KR20150041796A - Ｃ５ 바이패스 및 후―가수분해로 효소적 가수분해 및 단일―단계 자가가수분해를 이용한 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법들 - Google Patents
Ｃ５ 바이패스 및 후―가수분해로 효소적 가수분해 및 단일―단계 자가가수분해를 이용한 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법들 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 일반적으로 발효성 당들로 리그노셀룰로스 바이오매스를 가공하는 방법들 및 열수 전처리에 의존하는 방법들에 대한 것이다. 특히 본 발명은 하기를 포함하는 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법에 대한 것이다: 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료를 제공, 매우 낮은 엄격성으로 단일-단계 가압된 열수 전처리에서 공급원료의 전처리, 전처리된 바이오매스의 고체 부분 및 액체 부분으로 분리, 효소 혼합물에 의하여 촉매작용되는 효소 가수분해를 이용한 고체 부분의 가수분해, 및 그 다음 분리된 액체 부분 및 가수분해된 고체 부분의 혼합, 이로써 액체 부분 내 자일로-올리고머들이 자일로스 모노머들로 분해된다.
Description
본 발명은 일반적으로 리그노셀룰로스 바이오매스를 발효성 당들로 가공하는 방법들, 특히, 열수 전처리에 의존하는 방법들에 대한 것이다.
석유 및 다른 화석 연료들에 대한 역사적 의존은 온실 가스들의 대기 레벨들에서의 극적이며 두려운 증가와 관련되어 왔다. 온실가스 축적을 완화시키려는 국제적 노력들이 진행 중이며, 이는 많은 국가들에서 공식적인 정책 지침들에 의하여 지지된다. 이들 완화 노력들 중 가장 중요한 초점 하나는 연료들 및 다른 화학적 산물들의 전구체들의 소스로서 석유를 대체하기 위한 재생가능한 식물 바이오매스(biomass)의 이용을 위한 처리 및 기술들의 발달들이었다. 이 세상의 식물-유래 바이오매스의 매년 성장은 거의 정확히 일 년에 건조중량 1 x 10＾11 미터 톤(metric tons)으로 추산된다. Lieth and Whittaker (1975) 참조. 바이오매스 이용은, 이와 같이 지속가능한 경제 발전의 궁극적인 목표이다.
사탕수수, 뿌리 및 곡물 작물들과 같은, 당(sugar) 및 전분(starch) 베이스의 식물 물질들로부터 생산된 연료 에탄올은 현재 연간 730 억 리터가 넘게 전세계적으로 생산되어 이미 널리 이용되고 있다. 에탄올은 혼합 연료(fuel blend)의 첨가제로서, 심지어는 개인 자동차의 연료로서 좀더 직접적으로 쉽게 이용가능한, 화석 연료의 괜찮은 대안으로 항상 생각되어 왔다. 그러나 이들 "첫 번째 세대" 바이오에탄올 기술들에 의하여 생산된 에탄올의 이용은 온실가스 배출의 극적인 감소를 실질적으로 달성하지 않는다. 최종 에탄올 생산량(outputs)에 대한 총 화석 연료 투입(inputs)이 모두 고려될 때, 순 절약(net savings)은 석유에 비하여 약 13% 뿐이다. Farrell et al. (2006) 참조. 경제적 및 도덕적 반대들이 게다가 "첫 번째 세대" 바이오에탄올 시장들에 제기되어 왔다. 이는 인간 식량으로서 작물들의 수요를 개인 자동차들에 대한 수요의 직접적인 경쟁으로 두게 하였다. 그리고 정말로, 연료 에탄올 수요는 가난한, 곡물-수입 국가들의 골칫거리로 입증된 인상된 곡물 가격과 관련된 것이다.
식량 작물들-소위 "두 번째 세대" 바이오정제(biorefining)를 소비하지 않고, 이로써, 바이오에탄올 및 다른 산물들이 작물 폐기물(줄기들(stalks), 대(cobs)들, 씨(pits), 줄기(stems), 껍질들(shells), 겉껍질들(husks) 등...), 풀들, 짚들(straws), 나무조각들(wood chips), 휴지(waste paper), 그 비슷한 것들과 같은 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 바이오매스로부터 생산될 수 있는 바이오매스 전환 시스템들을 개발하는 것에 큰 관심이 생겨왔다. "두 번째 세대" 기술에서, 주로 셀룰로스 유래의 발효성 6탄(C6)당들 및 헤미셀룰로스 유래의 발효성 5탄(C5)당들은 효소 가수분해에 의하여 또는, 일부 경우들에는, 순수한 화학적 가수분해에 의하여 바이오매스 다당류 폴리머로부터 유리된다(liberate). "두 번째 세대" 바이오정제(biorefinery) 내 바이오매스 전환으로부터 수득되는 발효성 당들은 연료 에탄올, 또는 대체하여, 바이오플라스틱들 도는 다른 많은 산물들의 합성에 사용되기 위한 부탄올, 락트산 모노머들과 같은 다른 연료들을 생산하는데 이용될 수 있다.
C5 및 C6 당들 양쪽 모두의 총 생산량은 리그노셀룰로스 바이오매스 공정의 상업화에 있어 중요한 고려사항이다. 에탄올 생산 및 또한 락테이트(lactate) 또는 다른 화학 물질들(chemicals)의 생산의 경우에서, C5 및 C6 당 공정 스트림들(streams) 모두를 하나의 당 용액(solution)으로 통합하는(combine) 것이 유리할 수 있다. 변형된(modified) 발효성 미생물들이 현재 이용가능한데, 이는 에탄올 생산에 있어 C5 및 C6 당들 양쪽 모두를 효율적으로 소비할 수 있다. Madhavan et al. (2012); Dumon et al. (2012); Hu et al. (2011); Kuhad et al. (2011); Ghosh et al. (2011); Kurian et al. (2010); Jojima et al. (2010); Sanchez et al. (2010); Bettiga et al. (2009); Matsushika et al. (2009) 참조.
그것의 물리적 구조의 제한 때문에, 리그노셀룰로스 바이오매스는 어느 정도의 전처리 공정 없이 효소 가수분해에 의하여 발효성 당들로 효과적으로 전환될 수 없다. 매우 다양한 다른 전처리 계획들이 보고되었으며, 그 각각은 다른 이점들 및 단점들을 제공한다. 리뷰를 위하여 Agbor et al. (2011); Girio et al. (2010); Alvira et al. (2010); Taherzadeh and Karimi (2008) 참고. 환경적 및 "재생가능성' 관점으로부터 열수(hydrothermal) 전처리들이 특히 매력적이다. 이것들은 약 160-230 ℃ 온도에서 가압된 증기(steam)/액체 열수를 이용하여, 셀룰로스 가닥들과 복잡하게 관련된 소수성 리그닌을 살살 녹이고, C5 당들이 풍부한 헤미셀룰로스의 주요 성분을 가용화하고(solubilize), 그리고 생산하는 효소 결합에의 접근성을 개선하기 위하여 셀룰로스 가닥들을 파괴한다(disrupt). 열수 전처리들은 터빈(turbine) 증기 및 "과잉" 전력(power) 생산력을 효과적으로 이용하기 위하여, 기존의 석탄- 및 바이오매스-로 움직이는(fired) 전력 발전소들과 편리하게 통합될 수 있다.
열수 처리들의 경우, 전처리는 상충되는 목적들 사이에서 최적화되어야 한다는 것이 당업계에 잘 알려져 있으며, 널리 토론되어 왔다. 한 편으로는, 전처리는 모노머인 헤미셀룰로스-유래 당들의 궁극적인 수율을 최대화하기 위하여 헤미셀룰로스 당 함량을 이상적으로 보존하여야 한다. 그렇지만, 동시에 전처리는 셀룰로스 체인들을 효소 가수분해의 민감성에 충분히 노출시키고 프리컨디셔닝하여(pre-condition), 모노머인 셀룰로스-유래 당들의 합리적인 수율이 최소한의 효소 소비로 수득될 수 있도록 해야 한다. 효소 소비는 또한 "세계 시장 경제"의 맥락에서 "경제적 수익성" 직전에 있는 바이오매스 공정의 상업화의 주된 고려사항이다. 최근 몇 년 간의 극적인 개선들에도 불구하고, 상업적으로 이용가능한 효소 제제들의 높은 비용은 바이오매스 전환의 가장 높은 운영비들 중 하나로 남아 있다.
열수 전처리 온도들 및 반응기 체류(residence) 시간들이 증가하면서, 헤미셀루로스 유래의 C5 당들의 더 큰 비율이 돌이킬 수 없게 상실되는데, 이는 푸르푸랄(furfural) 및 축합 반응들의 산물들을 포함하는 다른 물질들(substance)로의 화학적 변화(transformation) 때문이다. 그렇지만, 더 높은 온도들 및 체류 시간들이 모노머인 6-탄소 글루코스로의 효율적인 효소 가수분해를 위하여 셀룰로스 섬유들을 적절히 컨디셔닝(condition)하기 위하여 요구된다.
종래 기술에서, 열수 전처리의 자주 사용되는 파라미터인 "엄격성(severity)"은 "Ro,"로, 이는 로그(log) 값으로서 전형적으로 표시된다. Ro는 방정식:Ro= tEXP[T-100/14.75] 에 따른 전처리 온도 및 반응기 체류 시간의 합성물(composite) 척도(measure)를 반영하는데, 이때 t는 분(minutes)으로의 체류 시간이고 T는 섭씨 온도로의 반응 온도이다. 우리는 전처리 엄격성(severity)의 대체 척도(measure), "자일란(xylan) 수(number)"를 개발하였는데, 이는 "엄격성(severity)"이 매우 낮은 레벨들에서도 전통적인 로그 Ro와 음의(negative) 선형 상관 관계를 제공한다. 전처리 조건들의 순수한 실험적 기재인 Ro와는 달리, 자일란(xylan) 수는 기능적으로 중요한 물리적 파라미터이다. 자일란 수는 그것들이 가해지는 Ro 엄격성(severity)에 상관없이, C5 회수의 면에서 다른(divergent) 바이오매스 공급원료들(feedstocks)의 비교를 허용하는 전처리 정도의 척도를 제공한다.
열수 전처리 엄격성이 "자일란 수" 또는 "Ro"의 면에서 표현되던지, 임의의 주어진 바이오매스 공급원료에 대한 전처리 조건들의 최적화는 본질적으로 헤미셀룰로스(낮은 엄격성)으로부터의 높은 모노머 C5 당 수율들에 대한 수요 및 셀룰로스(높은 엄격성)으로부터의 높은 모노머의 C6 당 수율들에 대한 수요 사이에서 어느 정도 타협을 요구한다.
열수 전처리 동안 가용화된(solubilized) 헤미셀룰로스-유래 C5 당들은 전형적으로 많은 부분 자일로(xylo)-올리고머들을 포함하며, 이는 셀룰라제 효소 촉매반응을 강하게 억제한다. Shi et al. (2011); Quing and Wyman (2011); Quing et al. (2010) 참조. 아세트산 및 가용화된 리그닌으로부터 유래한 페놀계(phenolic) 화합물들을 포함하는 전처리의 다른 가용성(soluble) 부산물들 또한 셀룰라제 효소 촉매반응을 억제하는 것으로 알려져 있다. Kothari and Lee (2011); Ximenes et al. (2010) 참조. 효소 억제제들의 효과적인 레벨들의 존재는 정해진 가수분해 정도를 달성하기 위하여 요구되는 효소 소모를 증가시킨다. 그러므로, 상업적 규모의 바이오매스 전환의 "경제적 수익성"은 전처리로부터 유래하는 가용성 화합물들의 셀룰라제 억제의 최소화를 선호한다.
여러가지 다른 열수 전처리 전략들이 헤미셀룰로스 및 셀룰로스 양쪽 모두로부터의 당 수율들을 최대화하기 위하여 그리고 셀룰라제 촉매반응의 자일로-올리고머 억제를 최소화하기 위하여 보고되어 왔다. 어떤 경우들에서는, 외인성(exogenous) 산들 또는 염기들이 헤미셀룰로스 분해(degradation) (산; pH < 3.5) 또는 리그닌 가용화(염기; pH > 9.0)에 촉매작용을 하기 위하여 첨가된다. 다른 경우들에서는, 열수 전처리는 리그노셀룰로스 그 자체로부터 유래한 매우 온화한(mild) 아세트산 만을 이용하여 수행된다(pH 3.5-9.0). 이러한 온화한 pH 조건들 하 열수 전처리들은 "자가가수분해(autohydrolysis)" 공정들로 칭해지는데, 이는 세히셀룰로스 에스터들 그 자체로부터 유리된 아세트산이 헤미셀룰로스 가수분해에 더 촉매 작용하기 때문이다.
"희산(dilute acid)" 또는 "산 함침(acid impregnation)"으로 알려진 산 촉매작용된 열수 전처리들은 일반적으로 C5 당들의 높은 수율들을 제공하는데, 이는 비교할만한 헤미셀룰로스 가용화가 산 촉매의 존재 하 더 낮은 온도에서 발생할 수 있기 때문이다. 희산 전처리에 뒤이은 효소 가수분해 후 총 C5 당 수율들은 이론상 임의의 정해진 바이오매스 공급원료로부터 유리될 수 있었던 것의 약 75% 또는 그 이상이다. 예컨대 Baboukaniu et al. (2012); Won et al. (2012); Lu et al. (2009); Jeong et al. (2010); Lee et al. (2008); Sassner et al. (2008); Thomsen et al. (2006); Chung et al. (2005) 참조.
그에 반하여, 자가가수분해 열수 전처리들은 일반적으로 C5 당들의 훨씬 더 낮은 수율들을 제공하는데, 이는 더 높은 온도 전처리가 산 촉매의 부존재 하 요구되기 때문이다. 상업적으로 비현실적으로 낮은 건조물 함량에서 수행되는 자가가수분해 전처리를 제외하고, 자가가수분해 전처리들은 일반적으로 C5 당 수율들 <40% 이론상 회수를 제공한다. 예컨대 Diaz et al. (2010); Dogaris et al. (2009)참조. 53%만큼 높은 자가가수분해로부터의 C5 수율들이 상업적으로 비현실적인 반응 시간들 및 극히 높은 효소 용량들이 사용된 케이스들에서 보고되어 왔다. 그러나 이러한 매우 높은 C5 수율들조차 희산 전처리를 이용하여 일상적으로 수득된 레벨들보다 여전히 아주 못하다. 예컨대 Lee et al. (2009); Ohgren et al. (2007) 참조.
자가가수분해로 수득된 더 낮은 C5 수율들의 결과로서, 상업적 바이오매스 전환 시스템들의 열수 전처리에 관한 대부분의 보고들은 희산 공정들에 중점을 두어 왔다. 약 85%의 헤미셀룰로스-유래 C5 당 수율들은 소위 "2-단계" 희산 전처리들의 이용을 통하여 달성되어 왔다. 2-단계 전처리들에서, 더 낮은 초기 온도가 헤미셀룰로스를 가용화하기 위하여 이용되었는데, 그 후 C5-풍부 액체 부분(fraction)이 분리된다. 두 번째 단계에서, 더 높은 온도가 셀룰로스 체인들(chains)을 컨디셔닝(condition)하는데 사용된다. 예컨대 Mesa et al. (2011); Kim et al. (2011); Chen et al. (2010); Jin et al. (2010); Monavari et al. (2009); Soderstrom et al. (2005); Soderstrom et al. (2004); Soderstrom et al. (2003); Kim et al. (2001); Lee et al. (1997); Paptheofanous et al. (1995) 참조. US National Renewable Energy Laboratory (NREL)에 의하여 보고된 하나의 정교한 "2-단계" 희산 전처리 시스템은 공급 원료로서 옥수수 대(stover)를 이용하여 약 90%의 C5 수율을 달성하였다고 주장한다. Humbird et al. (2011)참조.
셀룰라제 촉매 반응의 자일로-올리고머 억제는 희산 시스템들에서 회피되는데, 이는 자일로-올리고머들(xylo-oligomers)의 모노머 자일로스로의 가수분해가 첨가된 산에 의하여 촉매작용되기 때문이다. 자일로-올리고머들의 산 촉매작용된 가수분해는 또한 잔여 고형물들이 효소 가수분해를 당하게 되는 스트림(stream)으로부터 분리된 공정 스트림 내에서 발생한다.
그것이 제공하는 더 낮은 C5 수율들에도 불구하고, 자가가수분해는 상업적 규모에서 희산 전처리보다 더 경쟁력있는 이점을 제공한다.
자가가수분해 공정들의 이점들 중 가장 주목할만한 것은 잔여, 가수분해되지 않은 리그닌이 희산 공정들로부터 회수되는 리그닌과 비교할 때 훨씬 높은 시장 가치를 갖는 것이다. 첫 째로, 희산 전처리에서 일반적으로 사용되는 황산(sulphuric acid)은 잔여 황(sulphur) 함량을 준다. 이것은 그 결과로 리그닌을 제공하게 되는데, 이는 상업적 발전소에 별로 매력적이지 않고, 그렇지 않으면 석탄의 대체제인 "친환경(green)"으로서 자가가수분해로부터 수득되는 황-없는 리그닌 연료 펠렛(pellets)들을 소비하는데 기울여질 것이다. 둘 째로, 황산-촉매작용된 열수 전처리들 동안 발생하는 리그닌의 술폰화(sulfonation)는 그것을 비교적 친수성으로 만드는데, 이로써 그것의 기계적 용수량을 증가시킨다. 이 친수성은 상업적 이용을 위한 리그닌의 건조 비용을 증가시키며 또한, 수분을 흡수하는 그것의 경향을 고려할 때, 그것을 외부 보관에 부적당하게 만든다. 희산 전처리와 함께 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위한 NREL의 공정의 소위 "기술-경제적(techno-economic) 모델들"은 시장성있는 물품(commodity)으로서 리그닌을 설명하고 있지도 않다-공정 스트림을 위한 연료의 내부(internal) 소스(source)로서일 뿐이다. Humbird et al. (2011) 참조. 이에 반하여, 자가가수분해에 의존하는 공정 계획의 "경제적 수익성"은 깨끗하고, 건조한 리그닌 펠렛들의 탄탄한(robust) 규모(scale)로부터의 큰 공헌을 포함한다. 이는 전형적인 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들이 리그닌 대부분, 건조물 함량의 10 및 40% 사이를 포함한다는 점에서 특히 중요하다. 이렇게 하여, 자가가수분해 시스템으로부터의 가공 당 수율들이 희산 시스템에 비해 감소될 수 있는데에서도, 전체적인 "수익성"은 동등하거나 심지어 더 낫게 될 수 있다.
자가가수분해 공정들은 또한 희산의 잘 알려진 다른 난점들 또한 회피한다.황산을 요구하는 것은 "친환경(green)" 공정들을 선호하는 철학적(philosophical) 방향(orientation)에서 벗어나며, 공정(process) 투입(input)으로서 산에 대한 상당한 운영비를 도입하며(introduce), 그리고 정교한 폐수 처리 시스템들 및 또한 값 비싼 항-부식 장비에 대한 수요를 만들어낸다.
자가가수분해는 또한 보통의(modest) 공정(processing) 시나리오들(scenarios)에 유리하게 조정가능하다(scalable). NREL에 의하여 기재된 희산 공정은 너무 복잡하고 정교하여, 현실적으로 더 작은 규모로 확립될 수 없다-시간 당 바이오매스 공급연료 대략 100 톤의 거대한 규모일 뿐이다. 이러한 규모는 초-집중형(hyper-centralized) 바이오매스 공정 시나리오들에만 적합하다. Humbird et al. (2011) 참조. 옥수수 대(stover)의 초-집중형 바이오매스 공정은 USA에서 완전히 적합할 수 있는데, 이는 화학적으로 강화된 초-생산(hyper-production)으로 성장한 유전자 조작된(genetically-engineered) 옥수수가 풍부하다. 그러나 이러한 시스템은 세계의 다른 곳에서는 덜 적절하다. 이러한 시스템은 보통의 바이오매스 공정 시나리오들, 예컨대, 사탕수수 또는 팜유(palm oil) 또는 수수(sorghum) 밭들에서의 현지 공정, 또는 밀짚의 지역적 공정에는 부적절한데, 이는 일반적으로 유전자 조작 또는 화학적 강화들이 있어도, 옥수수보다 헥타르(hectare) 당 훨씬 적은 바이오매스를 생산한다.
희산과 대비하여, 자가가수분해 시스템들은 합법적으로 "친환경적"으로 쉽게 조정가능하고(scalable), 정교한 폐수 처리 시스템들에 대한 요구에 부담이 없다. 그러므로 당 수율만의 관점에서 희산 시스템보다 명백하게 유리하지 않을 수 있는 경우에도 개선된 자가가수분해 시스템들을 제공하는 것이 유리하다.
자가가수분해의 빈약한 C5 모노머 수율들의 문제는 다른 접근들을 추구하기 위하여 리그노셀룰로스 바이오매스 공정 기술의 상업적 제공자들을 유전적으로 몰아갔다. 개선된 C5 수율들을 공급하기 위하여 설계된 일부 "2-단계" 전처리 시스템들은 자가가수분해 전처리들을 갖는 것으로 보고되었다. WO2010/113129; US2010/0279361; WO 2009/108773; US2009/0308383; US8,057,639; US20130029406 참조. 이들 "2-단계" 전처리 계획들에서, 일부 C5-풍부 액체 부분(fraction)이 더 낮은 온도 전처리에 뒤이은 고형 부분의 그 다음의 더 높은 온도 전처리 후 고체/액체 분리에 의하여 제거된다. 이들 공개된 특허 출원들의 대부분은 실제 실험적 결과들을 보고하지 않았다. WO2010/113129의 2-단계 자가가수분해 전처리의 발명의 상세한 설명에서, Chemtex Italia는 52%의 평균 C5 당 회수로 밀짚을 이용한 총 26 개의 실험예들을 보고한다. 이들 C5 회수 값들은 C5 회수 그 자체 및 모노머 당 수율들 사이를 구분하고 있지 않은데, 이는 에탄올 및 다른 유용한 산물들로의 발효에서 실제로 소모되는 기질이다.
리그노셀룰로스 바이오매스 공정 계획으로 두 번째 전처리 단계의 도입은 추가적인 복잡함 및 비용을 도입한다. 그러므로 대체로 단순한 1(single)-단계 자가가수분해 시스템을 이용한 2-단계 전처리의 이점을 달성하는 것이 유리하다.
우리는, 단일-단계 자가가수분해 전처리가 매우 낮은 엄격성으로 수행되고, 60% 및 그 보다 높은 이론적 수율인, 예상 외로 높은 최종 C5 모노머 수율들이 효소 가수분해에 따라, 여전히 합리적인 글루코스 수율들을 달성하는 반면, 달성될 수 있다는 것을 발견하였다. 바이오매스 공급원료들이 자일란 수 10% 및 그보다 높게 전처리되는 경우, 원래의 자일란 함량의 많은 양들이 고형물 부분(fraction) 내에 남는다. 예상에 반하여, 이 매우 높은 잔여 자일란 함량은 높은 회수로, 모노머 자일로스로 효소적으로 가수분해될 수 있는데, 반면, 글루코스로의 셀룰로스 전환의 매우 적은 퍼센트만이 희생된다.
이 매우 낮은 엄격성 레벨들에서, 셀룰라제 활성 또는 발효성 미생물들에 영향을 미치는 가용성(soluble) 부산물들의 생산은 낮게 유지되어, 보통 어떠한 세척 또는 다른 해독(de-toxification) 단계의 요구 없이, 전처리된 물질이 효소 가수분해 및 그 다음의 발효에 직접 이용될 수 있다.
액체 부분(fraction) 내 자일로-올리고머들 또는 다른 가용성 산물들에 의한 셀룰라제 활성 억제는 공정 내에서 쉽게 회피될 수 있다. 고체/액체 분리 단계에 뒤이은 전처리는 액체 부분 및 고체 부분을 만든다. C5-풍부 액체 부분은 효소 가수분해 동안 고체 부분으로부터 "바이패스(bypass)" 내에서 따로 유지된다. 고체 부분의 효소 가수분해에 따라, 액체 부분이 가수분해물로 첨가되고, 잔여 활성 자일라나제(xylanase) 효소들에 의하여 후(post)-가수분해된다. 액체 부분 내 자일로-올리고머들은 이런 식으로 셀룰라제 활성이 더 이상 필요하지 않은 후에만 자일로스 모노머들로 가수분해된다. 그 결과인, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 양쪽 모두로부터 유래한 C5 및 C6 모노머들 모두를 포함하는, 결합된 가수분해물 및 후-가수분해물은 변형된 효모에 의하여 에탄올로 직접 발효될 수 있다.
본 발명은 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 바이오매스의 가공 방법을 제공한다.
본 발명은 일반적으로 발효성 당들로 리그노셀룰로스 바이오매스를 가공하는 방법들 및 열수 전처리에 의존하는 방법들에 대한 것이다. 특히 본 발명은 하기를 포함하는 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법에 대한 것이다: 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료를 제공, 매우 낮은 엄격성으로 단일-단계 가압된 열수 전처리에서 공급원료의 전처리, 전처리된 바이오매스의 고체 부분 및 액체 부분으로 분리, 효소 혼합물에 의하여 촉매작용되는 효소 가수분해를 이용한 고체 부분의 가수분해, 및 그 다음 분리된 액체 부분 및 가수분해된 고체 부분의 혼합, 이로써 액체 부분 내 자일로-올리고머들이 자일로스 모노머들로 분해된다.
본 발명은 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 바이오매스의 가공 방법을 제공한다.
도 1은 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 전처리 엄격성(severity) 팩터의 함수로서의 자일란 수를 나타낸다.
도 2는 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 자일란 수의 함수로서 가용성 및 불용성 형태로 C5 회수를 나타낸다.
도 3은 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들의 자일란 수의 함수(function)로서 총 C5 회수를 나타낸다.
도 4는 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 자일란 수의 함수로서 아세트산, 푸르푸랄 및 5-HMF의 생산을 나타낸다.
도 5는 매우 낮은 엄격성(severity) 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 셀룰로스 전환에 대한 용해된 고형물들의 제거의 효과를 보여준다.
도 6은 매우 낮은 엄격성 자가가수분해 전처리 되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들로부터 액체 부분의 HPLC 특성화(characterization)를 나타낸다.
도 7은 고체 부분이 효소 가수분해에 뒤이어 후-가수분해를 위하여 액체 부분의 도입이 되는 경우 시간의 함수로서 C5 당 회수를 나타낸다.
도 8은 매우 낮은 엄격성 자가가수분해에 의하여 전처리되고, 효소 가수분해되고 그리고 발효 억제제들을 제거하기 위한 해독(de-toxification) 없이 결합된 액체 및 고체 부분으로서 사용되는 밀짚을 이용하여 변형된 효모 균주에 의한 에탄올 발효의 발효 프로파일을 나타낸다.
도 9는 하나의 실시예를 위한 가공 계획을 나타낸다.
도 2는 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 자일란 수의 함수로서 가용성 및 불용성 형태로 C5 회수를 나타낸다.
도 3은 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들의 자일란 수의 함수(function)로서 총 C5 회수를 나타낸다.
도 4는 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 자일란 수의 함수로서 아세트산, 푸르푸랄 및 5-HMF의 생산을 나타낸다.
도 5는 매우 낮은 엄격성(severity) 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 셀룰로스 전환에 대한 용해된 고형물들의 제거의 효과를 보여준다.
도 6은 매우 낮은 엄격성 자가가수분해 전처리 되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들로부터 액체 부분의 HPLC 특성화(characterization)를 나타낸다.
도 7은 고체 부분이 효소 가수분해에 뒤이어 후-가수분해를 위하여 액체 부분의 도입이 되는 경우 시간의 함수로서 C5 당 회수를 나타낸다.
도 8은 매우 낮은 엄격성 자가가수분해에 의하여 전처리되고, 효소 가수분해되고 그리고 발효 억제제들을 제거하기 위한 해독(de-toxification) 없이 결합된 액체 및 고체 부분으로서 사용되는 밀짚을 이용하여 변형된 효모 균주에 의한 에탄올 발효의 발효 프로파일을 나타낸다.
도 9는 하나의 실시예를 위한 가공 계획을 나타낸다.
실시예의 자세한 설명
일부 실시예들에서, 본 발명은 하기를 포함하는 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 바이오매스의 가공 방법을 제공한다:
- 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료를 제공하는 단계,
- 매우 낮은 엄격성으로 단일-단계 가압된 열수 전처리에서 3.5 내지 9.0 범위 내의 pH에서 공급원료를 전처리하여, 상기 전처리된 바이오매스가 10% 또는 그보다 더 높은 자일란 수를 갖는 것으로 특징되는 단계,
- 상기 전처리된 바이오매스를 고체 부분 및 액체 부분으로 분리하는 단계,
- 엔도글루카나제(endoglucanase), 엑소글루카나제(exoglucanase), B-글루코시다제(glucosidase), 엔도자일라나제(endoxylanase), 자일로시다제(xylosidase) 및 아세틸(acetyl) 자일란(xylan) 에스테라제(esterase) 활성들을 포함하는 효소 혼합물에 의하여 촉매작용되는 효소 가수분해를 이용하여 보충의(supplemental) 물 함량의 첨가와 함께 또는 첨가 없이 고체 부분을 가수분해하는 단계, 및
- 그 뒤에 상기 분리된 액체 부분 및 상기 가숩누해된 고체 부분ㅇ르 혼합하여, 이로써 액체 부분의 자일로-올리고머들이 상기 가수분해된 고체 부분 내 남아 있던 효소 활성들의 작용에 의하여 자일로스 모노머들로 분해되는 단계.
여기에 사용된 대로, 하기 용어들은 하기 의미들을 갖는다:
정량적 숫자 또는 범위와 관련하여 여기에 사용된 대로 "약(about)"은 언급된 숫자 또는 범위의 상대적인 면에서 +/- 10%를 가리킨다.
"자가가수분해"는 전처리 동안 헤미셀룰로스 가수분해에 의하여 유리된 아세트산이 헤미셀룰로스 가수분해를 더 촉매 작용하는 전처리 공정을 가리키며, 3.5 및 9.0 사이의 pH에서 수행되는 리그노셀룰로스 바이오매스의 임의의 열수 전처리에 적용된다.
"리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제"는 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스의 효소 가수분해를 제공하는데 충분하며, 엔도셀룰라제(endocellulase) (엔도글루카나제(endoglucanase)), 엑소셀룰라제(exocellulase)(엑소글루카나제(exoglucanase)), 엔도자일라나제(endoxylanase), 아세틸(acetyl) 자일란(xylan) 에스테라제(esterase), 자일로시다제(xylosidase) 및 B-글루코시다제(glucosidase) 활성들을 포함하는, 효소 활성들의 상업적으로 이용가능한 혼합물을 가리킨다. 용어 "리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된"은 가수분해 수율을 개선하고/개선하거나 발효성 당들로 전처리리된 리그노셀룰로스 바이오매스의 가수분해에서의 효소 소모를 감소시키려는 특정 목적을 위하여 효소 혼합물들이 선택되고/선택되거나 변형되는 산물 개발 공정을 가리킨다.
건조물 레벨"에서(at)" 전처리를 수행하는 것은 가압된 열수 전처리의 시작에서 공급원료의 건조물 함량을 가리킨다. 전처리는 바이오매스의 수분(aqueous) 함량(content)의 pH가 가압된 열수 전처리의 시작에서의 pH인 pH"에서" 수행된다.
DM으로도 나타내는 "건조물(dry matter)"은 가용성 및 불용성 양쪽 모두인, 총 고체들을 가리키며, 효과적으로 "비(non)-수분(water) 함량"을 의미한다. 건조물 함량은 변함없는 중량이 달성될 때까지 105 ℃에서 건조시켜 측정된다.
"섬유 조직"은 전처리에 따른 섬유 단편들(fragments)들의 평균 크기가 >750 um인 정도까지 유지된다.
"열수 전처리"는 뜨거운 액체, 수증기(vapor steam) 또는 고온의 액체 또는 증기 또는 둘 다를 포함하는 가압된 증기로서, 120 ℃ 또는 그보다 높은 온도에서 바이오매스를 "조리(cook)"하기 위하여, 산 또는 다른 화학물질들의 첨가와 함께 또는 첨가 없이, 물의 이용을 가리킨다.
"단일-단계(single-stage) 가압된 열수 전처리"는 단일 패스(single pass)에서 바이오매스를 가열하는 것으로 설정된(configured) 단일 반응기 내에서 바이오매스가 가압된 열수 전처리가 되고, 그리고 가압된 열수 전처리가 된 공급 원료로부터 액체 부분을 제거하기 위하여 고체/액체 분리 단계 후에 더 이상의 가압된 열수 전처리가 적용되지 않는 전처리를 가리킨다.
"고체/액체 분리"는 적극적인 기계적 공정을 가리키며 이로써, 프레싱(pressing), 원심 또는 다른 힘을 통한 힘의 적용에 의하여 액체가 고체로부터 분리된다.
"연질 리그노셀룰로스 바이오매스"는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌을 포함하는 목재(wood) 외 식물 바이오매스를 가리킨다.
"고체 부분(fraction)" 및 "액체 부분(fraction)"은 고체/액체 분리에서 전처리된 바이오매스의 부분을 가리킨다. 상기 분리된 액체는 "액체 부분"으로 총괄하여 지시된다. 상당한 불용성 고체 함량을 포함하는 잔여 부분은 "고체 부분"으로 지시된다. "고체 부분"은 건조물 함량을 가질 것이며, 보통 "액체 부분"의 상당한 잔여물 또한 포함한다.
"이론적 수율"은 폴리머(polymeric) 셀룰로스 또는 폴리머 헤미셀룰로스 구조들로부터 수득되는 순수한 모노머 당들의 몰 동등한 질량(molar equivalent mass)을 가리키며, 이 때 구성 모노머 당들 또한 에스테르화(esterified)되거나 그렇지 않으면 치환(substituted)될 수 있다. 이론적 수율의 퍼센트로서 "C5 모노머 수율들"은 하기와 같이 결정된다: 전처리 전, 바이오매스 공급원료가 탄수화물에 대하여 HPLC 칼럼 및 자일로스로, 갈락토스(galactose) 및 만노스(mannose)가 함께 용출되는(co-elute) 용출 시스템을 이용하여 Sluiter et al. (2008)의 강산 가수분해 방법을 이용하여 분석된다. 이러한 시스템들의 예들은 Phenomenex의 REZEX ™ Monossacharide H+ 칼럼 및 Biorad의 AMINEX HPX 87C ™을 포함한다. 강산 가수분해 동안, 에스터들(esters) 및 산에 불안정한(acid-labile) 치환들(substitutions)이 제거된다. 특별히 기재된 경우 외에, 전처리되지 않은 바이오매스 내의 결정된 "자일로스" + 아라비노스(Arabinose)의 총량은 100% 이론적 C5 모노머 회수로 간주되며, 이는 총괄하여 "C5 모노머 회수"로 명칭될 수 있다. 모노머 당 결정들은 정제된 바깥 표준들(purified external standards)로 표준 곡선들에 기초한 HPLC 특성화(characterization)를 이용하여 만들어진다. 실제 C5 모노머 회수(recovery)는 그 다음에 이론적 수율의 퍼센트로서 표현된, C5 모노머들의 직접적 측정을 위한 샘플의 HPLC 특성화에 의하여 결정된다.
"자일란 수"는 하기와 같이 결정된 전처리된 바이오매스의 특성화를 가리킨다:
전처리된 바이오매스는 약 30% 총 고체들에서 고체 부분 및 액체 부분을 제공하기 위하여 고체/액체 분리가 된다. 이 고체 부분은 그 다음에 총 고체들(DM)의 물에 대한 1:3 wt:wt의 비율로 물과 70 ℃로 혼합됨으로써 부분적으로 세척된다. 이런 식으로 세척된 고체 부분은 그 다음에 약 30% 총 고형물로 프레스된다(press). 이런 식으로 세척된 고체 부분의 자일란 함량은 전체로서 여기에 참고로서 명확히 포함되는, 2008년 4월 수정된 Technical Report NREL/TP-510-42618에 기재된 대로, 2008년 4월 25일 발행된 A. Sluiter, et al., "Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass," US National Renewable Energy Laboratory (NREL) Laboratory Analytical Procedure (LAP)의 방법을 이용하여 결정된다. HPLC 칼럼 및 자일로스로, 갈락토스 및 만노스가 함께 용출되는 용출 시스템도 이용된다. 이러한 시스템들의 예들은 Phenomenex의 REZEX ™ Monossacharide H+ 칼럼 및 Biorad의 AMINEX HPX 87C ™ 칼럼을 포함한다. 전술한 대로 자일란 함량의 이 측정은 이들 조건들 하 고체 부분으로부터 세척되어버리지 않은 잔여 액체 부분으로부터 가용성 물질의 일부 공헌을 포함할 수 있다. 그러므로 "자일란 수"는 불용성 고체들 내 잔여 자일란 함량 및 "액체 부분" 내 가용성 자일로스 및 자일로-올리고머 함량의 "중량 결합" 수치(measurement)를 제공한다.
임의의 적절한 연질 리그노셀룰로스 바이오매스가 사용될 수 있는데, 이는 적어도 밀짚, 옥수수 대(stover), 옥수수 속대들( cobs), 빈 과실 송이들, 볏짚, 귀리짚, 보릿짚, 카놀라짚, 호밀(rye)짚, 수수(sorghum), 사탕수수(sweet sorghum), 대두(soybean) 대(stover), 스위치그래스(switch grass), 버뮤다그래스(Bermuda grass) 및 다른 풀들, 바가스(bagasse), 사탕무박(beet pulp), 옥수수 섬유(corn fiber) 또는 이들의 임의의 조합과 같은 바이오매스들을 포함한다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 종이, 신문인쇄용지, 판지(cardboard) 또는 다른 도시 또는 사무실 폐기물들과 같은 다른 리그노셀룰로스 물질들을 포함할 수 있다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 다른 공급원료들 유래의 물질들의 혼합물로서 이용될 수 있고, 신선할 수 있고, 특히 건조, 완전 건조 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 방법들은 적어도 약 10 kg 바이오매스 공급원료, 또는 적어도 100 kg, 또는 적어도 500 kg을 이용하여 수행된다.
리그노셀룰로스 바이오매스는 헤미셀룰로스의 느슨하게 조직된(loosely organized) 매트릭스 내에서 끼워넣어지고 소수성 리그닌이 풍부한 환경 내에서 밀봉된 결정질(crystalline) 셀룰로스 피브릴들(fibrils)을 포함한다. 셀룰로스 그 자체가 D-글루코스의 길고, 곧은(straight) 체인 폴리머들을 포함하는 반면, 헤미셀룰로스는 모든 5-탄소 알도펜토스들(aldopentoses)(C5 당들)에 더하여 글루코스 및 만노스를 포함하는 몇몇 6-탄소 (C6) 당들 모두의 모노머들을 포함하는, 짧고, 가지달린 체인의 탄수화물들의 불균질(heterogeneous) 혼합물이다. 리그닌은 어떠한 특정 주된 구조가 없는, 매우 불균질(heterogeneous)한 폴리머로, 소수성 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 모노머들을 포함한다.
적합한 리그노셀룰로스 바이오매스는 보통 전처리 전 건조질량(dry mass)의 20 및 50 % 사이의 양의 셀룰로스, 전처리 전 건조질량(dry mass)의 10 및 40 % 사이의 양의 리그닌, 및 15 및 40 % 사이의 양의 헤미셀룰로스를 포함한다.
일부 실시예들에서, 바이오매스 공급원료들은 열수 전처리 전에 크기 감소 및/또는 갈기(grinding), 제분(milling), 채썰기(shredding), 자르기(cutting) 또는 다른 공정들과 같은 다른 기계적 공정이 수행될 수 있다. 일부 실시예들에서, 바이오매스 공급원료들은 세척되고 그리고/또는 Knudsen et al. (1998)에서 기재한 대로, 가압된 전처리 전에 가치있는 염들이 침출(leach)될 수 있다. 일부 실시예들에서, 공급원료들은 99 ℃까지의 온도에서 가압된 전처리 전에 푹 담길 수(soak) 있다.
일부 실시예들에서, 공급원료는 열수 전처리 전에 첫째로 수용액에 푹 담긴다. 일부 실시예들에서, 전체가 참조로서 여기에 포함되는 US 8,123,864에 기재된 대로, 전처리들에서 그 다음의 단계로부터 수득되는 액체를 포함하는 아세트산에 공급원료를 푹 담그는 것이 유리할 수 있다. 전체가 참조로서 여기에 포함되는 US 12/935,587에 기재된 대로, 가장 높은 가능한 건조물 함량에서 처리를 수행하는 것이 유리하다. 높은 건조물에서 전처리를 수행하는 것은 불필요한 물을 가열하는데에 공정 에너지 소모를 피한다. 그러나, 일부 물 함량이 효소 가수분해로부터 최적의 궁극적인 당 수율들을 달성하기 위하여 요구된다. 보통 바이오매스 공급원료들을 그것들 고유의 용수량(water holding capacity)에서 또는 이와 근접하여 전처리하는 것이 유리하다. 이는 정해진 공급원료가 과도한 물 내 담겨지고 뒤이어 보통의 상업적 스크류(screw) 프레스(press)의 기계적 제한으로 프레싱된 후-보통 30 및 45% DM 사이- 다다르는 수분 함량의 레벨이다. 일부 실시예들에서, 열수 전처리는 DM 함량 적어도 35%에서 수행된다. 가열 동안 일부 물 함량이 첨가되므로 DM 함량은 열수 전처리 동안 감소할 수 있다는 것은 당업자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 일부 실시예들에서, 공급원료들은 DM 함량 적어도 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 40% 또는 그 미만, 또는 35% 또는 그 미만, 또는 30% 또는 그 미만에서 전처리된다.
일부 실시예들에서, 수용액에 담그는 것/적시는 것은 보통 자가가수분해에 유리한, 3.5 및 9.0 사이의 범위까지 전처리하기 전 pH를 조정하는 것을 돕는다. 아세트산이 가용화된(solubilized) 헤미셀룰로스로부터 유리되므로 더욱 산성인 레벨들로 전처리 동안 pH가 변할 수 있다는 것은 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
일부 실시예들에서, 열수 전처리는 습식(wet) 산화(oxidation) 전처리들에 요구되는 보충적인 산소 없이, 또는 오가노솔브(organosolv) 전처리에 요구되는 유기 용제(organic solvent)의 첨가 없이, 또는 마이크로파(microwave) 전처리에 요구되는 마이크로파 가열의 이용 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, 열수 전처리는 140 ℃ 또는 그보다 높은, 또는 150 ℃ 또는 그보다 높은, 또는 160 ℃ 또는 그보다 높은, 또는 160 및 200 ℃ 사이의, 또는 170 및 190 ℃ 사이의, 또는 180 ℃ 또는 그보다 낮은, 또는 170 ℃ 또는 그보다 낮은 온도에서 수행된다.
일부 실시예들에서, 일부 C5 함량(content)는 가압된 전처리 전 담그는 단계에 의하여 제거될 수 있다. 일부 실시예들에서, 단일 반응기가 바이오매스를 단일의(single) 목표 온도까지 가열하기 위하여 설정될 수 있다. 대체하여 단일 반응기는 하나 이상의 온도 영역으로의, 단일 통로(single passage) 동안 바이오매스가 노출되는 것과 같은 반응기 내 온도(temperature) 기울기(gradient)에 영향을 미치게 설정될 수 있다. 일부 실시예들에서, 전처리 코스 동안 가압된 반응기 내로부터 일부 가용화된 바이오매스 성분들을 부분적으로 제거하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 열수 전처리 반응기들은 보통 펄프 및 제지 산업으로부터 알려져 있는 대부분의 펄핑(pulping) 반응기들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 열수 전처리는 10 바(bar) 또는 그보다 더 낮게, 12 바(bar) 또는 그보다 더 낮도록, 또는 4 바(bar) 또는 그보다 더 높도록, 또는 8 바(bar) 또는 그보다 더 높게, 또는 8 및 18 바(bar) 사이, 또는 18 및 20 바 사이로 가압된 반응기 내 스트림(stream)에 의하여 투입된다(administer). 일부 실시예들에서, 전처리 반응기는 공급원료의 연속적인 유입을 위하여 설정된다(configured).
일부 실시예들에서, 젖은 바이오매스는 압력 하, 반응기를 통하여, 특정 기간 또는 "체류(residence) 시간" 동안 운반된다(conveyed). 체류 시간은 더 높은 바이오매스 처리량(throughput)을 가능하게 하기 위하여 짧게 유지하는 것이 유리하다. 그러나 수득되는 전처리 엄격성(severity)는 온도에 의하여 그리고 또한 체류 시간 모두에 의하여 결정된다. 열수 전처리 동안 온도는 더 낮게 유지되는데, 본 발명의 방법들이 매우 낮은 전처리 엄격성을 얻는 것을 추구하기 때문만이 아니라, 또한 더 낮은 온도들이 더 낮은 스트림(stream) 압력을 이용하여 달성될 수 있기 때문이기도 하다. 전처리 온도가 180 ℃ 또는 그보다 더 낮은 레벨일 수 있고, 따라서 포화된(saturated) 스트림(stream) 압력들이 10 바(bar) 또는 더 낮게 유지되는 정도까지, 부식의 더 낮은 경향이 경험되고, 더 낮은 급의(grade) 압입(pressure) 끼움(fittings)들 및 강철(steel) 조성물들이 이용될 수 있는데, 이는 공장(plant) 자산(capital) 비용들(costs)을 감소시킨다. 일부 실시예들에서, 반응기는 바이오매스를 160 및 200 ℃ 사이, 또는 170 및 190 ℃ 사이의 단일(single) 목표 온도로 가열하도록 설정된다. 일부 실시예들에서 체류 시간들은 60 미만, 또는 30 미만, 또는 20 미만, 또는 15 미만, 또는 14 미만, 또는 13 미만, 또는 12 미만, 또는 10 미만, 또는 8 미만, 또는 5 분 미만이다.
바이오매스 공급원료들은 다양한 수단들에 의하여 가압된 반응기 내로 대기압으로부터 로딩(load)될 수 있다. 일부 실시예들에서, 전체로서 참조로 여기에 포함되는 US 13/062,522에 기재된 시스템과 같이, 수문(sluice)-타입 "입자(particle) 펌프(pump)" 시스템이 바이오매스 공급원료들을 로딩(load)하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 소위 "스크류(screw) 플러그(plug) 공급장치(feeder)를 이용하여 전처리 반응기를 로딩하는 것이 유리할 수 있다.
전처리된 바이오매스는 다양한 수단들에 의하여 가압된 반응기로부터 내려질(unload) 수 있다. 일부 실시예들에서, 물질의 섬유 구조를 보존하기 위하여 전처리된 바이오매스는 이런 식으로 내려진다(unload). 전처리된 바이오매스의 섬유 구조를 보존하는 것은 유리한데, 왜냐하면 그것이 전처리된 물질의 고체 부분이 상대적으로 높은 건조물 레벨들로 고체/액체 분리 동안 보통의 스크류 프레스 장치를 이용하여 프레스되는 것을 허용하여, 추가되는 비용 및 멤브레인 필터 프레스 시스템들의 복잡성을 피하게 하기 때문이다.
섬유 구조는 어떤 의미로는 비-폭발성인(non-explosive) 가압된 반응기로부터 공급원료를 제거함으로서 유지될 수 있다. 일부 실시예들에서, 비-폭발성(non-explosive) 제거가 달성될 수 있고, 그리고 섬유 구조는 이로써 전체로서 여기에 참조로 포함되는 US 13/043,486에 기재된 것과 같이, 수문-타입 시스템을 이용하여 유지된다. 일부 실시예들에서, 비-폭발성 제거가 달성될 수 있고 섬유 구조가 이로써 전체로서 여기에 참조로 포함되는 US 12/996,392에 기재된 그것들과 같은, 하이드로사이클론(hydrocyclone) 제거 시스템을 이용하여 유지된다.
일부 실시예들에서, 전처리된 바이오매스는 전처리된 물질의 폭발성 방출을 수반하는 "스트림 폭발(explosion)"을 이용하여 가압된 전처리 반응기로부터 제거될 수 있다. 스트림-폭발된, 전처리된 바이오매스는 그것의 섬유 구조를 유지하지 않으며, 그러므로 섬유 구조를 유지하는 전처리된 바이오매스로 통상의 스크류 프레스 시스템들을 이용하여 달성할 수 있는 것에 필적하는 건조물 함량을 달성하기 위하여 더 정교한(elaborate) 고체/액체 분리 시스템들을 요구한다.
바이오매스 공급원료는 엄격성(severity)으로 전처리되어, 전처리된 바이오매스는 10% 또는 그보다 높은 자일란 수를 갖는 것으로 특징된다. 일부 실시예들에서, 바이오매스는 11% 또는 그보다 높은, 또는 12% 또는 그보다 높은, 또는 13% 또는 그보다 높은, 또는 14% 또는 그보다 높은, 또는 15% 또는 그보다 높은, 또는 16% 또는 그보다 높은, 또는 17% 또는 그보다 더 높은 자일란 수로 전처리된다. "자일란 수(number)"라는 파라미터는 불용성 고형물들 내 남아 있는 잔여 자일란 함량 및 또한 액체 부분 내 가용성 자일로스 및 자일로-올리고머들의 농도 모두의 가중된(weighted) 결합(combination)을 반영하는 합성(composite) 수치이다.더 낮은 Ro 엄격성(severity)에서, 자일란 수는 더 높다. 이런 식으로, 가장 높은 자일란 수는 가장 낮은 전처리 엄격성을 나타낸다. 자일란 수는 종래의 엄격성(severity) 기준(measure) 로그(log) Ro와, 불용성 고형물들 내 잔여 자일란 함량이 10% 또는 그보다 더 높은 매우 낮은 엄격성에도, 음(negative)의 선형 상관관계를 제공한다.
자일란 수는 특히 동등한 자일란 수를 갖는 다른 전처리된 바이오매스 공급원료들은 동등한(equivalent) C5 모노머 회수를 보여주는, 전처리 엄격성(severity)의 기준(measure)로서 유용하다. 그에 반하여, 종래의 Ro 엄격성(severity)는 전처리 조건들의 단순한 기재이며, 다른 바이오매스 공급원료들 사이의 비교를 위한 합리적 근거를 제공하지 않는다. 예를 들어, 엄격성(severity) 로그(log) Ro= 3.75로의 단일-단계 자가가수분해는 6-7% 사이의 자일란 수를 갖는 전처리된 사탕수수 바가스 및 옥수수 대(stover)를 제공하는데, 반면 보통 밀짚 종류(strain)들로는 전처리된 공급원료의 그 결과인 자일란 수는 약 10%이다.
바이오매스 공급원료들이, 전처리된 공급원료의 자일란 수가 10% 또는 그보다 더 큰, 매우 낮은 엄격성(severity)으로 전처리되는 것이 유리하다. 매우 낮은 엄격성(severity) 레벨은 전처리 동안 가용화되거나 또는 회복할 수 없을 정도로 손해를 입는(irretrievably lost) 전처리 전 공급원료의 총 헤미셀룰로스 함량이 최소화되는 공정에 상응한다. 10% 및 그보다 더 높은 자일란 수에서, 보통의 종류의 밀짚, 사탕수수 바가스(bagasse), 사탕수수(sweet sorghum) 바가스(bagasse), 옥수수 대(stover), 및 (기름야자나무로부터의) 빈 과실 송이들로, 공급원료의 원래 C5 함량의 적어도 60%가 단일-단계 자가가수분해 전처리 후 회수될 수 있는데, 이때 고체 부분 내 자일란 및 또한 액체 부분의 자일로스 및 자일로-올리고머들 모두가 이유가 된다.
우리는 단일-단계 자가가수분해에 의하여 매우 낮은 엄격성(severity)으로 전처리된 공급원료들의 효소 가수분해 후 C6 모노머 수율들의 주목할만한 손실 없이 적어도 55%의 이론적, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65%의 높은 최종 C5 모노머 수율들이 수득될 수 있었다는 것을 예상 외로 발견하였다. 매우 낮은 엄격성(severity) 레벨들에서, 공급 원료의 헤미셀룰로스 함량의 많은 부분들이 전처리 후 고체 부분 내에 남아 있는데, 이는 나중에 효소 가수분해를 이용하여 높은 회수로 C5 모노머들로 가수분해될 수 있다.
"자일로스 회수"에 관한 보고들이 자주 여기에서 보고된 자일로스 회수들에 필적하지 않는 용어로 표현되었다는 것에 주의하여야 한다. 예를 들어, Ohgren et al. (2007) and Lee et al. (2009)는 높은 자일로스 회수를 보고한다. 그러나 이들 값들은 전처리 전 공급원료의 원래 헤미셀룰로스 함량의 퍼센트로서 표현되지 않은, 전처리된 바이오매스로부터 자일로스 회수만을 가리킬 뿐이다. 또는 예컨대 WO2010/113129는 전처리 전 공급원료의 헤미셀룰로스 함량의 퍼센트로서 헤미셀룰로스 회수를 가리키는데, 그러나 총 헤미셀룰로스 회수보다 변함없이 더 작은 모노머 수율을 명시하지 않는다.
매우 낮은 엄격성(severity) 레벨들로 단일-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된 바이오매스의 또다른 아주 놀라운 특징은 발효성 생물들(organisms)의 억제제로서 작용하는 전처리 부산물들의 농도들이 매우 낮은 레벨들로 유지된다는 것이다. 그 결과, 본 발명의 방법들에 의하여 수득된 가수분해된 바이오매스를 어떠한 세척 또는 다른 해독(de-toxification) 단계의 요구 없이, 발효로 직접 이용하는 것이 보통 가능하다.
당업계에 널리 알려져 있듯이, 자가가수분해 열수 전처리는 보통 그것들이 발효성 생물들의 성장 및/또는 물질대사(metabolism)를 억제하는 "발효 억제제들"로서 작용하는 여러가지의 가용성 부산물들을 생산한다. 다른 발효 억제제들은 리그노셀룰로스 공급원료의 속성 및 전처리의 엄격성에 의존하여, 다른 양으로 생산된다. Klinke et al. (2004)참조. 적어도 세 카테고리들의 발효 억제제들이 보통 자가가수분해 전처리 동안 형성된다: (1) 퓨란(furans)들, 주로 모노- 또는 올리고-당들로부터의 분해 산물들인 2-푸르푸랄(furfural) 및 5-HMF (5 하이드록시메틸푸르푸르랄(hydroxymethylfurfural)); (2) 리그닌 구조의 분해 산물들인 모노머 페놀들; 및 (3) 작은 유기산들, 주로 헤미셀룰로스들 및 리그닌 내 아세틸 그룹들로부터 유래된 아세트산. 다른 억제제들의 혼합물은 효모 균주들, 예컨대 Palmquist et al. (1999) 참조, 및 또한 에탄올성(ethanolic) 대장균(Escherichia coli)예컨대 Zaldivar et al. (1999) 참조,를 이용한 바이오에탄올 발효에서 상조적으로(synergistically) 작용하는 것이 보여진다. 일부 실시예들에서, 전처리된 바이오매스를 당업계에 널리 알려진 방법들을 사용하여, 휘발성(volatile) 억제제들, 가장 중요하게는 푸르푸랄을 감소시키기 위하여, 순간증발(flash evaporation)하게 하는 것이 유리할 수 있다. 우리의 경험 상, 자일란 수 10% 또는 그보다 높게 전처리된, 밀짚, 사탕수수(sweet sorghum) 바가스(bagasse), 사탕수수 바가스(bagasse), 옥수수 대(stover), 및 빈 과실 송이들과 같은 보통 종류의 바이오매스 공급원료들로 자가가수분해를 이용하여, 아세트산 및 푸르푸랄 레벨들만이 발효성 생물들을 잠재적으로 억제한다. 바이오매스 공급원료들이 DM 35% 또는 그 보다 높은 데서 자일란 수 10% 또는 그보다 높게 전처리되는 경우, 그리고 고체 부분이 그 후에 25% 또는 그보다 더 낮은 DM에서, DM을 조정하기 위하여 첨가된 물과, 그러나 세척 단계 없이, 효소적으로 가수분해되는 경우, 가수분해물 내 푸르푸랄(furfural) 레벨들은 보통 3 g/kg 미만으로 유지될 수 있고 아세트산 레벨들 9 g/kg 아래다. 이들 레벨들은 전문화된 균주들(specialized strains)을 이용한 효모 발효에 보통 허용된다. 효소 가수분해 동안, 어느 정도 추가적인 아세트산이 고체 부분 내 헤미셀룰로스의 분해로부터 유출된다. 일부 실시예들에서, 전기투석(electrodialysis) 또는 다른 당업계에 알려진 방법들을 이용하여 액체 부분 및/또는 가수분해된 고체 부분으로부터 일부 아세트산 함량을 제거하는 것이 유리하다.
반응기 체류 시간들 및 온도들의 다른 다양한 다른 조합들에 의하여 다른 공급원료들이 자일란 수 10% 또는 그보다 크게 단일-단계 자가가수분해를 이용하여 전처리될 수 있다. 당업자는 통상적인 실험을 통하여 임의의 정해진 반응기를 이용하여 임의의 정해진 공급원료로, 그리고 임의의 정해진 바이오매스 반응기-로딩 및 반응기-언로딩(unloading) 시스템으로 적용할 통상의 적절한 전처리를 쉽게 결정할 것이다. 공급원료들이 수문-시스템 또는 스크류-플러그 공급장치(feeder)에 의하여 로딩되고, "입자(particle)" 펌프" 수문(sluice) 시스템 또는 하이드로사이클론(hydrocyclone) 시스템에 의하여 언로딩(unloaded)되는 연속식 반응기를 이용하여 전처리되는 경우, 10% 또는 그보다 큰 자일란 수의 매우 낮은 엄격성(severity)이 보통인 종류의 밀짚 또는 빈 과실 송이들을 이용하여 180 ℃의 온도 및 24 분의 반응기 체류 시간에 의하여 달성될 수 있다. 보통인 종류의 옥수수 대(stover), 사탕수수 바가스(bagasse), 및 사탕수수(sweet sorghum) 바가스(bagasse)를 위하여는, 10% 또는 그보다 큰 자일란 수의 매우 낮은 엄격성(severity)이 180 ℃의 온도 및 12분의 반응기(reactor) 체류 시간을 이용하여 또는 175 ℃의 온도 및 17 분의 반응기(reactor) 체류 시간을 이용하여 보통 달성될 수 있다. Ro 엄격성의 비슷한(comparable) 레벨들을 달성하기 위하여 체류 시간들 및 온도들이 조정될 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다.
전처리 후, 전처리된 바이오매스는 고체/액체 분리 단계에 의하여 고체 부분 및 액체 부분로 분리된다. "고체 부분" 및 "액체 부분"이 더 나뉘거나(subdivide) 또는 가공(processs)될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 일부 실시예들에서, 바이오매스는 고체/액체 분리와 동시에 전처리 반응기로부터 제거될 수 있다. 일부 실시예들에서, 전처리된 바이오매스는 반응기로부터 언로딩된 후, 고체 부분 및 액체 부분를 만들어내기 위하여 보통 단순하고 비용이 저렴한 스크류 프레스 시스템을 이용하여, 고체/액체 분리 단계를 거치게 된다. 셀룰라제 효소 활성들은, 액체 부분에 의하여, 가장 뚜렷하게는 자일로-올리고머 함량 때문에 그러나 아마도 또한 페놀(phenol) 함량 및/또는 아직 확인되지 않은 다른 성분들 때문에, 억제된다. 그러므로 고체 부분 내 건조물 함량의 가장 실행가능한 레벨들을 달성하는 것이 또는 대체하여 고체 부분으로부터 용해된 고형물(solids)의 가장 높은 실행 가능한 양을 제거하는 것이 유리하다. 일부 실시예들에서, 고체/액체 분리는 적어도 40%, 또는 적어도 45%, 또는 적어도 50% , 또는 적어도 55%의 DM 함량을 갖는 고체 부분을 달성한다. 보통의 스크류 프레스 시스템들을 이용한 고체/액체 분리는 바이오매스 공급원료가 섬유 구조가 유지되는 식으로 전처리된다면, 보통 고체 부분 내 50%만큼 높은 DM 레벨들를 달성할 수 있다. 일부 실시예들에서, 예컨대 멤브레인 필터 프레스 시스템을 이용하는 것과 같이, 더 효과적인 고체/액체 분리를 달성하기 위하여 더 높은 공장 자산(capital) 비용(expenses)을 발생시키는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시예들에서, 용해된 고형물들은 순차적인 세척 및 프레싱에 의하여 또는 펄프 및 제지 기술에 알려진 치환 세정(displacement washing) 기술들을 이용하여 고체 부분으로부터 제거될 수 있다. 일부 실시예들에서, 직접적으로 고체/액체 분리에 의하여, 또는 세척 및 고체/액체 분리의 몇몇 조합에 의하여, 고체 부분의 용해된 고형물들은 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%까지 감소된다.
자일란 수 10% 또는 그보다 높게 전처리된 공급연료들의 효소 가수분해는 보통 상업적으로 합리적인 효소 소모로, 특정 세척 또는 해독(de-toxification) 단계들의 요구 없이 수행될 수 있으며, 이때 고체 부분은 적어도 40% DM로 프레스되고 또는 고체 부분의 용해된 고형물들 함량이 적어도 50%까지 감소된다.
고체/액체 분리에 의하여 수득되는 액체 부분은 고체 부분의 효소 가수분해 동안 고체 부분으로부터 따로 유지된다. 우리는 이를 임시의 분리 "C5 바이패스(bypass)"라고 명명한다. 자일란 수 10% 또는 그 보다 높게 단일-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된 보통 종류의 밀짚, 사탕수수 바가스(bagasse), 사탕수수(sweet sorghum) 바가스(bagasse), 옥수수 대(stover), 및 빈 과실 송이들과 같은 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들로부터 수득된 액체 부분은 작은 성분의 C6 모노머들 (1x), 몇몇 다른 다른 당들을 갖는 주로 글루코스 및; 더 큰 성분의 가용성 C6 올리고머들 (약 2x - 7x); 더 큰 성분의 C5 모노머들 (약 4x - 8x), 몇몇 아라비노스 및 다른 당들을 갖고 주로 자일로스; 및 훨씬 큰 성분의 가용성 자일로-올리고머들 (약 18x - 30x)을 포함한다. 가용성 자일로-올리고머들은 보통 몇몇 더 높은 체인 올리고머들과 함께 쥴로 자일로헥소스(xylohexose), 자일로펜토스(xylopentose), 자일로테트라오스(xylotetraose), 자일로트리오스(xylotriose) 및 자일로비오스(xylobiose)를 포함한다.
고체 부분은 효소 활성들의 혼합물을 이용하여 효소 가수분해된다. 당업자가 쉽게 이해할 것이듯, 본 발명의 방법들의 실행에 적합한 효소 혼합물들의 조성물은 비교적 넓은 한도 내에서 다를 수 있다. 적합한 효소 제제들은 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들을 포함한다. 최적화(optimization) 동안 효소 혼합물들의 선택들 및 변형들은 예컨대 Zhang et al. (2006)에 의하여 또는 당업계에 알려진 다른 방법들에 의하여 기재된 대로와 같은 유전공학 기술들을 포함한다. 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들(preparations)은 보통 제조업자 및/또는 보통 말하는 공급업자에 의하여 확인된다. 이것들은 보통 일반 사용을 위한 또는 동물 사료, 식품, 직물 세제들(textiles detergents)의 생산 또는 제지 산업에서의 이용에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들과는 별개의 것이다. 일부 실시예들에서, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제는 GENENCOR ™에 의하여 공급되고, 예컨대 상표 ACCELLERASE TRIO ™ 판매되는 상업적 셀룰라제 제제와 같은, 유전자 변형된 트리코더마(Trichoderma) 리세이(reesei)의 발효들로부터 분리된 엑소글루카나제들(exoglucanases), 엔도글루카나제들(endoglucanases), 엔도자일라나제들(endoxylanases), 자일로시다제들(xylosidases), 아세틸 자일란 에스테라제들(acetyl xylan esterases) 및 베타 글루코시다제들(beta glucosidases)을 포함하는 것이 사용된다. 일부 실시예들에서, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제는 NOVOZYMES ™에 의하여 제공되고 예컨대, 상표들 CELLIC CTEC2 ™ 또는 CELLIC CTEC3 ™하 판매되는 상업적 셀룰라제 제제들과 같은, 엑소글루카나제들(exoglucanases), 엔도글루카나제들(endoglucanases), 엔도자일라나제들(endoxylanases), 자일로시다제들(xylosidases), 아세틸 자일란 에스테라제들(acetyl xylan esterases) 및 베타 글루코시다제들을 포함하는 것이 사용된다.
리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 3개의 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제에서 나타나는 효소 활성들이 자세히 분석되었다. 이들 세 개의 제제들, GENENCOR ™의 ACCELLERASE TRIO ™ 및 NOVOZYMES ™의 CELLIC CTEC2 ™ 및 CELLIC CTEC3 ™ 각각은 C5 모노머 수율들이 적어도 60%이고 셀룰로스 C6 전환 수율들이 적어도 60%이었던 본 발명의 방법들에 따라 제조된 결합된 C5/C6 밀짚 가수분해물의 제공에서, 제조업자에 의하여 제시된 범위 내의 효소 용량(dose) 레벨들에서 효과적인 것으로 보여졌다. 이들 상업적 셀룰라제 제제들 각각에 대하여, 12개의 다른 효소 활성들의 레벨들이 특성화되고 그람(gram) 단백질 당 표현되었다. 실험 세부사항들은 실험예 8에 제공된다. 결과들은 표 1에 보여진다.
표 1. 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적 셀룰라제 제제들의 선택된 활성 측정들.
일부 실시예들에서, 효소 제제들은 엔도글루카나제(endoglucanase), 엑소글루카나제(exoglucanase), B-글루코시다제(glucosidase), 엔도자일라나제(endoxylanase), 자일로시다제(xylosidase) 및/또는 아세틸 자일란 데스테라제 활성들 중 임의의 것 사이의 표 1에 기재된 상업적 제제들에 의하여 보여지는 것과 유사한 상대적 비율을 갖는 것으로 사용될 수 있다.
리그노셀룰로스 바이오매스를 가수분해하기에 효과적인 효소 혼합물들은 호기성 및 혐기성 박테리아, 백색 부후진균(white rot fungi), 부패병균(soft rot fungi) 및 혐기성 진균(anaerobic fungi)을 포함하는, 여러가지 미생물들로부터 당업계에 잘 알려진 방법들에 의하여 대체하여 수득될 수 있다. 예컨대 Singhania et al. (2010) 참조. 셀룰라제들을 생산하는 생물들은 보통 리그노셀룰로스계 기질들의 가수분해에 적합하기 위하여 적절한 비율들로 다른 효소들의 혼합물을 분비한다. 리그노셀룰로스 바이오매스의 전환에 유용한 셀룰라제 제제들의 바람직한 소스들은 트리코더마(Trichoderma), 페니실룸(Penicillium), 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 아스퍼질러스(Aspergillus) 및 파네로채트(Phanerochaete)의 종들과 같은 진균들을 포함한다.
특히, 하나의 진균, 트리코더마(Trichoderma) 리세이(reesei)가 널리 연구되어 왔다. 야생형 트리코더마(Trichoderma) 리세이(reesei)는 셀룰로스 체인들의 말단들을 감소시키고 감소시키지 않기 위한 각각의 특이성(specificities)들을 갖는 2 개의 엑소셀룰라제들(exocellulases)(셀로비오하이드롤라제들((cellobiohydrolases)), 상이한 셀룰로스 인식 위치들(sites)을 갖는 는 적어도 5개의 다른 엔도셀룰라제들, 2 개의 B-글루코시다제들을 비롯해 여러가지 엔도자일라나제들(endoxylanases) 및 엑소자일로시다제들(exoxylosidases)을 포함하는 효소들의 혼합물을 분비한다. Rouvinen, J., et al. (1990); Divne, C., et al. (1994); Martinez, D., et al. (2008) 참조. 상업적 셀룰라제 제제들은 보통 알파-아라비노퓨라노시다제들(arabinofuranosidase) 및 아세틸 자일란 에스테라제(acetyl xylan esterase) 활성들 또한 포함한다. 예컨대 Vinzant, T., et al. (2001) 참조.
야생형 생물들에 의하여 자연적으로 분비되는 혼합물들 내 존재하는 비율들과는 다른 상대적인 비율들인 효소 활성들의 최적화된 혼합물이 더 높은 당 수율들을 생산하기 위하여 이전에 보여져왔다. Rosgaard et al. (2007) 참조. 정말로, 무려 16 개의 다른 효소 단백질들을 포함하는 효소 블렌드(blends)들의 최적화가 임의의 정해진 전처리가 될 임의의 주어진 바이오매스 공급원료를 위하여 유리하게 따로 결정될 수 있다는 것이 제안되어 왔다. Billard, H., et al. (2012); Banerjee, G., et al. (2010) 참조. 그러나, 상업적 실현가능성으로서, 상업적 효소 공급자들은 보통 규모의 경제가 큰-규모 생산에서 얻어질 수 있도록 하기 위하여, 다른 효소 블렌드들의 가장 작은 실현가능한 수를 생산하는 것을 보통 추구한다.
일부 실시예들에서, 하나 또는 추가적으로 그보다 많은 또는 보충적인 효소 활성들을 갖고 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제를 보충하는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시예들에서, 단순히 상업적 제제에 존재하는 하나 또는 그 이상의 성분 효소들의 상대적인 비율을 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시예들에서, 전문화된(specialized) 추가적인 활성들을 도입하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 임의의 정해진 바이오매스 공급원료를 이용함으로서 본 발명의 방법들을 실행하는데 있어, 특정 가수분해되지 않은 탄수화물 결합들(linkages)은 하나 또는 그 이상의 보충적(supplemental) 효소 활성들의 이용을 통하여 유리하게 가수분해될 수 있다는 것이 확인될 수 있다. 이러한 가수분해되지 않은(unhydrolysed) 결합들은 가용성 가수분해물들 또는 불용성 가수분해되지 않은 잔여물(residual)에서 당업계에 잘 알려진 방법들을 이용하여 올리고머 탄수화물들의 특성화(characterization)를 통하여 확인될 수 있다. 가수분해되지 않은 결합들은 또한 Nguema-Ona et al. (2012)에 기재된 바와 같이 특정 탄수화물 결합들을 겨누는 잔일클론 항체들을 이용하여 포괄적인 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(profiling)을 통하여 확인될 수 있다. 일부 실시예들에서, 임의의 하나 또는 그 이상의 추가적인 엔도자일라나제(endoxylanase), B-글루코시다제(glucosidase), 만난나제(mannanase), 글루코로니다제(glucouronidase), 자일란 에스테라제(xylan esterase), 아밀라제(amylase), 장리로시다제(xylosidase), 글루코라닐 에스테라제(glucouranyl esterase), 또는 아라비노퓨라노시다제(arabinofuranosidase)를 이용하여 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제를 보충하는 것이 유리할 수 있다.
일부 실시예들에서, Humbird et al. (2011)에 기재된 바와 같이, 리그노셀룰로스 바이오매스 가공 시설에서 현장에서(on-site) 효소들을 생산하는 것이 대체하여 유리할 수 있다. 일부 실시예들에서, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제는 특정 바이오매스 공급원료에 적합한 특이적 효소 활성들의 맞춤형(customized) 보충(supplementation)을 갖고 또는 갖지 않고 현장에서(on-site) 생산될 수 있다.
일부 실시예들에서, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들이 사용되거나 그렇지 않든, 그리고 효소들이 바이오매스 가공 공장에서 현장에서(on-site) 생산되거나 그렇지 않든 간에, 하기를 포함하는 효소 혼합물을 이용하여 매우 낮은 엄격성(severity) 자일란 수 10% 또는 그보다 많게 자가가수분해 전처리되는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들을 이용하여 본 발명의 이점들이 얻어질 수 있다: (1) 셀룰로스 체인들의 말단들을 감소시키고 감소시키지 않는 것에 대한 특이성들을 갖는 적어도 2개의 효소들을 선택적으로 포함하는 엑소셀룰라제(Exocellulase) (셀로비오하이드롤라제(cellobiohydrolase)) 활성들(EC 3.2.1.91); (2) 엔도셀룰라제(endocellulase) 활성(EC 3.2.1.4); (3) B-글루코시다제 활성(EC 3.2.1.21); (4) B-1,4 엔도자일라나제(endoxylanase) 활성(EC 3.2.1.8); (5) 아세틸 자일란 에스테라제 활성(EC 3.1.1.72); 및 선택적으로 (6) B-1,3 자일로시다제 활성(EC 3.2.1.72);및 선택적으로 (7) B-1,4 자일로시다제 활성(EC 3.2.1.37);및 선택적으로 (8) 알파 1,3 및/또는 알파 1,5 아라비노퓨라노시다제(arabinofuranosidase) 활성 (EC 3.2.1.23). 일부 실시예들에서,효소 혼합물은 하기와 같은 효소 활성들의 상대적인 비율을 갖는 것으로 더 특성화된다: 1 FPU 셀룰라제 활성은 적어도 30 CMC U 엔도글루카나제(endoglucanase) 활성 및 적어도 적어도 28 pNPG U 베타 글루코시다제 활성 및 적어도 50 ABX U 엔도자일라나제(endoxylanase) 활성과 관련된다. CMC U가, 50 ℃ 및 pH 4.8의 특정 분석 조건들 하 활성의 1 CMC U는 1분에 환원당들의 1 umol 를 유리시키는(글루코스 등가(glucose equivalents)로 표시된다),카복시메틸세룰로스(carboxymethycellulose) 단위들(units)을 가리키고, pNPG U는 활성의 1 pNPG U이 50 ℃ 및 pH 4.8에서 파라-니트로페닐-B-D-글루코피라노사이드(para-nitrophenyl-B-D-glucopyranoside)로부터 분 당 1 umol의 니트로페놀(nitrophenol)을 유리하는 pNPG 단위들(units)을 가리키고; 그리고 ABX U는, 활성의 1 ABX U이 50 ℃ 및 pH 5.3에서 1분에 1 umol의 자일로스 환원당 등가(equivalent)를 유리시키는 버치우드(birchwood) 자일라나제(xylanase) 단위들(units)을 가리킨다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다. FPU가 다른 셀룰라제 효소들의 임의의 혼합물을 포함하는 총 셀룰라제 활성의 수치(measure)를 제공하는 "여과지(filter paper) 단위들(units)"를 가리킨다는 것을 당업자가 쉽게 더 이해할 것이다. 여기에 사용된 대로, FPU는, 전체가 여기에 참조로서 명백히 포함되는 Adney, B. and Baker, J., Laboratory Analytical Procedure #006, "Measurement of 셀룰라제 activity", August 12, 1996, the USA National Renewable Energy Laboratory (NREL)의 방법에 의하여 결정된다.
일부 실시예들에서, 효소 혼합물은 임의의 하나 또는 그보다 많은 만노시다제들(mannosidases)(EC 3.2.1.25), a-D-갈락토시다제들(galactosidases) (EC 3.2.1.22), a-L-아라비노퓨라노시다제들(arabinofuranosidases) (EC 3.2.1.55), a-D-글루쿠로니다제들(glucuronidases) (EC 3.2.1.139), 신나모일 에스테라제들( cinnamoyl esterases) (EC 3.1.1.-), 또는 페룰로일 에스테라제들(feruloyl esterases) (EC 3.1.1.73)를 더 포함할 수 있다.
당업자는 통상의 실험을 통하여, 적용할 임의의 정해진 효소 제제의 적절한 용량(dose) 레벨 및 효소 가수분해의 적절한 기간을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 더 낮은 효소 용량 레벨들을 유지하여 효소 비용들을 최소화하는 것이 일반적으로 유리하다. 일부 실시예들에서, 높은 효소 용량을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 방법을 실행하는데 있어, 당업자는 지역의(local) 바이오매스 비용들, 산물 스트림들의 시장 가격들, 총 공장 자본 비용들 및 할부상환(amortization) 계획들(schemes) 및 다른 팩터들(factor)을 포함하는 적절한 팩터들을 고려하여 효소 용량의 경제적 최적화를 결정할 수 있다. 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제가 사용되는 실시예에서, 제조업자에 의하여 제공된 일반적인 용량 범위가 최적화할 일반적인 범위를 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서 가수분해 기간은 적어도 48 시간(hours), 또는 적어도 64 시간(hours), 또는 적어도 72 시간(hours), 또는 적어도 96 시간(hours), 또는 24 및 150 시간들 사이의 시간이다.
당업계에 잘 알려 있듯이, 셀룰라제 촉매작용은 가수분해가 낮은 건조물 함량에서 수행될 때 더 효율적이다. 이 잘 알려진 효과에 대한 정확한 이유들은 완전히 이해되지는 않지만, 더 높은 고형물들 농도는 셀룰라제 촉매작용을 효과적으로 억제한다. 예컨대 Kristensen et al. (2009) 참조.
일부 실시예들에서, 몇몇 결과의 효소 소모 증가에도 불구하고, 매우 높은 DM > 20%에서 가수분해를 수행하는 것이 유리할 수 있다. 일반적으로, 물 소비 및 폐수 처리 요건들 모두를 최소화하기 위하여 가장 높은 실행가능한 건조물 레벨에서 가수분해를 수행하는 것이 유리하다. 가장 높은 실행가능한 당 농도들을 이용하는 것이 발효 시스템에서 추가적으로 유리하다. 가수분해가 더 높은 건조물 레벨들에서 수행되는 경우 더 높은 당 농도들이 생산된다. 통상적인 실험을 통하여, 임의의 정해진 바이오매스 공급원 및 효소 제제로, 정해진 가공 목적들을 달성하는데 적합한, 효소 가수분해를 수행하는 DM 레벨을 당업자는 쉽게 결정할 것이다. 일부 실시예들에서, 고체 부분의 효소 가수분해는 15% DM 또는 그보다 큰 데서, 또는 16% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 17% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 18% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 19% DM 그보다 큰데서, 또는 20% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 21% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 22% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 23% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 25% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 30% DM 또는 그보다 큰데서, 또는 35% DM 또는 그보다 큰데서 수행될 수 있다.
일부 실시예들에서, 40% DM 또는 그보다 큰 데서, 고체 부분은 고체/액체 분리로부터 회수되나, 추가적인 물 함량이 첨가되어 효소 가수분해는 더 낮은 DM 레벨들에서 수행될 수 있다. 물 함량은 신선한 물, 응축물(condensate) 또는 임의의 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) (PEG) 또는 계면활성제들, 염들, 암모니아, 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide), 칼슘 하이드록사이드(calcium hydroxide), 또는 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)와 같은 pH 조정을 위한 화학물질들, 항-박테리아 또는 항-진균제, 또는 다른 물질들과 같은 첨가제들과 함께 또는 없이 다른 가공 용액들(process solutions)의 형태로 첨가될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
고체 부분이 전환의 원하는 정도로 효소 가수분해된 후, C5 바이패스(bypass) 내 남아 있던 액체 부분은 후-가수분해를 위한 가수분해물 혼합물과 혼합된다. 일부 실시예들에서, 회수된 액체 부분 모두는 한번에 첨가될 수 있는데, 반면 다른 실시예들에서, 액체 부분의 일부 성분은 제거될 수 있고 그리고/또는 액체 부분은 증가하여 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에서, 액체 부분과 혼합하기 전에, 고체 부분은 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60% 셀룰로스 전환으로 가수분해되는데, 이는 적어도 글루코스 모노머들의 특이적인 이론적 수율이 얻어진다는 것을 의미한다. 액체 부분 내 존재하는 자일로-올리고머들의 상당 부분은 보통 가수분해물 혼합물 내 활성으로(active) 남아 있는 자일로스 및 다른 효소들의 작용에 의하여 자일로스 모노머들로 가수분해될 수 있다. 일부 실시예들에서, 후-가수분해는 적어도 6 시간(hours), 또는 15 및 50 시간(hours) 사이의 시간, 또는 적어도 24 시간들(hours) 동안 수행된다. 일부 실시예들에서, 가수분해물 혼합물 내 활성으로 남아 있는 자일라나제(xylanase) 및 다른 효소들의 작용에 의하여 후-가수분해 동안, 액체 부분에 존재하는 자일로-올리고머들의 무게(mass)에 의하여 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%가 자일로스 모노머들로 가수분해된다. 일부 실시예들에서, 액체 부분은 화학적 첨가제들의 더이상의 첨가 없이 가수분해물과 직접 혼합된다. 일부 실시예들에서, 아세트산, 푸르푸랄 또는 페놀들과 같은 액체 부분의 일부 성분들이 가수분해물과의 혼합 전 액체 부분으로부터 제거될 수 있다.
일부 실시예들에서, 고체 부분의 효소 가수분해 및/또는 액체 부분의 후-가수분해(post-hydrolysis)는 동시당화 발효(simultaneous saccharification and fermentation)(SSF) 공정으로서 수행될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, SSF이 효소 가수분해에 최적인 것과 동일한 온도에서 수행될 수 있을 때, 효소 가수분해의 코스 동안 도입되는 발효성 생물이 글루코스 및 자일로스 모노머들을 소모하고 이로써 효소 촉매작용된 반응들의 산물 억제를 감소시키기 때문에, 효소 소모는 최소화될 수 있다. 일부 실시예들에서, 적어도 60% 셀룰로스 전환으로 발효성 생물의 첨가 없이 후-가수분해는 섬유 부분이 가수분해된 후에만 수행된다.
보통 종류의 밀짚, 사탕수수(sugarcane) 바가스(bagasse), 사탕수수(sweet sorghum) 바가스(bagasse), 옥수수 대(stover) 또는 빈 과실 송이들과 같은 바이오매스 공급원료들이 35% 또는 그보다 큰 DM에서 단일-단계 자가가수분해에 의하여 자일란 수 10% 또는 그보다 크게 전처리되는 경우, 전처리된 바이오매스의 고체 부분이 용해된 고형물들의 적어도 40% DM 또는 적어도 50% 제거를 갖고 수득되는 경우, 고체 부분이 나중에 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제를 이용하여 15 및 27% 사이의 DM에서 효소 가수분해되는 경우, 효소 가수분해가 적어도 48 시간 동안 수행되는 경우, 액체 부분이 적어도 50% 글루코스 전환이 얻어진 후 고체 부분 가수분해물에 첨가되는 경우, 및 첨가된 액체 부분이 적어도 6 시간의 기간 동안 후-가수분해되는 경우, 이론적 최대의 자일로스 수율의 60% 또는 그보다 큰 C5 모노머 수율들에 상응하는 결합된 C5/C6 가수분해물에서 C5 모노머 농도들을 달성하는 것이 보통 가능하다.
일부 실시예들에서, 결합된(combined) C5/C6 가수분해물은 하나 또는 그보다 많은 변형된 효모 균주들을 이용하여 에탄올로 직접 발효될 수 있다.
도 9는 하나의 실시예를 위한 공정 계획을 보여준다.
나타나는 대로, 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스는 DM 35% 또는 그보다 큰 데서, 담기거나(soaked), 세척되거나(washed) 또는 적셔진다(wetted). 바이오매스는 자일란 수 10% 또는 그 보다 큰 것으로 특징되는 엄격성(severity)으로의 단일-단계 자가가수분해에서 가압된(pressurized) 스트림(steam)을 이용하여 3.5 내지 9.0의 범위 내의 pH에서 전처리된다. 전처리된 바이오매스는 DM 함량 40% 또는 그보다 큰 것을 갖는 액체 부분 및 고체 부분을 생산하는 고체/액체 분리가 된다. 고체 부분은 적절한 DM 함량으로 조정되고 그 다음에 셀룰로스 전환 60% 또는 그보다 큰 정도로 DM 함량 15% 또는 그보다 큰 데서 효소 가수분해된다. 분리된 액체 부분은 그 다음에 가수분해된 고체 부분과 혼합되고, 후가숩누해되고, 이로써 액체 부분에 존재하는 상당한 양의 자일로-올리고머들이 모노머 자일로스로 가수분해된다. 기재한 대로 가수분해 및 후-가수분해 후, C5 모노머 수율은 보통 적어도 60%인 반면, 셀룰로스 전환은 유사하게 적어도 60%이다.
실험예들:
실험예 1. 전처리 엄격성의 척도(measure)로서 고체 부분의 "자일란 수(Xylan number)" 특성화(characterization).
밀짚(WS), 옥수수 대(stover) (CS), 단 사탕수수(Sweet sugarcane) 바가스(bagasse) (SCB) 및 빈 과실 송이들(Empty Fruit Bunches) (EFB)이 35-50% 건조물에서 전처리 전, 0-10 g 아세트산/kg 건조물 바이오매스, pH > 4.0으로 적셔졌다. 약 60 kg DM/h 바이오매스가 12-18 분의 체류 시간으로 170-200 ℃로부터의 온도에서 전처리되었다. 바이오매스는 수문(sluice) 시스템을 이용하여 반응기 내로 로딩되었고, 전처리된 물질은 수문 시스템을 이용하여 언로드된다. 가압된(pressurized) 전처리 반응기 내 압력은 사용된 온도에서 포화된(saturated) 스트림의 압력에 상응한다. 전처리된 바이오매스는 스크류 프레스를 이용하여 고체/액체 분리되어 약 30% 건조물을 갖는 액체 부분 및 고체 부분을 생산한다. 고체 부분은 약 3 kg 물/kg 건조 바이오매스로 세척되고 다시 약 30% 건조물로 프레스되었다. 전처리 반응기 및 공정에 관한 세부사항들은 Petersen et al. (2009)에 더 기재되어 있다.
미가공(Raw) 공급원료들이 Phenomenex의 Rezex Monossacharide H+ 칼럼을 갖춘 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템을 이용하여 Sluiter el al. (2005) 및 Sluiter et al. (2008)에 기재된 방법들에 따라 탄수화물들로 분석되었다. 액체 부분 및 고체 부분의 샘플들은 연속적 전처리의 3시간 후 수집되엇고, 샘플들은 샘플이 정상(steady) 상태(state) 전처리로부터 얻어진 것을 보장하기 위하여 3시간 넘게 3번 수집되었다. 고체 부분들은 Rezex Monossacharide H+ Monosaccharide 칼럼을 갖춘 Dionex로부터 Ultimate 3000 HPLC 시스템으로 Sluiter et al. (2008)에 기재된 방법들에 따라 탄수화물들에 대하여 분석되었다. 액체 부분들은 Rezex Monossacharide H+ Monosaccharide 칼럼을 갖춘 Dionex로부터 Ultimate 3000 HPLC 시스템으로 Sluiter et al. (2006)에 기재된 방법들에 따라 탄수화물들(carbohydrates) 및 분해 산물들에 대하여 분석되었다. 고체 부분의 분해 산물들은 물과 5mM 황산이 1:4의 비율인 고체 부분의 현탁물(suspension)에 의하여 분석되었고, Rezex Monossacharide H+ 칼럼을 갖춘 Dionex의 Ultimate 3000 HPLC 시스템으로 Sluiter et al. (2006)에 기재된 방법들에 따라 그 다음에 분석되었다. 건조물 함량 및 현탁된(suspended) 고형물들은 Weiss et al. (2009)에 기재된 방법들에 따라 분석되었다. 물질 밸런스들(Mass balances)은 Petersen et al. (2009)에 기재된 대로 마련되었으며(set up), 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 회수(recoveries)들이 결정되었다. 플래싱(flashing)으로 인한 푸르푸랄의 손실이 설명되지 않은데도(not accounted for) 불구하고, 5-HMF 또는 푸르푸랄으로 분해된 당들의 양 및 바이오매스 건조물 kg 당 전처리 동안 헤미셀룰로스로부터 방출된(released) 아세테이트(acetate)의 양도 정량화되었다.
전처리 공정의 엄격성은 보통 Overend et al. (1987)에 의하여 먼저 개발된, 엄격성 팩터(factor)에 의하여 기재된다. 엄격성(severity) 팩터(factor)는 log(R0)=t*eksp((T-Tref)/14.75)와 같은 로그(log) 값으로 보통 표현되는데, 이때 R 0는 엄격성(severity) 팩터이고, t는 분(in minutes)들인 체류 시간이고, T는 온도이고 Tref는 보통 100 ℃인 참고 온도이다. 엄격성(severity) 팩터는 Belkecemi et al. (1991), Jacobsen and Wyman (2000) 또는 Lloyd et al. (2003)에 기재된 대로 헤미셀룰로스 가용화(solubilisation)의 동역학(kinetics)에 기초한다. 전처리의 엄격성(severity)은 이와 같이 전처리 후 고체 부분에 남은 잔여 헤미셀룰로스 함량과 관련된다.
기재된 대로 제조되고 세척된 고체 부분들이 Phenomenex의 Rezex Monossacharide H+ 칼럼을 갖춘 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템으로 Sluiter et al. (2008)에 의하여 기재된 방법들에 따라 C5 함량이 분석되었다. 전술한 대로 생산되고 세척된 고체 부분의 자일란(xylan) 함량은 열수 자가가수분해에 의하여 전처리될 때 예컨대 EFB의 밀짚, 옥수수 대(stover)와 같은 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스들에 대한 엄격성 팩터에 선형적으로(linearly) 의존한다. 전술한 대로 제조되고 세척된 고체 부분의 자일란(xylan) 함량으로서 엄격성(severity)의 정의는 전처리 설정들 사이에서 이동가능하다(transferable). 자일란 수(Xylan number)는 가용성 물질들로부터의 일부 공헌(contribution)을 포함하는 세척된 고체 부분들의 측정된 자일란 함량이다. 전처리 엄격성(severity) 로그(Ro)에 대한 자일란 수의 의존은 밀짚 , 옥수수 대(stover), 사탕수수(sugarcane) 바가스(bagasse) 및 팜유 공정으로부터의 빈 과실 송이들에 대한 도 1에 나타나 있다.
나타난 바와 같이, 단일-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된 시험된 바이오매스 공급원료들 각각에 대한 자일란 수 및 전처리 엄격성 사이에는 명확한, 음성(negative) 선형(linear) 상관관계가 존재한다.
실험예 2. 전처리 엄격성의 함수로써 C5 회수.
바이오매스 공급원료들은 실험예 1에 기재된 바와 같이 전처리되었고 샘플ㄹ들은 특징되었다(characterized). 도 2는 밀짚이 자가가수분해에 의하여 전처리되는 경우 실험들로부터 자일란 수의 함수로써 C5의 회수들(자일로스 + 아라비노스)를 보여준다. C5 회수들은 물 불용성 고형물들(water insoluble solids) (WIS), 물 가용성 고형물(water soluble solids)(WSS) 및 총 회수(total recovery)로서 나타낸다. 나타난 바와 같이, 자일란 수가 증가하면서 물 불용성 및 물 가용성 고형물들 모두로서 C5 회수가 증가한다. 자일란 수가 10%가 넘게 증가하면서, 물 불용성 고형물들로서 C5 회수가 계속해서 증가하는 반면, 물 가용성 고형물로서 C5 회수는 줄어든다.
시험된 보통 종류의 밀짚은 전처리 전 건조물 기초로 약 27% 헤미셀룰로스를 포함하였다. 도 3은 자가가수분해에 의하여 전처리된 밀짚, 옥수수 대(stover), 사탕수수(sugarcane) 바가스 및 EFB에 대한 자일란 수의 함수로써 전처리 후 총 C5 회수를 보여준다. 시험된 보통 종류들의 옥수수 대, 단 사탕수수(sweet sugarcane) 바가스 및 EFB는 전처리 전 건조물 기초로 약 25%, 19% 및 23% 각각의 C5 함량을 포함하였다. 나타난 바와 같이, 모든 공급원료들에 대하여 전처리 후 총 C5 회수는 자일란 수에 의하여 정의한 대로 전처리 엄격성에 의존적이다. 나타난 바와 같이, 전처리 후 회수된 90%의 C5 함량이 완전히 C5 모노머로 가수분해될 수 있는 경우, 효소 가수분해 후 60% 최종 C5 모노머 수율은 전처리 엄격성이 10% 또는 그보다 더 높은 자일란 수를 생산함으로써 특징화되는 경우에 노출될 수 있다.
실험예 3. 전처리 엄격성의 함수로써 효소들 및 효모 성장을 억제하는 분해 산물들의 생산.
실험예 1에 기재된 바와 같이 바이오매스 공급원료들이 전처리되고 샘플들이 특징화되었다. 도 4는 밀짚이 단일-단계 자가가수분해에 의하여 전처리되는 경우 실험들에 대한 자일란 수의 함수로써 푸르푸랄 및 5-하이드록시-메틸-푸르푸랄(5-hydroxy-methyl-fufural)(5-HMF)의 생산 및 아세트산 방출의 의존성을 보여준다. 나타난 바와 같이, 발효성(fermentive) 효모를 억제하는 것으로 잘 알려지고, 어떤 경우들에는 셀룰ㄹ라제 효소들 또한 억제하는 분해 산물들의 생산은 10%보다 더 낮은 자일란 수들에서 지수적(exponential)증가를 보인다. 자일란 수 10% 및 그보다 더 높을 때, 푸르푸랄 및 아세트산의 레벨들은 해독(de-toxification) 단계들의 요구 없이 전처리된 바이오매스의 발효를 허용하는 범위들 내에 들어간다. 아세트산의 경우에, 보통 C5 및 C6 당들 모두를 소모하도록 변형된 효모에 의하여 잘 참아지는 레벨들로이긴 하지만, 레벨들은 자일란 수 10% 및 그보다 더 높게 전처리된 바이오매스의 효소 가수분해 동안 더 증가된다.
실험예 4. 고체 부분의 DM%의 함수(function)로서 고체 부분에 남아 있는 물질에 의한 셀룰라제 효소들의 억제.
실험들은 WO2006/056838에 기재되고 이용된 6-챔버 반응기로서 원칙적으로 작동하는 6-챔버 자유낙하(free fall) 반응기에서 수행되었다. 6-챔버 가수분해 반응기는 고형문 농도들 약 20 % DM에서 액화(liquefaction) 및 가수분해로 실험들이 수행되기 위하여 설계되었다. 상기 반응기는 각각 24 cm 폭(wide) 및 50 cm 높이인 6개의 분리된 챔버들로 나뉘는 수평으로 위치한 드럼으로 구성된다. 각각의 챔버에서 3개의 패들들(paddles)로 고정된(mount) 수평 회전축(rotating shaft)은 혼합/교반(agitation)에 사용된다. 1.1 kW 모터가 드라이브(drive)로서 사용되며, 회전 속도는 2.5 및 16.5 rpm의 범위 내로 조정가능하다. 회전(rotation) 방향은 시계방향 및 시계 방향 간을 매 초 분 이동하도록 프로그램된다. 바깥의 물-채워진 가열 자켓(jacket)은 온도의 통제를 80 ℃까지 가능하게 한다.
실험들은 단일-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된, 밀짚을 사용하였다. 바이오매스는 DM > 35%까지 젖었고, 자일란 수 10.5%까지 증기(steam)에 의하여pH > 4.0에서 전처리되었다. 전처리는 덴마크의 Sk∞b∞k의 Inbicon 시험(pilot) 공장에서 수행되었다. 바이오매스는 수문(sluice) 시스템을 이용하여 전처리 반응기 내로 로딩되었고, 수문(sluice) 시스템을 이용하여 반응기로부터 전처리된 바이오매스가 제거되었다. 일부 경우들에, 전처리된 바이오매스는 스크류 프레스를 이용하여 고체/액체 분리 되어 액체 부분 및 고체 부분을 생산하였다. 고체 부분은 약 30%의 DM 함량을 가졌으며, 초기 셀룰로스 및 리그닌 중 다수, 헤미셀룰로스 중 일부 및 용해된 고형물들의 총 약 25%를 포함하였다.
6 챔버 반응기의 챔버들은 모든 용해되고 용해되지 않은 고형물들을 포함하는 총 전처리된 바이오매스 또는 총 용해된 고형물들의 약 25%를 포함하는 프레스된 고체 부분으로 채워졌다. 건조물 함량은 19 % DM으로 조정되었다. 전처리된 바이오매스는 그 다음 Novozymes의 0.08 ml CTec2 ™/Dupont, Genencor 의 g glucan 또는 0.2-0.3 ml Accellerase TRIO ™ / g 글루칸(glucan)을 이용하여 50 ℃ 및 pH 5.0 내지 5.3에서 가수분해되었다. 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 이들 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들의 이들 용량 레벨들은 제대로 제조업자들에 의하여 제안된 범위 내였다. 효소 가수분해 실험들은 6 rpm의 혼합 속도에서 96 시간 동안 수행되었다.
도 5는 효소 가수분해 전 제거된 % 용해된 고형물들의 함수로서 이들 조건들 하 효소 가수분해 후 셀룰로스 전환을 보여준다. 나타난 바와 같이, 이들 효소 용량 레벨들에서 75% 용해된 고형물들의 제거는 절대적으로 말하자면(in absolute terms), 셀룰로스 전환이 10-20% 개선되었다. 이런 식으로, DM 함량 적어도 40%으로 고체 부분을 프레스하거나 또는 그렇지 않으면 효소 가수분해 전 적어도 50% 용해된 고형물 함량을 감소시키는 것이 유리한데, 이것이 개선된 효소 수행을 제공할 것이기 때문이다.
실험예 5. 자일란 수 > 10%로 전처리된 바이오매스로부터 액체 부분의 당 함량 및 가수분해
밀짚, 옥수수 대(stover), 및 사탕수수 바가스(bagasse)가 자일란 수 11.5% (WS), 12.3% (SCB) 및 15.5% (CS)로 전처리되었고, 실험예 5에 기재된 바와 같이 고체/액체 분리되어 액체 부분 및 고체 부분을 생산하였다. 액체 부분들은 Rezex Monosaccharide 칼럼을 갖춘 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템을 이용하여 (Sluiter, Hames et al. 2005)에 기재된 방법들에 따라 탄수화물들 및 분해 산물들을 분석하였다. 표 2는 올리고 및 모노머 글루코스/글루칸, 자일로스/자일란 및 아라비노스/아라비난(arabinan_의 카테고리들로 나누어진 DM 함량의 퍼센트로서 표시된 액체 부분들의 당 함량을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 몇몇 글루코스 함량이 모노머 및 올리고머 형태 모두로 존재하는 반면, 당 함량의 대부분은 올리고머 자일란이다. 자가가수분해를 이용하여 수득된 액체 부분의 자일란 올리고머들의 우세는 희석 전처리를 이용하여 수득된 액체 부분과 기록에 대조된다. 희산 열수 전처리에 의하여 전처리된 바이오매스에서, 액체 부분은 보통 산 촉매의 작용에 의하여 모노머 성분들로 가수분해된다.
표 2. 자일란 수 > 10%로 전처리된 바이오매스의 액체 부분들의 당 함량.
전처리된 밀짚의 액체 부분은 모듈식(modular) Dionex ICS-5000 chromatographic 시스템을 이용하여 Thermo Scientific Dionex CarboPacTM PA200 칼럼을 이용하여 HPLC 분석에 의하여 더 특징되었다. 분석물들(analytes)은 NaOH/NaOAc-구배(gradien) 조건들을 이용하여 분리되었고, 금 전극을 이용하여 통합되고 펄스된 전류측정 검출(integrated and pulsed amperometric detection)(IPAD)에 의하여 측정되었다. 도 6은 자일로비오스(xylobiose) (X2), 자일로트리오스(xylotriose) (X3), 자일로테트라오스(xylotetraose) (X4), 자일로펜타오스(xylopentaose) (X5), 및 자일로헥사오스(xylohexaose) (X6) 표준들(standards)의 용출 프로파일이 더 낮은 기록 (trace) 보다 더 높은 기록(trace)로서 겹쳐진(super-imposed) HPLC 크로마토그램을 보여준다. 나타난 바와 같이, 자가가수분해된 바이오매스의 액체 부분은 작은 양의 자일로스 모노머 및 비교적 더 큰 양의 자일로비오스(xylobiose) (X2), 자일로트리오스(xylotriose) (X3), 자일로테트라오스(xylotetraose) (X4), 자일로펜타오스(xylopentaose) (X5), 및 자일로헥사오스(xylohexaose) (X6)에 덧붙여 다른 물질들을 포함하는 혼합물을 포함한다.
실험예 6. 자일란 수 > 10%로 전처리되고 > 40% DM으로 프레스되고 뒤이어 후 가수분해된 바이오매스로부터 섬유 가수분해 후 액체 부분의 첨가 및 고체 부분의 효소 가수분해.
실험들은 실험예 4에 기재된 대로 6-챔버 자유 낙하(free fall) 반응기에서 수행되었다.
실험들은 11.5 내지 15.6%로부터의 범위인 자일란 수로의 단일-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된 밀짚, 옥수수 대(stover), 또는 사탕수수 바가스(bagasse)을 이용하였다. 바이오매스는 절단되고(cut) DM > 35% 으로 적셔지고(wetted) 그리고 12분 간 170-190 ℃에서 증기(steam)에 의하여 전처리되었다. 전처리는 덴마크의 Sk∞b∞k의 Inbicon의 실험 공정에서 수행되었다. 전처리된 바이오매스는 스크류 프레스를 이용하여 고체/액체 분리되어 > 40% DM을 갖는 고체 부분을 생산하였다.
6 챔버 반응기의 챔버들은 약 10 kg 프레스된 전처리된 바이오매스로 채워졌고, 19-22 % DM으로 물 첨가에 의하여 조정되었다. 전처리된 바이오매스는 GENENCOR-DuPONT의 ACCELLERASE TRIO™을 이용하여 50 ℃ 및 pH 5.0 내지 5.3 에서 가수분해되었다. 혼합 속도는 6 rpm이었다. 가수분해 실험들은 96 시간 동안 이루어졌으며, 그 후에 전처리 후 고체 부분으로부터 프레스된 액체 부분이 첨가되고 후가수분해가 50 ℃ 및 pH 5.0 내지 5.3에서 48 시간 동안 수행되었다.
HPLC 샘플들은 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 전환을 따르기 위하여 매일 취해졌으며, 외부 표준(external standard)의 이용을 통한 정량화(quantification)로 Rezex Monosaccharide 칼럼을 갖춘 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템을 이용하여 글루코스, 자일로스 및 아라비노스에 대하여 분석되었다.
도 7은 자일란 수 12.3%으로 전처리되고 g 글루칸 당 0.3 ml Accellerase Trio ™ (Genencor) 을 이용하여 가수분해된 사탕수수 바가스(bagasse)를 이용하여 고체 부분의 96 시간 가수분해 후 액체 부분의 첨가로 헤미셀룰로스의 전환을 위한 가수분해 데이터를 보여 준다. 나타난 것은 보통의 가수분해 프로파일이다. C5 모노머 회수는 가수분해 반응에 존재하는 물질로부터 이론적 수율의 퍼센트로서 나타난다. 고체 부분 내 헤미셀룰로스의 대부분은 고체 부분의 가수분해의 초기 24 시간 동안의 모노머 당들로 전환되었다. 96 시간 후 액체 부분의 첨가는 이론적 가능 수율(potential yield)을 증가시키는데, 이는 액체 부분이 첨가된 직후 관찰된 C5 전환에서의 하락(drop)을 설명한다. 처음 24 시간 내에, 액체 부분의 C5의 대부분은 모노머들로 전환된다. 가수분해의 종점과 액체 부분이 첨가되기 바로 직전의 C5 전환을 비교하면, 이들 조건들 하 사탕수수 바가스를 이용할 때, 90 % 로서 액체 부분 내 C5 전환을 계산하는 것이 가능하다.
표 3은 다른 환경들 하 전처리되고 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제, Accellerase Trio ™ (Genencor)의 다른 용량 레벨들을 이용하여 가수분해된 다른 바이오매스들의 가수분해 데이터를 보여준다. 사용된 모든 효소 용량 레벨들은 제조업자에 의하여 제안된 범위 내였다. 나타난 바와 같이, 단일-단계 자가가수분해 및 C5 바이패스와 효소 가수분해 및 후-가수분해를 이용하여, 60% 또는 그보다 더 큰 셀룰로스 전환을 여전히 달성하면서, 60% 또는 그보다 큰 C5 모노머 수율들이 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들의 제조업자들의 추천된 용량들을 이용하여 달성될 수 있다.
표 3. C5 바이패스로 매우 낮은 엄격성(severity) 단일-단계 자가가수분해 및 후-가수분해를 이용한 가수분해 수율들.
실험예 7. 변형된 효모에 의한 결합된 가수분해물 내 C5 및 C6 당들의 에탄올로의 함께-발효(Co-fermentation).
자일란 수 > 10%으로 단일-단계 자가가수분해 전처리에 의하여 제조된 (이 경우 밀짚) 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 생산된 가수분해물의 용도의 예로서, 도 8은 C5 및 C6 당들 모두를 전환시킬 수 있는 GMO 효모로 발효되기 전(TERRANOL ™으로부터 균주 V1), 해독 또는 임의의 다른 공정 단계들 없이 수행되는 발효에 대한 데이터를 나타낸다. 가수분해물은 발효 전 KOH 펠렛들로 pH 5.5로 조정되었고 3 g/L 유레아(urea)로 보충되었다. 발효는 뱃치 발효로서 수행되었다. 반응기 내 초기 세포 농도는 0.75 g dw/L였다. 발효는 10% NH3의 자동 첨가를 이용하여 pH 5.5에서 통제되었다. 온도는 30 ℃에서 유지되었고 젓는(stirring) 속도(rate)는 300 rpm이었다. 나타난 바와 같이, 전처리 엄격성의 더 높은 레벨들에서 보통 억제를 입증하는 아세트산, 푸르푸랄 및 다른 ㅅ성분들의 존재에도 불구하고, 글루코스 및 자일로스는 쉽게 소모되고, 에탄올은 쉽게 생산된다.
실험예 8. 상업적 셀룰라제 제제들 내 활성 레벨들의 실험적 결정.
GENENCOR™의 ACCELLERASE TRIO ™ 및 NOVOZYME ™의 CELLIC CTEC2 ™ 및 CELLIC CTEC3 ™의 상업적 제제들이 희석되어 단백질 농도들이 시험된 샘플 제제들과 상응하게 되었다. 희석된 효소 제제들과 상응하는 부피들이 첨가되었고 분석 결과들은 2회 또는 3회로 되었다.
CBHI (엑소셀룰라제(exocellulase)) 활성의 분석이 pH 5, 25 ℃에서 25 분 간 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 4-메틸움벨리페릴-β-셀로비오사이드(4-methylumbelliferyl-β-cellobioside)로부터 4-메틸움벨리페론(4-Methylumbelliferon) 방출(Abs: 347nm)의 뒤이은(following) 연속 속도로 3회 결정되었다. 활성 단위(Activity unit)는 1 umole MeUmb 등가/분(equivalent/minute)이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 0.16, 0.14, 0.17mg/ml이었다. 기질 농도는 0.5mg/ml이었다.
엔도-1,4-β-글루카나제 활성의 분석은 pH 5; 50 ℃에서 60 분 동안 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 Avicel PH-101로부터 말단의 감소(reducing ends) 발생과 관련된 하기 흡수력 변화에 의하여 3회 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 글루코스 등가/분이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 0.80, 0.67, 0.79 mg/ml이었다. 기질 농도는 80 mg/ml이었다.
β-글루코시다제 활성 분석은 pH 5; 50 ℃에서 20 분 동안 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 셀로비오스(cellobiose)로부터 글루코스의 방출과 관련된 하기 흡수력(absorbance) 변화에 의하여 3 회 결정되었다. 활성 단위는 2 μmole 글루코스/분이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 0.1, 0.12, 0.12 mg/ml이었다. 기질 농도는 1.7 mg/ml이었다.
엔도-1,4-β-자일라나제 활성의 분석든 pH 5; 50 ℃에서 60 분 간 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 물 추출가능한 아라비노자일란(arabinoxylan)으로부터 말단 감소 발생과 관련된 하기 흡수력 변화에 의하여 3회 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 글루코스 등가/분이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.
β-자일로시다제(xylosidase) 활성의 분석은 pH 5; 50 ℃에서 60 분 동안 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 물 추출가능한 아라비노자일란(arabionxylan)의 가수분해와 관련된 자일로스의 하기 방출에 의하여 2회 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 자일로스/분(min)이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.
β-L-아라비노퓨라노시다제(arabinofuranosidase) 활성 분석은 pH 5; 50 ℃에서 60 분간 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 물 추출가능한 아라비노자일란의 가수분해와 관련된 아라비노스(arabinoase)의 하기 방출에 의하여 3회 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 아라비노스/분(min)이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.
아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase) (AMG) 활성의 분석은 pH 5; 50 ℃에서, 80 분 동안 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 가용성 옥수수 전분으로부터 글루코스 방출과 관련된 하기 흡수력 변화에 의하여 3회 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 글루코스/분이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.
α-아밀라제(amylase) 활성의 분석은 pH 5; 50 ℃에서 60 분 동안 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 가용성 옥수수 전분으로부터 말단 감소 발생과 관련된 하기 흡수력 변화에 의하여 3회 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 글루코스 등가/분이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml이었다. 기질(substrate) 농도는 10 mg/ml이었다.
아세틸 자일란 에스테라제 활성의 분석은 pH 5; 25 ℃에서 25 분 동안 100 mM 숙시네이트(Succinate) 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 4 4-나이트로페닐(Nitrophenyl) 아세테이트(acetate)로부터 4-나이트로페닐(Nitrophenyl) 방출의 하기 연속 속도(rate)에 의하여 3회 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole pNP 등가/분이었다. 단백질 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 0.48, 0.42, 0.51mg/ml이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.
활성 결정들의 결과들은 표 1에 나타나 있다.
실시예들 및 실험예들은 기재하는 것 뿐이며 특허청구범위의 범위를 제한하려고 의도되는 것은 아니다. 여기에서 인용된 참고문헌들 각각은 그 전체가 참조로써 명확히 여기에 포함된다.
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Claims (22)
- 하기를 포함하는 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법:
- 연질 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료를 제공하는 단계,
- 공급원료를 단일-단계 가압된 열수 전처리로 3.5 내지 9.0 범위 내의 pH에서 매우 낮은 엄격성으로 전처리하여 전처리된 바이오매스가 10% 또는 그보다 더 높은 자일란 수를 갖는 것으로 특징되게 하는 단계,
- 전처리된 바이오매스를 고체 부분 및 액체 부분으로 분리하는 단계,
- 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, B-글루코시다제, 엔도자일라나제, 자일로시다제 및 아세틸 자일란 에스테라제 활성들을 포함하는 효소 혼합물에 의하여 촉매 작용된 효소 가수분해를 이용하여 보충적 물 함량를 첨가하여 또는 첨가하지 않고 고체 부분을 가수분해하는 단계, 및
- 그 다음에 분리된 액체 부분 및 가수분해된 고체 부분을 혼합하여, 이로써 액체 부분 내 자일로-올리고머들이 가수분해된 고체 부분 내 남아 있는 효소 활성들의 작용에 의하여 자일로스 모노머들로 분해되는 단계.
- 제 1항에 있어서,
상기 공급원료는 밀짚, 옥수수 대, 사탕수수(sugar cane) 바가스, 사탕수수(sweet sorghum) 바가스, 또는 빈 과실 송이들인 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 공급원료는 세척 되고/되거나 가압된 전처리 전 침출되는(leach) 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 공급원료는 가압된 전처리 전 전처리의 그 다음 단계로부터 액체를 포함하는 아세트산 내 담기는(soaked) 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 공급원료는 적어도 35%의 건조물 함량에서 가압된 전처리되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
가압된 전처리는 10 바(bar) 또는 그보다 낮은 압력에서 수행되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 공급원료는 하이드로사이클론 시스템을 이용하여 가압된 전처리 반응기로부터 제거되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 공급원료는 수문-타입 시스템을 이용하여 가압된 전처리 반응기로부터 제거되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 공급원료는 바이오매스가 12% 또는 그보다 더 높은 자일란 수를 갖는 것으로 특징되는 것과 같은 엄격성으로 전처리되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 고체 부분은 40% 또는 그보다 높은 건조물 함량을 갖는 방법.
- 제 1항에 있어서,
후-가수분해 후 상기 모노머 자일로스 수율은 이론적 최대 수율의 적어도 60%인 방법.
- 제 1항에 있어서,
가수분해 후 상기 모노머 글루코스 수율은 이론적 최대 수율의 적어도 60%인 방법.
- 제 1항에 있어서,
효소 가수분해는 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제를 이용하여 수행되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
효소 가수분해는 적어도 96 시간 동안 수행되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
효소 가수분해는 15 및 23% 건조물 함량 사이에서 수행되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
효소 가수분해는 20% 또는 이보다 더 높은 건조물 함량에서 수행되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
효소 가수분해가 하기를 포함하는 효소 혼합물을 이용하여 수행되고: 엑소셀룰라제(exocellulase) 활성들 (EC 3.2.1.91); 엔도셀룰라제(endocellulase) 활성들 (EC 3.2.1.4); B-글루코시다제(glucosidase) 활성 (EC 3.2.1.21); B-1,4 엔도자일라나제(endoxylanase) 활성 (EC 3.2.1.8); 및 아세틸 자일란 에스테라제(acetyl xylan esterase) 활성 (EC 3.1.1.72), 이때 효소 혼합물은 1 FPU 셀룰라제 활성이 적어도 30 CMC U 엔도글루카나제(endoglucanase) 활성 및 적어도 적어도 28 pNPG U 베타 글루코시다제(glucosidase) 및 적어도 50 ABX U 엔도자일라나제(endoxylanase) 활성과 같은 효소 활성들의 상대적인 비율들에 의하여 더 특징되는 방법.
- 제 17항에 있어서,
상기 효소 혼합물은 B-1,3 자일로시다제(xylosidase) 활성 (EC 3.2.1.72); B-1,4 자일로시다제(xylosidase) 활성 (EC 3.2.1.37); 및 알파 1,3 및/또는 알파 1, 5 아라비노퓨라노시다제(arabinofuranosidase) 활성 (EC 3.2.1.23)을 더 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
액체 부분의 후-가수분해 후 회수된 결합된 C5/C6 가수분해물이 하나 또는 그 이상의 변형된 효모 균주들을 이용하여 에탄올로 직접 발효되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 고체 부분은 제거된, 관련된 용해된 고형물들의 50%보다 큰 불용성 고형물들을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
액체 부분에 존재하는 n자일로-올리고머들의 적어도 85%는 후-가수분해 동안 자일로스 모노머들로 가수분해되는 방법.
- 제 1항에 있어서,
글루코스로의 적어도 50% 셀룰로스 전환이 얻어진 후 액체 부분이 가수분해된 고체 부분에 첨가되는 방법.
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