, ou processamento regional de palha de trigo, que tipicamente produz muito menos biomassa por hectare que milho, mesmo com modificação genética e intensificações químicas.

[019] Os sistemas de auto-hidrólise, em contraste com ácido diluído, são legitimamente “verdes”, facilmente escalonáveis e desprovido de exigências de sistemas de tratamento de água de refugo elaborados. É, de modo correspondente, vantajoso fornecer sistemas de auto- hidrólise aprimorados, mesmo nos casos em que os mesmos podem não ser obviamente vantajosos em relação aos sistemas com ácido diluído em termos de rendimentos de açúcar apenas.

[020] O problema de rendimentos de monômero C5 insuficientes com auto-hidrólise tem levado de modo geral os fornecedores de tecnologia de processamento de biomassa lignocelulósica a buscar outras abordagens. Alguns sistemas de pré-tratamento “de dois estágios”, projetados para fornecer rendimentos de C5 aprimorados, foram relatados com pré-tratamentos de auto-hidrólise. Consultar os documentos WO2010/113129; US2010/0279361; WO 2009/108773; US2009/0308383; US8.057.639; US20130029406. Nesses esquemas de pré-tratamento de "dois estágios", parte da fração líquida rica em C5 é removida por separação de sólido/líquido após um pré-tratamento à baixa temperatura, seguido por um pré- tratamento à temperatura mais alta da fração sólida. A maioria desses pedidos de patente publicados não relatou resultados experimentais de fato. Nessa descrição de pré- tratamento anto-hidrolítico de dois estágios no documento WO2010/113129, Chemtex Italia relata um total de 26 amostras experimentais com o uso de palha de trigo com uma recuperação de açúcar C5 média de 52%. Esses valores de recuperação de C5 não distinguem entre recuperação de C5 por si só e rendimentos de açúcar monomérico, que é o substrato realmente consumido na fermentação em etanol e outros produtos úteis.

[021] A introdução de um segundo estágio de pré-tratamento em um esquema para processar biomassa lignocelulósica introduz complexidades e custos adicionais. É, de modo correspondente, vantajoso atingir substancialmente as vantagens de pré-tratamento de dois estágios com o uso de um sistema de auto-hidrólise de estágio único.

[022] Conclui-se que, nos casos em que pré- tratamento de auto-hidrólise de estágio único é conduzido em severidade muito baixa, é possível atingir rendimentos de monômero C5 finais altos de 55% de rendimento teórico e mais altos, enquanto se atinge ainda rendimentos de glicose razoáveis. Nos casos em que as matérias-primas de biomassa são pré-tratadas a tal severidade baixa de modo que o teor de sólidos não dissolvidos de material pré-tratado mantenha um teor de xilano residual de pelo menos 5,0% em peso, a perda de C5 durante o pré-tratamento é minimizada. Ainda ao contrário das expectativas, esse teor de xilano residual muito alto pode ser hidrolisado por enzima em xilose monomérica, com alta recuperação, enquanto sacrifica apenas uma percentagem muito pequena de conversão de celulose em glicose, contanto que atividades de xilanase e xilosidase suficientemente altas sejam empregadas durante a hidrólise enzimática.

[023] Nesses níveis de severidade muito baixos, a produção de subprodutos solúveis que afetam a atividade de celulase ou organismos fermentadores é mantida tão baixa que o material pré-tratado pode ser usado diretamente na hidrólise enzimática, e fermentação subsequente, tipicamente sem exigência de qualquer lavagem ou outra etapa de desintoxicação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[024] A Figura 1 mostra o número de xilano como uma função de fator de severidade de pré-tratamento para matérias-primas de biomassa lignocelulósica mole submetidas ao pré-tratamento por auto-hidrólise.

[025] A Figura 2 mostra a porcentagem em peso de xilano em sólidos não dissolvidos como uma função de número de xilano para matérias-primas pré-tratadas.

[026] A Figura 3 mostra a recuperação de C5 na forma solúvel e insolúvel como uma função de número de xilano para matérias-primas de biomassa lignocelulósica mole submetidas ao pré-tratamento por auto-hidrólise.

[027] A Figura 4 mostra a recuperação de C5 total como uma função de número de xilano para matérias- primas de biomassa lignocelulósica mole submetidas ao pré- tratamento por auto-hidrólise.

[028] A Figura 5 mostra a produção de ácido acético, furfural e 5-HMF como uma função de número de xilano para matérias-primas de biomassa lignocelulósica mole submetidas ao pré-tratamento por auto-hidrólise.

[029] A Figura 6 mostra o efeito da remoção de sólidos dissolvidos sobre a conversão de celulose para matérias-primas de biomassa lignocelulósica mole submetidas ao pré-tratamento por auto-hidrólise de severidade muito baixa.

[030] A Figura 7 mostra a caracterização por HPLC de fração líquida a partir de matérias-primas de biomassa lignocelulósica mole submetidas ao pré-tratamento por auto-hidrólise de severidade muito baixa.

[031] A Figura 8 mostra a recuperação de açúcar C5 como uma função de tempo em que a fração sólida é submetida à hidrólise enzimática seguida por introdução de fração líquida para pós-hidrólise.

[032] A Figura 9 mostra o perfil de fermentação de fermentação de etanol por uma cepa de levedura modificada com o uso de palha de trigo que foi pré-tratada por auto- hidrólise de severidade muito baixa, hidrolisada por enzima e usada como fração líquida e sólida combinada sem desintoxicação para remover os inibidores de fermentação.

[033] A Figura 10 mostra um esquema de processo para uma modalidade.

[034] A Figura 11 mostra a conversão de celulose como uma função de tempo - desvio de C5.

[035] A Figura 12 mostra a conversão de xilano como uma função de tempo - desvio de C5.

[036] A Figura 13 mostra a conversão de celulose como uma função de tempo - pasta fluida inteira.

[037] A Figura 14 mostra a conversão de xilano como uma função de tempo - pasta fluida inteira.

[038] A Figura 15 mostra a recuperação de C6 e C5 total após pré-tratamento e hidrólise como uma função de tempo de hidrólise - pasta fluida inteira.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES

[039] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para processar biomassa lignocelulósica que compreendem: - pré-tratar a matéria-prima em pH dentro da faixa de 3,5 a 9,0 em um pré-tratamento hidrotérmico pressurizado de estágio único em severidade em log Ro 3,75 ou inferior de modo a produzir uma pasta fluida de biomassa pré-tratada em que os sólidos não dissolvidos compreendem pelo menos 5,0% em peso de xilano, e- hidrolisar a biomassa pré-tratada com ou sem a adição de teor de água suplementar com o uso de hidrólise enzimática por pelo menos 24 horas catalisada por uma mistura de enzimas que compreende atividades de endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase, endoxilanase e β-xilosidase em níveis de atividade em nkat/g de glucano de endoglucanase de pelo menos 1.100, exoglucanase de pelo menos 280, β- glicosidase de pelo menos 3.000, endoxilanase de pelo menos 1.400 e β-xilosidase de pelo menos 75, de modo a produzir um hidrolisado em que o rendimento de monômeros C5 é pelo menos 55% do teor original de xilose e arabinose da matéria-prima antes do pré-tratamento.

[040] Em algumas modalidades, a biomassa pré- tratada é hidrolisada como uma pasta fluida inteira que compreende ambas as frações sólida e líquida.

[041] Conforme usado no presente documento, os termos a seguir têm os significados a seguir:

[042] “Cerca de”, conforme usado no presente documento em referência a um número ou faixa quantitativa, refere-se a +/- 10% em termos relativos do número ou faixa referida.

[043] “Auto-hidrólise” refere-se a um processo de pré-tratamento em que o ácido acético liberado por hidrólise de hemicelulose durante o pré-tratamento catalisa adicionalmente a hidrólise de hemicelulose, e aplica-se a qualquer pré-tratamento hidrotérmico de biomassa lignocelulósica conduzido em pH entre 3,5 e 9,0.

[044] "Preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica" refere-se a uma mistura comercialmente disponível de atividades de enzima que é suficiente para fornecer hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica pré-tratada e que compreende atividades de endocelulase (endoglucanase), exocelulase (exoglucanase), endoxilanase, xilosidase e B-glicosidase. O termo "otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica" refere-se a um processo de desenvolvimento de produto em que misturas de enzimas foram selecionadas e/ou modificadas para o propósito específico de aprimorar os rendimentos de hidrólise e/ou reduzir o consumo de enzima em hidrólise de biomassa lignocelulósica pré- tratada em açúcares fermentáveis.

[045] Conduzir o pré-tratamento “em” um nível de matéria seca refere-se ao teor de matéria seca da matéria- prima no início do pré-tratamento hidrotérmico pressurizado. O pré-tratamento é conduzido “em” um pH em que o pH do teor aquoso da biomassa é aquele pH no início do pré-tratamento hidrotérmico pressurizado.

[046] “Matéria seca”, também aparecendo como DM, refere-se aos sólidos totais, tanto solúveis como insolúveis, e significa efetivamente “teor de não água”. O teor de matéria seca é medido por secagem a 105 °C até um peso constante ser atingido.

[047] A “estrutura de fibra” é mantida na extensão em que o tamanho médio de fragmentos de fibra após o pré-tratamento é >750 um.

[048] "Glucano", conforme usado no presente documento, refere-se à celulose assim como a outros gluco- oligômeros.

[049] "Pré-tratamento hidrotérmico" refere-se ao uso de água, ou como líquido quente, vapor vaporizado ou vapor pressurizado que compreende vapor ou líquido à alta temperatura ou ambos, para "cozinhar" a biomassa, em temperaturas de 120 °C ou mais altas, tanto com como sem a adição de ácidos e outras substâncias químicas.

[050] “Pré-tratamento hidrotérmico pressurizado de estágio único” refere-se a um pré-tratamento em que a biomassa é submetida ao pré-tratamento hidrotérmico pressurizado em um único reator configurado para aquecer a biomassa em uma passagem única e em que nenhum pré-tratamento hidrotérmico pressurizado adicional é aplicado após a etapa de separação de sólido/líquido para remover a fração líquida da matéria-prima submetida ao pré-tratamento hidrotérmico pressurizado.

[051] "Separação de sólido/líquido" refere-se a um processo mecânico ativo segundo o qual o líquido é separado do sólido por aplicação de força através de pressionamento, centrífuga ou outra força.

[052] “Biomassa lignocelulósica mole” refere-se à biomassa de planta diferente da madeira que compreende celulose, hemicelulose e lignina.

[053] “Fração sólida” e “fração líquida” referem-se ao fracionamento de biomassa pré-tratada na separação de sólido/líquido. O líquido separado é residual que compreende teor de sólido insolúvel considerável é referida como “fração sólida”. Uma “fração sólida” terá um teor de matéria seca e tipicamente também compreenderá um residual considerável de “fração líquida”.

[054] “Rendimento teórico” refere-se à massa equivalente molar de açúcares monoméricos puros obtidos a partir de celulose polimérica ou a partir de estruturas de hemicelulose polimérica, em que os açúcares monoméricos constituintes podem ser também esterificados ou substituídos de outro modo. “Rendimentos de monômero C5” como uma percentagem de rendimento teórico são determinados conforme segue: Antes do pré-tratamento, a matéria-prima de biomassa é analisada quanto aos carboidratos com o uso do método de hidrólise por ácido forte de Sluiter et al. (2008) com o uso de uma coluna HPLC e um sistema de eluição em que galactose e manose coeluem com xilose. Os exemplos de tais sistemas incluem uma coluna H+ de Monossacarídeo REZEX ™ da Phenomenex e uma coluna AMINEX HPX 87C ™ da Biorad. Durante a hidrólise por ácido forte, os ésteres e substituições lábeis a ácido são removidas. Exceto se especificado de outro modo, a quantidade total de "Xilose" + Arabinose determinada na biomassa não pré-tratada é considerada como 100% de recuperação de monômero C5 teórico, que pode ser chamado coletivamente de ”recuperação de monômero C5”. As determinações de açúcar monomérico são realizadas com o uso de caracterização por HPLC com base em curvas padrão com padrões externos purificados. A recuperação de monômero C5 atual é determinada por caracterização por HPLC de amostras para medição direta de monômeros C5, que são, então, expressos como uma porcentagem de rendimento teórico.

[055] “Número de xilano” refere-se a uma caracterização de biomassa pré-tratada determinada conforme segue:

[056] A biomassa pré-tratada é obtida em cerca de 30% de sólidos totais, tipicamente após uma separação de sólido/líquido para fornecer uma fração sólida e uma fração líquida. Essa biomassa pré-tratada que tem cerca de 30% de sólidos totais é, então, parcialmente lavada por mistura com água a 70 °C na razão entre sólidos totais (DM) e água de 1:3 peso:peso. A biomassa pré-tratada lavada dessa maneira é, então, prensada até cerca de 30% de sólidos totais. O teor de xilano da biomassa pré-tratada lavada dessa maneira e prensada até cerca de 30% de sólidos totais é determinada com o uso do método de A. Sluiter, et al., "Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass", US National Renewable Energy Laboratory (NREL) Laboratory Analytical Procedure (LAP) com data de publicação de 25 de abril de 2008, conforme descrito no Relatório Técnico NREL/TP-510- 42618, revisado em abril de 2008. Uma coluna HPLC e um sistema de eluição são usados em que galactose e manose coeluem com xilose. Os exemplos de tais sistemas incluem uma coluna H+ de Monossacarídeo REZEX ™ da Phenomenex e uma coluna AMINEX HPX 87C ™ da Biorad. Essa medição de teor de xilano conforme descrita incluirá alguma contribuição de material solúvel de fração líquida residual que não é removida por lavagem da fração sólida sob essas condições. De modo correspondente, o “número de xilano” fornece uma medição de “combinação ponderada” de teor de xilano residual dentro de sólidos insolúveis e de xilose solúvel e teor de xilo- oligômero dentro da “fração líquida”.

[057] O teor de xilano de sólidos não dissolvidos é determinado tomando-se uma amostra representativa de biomassa pré-tratada, submetendo-se a mesma à separação de sólido/líquido de modo a fornecer uma fração sólida que tem pelo menos 30% de sólidos totais. Essa biomassa pré-tratada que tem pelo menos 30% de sólidos totais é, então, parcialmente lavada por mistura com água a 70 °C na razão entre sólidos totais (DM) e água de 1:3 peso:peso. A biomassa pré-tratada lavada dessa maneira é, então, prensada até pelo menos 30% de sólidos totais e novamente lavada por mistura com água a 70 °C na razão entre sólidos totais (DM) e água de 1:3 peso:peso. Esse material lavado é, então, novamente prensado até pelo menos 30% de sólidos totais e novamente lavada por mistura com água a 70 °C na razão entre sólidos totais (DM) e água de 1:3 peso:peso. Esse material lavado é, então, novamente prensado até pelo menos 30% de sólidos totais e usado como a amostra de sólidos não dissolvidos a ser analisada. O teor de xilano da amostra de sólidos não dissolvidos é, então, determinado conforme descrito na explicação acima em relação à determinação de número de xilano e expresso como uma porcentagem em peso do teor de sólidos totais da amostra.

[058] Qualquer biomassa lignocelulósica mole adequada pode ser usada, incluindo biomassas tais como pelo menos palha de trigo, palha de milho, espigas de milho, cachos de frutas vazios, palha de arroz, palha de aveia, palha de cevada, palha de canola, palha de centeio, sorgo, sorgo doce, palha de soja, painço amarelo, grama Bermuda e outras gramas, bagaço, polpa de beterraba, fibra de milho ou qualquer combinação dos mesmos. A biomassa lignocelulósica pode compreender outros materiais lignocelulósicos, tais como papel, papel de imprensa, papelão ou outros refugos municipais ou de escritório. A biomassa lignocelulósica pode ser usada como uma mistura de materiais que se original de diferentes matérias-primas, podem ser frescos, parcialmente secos, completamente secos ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são praticados com o uso de pelo menos cerca de 10 kg de matéria-prima de biomassa, ou pelo menos 100 kg, ou pelo menos 500 kg.

[059] A biomassa lignocelulósica compreende fibrilas de celulose cristalina intercaladas dentro de uma matriz organizada de modo frouxo de hemicelulose e vedada dentro de um ambiente rico em lignina hidrofóbica. Embora a própria celulose compreenda polímeros de cadeia normal longos de D-glicose, a hemicelulose é uma mistura heterogênea de carboidratos de cadeia ramificada curtos que incluem monômeros de todas as aldopentoses de cinco carbonos (açúcares C5) assim como alguns açúcares de 6 carbonos (C6), incluindo glicose e manose. A lignina é um polímero altamente heterogêneo, carecendo de qualquer estrutura primária particular, e que compreende monômeros fenilpropanoides hidrofóbicos.

[060] A biomassa lignocelulósica adequada tipicamente compreende celulose em quantidades entre 20 e 50% de massa seca antes do pré-tratamento, lignina em quantidades entre 10 e 40% de massa seca antes do pré-tratamento e hemicelulose em quantidades entre 15 e 40%.

[061] Em algumas modalidades, as matérias- primas de biomassa podem ser submetidas à redução de tamanho de partícula e/ou outro processamento mecânico, tal como trituração, moagem, retalhamento, corte ou outros processos antes do pré-tratamento hidrotérmico. Em algumas modalidades, as matérias-primas de biomassa podem ser lavadas e/ou lixiviadas de sais valiosos antes do pré-tratamento pressurizado, conforme descrito em Knudsen et al. (1998). Em algumas modalidades, as matérias-primas podem ser embebidas antes do pré-tratamento pressurizado a temperaturas até 99 °C.

[062] Em algumas modalidades, a matéria-prima é primeiramente embebida em uma solução aquosa antes do pré- tratamento hidrotérmico. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso embeber a matéria-prima em um líquido contendo ácido acético obtido a partir de uma etapa subsequente nos pré-tratamentos, conforme descrito no documento US 8.123.864. É vantajoso conduzir o tratamento no teor de matéria seca mais alto possível, conforme descrito no documento US 12/935.587. Conduzir o pré-tratamento em alto teor de matéria seca evita o gasto de energia de processo no aquecimento de água desnecessária. No entanto, algum teor de água é necessário para atingir rendimentos de açúcar eventuais ideais a partir de hidrólise enzimática. Tipicamente, é vantajoso pré-tratar as matérias-primas de biomassa em ou próximo à sua capacidade de retenção de água inerente. Esse é o nível de teor de água que uma dada matéria-prima alcançará após embebimento em um excesso de água seguido por pressionamento até os limites mecânicos de uma prensa de rosca comercial ordinária - tipicamente entre 30 e 45% de DM. Em algumas modalidades, o pré-tratamento hidrotérmico é conduzido em teor de DM de pelo menos 35%. Será facilmente entendido por um versado na técnica que o teor de DM pode diminuir durante o pré-tratamento hidrotérmico conforme algum teor de água é adicionado durante o aquecimento. Em algumas modalidades, as matérias-primas são pré-tratadas em teor de DM de pelo menos 20%, ou pelo menos 25%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou 40% ou menos, ou 35% ou menos ou 30% ou menos.

[063] Em algumas modalidades, o embebimento/umidificação com uma solução aquosa pode servir para ajustar o pH antes do pré-tratamento à faixa entre 3,5 e 9,0, que é tipicamente vantajosa para auto-hidrólise. Será facilmente entendido que o pH pode mudar durante o pré- tratamento, tipicamente até níveis mais ácidos conforme o ácido acético é liberado da hemicelulose solubilizada.

[064] Em algumas modalidades, o pré-tratamento hidrotérmico é conduzido sem oxigênio suplementar conforme exigido para pré-tratamentos de oxidação úmida, ou sem a adição de solvente orgânico conforme exigido para pré- tratamento por organossolvente, ou sem o uso de aquecimento por micro-ondas conforme exigido para pré-tratamentos por micro-ondas. Em algumas modalidades, o pré-tratamento hidrotérmico é conduzido em temperaturas de 140 °C ou mais altas, ou a 150 °C ou mais, ou a 160 °C ou mais, ou entre 160 e 200 °C, ou entre 170 e 190 °C, ou a 180 °C ou menos, ou a 170 °C ou menos.

[065] Em algumas modalidades, algum teor de C5 pode ser removido por uma etapa de embebimento antes do pré- tratamento pressurizado. Em algumas modalidades, o reator único pode ser configurado para aquecer a biomassa a uma temperatura alvo única. Alternativamente, o reator único pode ser configurado para afetar um gradiente de temperatura dentro do reator de modo que a biomassa seja exposta, durante uma passagem única, a mais de uma região de temperatura. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso remover parcialmente alguns componentes de biomassa solubilizados de dentro do reator pressurizado durante o curso do pré-tratamento.

[066] Os reatores de pré-tratamento hidrotérmico adequados tipicamente incluem a maioria dos reatores de polpação conhecidos a partir da indústria de polpa e papel. Em algumas modalidades, o pré-tratamento hidrotérmico é administrado por vapor dentro de um reator pressurizado a 1 MPa (10 bar) ou menos, ou a 1,2 MPa (12 bar) ou menos, ou a 0,4 MPa (4 bar) ou mais, ou 0,8 MPa (8 bar) ou mais, ou entre 0,8 e 1,8 MPa (8 e 18 bar) ou entre 1,8 e 2 MPa (18 e 20 bar). Em algumas modalidades, o reator de pré- tratamento é configurado para um fluxo de entrada contínuo de matéria-prima.

[067] Em algumas modalidades, a biomassa umedecida é conduzida através do reator, sob pressão, por uma determinada duração ou “tempo de residência”. O tempo de residência é vantajosamente mantido breve para facilitar o rendimento de biomassa mais alto. No entanto, a severidade de pré-tratamento obtida é determinada tanto por temperatura como também por tempo de residência. A temperatura durante o pré-tratamento hidrotérmico é vantajosamente mantida mais baixa, não apenas devido ao fato de que os métodos da invenção buscam obter uma severidade de pré-tratamento muito baixa, mas também devido ao fato de que as temperaturas podem ser alcançadas com o uso de pressões de vapor mais baixas. Na extensão em que a temperatura de pré-tratamento pode estar em níveis de 180 °C ou menos e, de modo correspondente, pressões de vapor saturadas mantidas a 1 MPa (10 bar) ou menos, tendência menos à corrosão é experimentada e equipamentos de pressão de grau muito mais baixo e composições de aço podem ser usados, o que reduz os custos de capital da instalação. Em algumas modalidades, o reator é configurado para aquecer a biomassa a uma temperatura alvo única entre 160 e 200 °C, ou entre 170 e 190 °C. Os tempos de residência, em algumas modalidades, são menos de 60, ou menos de 30, ou menos de 20, ou menos de 15, ou menos de 14, ou menos de 13, ou menos de 12, ou menos de 10, ou menos de 8 ou menos de 5 minutos.

[068] As matérias-primas de biomassa podem ser carregadas a partir da pressão atmosférica em um reator pressurizado por uma variedade de meios. Em algumas modalidades, um sistema de “bomba de partículas” do tipo barragem pode ser usado para carregar as matérias-primas de biomassa, tal como o sistema descrito no documento US 13/062.522. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso carregar um reator de pré-tratamento com o uso de um assim chamado alimentador de “conector de rosca”.

[069] A biomassa pré-tratada pode ser descarregada de um reator pressurizado por uma variedade de meios. Em algumas modalidades, a biomassa pré-tratada é descarregada de tal maneira a preservar a estrutura de fibra do material. Preservar a estrutura de fibra da biomassa pré- tratada é vantajoso devido ao fato de que permite que a fração sólida do material pré-tratado seja prensada durante a separação de sólido/líquido até níveis de matéria seca comparativamente altos com o uso de equipamento de prensa de rosca ordinário e evitando, assim, o custo e a complexidade adicionais de sistemas de presa de filtro de membrana.

[070] A estrutura de fibra pode ser mantida por remoção da matéria-prima do reator pressurizado de uma maneira que não é explosiva. Em algumas modalidades, a remoção não explosiva pode ser realizada e a estrutura de fibra assim mantida com o uso de um sistema do tipo barragem, tal como aquele descrito no documento US 13/043.486. Em algumas modalidades, a remoção não explosiva pode ser realizada e a estrutura de fibra assim mantida com o uso de um sistema de remoção por hidrociclone, tais como aqueles descritos no documento US 12/996.392.

[071] Em algumas modalidades, a biomassa pré- tratada pode ser removida de um reator de pré-tratamento pressurizado com o uso de “explosão de vapor”, que envolve liberação explosiva do material pré-tratado. A biomassa pré- tratada explodida por vapor não mantém sua estrutura de fibra e, de modo correspondente, exige sistemas de separação de sólido/líquido mais elaborados a fim de atingir teor de matéria seca comparável àquele que pode ser atingido com o uso de sistemas de prensa de rosca ordinários com biomassa pré-tratada que mantém sua estrutura de fibra.

[072] A matéria-prima de biomassa é pré-tratada até severidade muito baixa log Ro 3,75 ou menos. Isso resultará tipicamente na biomassa pré-tratada tem um número de xilano de 10% ou mais. O parâmetro “número de xilano” refere-se a uma medição compósita que reflete uma combinação ponderada tanto de teor de xilano residual dentro dos sólidos insolúveis como também a concentração de xilose solúvel e xilo-oligômeros dentro da fração líquida. Em severidade Ro mais baixa, o número de xilano é mais alto. Assim, o número de xilano mais alto refere-se à severidade de pré-tratamento mais baixa. O número de xilano fornece uma correlação linear negativa com medida de severidade convencional log Ro mesmo em severidade muito baixa, em que o teor de xilano residual dentro dos sólidos não dissolvidos é mais alto. A relação entre a severidade de pré-tratamento log Ro e o número de xilano da biomassa pré-tratada resultante para uma variedade de diferentes matérias-primas é mostrada na Figura 1, que é explicada em detalhes no Exemplo 1.

[073] O número de xilano é particularmente útil como uma medida de severidade de pré-tratamento pelo fato de que diferentes matérias-primas de biomassa pré-tratada que têm número de xilano equivalente exibem recuperação de monômero C5 equivalente. Em contraste, a severidade Ro convencional é simplesmente uma descrição empírica de condições de pré-tratamento, que não fornece uma base racional para comparações entre diferentes matérias-primas de biomassa. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 1, a auto- hidrólise de estágio único em severidade log Ro= 3,75 fornece bagaço de cana-de-açúcar e palha de milho pré-tratados que têm um número de xilano entre 6 a 7%, enquanto com cepas de palha de trigo típicas, o número de xilano resultante de matéria-prima pré-tratada é cerca de 10%.

[074] Um versado na técnica pode determinar facilmente uma severidade de pré-tratamento log Ro apropriada para qualquer dada matéria-prima para produzir uma biomassa pré-tratada que tem o número de xilano desejado. Em algumas modalidades, a matéria-prima de biomassa é pré-tratada até severidade muito baixa log Ro 3,75 ou menos, ou 3,74 ou menos, ou 3,73 ou menos, ou 3,72 ou menos, ou 3,71 ou menos, ou 3,70 ou menos, ou 3,69 ou menos, ou 3,68 ou menos, ou 3,67 ou menos, ou 3,66 ou menos, ou 3,65 ou menos, ou 3,64 ou menos, ou 3,63 ou menos, ou 3,62 ou menos, ou 3,61 ou menos, ou 3,60 ou menos, ou 3,59 ou menos, ou 3.58 ou menos, ou 3,57 ou menos, ou 3,56 ou menos, ou 3,55 ou menos, ou 3,54 ou menos, ou 3,53 ou menos, ou 3,52 ou menos, ou 3,51 ou menos, ou 3,50 ou menos, ou 3,45 ou menos, ou 3,40 ou menos. Em algumas modalidades, a biomassa é pré-tratada a uma severidade baixa log Ro de modo a produzir uma biomassa pré- tratada que tem um número de xilano de 11% ou maior, ou 12% ou maior, ou 13% ou maior, ou 14% ou maior, ou 15% ou maior, ou 16% ou maior, ou 17% ou maior.

[075] O número de xilano é útil como uma medida prática em processamento de biomassa em escala de produção devido ao fato de que pode ser facilmente medido em linha com base em medições simples, tais como são fornecidas por monitores espectroscópicos de infravermelho próximo. O número de xilano pode ser, ainda, usado como medida de ponto final para controle de pré-tratamento, conforme descrito no documento WO2013/120492.

[076] Como uma alternativa ao número de xilano, que reflete uma medida compósita tanto de teor de xilano solúvel como também teor de xilano residual em sólidos não dissolvidos, o efeito de pré-tratamento pode ser expresso em termos de teor de xilano residual em sólidos não dissolvidos. A relação entre teor de xilano residual em sólidos não dissolvidos e número de xilano é mostrada na Figura 2, que é explicada no Exemplo 1. Um versado na técnica pode determinar facilmente uma severidade de pré-tratamento log Ro apropriada para qualquer dada matéria-prima para produzir uma biomassa pré-tratada que tem o teor de xilano residual desejado em sólidos não dissolvidos. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 2, a auto-hidrólise de estágio único a uma severidade suficiente para produzir biomassa pré-tratada que tem um número de xilano de 10% produzirá tipicamente biomassa pré- tratada que te um teor de xilano residual em sólidos não dissolvidos de cerca de 5,0% em peso para matérias-primas lignocelulósicas, incluindo, porém, sem limitação, palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, cachos de frutas vazios e palha de milho. Em algumas modalidades, a matéria-prima de biomassa é pré-tratada à severidade log Ro apropriada para produzir uma biomassa pré-tratada em que o teor de xilano residual de sólidos não dissolvidos é pelo menos 5,0% em peso, ou pelo menos 5,1%, ou pelo menos 5,2%, ou pelo menos 5,3%, ou pelo menos 5,4%, ou pelo menos 5,5%, ou pelo menos 5,6%, ou pelo menos 5,7%, ou pelo menos 5,8%, ou pelo menos 5,9%, ou pelo menos 6,0%, ou pelo menos 6,1%, ou pelo menos 6,2%, ou pelo menos 6,3%, ou pelo menos 6,4%, ou pelo menos 6,5%, ou pelo menos 6,6%, ou pelo menos 6,7%, ou pelo menos 6,8%, ou pelo menos 6,9%, ou pelo menos 7,0%, ou pelo menos 7,1%, ou pelo menos 7,2%, ou pelo menos 7,3% ou pelo menos 7,4%, ou pelo menos 7,5%, ou pelo menos 7,6%, ou pelo menos 7,7%, ou pelo menos 7,8%, ou pelo menos 7,9% ou pelo menos 8,0%, ou pelo menos 8,1%, ou pelo menos 8,2%, ou pelo menos 8,3%, ou pelo menos 8,4%, ou pelo menos 8,5%.

[077] É vantajoso que as matérias-primas de biomassa sejam pré-tratada à severidade muito baixa, em que o número de xilano da matéria-prima pré-tratada é 10% ou mais, ou em que o teor de xilano residual de sólidos não dissolvidos na matéria-prima pré-tratada é pelo menos 5,0% ou mais. Esse nível de severidade muito baixo corresponde a um processo em que o teor de hemicelulose total da matéria-prima antes do pré-tratamento que é ou solubilizado ou perdido de modo irrecuperável durante o pré-tratamento é minimizado. Foi revelado inesperadamente que rendimentos de monômero C5 finais muito altos de pelo menos 55% teóricos podem ser obtidos sem perda notável de rendimentos de monômero C6 com cepas típicas de palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de sorgo doce, palha de milho e cachos de frutas vazios após a hidrólise enzimática de matérias-primas pré- tratadas à severidade muito baixa por auto-hidrólise de estágio único, contanto que atividades de xilanase e xilosidase suficientemente altas sejam empregadas durante a hidrólise enzimática. Em níveis de severidade muito baixos, uma fração grande do teor de hemicelulose da matéria-prima permanece dentro da fração sólida após o pré-tratamento, em que a mesma pode ser subsequentemente hidrolisada em monômeros C5 com alta recuperação com o uso de hidrólise enzimática, em que atividades de xilanase e xilosidase suficientes são usadas.

[078] Deve-se perceber que relatórios relacionados à “recuperação de xilose” são frequentemente expressos em termos que não são comparáveis às recuperações de xilose relatadas aqui. Por exemplo, Ohgren et al. (2007) e Lee et al. (2009) relatam altas recuperações de xilose. Mas esses valores referem-se apenas à recuperação de xilose a partir de biomassa pré-tratada, não expressa como uma porcentagem do teor de hemicelulose original da matéria-prima antes do pré-tratamento. Ou, por exemplo, o documento WO2010/113129 refere-se à recuperação de hemicelulose como uma porcentagem de teor de hemicelulose da matéria-prima antes do pré-tratamento, mas não especifica o rendimento de monômero, que é invariavelmente menor que a recuperação de hemicelulose total. Em algumas modalidades, rendimentos de monômero C5 de pelo menos 56% teóricos podem ser obtidos em hidrolisado após a hidrólise enzimática, ou pelo menos 57%, ou pelo menos 58%, ou pelo menos 59%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 61%, ou pelo menos 62%, ou pelo menos 63%, ou pelo menos 64%, ou pelo menos 65%.

[079] A hidrólise enzimática pode ser conduzida em uma variedade de formas diferentes. Em algumas modalidades, a biomassa pré-tratada é hidrolisada como uma pasta fluida inteira, significando que substancialmente todos os sólidos da biomassa pré-tratada são submetidos à hidrólise enzimática em uma mistura de reação que compreende tanto sólidos dissolvidos como não dissolvidos. Conforme usado no presente documento, o termo "pasta fluida inteira" refere-se a uma mistura de reação de hidrólise enzimática em que a razão em peso entre sólidos não dissolvidos e dissolvidos no início da hidrólise enzimática é menor que 2,2:1.

[080] O teor de sólidos não dissolvidos" e "sólidos dissolvidos" da pasta fluida de biomassa pré-tratada é determinado conforme segue:

[081] O teor de “sólidos totais” e “sólidos totais filtrados” é determinado de acordo com o procedimento descrito em Weiss et al. (2009). A partir desses valores, o teor de “sólidos não dissolvidos” e “sólidos dissolvidos” pode ser calculado de acordo com as seguintes fórmulas:[Sólidos não dissolvidos] (peso-%) = ([Sólidos totais] (peso-%) - [Sólidos totais filtrados] (peso-%))/(1 - [Sólidos totais filtrados] (peso-%)) [Sólidos dissolvidos] (peso-%) = [Sólidos totais] (peso-%) - [sólidos não dissolvidos] (peso-%)

[082] Em algumas modalidades, antes da hidrólise enzimática, a biomassa pré-tratada é submetida a uma etapa de separação de sólido/líquido para produzir uma fração sólida e uma fração líquida separadas. Tal separação é, de modo geral, vantajosa pelo fato de que algum componente dos sólidos dissolvidos na biomassa pré-tratada tipicamente atua para inibir as atividades de uma ou mais enzimas usadas na hidrólise enzimática. Por exemplo, a remoção de teor de sólidos dissolvidos da pasta fluida inteira de biomassa pré- tratada claramente aprimora a conversão de celulose atingida com matérias-primas pré-tratadas conforme descrito aqui que foram submetidas à hidrólise enzimática em teor de matéria seca alto com o uso de preparações de celulase comercialmente disponíveis para conversão de biomassa lignocelulósica fornecida ou junto à GENENCOR ™ sob o nome comercial ACCELLERASE TRIO ™ ou junto à NOVOZYMES ™ sob o nome comercial CELLIC CTEC3 ™, conforme é mostrado na Figura 6 e conforme explicado no Exemplo 4.

[083] De modo surpreendente, no entanto, nos casos em que a pasta fluida de biomassa pré-tratada é suficientemente diluída ao teor de matéria seca mais baixo, as concentrações das substâncias inibidoras presentes na pasta fluida de biomassa pré-tratada são suficientemente diluídas de modo que rendimentos de conversão equivalentes possam ser obtidos na hidrólise de pasta fluida inteira, e mesmo em níveis de dose de enzima mais baixos, conforme explicado no Exemplo 10.

[084] Em modalidades que empregam uma etapa de separação de sólido/líquido antes da hidrólise enzimática, em que se deseja que a hidrólise enzimática seja conduzida em teor de matéria seca alto, é vantajoso atingir os níveis praticáveis mais altos de teor de matéria seca na fração sólida ou, alternativamente, remover a quantidade praticável mais alta de sólidos dissolvidos da fração sólida. Em algumas modalidades, a separação de sólido/líquido atinge uma fração sólida que tem um teor de DM de pelo menos 40% em peso, ou pelo menos 45%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 55%. A separação de sólido/líquido com o uso de sistemas de prensa de rosca ordinários pode tipicamente atingir níveis de DM tão altos quanto 50% na fração sólida, contanto que a matéria- prima de biomassa tenha sido pré-tratada de tal forma que a estrutura de fibra seja mantida. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso gerar despesas de capital de instalação mais altas a fim de atingir separação de sólido/líquido mais eficaz, por exemplo, com o uso de um sistema de prensa de filtro de membrana. Em algumas modalidades, os sólidos dissolvidos podem ser removido de uma fração sólida por lavagem e pressionamento em série ou por técnicas de lavagem por deslocamento conhecidas no campo de polpa e papel. Em algumas modalidades, seja por separação de sólido/líquido diretamente ou por alguma combinação de lavagem e separação de sólido/líquido, o teor de sólidos dissolvidos da fração sólida é reduzido em pelo menos 50%, ou pelo menos 55%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 65%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 75%.

[085] A fração líquida obtida a partir de tal separação de sólido/líquido pode ser, então, mantida separadamente da fração sólida durante a hidrólise enzimática da fração sólida. Chama-se essa separação temporária de “desvio de C5”. O material de "desvio" rico em C5 pode ser, então, adicionado de volta à mistura de hidrólise, após a hidrólise enzimática da fração sólida tem atingido um grau desejado de conversão de glucano. Refere-se a isso como "pós- hidrólise" do material de "desvio de C5". Dessa maneira, a interferência que poderia ser, de outro modo, causada pelos sólidos dissolvidos inibidores de enzima presentes na pasta fluida de biomassa pré-tratada é minimizada, sem perda de rendimento de monômero C5. A fração líquida obtida a partir de matérias-primas de biomassa lignocelulósica mole, tais como cepas típicas de palha de trigo, bagaço de cana-de- açúcar, bagaço de sorgo doce, palha de milho e cachos de frutas vazios pré-tratados por auto-hidrólise de estágio único à severidade muito baixa de modo a fornecer material pré-tratado que tem número de xilano 10% ou maior, ou que tem teor de xilano de sólidos não dissolvidos de 5,0% ou maior, tipicamente compreende um componente pequeno de monômeros C6 (1x), principalmente glicose com alguns outros açúcares; um componente maior de oligômeros C6 solúveis (cerca de 2x a 7x); um componente maior de monômeros C5 (cera de 4x a 8x), principalmente xilose e arabinose e outros açúcares; e um componente muito maior de xilo-oligômeros solúveis (cerca de 18x a 30x). Os xilo-oligômeros solúveis tipicamente incluem, principalmente, xiloexose, xilopentose, xilotetraose, xilotriose e xilobiose com alguns oligômeros de cadeia superiores. Esses oligômeros de xilose (ou xilo-oligômeros) são tipicamente hidrolisados por enzima durante a "pós- hidrólise" por atividades enzimáticas usadas na hidrólise enzimática de fração sólida. Ou, em outras palavras, por mistura da fração líquida separada e da fração sólida hidrolisada, os xilo-oligômeros na fração líquida são degradados em monômeros de xilose pela ação de atividades enzimáticas remanescentes dentro da fração sólida hidrolisada.

[086] Alternativamente, em algumas modalidades, a fração líquida separada pode ser usada para outros propósitos. Em algumas modalidades, a fração líquida separada pode ser mesclada com vinhaça fina após a recuperação de etanol a partir da fermentação de hidrolisados. A fração líquida mesclada e a vinhaça fina podem ser, então, usadas como um substrato de biometano. Ou, alternativamente, a vinhaça fina e as frações líquidas podem ser usadas como substrato de biometano separado. De modo surpreendente, o potencial de biometano de vinhaça fina e também da fração líquida é aumentado após pré-tratamento de severidade muito baixa que produz biomassa pré-tratada que tem número de xilano 10% ou maior. Consequentemente, em algumas modalidades, é vantajoso conduzir a fermentação de C6 em severidade muito baixa, pelo fato de que rendimentos de biometano aumentados podem compensar de algum modo os rendimentos de etanol diminuídos. Em algumas modalidades, um rendimento de biometano de pelo menos 75 NM3 metano/tonelada de matéria-prima de biomassa, ou pelo menos 78, ou pelo menos 80, ou pelo menos 82, ou pelo menos 85, ou pelo menos 87, ou pelo menos 90, ou pelo menos 92, ou pelo menos 95 pode ser produzido a partir de um substrato de biometano que compreende fração líquida e vinhaça fina combinadas, em que a matéria-prima foi pré-tratada à severidade baixa log Ro de modo a produzir uma biomassa pré-tratada que tem número de xilano pelo menos 10%, ou em que os sólidos não dissolvidos compreendem pelo menos 5,0% em peso de xilano. Em algumas modalidades, o próprio hidrolisado de pasta fluida inteira é usado como um substrato de biometano.

[087] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para processar biomassa lignocelulósica que compreendem:- fornecer matéria-prima de biomassa lignocelulósica mole,- pré-aquecer a matéria-prima em pH dentro da faixa de 3,5 a 9,0 em um pré-tratamento hidrotérmico pressurizado de estágio único à severidade muito baixa de modo que a biomassa pré-tratada seja caracterizada por ter um número de xilano de 10% ou mais alto,- separar a biomassa pré-tratada em uma fração sólida e uma fração líquida,- hidrolisar a fração sólida com ou sem a adição de teor de água suplementar com o uso de hidrólise enzimática catalisada por uma mistura enzimática que compreende atividades de endoglucanase, exoglucanase, B-glicosidase, endoxilanase e xilosidase, e- misturar, subsequentemente, a fração líquida separada e da fração sólida hidrolisada, segundo o qual os xilo-oligômeros na fração líquida são degradados em monômeros de xilose pela ação de atividades enzimáticas remanescentes dentro da fração sólida hidrolisada.

[088] Em algumas modalidades, o hidrolisado enzimático, ou de uma fração sólida separada ou de uma fração sólida hidrolisada à qual a fração líquida separada foi adicionada para pós-hidrólise, ou de uma pasta fluida inteira, é subsequentemente submetido à fermentação para produzir etanol.

[089] Em algumas modalidades, a vinhaça fina recuperada após a fermentação de um hidrolisado é usada como um substrato para a produção de biometano. Em algumas modalidades, a fração líquida separada é mesclada com vinhaça fina recuperada após a fermentação de um hidrolisado e usada como um substrato de biometano combinado.

[090] Será facilmente entendido que a "fração sólida" e a "fração líquida" podem ser adicionalmente subdivididas ou processadas. Em algumas modalidades, a biomassa pode ser removida de um reator de pré-tratamento concorrentemente com a separação de sólido/líquido. Em algumas modalidades, a biomassa pré-tratada é submetida a uma etapa de separação de sólido/líquido após ter sido descarregada do reator, tipicamente com o uso de um sistema de prensa de rosca de baixo custo e simples, para gerar uma fração sólida e uma fração líquida.

[091] Conforme é bem conhecido na técnica, a hidrólise enzimática que usa atividade de celulase é mais eficaz nos casos em que a hidrólise é conduzida em teor de matéria seca mais baixo. A concentração de sólidos mais alta inibe de modo eficaz a catálise de celulase, embora as razões exatas para esse efeito bem conhecido não sejam completamente entendidas. Consultar, por exemplo, Kristensen et al. (2009). Apesar de a visão prevalecente na técnica ser que a hidrólise no teor de matéria seca prático mais alto seja vantajosa, a mesma está necessariamente associada ao consumo de enzima aumentado. Os mesmos efeitos de hidrólise enzimática podem ser atingidos com o uso das mesmas preparações enzimáticas em teor de matéria seca mais baixo com economias de custos de enzima.

[092] Um versado na técnica determinará facilmente, através de experimentação de rotina, um nível de DM em que conduzir a hidrólise enzimática que seja apropriado para atingir os dados objetivos de processo, para qualquer dada matéria-prima de biomassa e preparação de enzima. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso conduzir a hidrólise em DM muito alta > 20%, não obstante algum aumento resultante no consumo de enzima. É, de modo geral, considerado vantajoso conduzir a hidrólise no nível de matéria seca praticável mais alto, por uma variedade de razões que incluem minimizar o consumo de água e poupar custos de energia em destilação de etanol, em que concentrações de açúcar mais altas produzidas por hidrólise enzimática em níveis de matéria seca mais altos resultam em concentrações de etanol mais altas, o que, por sua vez, reduz os custos de destilação. Em algumas modalidades, a hidrólise enzimática de uma fração sólida separada ou de pasta fluida inteira pode ser conduzida a 8% de DM ou mais, ou a 9% de DM ou mais, ou a 10% de DM ou mais, ou a 11% de DM ou mais, ou a 12% de DM ou mais, ou a 13% de DM ou mais, ou a 14% de DM ou mais, ou a 15% de DM ou mais, ou a 16% de DM ou mais, ou a 17% de DM ou mais, ou a 18% de DM ou mais ou a 19% de DM ou mais, ou a 20% de DM ou mais, ou a 21% de DM ou mais, ou a 22% de DM ou mais, ou a 23% de DM ou mais, ou a 25% de DM ou mais, ou a 30% de DM ou mais, ou a 35% de DM ou mais.

[093] Em algumas modalidades, a fração sólida é recuperada a partir da separação de sólido/líquido de biomassa pré-tratada a 40% de DM ou mais, mas teor de água adicional é adicionado de modo que a hidrólise enzimática possa ser conduzida em níveis de DM mais baixos. Será facilmente entendido que o teor de água pode ser adicionado na forma de água doce, condensado ou outras soluções de processo com ou sem aditivos, tais como polietileno glicol (PEG) de qualquer peso molecular ou tensoativos, sais, substâncias químicas para ajuste de pH, tais como amônia, hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio ou hidróxido de sódio, agentes antibacterianos ou agentes antifúngicos ou outros materiais.

[094] A fim de atingir rendimentos de monômero C5 em hidrolisado de pelo menos 55% ou mais, de acordo com os métodos da invenção, a hidrólise enzimática é conduzida com o uso de uma variedades de atividades enzimáticas. A mistura de enzimas usada na hidrólise enzimática deve compreender pelo menos as seguintes atividades de endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase, endoxilanase e β-xilosidase. Será facilmente entendido por um versado na técnica que vários níveis diferentes de dose de enzima podem ser aplicados, dependendo do teor de matéria seca sob o qual a hidrólise é conduzida, os rendimentos de conversão de glucano desejados como objetivos de processo e os tempos de hidrólise desejados como objetivos de processo. Assim, um nível de dose de enzima apropriado para hidrólise rápida com teor de matéria seca mais alto pode ser bastante reduzido e usado em um período de tempo de hidrólise mais longo com teor de matéria seca mais baixo.

[095] Como uma regra geral, rendimentos de monômero C5 em hidrolisado de pelo menos 55% ou mais podem ser atingidos de modo relativamente rápido, tipicamente em períodos de tempo tão baixos quanto 24 horas, e, de modo geral, dentro da faixa de 18 horas a 60 horas. É vantajoso atingir essas recuperações de monômero C5 muito altas o mais rapidamente possível, devido ao fato de que uma vez que o teor de xilano seja substancialmente removido dos sólidos não dissolvidos, as endo e exoglucanases são comparativamente menos bloqueadas na abordagem à ligação produtiva. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso suplementar uma mistura de enzimas com atividade de endo e exoglucanase em excesso após os rendimentos de monômero C5 serem atingidos. Os períodos de tempo de hidrólise durante os quais esses rendimentos de monômero C5 altos podem ser tipicamente atingidos são indicados, por exemplo, na Figura 11, e conforme explicados no Exemplo 10, que mostra a conversão de xilano em hidrólise de pasta fluida inteira a 12% de DM, nos casos em que a recuperação de C5 total após o pré-tratamento foi cerca de 77%. Conforme mostrado, mesmo em níveis de dose de enzima muito baixos, rendimentos de monômero C5 de pelo menos 55% podem ser atingidos dentro de 40 horas.

[096] Os níveis apropriados das várias atividades de enzima adequados para praticar os métodos da invenção de modo a tingir rendimentos de monômero C5 de 55% ou mais são tipicamente conforme seguem:

[097] Endoglucanase refere-se a 4-(1,3;1,4)-β- D-glucano 4-glucanoidrolase, também conhecida como β-1,4- glucanase (EC 3.2.1.4). Para propósitos de definição de valores limitantes, as atividades de endoglucanase são determinadas com o uso do método de Ghose (1987) com o uso de hidroxil-etil celulose (HEC) como substrato e expressas em nkat/g de preparação de enzima. Tipicamente, os níveis de endoglucanase devem ser pelo menos 1100 nkat/g de glucano no início da hidrólise enzimática. Dependendo dos objetivos de processo, tal como velocidade de hidrólise, grau de conversão e teor de matéria seca, os níveis de atividade de endoglucanase podem variar dentro da faixa de 1.100 a 30.000 nkat/g de glucano. Em algumas modalidades, a faixa pode estar entre 1.100 a 2.832, ou entre 1.130 a 1.529, ou entre 2.317 a 3.852, ou entre 3.000 a 5.120, ou entre 4.000 a 8.000, ou entre 7.000 a 10.000, ou entre 11.000 a 20.000.

[098] Exoglucanase refere-se a 4-β-D-glucano celobioidrolase (EC 3.2.1.91). Para propósitos de definição de valores limitantes, as atividades de exoglucanase são determinadas com o uso do método de Bailey e Tahtiharju (2003) com o uso de 4-metil-umbeliferil-β-D-lactosideo como substrato e expressas em nkat/g de preparação de enzima. Tipicamente, os níveis de exoglucanase devem ser pelo menos 280 nkat/g de glucano no início da hidrólise enzimática. Dependendo dos objetivos de processo, tal como velocidade de hidrólise, grau de conversão e teor de matéria seca, os níveis de atividade podem variar dentro da faixa de 280 a 20.000 nkat/g de glucano. Em algumas modalidades, a faixa pode estar entre 280 a 690, ou entre 370 a 560, ou entre 400 a 932, ou entre 700 a 1.240, ou entre 1.200 a 2.000, ou entre 3.000 a 5.000.

[099] β-glicosidase refere-se a β-D-glicosideo glicoidrolase (EC 3.2.1.21). Para propósitos de definição de valores limitantes, as atividades de β-glicosidase são determinadas com o uso do método de Berghem e Pettersson (1974) com o uso de 4-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo como substrato e expressas em nkat/g de preparação de enzima. Tipicamente, os níveis de β-glicosidase devem ser pelo menos 3000 nkat/g de glucano no início da hidrólise enzimática. Dependendo dos objetivos de processo, tal como velocidade de hidrólise, grau de conversão e teor de matéria seca, os níveis de atividade podem variar dentro da faixa de 30.000 a 50.000 nkat/g de glucano. Em algumas modalidades, a faixa pode estar entre 3.000 a 7.500, ou entre 4.000 a 6.010, ou entre 5.000 a 1.000, ou entre 7.000 a 14.000, ou entre 15.000 a 25.000.

[0100] Endoxilanase refere-se a 4-β-D-xilano xilanoidrolase (EC 3.2.1.8). Para propósitos de definição de valores limitantes, as atividades de endoxilanase são determinadas com o uso do método de Bailey et al. (1992) com o uso de xilano de bétula como substrato e expressas em nkat/g de preparação de enzima. Tampão citrato pode ser usado para ajustar o pH a um nível apropriado para a atividade testada. Tipicamente, os níveis de endoxilanase devem ser pelo menos 1.400 nkat/g de glucano no início da hidrólise enzimática. Dependendo dos objetivos de processo, tal como velocidade de hidrólise, grau de conversão e teor de matéria seca, os níveis de atividade podem variar dentro da faixa de 14.000 a 70.000 nkat/g de glucano. Em algumas modalidades, a faixa pode estar entre 1.400 a 3.800, ou entre 4.000 a 5.000, ou entre 6.000 a 7.000, ou entre 7.000 a 8.000, ou entre 9.000 a 12.000, ou entre 11.000 a 15.000, ou entre 15.000 a 20.000, ou entre 18.000 a 30.000.

[0101] β-xilosidase refere-se a 4-β-D-xilano xiloidrolase (EC 3.2.1.37). Para propósitos de definição de valores limitantes, as atividades de β-xilosidase são determinadas com o uso do método de Poutanen e Puls (1988) com o uso de para-nitrofenil-β-D-xilanopiranosideo como substrato e expressas em nkat/g de preparação de enzima. Tipicamente, os níveis de β-xilosidase devem ser pelo menos 75 nkat/g de glucano no início da hidrólise enzimática. Dependendo dos objetivos de processo, tais como velocidade de hidrólise, grau de conversão e teor de matéria seca, os níveis de atividade podem variar dentro da faixa de 75 a 124, ou entre 100 a 300, ou entre 250 a 500, ou entre 400 a 800, ou entre 700 a 20.000 nkat/g de glucano. Em algumas modalidades, a faixa pode estar entre 700 a 900, ou entre 800 a 1.400, ou entre 1.100 a 1.700, ou entre 1.500 a 2.500, ou entre 2.000 a 3.500, ou entre 3.000 a 5.000, ou entre 4.000 a 10.000, ou entre 8.000 a 20.000.

[0102] Qualquer um dos ensaios indicados acima a serem usados para determinações de atividade pode ser modificado de formas apropriadas, incluindo que as amostras podem ser ajustadas à diluição apropriada para propósitos de medições. O ensaio pode ser adaptado para medições em amostras representativas tomadas de uma mistura de hidrólise por comparação com curvas padrão nos casos em que atividades conhecidas são adicionadas às amostras com teor de matéria seca de plano de fundo similares.

[0103] Conforme será facilmente entendido por um versado na técnica, a composição de misturas de enzimas para praticar os métodos da invenção pode variar dentro de limites comparativamente amplos. As preparações de enzima adequadas incluem preparações comercialmente disponíveis otimizadas para conversão de biomassa lignocelulósica. A seleção e a modificação de misturas de enzimas durante a otimização podem incluir técnicas de modificação genética, por exemplo, tais como aquelas descritas por Zhang et al. (2006) ou por outros métodos conhecidos na técnica. As preparações de celulase comercialmente disponíveis otimizadas para conversão de biomassa lignocelulósica são tipicamente identificadas pelo fabricante e/ou fornecedor como tais. Essas são tipicamente distintas de preparações de celulase comercialmente disponíveis para uso geral ou otimizadas para uso na produção de razão para animais, alimentos, detergentes têxteis ou na indústria de papel. Em algumas modalidades, é usada uma preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica que é fornecida pela GENENCOR ™ e que compreende exoglucanases, endoglucanases, endoxilanases, xilosidases, e beta glicosidases isoladas das fermentações de Trichoderma reesei geneticamente modificado, tal como, por exemplo, a preparação de celulase comercial vendida sob o nome comercial ACCELLERASE TRIO ™. Em algumas modalidades, é usada uma preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica que é fornecida pela NOVOZYMES ™ e que compreende exoglucanases, endoglucanases, endoxilanases, xilosidases e beta glicosidases, tal como, por exemplo, as preparações de celulase comerciais vendidas sob qualquer um dos nomes comerciais CELLIC CTEC2 ™ ou CELLIC CTEC3 ™.

[0104] As atividades de enzima representadas em três preparações de celulase comercialmente disponíveis otimizadas para conversão de biomassa lignocelulósica foram analisadas em detalhes. Para cada uma dessas preparações de celulase comerciais, os níveis de doze atividades de enzima diferentes foram caracterizados e expressos por grama de proteína. Os detalhes experimentais são fornecidos no Exemplo 8. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Deve-se perceber que os métodos de ensaio usados nesse exemplo não são os mesmos que aqueles baseados em determinações de atividades no presente documento. Esses resultados fornecem apenas comparação generalizada e qualitativa e não devem ser vistos como limitantes em relação às reivindicações aos métodos da invenção.

[0105] Tabela 1. Medições de atividade selecionada em preparações de celulase comerciais otimizadas para conversão de biomassa lignocelulósica.

[0106] As misturas de enzimas que são eficazes para hidrolisar a biomassa lignocelulósica podem ser, alternativamente, obtidas por métodos bem conhecidos na técnica a partir de uma variedade de microrganismos, incluindo, bactérias aeróbias e anaeróbias, fungos da podridão branca, fungos da podridão mole e fungos anaeróbios. Consultar, por exemplo, Singhania et al. (2010). Os organismos que produzem celulases tipicamente secretam uma mistura de diferentes enzimas em proporções apropriadas de modo a ser adequada para a hidrólise de substratos lignocelulósicos. As fontes preferenciais de preparações de celulase úteis para a conversão de biomassa lignocelulósica incluem fungos tais como espécies de Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Humicola, Aspergillus e Phanerochaete.

[0107] Uma espécie de fungo em particular, Trichoderma reesei, foi extensivamente estudada. O Trichoderma reesei do tipo selvagem secreta uma mistura de enzimas de compreende duas exocelulases (celobioidrolases) com as respectivas especificidades para fins de redução e não redução de cadeias de celulose, pelo menos cinco endocelulases diferentes que têm sítios de reconhecimento de celulose diferentes, duas B-glicosidases assim como uma variedade de endoxilanases e exoxilosidases. Consultar Rouvinen, J., et al. (1990); Divne, C., et al. (1994); Martinez, D., et al. (2008). As preparações de celulose comerciais tipicamente também incluem atividades de alfa- arabinofuranosidase e acetil xilano esterase. Consultar, por exemplo, Vinzant, T., et al. (2001).

[0108] Uma mistura otimizada de atividades de enzima em proporções relativas que diferem das proporções apresentadas nas misturas naturalmente secretadas por organismos do tipo selvagem mostrou anteriormente produzir rendimentos de açúcar mais altos. Consultar, Rosgaard et al. (2007). De fato, foi sugerido que as otimizações de mesclas de enzima que incluem tanto quanto 16 proteínas enzimáticas diferentes podem ser vantajosamente determinadas de modo separada para qualquer dada matéria-prima de biomassa submetida a qualquer dado pré-tratamento. Consultar Billard, H., et al. (2012); Banerjee, G., et al. (2010). Como uma praticidade comercial, no entanto, os fornecedores de enzima comercial tipicamente buscam produzir o menor número praticável de mesclas de enzimas diferentes, a fim de que economias de escala possam ser obtidas em produção em larga escala.

[0109] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso suplementar uma preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica com uma ou mais atividades de enzima adicionais ou suplementares. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso simplesmente aumentar a proporção relativa de uma ou mais enzimas componentes presentes na preparação comercial. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso introduzir atividades adicionais especializadas. Por exemplo, na prática dos métodos da invenção com o uso de qualquer dada matéria-prima de biomassa, ligações de carboidrato não hidrolisadas particulares podem ser identificadas que poderiam ser vantajosamente hidrolisadas através do uso de uma ou mais atividades de enzima suplementares. Tais ligações não hidrolisadas podem ser identificadas através de caracterização de carboidratos oligoméricos, com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, em hidrolisados solúveis ou em resíduo não hidrolisado insolúvel. As ligações não hidrolisadas podem ser também identificadas através de definição de perfil de polímero de microarranjo abrangente, com o uso de anticorpos monoclonais direcionados contra ligações de carboidrato específicas, as descritos por Nguema- Ona et al. (2012). Em algumas modalidades, pode ser vantajoso suplementar uma preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica com o uso de qualquer uma ou mais dentre endoxilanase, B-glicosidase, mananase, glicouronidase, xilano esterase, amilase, xilosidase, glicouranil esterase ou arabinofuranosidase adicionais.

[0110] Em algumas modalidades, pode ser alternativamente vantajoso produzir enzimas no local em uma instalação de processamento de biomassa lignocelulósica, conforme descrito por Humbird et al. (2011). Em algumas modalidades, uma preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica pode ser produzida no local, com ou sem suplementação customizada de atividades de enzima específicas apropriadas para uma matéria-prima de biomassa particular.

[0111] Em algumas modalidades, a mistura de enzimas pode incluir, ainda, qualquer uma ou mais dentre atividade de manosidases (EC 3.2.1.25), a-D-galactosidases (EC 3.2.1.22), a-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), a-D- glicuronidases (EC 3.2.1.139), cinamoil esterases (EC 3.1.1.), ou feruloil esterases (EC 3.1.1.73), acetil xilano esterases (EC 3.1.1.72); B-1,3 xilosidase (EC 3.2.1.72); atividade de alfa 1,3 e/ou alfa 1, 5 arabinofuranosidase (EC 3.2.1.23); ou outras atividades.

[0112] Outra característica impressionante da biomassa que foi pré-tratada por auto-hidrólise de estágio único a níveis de severidade muito baixos é que as concentrações de subprodutos de pré-tratamento que servem como inibidores de organismos fermentadores são mantidas em níveis muito baixos. Como consequência, é tipicamente possível usar biomassa hidrolisada obtida por métodos da invenção diretamente nas fermentações, sem exigência de qualquer lavagem ou outra etapa de desintoxicação.

[0113] Conforme é bem conhecido na técnica, o pré-tratamento hidrotérmico de anto-hidrólise tipicamente produz uma variedade de subprodutos solúveis que atual como “inibidores de fermentação”, pelo fato de que esses inibem a proliferação e/ou o metabolismo de organismos fermentadores. Diferentes inibidores de fermentação são produzidos em diferentes quantidades, dependendo das propriedades da matéria-prima lignocelulósica e da severidade do pré- tratamento. Consultar Klinke et al. (2004). Pelo menos três categorias de inibidores de fermentação são tipicamente formadas durante o pré-tratamento de auto-hidrólise: (1) furanos, principalmente 2-furfural e 5-HMF (5 hidroximetilfurfural) que são produtos de degradação de mono ou oligossacarídeos; (2) fenóis monoméricos, que são produtos de degradação da estrutura de lignina; e (3) ácidos orgânicos pequenos, principalmente ácido acético, que se originam de grupos acetila em hemiceluloses, e lignina. A mistura de diferentes inibidores mostrou atuar de modo sinergético em fermentação de bioetanol com o uso de cepas de levedura, consultar, por exemplo, Palmquist et al. (1999), e, também, com o uso de Escherichia coli etanólico, consultar, por exemplo, Zaldivar et al. (1999). Em algumas modalidades, pode ser vantajoso submeter a biomassa pré-tratada à evaporação flash, com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, a fim de reduzir os níveis de inibidores voláteis, mais notavelmente furfural. Com o uso de auto-hidrólise com cepas típicas de matérias-primas de biomassa, tais como palha de trigo, bagaço de sorgo doce, bagaço de cana-de-açúcar, palha de milho e cachos de frutas vazios, pré-tratados até número de xilano 10% ou mais alto, por experiência apenas os níveis de ácido acético e furfural são potencialmente inibidores de organismos fermentadores. Nos casos em que as matérias-primas de biomassa são pré-tratadas a DM 35% ou mais a número de xilano 10% ou mais, e nos casos em que a fração sólida é subsequentemente hidrolisada por enzima a 25% ou menos de DM, com água adicionada para ajustar a DM, mas sem etapas de lavagem, os níveis de furfural no hidrolisado podem ser tipicamente mantidos sob 3 g/kg e os níveis de ácido acético abaixo de 9 g/kg. Esses níveis são tipicamente aceitáveis para fermentações de levedura com o uso de cepas especializadas. Durante a hidrólise enzimática, parte do ácido acético adicional é liberada a partir da degradação de hemicelulose na fração sólida. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso remover parte do teor de ácido acético da fração líquida e/ou da fração sólida hidrolisada com o uso de eletrodiálise ou outros métodos conhecidos na técnica.

[0114] Diferentes matérias-primas podem ser pré- tratadas com o uso de auto-hidrólise de estágio único à baixa severidade log Ro suficiente para produzir biomassa pré- tratada que tem número de xilano 10% ou maior com o uso de uma variedade de diferentes combinações de tempos de residência em reator e temperaturas. Um versado na técnica determinará facilmente através de experimentação de rotina uma rotina de pré-tratamento apropriada para aplicação com qualquer dada matéria-prima, com o uso de qualquer dado reator, e com qualquer dado sistema de carregamento em reator e descarregamento em reator de biomassa. Nos casos em que as matérias-primas são pré-tratadas com o uso de um reator contínuo, carregado por um sistema de barragem ou um alimentador de conector de rosca, e descarregado por ou um sistema de barragem de “bomba de partículas” ou um sistema de hidrociclone, severidade muito baixa de 10% ou número de xilano maior pode ser atingido com o uso de cepas típicas de palha de trigo ou cachos de frutas vazios por uma temperatura de 180 °C e um tempo de residência em reator de 24 minutos, ou temperaturas dentro da faixa de 175 °C a 185 °C para tempos de residência dentro da faixa de 18 a 35 minutos, ou temperaturas dentro da faixa de 170 °C a 190 °C para tempos de residência dentro da faixa de 13 a 40 minutos. Para cepas típicas de palha de milho, bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de sorgo doce, severidade muito baixa de 10% ou número de xilano maior pode ser tipicamente atingido com o uso dentro da faixa de 175 °C a 185 °C para tempos de residência dentro da faixa de 8 a 25 minutos, ou temperaturas dentro da faixa de 170 °C a 190 °C para tempos de residência dentro da faixa de 6 a 35 minutos. Será facilmente entendido por um versado na técnica que os tempos de residência e as temperaturas podem ser ajustados para atingir níveis comparáveis de severidade Ro.

[0115] A hidrólise enzimática de matérias-primas pré-tratadas a número de xilano 10% ou mais alto pode ser tipicamente conduzida em DM alta > 20% com consumo de enzima comercialmente razoável, sem exigência de etapas de lavagem ou desintoxicação específicas, nos casos em que a fração sólida é prensada a pelo menos 40% de DM, ou nos casos em que o teor de sólidos dissolvidos da fração sólida é reduzido em pelo menos 50%.

[0116] Em algumas modalidades, a mistura de enzimas pode incluir, ainda, qualquer uma ou mais dentre atividade de manosidases (EC 3.2.1.25), a-D-galactosidases (EC 3.2.1.22), a-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), a-D- glucuronidases (EC 3.2.1.139), cinamoil esterases (EC 3.1.1.), ou feruloil esterases (EC 3.1.1.73), acetil xilano esterases (EC 3.1.1.72); B-1,3 xilosidase (EC 3.2.1.72); atividade de alfa 1,3 e/ou alfa 1, 5 arabinofuranosidase (EC 3.2.1.23); ou outras atividades.

[0117] Um versado na técnica determinará facilmente um nível de dose apropriado de qualquer dada preparação de enzima para aplicação, e condições de pH e temperatura apropriadas assim como uma duração apropriada para hidrólise enzimática. Conforme mencionado anteriormente, a duração da hidrólise pode variar dependendo dos objetivos de processo. A hidrólise mais longa leva a rendimentos de conversão de glicose finais melhores, mas impõe custos de capital e operacionais maiores em escala de produção. A duração da hidrólise, em algumas modalidades, é pelo menos 24 horas, ou pelo menos 36 horas, ou pelo menos 48 horas, ou pelo menos 64 horas, ou pelo menos 72 horas, ou pelo menos 96 horas, ou por um tempo entre 24 e 150 horas. É, de modo geral, vantajoso manter níveis de dose de enzima mais baixos, de modo a minimizar os custos de enzima. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso usar uma dose de enzima alta. Na prática dos métodos da invenção, um versado na técnica pode determinar uma otimização econômica de dose de enzima considerando fatores relevantes, incluindo custos de biomassa locais, preços de mercado para correntes de produto, custos de capital de instalação totais e esquemas de amortização e outros fatores. Nas modalidades em que uma preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica é usada, uma faixa de dose geral fornecida por fabricantes pode ser usada para determinar a faixa geral dentro da qual otimizar.

[0118] Em algumas modalidades, após uma fração sólida separada ter sido hidrolisada por enzima a um grau de conversão desejado, a fração líquida, que foi mantida em desvio de C5, é misturada com a mistura de hidrolisado para pós-hidrólise. Em algumas modalidades, toda a fração líquida recuperada pode ser adicionada de uma vez, enquanto, em outras modalidades, parte do componente da fração líquida pode ser removido e/ou a fração líquida pode ser adicionada em incrementos. Em algumas modalidades, antes da mistura com a fração líquida, a fração sólida é hidrolisada a pelo menos 50%, ou pelo menos 55%, ou pelo menos 60% de conversão de celulose, significando que pelo menos o rendimento teórico especificado de monômeros de glicose é obtido no hidrolisado. Uma porção substancial de xilo-oligômeros presentes na fração líquida pode ser tipicamente hidrolisada em monômeros de xilose por ação de xilanase e outras enzimas que permanecem ativas dentro da mistura de hidrolisado. Em algumas modalidades, a pós-hidrólise é conduzida por pelo menos 6 horas, ou por um tempo entre 15 e 50 horas, ou por pelo menos 24 horas. Em algumas modalidades, pelo menos 60%, ou pelo menos 65%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90% em massa dos xilo-oligômeros presentes na fração líquida são hidrolisados em monômeros de xilose durante a pós-hidrólise por ação de xilanase e outras enzimas que permanecem ativas dentro da mistura de hidrolisado. Em algumas modalidades, a fração líquida é misturada com hidrolisado diretamente, sem mais adição de aditivos químicos. Em algumas modalidades, alguns componentes da fração líquida, tal como ácido acético, furfural ou fenóis, podem ser removidos da fração líquida antes da mistura com o hidrolisado.

[0119] Em algumas modalidades, a hidrólise enzimática da fração sólida e/ou pós-hidrólise da fração líquida pode ser conduzida como um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Conforme é bem conhecido na técnica, quando SSF pode ser conduzido na mesma temperatura que aquela que é ideal para a hidrólise enzimática, o consumo de enzima pode ser minimizado devido ao fato de que um organismo fermentador introduzido durante o curso da hidrólise enzimática consome os monômeros de glicose e xilose e, assim, reduz a inibição de produto de reações catalisadas por enzima. Em algumas modalidades, a pós-hidrólise é apenas conduzida após a fração de fibra ter sido hidrolisada, sem a adição de organismo fermentador, a pelo menos 60% de conversão de celulose. Em algumas modalidades, o SSF pode ser conduzido após um período inicial de hidrólise enzimática, que é um organismo fermentador adicionado após um período inicial de hidrólise enzimática, e tanto a fermentação como a hidrólise continuam, opcionalmente a uma temperatura que não é ideal para a hidrólise enzimática.

[0120] Nos casos em que as matérias-primas de biomassa, tais como cepas típicas de palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de sorgo doce, palha de milho ou cachos de frutas vazios são pré-tratados a 35% ou mais de DM por auto-hidrólise de estágio único à severidade log Ro suficientemente baixa de modo a produzir biomassa pré-tratada que tem número de xilano 10% ou maior, nos casos em que a fração sólida da biomassa pré-tratada é obtida tendo pelo menos 40% de DM ou tendo pelo menos 50% de remoção de sólidos dissolvidos, nos casos em que a fração sólida é subsequentemente submetida à hidrólise enzimática em DM entre 15 e 27% com o uso de uma preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica, nos casos em que a hidrólise enzimática é conduzida por pelo menos 48 horas, nos casos em que a fração líquida é adicionada ao hidrolisado de fração sólida após pelo menos 50% de conversão de glicose terem sido obtidos e nos casos em que a fração líquida adicionada é submetida à pós-hidrólise por um período de pelo menos 6 horas, é tipicamente possível atingir concentrações de monômero C5 no hidrolisado C5/C6 combinado que correspondem aos rendimentos de monômero C5 de 60% ou mais do rendimento de monômero C5 máximo teórico.

[0121] Em algumas modalidades, um hidrolisado C5/C6 combinado pode ser diretamente fermentado em etanol com o uso de uma ou mais cepas de levedura modificadas.

[0122] A Figura 9 mostra um esquema de processo para uma modalidade. Conforme mostrado, a biomassa lignocelulósica mole é embebida, lavada ou umedecida a DM 35% ou mais. A biomassa é pré-tratada em pH dentro da faixa de 3,5 a 9,0 com o uso de vapor pressurizado em auto-hidrólise de estágio único a uma severidade caracterizada por número de xilano 10% ou maior. A biomassa pré-tratada é submetida à separação de sólido/líquido, produzindo uma fração líquida e uma fração sólida que tem teor de DM 40% ou maior. A fração sólida é ajustada a um teor de DM apropriado, então, submetido à hidrólise enzimática em teor de DM 15% ou maior a um grau de conversão de celulose de 60% ou maior. A fração líquida separada é subsequentemente misturada com a fração sólida hidrolisada e submetida à pós-hidrólise, segundo a qual uma quantidade substancial de xilo-oligômeros presentes na fração líquida é hidrolisada em xilose monomérica. Após o final da hidrólise e da pós-hidrólise conforme descrito, o rendimento de monômero C5 é tipicamente pelo menos 60%, enquanto a conversão de celulose é similarmente pelo menos 60%.

[0123] Em modalidades alternativas, a biomassa pré-tratada é submetida à hidrólise enzimática como uma pasta fluida inteira. Em ainda outras modalidades, uma fração líquida é separada e uma fração sólida submetida à hidrólise enzimática e fermentação subsequente. Em algumas modalidades, após a recuperação de etanol de tal fermentação, a vinhaça fina remanescente pode ser mesclada com a fração líquida separada e usada como substrato de biometano.

EXEMPLOS:

[0124] Exemplo 1. Caracterização de ”número de xilano” de fração sólida como uma medida de severidade de pré-tratamento.

[0125] Palha de trigo (WS), palha de milho (CS), bagaço de cana-de-açúcar (SCB) e cachos de frutas vazios (EFB) foram embebidos com 0 a 10 g de ácido acético/kg de matéria seca de biomassa, pH > 4,0, antes do pré-tratamento a 35 a 50% de matéria seca cerca de 60 kg DM/h de biomassa foram pré-tratados a temperaturas de 170 a 200 °C com um tempo de residência de 12 a 18 minutos. A biomassa foi carregada no reator com o uso de um sistema de barragem e o material pré-tratado descarregado com o uso de um sistema de barragem. A pressão dentro do reator de pré-tratamento pressurizado correspondeu à pressão de vapor saturado na temperatura usada. A biomassa pré-tratada foi submetida à separação de sólido/líquido com o uso de uma prensa de rosca, produzindo uma fração líquida e uma fração sólida que tem cerca de 30% de matéria seca. A fração sólida foi lavada com cerca de 3 kg de água /kg de biomassa seca e prensada a cerca de 30% de matéria seca novamente. Os detalhes em relação ao processo e ao reator de pré-tratamento são descritos adicionalmente em Petersen et al. (2009).

[0126] As matérias-primas brutas foram analisadas quanto aos carboidratos de acordo com os métodos descritos em Sluiter el al. (2005) e Sluiter et al. (2008) com o uso de um sistema de HPLC Dionex Ultimate 3000 com uma coluna H+ de Monossacarídeo Rezex da Phenomenex. As amostras de fração líquida e fração sólida foram coletadas após três horas de pré-tratamento contínuo e as amostras foram coletadas três vezes durante três oras para garantir que uma amostra fosse obtida de pré-tratamento em estado estável. As frações sólidas foram analisadas quanto aos carboidratos de acordo com os métodos descritos em Sluiter et al. (2008) com um sistema HPLC Ultimate 3000 da Dionex equipado com uma coluna de Monossacarídeo H+ de Monossacarídeo Rezex. As frações líquidas foram analisadas quanto aos carboidratos e produtos de degradação de acordo com os métodos descritos em Sluiter et al. (2006) com um sistema HPLC Ultimate 3000 da Dionex equipado com uma coluna de Monossacarídeo H+ de Monossacarídeo Rezex. Os produtos de degradação na fração sólida foram analisados por suspensão da fração sólida em água com 5 mM de ácido sulfúrico em uma razão de 1:4 e em seguida analisados de acordo com os métodos descritos em Sluiter et al. (2006) com um sistema HPLC Ultimate 3000 da Dionex equipado com uma coluna H+ de Monossacarídeo Rezex. O teor de matéria seca e a quantidade de sólidos suspensos foi analisado de acordo com os métodos descritos em Weiss et al. (2009). Os saldos de massa foram configurados conforme descrito em Petersen et al. (2009) e as recuperações de celulose e hemicelulose foram determinadas. A quantidade de açúcares que foram degradados em 5-HMF ou furfural e a quantidade de acetato liberado a partir de hemicelulose durante o pré-tratamento por kg de matéria seca de biomassa foi quantificada também, embora a perda de furfural devido à vaporização não seja considerada.

[0127] A severidade de um processo de pré- tratamento é comumente descrita por um fator de severidade, primeiramente desenvolvido por Overend et al. (1987). O fator de severidade é tipicamente expresso como um valor em log de modo que log(R0)=t*eksp((T-Tref)/14,75), em que R0 é o fator de severidade, t é o tempo de residência em minutos, T é a temperatura e Tref é a temperatura de referência, tipicamente 100 °C. O fator de severidade é baseado em cinética de solubilização de hemicelulose conforme descrito por Belkecemi et al. (1991), Jacobsen e Wyman (2000) ou Lloyd et al. (2003). A severidade de um pré-tratamento está, assim, relacionada ao teor de hemicelulose residual remanescente na fração sólida após o pré-tratamento.

[0128] As frações sólidas preparadas e lavadas conforme descrito forma analisadas quanto ao teor de C5 de acordo com os métodos descritos por Sluiter et al. (2008) com um sistema de HPLC Dionex Ultimate 3000 com uma coluna H+ de Monossacarídeo Rezex da Phenomenex. O teor de xilano na fração sólida produzida e lavada conforme descrito acima é linearmente dependente do fator de severidade para biomassas lignocelulósicas moles, tais como, por exemplo, palha de trigo, palha de milho de EFB quando pré-tratadas por auto- hidrólise hidrotérmicas. A definição de severidade como o teor de xilano em uma fração sólida preparada e lavada conforme descrito acima é transferível entre configurações de pré-tratamento. O número de xilano é o teor de xilano medido nas frações sólidas lavadas, o que inclui alguma contribuição de material solúvel. A dependência de número de xilano em severidade de pré-tratamento log(Ro) é mostrada na Figura 1 para palha de trigo, palha de milho, bagaço de cana-de-açúcar e cachos de frutas vazios do processamento de dendezeiro.

[0129] Conforme mostrado, existe uma correlação negativa clara entre o número de xilano e a severidade de pré-tratamento para cada uma das matérias-primas de biomassa testadas pré-tratadas por auto-hidrólise de estágio único.

[0130] O teor de xilano de sólidos não dissolvidos nos experimentos foi também calculado como o teor de xilano total em fração de fibra da qual é subtraído o teor de xilano dissolvido no líquido entre as fibras (oligômeros e monômeros).

[0131] [Xilano sólido em fibras](peso-%) =[Xilano total em fração de fibra] (peso-%)- [Xilano dissolvido em fração de fibra] (peso-%)

[0132] O teor de xilano dissolvido é calculado por [(sólidos dissolvidos/ sólidos totais) como % em peso em fração de fibra] x [concentração de xilano dissolvido em fração líquida].

[0133] O teor de xilano calculado de sólidos não dissolvidos em % em peso é mostrado como uma função de número de xilano na Figura 2 para palha de trigo (PWS), palha de milho (PCS), bagaço de cana-de-açúcar (SCB) e cachos de frutas vazios de dendezeiro (PEFB) pré-tratados.

[0134] Exemplo 2. Recuperação de C5 como uma função de severidade de pré-tratamento.

[0135] As matérias-primas de biomassa foram pré- tratadas e as amostras caracterizadas conforme descrito no exemplo 1. A Figura 3 mostra as recuperações de C5 (xilose + arabinose) como uma função de of número de xilano para experimentos em que a palha de trigo foi pré-tratada por auto-hidrólise de estágio único. As recuperações de C5 são mostradas como sólidos insolúveis em água (WIS), sólidos solúveis em água (WSS) e recuperação total. Conforme mostrado, a recuperação de C5 como sólidos tanto insolúveis em água como solúveis em água aumenta conforme o número de xilano aumenta. Conforme o número de xilano aumenta acima de 10%, a recuperação de C5 como sólidos solúveis em água diminui enquanto a recuperação de C5 como sólidos insolúveis em água continua a aumentar.

[0136] As cepas típicas de palha de trigo testadas continham cerca de 27% de hemicelulose em base de matéria seca antes do pré-tratamento. A Figura 4 mostra a recuperação de C5 total após o pré-tratamento como uma função de número de xilano para palha de trigo, palha de milho, bagaço de cana-de-açúcar e EFB pré-tratados por auto- hidrólise. As cepas típicas de palha de milho, bagaço de cana de açúcar e EFB testadas continham cerca de 25%, 19% e 23%, respectivamente de teor de C5 em base de matéria seca antes do pré-tratamento. Conforme mostrado, para todas as matérias- primas, a recuperação de C5 total após o pré-tratamento é dependente da severidade de pré-tratamento conforme definida pelo número de xilano de biomassa pré-tratada. Conforme mostrado, nos casos em que 90% do teor de C5 recuperado após o pré-tratamento podem ser completamente hidrolisados em monômero C5, pelo menos 60% de rendimento de monômero C5 final após a hidrólise enzimática podem ser tipicamente esperados nos casos em que a severidade de pré-tratamento é caracterizada por produção de um número de xilano de 10% ou mais alto.

[0137] Exemplo 3. Produção de produtos de degradação que inibem enzimas e proliferação de levedura como uma função de severidade de pré-tratamento.

[0138] As matérias-primas de biomassa foram pré- tratadas e as amostras caracterizadas conforme descrito no exemplo 1. A Figura 5 mostra a dependência de liberação e produção de ácido acético de furfural e 5-hidróxi-metil- fufural (5-HMF) como uma função do número de xilano para experimentos em que a palha de trigo foi pré-tratada por auto-hidrólise de estágio único. Conforme mostrado, a produção desses produtos de degradação, que são bem conhecidos por inibir a levedura fermentadora e que, em alguns casos, também inibem as enzimas celulase, exibe um aumento potencial em número de xilanos menor que 10%. Em número de xilano 10% e mais alto, os níveis de furfural e ácido acético estão dentro de faixas que permite a fermentação de biomassa pré-tratada sem exigência de etapas de desintoxicação. No caso de ácido acético, os níveis são adicionalmente aumentados durante a hidrólise enzimática de biomassa pré-tratada ao número de xilano 10% e mais alto, embora tipicamente a níveis que são bem tolerados por levedura modificada para consumir ambos os açúcares C5 e C6.

[0139] Exemplo 4. Inibição de enzimas celulase por material remanescente em fração sólida como uma função de % de DM de fração sólida.

[0140] Os experimentos foram conduzidos em um reator de queda livre de 6 câmaras que funciona, a princípio, como o reator de 6 câmaras descrito e usado no documento WO2006/056838. O reator de hidrólise de 6 câmaras foi projetado a fim de realizar experimentos com liquefação e hidrólise a concentrações de sólido acima de 20% de DM. O reator consiste em um tambor posicionado na horizontal dividido em 6 câmaras separadas, cada um com 24 cm de largura e 50 cm de altura. Uma haste de rotação horizontal montada com três pás em cada câmara é usada para mistura/agitação. Um motor de 1,1 kW é usado como acionamento e a velocidade rotacional é ajustável dentro da faixa de 2,5 e 16,5 rpm. A direção de rotação é programada para mudar a cada segundo minuto entre sentido horário e anti-horário. Uma camisa de aquecimento preenchida com água no exterior possibilita o controle da temperatura até 80 °C.

[0141] Os experimentos usaram palha de trigo, pré-tratada por auto-hidrólise de estágio único com o uso do sistema descrito no exemplo 1. A biomassa foi umedecida a uma DM de > 35% e pré-tratada em pH > 4,0 por vapor á severidade log Ro de aproximadamente 3,7, produzindo material pré- tratado que tem número de xilano 10,5%. O pré-tratamento foi conduzido na instalação piloto Inbicon em Skarbak, Dinamarca. A biomassa foi carregada no reator de pré-tratamento com o uso de um sistema de barragem e a biomassa pré-tratada removida do reator com o uso de um sistema de barragem. A biomassa pré-tratada foi, em alguns casos, submetida à separação de sólido/líquido com o uso de uma prensa de rosca, produzindo uma fração líquida e uma fração sólida. A fração sólida tinha um teor de DM de cerca de 30%, continha a maior parte da celulose e da lignina iniciais, parte da hemicelulose e um total de cerca de 25% dos sólidos dissolvidos.

[0142] As câmaras do reator de 6 câmaras foram preenchidas com ou biomassa pré-tratada total que compreende todos os sólidos dissolvidos e não dissolvidos ou fração sólida prensada que compreende cerca de 25% dos sólidos totais dissolvidos. O teor de matéria seca foi ajustado em 19% de DM. A biomassa pré-tratada foi, então, hidrolisada a 50 °C e pH 5,0 a 5,3 com o uso de 0,08 ml de CTec2 ™ da Novozymes / g de glucano ou 0,2 a 0,3 ml de Accellerase TRIO ™ da Dupont, Genencor / g de glucano. Esses níveis de dose dessas preparações de celulase comercialmente disponíveis otimizadas para conversão de biomassa lignocelulósica estavam também dentro da faixa sugerida pelos fabricantes. Os experimentos de hidrólise enzimática foram conduzidos por 96 horas a uma velocidade de mistura de 6 rpm.

[0143] Pode ser mostrado que as atividades de enzima no experimento com Accellerase TRIO conforme medidas conforme descrito no presente documento estavam inicialmente dentro da faixa de exoglucanase a 280 a 5.000 nkat/g de glucano, endoglucanase a 1.100 a 20.000 nkat/g de glucano, β- glicosidase 3.000 a 25.000 nkat/g de glucano, endoxilanase a 1.400 a 30.000 nkat/g de glucano, β-xilosidase a 75 a 25.000 nkat/g de glucano.

[0144] A Figura 6 mostra a conversão de celulose após a hidrólise enzimática sob essas condições como uma função de % de sólidos dissolvidos removida antes da hidrólise enzimática. Conforme mostrado, a remoção de 75% de sólidos dissolvidos nesses níveis de dose de enzima aprimora a conversão de celulose em 10 a 20% em termos absolutos. Assim, em casos em que a hidrólise enzimática deve ser conduzida com o uso de uma fração sólida separada, é vantajoso prensar a fração sólida ao teor de DM de pelo menos 40% ou reduzir de outro modo o teor de sólidos dissolvidos em pelo menos 50% antes da hidrólise enzimática, já que isso fornecerá tipicamente desempenho de enzima aprimorado.

[0145] Exemplo 5. Teor de açúcar e hidrólise da fração líquida da biomassa pré-tratada para número de xilano > 10%.

[0146] A palha de trigo, palha de milho e o bagaço de cana-de-açúcar foram pré-tratados até severidade log Ro 3.63, produzindo uma palha de trigo pré-tratada (WS) que tem número de xilano 11,5%, até log Ro 3,51 produzindo bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado (SCB) que tem número de xilano 12,3% e até log Ro 3,35, produzindo palha de milho pré-tratada (CS) que tem número de xilano 15,5%. As matérias- primas pré-tratadas foram submetidas à separação de sólido/líquido para produzir uma fração líquida e uma fração sólida, conforme descrito no exemplo 4. As frações líquidas foram analisadas quanto a carboidratos e produtos de degradação de acordo com os métodos descritos com o uso de (Sluiter, Hames et al. 2005) um sistema Dionex Ultimate 3000 HPLC equipado com uma coluna Rezex Monosaccharide. A Tabela 2 mostra o teor de açúcar das frações líquidas expresso como uma porcentagem do teor de DM quebrado em categorias de glicose/glucano, xilose/xilano e arabinose/arabinano oligoméricos e monoméricos. Conforme mostrado, embora algum teor de glicose esteja presente tanto na forma monomérica quanto na oligomérica, a maior parte do teor de açúcar é xilano oligomérico. A predominância de oligômeros de xilano na fração líquida obtida com o uso de auto-hidrólise está no contraste notado com a fração líquida obtida com o uso de pré-tratamento com ácido diluído. Na biomassa pré-tratada por pré-tratamento hidrotérmico com ácido diluído, a fração líquida é tipicamente hidrolisada em constituintes monoméricos pela ação do catalisador de ácido.

[0147] Tabela 2. Teor de açúcar das frações líquidas na biomassa pré-tratada para número de xilano > 10%.

[0148] A fração líquida da palha de trigo pré- tratada foi adicionalmente caracterizada pela análise HPLC com o uso de uma coluna Thermo Scientific Dionex CarboPacTM PA200 com o uso de um sistema cromatográfico Dionex ICS-5000 modular. Os analitos foram separados com o uso de condições de gradiente de NaOH/NaOAc e medidos pela detecção amperométrica integrada e pulsada (IPAD) com o uso de um eletrodo de ouro. A Figura 7 mostra um cromatograma de HPLC no qual o perfil de eluição dos padrões de xilobiose (X2), xilotriose (X3), xilotetraose (X4), xilopentaose (X5) e xiloexaose (X6) é sobreposto como o traço superior sobre o traço inferior, que retrata o perfil de eluição da fração líquida. Conforme mostrado, a fração líquida da biomassa auto-hidrolisada contém uma mistura que compreende uma pequena quantidade de monômero de xilose e quantidades comparativamente maiores de xilobiose (X2), xilotriose (X3), xilotetraose (X4), xilopentaose (X5) e xiloexaose (X6), juntamente com outros materiais.

[0149] Exemplo 6. Hidrólise enzimática da fração sólida e adição da fração líquida após a hidrólise de fibra da biomassa pré-tratada ao número de xilano > 10% e prensada a > 40% de DM seguida pela pós-hidrólise.

[0150] Os experimentos foram conduzidos em um reator de queda livre com 6 câmaras conforme descrito no exemplo 4.

[0151] Os experimentos usaram palha de trigo, palha de milho ou bagaço de cana-de-açúcar pré-tratados por auto-hidrólise de estágio único até severidade log Ro entre cerca de 3,19 e 3,73 para produzir a biomassa pré-tratada que tem números de xilano na faixa de 11,5 a 15,6%. A biomassa foi cortada e umedecida a uma DM de > 35% e pré-tratada por vapor a 170 a 190 °C por 12 min. O pré-tratamento foi conduzido na fábrica piloto Inbicon em Skarbak, Dinamarca. A biomassa pré-tratada foi submetida à separação de sólido/líquido com o uso de uma prensa de rosca para produzir uma fração sólida que tem > 40% de DM. A fração líquida foi guardada (desvio de C5) de modo a ser subsequentemente adicionada ao hidrolisato (pós-hidrólise).

[0152] As câmaras do reator com 6 câmaras foram carregadas com cerca de 10 kg de fração sólida de biomassa pré-tratada prensada e ajustadas por adição de água a 19 a 22% de DM. A fração sólida pré-tratada foi hidrolisada a 50 °C e pH 5,0 a 5,3 com o uso de ACCELLERASE TRIO ™ junto à GENENCOR-DuPONT. A velocidade de mistura foi 6 rpm. Os experimentos de hidrólise foram executados por 96 horas e, posteriormente, a fração líquida guardada (desvio de C5) foi adicionada e a pós-hidrólise foi executada por 48 horas a 50 °C e pH 5,0 a 5,3.

[0153] As amostras de HPLC foram retiradas hemicelulose e analisadas quanto à glicose, xilose e arabinose com o uso de um sistema Dionex Ultimate 3000 HPLC equipado com uma coluna Rezex Monosaccharide com quantificação através do uso do padrão externo.

[0154] A Figura 8 mostra dados de hidrólise para a conversão de hemicelulose com adição da fração líquida após 96 horas de hidrólise da fração sólida com o uso de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado até número de xilano 12,3% e hidrolisado com o uso de 0,3 ml de Accellerase Trio ™ (Genencor) por g de glucano. É mostrado um perfil de hidrólise típico. A recuperação de monômero C5 é expressa como uma porcentagem de rendimento teórico do material presente na reação de hidrólise. A maior parte da hemicelulose dentro da fração sólida foi convertida em açúcares monoméricos dentro das primeiras 24 horas na hidrólise da fração sólida. A adição da fração líquida após 96 horas aumenta o rendimento potencial teórico, que explica a queda na conversão de C5 observada logo após a fração líquida ser adicionada. Dentro das primeiras 24 horas, a maior parte do C5 da fração líquida é convertida em monômeros. Em comparação à conversão de C5 logo antes da fração líquida ser adicionada com o ponto final da hidrólise, é possível calcular a conversão de C5 na fração líquida como 90% ao usar bagaço de cana-de-açúcar sob essas condições.

[0155] A Tabela 3 mostra os dados de hidrólise para diferentes biomassas pré-tratadas sob diferentes circunstâncias e hidrolisadas com o uso de diferentes níveis de dose de uma preparação de celulase comercialmente disponível otimizada para a conversão de biomassa lignocelulósica, Accellerase Trio ™ (Genencor). Todos os níveis de dose de enzima usados estavam dentro da faixa sugerida pelo fabricante. Conforme mostrado, com o uso da auto-hidrólise de estágio único e da hidrólise enzimática com desvio de C5 e pós-hidrólise, os rendimentos de monômero C5 de 60% ou mais podem ser alcançados com o uso de doses recomendadas pelos fabricantes de preparações de celulase comercialmente disponíveis otimizadas para a conversão de biomassa lignocelulósica enquanto ainda alcançam uma conversão de celulose de 60% ou mais.

[0156] Pode ser mostrado que as atividades de enzima nos experimentos referenciados na Tabela 3 com Accellerase TRIO medidas conforme descrito no presente documento estavam inicialmente dentro da faixa exoglucanase a 280 a 5.000 nkat/g de glucano, endoglucanase a 1.100 a 20.000 nkat/g de glucano, β-glucosidase a 3.000 a 25.000 nkat/g de glucano, endoxilanase a 1.400 a 30.000 nkat/g de glucano, β- xilosidase a 75 a 25.000 nkat/g de glucano nkat/g de glucano.

[0157] Tabela 3. Rendimentos de hidrólise com o uso de auto-hidrólise de estágio único de severidade muito baixa com desvio de C5 e pós-hidrólise.

[0158] Exemplo 7. Cofermentação em etanol de açúcares C5 e C6 em hidrolisato combinado por levedura modificada.

[0159] Como um exemplo do uso de um hidrolisato produzido a partir da biomassa lignocelulósica macia (nesse caso, palha de trigo) preparada pelo pré-tratamento de auto- hidrólise de estágio único até um número de xilano > 10%, a Figura 9 mostra os dados para a fermentação realizada sem a desintoxicação ou quaisquer outras etapas de processo antes da fermentação com levedura GMO que tem a capacidade de converter açúcares C5 e C6 (cepa V1 junto à TERRANOL ™). A fração sólida da palha de trigo pré-tratada separada conforme descrito no exemplo 4 foi hidrolisada com o uso de Cellic Ctec2 ™ junto à Novozymes e, então, combinada com a fração líquida guardada e usada sem qualquer desintoxicação para remover os inibidores de fermentação.

[0160] O hidrolisato foi ajustado a um pH 5,5 com péletes de KOH antes da fermentação e suplementado com 3 g/l de ureia. A fermentação foi conduzida como uma fermentação em batelada. A concentração celular inicial no reator foi 0,75 g dw/l. As fermentações foram controladas a um pH 5,5 com o uso da adição automática de NH3 10%. A temperatura foi mantida a 30 °C e a taxa de agitação foi 300 rpm. Conforme mostrado, a glicose e a xilose são prontamente consumidas e o etanol prontamente produzido, não obstante a presença de ácido acético, furfural e outros compostos que se provariam tipicamente inibidores a níveis mais altos de severidade de pré-tratamento.

[0161] Exemplo 8. Determinação experimental dos níveis de atividade em preparações de celulase comerciais.

[0162] As preparações comerciais de ACCELLERASE TRIO TM junto à GENENCOR ™ e CELLIC CTEC2 ™ e CELLIC CTEC3 ™ junto à NOVOZYMES ™ foram diluídas de modo a as preparações de enzima tivessem densidade equivalente, significando que as alíquotas dimensionadas equivalentes tinham massa equivalente. Os volumes equivalentes de preparações de enzima diluídas foram adicionados e determinações de ensaio feitas em duplicata ou triplicata.

[0163] O ensaio da atividade de CBHI (exocelulase) foi conduzido em tampão de NaOAC a 50 mM a pH 5, 25° C, por 25 minutos. A atividade foi determinada em triplicata pela taxa contínua a seguir de liberação de 4- Metilumbeliferona (Abs: 347 nm) a partir do substrato modelo 4-metilumbeliferil-β-celobiosideo. A unidade de atividade foi 1 umol de equivalente de MeUmb/minuto. As concentrações de preparação de enzima foram 0,16, 0,14, 0,17 mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 0,5 mg/ml.

[0164] O ensaio da atividade de Endo-1,4-β- glucanase foi conduzido em tampão de NaOAC a 50 mM, pH 5, 50° C, por 60 minutos. A atividade foi determinada em triplicata pela a alteração de absorbância seguinte associada à geração de extremidades de redução do substrato modelo Avicel PH-101. A unidade de atividade foi 1 μmol de equivalente de glicose/min. As concentrações de preparação de enzima foram 0,80, 0,67, 0,79 mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 80 mg/ml.

[0165] O ensaio da atividade de β-glucosidase foi conduzido em tampão de NaOAC a 50 mM, pH 5, 50° C, por 20 minutos. A atividade foi determinada em triplicata pela a alteração de absorbância seguinte associada à liberação de glicose do substrato modelo celobiose. A unidade de atividade foi 2 μmoles de glicose/min. As concentrações de preparação de enzima foram 0,1, 0,12, 0,12 mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 1,7 mg/ml.

[0166] O ensaio da atividade de Endo-1,4-β- xilanase foi conduzido em tampão de NaOAC a 50 mM, pH 5, 50° C, por 60 minutos. A atividade foi determinada em triplicata pela a alteração de absorbância seguinte associada à geração de extremidades de redução do substrato modelo arabinoxilano extraível em água. A unidade de atividade foi 1 μmol de equivalente de glicose/min. As concentrações de preparação de enzima foram 1,12, 0,97, 1,12 mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 10 mg/ml.

[0167] O ensaio da atividade de β-xilosidase foi conduzido em tampão de NaOAC a 50 mM, pH 5, 50° C, por 60 minutos. A atividade foi determinada em duplicata pela liberação seguinte de xilose associada à hidrólise do substrato modelo arabionxilano extraível em água. A unidade de atividade foi 1 μmol de xilose/min. As concentrações de preparação de enzima foram 1,12, 0,97, 1,12 mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 10 mg/ml.

[0168] O ensaio da atividade de β-L- arabinofuranosidase foi conduzido em tampão de NaOAC a 50 mM, pH 5, 50° C, por 60 minutos. A atividade foi determinada em triplicata pela liberação seguinte de arabinoase associada à hidrólise do substrato modelo arabionxilano extraível em água. A unidade de atividade foi 1 μmol de arabinose/min. As concentrações de preparação de enzima foram 1,12, 0,97, 1,12 mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 10 mg/ml.

[0169] O ensaio da atividade de Amiloglicosidase (AMG) foi conduzido em tampão de NaOAC a 50 mM, pH 5, 50° C, por 80 minutos. A atividade foi determinada em triplicata pela a alteração de absorbância seguinte associada à liberação de glicose do substrato modelo amido de milho solúvel. A unidade de atividade foi 1 μmoles de glicose/min. As concentrações de preparação de enzima foram 1,12, 0,97, 1,12 mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 10 mg/ml.

[0170] O ensaio da atividade de αamilase foi conduzido em tampão de NaOAC a 50 mM, pH 5, 50° C, por 60 minutos. A atividade foi determinada em triplicata pela a alteração de absorbância seguinte associada à geração de extremidades de redução do substrato modelo amido de milho solúvel. A unidade de atividade foi 1 μmol de equivalente de glicose/min. As concentrações de preparação de enzima foram 1,12, 0,97, 1,12 mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 10 mg/ml.

[0171] O ensaio da atividade de acetil xilano esterase foi conduzido em tampão de Succinato a 100 mM, pH 5, 25° C, por 25 minutos. A atividade foi determinada em triplicata pela taxa contínua a seguir de liberação de 4- Nitrofenil (Abs: 410 nm) do substrato modelo acetato de 4 4- Nitrofenil. A unidade de atividade foi 1 μmol de equivalente de pNP/min. As concentrações de preparação de enzima foram 0,48, 0,42, 0,51mg/ml respectivamente para os ensaios CTEC3, ACTrio e CTEC2. A concentração de substrato foi 10 mg/ml.

[0172] Os resultados das determinações de atividade são mostrados na Tabela 1.

[0173] Esses resultados fornecem uma comparação qualitativa entre as preparações de enzima, mas não são, na maioria dos casos, conduzidos de acordo com os métodos usados para determinar os valores de nkat para as atividades de enzima para os propósitos das reivindicações no presente documento.

[0174] Exemplo 9. Identificação de atividades de enzima importantes para alcançar rendimento de monômero C5 alto na hidrólise enzimática da matéria-prima pré-tratada por auto-hidrólise de estágio único de baixa severidade.

[0175] A palha de trigo foi pré-tratada conforme descrito no exemplo 4 até severidade log Ro 3,52 (183° C por um tempo de permanência de 12 minutos) para produzir uma biomassa pré-tratada que tem um número de xilano 13,5%, com aproximadamente 7,8% em peso de xilano restante nos sólidos não dissolvidos, conforme estimado a partir da Figura 2. A recuperação de glucano do pré-tratamento foi 100%. A recuperação de xilano do pré-tratamento foi 77%.

[0176] As medições de atividade de celulase em Unidades de Filtro de Papel (FPU) foram determinadas para três preparações de enzima comercialmente disponíveis separadas ACCELLERASE TRIO TM junto à GENENCOR ™, CELLIC CTEC3 ™ junto à NOVOZYMES ™ e uma mistura de CELLUCLAST e NOVOZYME 188 junto à NOVOZYMES ™ misturadas na razão em peso 1:0,2, respectivamente. As atividades de FPU foram determinadas pelo método de Ghose (1987) e reveladas como sendo 179 FPU/g de preparação de enzima para CTEC3 e 60 FPU/g de preparação de enzima para CELLUCLCAST/188.

[0177] Os experimentos de hidrólise foram conduzidos essencialmente conforme descrito no exemplo 6, exceto que o teor de matéria seca inicial foi 22% de DM, 1% em peso de polietileno glicol (PEG) foi adicionado, a hidrólise inicial da fração sólida foi conduzida por 94 horas, a pós-hidrólise com fração líquida adicionada (desvio de C5) foi conduzida por 50 horas e a enzima usada foi CTEC3, ACTRIO ou CELLUCLAST/188 aplicada a uma dose equivalente em FPU/g de glucano de 14,3 FPU/g de glucano.

[0178] A dose real das enzimas aplicadas foi CTEC3 a 0,08 g/g de glucano, AcTRIO a 0,24 g/g de glucano, CELLUCLAST/188 a 0,22 g/g de glucano.

[0179] As atividades de enzima em nkat/g de glucano, para serem medidas conforme descrito no presente documento, que foram usadas no experimento foram estimadas como sendo conforme segue:

+ com base nos valores relatados por Juhasz et al. (2005)a medido com o uso de 4-metilumbeliferil-beta- celobiosídeo como substratob com base na folha de informações de produto ACCELLERASE TRIO que relata um valor de endoglucanase mínimo com o uso de carboximetilcelulose (CMC) como o substrato e presumindo que o valor correspondente para hidroxietilcelulose será aproximadamente 0,35 vezes o valor de CMC, tal como relatado por exemplo, por Dori et al. (1995) c com base na folha de informações de produto ACCELLERASE TRIO que relata os valores mínimosd com base na razão alternativamente medida da atividade de xilosidase em comparação a Trio:Celluclast de 3,86:1 por g de preparação de enzima.e com base na razão alternativamente medida da atividade de endoglucanase em comparação aCTEC3:TRIO de 3,12:1 por g de preparação de enzima.d com base na razão alternativamente medida da atividade de beta-glucosidase em comparação a CTEC3:TRIO de 3,76:1 por g de preparação de enzima.

[0180] Pode ser mostrado que as atividades deenzima nesses experimentos medidas conforme descrito nopresente documento estavam inicialmente dentro da faixaexoglucanase a 280 a 1.240 nkat/g de glucano, endoglucanasea 1.100 a 8.000 nkat/g de glucano, β-glucosidase a 3.000 a15.000 nkat/g de glucano, endoxilanase a 9.000 a 30.000nkat/g de glucano, β-xilosidase a 75 a 1.400 nkat/g deglucano nkat/g de glucano.

[0181] A Figura 11 mostra a conversão decelulose como uma função de tempo nas várias câmaras dereação. A conversão de celulose é determinada como aconcentração de glicose dividida pelo potencial de glicoseteórico no momento em que a amostra foi retirada. Quando odesvio de C5 é adicionado, o potencial de glicose muda namedida em que o desvio contém uma pequena quantidade deoligômeros de glicose que não são digeridos resultando em umadiminuição de conversão geral. Conforme mostrado, ascinéticas de conversão de celulose são equivalentes para ascâmaras de CTEC e TRIO, mas não para a câmara deCELLUCLAST/188. Isso é atribuído aos níveis apreciavelmentemenores de atividade de xilanase e xilosidase.

[0182] A Figura 12 mostra a conversão de xilano correspondente como uma função de tempo. A conversão de xilano é calculada do mesmo modo que para a conversão de celulose, mas, como o desvio de C5 contém uma quantidade grande de oligômeros de xilose, a conversão cai inicial e dramaticamente quando o desvio de C5 é adicionado ao hidrolisato. Conforme mostrado, as cinéticas de conversão de xilano são equivalentes para as câmaras de CTEC e TRIO, mas não para a câmara de CELLUCLAST/188. Isso é novamente atribuído aos níveis apreciavelmente menores de atividade de xilanase e xilosidase.

[0183] Quando a recuperação de xilano do pré-tratamento foi 77%, as recuperações de xilano mostradas naFigura 12 correspondem a uma recuperação de monômero C5 finalmuito alta no hidrolisato, por exemplo, 80% de conversão naFigura 12 corresponde a (0,80)*(0,77)= 61,6% de recuperaçãode monômero C5.

[0184] Os teores de glucano e xilano sãodeterminados conforme descrito em Sluiter, A., B. Hames, etal. (2005). Determination of Sugars, Byproducts, andDegradation Products in Liquid Fraction Process Samples, NREL- Biomass Program and in Sluiter, A., B. Hames, et al.(2006). Determintation of Structural Carbohydrates and Ligninin Biomass, NREL- Biomass Program.

[0185] Exemplo 10. A diluição à matéria seca inferior permite rendimentos de conversão equivalentes a uma dose de enzima menor com o uso da pasta fluida inteira.

[0186] Nos experimentos descritos no exemplo 9, duas câmaras do reator de hidrólise com 6 câmaras foram usadas para comparar a hidrólise da pasta fluida inteira, na qual a fração líquida separada da fração sólida após o pré- tratamento não foi guardada como o desvio para ser posteriormente adicionada ao hidrolisato, mas, em vez disso, foi mesclada de volta com a fração sólida e hidrolisada ao mesmo tempo. A pasta fluida inteira foi diluída a 12% de DM, que fornece a concentração de substâncias dissolvidas inibidoras como sendo aproximadamente equivalente a esta alcançada nas reações descritas no exemplo 9, em que os sólidos dissolvidos foram removidos e mantidos separados (desvio de C5) da hidrólise da fração sólida a 22% de DM. CTEC3 e ACTRIO foram usadas como a preparação de enzima e aplicadas a uma dose menor de 10,7 FPU/g de glucano.

[0187] As atividades de enzima em nkat/g de glucano, para serem medidas conforme descrito no presente documento, que foram usadas no experimento foram estimadas (com base nos valores dados no exemplo 9) como sendo conforme segue:

[0188] Pode ser mostrado que as atividades de enzima nesses experimentos medidas conforme descrito no presente documento estavam inicialmente dentro da faixa exoglucanase a 280 a 1.240 nkat/g de glucano, endoglucanase a 1.100 a 8.000 nkat/g de glucano, β-glucosidase a 3.000 a 15.000 nkat/g de glucano, endoxilanase a 9.000 a 30.000 nkat/g de glucano, β-xilosidase a 75 a 1.400 nkat/g de glucano nkat/g de glucano.

[0189] A Figura 13 mostra a conversão de celulose como uma função de tempo para ambas as amostras de hidrólise de pasta fluida inteira. A conversão de celulose é determinada como no exemplo 9. Conforme mostrado, as cinéticas de conversão de celulose são equivalentes para as câmaras de CTEC e TRIO. Ademais, não obstante a dose de enzima menor, os níveis de conversão são equivalentes àqueles alcançados com desvio de C5 e pós-hidrólise, conforme descrito no exemplo 9.

[0190] A Figura 14 mostra a conversão de xilano correspondente como uma função de tempo para ambas as amostras de hidrólise de pasta fluida inteira. Conforme mostrado, as cinéticas de conversão de xilano são aproximadamente equivalentes para as câmaras de CTEC e TRIO. Quando a recuperação de xilano do pré-tratamento foi 77%, as recuperações de xilano mostradas na Figura 14 correspondem a uma recuperação de monômero C5 final muito alta no hidrolisato, por exemplo, 80% de conversão na Figura 12 corresponde a (0,80)*(0,77)= 61,6% de recuperação de monômero C5. Conforme mostrado, na hidrólise de pasta fluida inteira, as recuperações de monômero C5 muito altas de pelo menos 55%, que correspondem a 71% de conversão de xilano na Figura 14, são alcançadas dentro de 41 horas de hidrólise sob essas condições.

[0191] Os vários parâmetros de pré-tratamento, hidrólise e recuperação para os experimentos descritos nos exemplos 9 e 10 são mostrados na Tabela 4.Tabela 4 Rendimentos de hidrólise com o uso daauto-hidrólise de estágio único de severidade muito baixa.

[0192] Exemplo 11. Hidrólise de pasta fluida inteira do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado.

[0193] O bagaço de cana-de-açúcar foi pré- tratado conforme descrito no exemplo 4 até severidade log Ro 3,43 (180° C por um tempo de permanência de 12 minutos) para produzir uma biomassa pré-tratada que tem um número de xilano 12,0%, com aproximadamente 6,8% em peso de xilano restante nos sólidos não dissolvidos, conforme estimado a partir da Figura 2. A recuperação de xilano do pré-tratamento foi 83%. Após sair do reator, a pasta fluida foi prensada a uma fração de fibra de aproximadamente 57% e uma fração líquida. O material pré-tratado, a fração de fibra assim como a fração líquida, foi coletado e analisado. A matéria seca e a composição das amostras foram determinadas conforme descrito nas amostras anteriores.

[0194] Os experimentos foram conduzidos no reator com 6 câmaras descrito no exemplo 6. O bagaço pré- tratado foi usado como a mistura de pasta fluida inteira, em que a fração de fibra foi misturada com a fração líquida antes da adição de enzima. O teor de matéria seca foi ajustado com água a 18% em peso de DM. A hidrólise foi executada a 50° C com um pH ajustado entre 4,7 e 5,3 com o uso de 20% em peso da solução de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2). Accellerase Trio foi usada como a enzima em uma concentração de 0,16 ml/g de glucano (9,5 FPU/g de glucano). Cada dia, uma amostra foi retirada e analisada quanto ao teor de açúcar. Após 118 h, a hidrólise foi parada. Os experimentos foram realizados em determinação dupla.

[0195] As atividades de enzima em nkat/g de glucano, para serem medidas conforme descrito no presente documento, que foram usadas no experimento foram estimadas (com base nos valores dados no exemplo 9) como sendo inicialmente conforme segue:Beta- Exogluc endgluc xilanase xilosidaseglucTrio 478 1973 5591 8387 186

[0196] Pode ser mostrado que as atividades de enzima nesses experimentos medidas conforme descrito no presente documento estavam inicialmente dentro da faixa exoglucanase nkat/g de glucano, endoglucanase nkat/g de glucano, β-glucosidase nkat/g de glucano, endoxilanase nkat/g de glucano, β-xilosidase nkat/g de glucano nkat/g de glucano.

[0197] Os vários parâmetros de pré-tratamento, hidrólise e recuperação para os experimentos descritos nesses exemplos 11 são mostrados na Tabela 5.Tabela 5. Rendimentos de hidrólise com o uso daauto-hidrólise de estágio único de severidade muito baixa.

[0198] A Figura 15 mostra a recuperação de monômero C5 e C6 total no hidrolisato como uma função do tempo de hidrólise para a hidrólise de pasta fluida inteira do bagaço. Conforme mostrado, a recuperação de monômero C5 total de pelo menos 55% é alcançada dentro de 24 horas sob essas condições.

[0199] Exemplo 12. O potencial de biometano melhorado da vinhaça fina que permanece após a fermentação de etanol C6 do hidrolisato da matéria-prima pré-tratada por auto-hidrólise de baixa severidade.

[0200] A palha de trigo foi pré-tratada conforme descrito no exemplo 4 a três severidades diferentes de modo a produzir a biomassa pré-tratada que tem número de xilano 3,0%, 9,1% e 13,2%, que tem respectiva e aproximadamente 2,0%, 4,3% e 7,8% em peso de xilano restante nos sólidos não dissolvidos, conforme estimado a partir da Figura 2.

[0201] O material pré-tratado foi submetido à separação de sólido/líquido para produzir uma fração de fibra, que foi subsequentemente usada em experimentos de hidrólise enzimática, assim como uma fração líquida, que foi mantida separada da hidrólise. As frações sólidas foram hidrolisadas com o uso de CTEC3 nas respectivas doses 0,052 g/g de glucano para a amostra de número de xilano 3,0%, 0,056 g/g de glucano para a amostra de número de xilano 9,1% e 0,075 g/g de glucano para a amostra de número de xilano 13,2%.

[0202] Pode ser mostrado que as atividades de enzima nesses experimentos medidas conforme descrito no presente documento estavam inicialmente dentro da faixa exoglucanase nkat/g de glucano, endoglucanase nkat/g de glucano, β-glucosidase nkat/g de glucano, endoxilanase nkat/g de glucano, β-xilosidase nkat/g de glucano nkat/g de glucano.

[0203] A hidrólise foi conduzida a 22% de DM por 144 horas a 50° C com o pH ajustado a 5,0. Após 144 horas, a levedura de pão comum (fermentação de C6) foi adicionada ao hidrolisato, a temperatura reduzida a 37° C e a fermentação/hidrólise continuada por mais 60 horas. No final da hidrólise/fermentação, as concentrações de etanol foram aproximadamente equivalentes entre os diferentes grupos, entre 61,77 a 63,68 g/kg de etanol.

[0204] A produção de biometano a partir dos hidrolisatos fermentados e a partir da fração líquida separada correspondente foi determinada em ensaios em batelada duplicada, com o uso do inóculo junto à Fredericia Spildevand, Fredericia, Dinamarca, a uma taxa de inóculo/substrato entre 5 a 6,5 (em uma base de sólidos voláteis).

[0205] Os saldos de massa para cada um dos pré- tratamentos foram cuidadosamente determinados e usados para estimar o potencial de metano de vinhaça fina restante da fermentação de etanol C6 de cada um dos hidrolisatos de cada um dos três níveis de severidade diferentes. Subtraindo a contribuição conhecida de etanol aos potenciais de biometano observados, a produção de metano estimada de 1 tonelada de matéria seca de palha de trigo foi determinada. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

[0206] Tabela 6. Produção de metano a partir de vinhaça fina e fração líquida derivada de 1 tonelada de matéria seca de palha, dependendo da severidade do pré- tratamento.

[0207] As modalidades e exemplos são descritivos apenas e não se destinam a limitar o escopo das reivindicações.REFERÊNCIASAgbor, V., et al. “Biomass pretreatment: Fundamentals toward application”, Biotechnology Advances (2011) 29:675Alvira, P., et al. “Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review”, Bioresource Technology (2010) 101:4.851Baboukani, B., et al. “Optimisation of dilute-acid pretreatment conditions for enhancement sugar recovery and enzymatic hydrolysis of wheat straw”, Biosystems Engineering III (2012) 166Bailey, M. et al., "Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity", Journal of Biotechology (1992), 23:257.Bailey, M. e Tahtiharju, J., "Efficient cellulase production by Trichoderma reesei in continuous cultivation on lactose medium with a computer-controlled feeding strategy", Appl. Microbiol. Biotechnol. 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Claims

1. MÉTODO PARA PROCESSAR BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA, caracterizado por compreender:- fornecer matéria-prima de biomassa lignocelulósica mole,- pré-tratar a matéria-prima em pH dentro da faixa de 3,5 a 9,0 em um pré-tratamento hidrotérmico pressurizado de estágio único a uma temperatura de pelo menos 140 °C por menos de 60 minutos em severidade em log Ro 3,75 ou inferior de modo a produzir uma pasta fluida de biomassa pré-tratada em que os sólidos não dissolvidos compreendem pelo menos 5,0% em peso de xilano, ehidrolisar a biomassa pré-tratada como uma pasta fluida inteira com ou sem a adição de teor de água suplementar com o uso de hidrólise enzimática por pelo menos 24 horas catalisada por uma mistura de enzimas que compreende atividades de endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase, endoxilanase e β-xilosidase em níveis de atividade em nkat/g glucano de endoglucanase de pelo menos 1.100, exoglucanase de pelo menos 280, β-glicosidase de pelo menos 3.000, endoxilanase de pelo menos 1.400 e β-xilosidase de pelo menos 75, de modo a produzir um hidrolisado em que o rendimento de monômeros C5 é pelo menos 55% do teor original de xilose e arabinose da matéria-prima antes do pré-tratamento.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo pré-tratamento hidrotérmico ser conduzido como uma auto-hidrólise, em que o ácido acético liberado pela hidrólise de hemicelulose durante o pré-tratamento catalisa adicionalmente a hidrólise de hemicelulose.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela matéria-prima ser submetida a pré- tratamento pressurizado a um teor de matéria seca de pelo menos 35% ou a uma temperatura entre 160 e 200 °C.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo hidrolisado de pasta fluida inteira ser usado como um substrato de biometano.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela hidrólise enzimática ser conduzida em teor de matéria seca entre 8 e 19%.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela hidrólise enzimática ser conduzida em teor de matéria seca de 20% ou mais.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela atividade de endoglucanase estar dentro da faixa de 1.100 a 30.000 nkat/g de glucano, a atividade de exoglucanase estar dentro da faixa de 280 a 20.000 nkat/g de glucano, a atividade de β- glicosidase estar dentro da faixa de 3.000 a 50.000 nkat/g de glucano, a atividade de endoxilanase estar dentro da faixa de 1.400 a 70.000 nkat/g de glucano e/ou a atividade de β- xilosidase estar dentro da faixa de 75 a 20.000 nkat/g de glucano.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela atividade de β-glicosidase estar dentro da faixa de 4.000 a 50.000 nkat/g de glucano, a atividade de endoxilanase estar dentro da faixa de 4.000 a 70.000 nkat/g de glucano e/ou a atividade de β-xilosidase estar dentro da faixa de 250 a 20.000 nkat/g de glucano.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela biomassa pré- tratada ser descarregada do pré-tratamento hidrotérmico pressurizado de tal forma que preserve a estrutura de fibra do material.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela matéria-prima de biomassa ser submetida à redução de tamanho de partícula e/ou outro processamento mecânico antes do pré-tratamento hidrotérmico.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela biomassa pré-tratada ser submetida a uma etapa de separação de sólido/líquido para produzir uma fração líquida e uma fração sólida que tem um teor de matéria seca de pelo menos 40% em peso e a fração sólida é hidrolisada.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela fração líquida separada ser adicionada de volta à mistura de hidrólise, após a hidrólise enzimática da fração sólida ter atingido um grau desejado de conversão de glucano.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela matéria-prima ser palha de trigo, palha de milho, bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de sorgo doce ou cachos de frutas vazios.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo pré-tratamento pressurizado ser conduzido a uma pressão de 1 MPa (10 bar) ou menor.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela matéria-prima ser removida do reator de pré-tratamento pressurizado com o uso de um sistema de hidrociclone.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela hidrólise enzimática ser conduzida por pelo menos 96 horas.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ainda caracterizado por um hidrolisado C5/C6 combinado ser 5 diretamente fermentado em etanol com o uso de uma ou mais cepas de levedura modificadas.