KR20160041953A - 일―단계 자가가수분해 전처리 및 효소 가수분해를 이용한 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법들 - Google Patents

Abstract

열수(hydrothermal) 전처리에 의존하는, 리그노셀룰로스 바이오매스를 발효성 당들로 가공하는 방법들이 제공된다. 연질 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료는 매우 낮은 엄격도로 일(single)-단계 가압된 열수(hydrothermal) 전처리에서 전처리된다. 전처리된 바이오매스는, 보통 C5 모노머들의 수율이 전처리 전 공급원료의 원래 자일로스 및 아라비노스 함량의 적어도 55%인 가수분해물을 생산하기 위하여, 적어도 1100의 엔도글루카나제의 nkat/g 글루칸의, 적어도 280의 엑소글루카나제, 적어도 3000의 β-글루코시다제, 적어도 1400의 엔도자일라나제 및 적어도 75의 β-자일로시다제의 활성 레벨들에서, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, β-글루코시다제, 엔도자일라나제, 및 β-자일로시다제 활성들를 포함하는 효소 혼합물에 의하여 촉매화된 효소 가수분해를 이용하여 전체 슬러리로서 가수분해된다.

Description

일―단계 자가가수분해 전처리 및 효소 가수분해를 이용한 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법들{METHODS OF PROCESSING LIGNOCELLULOSIC BIOMASS USING SINGLE-STAGE AUTOHYDROLYSIS PRETREATMENT AND ENZYMATIC HYDROLYSIS}

본 발명은 일반적으로 리그노셀룰로스 바이오매스를 발효가능한 당들로 가공하는 방법들, 및 특히, 열수(hydrothermal) 전처리에 의존적인 방법들에 대한 것이다.

석유 및 다른 화석연료들에 대한 역사적 의존은 온실가스들의 대기 레벨들의 극적이고 걱정스러운 증가와 관련되어 왔다. 많은 국가들에서 공식적인 정책 지시들에 의하여 지지되어, 온실 가스 축적을 경감시키기 위한 국제적 노력들이 진행 중이다. 이러한 경감 노력들 중 중요한 초점 하나는 연료들 및 다른 화학적 산물들의 전구체들의 소스로서 석유를 대체하기 위한 재생가능한 식물 바이오매스의 이용을 위한 가공들 및 기술들의 발달이었다. 지구상 식물-유래 바이오매스의 연간 성장은 거의 연간 1 x 10^11 미터(metric) 톤(tons) 건조중량으로 추정된다. Lieth and Whittaker (1975) 참조. 그러므로 바이오매스 이용은 지속가능한 경제 발전의 궁극적인 목표이다.

현재 연간 730억 리터들을 능가하는 세계적 생산으로, 사탕수수, 뿌리 및 곡물들과 같은, 당 및 전분 베이스의 식물 물질들로부터 생산되는 연료 에탄올은 이미 널리 사용된다. 에탄올은 연료 블렌드(blends)들에서 첨가제로서, 또는 더 직접적으로 개인의 자동차들을 위한 연료로서, 손쉽게 이용가능한, 화석 연료들의 허용가능한 대체제로 항상 생각되어 왔다. 그러나 사실 이들 "일 세대"바이오에탄올 기술들에 의하여 생산된 에탄올의 이용은 온실 가스 배출의 극적인 감소를 달성하지 않는다. 최종 에탄올 아웃풋(outputs)들에 대한 전체 화석 연료 인풋(inputs)이 모두 고려될 때, 순(net) 절약(saving)은 석유에 비하여 약 13 %뿐이다. Farrell et al. (2006) 참조. 게다가, 경제적 및 도덕적 반대 모두가 "일 세대" 바이오에탄올 시장에 제기되었다. 이것은 인간의 식품으로서의 작물에 대한 수요를 개인 자동차들에 대한 수요와 직접적인 경쟁으로 놓는다. 그리고 정말로, 연료 에탄올 수요는 가난하고, 곡물을 수입하는 국가들에서 고질적으로 드러난 증가된 곡물 가격들과 연관되어 왔다.

식품 작물들을 소비하지 않는 바이오매스 전환 시스템들 - 소위 "이(second) 세대" 바이오정제(biorefining)로, 이로써 바이오에탄올 및 다른 산물들이 작물 폐기물(대들(stalks), 옥수수속(cobs)들, 씨들(pits), 줄기들(stems), 껍질들(shells), 겉껍질들(husks) 등), 풀들, 짚들(straws), 우드칩들(wood chips), 폐지(waste paper) 등과 같은 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 생산될 수 있는 것에 대하여 큰 관심이 생겼다. "이(second) 세대" 기술에서, 셀룰로스로부터 주로 유래된 발효가능한 6탄당들(C6) 및 헤미셀룰로스로부터 유래된 발효가능한 5탄당(C5)이 효소 가수분해에 의하여, 또는, 몇몇 경우, 순수한 화학적 가수분해에 의하여, 바이오매스 다당류 폴리머로부터 유리된다. "이 세대" 바이오정제에서 바이오매스 전환으로부터 수득된 발효가능한 당들은 연료 에탄올 또는, 대체하여, 부탄올과 같은 다른 연료들, 또는 바이오플라스틱들 또는 많은 다른 산물들의 합성에 사용되기 위한 젖산 모노머들을 생산하는데 사용될 수 있다.

C5 및 C6 당들 모두의 총 수율(yield)은 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 바이오매스(biomass) 가공의 상업화의 중점적인 고려사항이다. 에탄올 생산, 및 또한 락테이트 또는 다른 화학물질들(chemicals)의 생산의 경우, C5 및 C6 당 가공 스트림(streams)들 둘 다를 하나의 당(sugar) 용액으로 결합시키는 것이 유리할 수 있다. 에탄올 생산에서 C5 및 C6 당들 둘다를 효율적으로 소모할 수 있는 변형된 발효(fermentive) 생물체들(organisms)이 현재 이용가능하다. 예컨대 Madhavan et al. (2012); Dumon et al. (2012); Hu et al. (2011); Kuhad et al. (2011); Ghosh et al. (2011); Kurian et al. (2010); Jojima et al. (2010); Sanchez et al. (2010); Bettiga et al. (2009); Matsushika et al. (2009) 참조.

그것의 물리적 구조의 한계들 때문에, 리그노셀룰로스 바이오매스는 몇몇 전처리 공정 없이 효소 가수분해에 의하여 발효성(fermentable) 당들로 효과적으로 전환될 수 없다. 매우 다양한 다른 전략들이 보고되었는데, 그 각각은 다른 장점들 및 단점들을 제시한다. 검토를 위하여 Agbor et al. (2011); Girio et al. (2010); Alvira et al. (2010); Taherzadeh and Karimi (2008) 참조. 환경적 및 "재생가능성(renewability)" 관점으로부터, 열수(hydrothermal) 전처리들이 특히 매력적이다. 이것들은 약 160 - 230 ℃의 온도에서 가압(pressurized) 증기(steam)/액체 열수를 이용하여, 셀룰로스 가닥(strand)들과 복잡하게 연결된 소수성 리그닌을 완만하게 녹이고, C5 당들이 풍부한, 헤미셀룰로스의 주요 성분을 가용화하고(solubilize), 그리고 생산적인 효소 결합에의 접근가능성을 개선하기 위하여 셀룰로스 가닥들을 방해한다(disrupt). 열수 전처리들은 "과도한" 전기(power) 생산 능력 및 터빈 증기를 효율적으로 이용하기 위하여, 존재하는 석탄- 및 바이오매스-를 때는 전기 발전소들에 편리하게 통합될 수 있다.

열수 공정의 경우, 전처리가 상충되는 목적들 사이에서 최적화되어야 한다는 것을 당업자가 잘 알고 있고, 또한 널리 토론되어 왔다. 반면, 전처리는 모노머 헤미셀룰로스-유래 당들의 궁극적인 수율을 최대화하기 위하여, 헤미셀룰로스 당 함량을 이상적으로 보존하여야 한다. 그러나 동시에, 전처리는 효소 가수분해의 민감성에 셀룰로스 체인(chains)들을 전처리하고 충분히 노출시켜, 모노머 셀룰로스-유래 당들의 합리적인 수율들이 최소의 효소 소모로 얻어질 수 있어야 한다. 효소 소모는 또한 그것들이 현재 정의되는대로, "세계 시장 경제"의 맥락에서 "경제적 유용성" 직전에 선, 바이오매스 공정의 상업화의 주요 고려사항이다. 최근 몇년 간의 극적인 개선들에도 불구하고, 상업적으로 이용가능한 효소 제조들의 고비용은 바이오매스 전환의 가장 높은 운영 비용들 중 하나로 남아 있다.

열수(hydrothermal) 전처리 온도들 및 반응기 체류 시간들(residence times)이 증가하면서, 축합 반응들의 산물들 및 푸르푸랄(furfural)을 포함하는, 다른 성분들로의 화학적 변화(transformation) 때문에, 헤미셀룰로스(hemicellulose)로부터 유래된 C5 당들의 더 많은 비율들이 회복할 수 없을 정도로 손실된다. 그러나 모노머 6-탄소 글루코스(glucose)로 효과적인 효소 가수분해를 위하여 셀룰로스(cellulose) 섬유들(fibers)을 적절히 컨디셔닝(condition)하기 위하여 더 높은 온도들 및 체류 시간들이 요구된다.

선행기술에서, 열수(hydrothermal) 전처리 "엄격도(severity)"의 자주 사용된 파라미터는 "Ro,"으로, 이는 보통 낮은 값을 나타낸다. 방정식에 따른 전처리 온도 및 반응기 체류 시간의 합성(composite) 척도(measure)를 반영한다: Ro= tEXP[T-100/14.75] 이 때 t는 분(minutes)인 체류 시간이고, T 는 섭씨 온도인 반응 온도이다.

정해진 바이오매스 공급원료(feedstock)를 위한 전처리 조건들의 최적화는 본질적으로 헤미셀룰로스로부터 더 높은 모노머 C5 당 수율들을 위한 수요들 (낮은 엄격도) 및 셀룰로스로부터 높은 모노머 C6 당 수율들을 위한 수요들 (높은 엄격도) 사이에 포함되는 일부를 요구한다.

헤미셀룰로스 및 셀룰로스 둘다로부터 당 수율들을 최대화하기 위하여,그리고 셀룰라제(cellulase) 촉매작용의 자일로(xylo)-올리고머를 최소화하기 위하여 여러가지 많은 전처리 전략들이 보고되어 왔다. 몇몇 경우들에서, 외인성 산들 또는 염기들이 헤미셀룰로스 분해 (산; pH < 3.5) 또는 리그닌(lignin) 가용화(solubilisation) (염기; pH > 9.0)을 촉매화하기 위하여 첨가된다. 다른 경우들에서, 열수 전처리는 리그노셀룰로스 자체로부터 유래되는 매우 온화한 아세트산만을 이용하여 수행된다(pH 3.5-9.0). 이들 온화한 pH 조건들 하 열수 전처리들은 "자가가수분해(autohydrolysis)"로 명명되어 왔는데, 이는 헤미셀룰로스 에스터들(esters)로부터 유리된 아세트산이 헤미셀룰로스 가수분해를 더 촉매화하기 때문이다.

"희산" 또는 "산 함침(impregnation)" 처리들로 알려진, 산 촉매된 열수(hydrothermal) 전처리들은 보통, 비슷한 헤미셀룰로스 가용화(solubilisation)가 산 촉매의 존재 하 더 낮은 온도에서 발생할 수 있기 때문에, C5 당들의 높은 수율을 제공한다. 희산(dilute acid) 전처리에 이은 효소 가수분해 후 총 C5 당 수율들은 보통 약 75% 또는 임의의 정해진 바이오매스 공급원료로부터 이론적으로 유리될 수 있는 그 이상이다. 예컨대 Baboukaniu et al. (2012); Won et al. (2012); Lu et al. (2009); Jeong et al. (2010); Lee et al. (2008); Sassner et al. (2008); Thomsen et al. (2006); Chung et al. (2005) 참조.

자가가수분해 열수(hydrothermal) 전처리들은, 반면, 보통 훨씬 낮은 수율의 C5 당들을 제공하는데, 산 촉매 부재 하 더 높은 온도 전처리가 요구되기 때문이다. 상업적으로 비현실적으로 낮은 건조물 함량에서 수행되는 자가가수분해(autohydrolysis)는 제외하고, 자가가수분해 처리들은 보통 C5 당 수율들 <40% 이론상 회수를 제공한다. 예컨대 Diaz et al. (2010); Dogaris et al. (2009) 참조. 53% 만큼 높은 자가가수분해로부터의 C5 수율은 상업적으로 비현실적인 반응들 시간들 및 극단적으로 높은 효소 용량들이 사용되었을 경우에 보고되어 왔다. 그러나 이들 매우 높은 C5 수율들조차 희산 전처리를 이용하여 일상적으로 수득되는 레벨들보다 아주 밑에 남아 있다. 예컨대 Lee et al. (2009); Ohgren et al. (2007) 참조.

자가가수분해로 얻어지는 더 낮은 C5 수율들의 결과로서, 상업적인 바이오매스 전환 시스템들에 잇어 열수 전처리에 대한 대부분의 보고들은 희산 공정들에 포커스되어 왔다. 헤미셀룰로스-유래된 C5 당 수율들 약 85% 는 소위 "이(two)-단계(stage)" 희산 전처리들의 이용을 통하여 달성되어 왔다. 이-단계 전처리들에서, 더 낮은 초기 온도는 헤미셀룰로스를 가용화하는데 사용되고, 그 후 C5-풍부한 액체 분획(fraction)이 분리된다. 두 번째 단계에서, 더 높은 온도가 셀룰로스 체인들을 컨디셔닝하는데 사용된다. 예컨대 Mesa et al. (2011); Kim et al. (2011); Chen et al. (2010); Jin et al. (2010); Monavari et al. (2009); Soderstrom et al. (2005); Soderstrom et al. (2004); Soderstrom et al. (2003); Kim et al. (2001); Lee et al. (1997); Paptheofanous et al. (1995) 참조. US 국립(National) 신재생(Renewable) 에너지(Energy) 연구소(Laboratory) (NREL)에 의하여 보고된 하나의 정교한 "이-단계" 희산 전처리 시스템은 공급원료 옥수수 대(stober)를 이용하여 약 90% 의 C5 수율들을 달성해 온 것을 주장한다. Humbird et al. (2011) 참조.

그것이 제공하는 더 낮은 C5 수율들에도 불구하고, 자가가수분해는 상업적 스케일로 희산 전처리들에 경쟁력있는 이점들을 계속해서 제공한다.

자가가수분해의 장점들 중 가장 주목할만한 것은 잔여, 가수분해되지 않은 리그닌이 희산 공정들로부터 회수된 리그닌과 비교할 때 매우 증강된 시장 가치를 갖는다는 것이다. 먼저, 희산 전처리에 보통 사용되는 황산은 잔여 황 함량을 준다. 이는 상업적 발전소에 매력적이지 않은 그 결과로 초래된 리그닌을 만드는데, 이는 그렇지 않으면 석탄에 대한 "친환경(green)" 대안으로서 자가가수분해로부터 수득되는 황-없는 리그닌 연료 펠렛들(pellets)을 소모하는 경향이 있을 것이다. 둘째, 황산-촉매화된 열수(hydrothermal) 전처리들 동안 발생하는 리그닌의 설폰화(sulfonation)는 그것을 비교적 친수성으로 만들고, 이로써 그것의 기계적 물 보유(holding) 능력(capacity)을 증가시킨다. 이 친수성은 수분을 흡수하기 위한 그것의 경향을 고려할 때, 상업적 이용을 위한 리그닌을 건조시키는 비용을 증가시키며 또한 그것을 외부 보관에 형편없이 어울리게 만든다. 희산 전처리로, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위한 NREL의 공정의 소위 "기술-경제적 모델들"은 - 오직 공정 증기(steam)를 위한 내부 소스(source)로써만이며, 시장성 있는 상품으로써 리그닌을 설명하지도 못한다. Humbird et al. (2011) 참조. 반면, 자가가수분해에 의존하는 공정 계획의 "경제적 수익성"은 깨끗한 건조 리그닌 펠렛들의 탄탄한 판매로부터의 중요한 기여를 포함한다. 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들이 건조물 함량의 10 및 40% 사이의, 리그닌의 큰 부분을 포함하는 점에서 이는 특히 중요하다. 이와 같이, 자가가수분해 시스템들로부터의 공정 당 수율들이 희산 시스템들에 비례하여 줄어들 수 있을 때에도, 전체 "수익성"은 동등하거나 또는 더 좋게 남을 수 있다.

자가가수분해 공정들은 또한 희산의 다른 잘 알려진 단점들을 회피한다. 황산의 필요는 "친환경" 공정들을 선호하는 철학적 방향을 벗어나며, 공정 인풋(input)으로서 산에 대한 상당한 작동 비용을 도입하고, 비싼 항-부식 장비 및 정교한 폐수 처리 시스템들의 필요를 만든다.

자가가수분해는 또한 보통의 공정 시나리오들에도 또한 안성맞춤으로 가능하다. NREL에 의하여 기재된 희산 공정은 복잡하고 정교하여, 그것은 현실적으로 말해서, 시간 당 약 100 톤의 바이오매스 공급원료의 대대적 규모로만이고 - 더 작은 규모로 설립될 수 없다. 이러한 규모는 지나치게-집중된(centralized) 바이오매스 가공 시나리오들에서 오직 적합하다. Humbird et al. (2011) 참조. 옥수수 대의 지나치게-집중된 바이오매스 가공은, 화학적으로-증강된 지나친-생산에서 자란 유전적으로-조작된 옥수수가 풍부한, USA에서 매우 적합할 수 있다. 그러나 이러한 시스템은 세계의 다른 곳에서는 덜 적절하다. 이러한 시스템은, 예를 들어, 유전적으로-조작되고 화학적으로 증강된 것이라도 보통 옥수수보다 헥타르 당 훨씬 적은 바이오매스를 생산하는, 밀짚(wheat straw)의 지역 가공, 또는 사탕수수 또는 팜(palm) oil 또는 수수(sorghum) 밭들에서의 현장 가공인, 보통의 바이오매스 가공 시나리오들에 부적합하다.

희산과 대조적으로 자가가수분해 시스템들은, 합법적으로 "친환경," 쉽게 확장가능하고(scalable), 그리고 정교한 폐수 처리 시스템들을 위한 요구에 의한 부채가 없다. 따라서 당 수율 단독 면에서 희산 시스템들보다 명백히 이점이 될 수 없을 때에도, 개선된 자가가수분해 시스템을 제공하는데 유리하다.

자가가수분해로 갖는 나쁜 C5 모노머 수율들의 문제는 일반적으로, 리그노셀룰로스 바이오매스 가공 기술의 상업적 제공자들을 다른 접근들을 추구하도록 몰아간다. 개선된 C5 수율들을 제공하기 위하여 설계된 몇몇 "이-단계" 전처리 시스템들은 자가가수분해 전처리들과 함께 보고되어 왔다. WO2010/113129; US2010/0279361; WO 2009/108773; US2009/0308383; US8,057,639; US20130029406 참조. 이들 "이 단계" 전처리 계획들에서, 몇몇 C5-풍부 액체 분획(fraction)은 더 낮은 온도 전처리 후 고체/액체 분리, 뒤이은 그 다음의 고체 분획의 더 높은 온도 전처리에 의하여 제거된다. 이들 공개된 특허 출원들의 대부분은 실제 실험 결과들을 보고하지 않았다. WO2010/113129의 이(two)-단계 자가가수분해 전처리의 기재에서, Chemtex Italia는 52%의 평균 C5 당 회수를 갖는 밀짚을 이용한 총 26 개 실험예들을 보고한다. 이들 C5 회수 값들은 C5 회수 자체 및 모노머 당(sugar) 수율들을 구별하지 않는데, 이는 에탄올 및 다른 유용한 산물들로 발효에서 실제로 소모되는 기질이다.

리그노셀룰로스 바이오매스를 가공하기 위한 계획으로 두 번째 전처리 단계의 도입은 추가의 복잡성들 및 비용들을 도입한다. 따라서 단일의 일(single)-단계 자가가수분해 시스템을 이용하여 이(two)-단계 전처리의 이점들을 주로 달성하는 것이 유리하다.

우리는 일(single)-단계 자가가수분해 전처리가 매우 낮은 엄격도로 수행되며, 여전히 합리적인 글루코스 수율을 달성하는 반면, 55% 이론적 수율 및 그보다 더 높은 예상 외로 높은 최종 C5 모노머 수율을 달성하는 것이 가능하다는 것을 발견했다. 바이오매스 공급원료들이 이렇게 낮은 엄격도로 전처리될 때, 전처리가 최소화되는 동안, 전처리된 물질의 용해되지 않은 고체 함량이 C5의 손실, 적어도 5.0 중량%의 잔여 자일란(xylan) 함량으로 남는다. 그렇지만, 효소 가수분해 동안 충분히 높은 자일라나제(xylanase) 및 자일로시다제(xylosidase) 활성들이 이용된다면, 매우 적은 퍼센트의 글루코스로의 셀룰로스 전환만이 희생되는 반면, 예상과 달리, 이 매우 높은 잔여 자일란 함량은, 높은 회수로, 모노머 자일로스(xylose)로 효소 가수분해될 수 있다.

이들 매우 낮은 엄격한 레벨들에서, 셀룰라제 활성 또는 발효성 유기체들(organisms)에 영향을 미치는 가용성 부산물들의 생산은 매우 낮게 유지되어, 전처리된 물질은 효소 가수분해 및 임의의 세척 또는 다른 해독(de-toxification) 단계를 위한 요구 없이 보통, 그 다음의 발효에 직접적으로 이용될 수 있다.

본 발명은 일반적으로 리그노셀룰로스 바이오매스를 발효가능한 당들로 가공하는 방법들, 및 특히, 열수(hydrothermal) 전처리에 의존적인 방법들에 대한 것이다.

열수(hydrothermal) 전처리에 의존하는, 리그노셀룰로스 바이오매스를 발효성 당들로 가공하는 방법들이 제공된다. 연질 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료는 매우 낮은 엄격도로 일(single)-단계 가압된 열수(hydrothermal) 전처리에서 전처리된다. 전처리된 바이오매스는, 보통 C5 모노머들의 수율이 전처리 전 공급원료의 원래 자일로스 및 아라비노스 함량의 적어도 55%인 가수분해물을 생산하기 위하여, 적어도 1100의 엔도글루카나제의 nkat/g 글루칸의, 적어도 280의 엑소글루카나제, 적어도 3000의 β-글루코시다제, 적어도 1400의 엔도자일라나제 및 적어도 75의 β-자일로시다제의 활성 레벨들에서, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, β-글루코시다제, 엔도자일라나제, 및 β-자일로시다제 활성들를 포함하는 효소 혼합물에 의하여 촉매화된 효소 가수분해를 이용하여 전체 슬러리로서 가수분해된다.

열수(hydrothermal) 전처리에 의존하는, 리그노셀룰로스 바이오매스를 발효성 당들로 가공하는 방법들이 제공된다.

도 1은 자가가수분해 전처리에 가해진 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대하여 전처리 엄격도 인자의 함수로서 자일란 수를 보여준다.
도 2는 전처리된 공급원료들에 대한 자일란 수의 함수로서 용해되지 않은 고체들의 자일란 중량 퍼센트(percentage by weight)를 보여준다.
도 3은 자가가수분해 전처리에 가해진 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대하여 자일란 수의 함수로서 가용성 및 불용성 형태인 C5 회수를 보여준다.
도 4는 자가가수분해 전처리에 가해지는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 자일란 수의 함수로서 총 C5 회수를 보여준다.
도 5는 자가가수분해 전처리에 가해지는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대한 자일란 수의 함수로서 아세트산, 푸르푸랄 및 5-HMF의 생산을 보여준다.
도 6은 매우 낮은 엄격도 자가가수분해 전처리에 가해지는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들에 대하여 셀룰로스 전환에 대한 용해된 고체들의 제거의 영향을 보여준다.
도 7은 매우 낮은 엄격도 자가가수분해 전처리에 가해지는 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들로부터 액체 분획의 HPLC 특성화(characterization)를 보여준다.
도 8은 고체 분획이 후(post)-가수분해에 대하여 효소 가수분해에 뒤이어 액체 분획의 도입에 가해질 때 시간의 함수로서 C5 당 회수를 보여준다.
도 9는 매우 낮은 엄격도 자가가수분해에 의하여 전처리되고, 효소적으로 가수분해되고, 그리고 발효 억제제들를 제거하기 위한 해독(de-toxification) 없이 결합된 액체 및 고체 분획으로서 사용되는 밀짚을 이용하여 변형된 효모 균주에 의한 에탄올 발효의 발효 프로파일을 보여준다.
도 10은 한 예를 위한 공정 계획을 보여준다.
도 11은 시간의 함수로서 셀룰로스 전환을 보여준다 - C5 바이패스.
도 12는 시간의 함수로서 자일란 전환을 보여준다 - C5 바이패스.
도 13은 시간의 함수로서 셀룰로스 전환을 보여준다 - 전체 슬러리.
도 14는 시간의 함수로서 자일란 전환을 보여준다 - 전체 슬러리.
도 15는 가수분해 시간의 함수로서 전처리 및 가수분해 후 총 C6 및 C5 회수를 보여준다 - 전체 슬러리.

몇몇 예들에서, 본 발명은 하기를 포함하는 리그노셀룰로스 바이오매스를 가공하는 방법들을 제공한다:

- 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료를 제공하는 단계,

- 용해되지 않는 고체들이 적어도 5.0 중량% 자일란을 포함하는 전처리된 바이오매스 슬러리를 생산하기 위하여 낮은(log) 엄격도(severity) Ro 3.75 또는 이보다 더 낮은 것으로 일(single)-단계 가압된 열수(hydrothermal) 전처리에서 3.5 내지 9.0의 범위 내에서 그 공급원료를 전처리하는 단계, 및

- C5 모노머들의 수율이 전처리 전 공급원료의 원래의 자일로스 및 아라비노즈(arabinose) 함량의 적어도 55%인, 가수분해물을 생산하기 위하여, 적어도 엔도글루카나제의 글루칸 1100, 적어도 엑소글루카나제의 적어도 280, β-글루코시다제의 적어도 3000, 엔도자일라나제의 적어도 1400, 및 β-자일로시다제의 적어도 75 의 nkat/g 에서의 활성 레벨들에서, 엔도글루카나제(endoglucanase), 엑소글루카나제(exoglucanase), β-글루코시다제(glucosidase), 엔도자일라나제(endoxylanase), 및 β-자일로시다제(xylosidase) 활성들을 포함하는 효소 혼합물에 의하여 촉매화되는, 적어도 24 시간 동안 효소 가수분해를 이용하여 추가(supplemental) 물 함량의 첨가와 또는 첨가 없이, 전처리된 바이오매스를 가수분해하는 단계.

몇몇 예들에서, 전처리된 바이오매스는 고체 및 액체 분획(fractions)들 둘다를 포함하는 전체 슬러리로서 가수분해된다.

여기에서 사용된 대로, 하기 용어들은 하기 의미들을 갖는다:

양적인 숫자 또는 범위를에 관하여 여기에서 사용된 대로 "약"은 나타내는 숫자 또는 범위의 상대적인 용어에서, +/- 10% 를 나타낸다.

"자가가수분해"는 헤미셀룰로스 가수분해에 의하여 유리된 아세트산이 전처리 동안 헤미셀룰로스 가수분해를 더 촉매화하고, 그리고 3.5 및 9.0 사이의 pH에서 수행되는 리그노셀룰로스 바이오매스의 임의의 열수(hydrothermal) 전처리에 적용되는 전처리 공정을 나타낸다.

"리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제(preparation)"는 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스의 효소 가수분해를 제공하기에 충분하고, 엔도셀룰라제(endocellulase) (엔도글루카나제), 엑소셀룰라제(exocellulase) (엑소글루카나제(exoglucanase)), 엔도자일라나제, 자일로시다제(xylosidase) 및 B-글루코시다제 활성들를 포함하는, 효소 활성들의 상업적으로 이용가능한 혼합물을 가리킨다. 용어 "리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위한 최적화"는 효소 혼합물들이 발효성 당들로 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스의 가수분해에서의 효소 소모를 감소시키고 그리고/또는 가수분해 수율을 개선시키는 특정 목적을 위하여 변형 및/또는 선택되어 온 산물 개발 공정을 가리킨다.

건조물 레벨"에서" 전처리를 수행하는 것은 가압된 열수(hydrothermal) 전처리의 시작에서 공급원료의 건조물 함량을 가리킨다. 전처리는 바이오매스의 수성 함량의 pH가 전처리는 가압된 열수(hydrothermal) 전처리의 시작에서의 pH인 pH"에서" 수행된다.

DM으로도 나타나는 "건조물(dry matter)"는 가용성 및 불용성 모두인 총 고체들을 가리키며, 실질적으로 "물이 아닌(non-water) 함량"을 의미한다. 건조물 함량은 항량이 달성될 때까지 105 ℃에서 건조시킴으로써 측정된다.

"섬유 구조"는 전처리 후 섬유 단편의 평균 크기가 > 750 um 인 정도까지 유지된다. 여기에서 사용된 대로 "글루칸"은 다른 글루코-올리고머들에 더해, 셀룰로스(cellulose)를 가리킨다.

"열수 전처리"는 산들 또는 다른 화학물질들의 첨가와 또는 첨가 없이 120 ℃ 또는 그보다 더 높은 온도들에서, 바이오매스를 "요리하기" 위하여, 높은 온도 액체 또는 증기 또는 둘다를 포함하는 뜨거운 액체, 증기(vapor) 증기(steam) 또는 가압 증기(steam)로서, 물의 사용을 가리킨다.

"일(single)-단계 가압된 열수(hydrothermal) 전처리"는, 바이오매스가 단일 패스(pass)에서 바이오매스를 가열하기 위하여 설정된 단일 반응기에서 가압된 열수(hydrothermal) 전처리로 당하는, 그리고 더 이상의 가압된 열수(hydrothermal) 전처리가 가압된 열수(hydrothermal) 전처리되게 된 공급원료로부터 액체 분획(fraction)을 제거하기 위한 고체/액체 분리 단계 후 적용되지 않는, 전처리를 가리킨다.

"고체/액체 분리"는 압착(pressing), 원심(centrifugal) 또는 다른 힘을 통한 힘의 적용에 의하여 고체로부터 액체가 분리되게 하는, 적극적인(active) 기계적 공정을 가리킨다.

"연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스"는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌을 포함하는, 목재가 아닌 식물 바이오매스를 가리킨다.

"고체 분획" 및 "액체 분획"은 고체/액체 분리에서 전처리된 바이오매스의 분류(fractionation)를 가리킨다. 분리된 액체는 "액체 분획(fraction)"으로 총괄하여 가리켜진다. 상당한 불용성 고체 함량을 포함하는 잔여 분획은 "고체 분획"으로 가리켜진다. "고체 분획"은 건조물 함량을 가질 것이며, 그리고 보통 "액체 분획"의 상당한 잔여물을 또한 포함할 것이다.

"이론상 수율"은 구성 모노머 당들이 또한 에스테르화되거나(esterified) 또는 그렇지 않으면 치환될(substituted) 수 있는, 폴리머 셀룰로스로부터, 또는 폴리머 헤미셀룰로스 구조들로부터 수득되는 순수한 모노머 당들의 몰(molar) 등가(equivalent) 질량(mass)을 가리킨다. 이론상 수율의 퍼센트로서 "C5 모노머 수율들"은 하기와 같이 결정된다: 전처리 전, 자일로스와 함께 갈락토스(galactose) 및 만노스(mannose)가 같이-용리되는 용리(elution) 시스템 및 HPLC 칼럼를 이용하여 Sluiter et al. (2008)의 강산 가수분해 방법을 이용하여 바이오매스 공급원료는 탄수화물들이 분석된다. 이러한 시스템들의 예들은 Phenomenex의 REZEX ™ Monossacharide H+ 칼럼 및 Biorad의 AMINEX HPX 87C ™ 칼럼을 포함한다. 강산 가수분해 동안, 에스터들 및 산-불안정한(labile) 치환들이 제거된다. 따로 명시되지 않으면, 비-전처리된 바이오매스에서 결정되는 "자일로스" + 아라미노스의 총량은 100% 이론상 C5 모노머 회수로 되는데, 이는 총괄하여 "C5 모노머 회수"로 명명될 수 있다. 모노머 당 결정은 정제된 바깥 표준들로 표준 곡선에 기초하여 HPLC 특성화(characterization)를 이용하여 된다. 실제 C5 모노머 회수는 C5 모노머들의 직접적 측정을 위한 샘플들의 HPLC 특성화(characterization)에 의하여 결정되는데, 이는 그 다음에 이론상 수율의 퍼센트로서 표현된다.

"자일란 수"는 하기와 같이 결정된 전처리된 바이오매스의 특성화(characterization)를 가리킨다:

전처리된 바이오매스는 보통, 고체 분획 및 액체 분획(fraction)을 제공하기 위한 고체/액체 분리 후, 약 30% 총 고체들에서 수득된다. 약 30% 총 고체들을 갖는 전처리된 바이오매스는 그 다음 1:3 wt:wt의 총 고체들(DM)의 물에 대한 비율로, 70 ℃ 물에서 혼합에 의하여 부분적으로 세척된다. 이 방식으로 세척된 전처리된 바이오매스는 그 다음 약 30% 총 고체들까지 압착(press)된다. 이 방식으로 세척되고 약 30% 총 고체들까지 압착(press)된 전처리된 바이오매스의 자일란 함량은, 그 전체가 여기에 참조로서 분명히 포함되는, 2008년 4월 수정된, Technical Report NREL/TP-510-42618에 기재된 대로, 2008년 4월 25일 발행일인, US National Renewable Energy Laboratory (NREL) Laboratory Analytical Procedure (LAP), A. Sluiter, et al., "Determination of structural carbohydrates and lignin in 바이오매스,"의 방법을 이용하여 결정된다. 자일로스와 함께 갈락토스 및 만노스가 함께-용리되는, 용리 시스템 및 HPLC 칼럼이 이용된다. 이러한 시스템들의 예들은 Phenomenex로부터 REZEX ™ Monossacharide H+ 칼럼 및 Biorad로부터 AMINEX HPX 87C ™ 칼럼을 포함한다. 기재된 대로 자일란 함량의 이 측정은, 이들 조건들 하 고체 분획의 씻어 내어지지 않은 잔여 액체 분획(fraction)으로부터 가용성(soluble) 물질의 일부 기여(contribution)를 포함할 것이다. 따라서, "자일란 수"는 "액체 분획" 내 가용성 자일로스 및 자일로-올리고머 함량의, 그리고 불용성 고체들 내 잔여 자일란 함량의 "가중치(weighted) 결합(combination)"을 제공한다.

용해되지 않은 고체들 내 자일란 함량은, 적어도 30% 총 고체들을 갖는 고체 분획을 제공하기 위하여, 그것을 고체/액체 분리에 가하는, 전처리된 바이오매스의 대표적 샘플을 취함으로써 결정된다. 적어도 30% 총 고체들을 갖는 이 전처리된 바이오매스는 그 다음에 1:3 wt:wt의 총 고체들 (DM)의 물에 대한 비율로, 70 ℃에서 혼합함으로써 부분적으로 세척된다. 이 방식으로 세척된 전처리된 바이오매스는 그 다음에 적어도 30% 총 고체들까지 압착되고, 그리고 1:3 wt:wt의 총 고체들 (DM)의 물에 대한 비유로 70 ℃에서 혼합함으로써 다시 세척된다. 이 세척된 물질은 그 다음에 다시 적어도 30% 총 고체들까지 압착되고 그리고 1:3 wt:wt의 총 고체들 (DM)의 물에 대한 비율로 70 ℃에서 혼합함으로써 다시 세척된다. 이 세척된 물질은 그 다음에 적어도 30% 총 고체들로 다시 압착되고 그리고 분석될 용해되지 않은 고체들의 샘플로서 이용된다. 용해되지 않은 고체들 샘플의 자일란 함량은 그 다음에 자일란 수의 상기 결정에 관한 설명에 기재된 대로 결정되고, 샘플의 총 고체들 함량의 중량에 의한 퍼센트로서 표현된다.

임의의 적절한 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스가 사용될 수 있는데, 적어도 밀짚, 옥수수 대(stover), 옥수수 속대(cobs), 빈(empty) 과실(fruit) 송이들(bunches), 볏짚, 귀리짚, 보릿짚, 카놀라(canola) 짚(straw), 호밀(rye) 짚, 수수(sorghum), 단수수(sweet sorghum), 대두(soybean) 스토버(stover), 스위치그래스(switch grass), 버뮤다그래스(Bermuda grass) 및 다른 풀들(grasses), 바가스(bagasse), 사탕무박(beet pulp), 옥수수 섬유(fiber), 또는 이것들의 임의의 조합들과 같은 바이오매스들을 포함한다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 종이, 신문인쇄용지, 판지 또는 다른 도시(municipal) 또는 사무실 폐기물들과 같은 다른 리그노셀룰로스 물질들을 포함할 수 있다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 다른 공급원료들로부터 비롯되는 물질들의 혼합물로서 사용될 수 있고, 신선하거나, 부분적으로 건조되거나, 완전히 건조되거나 또는 이들의 조합일 수 있다. 몇몇 예들에서, 본 발명의 방법들은 적어도 약 10 kg 바이오매스 공급원료, 또는 적어도 100 kg, 또는 적어도 500 kg을 이용하여 수행된다.

리그노셀룰로스 바이오매스는 헤미셀룰로스의 느슨하게 조직된 매트릭스 내에서 끼워넣어지고 소수성 리그닌이 풍부한 환경에서 밀봉된(sealed) 결정질 셀룰로스 원섬유(fibrils)를 포함한다. 셀룰로스 자체가 D-글루코스의 길고 똑바른 체인 폴리머들을 포함하는 반면, 헤미셀룰로스는 글루코스 및 만노스를 포함하는 몇몇 6-탄소 (C6) 당들을 비롯해 모든 5-탄소 알도펜토스들(aldopentoses) (C5 당들)의 모노머들을 포함하는 짧고, 가지달린-체인 탄수화물들의 불균일한 혼합물이다. 리그닌은 임의의 특정 1차(primary) 구조가 부족하고, 그리고 소수성 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 모노머들을 포함하는, 매우 불균일한 폴리머이다.

적절한 리그노셀룰로스 바이오매스는 보통 전처리 전 건조 질량(dry mass) 20 및 50 % 사이의 양의 셀룰로스, 전처리 전 건조 질량(dry mass) 10 및 40 %의 리그닌, 및 15 및 40% 사이의 양의 헤미셀룰로스를 포함한다.

몇몇 예들에서, 바이오매스 공급원료들은 열수(hydrothermal) 전처리 전 분쇄(grinding), 제분(milling), 찢음(shredding), 절단(cutting) 또는 다른 공정들과 같은 입자 크기 감소 및/또는 다른 기계적 공정에 가해질 수 있다. 몇몇 예들에서, 바이오매스 공급원료들은 Knudsen et al. (1998)에서 기재된 바와 같이, 가압된 전처리 전 가치있는 염들이 침출되고 그리고/또는 세척될 수 있다. 몇몇 예들에서, 공급원료들은 99 ℃ 까지의 온도들에서 가압된 전처리 전에 푹 담가질 수 있다.

몇몇 예들에서, 공급원료는 열수(hydrothermal) 전처리 전 수성 용액에 먼저 담가진다. 몇몇 예들에서, 여기에 그 전체가 참조로서 포함되는 US 8,123,864에 기재된 바와 같이, 전처리들의 그 다음 단계에서 수득되는 액체를 포함하는 아세트산에 공급원료를 담그는 것이 이로울 수 있다. 여기에 그 전체가 참조로서 포함되는 US 12/935,587에 기재된 대로, 가능한 최고의 건조물 함량에서 처리를 수행하는 것이 이롭다. 높은 건조물에서 전처리를 수행하는 것은 불필요한 물을 가열하는 공정 에너지의 비용을 피한다. 그러나 몇몇 물 함량이 효소 가수분해로부터 최적의 최종적인 당 수율들을 달성하는데 요구된다. 보통 그것들의 내재된 물 보유 능력에서 또는 이에 인접하여 바이오매스 공급원료들을 전처리하는 것이 유리하다. 이는 정해진 공급원료가 과도한 물에 담그고 뒤이어 보통 30 및 45% DM 사이로-보통의 상업적 스크류(screw) 프레스(press)의 기계적 한계까지 압착하여 얻을 물 함량의 레벨이다. 몇몇 예들에서, 열수(hydrothermal) 전처리는 DM 함량 적어도 35%에서 수행된다. 당업자는 가열 동안 일부 물 함량이 첨가되기 때문에 열수(hydrothermal) 전처리 동안 DM 함량이 감소될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 몇몇 예들에서, 공급원료들은 적어도 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 40% 또는 미만(less), 또는 35% 또는 미만(less), 또는 30% 또는 미만(less)의 DM 함량에서 전처리된다.

몇몇 예들에서, 수성 용액에 담그는 것/적시는 것은 전처리 전 pH를 자가가수분해에 보통 유리한, 3.5 및 9.0 사이의 범위로 조정하도록 도울 수 있다. pH가 전처리 동안 아세트산이 가용화된 헤미셀룰로스로부터 유리되기 때문에 더 많은 산성 레벨들로 변화할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.

몇몇 예들에서, 열수(hydrothermal) 전처리는 습식(wet) 산화(oxidation) 전처리들에 요구되는 대로 추가의 산소 없이, 또는 오가노솔브(organosolv) 전처리에 요구되는대로 유기 용제(solvent)의 첨가 없이, 또는 마이크로파(microwave) 전처리들에 요구되는대로 마이크로파 가열의 사용 없이 수행된다. 몇몇 예들에서, 열수(hydrothermal) 전처리는 140 ℃ 또는 더 높은, 또는 150 ℃에서 또는 더 높은, 또는 160 ℃에서 또는 더 높은, 또는 160 및 200 ℃ 사이, 또는 170 및 190 ℃ 사이, 또는 180 ℃ 또는 더 낮은, 또는 170 ℃ 또는 더 낮은 온도들에서 수행된다.

몇몇 예들에서, 일부 C5 함량은 가압된 전처리 전 담그는 단계에 의하여 제거될 수 있다. 몇몇 예들에서, 단일 반응기는 단일 타겟(target) 온도로 바이오매스를 가열하기 위하여 설정될 수 있다. 대체하여 단일 반응기는 반응기 내에서 온도 구배(gradient)에 영향을 미쳐 단일 흐름(passage) 동안, 하나 이상의 온도 영역에 바이오매스가 노출되도록 하기 위하여 설정될 수 있다. 몇몇 예들에서, 그것은 전처리의 코스 동안 가압된 반응기 내로부터 일부 가용화된 바이오매스 성분들(components)을 부분적으로 제거하는데 유리할 수 있다.

적절한 열수(hydrothermal) 전처리 반응기들은 보통 펄프(pulp) 및 종이 산업으로부터 알려져 있는 대부분의 펄핑(pulping) 반응기들을 포함한다. 몇몇 예들에서, 열수(hydrothermal) 전처리는 10 bar 또는 더 낮게, 또는 12 bar 또는 더 낮게, 또는 4 bar 또는 더 높게, 또는 8 bar 또는 더 높게, 또는 8 및 18 bar 사이로, 또는 18 및 20 bar 사이로 가압된 반응기 내에서 스팀(steam)에 의하여 실행된다(administer). 몇몇 예들에서, 전처리 반응기는 공급원료의 연속적 유입(inflow)를 위하여 설정된다.

몇몇 예들에서, 젖은 바이오매스는 특정 기간(duration) 또는 "체류(residence) 시간" 동안 압력 하, 반응기를 통하여 수송된다. 체류 시간은 더 높은 바이오매스 처리량을 가능하게 하기 위하여 유리하게 짧게 유지된다. 그러나 얻어지는 전처리 엄격도는 온도 및 체류 시간 둘 다에 의하여 결정된다. 열수(hydrothermal) 전처리 동안 온도는 본 발명의 방법들이 매우 낮은 전처리 엄격도를 얻는 것을 추구하기 때문만이 아니라, 더 낮은 온도들이 더 낮은 스팀(steam) 압력들을 이용하여 성취될 수 있기 때문에, 유리하게 낮게 유지된다. 전처리 온도가 180 ℃ 또는 더 낮은 레벨들에서 될 수 있고, 그리고 따라서 포화된 스팀(steam) 압력들이 10 bar 또는 더 낮게 유지될 정도까지, 더 낮은 부식 경향이 경험되고, 그리고 훨씬 더 낮은 등급(grade) 압력 기구들(fittings) 및 철(steeml) 조성물들이 사용될 수 있는데, 이는 시설(plant) 자본비를 감소시킨다. 몇몇 예들에서, 반응기가 160 및 200 ℃, 또는 170 및 190 ℃ 사이의 단일 타겟 온도까지 바이오매스를 가열시키기 위하여 설정된다. 몇몇 예들에서, 체류 시간들은 60 분 미만(less), 또는 30 분 미만(less), 또는 20 분 미만(less), 또는 15 분 미만(less), 또는 14 분 미만(less), 또는 13 분 미만(less), 또는 12 분 미만(less), 또는 10 분 미만(less), 또는 8 분 미만(less), 또는 5 분 미만(less)이다.

바이오매스 공급원료들은 여러가지 수단에 의하여 가압된 반응기 내로 대기압부터 로딩(load)될 수 있다. 몇몇 예들에서, 수문(sluice)-타입 "입자 펌프" 시스템은, 그 전체가 참조로서 여기에 포함되는 US 13/062,522에 기재된 시스템과 같은, 바이오매스 공급원료들을 로딩하는데 사용될 수 있다. 몇몇 예들에서, 소위 "스크류(screw) 플러그(plug)" 공급장치(feeder)를 이용하여 전처리 반응기를 로딩하는 것이 유리할 수 있다.

전처리된 바이오매스는 여러가지 수단들에 의하여 가압된 반응기로부터 내려질(unload) 수 있다. 몇몇 예들에서, 전처리된 바이오매스는 물질의 섬유 구조를 보존하기 위하여 이러한 방식으로 내려진(unload)다. 전처리된 바이오매스의 섬유 구조를 보존하는 것은 유리한데, 이는 이것이 통상의 스크류 프레스(press) 장비를 이용하여 전처리된 물질의 고체 분획이 고체/액체 분리 동안 비교적 높은 건조물 레벨들로 압착되어, 이로써 멤브레인 필터 프레스 시스템들의 복잡성 및 추가되는 비용을 피하는 것을 허용하기 때문이다.

섬유 구조는 비(non)-폭발성(explosive)인 방식으로 가압된 반응기로부터 공급원료를 제거함으로써 유지될 수 있다. 몇몇 예들에서, 비-폭발성 제거가 달성되고 그리고 이에 의한 섬유 구조가 전체가 여기에 참조로서 포함되는 US 13/043,486에 기재된 바와 같은, 수문-타입 시스템을 이용하여 유지될 수 있다. 몇몇 예들에서, 비-폭발성 제거는 달성되고 그리고 이에 의한 섬유 구조는 전체가 여기에 참조로서 포함되는 US 12/996,392에 기재된 것들과 같은, 하이드로사이클론(hydrocyclone) 제거 시스템을 이용하여 유지될 수 있다.

몇몇 예들에서, 전처리된 바이오매스는 전처리된 물질의 폭발적 방출을 수반하는, "스팀 폭발(explosion)"을 이용하여 가압된 전처리 반응기로부터 제거될 수 있다. 스팀-폭발된, 전처리된 바이오매스는 그것의 섬유 구조를 유지하지 않으며 그러므로, 그것의 섬유 구조를 유지하는 전처리된 바이오매스로 통상의 스크류 프레스 시스템들을 이용하여 달성될수 있는 그것에 필적할만한 건조물 함량을 달성하기 위하여 더 정교한 고체/액체 분리 시스템들을 요구한다.

바이오매스 공급원료는 log Ro 3.75 또는 그 미만의 매우 낮은 엄격도로 전처리된다. 이는 보통 10% 또는 그보다 더 높은 자일란 수(number)를 갖는 전처리된 바이오매스를 야기할 것이다. 파라미터(parameter) "자일란 수"는 불용성(insoluble) 고체들 내 남아 있는 잔여 자일란 함량 및 또한 액체 분획(fraction) 내 가용성(soluble) 자일로스 및 자일로(xylo)-올리고머들의 농도 둘다의 가중치(weighted) 결합(combination)을 반영하는 합성(composite) 척도(measurement)를 반영한다. 더 낮은 Ro 엄격도에서, 자일란 수는 더 높다. 이런 식으로, 가장 높은 자일란 수는 가장 낮은 전처리 엄격도를 반영한다. 자일란 수는 용해되지 않은 고체들 내 잔여 자일란 함량이 더 높은, 심지어 매우 낮은 엄격도로 통상의 엄격도 척도 log Ro 과 음성 선형 상관관계를 제공한다. 여러가지 다른 공급원료들을 위하여 야기된 전처리된 바이오매스의 자일란 수 및 전처리 엄격도 log Ro 사이의 관계는 도 1에 나타나 있는데, 이는 실시예 1에서 자세히 설명된다.

자일란 수는 등가의 자일란 수를 갖는 다른 전처리된 바이오매스 공급원료들이 등가의 C5 모노머 회수를 보인다는 면에서 전처리 엄격도의 척도로서 특히 유용하다. 반면, 통상의 Ro 엄격도는, 다른 바이오매스 공급원료들 사이의 비교를 위한 합리적 기준을 제공하는 것이 아니라, 단순히 전처리 조건들의 경험에 의한 기재이다. 예를 들어, 도 1에 나타난 바와 같이, 엄격도 log Ro= 3.75 로의 일(single)-단계 자가가수분해는 보통의 밀짚 종류들로는, 전처리된 공급원료의 그 결과인 자일란 수가 약 10%인데 반하여, 6-7 % 상이의 자일란 수를 갖는 전처리된 사탕수수 바가스(bagasse) 및 옥수수 대를 제공한다.

당업자는 원하는 자일란 수를 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하기 위하여 임의의 정해진 공급원료를 위하여, 적절한 전처리 엄격도 log Ro를 쉽게 결정할 수 있다. 몇몇 예들에서, 바이오매스 공급원료는 매우 낮은 엄격도 log Ro 3.75 또는 미만(less), 또는 3.74 또는 미만(less), 또는 3.73 또는 미만(less), 또는 3.72 또는 미만(less), 또는 3.71 또는 미만(less), 또는 3.70 또는 미만(less), 또는 3.69 또는 미만(less), 또는 3.68 또는 미만(less), 또는 3.67 또는 미만(less), 또는 3.66 또는 미만(less), 또는 3.65 또는 미만(less), 또는 3.64 또는 미만(less), 또는 3.63 또는 미만(less), 또는 3.62 또는 미만(less), 또는 3.61 또는 미만(less), 또는 3.60 또는 미만(less), 또는 3.59 또는 미만(less), 또는 3.58 또는 미만(less), 또는 3.57 또는 미만(less), 또는 3.56 또는 미만(less), 또는 3.55 또는 미만(less), 또는 3.54 또는 미만(less), 또는 3.53 또는 미만(less), 또는 3.52 또는 미만(less), 또는 3.51 또는 미만(less), 또는 3.50 또는 미만(less), 또는 3.45 또는 미만(less), 또는 3.40 또는 미만으로 전처리된다. 몇몇 예들에서, 바이오매스는 11% 또는 더 높은, 또는 12% 또는 더 높은, 또는 13% 또는 더 높은, 또는 14% 또는 더 높은, 또는 15% 또는 더 높은, 또는 16% 또는 더 높은, 또는 17% 또는 더 높은 자일란 수를 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하기 위하여 낮은 엄격도 log Ro로 전처리된다.

자일란 수는 생산 규모 바이오매스 가공에서 실질적인 척도로서 유용한데, 이는 그것이 근처의 적외선 분광 모니터들에 의하여 제공되는 것과 같은 단순한 척도들에 기초한 온-라인으로 쉽게 측정될 수 있기 때문이다. 자일란 수는 나아가, WO2013/120492에 기재된 바와 같이, 전처리의 통제를 위한 종점(end-point) 척도로서 이용될 수 있다.

가용성 자일란 함량 및 또한 용해되지 않은 고체들 내 잔여 자일란 함량 둘다의 합성 척도를 반영하는, 자일란 수의 대안으로서, 전처리의 효과는 용해되지 않은 고체들 내 잔여 자일란 함량의 면에서 표현될 수 있다. 용해되지 않은 고체들 내 잔여 자일란 함량 및 자일란 수의 관계는 도 2에 나타나 있는데, 이는 실시예 1에서 설명된다. 당업자는 용해되지 않은 고체들 내 원하는 잔여 자일란 함량을 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하기 위하여 임의의 정해진 공급원료를 위하여 적절한 전처리 엄격도 log Ro를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 도 2에 나타난 바와 같이, 10%의 자일란 수를 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하기에 충분한 엄격도에서 일(single)-단계 자가가수분해는, 밀짚, 사탕수수 바가스, 빈 과실 송이들, 및 옥수수 대를 포함하나 이에 제한되지 않는, 연질(soft) 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 공급원료들을 위한 약 5.0 중량%의 용해되지 않은 고체들 내 잔여 자일란 함량을 갖는 전처리된 바이오매스를 보통 생산할 것이다. 몇몇 예들에서, 바이오매스 공급원료는 용해되지 않은 고체들 내 잔여 자일란 함량이 적어도 5.0 중량%(% by weight), 또는 적어도 5.1%, 또는 적어도 5.2%, 또는 적어도 5.3%, 또는 적어도 5.4%, 또는 적어도 5.5%, 또는 적어도 5.6%, 또는 적어도 5.7%, 또는 적어도 5.8%, 또는 적어도 5.9%, 또는 적어도 6.0%, 또는 적어도 6.1%, 또는 적어도 6.2%, 또는 적어도 6.3%, 또는 적어도 6.4%, 또는 적어도 6.5%, 또는 적어도 6.6%, 또는 적어도 6.7%, 또는 적어도 6.8%, 또는 적어도 6.9%, 또는 적어도 7.0%, 또는 적어도 7.1%, 또는 적어도 7.2%, 또는 적어도 7.3% 또는 적어도 7.4%, 또는 적어도 7.5%, 또는 적어도 7.6%, 또는 적어도 7.7%, 또는 적어도 7.8%, 또는 적어도 7.9% 또는 적어도 8.0%, 또는 적어도 8.1%, 또는 적어도 8.2%, 또는 적어도 8.3%, 또는 적어도 8.4%, 또는 적어도 8.5% 인 전처리된 바이오매스를 생산하기에 적합한 엄격도 log Ro로 전처리된다.

바이오매스 공급원료들은 전처리된 공급원료의 자일란 수가 10% 또는 그보다 큰, 또는 전처리된 공급원료 내 용해되지 않은 고체들의 잔여 자일란 함량이 적어도 5.0% 또는 그보다 큰, 매우 낮은 엄격도로 전처리되는 것이 유리하다. 이 매우 낮은 엄격도 레벨은 전처리 동안 가용화(solubilize)되거나 또는 되돌릴 수 없을 정도로 상실(lost)되는 전처리 전 공급원료의 총 헤미셀룰로스 함량 이 최소화되는 공정에 대응한다. 우리는 적어도 55% 이론상의 매우 높은 최종 C5 모노머 수율들이, 효소 가수분해 동안 충분히 높은 자일라나제(xylanase) 및 자일로시다제(xylosidase) 활성들이 이용되면, 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 매우 낮은 엄격도로 전처리된 공급원료들의 효소 가수분해 후 밀짚, 사탕수수 바가스, 단수수(sweet sorghum) 바가스, 옥수수 대, 및 빈 과실 송이들의 보통 종류들을 갖고 C6 모노머 수율들의 주목할만한 상실 없이 수득될 수 있다는 것을 예상 외로 발견했다. 매우 낮은 엄격도 레벨들에서, 공급원료의 헤미셀룰로스 함량의 큰 분획은, 이는 그것이 효소 가수분해를 이용하여 높은 회수로 C5 모노머들로 그 다음에 가수분해될 수 있고, 충분한 자일라나제(xylanase) 및 자일로시다제(xylosidase) 활성들이 사용되는, 전처리 후 고체 분획 내에 남는다.

"자일로스 회수"에 대한 보고서들이 자주 여기에서 보고된 자일로스 회수들에 맞먹지 않은 용어들로 표현되는 것을 주의해야 한다. 예를 들어, Ohgren et al. (2007) 및 Lee et al. (2009)은 높은 자일로스 회수들을 보고한다. 그러나 이들 값들은 전처리 전 공급원료의 원래 헤미셀룰로스 함량의 퍼센트로서 표현되지 않고, 전처리된 바이오매스로부터 자일로스 회수만을 나타낸다. 또는 예를 들어 WO2010/113129는 전처리 전 공급원료의 헤미셀룰로스 함량의 퍼센트로서 헤미셀룰로스 회수를 나타낸는데, 총 헤미셀룰로스 회수보다 변함없이 더 작은, 모노머 수율을 특정하지 않는다. 몇몇 예들에서, 적어도 56% 이론상의 C5 모노머 수율들은 효소 가수분해 후 가수분해물에서 수득될 수 있고, 또는 적어도 57%, 또는 적어도 58%, 또는 적어도 59%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 61%, 또는 적어도 62%, 또는 적어도 63%, 또는 적어도 64%, 또는 적어도 65%이다.

효소 가수분해는 여러가지 다른 방법들로 수행될 수 있다. 몇몇 예들에서, 전처리된 바이오매스는 전체 슬러리로서 가수분해되는데, 이는, 전처리된 바이오매스로부터의 실질적으로 모든 고체들이, 용해된 그리고 용해되지 않은 고체들 둘다를 포함하는 하나의 반응 혼합물 내 효소 가수분해로 가해진다는 것을 의미한다. 여기에서 사용된 대로, 용어 "전체 슬러리"는, 효소 가수분해의 시작에서, 용해되지 않은 것의 용해된 고체들에 대한 중량 비율이 2.2:1 미만(less)인 효소 가수분해 반응 혼합물을 나타낸다.

전처리된 바이오매스 슬러리의 "용해되지 않은 고체들" 및 "용해된 고체들" 함량은 하기와 같이 결정된다:

"총 고체들" 및 "여과된 총 고체들" 함량은 Weiss et al. (2009)에 기재된 절차에 따라 결정된다. 이들 값들로부터 "용해되지 않은 고체들" 및 "용해된 고체들" 함량이 하기 식들에 따라 계산될 수 있다:

[용해되지 않은 고체들] (wt-%) = ([총 고체들] (wt-%) - [여과된 총 고체들] (wt-%))/(1 - [여과된 총 고체들] (wt-%))

[용해된 고체들] (wt-%) = [총 고체들] (wt-%) - [용해되지 않은 고체들] (wt-%)

몇몇 예들에서, 효소 가수분해 전, 전처리된 바이오매스는 분리된 고체 분획 및 액체 분획(fraction)을 생산하기 위하여 고체/액체 분리 단계에 가해진다. 이러한 분리는 전처리된 바이오매스 내 용해된 고체들의 일부 성분이 보통 효소 가수분해에 사용된 하나 또는 그보다 많은 효소들의 활성들을 억제하는 기능을 하는데 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 전처리된 바이오매스 전체(whole) 슬러리로부터 용해된 고체 함량의 제거는, 실시예 4에서 설명된 대로 그리고 도 6에서 나타난 대로, 상표 CELLIC CTEC3 ™ 하 NOVOZYMES ™ 에 의하여 또는 상표 ACCELLERASE TRIO ^TM 하 GENENCOR ™ 에 의하여 제공되는 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들을 이용하여 높은 건조물 함량에서 효소 가수분해로 가해지는, 여기에 기재된 대로 전처리된 공급원료들로 달성된 셀룰로스 전환을 명확히 개선시킨다.

그러나, 놀랍게도, 전처리된 바이오매스 슬러리가 충분히 더 낮은 건조물 함량으로 충분히 희석될 때, 전처리된 바이오매스 슬러리 내 존재하는 억제 물질들(substances)의 농도가 충분히 희석되어, 등가 전환 수율들이 실시예 10에 설명된 대로, 더 낮은 효소 용량(dose) 레벨들에서도, 전체(whole) 슬러리 가수분해에서 수득될 수 있다.

효소 가수분해가 높은 건조물 함량에서 수행되도록 원해지는, 효소 가수분해 전 고체/액체 분리 단계를 이용하는 예들에서, 고체 분획 내 건조물 함량의 가장 높은 실행가능한 레벨들을 달성하는 것, 또는 대체하여, 고체 분획으로부터 용해된 고체들의 가장 높은 실행가능한 양을 제거하는 것이 유리하다. 몇몇 예들에서, 고체/액체 분리는 적어도 40 중량%, 또는 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 55%의 DM 함량을 갖는 고체 분획을 달성한다. 통상의 스크류 프레스 시스템들을 이용한 고체/액체 분리는 보통 섬유 구조가 유지되는 방식으로 바이오매스 공급원료가 전처리되면, 고체 분획 내 50% 로 높은 DM 레벨들을 달성할 수 있다. 몇몇 예들에서, 예를 들어, 멤브레인 필터 프레스 시스템을 이용하여, 더욱 효과적인 고체/액체 분리를 달성하기 위하여 더 높은 공장(plant) 자본(capital) 비용들을 발생시키는 것이 유리할 수 있다. 몇몇 예들에서, 용해된 고체들은 펄프 및 종이 기술에 알려진 치환(displacement) 세척 기술들에 의하여 또는 순차적인 세척 및 프레싱에 의하여 고체 분획으로부터 제거될 수 있다. 몇몇 예들에서, 고체/액체 분리에 의하여 직접적으로, 또는 세척 및 고체/액체 분리의 몇몇 조합에 의하여, 고체 분획의 용해된 고체들 함량은 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%에 의하여 감소된다.

이러한 고체/액체 분리로부터 수득되는 액체 분획(fraction)은 그 다음 고체 분획의 효소 가수분해 동안 고체 분획로부터 분리되어 유지될 수 있다. 우리는 이를 임시 분리 "C5 바이패스(bypass)"로 명명한다. 고체 분획의 효소 가수분해가 글루칸 전환의 원하는 정도에 도달한 후, C5-풍부 "바이패스" 물질은 그 다음 가수분해 혼합물로 다시 첨가될 수 있다. 우리는 이것을 "C5 바이패스" 물질의 "전가수분해(poshydrolysis)"로 가리킨다. 이 방식으로, 그외 전처리된 바이오매스 슬러리 내 존재하는 효소-억제성(inhibitory) 용해된 고체들에 의하여 야기되는 간섭(interference)이, C5 모노머 수율의 상실 없이, 최소화된다. 자일란 수 10% 또는 그보다 높은 것을 갖는, 또는 5.0% 또는 그보다 큰 자일란 함량을 갖는 용해되지 않은 고체들을 갖는 전처리된 물질을 제공하기 위하여, 매우 낮은 엄격도로 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 전처리되는 밀짚, 사탕수수 바가스, 단수수(sweet sorghum) 바가스, 옥수수 대, 및 빈 과실 송이들의 보통 종류들과 같은, 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들로부터 수득되는 액체 분획은 보통 C6 모노머들 (1x)의 작은 성분, 몇몇 다른 당들을 갖는 주로 글루코스; 가용성(soluble) C6 올리고머들 의 더 큰 성분(약 2x - 7x); C5 모노머들의 더 큰 성분 (약 4x - 8x), 몇몇 아라비노스 및 다른 당들과 같이 주로 자일로스; 및 가용성 자일로-올리고머들 (약 18x - 30x)의 훨씬 더 큰 성분을 포함한다. 가용성 자일로-올리고머들은 보통 몇몇 더 높은 체인 올리고머들과 함께 주로 자일로헥소스(xylohexose), 자일로펜토스(xylopentose), 자일로테트라오스(xylotetraose), 자일로트리오스(xylotriose) 및 자일로비오스(xylobiose)를 포함한다. 이들 자일로스 올리고머들 (또는 자일로-올리고머들)은 보통 고체 분획의 효소 가수분해에 사용되는 효소 활성들에 의하여 "가수분해후(posthydrolysis)" 동안 효소로 가수분해된다. 또는 다시 말해서, 분리된 액체 분획(fraction) 및 가수분해된 고체 분획을 혼합함으로써, 액체 분획 내 자일로-올리고머들이 가수분해된 고체 분획 내 남아 있는 효소 활성들의 작용에 의하여 자일로스 모노머들로 분해된다.

대체하여, 몇몇 예들에서, 분리된 액체 분획은 다른 목적들을 위하여 사용될 수 있다. 몇몇 예들에서, 분리된 액체 분획은 가수분해물들의 발효로부터 에탄올의 회수 후 수득되는 딘(thin) 스틸레지(stillage)로 블렌딩(blend)될 수 있다. 블렌딩된 액체 분획 및 딘 스틸레지는 그 다음에 바이오메탄 기질로서 사용될 수 있다. 또는 대체하여, 딘 스틸레지 및 액체 분획(fractions)들은 분리된 바이오메탄 기질로서 사용될 수 있다. 놀랍게도 딘 스틸레지 및 또한 액체 분획(fraction)의 바이오메탄 잠재력(potential)은 자일란 수 10% 또는 이보다 큰 것을 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하는 매우 낮은 엄격도 전처리 후 증가된다. 그 결과, 몇몇 예들에서, 증가된 바이오메탄 수율이 다소 감소된 에탄올 수율들을 상쇄할 수 있다는 점에서, 매우 낮은 엄격도에서 C6 발효를 수행하는 것이 유리하다. 몇몇 예들에서, 적어도 75 NM3 메탄(methane)/톤(ton) 바이오매스 공급원료, 또는 적어도 78, 또는 적어도 80, 또는 적어도 82, 또는 적어도 85, 또는 적어도 87, 또는 적어도 90, 또는 적어도 92, 또는 적어도 95 의 바이오메탄 수율이, 자일란 수 적어도 10%를 갖는, 또는 용해되지 않은 고체들이 적어도 5.0 중량% 자일란을 포함하는, 전처리된 바이오매스를 생산하기 위하여 공급원료가 낮은 엄격도 log Ro 로 전처리되는, 결합된(combined) 액체 분획(fraction) 및 딘 스틸레지를 포함하는 바이오메탄 기질로부터 생산될 수 있다. 몇몇 예들에서, 전체 슬러리 가수분해물 자체는 바이오메탄 기질로서 이용된다.

몇몇 예들에서, 본 발명은 하기를 포함하는 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법들을 제공한다:

- 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료를 제공하는 단계,

- 매우 낮은 엄격도로 일(single)-단계 가압된 열수(hydrothermal) 전처리에서 3.5 내지 9.0 범위 내 pH 에서 공급원료를 전처리하여, 전처리된 바이오매스가 10% 또는 그보다 더 높은 자일란 수를 가짐으로써 특징되는 단계,

- 고체 분획 및 액체 분획으로 전처리된 바이오매스를 분리하는 단계,

- 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, B-글루코시다제, 엔도자일라나제, 및 자일로시다제(xylosidase) 활성들을 포함하는 효소 혼합물에 의하여 촉매화되는 효소 가수분해를 이용하여 보충 물 함량의 추가로 또는 추가 없이 고체 분획을 가수분해하는 단계, 및

- 그 다음에 분리된 액체 분획(fraction) 및 가수분해된 고체 분획을 혼합하고, 그로써 액체 분획 내 자일로-올리고머들이 가수분해된 고체 분획 내 남아 있는 효소 활성들의 작용에 의하여 자일로스 모노머들로 분해되는 단계.

몇몇 예들에서, 분리된 액체 분획(fraction)이 가수분해후(posthydrolysis)를 위하여 첨가되는, 또는 전체 슬러리로부터인, 분리된 고체 분획 또는 가수분해된 고체 분획으로부터인, 효소 가수분해물이 그 다음에 발효에 가해져 에탄올을 생산한다.

몇몇 예들에서, 가수분해물의 발효 후 회수되는 딘 스틸레지는 바이오메탄 생산을 위한 기질로서 이용될 수 있다. 몇몇 예들에서, 분리된 액체 분획(fraction)은 가수분해물의 발효 후 회수되는 딘 스틸레지와 블렌딩되고, 그리고 결합된 바이오메탄 기질로서 사용된다.

"고체 분획" 및 "액체 분획"이 더 세분되거나 또는 가공될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 몇몇 예들에서, 바이오매스는 고체/액체 분리와 동시에 전처리 반응기로부터 제거될 수 있다. 몇몇 예들에서, 전처리된 바이오매스는 보통 단순하고 낮은 비용의 스크류 프레스 시스템을 이용하여, 고체 분획 및 액체 분획을 만들기 위하여, 반응기로부터 내려진(unload) 후 고체/액체 분리 단계로 가해진다.

업계에서 잘 알려져 있듯이, 셀룰라제 활성을 이용한 효소 가수분해는 가수분해가 더 낮은 건조물 함량에서 수행될 때 더 효율적이다. 이 잘 알려진 효과의 정확한 이유들은 완전히 이해되지는 않지만, 더 높은 고체들 농도는 셀룰라제 촉매작용을 효과적으로 억제한다. 예컨대 Kristensen et al. (2009) 참조. 업계의 우세한 관점이 가장 높은 실질적 건조물 함량에서의 가수분해가 유리하다는 것인 반면, 이는 증가하는 효소 소모와 필연적으로 관련된다. 동일한 효소 가수분해 효과들은 효소 비용들의 절약과 더 낮은 건조물 함량에서 동일한 효소 제제들을 이용함으로써 달성될 수 있다.

당업자는 임의의 정해진 바이오매스 공급원료 및 효소 제제를 위한, 정해진 공정 목표들을 달성하는데 적합한 효소 가수분해를 수행하기 위한 DM 레벨을 통상의 실험을 통하여 쉽게 결정할 것이다. 몇몇 예들에서, 효소 소모에서 몇몇 야기된 증가에도 불구하고, 매우 높은 DM > 20% 에서 가수분해를 수행하는 것이 유리할 수 있다. 에탄올 증류에서 에너지 비용들을 아끼는 것 그리고 물 소모를 최소화하는 것을 포함하는 여러가지 이유들로, 가장 높은 실행가능한 건조물 레벨에서 가수분해를 수행하는 것이 유리하다고 생각된다. 몇몇 예들에서, 전체 슬러리의 또는 분리된 고체 분획의 효소 가수분해는 8% DM 또는 그보다 큰, 또는 9% DM에서 또는 그보다 큰, 또는 10% DM에서 또는 그보다 큰, 또는 11% DM에서 또는 그보다 큰, 또는 12% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 13% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 14% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 15% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 16% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 17% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 18% DM 또는 그보다 큰 것에서 또는 19% DM 또는 그보다 큰 것에서 또는 20% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 21% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 22% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 23% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 25% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 30% DM 또는 그보다 큰 것에서, 또는 35% DM 또는 더 큰 것에서 수행될 수 있다.

몇몇 예들에서, 고체 분획은 40% DM 또는 그보다 큰 것에서 전처리된 바이오매스의 고체/액체 분리로부터 회수되나, 그러나 추가적인 물 함량이 첨가되어 효소 가수분해는 더 낮은 DM 레벨들에서 수행될 수 있다. 물 함량이 신선한 물, 임의의 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 첨가제들이 있는 또는 없는 다른 공정 용액들 또는 응축물, 계면활성제들, 염들, 암모니아, 암모늄(ammonium) 하이드록사이드(hydroxide), 칼슘 하이드록사이드, 또는 소듐(sodium) 하이드록사이드와 같은 pH 조정을 위한 화학물질들, 항-박테리아 또는 항-진균 제제들, 또는 다른 물질들의 형태로 첨가될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.

적어도 55% 또는 그보다 큰 가수분해물에서 C5 모노머 수율을 달성하기 위하여, 본 발명에 따라, 여러가지 효소 활성들을 이용하여 효소 가수분해가 수행된다. 효소 가수분해에서 사용되는 효소들의 혼합물은 적어도 하기 활성들 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, β-글루코시다제, 엔도자일라나제, 및 β-자일로시다제을 포함하여야 한다. 가수분해가 수행되는 건조물 함량, 공정 목표들로서 원하는 글루칸 전환 수율들 및 공정 목표들로서 원하는 가수분해 시간들에 의존하여 여러 다른 효소 용량(dose) 레벨들이 적용될 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다. 이런 식으로, 더 높은 건조물, 급속의 가수분해에 적합한 효소 용량(dose) 레벨은 크게 감소되고, 더 낮은 건조물, 더 긴 가수분해 기간(time frame)에서 사용될 수 있다.

일반적인 규칙으로써, 적어도 55% 또는 그보다 큰 가수분해물의 C5 모노머 수율은 상대적으로 빨리, 전형적으로 24 시간만큼 낮은 기간에서, 그리고 일반적으로 18 내지 60 시간의 범위 내에서 달성될 수 있다. 실현가능한 한 빨리 이들 매우 높은 C5 모노머 회수들을 달성하는 것이 유리한데, 이는 일단 자일란 함량이 용해되지 않은 고체들로부터 상당히 제거되면, 생산적 결합에 접근하는데 엔도(endo)- 및 엑소(exo)-글루카나제들이 비교적 덜 방해되기 때문이다. 몇몇 예들에서, 높은 C5 모노머 수율들이 달성된 후 과도한 엔도- 및 엑소- 글루카나제 활성으로 효소 혼합물을 보충하는 것이 유리할 수 있다. 이를 통하여(over) 이들 높은 C5 모노머 수율들을 보통 달성할 수 있는 가수분해 기간들은, 예를 들어 도 11에서 표시되며, 실시예 10에 설명된 대로, 전처리 후 총 C5 회수가 약 77% 이었던 12% DM에서 전체 슬러리 가수분해에서 자일란 전환을 보인다. 보이는 대로, 매우 낮은 효소 용량(dose) 레벨들에서도, 적어도 55%의 C5 모노머 수율들은 40 시간들 내에 달성될 수 있다.

55% 또는 이보다 큰 C5 모노머 수율들을 달성하기 위하여 본 발명의 방법들을 실시하는데 적합한 여러가지 효소 활성들의 적절한 레벨들은 보통 하기와 같다:

엔도글루카나제(endoglucanase)는 β-1,4-글루카나제 (EC 3.2.1.4)로도 알려진 4-(1,3;1,4)-β-D-글루칸(glucan) 4-글루카노하이드롤라제(glucanohydrolase)를 가리킨다. 제한 값들을 정의하려는 목적으로, 엔도글루카나제 활성들이 하이드록실-에틸 셀룰로스 (HEC)를 이용하여 Ghose (1987)의 방법을 이용하여 결정되었고, 그리고 nkat/g 효소 제제로 표현되었다. 보통 엔도글루카나제 레벨들은 효소 가수분해의 시작 시 적어도 1100 nkat/g 글루칸이어야 한다. 가수분해 속도, 전환 정도 및 건조물 함량과 같은 공정 목표들에 의존하여, 엔도글루카나제 활성 레벨들은 1100 - 30000 nkat/g 글루칸 범위 내에서 다를 수 있다. 몇몇 예들에서, 범위는 1100-2832 사이, 또는 1130-1529 사이, 또는 2317-3852 사이, 또는 3000-5120 사이, 또는 4000-8000 사이, 또는 7000-10000 사이, 또는 11000-20000 사이일 수 있다.

엑소글루카나제(exoglucanase)는 4-β-D-글루칸(glucan) 셀로비오하이드롤라제(cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91)를 가리킨다. 한계 값들을 정의하려는 목적을 위하여, 엑소글루카나제 활성들이 기질로서 4-메틸-엄벨리페릴(umbelliferyl)-β-D-락토사이드(lactoside)를 이용하여 Bailey and Tahtiharju (2003)의 방법을 이용하여 결정되고 nkat/g 효소 제제로 표현된다. 보통 엑소글루카나제 레벨들은 효소 가수분해 시작 시 적어도 280 nkat/g 글루칸이어야 한다. 가수분해 속도, 전환 정도 및 건조물 함량과 같은, 가공 목표들에 의존하여, 활성 레벨들은 280-20000 nkat/g 글루칸 범위 내에서 다를 수 있다. 몇몇 예들에서, 범위는 280-690,사이 또는 370-560 사이, 또는 400-932 사이, 또는 700-1240 사이, 또는 1200-2000 사이, 또는 3000-5000 사이일 수 있다.

β-글루코시다제는 β-D-글루코사이드(glucoside) 글루코하이드롤라제(glucohydrolase) (EC 3.2.1.21)를 가리킨다. 한계 값들을 정의하려는 목적을 위하여, β-글루코시다제 활성들은 기질로서 4-나이트로페닐(nitrophenyl)-β-D-글루코피라노사이드(glucopyranoside)를 이용하여 Berghem and Pettersson (1974)의 방법을 이용하여 결정되고 그리고 nkat/g 효소 제제로 표현된다. 보통 β-글루코시다제 레벨들은 효소 가수분해의 시작 시 적어도 3000 nkat/g 글루칸이어야 한다. 가수분해 속도, 전환 정도 및 건조물 함량과 같은 공정 목표들에 의존하여, 활성 레벨들은 3000-50000 nkat/g 글루칸 범위 내에서 다를 수 있다. 몇몇 예들에서, 범위는 3000-7500 사이, 또는 4000-6010 사이, 또는 5000-1000 사이, 또는 7000-14000 사이, 또는 15000-25000 사이일 수 있다.

엔도실라나제(endoxylanase)는 4-β-D-자일란(xylan) 자일라노하이드롤라제(xylanohydrolase) (EC 3.2.1.8)를 나타낸다. 한계 값들을 정의하려는 목적을 위하여, 엔도자일라나제 활성들이 기질로서 버치우드(birchwood) 자일란을 이용하여 Bailey et al. (1992)의 방법을 이용하여 결정되고, 그리고 nkat/g 효소 제제로 표현된다. 시트레이트(citrate) 버퍼는 시험되는 활성을 위한 적절한 레벨로 pH 를 조정하기 위하여 사용될 수 있다. 보통 엔도자일라나제 레벨들은 효소 가수분해 시작 시 적어도 1400 nkat/g 글루칸이어야 한다. 가수분해 속도, 전환 정도 및 건조물 함량과 같은 공정 목표들에 의존하여, 활성 레벨들은 1400-70000 nkat/g 글루칸의 범위 내에서 다를 수 있다. 몇몇 예들에서, 그 범위는 1400-3800 사이, 또는 4000-5000 사이, 또는 6000-7000 사이, 또는 7000-8000 사이, 또는 9000-12000 사이, 또는 11000-15000 사이, 또는 15000-20000 사이, 또는 18000-30000 사이일 수 있다.

β-자일로시다제는 4-β-D-자일란(xylan) 자일로하이드롤라제(xylohydrolase) (EC 3.2.1.37)를 가리킨다. 한계 값들을 정의하려는 목적을 위하여, β-자일로시다제 활성들이 기질로서 파라(para)-나이트로페닐(nitrophenyl)-β-D-자일라노피라노사이드(xylanopyranoside)를 이용하여 Poutanen and Puls (1988)의 방법을 이용하여 결정되고 nkat/g 효소 제제로 표현된다. 보통 β-자일로시다제 레벨들은 효소 가수분해 시작 시 적어도 75 nkat/g 글루칸이어야 한다. 가수분해 속도, 전환 정도 및 건조물 함량과 같은 가공 목표들에 의존하여, 활성 레벨들은 75-124, 또는 100-300 사이, 250-500 사이, 또는 400-800 사이, 또는 700-20000 nkat/g 글루칸 사이의 범위 내에서 다를 수 있다. 몇몇 예들에서, 그 범위는 700-900, 또는 800-1400 사이, 또는 1100-1700 사이, 또는 1500-2500 사이, 또는 2000-3500 사이, 또는 3000-5000 사이, 또는 4000-10000 사이, 또는 8000-20000 사이일 수 있다.

활성 결정을 위하여 사용되는 상기 나타낸 분석들 중 임의의 것은, 샘플들이 측정 목적을 위하여 적절한 희석도로 조정되어야 한다는 것을 포함하여, 적절한 식들로 변형될 수 있다. 분석은 알려진 활성들이 유사한 배경(background) 건조물 함량을 갖고 샘플들에 첨가되는, 표준 곡선들과의 비교하면, 가수분해 혼합물로부터 취해진 대표적인 샘플들에서의 측정들을 위하여 조정될 수 있다.

당업자는 쉽게 이해할 것이듯이, 본 발명의 방법을 실행하는데 적합한 효소 혼합물들의 조성물은 비교적 넓은 경계들 내에서 다를 수 있다. 적절한 효소 제제들은 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들을 포함한다. 최적화 동안 효소 혼합물들의 선택 및 변형은, 예를 들어 Zhang et al. (2006) 에 의하여 기재된 것들과 같은, 또는 당업계에 알려진 다른 방법들에 의한, 유전 공학 기술들을 포함할 수 있다. 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들은 제조업자 및/또는 보통 말하는 조달업자에 의하여 보통 확인된다. 이것들은 보통 일반적인 사용을 위한, 또는 동물 사료, 식품, 직물 세제들 또는 종이 산업의 생산에 사용되기 위하여 최적화된, 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들과는 완전히 다른 것이다. 몇몇 예들에서, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제는 GENENCOR ™ 에 의하여 제공되는 것 그리고 예컨대, 상표 ACCELLERASE TRIO TM 하 판매되는 상업적 셀룰라제 제제와 같은, 유전적으로 변형된 트리코데마(Trichoderma) 리세이(reesei)의 발효물들로부터 분리된 베타 글루코시다제들, 엑소글루카나제들, 엔도글루카나제들, 엔도자일라나제들, 자일로시다제들을 포함하는 것이 이용된다. 몇몇 예들에서, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제는 NOVOZYMES ™에 의하여 제공되는 것 그리고 상표들 CELLIC CTEC2 ™ 또는 CELLIC CTEC3 ™ 하 판매되는 상업적 셀룰라제 제제들과 같은, 베타 글루코시다제들, 엑소글루카나제들, 엔도글루카나제들, 엔도자일라나제들 및 자일로시다제들을 포함하는 것이 이용된다.

리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 세 개의 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제로 대표되는 효소 활성들이 자세히 분석되었다. 이들 상업적 셀룰라제 제제들 각각에 대하여, 12 개의 다른 효소 활성들의 레벨들이 특징화되고 그램(gram) 단백질 당 표현되었다. 실험의 자세한 사항들은 실시예 8에 제공된다. 결과들은 표 1에 나타난다. 이 예에서 사용된 분석 방법들이 여기에 활성들의 결정들을 위하여 의존하는 것들과 동일하지 않다는 것에 주목해야 한다. 이들 결과들은 일반화된, 질적인 비교만을 제공하며, 본 발명의 방법들에 대한 주장들에 대한 제한으로서 여겨져서는 안된다.

리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 상업적 셀룰라제 제제들에서의 선택된 활성 측정들.

리그노셀룰로스 바이오매스를 가수분해하는데 효과적인 효소 혼합물들은, 대신에, 호기성 및 혐기성 박테리아, 백색(white) 부패(rot) 진균(fungi), 부패병(soft rot) 진균 및 혐기성 진균을 포함하는 여러 미생물들로부터 당업계에 잘 알려진 방법들에 의하여 수득될 수 있다. 예컨대 Singhania et al. (2010) 참조. 셀룰라제들을 생산하는 생물들은 보통 리그노셀룰로스 기질들의 가수분해 에 적합하기 위하여 적당한 비율(proportions)로 다른 효소들의 혼합물을 분비한다. 리그노셀룰로스 바이오매스의 전환에 유용한 셀룰라제 제제들의 선호되는 소스들은 트리코더마(Trichoderma), 페니실리움(Penicillium), 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 아스포질러스(Aspergillus) 및 파네로차에트(Phanerochaete)의 종들과 같은 진균들을 포함한다.

한 진균 종들, 특히 트리코더마(Trichoderma) 레세이(reesei)는 널리 연구되어 왔다. 야생형 트리코더마(Trichoderma) 레세이(reesei)는 여러가지 엔도자일라나제들 및 엑소실로시다제들(exoxylosidases)과 더불어, 다른 셀룰로스 인식 자리들(sites)을 갖는 적어도 다섯 개의 다른 엔도셀룰라제들(endocellulases), 두 개의 B-글루코시다제들, 셀룰로스 체인들의 환원성(reducing) 및 비-환원성 말단들에 대한 각각의 특이성을 갖는 두 개의 엑소셀룰라제들(exocellulases) (셀로비오하이드롤라제(cellobiohydrolases))를 포함하는 효소들의 혼합물을 분비한다. Rouvinen, J., et al. (1990); Divne, C., et al. (1994); Martinez, D., et al. (2008) 참조. 상업적 셀룰라제 제제들은 보통 알파-아라비노퓨라노시다제(arabinofuranosidase) 및 아세틸 자일란 에스테라제(esterase) 활성들을 또한 포함한다. 예컨대 Vinzant, T., et al. (2001) 참조.

야생형 생물들에 의하여 자연적으로 분비되는 혼합물들 내 존재하는 비율들과는 다른 상대적인 비율들의 효소 활성들의 최적화된 혼합물은 더 높은 당 수율들을 생산하는 것을 전에 보여왔다. Rosgaard et al. (2007) 참조. 정말, 16 개의 다른 효소 단백질들만큼 많은 것을 포함하는 효소 블렌드들(blends)의 최적화들은 임의의 정해진 전처리에 가해지는 임의의 정해진 바이오매스 공급원료에 유리하게 분리적으로 결정될 수 있다는 것이 제안되어 왔다. Billard, H., et al. (2012); Banerjee, G., et al. (2010) 참조. 그러나, 상업적인 실질적 측면에서, 상업적 효소 제공자들은 보통 규모의 경제들이 큰 규모 생산에서 수득될 수 있도록, 다른 효소 블렌드들(blends)의 가장 작은 실행가능한 수를 생산하는 것을 추구한다.

몇몇 예들에서, 하나 또는 그보다 많은 추가의 또는 보충의 효소 활성들을 갖고, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제를 보충하는 것이 유리할 수 있다. 몇몇 예들에서, 상업적 제제에 존재하는 하나 또는 그보다 많은 구성요소 효소들의 상대적인 비율을 단순히 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 몇몇 예들에서, 전문화된 추가 활성들을 도입하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 임의의 정해진 바이오매스 공급원료를 이용하여 본 발명의 방법들을 실행하는데 있어, 특정 가수분해되지 않은 탄수화물 연결들(linkages)은 하나 또는 그보다 많은 보충의 효소 활성들의 이용을 통하여 유리하게 가수분해될 수 있는 것으로 확인될 수 있다. 이러한 가수분해되지 않은 연결들은, 가용성 가수분해물들 또는 불용성 가수분해되지 않은 잔여물(residual)에서, 당업계에 잘 알려지니 방법들을 이용하여 올리고머 탄수화물들의 특성화(characterization)를 통하여 확인될 수 있다. 가수분해되지 않은 연결들은 또한, Nguema-Ona et al. (2012)에 의하여 기재된 대로, 특정 탄수화물 연결들에 대향하는 단일클론 항체들을 이용하여, 종합적(comprehensive) 마이크로어레이(microarray) 폴리머 프로파일링(profiling)을 통하여 확인될 수 있다. 몇몇 예들에서, 임의의 하나 또는 그보다 많은 추가의 엔도자일라나제, B-글루코시다제, 만나제(mannanase), 글루코우로니다제(glucouronidase), 자일란 에스테라제, 아밀라제(amylase), 자일로시다제(xylosidase), 글루코우라닐(glucouranyl) 에스테라제, 또는 아라비노퓨라노시다제(arabinofuranosidase)를 이용하여 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제를 추가하는 것이 유리할 수 있다.

몇몇 예들에서, Humbird et al. (2011)에 기재된 대로, 리그노셀룰로스 바이오매스 가공 시설에서 현지에서 효소들을 생산하는 것이 대체하여 유리할 수 있다. 몇몇 예들에서, 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제는 특정 바이오매스 공급원료에 적합한 특이적 효소 활성들의 맞춤형 보충제로 또는 그것 없이, 현장에서 생산될 수 있다.

몇몇 예들에서, 효소 혼합물은 만노시다제들(mannosidases) (EC 3.2.1.25), a-D-갈락토시다제들(galactosidases) (EC 3.2.1.22), a-L-아라비노퓨라노시다제들(arabinofuranosidases) (EC 3.2.1.55), a-D-글루쿠로니다제들(glucuronidases (EC 3.2.1.139), 시나모일(cinnamoyl) 에스테라제들 (EC 3.1.1.-), 또는 페룰로일(feruloyl) 에스테라제들 (EC 3.1.1.73), 아세틸 자일란 에스테라제들 (EC 3.1.1.72); B-1,3 자일로시다제(xylosidase) 활성 (EC 3.2.1.72); 알파 1,3 및/또는 알파 1, 5 아라비노퓨라노시다제 활성 (EC 3.2.1.23); 또는 다른 활성들의 임의의 하나 또는 그보다 많은 것을 더 포함할 수 있다.

매우 낮은 엄격도 레벨들로의 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된 바이오매스의 또다른 아주 놀라운 특징은 발효성 생물들의 억제제로서 작용하는 전처리 부산물들의 농도들이 매우 낮은 레벨들로 유지된다는 것이다. 그 결과, 임의의 세척 또는 다른 해독(de-toxification) 단계를 위한 요구 없이, 본 발명의 방법들에 의하여 얻어지는 가수분해된 바이오매스를 발효에 직접 이용하는 것이 보통 가능하다.

당업계에 알려져 있듯이, 자가가수분해 열수(hydrothermal) 전처리는 보통 이것들이 발효성 생물들의 성장 및/또는 대사를 억제하는 점에서, "발효 억제제들"로서 작동하는 여러가지 수용성 부산물들을 생산한다. 다른 발효 억제제들이 리그노셀룰로스 공급원료의 물성들 및 전처리의 엄격도에 의존하여, 다른 양들로 생산된다. Klinke et al. (2004) 참조. 적어도 세 개의 카테고리들의 발효 억제제들이 보통 자가가수분해 전처리 동안 형성된다: (1) 퓨란들(furans), 주로 모노- 또는 올리고(oligo)-당들(saccharides)로부터의 분해 산물들인 주로 2-푸르푸랄(furfural) 및 5-HMF (5 하이드록시메틸푸르푸랄(hydroxymethylfurfural)) (2) 리그닌 구조의 분해 산물들인, 모노머 페놀들;및 (3) 헤미셀룰로스들인 아세틸 그룹으로부터 유래하는, 작은 유기산들, 주로 아세트산, 및 리그닌. 다른 억제제들의 혼합물은 에탄올성(ethanolic) 대장균(Escherichia coli)을 이용하는, 예컨대 Zaldivar et al. (1999) 참조, 그리고 또한 효모 균주들을 이용하는, 예컨대 Palmquist et al. (1999) 참조, 바이오에탄올 발효에 상승작용적으로(synergistically) 작용하는 것이 보여져 왔다. 몇몇 예들에서, 휘발성 억제제들, 가장 특히 푸르푸랄의 레벨들을 감소시키기 위하여, 당업계에 잘 알려진 방법들을 이용하여, 전처리된 바이오매스를 순간 증발(flash evaporation)에 가하는 것이 유리할 수 있다. 자일란 수 10% 또는 그보다 높게 전처리된, 밀짚, 단수수(sweet sorghum) 바가스, 사탕수수 바가스, 옥수수 대, 및 빈 과실 송이들과 같은 바이오매스 공급원료들의 보통 종류들(strains)로 자가가수분해를 이용하여, 우리의 경험에 의하면 아세트산 및 푸르푸랄 레벨들만이 발효성 생물들을 잠재적으로 억제한다. DM을 조정하기 위하여 첨가된 물로, 그러나 세척 단계들 없이, 바이오매스 공급원료들이 자일란 수 10% 또는 그보다 더 높도록 DM 35% 또는 그보다 높은 데서 전처리될 때, 그리고 고체 분획이 나중에 25% 또는 더 낮은 DM에서 효소적으로 가수분해될 때, 가수분해물 내 푸르푸랄 레벨들은 3 g/kg 밑으로 그리고 9 g/kg 밑 아세트산 레벨들이 보통 유지될 수 있다. 이들 레벨들은 보통 전문화된 종류들(strains)을 이용한 효모 발효에 적합하다. 효소 가수분해 동안, 몇몇 추가의 아세트산이 고체 분획 내 헤미셀룰로스의 분해로부터 방출된다. 몇몇 예들에서, 전기투석 또는 당업계에 알려진 다른 방법들을 이용하여 고체 분획 및/또는 액체 분획으로부터 일부 아세트산 함량을 제거하는 것이 유리할 수 있다.

다른 공급원료들이 반응기 체류 시간들 및 온도들의 여러가지 다른 조합들을 이용하여 자일란 수 10% 또는 그보다 큰 것을 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하는데 충분히 낮은 엄격도 log Ro 로 일(single)-단계 자가가수분해를 이용하여 전처리될 수 있다. 당업자는 보통의(routine) 실험을 통하여, 임의의 정해진 공급원료로, 임의의 정해진 반응기를 이용하여, 그리고 임의의 정해진 바이오매스 반응기-로딩 및 반응기-언로딩(unloading) 시스템으로 적절한 전처리 루틴(routine)을 쉽게 결정할 것이다. 공급원료들이 연속적인 반응기를 이용하여 전처리되고, 수문-시스템 또는 스크류-플러그 공급장치(feeder)에 의하여 로딩되고(load), 그리고 "입자 펌프" 수문 시스템 또는 하이드로사이클론 시스템에 의하여 언로딩(unloaded)될 때, 24 분의 반응기 체류 시간 및 180 ℃의 온도, 또는 18 내지 35 분 범위 내 체류 시간들 및 175 ℃ 내지 185 ℃의 범위 내 온도들, 13 내지 40 분 범위 내 체류 시간들 및 170 ℃ to 190 ℃ 범위 내 온도들에 의하여 밀짚 또는 빈 과실 송이들의 보통 종류들을 이용하여, 10% 또는 그보다 큰 자일란 수의 매우 낮은 엄격도가 달성될 수 있다. 옥수수 대, 사탕수수 바가스, 및 단수수(sweet sorghum) 바가스의 보통 종류들에 대하여, 10% 또는 그보다 큰 자일란 수의 매우 낮은 엄격도가 8 내지 25 분 범위 내 체류 시간들 동안 175 ℃ 내지 185 ℃ 범위 내로, 또는 6 내지 35 분 범위 내 체류 시간들 동안 170 ℃ 내지 190 ℃ 범위 내 온도들을 이용하여 보통 달성될 수 있다. 체류 시간들 및 온도들이 Ro 엄격도의 비슷한 레벨들을 달성하기 위하여 조정될 수 있다는 것이 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.

자일란 수 10% 또는 그보다 높게 전처리된 공급원료들의 효소 가수분해는 보통 고체 분획이 적어도 40% DM까지 압착(press)될 때, 또는 고체 분획의 용해된 고체들 함량이 적어도 50%까지 감소될 때, 특이적 세척 또는 해독(de-toxification) 단계들에의 요구 없이, 상업적으로 합리적인 효소 소모로, 높은 DM > 20% 에서 수행될 수 있다.

몇몇 예들에서, 효소 혼합물은 만노시다제들 (EC 3.2.1.25), a-D-갈락토시다제들 (EC 3.2.1.22), a-L-아라비노퓨라노시다제들 (EC 3.2.1.55), a-D-글루쿠로니다제들 (EC 3.2.1.139), cinnamoyl 에스테라제들 (EC 3.1.1.-), 또는 페룰로일(feruloyl) 에스테라제들 (EC 3.1.1.73), 아세틸 자일란 에스테라제들 (EC 3.1.1.72); B-1,3 자일로시다제(xylosidase) 활성 (EC 3.2.1.72); 알파 1,3 및/또는 알파 1, 5 아라비노퓨라노시다제 활성 (EC 3.2.1.23); 또는 다른 활성들 중 임의의 하나 또는 그보다 많은 것을 더 포함할 수 있다.

당업자는 적용하기 위하여 임의의 정해진 효소 제제의 적당한 용량 레벨, 및 효소 가수분해에 적합한 기간과 마찬가지로 적절한 pH 및 온도 조건들을 쉽게 결정할 수 있다. 전술한 바와 같이, 가수분해 기간은 공정 목표들에 의존하여 다를 수 있다. 더 긴 가수분해는 더 좋은 궁극적인 글루코스 전환 수율들을 이끌지만, 생산 규모에서 더 큰 자본 및 작동 비용들을 지운다. 몇몇 예에서 가수분해 기간은 적어도 24 시간, 또는 적어도 36 시간, 또는 적어도 48 시간, 또는 적어도 64 시간, 또는 적어도 72 시간, 또는 적어도 96 시간, 또는 24 및 150 시간 사이의 시간 동안이다. 효소 비용을 최소화하기 위하여 더 낮은 효소 용량(dose) 레벨들을 유지하는 것이 일반적으로 유리하다. 몇몇 예들에서, 높은 효소 용량을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 방법을 실행하는데 있어, 당업자는 그 지역의 바이오매스 비용, 산물 스트림들(streams)를 위한 시장 가격들, 총 시설(plant) 자본 비용들 및 할부상환(amortization) 계획들, 및 다른 요소들을 포함하는 관련 요인들을 고려할 때 효소 용량의 경제적 최적화를 결정할 수 있다. 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위한 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제가 이용되는 예들에서, 제조업자들에 의하여 제공되는 일반적인 용량 범위는 최적화하려는 것 내인 전반적인 범위를 결정하는데 이용될 수 있다.

몇몇 예들에서, 분리된 고체 분획이 원하는 정도의 전환까지 효소적으로 가수분해된 후, C5 바이패스(bypass) 내 유지되어 왔던 액체 분획이 후(post)-가수분해를 위하여 가수분해물 혼합물과 혼합된다. 다른 예들에서, 액체 분획의 일부 성분이 제거될 수 있고 그리고/또는 액체 분획이 증가하여 첨가될 수 있는 반면, 몇몇 예들에서, 회수된 액체 분획 모두가 동시에 첨가될 수 있다. 몇몇 예들에서, 액체 분획과 혼합하기 전, 고체 분획이 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60% 셀룰로스 전환까지 가수분해되는데, 이는 적어도 글루코스 모노머들의 특이적 이론상 수율이 가수분해물에서 얻어진다는 것을 의미한다. 액체 분획 내 존재하는 자일로-올리고머들의 상당 부분은 보통 가수분해물 혼합물 내 활성으로 남아 있는 다른 효소들 및 자일라나제(xylanase)의 작용에 의하여 자일로스 모노머들로 가수분해될 수 있다. 몇몇 예들에서, 후-가수분해는 적어도 6 시간 동안, 또는 15 및 50 시간 사이의 시간 동안, 또는 적어도 24 시간 동안 수행된다. 몇몇 예들에서, 액체 분획 내 존재하는 자일로-올리고머들의 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90 무게(mass)%가 가수분해물 혼합물 내 활성으로 남아 있는 다른 효소들 및 자일라나제(xylanase)의 작용에 의하여 후-가수분해 동안 자일로스 모노머들로 가수분해된다. 몇몇 예들에서, 액체 분획의 화학적 첨가제들의 추가의 첨가 없이, 가수분해물과 직접적으로 혼합된다. 몇몇 예들에서, 아세트산, 푸르푸랄 또는 페놀들과 같은 액체 분획의 일부 성분들은 가수분해물과 혼합되기 전 액체 분획으로부터 제거될 수 있다.

몇몇 예들에서, 고체 분획의 효소 가수분해 및/또는 액체 분획의 후(post)-가수분해는 동시(simultaneous) 당화(saccharification) 및 발효(fermentation) (SSF) 공정으로서 수행될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있듯이, SSF가 효소 가수분해에 최적인 것과 동일한 온도에서 수행될 수 있을 때, 효소 소모는 최소화될 수 있는데, 이는 효소 가수분해 과정 동안 도입된 발효성 생물이 글루코스 및 자일로스 모노머들를 소모하고 그리고 이로써 효소 촉매화된 반응들의 산물 억제를 감소시키기 때문이다. 몇몇 예들에서, 후(post)-가수분해는, 발효성 생물의 첨가 없이, 적어도 60% 셀룰로스 전환까지 섬유 분획이 가수분해된 후에만 수행된다. 몇몇 예들에서, SSF는 효소 가수분해의 초기 기간 후에 수행될 수 있고, 즉 효소 가수분해의 초기 기간 후 첨가되는 발효성 생물들, 및 발효 및 가수분해 둘 다, 선택적으로 효소 가수분해에 최적이지 않은 온도에서, 계속된다.

자일란 수 10% 또는 그보다 큰 것을 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하기 위하여, 밀짚, 사탕수수 바가스, 단수수(sweet sorghum) 바가스, 옥수수 대 또는 빈 과실 송이들의 보통 종류들과 같은 바이오매스 공급원료들이 충분히 낮은 엄격도 log Ro 로 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 35% 또는 그보다 큰 DM에서 전처리될 때, 전처리된 바이오매스의 고체 분획이 용해되지 않은 고체들의 적어도 50% 제거를 갖는, 또는 적어도 40% DM을 갖는 것으로 수득될 때, 고체 분획이 그 뒤에 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제를 이용하여 15 및 27% 사이의 DM에서 효소 가수분해에 가해질 때, 효소 가수분해가 적어도 48 시간 동안 수행될 때, 적어도 50% 글루코스 전환이 얻어진 후 액체 분획이 고체 분획 가수분해물에 첨가될 때, 그리고 첨가된 액체 분획이 적어도 6 시간의 기간 동안 후(post)-가수분해에 가해질 때, 이론상 최대의 C5 모노머 수율의 60% 또는 그보다 큰 C5 모노머 수율들에 대응하는, 결합된 C5/C6 가수분해물에서의 C5 모노머 농도들을 달성하는 것이 보통 가능하다.

몇몇 예들에서, 결합된 C5/C6 가수분해물은 하나 또는 그보다 많은 변형된 효모 균주들을 이용하여 에탄올로 직접적으로 발효될 수 있다.

도 9는 한 예를 위한 공정 계획을 보여준다.

보여진 대로, 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스가 잠기거나, 세척되거나 또는 DM 35% 또는 그보다 크게 젖는다. 바이오매스는 자일란 수 10% 또는 그보다 큰 것으로 특징되는 엄격도로 일(single)-단계 자가가수분해 내 가압된 스팀을 이용하여 3.5 내지 9.0의 범위 내 pH에서 전처리된다. 전처리된 바이오매스는 DM 함량 40% 또는 그보다 큰 것을 갖는 고체 분획 및 액체 분획을 생산하는 고체/액체 분리에 가해진다. 고체 분획은 적절한 DM 함량으로 조정되고, 그리고 나서 셀룰로스 전환 60% 또는 그보다 큰 정도로 DM 함량 15% 또는 그보다 큰 데에서, 효소 가수분해에 가해진다. 분리된 액체 분획은, 그 뒤에 가수분해된 고체 분획과 혼합되고, 그리고 후-가수분해에 가해지고, 이로써 액체 분획 내 존재하는 상당한 양의 자일로-올리고머들이 모노머 자일로스로 가수분해된다. 기재한 바와 같이 가수분해 및 후(post)-가수분해의 종료 후, C5 모노머 수율은 보통 적어도 60%이고, 반면 셀룰로스 전환은 유사하게 적어도 60%이다.

대체되는 예들에서, 전처리된 바이오매스는 전체 슬러리로서 효소 가수분해에 가해진다. 여전히 다른 예들에서, 액체 분획은 분리되고, 고체 분획은 효소 가수분해 및 그 다음 발효로 가해진다. 몇몇 예들에서, 이러한 발효로부터 하기 에탄올 회수 다음, 남아 있는 딘 스틸레지는 분리된 액체 분획과 블렌딩되고 바이오메탄 기질로서 이용될 수 있다.

실시예들 :

실시예 1. 전처리 엄격도의 척도로서 고체 분획의 "자일란(xylan) 수" 특성화(characterization)

밀짚(WS), 옥수수 대 (CS), 단(Sweet) 사탕수수(sugarcane) 바가스(bagasse) (SCB) 및 빈(Empty) 과실(Fruit) 송이들(Bunches) (EFB) 이 35-50% 건조물에서 전처리 전, 0-10 g 아세트산/kg 건조물 바이오매스, pH > 4.0에 담가졌다. 약 60 kg DM/h 바이오매스이 12-18 분의 체류 시간으로 170 - 200 ℃ 로부터 온도들에서 전처리되었다. 수문 시스템을 이용하여 언로딩(unload)된 전처리된 물질 및 수문 시스템을 이용하여 반응기 내로 바이오매스가 로딩되었다. 가압된 전처리 반응기 내 압력은 사용된 온도에서 포화된(saturated) 스팀의 압력에 대응한다. 전처리된 바이오매스는 스크류 프레스를 이용하여 고체/액체 분리로 가해지고, 약 30% 건조물을 갖는 고체 분획 및 액체 분획을 생산한다. 고체 분획은 약 3 kg 물/kg 건조 바이오매스로 세척되었고 그리고 약 30% 건조물으로 다시 압착됐다(press). 전처리 반응기 및 공정에 대한 상세한 사항들은 Petersen et al. (2009)에 더 기재되어 있다.

미가공(raw) 공급원료들은 Phenomenex로부터의 Rezex Monossacharide H+ 칼럼을 갖춘 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템을 이용하여 Sluiter el al. (2005) 및 Sluiter et al. (2008)에 기재된 방법들에 따라 탄수화물들에 대하여 분석되었다. 액체 분획(fraction) 및 고체 분획의 샘플들은 연속적 전처리의 3시간 후 수집되었고 그리고 샘플들은 정상(steady) 상태 전처리로부터 얻어진다는 것을 보장하기 위하여 3 시간 넘게 3회 수집되었다. 고체 분획들은 Rezex Monossacharide H+ Monosaccharide 칼럼을 갖춘 Dionex로부터 Ultimate 3000 HPLC 시스템으로 Sluiter et al. (2008)에 기재된 방법들에 따라 탄수화물들에 대하여 분석되었다. 액체 분획은 Rezex Monossacharide H+ Monosaccharide 칼럼을 갖춘 Dionex로부터의 Ultimate 3000 HPLC 시스템으로 Sluiter et al. (2006)에 기재된 방법들에 따라 탄수화물들 및 분해(degradation) 산물들에 대하여 분석되었다. 고체 분획의 분해 산물들은 물과 5mM 황산을 1:4 의 비율로 가진 것 내 고체 분획의 현탁물(suspension)에 의하여 분석되었고, 그 다음에 Rezex Monossacharide H+ 칼럼을 갖춘 Dionex로부터의 Ultimate 3000 HPLC 시스템으로 Sluiter et al. (2006)에 기재된 방법들에 따라 분석되었다. 건조물 함량 및 현탁된 고체들의 양은 Weiss et al. (2009)에 기재된 방법들에 따라 분석되었다. 물질(Mass) 밸런스(balances)는 Petersen et al. (2009)에 기재된 대로 설치되었고, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 회수들이 결정되었다. 발광(flashing) 때문에 푸르푸랄의 손실이 해명되지 않는데도 불구하고, 바이오매스 건조물 kg 당 전처리 동안 헤미셀룰로스(hemicelleulose)로부터 방출된 아세테이트(acetate)의 양 및 5-HMF 또는 푸르푸랄으로 분해된 당들의 양이 잘 수량화되었다.

전처리 공정의 엄격도는 Overend et al. (1987)에 의하여 먼저 개발된, 엄격도 인자(factor)에 의하여 보통 기재된다. 엄격도 인자는 보통 log(R0)=t*eksp((T-Tref)/14.75)와 같은 로그(log) 값으로 표현되며, 이때 R₀는 엄격도 인자이고, t는 분(minutes)인 체류 시간이고 , T는 온도이고, 그리고 T_ref 는 참고(reference) 온도로, 보통 100 ℃ 이다. 엄격도 인자는 Belkecemi et al. (1991), Jacobsen and Wyman (2000) 또는 Lloyd et al. (2003)에 의하여 기재된 대로 헤미셀룰로스 가용화(solubilisation)의 동역학(kinetics)에 기초한다. 이런 식으로 전처리의 엄격도는 전처리 후 고체 분획에 남아 있는 잔여 헤미셀룰로스 함량에 관련있다.

기재된 대로 제조되고 세척된 고체 분획들은 Phenomenex로부터의 Rezex Monossacharide H+ 칼럼을 갖춘 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템으로 Sluiter et al. (2008)에 의하여 기재된 방법들에 따라 C5 함량이 분석되었다. 전술한 바와 같이 생산되고 세척된 고체 분획 내 자일란 함량은 열수(hydrothermal) 자가가수분해에 의하여 전처리할 때, EFB의 예를 들어 밀짚, 옥수수 대와 같은 연질 리그노셀룰로스 바이오매스들에 대한 엄격도 인자에 선형적으로 의존한다. 전술한 바와 같이 제조되고 세척된 고체 분획 내 자일란 함량으로서 엄격도의 정의는 전처리 조직들(setups) 사이에서 이동가능하다. 자일란 수는 가용성 물질로부터의 일부 기여를 포함하는 세척된 고체 분획들 내 측정된 자일란 함량이다. 전처리 엄격도 log(Ro)에 대한 자일란 수의 의존은 팜 오일 공정으로부터 밀짚, 옥수수 대, 사탕수수(sugarcane) 바가스 및 빈 과실 송이들에 대하여 도 1에 보여진다.

보여지는 바와 같이, 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된 시험된 바이오매스 공급원료들의 각각을 위한 자일란 수 및 전처리 엄격도 사이의 명확한 음성 선형 상관관계가 존재한다.

실험들에서 용해되지 않은 고체들의 자일란 함량은 또한 이로부터 섬유들(올리고머들 및 모노머들) 사이의 액체에서 용해된(dissolved) 자일란의 함량을 뺀 섬유(fibre) 분획 내 총 자일란 함량으로서 계산되었다.

[섬유(fibres) 내 고체 자일란](wt-%) = [섬유(fibre) 분획 내 총 자일란] (wt-%)- [섬유(fibre) 분획 내 용해된 자일란] (wt-%)

용해된 자일란 함량은 [섬유(fibre) 분획 내 wt%로서 (용해된 고체들/ 총 고체들)] x [액체 분획 내 용해된 자일란 농도]에 의하여 계산된다.

wt% 로 된 용해되지 않은 고체들의 계산된 자일란 함량은 전처리된 밀짚 (PWS), 옥수수 대 (PCS), 사탕수수(sugarcane) 바가스 (SCB) 및 기름 야자나무로부터의 빈 과실 송이들(PEFB)에 대하여 도 2의 자일란 수의 함수로서 보여진다.

실시예 2. 전처리 엄격도의 함수로서 C5 회수.

바이오매스 공급원료들은 전처리되었고 실시예 1에 기재된 대로 샘플들이 특성화되었다. 도 3은 밀짚이 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 전처리되었을 때 시험들을 위한 자일란 수의 함수로서 C5 회수들 (자일로스 + 아라비노스) 를 보여준다. C5 회수들은 물(water) 불용성(insoluble) 고체들(solids) (WIS), 물(water) 가용성(soluble) 고체들(solids) (WSS) 및 총 회수로서 나타나진다. 보여진 바와 같이, 자일란 수가 증가하면서 물 불용성 및 물 가용성 고체들 둘 다로서 C5 회수가 증가한다. 자일란 수가 10% 넘게 증가하면서, 물 불용성 고체들로서의 C5 회수가 계속해서 증가하는 반면, 물 가용성 고체들로서의 C5 회수는 줄어든다.

시험된 밀짚의 보통 종류들은 전처리 전 건조물 기준(basis) 상 약 27% 헤미셀룰로스를 함유하였다. 도 4는 자가가수분해에 의하여 전처리된 EFB, 사탕수수(sugarcane) 바가스, 옥수수 대 및 밀짚에 대하여 자일란 수의 함수로서 전처리 후 총 C5 회수를 보여준다. 시험된 옥수수 대, 단(sweet) 사탕수수(sugarcane) 바가스 및 EFB의 보통 종류들은 전처리 전 건조물 기준으로 각각 C5 함량의 약 25%, 19% 및 23% 를 함유하였다. 보여진 바와 같이, 모든 공급원료들에 대하여, 전처리 후 총 C5 회수는 전처리된 바이오매스의 자일란 수에 의하여 정의된 대로의 전처리 엄격도에 의존한다. 보여진 바와 같이, 전처리 후 회수되는 C5 함량의 90%가 C5 모노머로 완전히 가수분해될 수 있을 때, 전처리 엄격도가 10% 또는 그보다 더 높은 자일란 수를 생산함으로써 특징될 때 효소 가수분해 후 적어도 60% 최종 C5 모노머 수율이 보통 예상될 수 있다.

실시예 3. 전처리 엄격도의 함수(function)로서 효모 성장 및 효소들을 억제하는 분해 산물들의 생산

바이오매스 공급원료들은 전처리되고 샘플들은 실시예 1에 기재된 대로 특징되었다. 도 5는 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 밀짚이 전처리 될 때 실험들에 대한 자일란 수의 함수로서 푸르푸랄 및 5-하이드록시(hydroxy)-메틸(methyl)-푸르푸랄(fufural) (5-HMF)의 생산 및 아세트산 방출의 의존성을 보여준다. 보여진 바와 같이, 발효성 효모를 억제하는 것으로 잘 알려진, 그리고 경우에 따라서는 셀룰라제 효소들 또한 억제하는, 이들 분해 산물들의 생산은 10% 보다 더 낮은 자일란 수들에서 기하급수적(exponential) 증가를 보인다. 자일란 수 10% 및 그보다 높은 데서, 푸르푸랄 및 아세트산의 레벨들은 해독(de-toxification) 단계들의 요구 없이 전처리된 바이오매스의 발효를 허용하는 범위들 내에 속한다. 아세트산의 경우에, 레벨들은 자일란 수 10% 및 그보다 높게, 그러나(although) 보통 C5 및 C6 당들 둘 다를 소모하도록 변형된 효모에 의하여 잘 견디는 레벨들로, 레벨들은 전처리된 바이오매스의 효소 가수분해 동안 더 증가된다.

실시예 4. 고체 분획의 DM%의 함수로서, 고체 분획 내 남아 있는 물질에 의한 셀룰라제 효소들의 억제.

실험들은 WO2006/056838에 기재되고 이용된 6-챔버(chamber) 반응기에서 수행되었다. 6-챔버 가수분해 반응기는 20 % DM을 넘는(over) 고체 농도들에서 액화 및 가수분해로 실험들을 수행하기 위하여 설계되었다. 반응기는 각각 24 cm 넓이 및 50 cm 높이인 6 개의 분리된 챔버들로 나누어지는, 수평으로(horizontally) 위치한 드럼(drum)으로 구성된다. 각 챔버 내 3 개의 패들들(paddles)로 고정되는(mounted) 수평의 회전(rotating) 축(shaft)은 혼합(mixing)/교반(agitation)에 사용된다. 1.1 kW 모터가 구동 장치(drive)로서 사용되고, 그리고 회전 속도는 2.5 및 16.5 rpm의 범위 내에서 조정가능하다. 회전(rotation) 방향은 시계방향 및 반시계 방향 사이의 모든 초(second) 분(minute)로 바꾸도록 프로그램된다. 밖의 물-채워진 가열 자켓(jacket)은 80 ℃까지의 온도의 통제를 가능하게 한다.

실험들은 실시예 1에 기재된 시스템을 이용한 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된, 밀짚을 이용하였다. 바이오매스는 DM of > 35% 으로 적셔지고, 그리고 자일란 수 10.5%을 갖는 전처리된 물질을 생산하는, 엄격도 log Ro 거의 3.7 로 스팀에 의하여 pH > 4.0 에서 전처리되었다. 전처리는 Skærbæk, Denmark의 Inbicon 파일럿(pilot) 시설(plant)에서 수행되었다. 바이오매스는 수문 시스템을 이용하여 전처리 반응기 내로 로딩되었고, 그리고 전처리된 바이오매스는 수문 시스템을 이용하여 반응기로부터 제거되었다. 전처리된 바이오매스는 몇몇 경우에, 액체 분획(fraction) 및 고체 분획을 생산하는, 스크류 프레스를 이용하여 고체/액체 분리에 가해진다. 고체 분획은 초기 셀룰로스 및 리그닌의 다수, 헤미셀룰로스의 일부분 및 용해된 고체들의 총 약 25% 를 포함한, 약 30%의 DM 함량을 가졌다.

6 챔버 반응기의 챔버들은 총 용해된 고체들의 약 25%를 포함하는 압착된(pressed) 고체 분획 또는 모든 용해된 그리고 용해되지 않은 고체들을 포함하는 총 전처리된 바이오매스로 채워졌다. 건조물 함량은 19 % DM으로 조정되었다. 전처리된 바이오매스는 그 다음에 Dupont, Genencor로부터 0.2-0.3 ml Accellerase TRIO ™ / g 글루칸 또는 Novozymes로부터 0.08 ml CTec2 ™ / g 글루칸을 이용하여 50 ℃ 및 pH 5.0 내지 5.3 에서 가수분해되었다. 리그노셀룰로스 바이오매스을 위하여 최적화된 이들 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들의 이들 용량(dose) 레벨들은 제조업자들에 의하여 제안된 범위 내였다. 효소 가수분해 실험들은 6 rpm의 혼합 속도로 96 시간 동안 수행되었다.

전술한 대로 측정된 대로 Accellerase TRIO 로 한 실험에서 효소 활성들이 처음에 엑소글루카나제 280-5000 nkat/g 글루칸, 엔도글루카나제 1100-20000 nkat/g 글루칸, β-글루코시다제 3000-25000 nkat/g 글루칸, 엔도자일라나제 1400-30000 nkat/g 글루칸, β-자일로시다제 75-25000 nkat/g 글루칸 nkat/g 글루칸 범위 내였다는 것이 보여질 수 있다.

도 6은 효소 가수분해 전 제거된 % 용해된 고체들의 함수로서 이들 조건들 하 효소 가수분해 후 셀룰로스 전환을 보여준다. 보여진 대로 이들 효소 용량(dose) 레벨들에서 75% 용해된 고체들의 제거는 절대치로 본다면, 10-20% 만큼 셀룰로스 전환이 개선된다. 이런 식으로, 효소 가수분해가 분리된 고체 분획을 이용하여 수행될 때, 이것이 보통 개선된 효소 수행을 제공할 것이므로, 고체 분획을 적어도 40% DM 함량으로 가압(press)하는 것 또는 그렇지 않으면 효소 가수분해 전 적어도 50%만큼 용해된 고체들 함량을 감소시키는 것이 유리하다.

실시예 5. 자일란 수 > 10% 로 전처리된 바이오매스로부터의 액체 분획(fraction)의 가수분해 및 당 함량.

밀짚, 옥수수 대, 및 사탕수수 바가스는 자일란 수 11.5%를 갖는 전처리된 밀짚 (WS)을 생산하는 엄격도 log Ro 3.63로, 자일란 수 12.3%를 갖는 전처리된 사탕수수 바가스 (SCB)을 생산하는 log Ro 3.51로, 그리고 자일란 수 15.5%를 갖는 전처리된 옥수수 대 (CS)를 생산하는 log Ro 3.35으로 전처리되었다. 전처리된 공급원료들은 실시예 4에 기재된 바와 같이, 고체/액체 분리에 가해져 액체 분획(fraction) 및 고체 분획을 생산하였다. 액체 분획(fractions)들은 Rezex Monosaccharide 칼럼을 갖춘 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템을 이용하여 (Sluiter, Hames et al. 2005)에 기재된 방법들에 따라 탄수화물들 및 분해 산물들이 분석되었다. 표 2는 올리고머 및 모노머 글루코스/글루칸, 자일로스/자일란 및 아라비노스/아라비난(arabinan)의 카테고리들로 나뉜 DM 함량의 퍼센트로서 표현된 액체 분획(fractions)들의 당 함량을 보여준다. 보여진 바와 같이, 일부 글루코스 함량이 모노머 및 올리고머 형태 모두로 존재하는 반면, 당 함량의 대부분은 올리고머(oligomeric)인 자일란이다. 자가가수분해를 이용하여 수득된 액체 분획 내 자일란 올리고머들의 우세는 희산 전처리를 이용하여 수득된 액체 분획과는 알려진 대조이다. 희산 열수(hydrothermal) 전처리에 의하여 전처리된 바이오매스에서, 액체 분획는 보통 산 촉매의 작용에 의하여 모노머 구성성분들로 가수분해된다.

자일란 수 >10%으로 전처리된 바이오매스에서 액체 분획(fractions)들의 당 함량.

전처리된 밀짚으로부터의 액체 분획은 나아가 모듈식 Dionex ICS-5000 크로마토그래피(chromatographic) 시스템을 이용하여 Thermo Scientific Dionex CarboPacTM PA200 칼럼을 이용한 HPLC 분석에 의하여 특징되었다. 분석물질들(analytes)은 NaOH/NaOAc-구배(gradient) 조건들(conditions)을 이용하여 분리되었고, 그리고 금 전극을 이용하여, 통합되고(integrated) 펄스된(pulsed) 전류측정(amperometric) 감지(detection) (IPAD)에 의하여 측정되었다. 도 7은 자일로비오스(xylobiose) (X₂), 자일로트리오스(xylotriose) (X₃), 자일로테트라오스(xylotetraose) (X₄), 자일로펜타오스(xylopentaose) (X₅), 및 자일로헥사오스(xylohexaose) (X₆) 표준들이 액체 분획의 용리 프로파일을 묘사하는(depict), 더 낮은 기록(trace)을 넘는(over) 더 높은 기록으로서 덧붙여진(super-imposed), HPLC 크로마트로그램을 보여준다. 보여지는 대로, 자가가수분해된 바이오매스 내 액체 분획은 다른 물질들과 함께 소량의 자일로스 모노머 및 비교적 더 많은 양의 자일로비오스(xylobiose) (X₂), 자일로트리오스(xylotriose) (X₃), 자일로테트라오스(xylotetraose) (X₄), 자일로펜타오스(xylopentaose) (X₅), 및 자일로헥사오스(xylohexaose) (X₆)을 포함하는 혼합물을 포함한다.

실시예 6. 고체 분획의 효소 가수분해 및 자일란 수 > 10%로 전처리되고 > 40% DM로 압착(press)되고 뒤이어 후(post 가수분해)된 바이오매스로부터 섬유(fibre) 가수분해 후 액체 분획의 첨가.

실험들은 실시예 4에 기재된 바와 같이 6-챔버 자유낙하(free fall) 반응기 내에서 수행되었다.

실험들은 11.5 부터 15.6% 까지의 범위의 자일란 수들을 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하기 위하여 약 3.19 및 3.73 사이의 엄격도 log Ro 로 일(single)-단계 자가가수분해에 의하여 전처리된 밀짚, 옥수수 대, 또는 사탕수수 바가스를 이용하였다. 바이오매스는 절단되고 DM of > 35%으로 젖어졌으며, 12 분 동안 170 - 190 ℃에서 스팀에 의하여 전처리되었다. 전처리는 덴마크, Skærbæk 의 Inbicon 파일럿 시설에서 수행되었다. 전처리된 바이오매스는 스크류 프레스를 이용하여 고체/액체 분리에 가해져 > 40% DM을 갖는 고체 분획을 생산하였다. 액체 분획은 그 뒤에 가수분해물 (후가수분해(posthydrolysis))되기 위하여 남겨두었다(C5 바이패스).

6 챔버 반응기의 챔버들은 약 10 kg 압착된(pressed) 전처리된 바이오매스 고체 분획으로 채워지고, 그리고 19-22 % DM로 물 첨가에 의하여 조정되었다. 전처리된 고체 분획은 GENENCOR-DuPONT의 ACCELLERASE TRIO ™을 이용하여 50 ℃ 및 pH 5.0 내지 5.3 에서 가수분해되었다. 혼합 속도는 6 rpm이었다. 가수분해 실험들은 96 시간 동안 운영되었고, 그 후 남겨진 액체 분획(fraction) (C5 바이패스)이 첨가되었고 후(post) 가수분해가 50 ℃ 및 pH 5.0 내지 5.3 에서 48 시간 동안 운영되었다.

HPLC 샘플들은 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 전환을 따르기 위하여 매일 취해졌고, 외부 표준의 사용을 통한 정량화(quantification)와 함께 Rezex Monosaccharide 칼럼을 갖춘 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템을 이용하여 글루코스, 자일로스 및 아라비노스가 분석되었다.

도 8은 자일란 수 12.3% 로 전처리되고, g 글루칸 당 0.3 ml Accellerase Trio ™ (Genencor) 을 이용하여 가수분해된, 사탕수수 바가스를 이용하여 고체 분획의 96 시간 가수분해 후 액체 분획의 첨가와 함께 헤미셀룰로스의 전환을 위한 가수분해 데이터를 보여준다. 보여지는 것은 보통의 가수분해 프로파일이다. C5 모노머 회수는 가수분해 반응에 존재하는 물질로부터의 이론상 수율의 퍼센트로서 나타내어진다. 고체 분획 내 헤미셀룰로스의 대부분은 고체 분획의 가수분해에서 처음 24 시간 내의 모노머 당들로 분해되어 왔다. 96 시간 후 액체 분획의 첨가는 이론상 잠재 수율을 증가시키는데, 이는 액체 분획이 첨가된 직후 관찰된 C5 전환의 하락을 설명한다. 처음 24 시간 내에, 액체 분획으로부터 C5의 대부분은 모노머들로 전환된다. 액체 분획 바로 전 C5 전환이 가수분해의 종료점에 첨가되는 것과 비교할 때, 이들 조건들 하 사탕수수 바가스를 이용할 때, 90 % 로 액체 분획에서의 C5 전환을 계산하는 것이 가능하다.

표 3은 다른 상황들 하 전처리되고, 그리고 리그노셀룰로스 바이오매스 전환, Accellerase Trio ™ (Genencor)를 위하여 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제의 다른 용량(dose) 레벨들을 이용하여 가수분해된 다른 바이오매스들에 대한 가수분해 데이터를 보여준다. 사용된 모든 효소 용량(dose) 레벨들은 제조업자에 의하여 제안된 범위 내였다. 보여진 바와 같이, 일(single)-단계 자가가수분해 및 C5 바이패스로 하는 효소 가수분해 및 후(post)-가수분해를 이용하는 것은, 60% 또는 그보다 더 큰 셀룰로스 전환을 여전히 달성하는 반면, 60% 또는 이보다 큰 C5 모노머 수율들은 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들의 추천되는 제조업자들의 용량들을 이용하여 달성될 수 있다.

여기에 기재된 대로 측정된 Accellerase TRIO로 하는 표 3 내 언급된 실험들에서 효소 활성들은 초기에 엑소글루카나제 280-5000 nkat/g 글루칸, 엔도글루카나제 1100-20000 nkat/g 글루칸, β-글루코시다제 3000-25000 nkat/g 글루칸, 엔도자일라나제 1400-30000 nkat/g 글루칸, β-자일로시다제 75-25000 nkat/g 글루칸 nkat/g 글루칸의 범위 내에 있었다.

C5 바이패스로 하는 매우 낮은 엄격도 일(single)-단계 자가가수분해를 이용한 가수분해 수율들 및 후(post)-가수분해.

실시예 7. 변형된 효모에 의하여 결합된 가수분해물 내 C5 및 C6 당들의 에탄올로의 공(co)-발효.

자일란 수 > 10%로의 일(single)-단계 자가가수분해 전처리에 의하여 제조된 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스 (이 경우 밀짚)로부터 생산된 가수분해물의 이용에 대한 예로써, 도 9는 C5 및 C6 당들 둘다로 전환되는 것이 가능한 GMO 효모로 발효 전(TERRANOL ™으로부터 균주 V1), 해독 또는 임의의 다른 공정 단계들 없이 수행된 발효에 대한 데이터를 보여준다. 실시예 4에 기재된 대로 분리된 전처리된 밀짚으로부터의 고체 분획은 Novozymes로부터의 Cellic Ctec2 ™을 이용하여 가수분해되었고, 그리고 그 다음에 남겨진 액체 분획과 결합되었고 그리고 발효 억제제들을 제거하기 위한 임의의 해독(de-toxification) 없이 사용되었다.

가수분해물은 발효 전 KOH 펠렛들으로 pH 5.5 로 조정되었고 그리고 3 g/L 우레아(urea)로 보충되었다. 발효는 뱃치(batch) 발효로 수행되었다. 반응기 내 초기 세포 농도는 0.75 g dw/L이었다. 발효는 10% NH3의 자동적인 첨가를 이용하여 pH 5.5 에서 통제되었다. 온도는 30 ℃에서 유지되었고, 젓는(stirring) 속도는 300 rpm이었다. 보여지는 대로, 전처리 엄격도의 더 높은 레벨들에서 보통 억제성인 것으로 드러난 아세트산, 푸르푸랄 및 다른 화합물들의 존재에도 불구하고, 글루코스 및 자일로스는 순조롭게 소모되고 에탄올은 순조롭게 생산된다.

실시예 8. 상업적 셀룰라제 제제들에 있어 활성 레벨들의 실험적 결정.

NOVOZYMES ™로부터 CELLIC CTEC2 ™ 및 CELLIC CTEC3 ™ 및 GENENCOR ™로부터 ACCELLERASE TRIO ^TM의 상업적 제제들이 희석되어 효소 제제들이 등가의(equivalent) 밀도(density)를 갖게 되었는데, 이는 등가의 사이즈의 부분표본들(aliquots)이 등가의 질량(mass)을 갖는다는 것을 의미한다. 희석된 효소 제제의 등가의 부피들이 첨가되었고 분석 결정들이 2회 또는 3회 이루어졌다.

CBHI (엑소셀룰라제(exocellulase)) 활성의 분석은 25 분 동안 pH 5, 25 ℃에서 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 그 다음 모델 기질 4-메틸움벨리페릴(methylumbelliferyl)-β-셀로비오사이드(cellobioside)로부터 4-메틸움벨리페론(Methylumbelliferon) 방출 (Abs: 347nm) 의 연속적인 속도에 의하여 3회로 결정되었다. 활성 단위(unit)은 1 umole MeUmb 등가물(equivalent)/분이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에서 각각 0.16, 0.14, 0.17mg/ml이었다. 기질 농도는 0.5mg/ml 이었다.

엔도-1,4-β-글루카나제 활성의 분석은 60 분 동안 pH 5; 50 ℃, 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 Avicel PH-101로부터 환원성 말단의 생성(generation)과 관련된, 그 다음의 흡수력 변화에 의하여 3 회로 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 글루코스 등가물(equivalent)/분(min)이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 0.80, 0.67, 0.79 mg/ml 이었다. 기질 농도는 80 mg/ml이었다.

β-글루코시다제 활성 분석은 20 분 동안 pH 5; 50 ℃에서, 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 셀로비오스(cellobiose)로부터 글루코스의 방출과 관련된, 그 다음의 흡수력 변화에 의하여 3회로 결정되었다. 활성 단위는 2 μmole 글루코스/분(min)이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에 대하여 각각 0.1, 0.12, 0.12 mg/ml 이었다. 기질 농도는 1.7 mg/ml이었다.

엔도-1,4-β-xylanase 활성의 분석은 60 분 동안 pH 5; 50 ℃에서, 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 물 추출가능한 아라비노자일란(arabinoxylan)으로부터 환원성 말단들의 발생과 관련된 그 다음의 흡수력 변화에 의하여 3회로 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 글루코스 등가물(equivalent)/분이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에서 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml 이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.

β-자일로시다제 활성의 분석은 60 분 동안 pH 5; 50 ℃에서 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 물 추출가능한 아라비노자일란(arabionxylan)의 가수분해와 관련된, 자일로스의 그 다음의 방출에 의하여 3회로 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 자일로스/분(min)이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에서 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml 이었다. 기질 농도는 10 mg/ml 이었다.

β-L-아라비노퓨라노시다제 활성의 분석은 60 분 동안 pH 5; 50 ℃에서 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 물 추출가능한 아라비노자일란의 가수분해와 과 sfus한 아라비노스(arabinoase)의 그 다음의 방출에 의하여 3회로 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 아라비노스/분이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에서 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml 이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.

아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase) (AMG) 활성의 분석은 80 분 동안 pH 5; 50 ℃에서 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 가용성 옥수수 전분로부터 글루코스 방출과 관련된, 그 다음의 흡수력 변화에 의하여 3회로 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 글루코스/분이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에서 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.

알파(α)-아밀라제 활성의 분석은 60 분 동안 pH 5; 50 ℃에서, 50 mM NaOAC 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 가용성 옥수수 전분으로부터 환원성 말단들의 발생과 관련된, 그 다음의 흡수력 변화에 의하여 3회로 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole 글루코스 등가물(equivalent)/분이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에서 각각 1.12, 0.97, 1.12 mg/ml이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.

아세틸 자일란 에스테라제 활성의 분석은 25 분 동안 pH 5; 25 ℃에서 100 mM 숙시네이트(succinate) 버퍼에서 수행되었다. 활성은 모델 기질 4 4-나이트로페닐(Nitrophenyl) 아세테이트(acetate)로부터 4-나이트로페닐(Nitrophenyl) 방출 (Abs: 410 nm)의, 그 다음의 연속적 속도에 의하여 3회로 결정되었다. 활성 단위는 1 μmole pNP 등가물(equivalent)/분이었다. 효소 제제 농도들은 CTEC3, ACTrio, 및 CTEC2 분석들에서 각각 0.48, 0.42, 0.51mg/ml이었다. 기질 농도는 10 mg/ml이었다.

활성 결정들의 결과들은 표 1에 나타나 있다.

이들 결과들은 효소 제제들 사이의 질적인 비교를 제공하지만, 그러나 대부분의 경우들에는 여기에서 청구항들의 목적들을 위한 효소 활성들의 nkat 값들을 결정하는데 사용되는 방법들에 따라 수행되지 않는다.

실시예 9. 낮은 엄격도, 일(single) 단계(stage) 자가가수분해에 의하여 전처리된 공급원료의 효소 가수분해에서 높은 C5 모노머 수율을 달성하는데 중요한 효소 활성들의 확인.

밀짚은 엄격도 log Ro 3.52 (12 분의 체류 시간 동안 183 ℃)로 실시예 4에 기재된 대로 전처리되어, 도 2에서 추정한대로, 용해되지 않은 고체들 내 남아 있는, 거의 7.8 중량% 자일란으로, 자일란 수 13.5%를 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하였다. 전처리로부터 글루칸 회수는 100%이었다. 전처리로부터 자일란 회수는 77%였다.

여과지(Filter Paper) 단위들(Units) (FPU)로 나타내는 셀룰라제 활성 측정들(measurements)은 3 개의 분리된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 효소 제제들, GENENCOR ™로부터 ACCELLERASE TRIO ^TM, NOVOZYMES ™으로부터 CELLIC CTEC3 ™, 및 각각 1:0.2 의 중량비로 혼합된 CELLUCLAST 및 NOVOZYMES ™로부터의 NOVOZYME 188의 혼합물에 대하여 결정되었다. FPU 활성들은 Ghose (1987)의 방법에 의하여 결정되었고, CTEC3에 대하여 179 FPU/g 효소 제제 및 CELLUCLCAST/188에 대하여 60 FPU/g 효소로 발견되었다.

초기 건조물 함량이 22% DM였고, 1 wt% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 첨가되었고, 고체 분획의 초기 가수분해가 94 시간 동안 수행되었고, 첨가된 액체 분획(fraction) (C5 바이패스)을 갖는 후가수분해(posthydrolysis)이 50 시간 동안 수행되었고, 그리고 사용된 효소는 14.3 FPU/g 글루칸의 FPU/g 글루칸에 등가 용량(dose)으로 적용된 CTEC3, ACTRIO, 또는 CELLUCLAST/188 이었다는 점을 제외하면, 가수분해 실험들은 기본적으로 실시예 6에 기재된 대로 수행되었다.

적용된 효소들의 실제 용량(dose)은 CTEC3 0.08 g/g 글루칸, AcTRIO 0.24 g/g 글루칸, CELLUCLAST/188 0.22 g/g 글루칸 이었다.

실험에서 사용된, 여기에 기재된 대로 측정되는, nkat/g 글루칸으로 나타낸 효소 활성들이 하기에 추정되었다:

+ Juhasz et al. (2005)에 의하여 보고된 값들에 기초한다.

a 기질로서 4-메틸움벨리페릴(methylumbelliferyl)-베타(beta)-셀로비오사이드(cellobioside)를 이용하여 측정된다.

b. 기질로 카복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose) (CMC)를 이용한 최소 엔도글루카나제 값을 보고하고, 예를 들어 by Dori et al. (1995)에 의하여 보고된 것과 같이, 하이드록시에틸셀룰로스(hydroxyethylcellulose)에 대응하는 값이 거의 0.35 배 CMC 값이라는 것을 추정하는, ACCELLERASE TRIO 제품 정보 시트에 기초한다.

c 최소 값들을 보고하는 ACCELLERASE TRIO 제품 정보 시트에 기초한다.

d. g 효소 제제 당 3.86:1의 Trio:Celluclast을 비교하는 자일로시다제(xylosidase) 활성의 대체하여 측정한 비율에 기초한다.

e. g 효소 제제 당 3.12:1 의 CTEC3:TRIO 을 비교하는 엔도글루카나제 활성의 대체하여 측정한 비율에 기초한다.

f. g 효소 제제 당 3.76:1 의 CTEC3:TRIO을 비교하는 베타-글루코시다제 활성의 대체하여 측정한 비율에 기초한다.

여기에 기재된 대로 측정된 이들 실험들에서 효소 활성들이 초기에 엑소글루카나제 280-1240 nkat/g 글루칸, 엔도글루카나제 1100-8000 nkat/g 글루칸, β-글루코시다제 3000-15000 nkat/g 글루칸, 엔도자일라나제 9000-30000 nkat/g 글루칸, β-자일로시다제 75-1400 nkat/g 글루칸 nkat/g 글루칸 범위 내였다는 것이 보여질 수 있다.

도 11은 다른 반응 챔버들에서 시간의 함수로서 셀룰로스 전환을 보여준다. 셀룰로스 전환은 샘플이 취해지는 때 이론상 글루코스 잠재성(potential)에 의하여 나누어지는 글루코스 농도로서 결정된다. C5 바이패스가 첨가될 때 바이패스로서 글루코스 잠재적(potential) 변화들은 종합적인 전환 감소를 야기하는, 소화되지 않은 소량의 글루코스 올리고머들을 포함한다. 보여진 대로, 셀룰로스 전환 동역학(kinetics)은 CTEC 및 TRIO 챔버들에서 등가이나, CELLUCLAST/188 챔버에 대하여는 그렇지 않다. 이는 자일라나제(xylanase) 및 자일로시다제(xylosidase) 활성의 눈에 띄게 더 낮은 레벨들에 기인한다.

도 12는 시간의 함수로서 상응하는 자일란 전환을 보여준다. 자일란 전환은 셀룰로스 전환에 대한 것과 동일한 방식으로 계산되나, C5-바이패스가 많은 양의 자일로스 올리고머들을 포함하기 때문에, C5-바이패스가 가수분해물에 첨가될 때 전환은 초기에 극적으로 낮아진다. 보여지는 바와 같이, 자일란 전환 동역학(kinetics)은 CTEC 및 TRIO 챔버들에 대하여 등가이나, CELLUCLAST/188 챔버에 대하여는 그렇지 않다. 이는 자일라나제(xylanase) 및 자일로시다제(xylosidase) 활성의 눈에 띄게 더 낮은 레벨들에 다시 기인한다.

전처리로부터 자일란 회수가 77%일 때, 도 12에 나타난 자일란 회수들은 가수분해물 내 매우 높은 최종적인 C5 모노머 회수에 대응하는데, 예를 들어, 도 12에서 80% 전환은 (0.80)*(0.77)= 61.6% C5 모노머 회수에 대응한다.

글루칸 및 자일란은 Sluiter, A., B. Hames, et al. (2005). Determination of Sugars, Byproducts, and Degradation Products in Liquid Fraction Process Samples, NREL - Biomass Program and in Sluiter, A., B. Hames, et al. (2006). Determintation of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass, NREL- Biomass Program에 기재된 대로 결정된다.

실시예 10. 더 낮은 건조물의 희석은 전체 슬러리를 이용한 더 낮은 효소 용량(dose)에서 등가의 전환 수율을 가능하게 한다.

실시예 9에 기재된 실험들에서, 6-챔버의 가수분해 반응기의 2 개의 챔버들은 전체 슬러리의 가수분해를 비교하는데 사용되었는데, 여기에서 전처리 후 고체 분획으로부터 분리된 액체 분획이 가수분해물에 나중에 첨가될 바이패스로서 남겨지지 않았고, 대신 고체 분획과 다시 블렌딩되었고 동시에 가수분해되었다. 전체 슬러리는 12% DM로 희석되었는데, 이는 억제성 용해된 성분들을, 용해된 고체들이 제거되고 22% DM에서 고체 분획의 가수분해로부터 분리되어 가져가지는(C5 바이패스), 실시예 9에서 기재된 반응에서 달성된 것과 거의 등가로 만든다. CTEC3 및 ACTRIO은 효소 제제로서 사용되었고 10.7 FPU/g 글루칸의 더 낮은 용량(dose)에서 적용되었다.

여기에서 기재된 대로 측정되는, 실험에서 사용된, nkat/g 글루칸로 나타나는 효소 활성들은 (실시예 9에 주어진 값들에 기초하여) 하기와 같이 추정되었다:

여기에서 기재된 대로 측정된 이들 실험들에서 효소 활성들은 초기에 엑소글루카나제 280-1240 nkat/g 글루칸, 엔도글루카나제 1100-8000 nkat/g 글루칸, β-글루코시다제 3000-15000 nkat/g 글루칸, 엔도자일라나제 9000-30000 nkat/g 글루칸, β-자일로시다제 75-1400 nkat/g 글루칸 nkat/g 글루칸의 범위 내였다는 것이 보여질 수 있다.

도 13은 전체 슬러리 가수분해 샘플들 둘 다에 대하여 시간의 함수로서 셀룰로스 전환을 보여준다. 셀룰로스 전환은 실시예 9에 기재된 대로 결정된다. 보여진 대로, 셀룰로스 전환 동역학(kinetics)은 CTEC 및 TRIO 챔버들에 대하여 등가이다. 나아가 더 낮은 효소 용량에도 불구하고, 전환 레벨들은 실시예 9에 기재된 대로, C5 바이패스 및 후가수분해로 달성되는 그것들과 등가이다.

도 14는 전체 슬러리 가수분해 샘플들 둘 다에 대한 시간의 함수로서 대응하는 자일란 전환을 보여준다. 보여진 대로, 자일란 전환 동역학(kinetics)은 CTEC 및 TRIO 챔버들에 대하여 거의 등가이다. 전처리로부터 자일란 회수가 77%일 때, 도 14에 나타난 자일란 회수들은 가수분해물의 매우 높은 최종 C5 모노머 회수에 대응하는데, 예를 들어, 도 12에서의 80% 전환은 (0.80)*(0.77)= 61.6% C5 모노머 회수에 대응한다. 보여지는 바와 같이, 전체 슬러리 가수분해에서, 도 14의 71% 자일란 전환에 대응하는, 적어도 55%의 매우 높은 C5 모노머 회수들은 이들 조건들 하 41 시간 가수분해 내에서 달성된다.

실시예 9 및 10에서 기재된 실험들을 위한 전처리, 가수분해 및 회수의 다른 파라미터들이 표 4에 나타나 있다.

매우 낮은 엄격도 일(single)-단계 자가가수분해를 이용한 가수분해 수율들.

실시예 11. 전처리된 사탕수수 바가스의 전체 슬러리 가수분해.

사탕수수(sugar cane) 바가스는 엄격도 log Ro 3.43 (12 분의 체류 시간 동안 180 ℃)로 실시예 4에 기재된 대로 전처리되어, 도 2에 추정된 대로, 용해되지 않은 고체들 내 남아 있는 거의 6.8 중량% 자일란으로, 자일란 수 12.0%를 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하였다. 전처리로부터 자일란 회수는 83%이었다. 반응기를 떠난 후,슬러리는 거의 57 %의 섬유(fibre) 분획 및 액체 분획으로 압착(press)되었다. 액체 분획과 마찬가지로, 전처리된 물질, 섬유(fibre) 분획은 수집되었고 분석되었다. 건조물 및 샘플들의 조성물은 앞의 실시예들에 기재된 대로 결정되었다.

실험들은 실시예 6에 기재된 6-챔버 반응기에서 수행되었다. 전처리된 바가스는 전체 슬러리 혼합물로서 사용되었는데, 이때 섬유 분획은효소 첨가 전 액체 분획과 혼합되었다. 건조물 함량은 그 다음에 18 wt-% DM으로 물로 조정되었다. 가수분해는 20 wt-% 칼슘(calcium) 하이드록사이드(hydroxide) 용액 (Ca(OH)2)의 사용으로 4.7 및 5.3 사이로 조정된 pH로 50 ℃에서 수행되었다. Accellerase Trio는 0.16 mL/g 글루칸 (9.5 FPU/g 글루칸)의 농도로 효소로서 사용되었다. 매일 샘플이 취해지고 당 함량이 분석되었다. 118 시간(h) 후 가수분해가 멈춰졌다. 실험들은 이중(double) 결정(determination)으로 수행되었다.

실험에서 사용된, 여기에 기재된 대로 측정되는, nkat/g 글루칸로 나타난 효소 활성들은 하기와 같이 초기에 (실시예 9에서 주어진 값들에 기초하여) 추정되었다:

여기에 기재된 대로 측정된 이들 실험들의 효소 활성들이 초기에 엑소글루카나제 nkat/g 글루칸, 엔도글루카나제 nkat/g 글루칸, β-글루코시다제 nkat/g 글루칸, 엔도자일라나제 nkat/g 글루칸, β-자일로시다제 nkat/g 글루칸 nkat/g 글루칸의 범위 내였다는 것이 보여질 수 있다.

이 실시예들 11에 기재된 실험들을 위한 전처리, 가수분해 및 회수의 다른 파라미터들은 표 5에 보여진다.

매우 낮은 엄격도 일(single)-단계 자가가수분해를 이용한 가수분해 수율들.

도 15는 바가스의 전체 슬러리 가수분해를 위한 가수분해 시간의 함수로서 가수분해물 내 총 C5 및 C6 모노머 회수를 보여준다. 보여지는 대로, 적어도 55%의 총 C5 모노머 회수가 이들 조건들 하 24 시간 이내에 달성된다.

실시예 12. 낮은 엄격도 자가가수분해에 의하여 전처리된 공급원료로부터 가수분해물의 C6 에탄올 발효 후 남아 있는 딘 스틸레지의 개선된 바이오메탄 잠재성(potential)

도 2에서 추정된 대로 용해되지 않은 고체들 내에 남아 있는 각각 거의 2.0%, 4.3% 및 7.8 중량% 자일란을 갖는 자일란 수 3.0%, 9.1% 및 13.2%를 갖는 전처리된 바이오매스를 생산하기 위하여 3개의 다른 엄격도들로 실시예 4에 기재된 대로 밀짚이 전처리되었다.

전처리된 물질은 섬유 분획을 생산하기 위하여 고체/액체 분리에 가해졌고, 가수분해와 분리되어 유지되는 액체 분획과 마찬가지로, 그 뒤에 효소 가수분해 실험들에서 사용되었다. 고체 분획들은 3.0% 자일란 수 샘플에 대하여 0.052 g/g 글루칸, 9.1% 자일란 수 샘플에 대하여 .056 g/g 글루칸, 및 13.2% 자일란 수 샘플에 대하여 0.075 g/g 글루칸의 각각의 용량으로 CTEC3를 이용하여 가수분해되었다.

여기에 기재된 대로 측정된 이들 실험들의 효소 활성들은 초기에 엑소글루카나제 nkat/g 글루칸, 엔도글루카나제 nkat/g 글루칸, β-글루코시다제 nkat/g 글루칸, 엔도자일라나제 nkat/g 글루칸, β-자일로시다제 nkat/g 글루칸 nkat/g 글루칸 범위 내였다는 것이 보여질 수 있다.

가수분해는 5.0으로 조정된 pH로 50 ℃에서 144 시간 동안 22% DM에서 수행되었다. 144 시간 후 보통의 제빵용(bakers') 효모 (C6 발효(fermenting))가 가수분해물에 첨가되었고 온도가 37 ℃로 낮아졌고, 그리고 발효/가수분해가 또다른 60 시간 동안 계속되었다. 가수분해/발효의 말에, 에탄올 농도들은 다른 그룹들 사이에서, 61.77 - 63.68 g/kg 에탄올 상이에서, 거의 등가였다.

발효된 가수분해물들로부터 그리고 대응하는 분리된 액체 분획으로부터 바이오메탄 생산은, (휘발성 고체들 기초로) 5-6.5 사이의 접종물(inoculum)/기질(substratio) 비율로, 덴마크, Fredericia Spildevand, Fredericia,로부터의 접종물을 이용하여, 2회(duplicate) 뱃치(batch) 분석들에서 결정되었다.

전처리들 각각에 대한 물질 밸런스들은 주의깊게 결정되었고, 3 개의 다른 엄격도 레벨들의 각각으로부터 가수분해물들 각각의 C6 에탄올 발효로부터 남아 있는 딘 스틸레지의 메탄 잠재성(potential)을 추정하는데 사용되었다. 관찰된 바이오메탄 잠재성들(potentials)에 대한 에탄올의 알려진 기여를 빼는 것(substracting)으로, 밀짚 건조물 1 톤으로부터 추정치 메탄 생산이 결정되었다. 결과들은 표 6에 보여진다.

전처리의 엄격도에 의존한, 짚 건조물 1 톤(tonne)으로부터 얻어진 액체 분획 및 딘 스틸레지로부터 메탄 생산.

예들 및 실시예들은 오직 기술하기 위한 것이며, 청구항들의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 여기에 인용된 참고문헌들 각각은 그 전체가 참고로서 명백히 여기에 포함된다.

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Claims (17)

1. - 연질 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료(feedstock)를 제공하는 단계,
   - 용해되지 않은 고체들이 적어도 5.0 중량% 자일란을 포함하는 전처리된 바이오매스 슬러리를 생산하기 위하여, log 엄격도 Ro 3.75 또는 그보다 더 낮게 일-단계 가압된(pressurized) 열수 전처리에서 3.5 내지 9.0 범위 내 pH에서 공급원료를 전처리하는 단계, 및
   C5 모노머들의 수율이 전처리 전 공급원료의 원래 자일로스 및 아라비노스 함량의 적어도 55%인 가수분해물을 생산하기 위하여, 적어도 1100의 엔도글루카나제, 적어도 280의 엑소글루카나제, 적어도 3000의 β-글루코시다제, 적어도 1400의 엔독실라나제,및 적어도 75의 β-자일로시다제의 nkat/g 글루칸인 활성 레벨들의 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, β-글루코시다제, 엔독실라나제 및 β-자일로시다제 활성들을 포함하는 효소 혼합물에 의하여 촉매화되는, 적어도 24 시간 동안 효소 가수분해를 이용하여 보충의 물 함량의 첨가와 또는 첨가 없이 전-처리된 바이오매스를 가수분해하는 단계
   를 포함하는 리그노셀룰로스 바이오매스의 가공 방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   전처리된 바이오매스는 전체 슬러리로서 가수분해된 것인 방법.
   
3. 제 2항에 있어서,
   가수분해는 건조물 함량 8 및 19 %에서 수행되는 방법.
   
4. 제 2항에 있어서,
   전체 슬러리 가수분해물은 바이오메탄 기질로서 이용되는 방법.
   
5. 제 1항에 있어서,
   전처리된 바이오매스는 고체/액체 분리 단계에 가해져 적어도 40 중량%의 건조물 함량을 갖는 고체 분획 및 액체 분획을 생산하고, 그리고 고체 분획이 가수분해되는 방법.
   
6. 제 4항에 있어서,
   가수분해는 20 % 또는 그보다 큰 건조물 함량에서 수행되는 방법.
   
7. 제 4항에 있어서,
   고체 분획의 효소 가수분해가 원하는 정도의 글루칸 전환에 도달한 후, 분리된 액체 분획이 가수분해 혼합물로 다시 첨가되는 방법.
   
8. 제 7항에 있어서,
   액체 분획 내 존재하는 n자일로-올리고머들의 적어도 85%가 후-가수분해 동안 자일로스 모노머들로 가수분해되는 방법.
   
9. 제 7항에 있어서,
   적어도 50% 글루코스로의 셀룰로스 전환이 얻어진 후, 액체 분획이 가수분해된 고체 분획에 첨가되는 방법.
   
10. 제 1항에 있어서,
    공급원료는 밀짚, 옥수수 대, 사탕수수 바가스, 단 수수 바가스 또는 빈 과실 송이들인 방법.
    
11. 제 1항에 있어서,
    공급원료는 적어도 35%의 건조물 함량에서 가압된 전처리에 가해지는 방법.
    
12. 제 1항에 있어서,
    가압된 전처리는 10 bar 또는 그보다 더 낮은 압력에서 수행되는 방법.
    
13. 제 1항에 있어서,
    공급원료는 하이드로사이클론 시스템을 이용하여 가압된 전처리 반응기로부터 제거되는 방법.
    
14. 제 1항에 있어서,
    공급원료가 엄격도로 전처리되어 바이오매스가 자일란 수 12% 또는 더 높은 것을 갖는 것으로 특징되는 방법.
    
15. 제 1항에 있어서,
    효소 가수분해는 리그노셀룰로스 바이오매스 전환에 최적화된 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제를 이용하여 수행되는 방법.
    
16. 제 1항에 있어서,
    효소 가수분해는 적어도 96 시간 동안 수행되는 방법.
    
17. 제 1항에 있어서,
    하나 또는 그보다 많은 변형된 효모 균주들을 이용하여 결합된 C5/C6 가수분해물이 에탄올로 직접 발효되는 것으로 더 특징되는 방법.
    
    

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