BR112016000565B1

BR112016000565B1 - Polipeptídeo cíclico, seu uso, composição farmacêutica e processo para produzir a mesma

Info

Publication number: BR112016000565B1
Application number: BR112016000565-1A
Authority: BR
Inventors: Susan Greenfield
Original assignee: Neuro-Bio Ltd
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2014-07-04
Publication date: 2023-11-07
Also published as: NZ716647A; US10053677B2; CA2917389C; WO2015004430A1; JP6647199B2; CA2917389A1; AU2018260893A1; BR112016000565A2; AU2014289001B2; CN105531383A; US20160369250A1; AU2014289001A1; WO2015004430A9; JP2016525095A; EP3019591A1; MX2016000095A; EP3019591B1; US20190100735A1; AU2018260893B2; KR20160078950A

Abstract

polipeptìdeo cíclico, seu uso, modulador alostérico , composição farmacêutica, processo para produzir a mesma. polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos derivada do c-terminal de acetilcolinesterase (ache), ou um truncamento da mesma.

Description

[001] A invenção refere-se a distúrbios neurodegenerativos e, em particular, a composições, terapias e métodos inovadores para tratar tais afecções, por exemplo, doença de Alzheimer.

[002] A doença de Alzheimer afeta principalmente homens e mulheres acima de 65 anos e a probabilidade de serem diagnosticados com a doença aumenta substancialmente com a idade. Com a expectativa de crescimento mundial da porcentagem de adultos acima de 65 anos nos próximos 40 anos, espera-se que a incidência de doença de Alzheimer mais que dobre, subindo de 21 milhões de casos em 2010 para 53 milhões em 2050 (estatísticas de www.alzheimersresearchuk.org e www.alz.org). Esse aumento exponencial no número de pacientes esperado que apresentam a doença de Alzheimer não representa apenas uma área importante de necessidades médicas não atendidas, como oferece uma oportunidade de mercado significativa para terapias e diagnósticos visto que não há, atualmente, método de tratamento da doença totalmente eficaz.

[003] Não há nenhum fármaco novo para combater a doença de Alzheimer especificamente, nem a neurodegeneração de modo mais geral, nos últimos 10 anos. A razão é que, até o momento, o mecanismo cerebral subjacente básico ainda não foi identificado, que poderia, consequentemente, ser alvejado em termos farmacêuticos. O competidor principal para justificar o processo de neurodegeneração é a "hipótese de amiloide", em que a morte neural é atribuída ao rompimento da membrana celular pelos depósitos tóxicos de amiloide, característica do cérebro com Alzheimer post-mortem, e que resulta da abnormal clivagem de proteína de precursor de amiloide. No entanto, essa "hipótese de amiloide" não explica a copatologia frequentemente observada com doenças de Alzheimer e Parkinson, nem a seletividade característica de células vulneráveis à degeneração, nem a ausência de depósitos de amiloide em modelos animais de demência, nem, de fato, a ocorrência de amiloide em determinadas regiões do cérebro em que os déficits cognitivos não são evidentes. Apesar da popularidade de formação de amiloide como um alvo farmacêutico nas últimas duas décadas, nenhum tratamento baseado nessa teoria ainda provou ser eficaz. Uma possibilidade mais provável é que uma vez que o processo neurodegenerativo está a caminho, então, o amiloide será adicionalmente gerado como um efeito secundário exagerado que é menos específico.

[004] Uma pista para identificar o mecanismo primário de neurodegeneração, poderia ser que apenas vários grupos neuronais são principalmente vulneráveis. Além do mais, os subgrupos celulares variados propensos às doenças de Alzheimer, Parkinson e neuromotoras, não obstante, são adjacentes entre si e formam uma "parte central" contínua que se estende a partir do tronco cerebral até o prosencéfalo que enviam, todos, projeções difusas para cima e para baixo até o centro cerebral superior. Por isso, apesar de sua heterogeneidade em transmissores, esses grupos neuronais foram coletivamente chamados de neurônios "Globais" para distinguí- los dos circuitos de células mais familiares e localizados na maioria das outras partes do cérebro, como cerebelo, tálamo, córtex etc. Esses neurônios Globais seletivamente vulneráveis foram previamente identificados, apesar de usar uma terminologia diferente ("núcleo isodendrítico"), como centrais na neurodegeneração diversas décadas atrás.

[005] Os subgrupos de neurônios Globais têm um recurso específico em comum que pode explicar a questão confusa e ainda não respondida quanto ao por quê de apenas essas células sucumbirem à morte progressiva enquanto suas contrapartes em qualquer lugar no cérebro, mesmo quando danificadas por derrame, não o fazem: elas retêm uma plasticidade sólida por toda a fase adulta, acompanhadas por uma sensibilidade específica às substâncias que auxiliam e sustentam o crescimento - "fatores tróficos". No cérebro em desenvolvimento, os fatores tróficos funcionam através da estimulação de fluxo de entrada de cálcio, que dispara uma cascata de eventos dentro da célula, que resultam eventualmente na diferenciação seletiva e no crescimento. No entanto, em doses mais elevadas ou com exposições mais longas, a entrada de cálcio sustentada pode ser tóxica para os neurônios. De modo mais significativo, um fator de determinação adicional no fato de se a entrada de cálcio dispara ou não efeitos tróficos ou tóxicos é a idade: à medida que os neurônios amadurecem, um nível trófico anterior de cálcio intracelular se torna letal.

[006] O inventor propôs anteriormente que o processo neurodegenerativo seja, de fato, um processo de desenvolvimento ativado de modo anormal. No suporte dessa hipótese, uma hipertrofia dos neurônios da "parte central" do tronco cerebral foi, de fato, relatada nos cérebros com Alzheimer (Bowser et al., 1997, Brain Pathol. 7:723-30). Se áreas grandes dessa parte central forem danificadas, então, mais do que uma doença neurodegenerativa se apresentará, à medida que ocorre nos casos frequentemente vistos, mas nunca explicados de copatologia com doenças de Alzheimer e Parkinson. De modo interessante, todos os neurônios dentro da parte central vulnerável de neurônios Globais, apesar da heterogeneidade do transmissor, todos contêm aacetilcolinesterase de enzima familiar (AChE). AChE está, portanto, presente em neurônios em que seriam incapazes de realizar sua função normal, uma vez que tais subgrupos de células como o locus coeruleus noradrenérgico, a substância negra dopaminérgica ou os núcleos da rafe serotonérgicos, em quaisquer casos contêm o substrato comum, acetilcolina. Um desvio inesperado adicional de seu papel enzimático normal é que a AChE é, de fato, liberada dos neurônios Globais, presumidamente como algum tipo de mensageiro intracelular por si mesmo. Em geral, a AChE é, agora, amplamente e bem estabelecida como uma molécula de sinalização que tem atividade trófica em uma variedade diversa de situações tanto no tecido neural quanto no não neural.

[007] O inventor mostrou anteriormente que a AChE, que opera como um agente trófico independente de sua ação enzimática, não dispara, de fato, a entrada de cálcio nos neurônios. É possível, no entanto, que dentro dos neurônios Globais, a AChE tenha dupla ação não clássica que varia ao longo de um eixo geométrico trófico e tóxico, dependendo da quantidade, duração de disponibilidade e, de modo mais significativo, idade. Se os neurônios padrão forem danificados na fase adulta, como em um derrame, outros irão compensar a funcionalidade. Em contrapartida, os neurônios Globais irão responder chamando seus recursos tróficos em uma tentativa para regenerar. Porém, devido ao fato de que o fluxo de entrada de cálcio subsequente será letal nas células maduras mais velhas, os danos resultantes irão disparar tentativas adicionais para compensar um ciclo prejudicial que distingue a neurodegeneração.

[008] A acetilcolinesterase (AChE) é expressa em diferentes estágios de desenvolvimento de várias formas, todas das quais têm atividade enzimática idêntica, mas que têm composição molecular muito diferente. A "caudal" (T-AChE) é expressa em sinapses e os inventores identificaram anteriormente dois peptídeos que poderiam ser clivados a partir do C-terminal, um referido como “T14”, dentro do outro que é conhecido como “T30”, e os quais, ambos, têm forte homologia de sequência à região comparável de β-amiloide (consulte a Figura 11; e SEQ ID NOs: (2 a 5) O peptídeo de C-terminal de AChE “T14”’ foi identificado como sendo a parte saliente da molécula de AChE responsável por sua faixa de ações não hidrolíticas. O análogo de peptídeo de 14 aminoácidos sintético (isto é, “T14”), e subsequentemente a sequência de aminoácidos maior, mais estável e mais potente em que o mesmo está embutido (isto é, “T30”) exibe ações comparáveis àquelas relatadas para a AChE "não colinérgica", em que o resíduo inerte dentro da sequência de T30 (isto é, “T15”) não tem efeito.

[009] Os efeitos agudos de T14 e T30 são que os mesmos:-(i) modulam a entrada de cálcio nos neurônios nos cortes do cérebro em escalas de tempo de milissegundos a horas; (ii) comprometem a viabilidade celular em células PC 12 e também em culturas organotípicas neuronais in vitro. (iii) modulam a liberação de AChE induzida por cálcio "compensatória" de neurônios e células PC 12; (iv) ativam as correntes de cálcio em oócitos e neurônios em cortes do cérebro; (v) fazem a sinergia com amiloide em efeitos tóxicos; e (vi) são envolvidos em produção de proteína de precursor de amiloide e liberação de peptídeo de beta amiloide. Os efeitos crônicos de T14 e T30 são que os mesmos:- (i) reduzem o crescimento de neurônio; (ii) induzem a apoptose; (iii) aumentam a liberação de AChE; (iv) se ligam e modulam α7 receptor nicotínico; e (v) intensificam a expressão do α7 receptor na superfície celular durante 24 horas, fornecendo, desse modo, um mecanismo de alimentação direta para a toxicidade adicional.

[0010] Uma vez que T14 e T30 são mais seletivos do que o β- amiloide na indução de toxicidade e também são sinérgicos com a toxicidade exagerada de amiloide, foi postulado que qualquer agente que bloqueie o efeito de T14 ou T30 também reduziria o efeito tóxico de amiloide subsequente e menos seletivo. O inventor mostrou previamente que os peptídeos T30 e T14 se ligam a um local alostérico no a7 receptor nicotínico para induzir um espectro de efeitos tóxicos tróficos. Esse receptor é coexpresso com AChE durante os períodos críticos de desenvolvimento cerebral assim como mostram uma distribuição paralela aproximada no cérebro adulto, e é um dos inóforos de cálcio mais potentes no cérebro. Isso também pode funcionar independente da transmissão colinérgica, uma vez que a colina (derivada de dieta) pode servir como um ligante primário alternativo. Além do mais, esse receptor já foi envolvido na doença de Alzheimer como um dos alvos para a galantamina para terapia atual (Reminil (RTM)), assim como está ligado às ações de amiloide.

[0011] No entanto, a eficácia de galantamina provou ser limitada, enquanto outros antagonista do receptor de o7 acetilcolina nicotínica ainda estão em fase de testes clínicos. A galantamina tem uma baixa afinidade para o o7 receptor nicotínico (isto é, apenas 10 μM) em comparação com aquele de T30 e T14, que têm afinidades muito maiores para o o7 receptor nicotínico (isto é, 5 nM). Por isso, se, em um cérebro com Alzheimer, o equivalente endógeno de peptídeo de T30 já ocupa o respectivo local de receptor, a galantamina precisaria ser fornecida em altas doses não fisiológicas com efeitos colaterais inevitáveis e, com mais importância, eficácia questionável.

[0012] Há, portanto, uma necessidade de fornecer um medicamento aprimorado para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, como doença de Alzheimer e doença de Parkinson.

[0013] Conforme descrito nos Exemplos, o inventor demonstrou surpreendentemente que as formas cíclicas de peptídeos derivadas do C-terminal de AChE podem ser usadas para inibir seletivamente os efeitos não clássicos de AChE e/ou seu peptídeo terminal in vitro (isto é, os efeitos de AChE que são independentes de sua atividade enzimática) e, portanto, tratam efetivamente os distúrbios neurodegenerativos.

[0014] Assim, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, fornece-se um polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo, que compreende uma sequência de aminoácidos derivada do C-terminal de acetilcolinesterase (AChE) ou um truncamento da mesma.

[0015] Os polipeptídeos cíclicos são cadeias de peptídeo cujo N- e C-terminais são, os próprios, ligados juntamente com uma ligação de peptídeo que forma uma cadeia circular de aminoácidos, e, até a presente data, nenhum peptídeo cíclico foi desenvolvido, o qual compreende uma sequência de aminoácidos derivada de C-terminal de acetilcolinesterase (AChE) ou um truncamento da mesma. Conforme descrito nos Exemplos, o inventor demonstrou surpreendentemente que a ineficiência de proteção contra a ação não específica de peróxido de hidrogênio iria sugerir que a ação de bloqueio do polipeptídeo cíclico do primeiro aspecto é altamente seletiva e mediada por receptor. O inventor também ficou muito surpreso de observar que os polipeptídeos cíclicos da invenção antagonizam os efeitos tóxicos dos peptídeos lineares conhecidos, T14 e T30, em uma variedade de testes que indicam que os mesmos impedem o fluxo de entrada adicional de cálcio através de um local alostérico (por exemplo, um local alostérico sensível à Ivermectina) di α7 receptor nicotínico e, efetivamente, superam a ligação para os peptídeos lineares T14 e T30, assim como β-amiloide. Portanto, o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo pode ser um antagonista seletivo do α7 receptor nicotínico.

[0016] No entanto, os inventores mostraram que os polipeptídeos cíclicos da invenção agem como um modulador alostérico inerte do α7 receptor nicotínico que antagoniza a ação de peptídeos T30 e de beta amiloide. Portanto, de preferência, o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo é um modulador alostérico seletivo do α7 receptor nicotínico, com mais preferência, um modulador alostérico seletivo inerte do mesmo. O termo “inerte” pode significar que o polipeptídeo da invenção age apenas como um modulador alostérico do receptor na presença dos compostos tóxicos, isto é, peptídeos T30 e de beta amiloide (β-amiloide).

[0017] De preferência, o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo impede o fluxo de entrada adicional de cálcio através de um local alostérico (com mais preferência, um local alostérico sensível a Ivermectina) do α7 receptor nicotínico. É preferencial que o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo supere a ligação para β-amiloide.

[0018] Poderia não ter sido previsto que os peptídeos da invenção superariam o equivalente endógeno de peptídeo de T30 que já ocupa o respectivo local de receptor. Ademais, a estabilidade otimizada de peptídeos cíclicos justificaria esse deslocamento eficaz. Dessa maneira, o polipeptídeo cíclico impede os efeitos tóxicos estabelecidos anteriormente dos peptídeos lineares de T14 e T30 e também β-amiloide. O inventor acredita, portanto, que os polipeptídeos cíclicos da invenção terão utilidade significativa para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos na estabilização de qualquer perda celula adicional.

[0019] O termo “derivado ou análogo do mesmo” pode significar um polipeptídeo dentro do qual os resíduos de aminoácido são substituídos por resíduos (independente de serem aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais ou imitações de aminoácido) com propriedades de cadeia principal de peptídeo ou cadeias laterais semelhantes.

[0020] O termo “derivado de” pode significar uma sequência de aminoácidos que é um derivado ou uma modificação de uma sequência de aminoácidos que está presente no C-terminal de AChE e na porção do mesmo, ou forma o mesmo.

[0021] O termo “truncamento da mesma” pode significar que o polipeptídeo cíclico derivado de AChE é reduzido em tamanho através da remoção de aminoácidos. A redução de aminoácidos pode ser alcançada pela remoção de resíduos do C- ou N- terminal do peptídeo antes da ciclização para o polipeptídeo cíclico da invenção, oi pode ser alcançada pela deleção de um ou mais aminoácidos de dentro do núcleo do peptídeo antes da ciclização.

[0022] De preferência, o polipeptídeo cíclico é purificado e/ou isolado, isto é, não é encontrado na natureza.

[0023] A acetilcolinesterase é uma protease de serina que hidrolisa a acetilcolina, e será bem conhecida pela pessoa versada. A principal forma de acetilcolinesterase que é encontrada no cérebro é conhecida como acetilcolinesterase caudal (T-AChE). Dado que a invenção está principalmente envolvida com o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, é preferencial que o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo compreenda uma sequência de aminoácidos derivada do C-terminal de acetilcolinesterase caudal (T-AChE), ou um truncamento da mesma.

[0024] A sequência de proteína de uma modalidade de acetilcolinesterase caudal humana (Gen Bank: AAA68151.1) é de 614 aminoácidos de comprimento e é fornecida no presente documento como SEQ ID No:1, conforme segue: 1 mrppqcllht irlktpggpv pslaspllll llwllgggvg aegredaell vtvrggrlrg 61 saflgipfae fegtemwnpn ppmgprrflp pepkqpwsgv vdattfqsvc yqyvdtlypg 121 relsedclyl qaertvlvsm nvwtpyprpt sptpvlvwiy gggfysgass ldvydgrflv 181 nyrvgafgfl fgesagaasv alpgsreapg nvglldqrla lqwvqenvaa fggdptsvtl 241 gmhllsppsr ggtggndtel glfhravlqs gapngpwatv gmgearrrat qlahlvgcpp 301 vaclrtrpaq dfhglqvlvg vlvnhewhvl pqesvfrfsf vpvvdgdfls dtpealinag 361 vvkdegsyfl lhytdwlhpe vygapgfskd neslisraef lagvrvgvpq vsdlaaeavv 421 dparlreals plwmgvphgy dvvgdhnvvc pvaqlagrla aqgarvyayv fehrastlsw 481 eiefifgipl wppytagaqq dpsrnytaee kifaqrlmry wanfartgdp neprdpkapq 541 yvsldlrple wssymvhwkn vrrglraqac afwnrflpkl lsatdtldea erqwkaefhr 601 qfdhyskqdr csdl [SEQ ID No:1]

[0025] Será observado que os primeiros resíduos de 31 aminoácidos de SEQ ID No:1 são removidos enquanto a proteína é liberada deixando, desse modo, uma sequência de 583 aminoácidos. Dessa maneira, é preferencial que o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo compreenda uma sequência de aminoácidos derivada do C-terminal de acetilcolinesterase ou um truncamento da mesma, em que a acetilcolinesterase compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente conforme estabelecida em SEQ ID No:1, de preferência, que exclui os 31 aminoácidos no N-terminal.

[0026] De preferência, o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo compreende uma sequência de aminoácidos derivada dos últimos 300, 200, 100 ou 50 aminoácidos que formam o C-terminal de acetilcolinesterase, ou um truncamento da mesma, de preferência, em que a acetilcolinesterase compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente conforme estabelecida em SEQ ID No:1. O polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo, compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos derivada dos últimos 40 aminoácidos que formam o C-terminal de acetilcolinesterase ou um truncamento da mesma.

[0027] De preferência, o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo compreende entre resíduos de 8 e 40 aminoácido, com mais preferência, entre 10 e 30 aminoácidos, e com máxima preferência, entre 12 e 20 aminoácidos. Conforme mostrado na Figura 11, o inventor preparou um alinhamento de sequência entre β-amiloide (Aβ), e três peptídeos que são derivados do C-terminal de AChE, que são referidos no presente documento como T30, T14 e T15.

[0028] A sequência de aminoácidos de parte de β-amiloide (Aβ) é fornecida no presente documento como SEQ ID No:2, conforme segue:-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA [SEQ ID No:2]

[0029] A sequência de aminoácidos de T30 (que corresponde aos resíduos dos últimos 30 aminoácido de SEQ ID No:1) é fornecida no presente documento como SEQ ID No:3, conforme segue:- KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL [SEQ ID No:3]

[0030] A sequência de aminoácidos de T14 (que corresponde aos resíduos de 14 aminoácido localizados no sentido da extremidade de SEQ ID No:1, e carece de 15 aminoácidos finais encontrados em T30) é fornecida no presente documento como SEQ ID No:4, conforme segue:- AEFHRWSSYMVHWK [SEQ ID No:4]

[0031] A sequência de aminoácidos de T15 (que corresponde aos resíduos dos últimos 15 aminoácido de SEQ ID No:1) é fornecida no presente documento como SEQ ID No:5, conforme segue:- NQFDHYSKQDRCSDL [SEQ ID No:5]

[0032] O inventor gerou uma sequência consensual com base em SEQ ID Nos 2 a 5, que é fornecida no presente documento como SEQ ID No:6, conforme segue:- AEFx1x2x3Sx4Yx5VH [SEQ ID No:6]

[0033] De preferência, em SEQ ID No:6, x1 pode ser um resíduo de aminoácido básico, de preferência, histidina (H); x2 pode ser um resíduo de aminoácido básico, de preferência, arginina (R); x3 pode ser um resíduo de aminoácido aromático, de preferência, triptofano (W); x4 pode ser um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral de hidroxila alifática, de preferência, serina (S); x5 pode ser triptofano (W) ou metionina (M).

[0034] Será observado que quaisquer das sequências representadas como SEQ ID No:2 a 6 podem ser prontamente cicladas para formar um polipeptídeo cíclico do primeiro aspecto. Por exemplo, a ciclização de peptídeos pode ser alcançada através de técnicas de ciclização de cadeia lateral para cadeia lateral, cadeia lateral para cadeia principal ou cabeça a cauda (C-terminal a N-terminal). Em uma modalidade preferencial, a ciclização de cabeça a cauda é o método preferencial pelo qual os polipeptídeos cíclicos são produzidos. Os polipeptídeos cíclicos podem ser sintetizados com o uso de ciclização de peptídeo linear de fase de solução clássica ou ciclização baseada em resina. Os métodos preferenciais para ciclização são descritos nos Exemplos. Em uma outra modalidade preferencial, o polipeptídeo é produzido com o uso de uma abordagem de clivagem de ciclização, em que o polipeptídeo cíclico é sintetizado através de ciclização após a síntese de peptídeo linear gradual. Uma vantagem desse método é que a cadeia lateral não precisa ser ancorada, tornando a abordagem mais geral. De preferência, antes do uso, as amostras resultantes de peptídeos cíclicos podem ser analisadas por MALDI-TOF MS.

[0035] Dessa maneira, um polipeptídeo preferencial de acordo com a invenção compreende SEQ ID No:3, 4, 5 ou 6 cíclica ou uma variante funcional ou fragmento da mesma.

[0036] Em uma modalidade, o polipeptídeo cíclico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No:3, e o resíduo de lisina de N-terminal está ligado ao resíduo de leucina de C- terminal para formar uma cadeia circular de aminoácidos. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo cíclico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No:4, e o resíduo de alanina de N-terminal está ligado ao resíduo de lisina de C- terminal. Em ainda outra modalidade, o polipeptídeo cíclico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No:5, e o resíduo de asparagina de N-terminal está ligado ao resíduo de leucina de C-terminal. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo cíclico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No:6, em que x1 pode ser um resíduo de aminoácido básico, de preferência, histidina (H); x2 pode ser um resíduo de aminoácido básico, de preferência, arginina (R); x3 pode ser um resíduo de aminoácido aromático, de preferência, triptofano (W); x4 pode ser um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral de hidroxila alifática, de preferência, serina (S); x5 pode ser triptofano (W) ou metionina (M) e o resíduo de alanina de N-terminal está ligado ao resíduo de histidina de C-terminal.

[0037] O inventor concluiu que a SEQ ID No: 4 ciclada (isto é, referida no presente documento como “T14 ciclado”, “CT14” ou “NBP14”) age, surpreendentemente, como um verdadeiro antagonista do α7 receptor nicotínico, isto é, que a SEQ ID No:4 ciclada protege as células contra a toxicidade de T14, T30 lineares e β-amiloide. Além do mais, o T14 ciclado bloqueia a liberação de AChE compensatória induzida por essa toxicidade de T14 e T30 linear. Além disso, observou-se que o T14 cíclico fornecido por si só não tem efeitos significativos em concentrações de Ca2+ em cortes do cérebro de rato, mas bloqueiam os efeitos de β-amiloide. Dessa maneira, um polipeptídeo cíclico preferencial do primeiro aspecto compreende SEQ ID No:4 cíclica ou uma variante funcional ou fragmento da mesma.

[0038] A pessoa versada iria observar que as variantes funcionais e análogos retêm substancialmente a mesma atividade biológica que o T14 cíclico em qualquer um dos experimentos descritos nos Exemplos. Dessa maneira, uma variante funcional ou análogo pode ser selecionada com base em sua atividade antagonística no local alostérico sensível a Ivermectina no α7 receptor nicotínico, ou pela extensão até a qual a mesma bloqueia a liberação de AChE ou a extensão até a qual a mesma protege as células contra toxicidade de T14, T30 lineares e β- amiloide, ou a extensão até a qual a mesma modula os níveis de Ca2+ em um corte de cérebro de rato.

[0039] O inventor acredita convictamente que o antagonismo do receptor fornecido pela ciclização do polipeptídeo, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto foi tão surpreendente que não poderia ter sido antecipado por uma pessoa versada na técnica. Desse modo, o inventor acredita que a ciclização de qualquer polipeptídeo poderia ser usada para antagonizar um receptor, como o α7 receptor nicotínico.

[0040] Por isso, em um segundo aspecto, fornece-se um antagonista de receptor que compreende um polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo.

[0041] Ademais, em um terceiro aspecto, fornece-se um polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo, para uso como um antagonista de receptor.

[0042] Conforme discutido acima, os inventores mostraram surpreendentemente que os polipeptídeos cíclicos da invenção agem como um modulador alostérico inerte do α7 receptor nicotínico que antagoniza a ação de peptídeos T30 e de beta amiloide.

[0043] Por isso, em um quarto aspecto, fornece-se um modulador alostérico de receptor que compreende um polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo.

[0044] Em um quinto aspecto, fornece-se um polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo, para uso como um modulador alostérico de receptor.

[0045] O polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo é, de preferência, o polipeptídeo, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto. O receptor, cujo o agente de polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo antagoniza ou modula de modo alostérico, pode ser qualquer receptor, mas é, de preferência, um α7 receptor. De preferência, no entanto, o receptor, cujo o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo antagoniza ou modula de modo alostérico, é o α7 receptor nicotínico. É preferencial que o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo antagonize ou module um local alostérico no receptor, e, de preferência, um local alostérico sensível a Ivermectina do receptor.

[0046] Os inventores acreditam que são os primeiros a terem mostrado que um polipeptídeo cíclico pode ser usado na terapia, por exemplo, no tratamento de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer.

[0047] Assim, em um aspecto adicional, fornece-se um polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo, para uso em uma terapia ou diagnóstico.

[0048] Em m aspecto adicional, fornece-se um polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo, para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio neurodegenerativo.

[0049] Ainda em um outro aspecto, fornece-se um método de tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo, sendo que o método compreende, a administração em um indivíduo com necessidade de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo.

[0050] Conforme discutido acima, o inventor acredita que o polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo ou o antagonista de receptor ou modulador alostérico descrito no presente documento possa ser usado para formar a base para tratar distúrbios neurodegenerativos.

[0051] Assim, em um sexto aspecto da invenção, fornece-se a polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto, ou a antagonista de receptor de acordo com o segundo aspecto, ou o modulador alostérico de receptor do quarto aspecto, para uso na terapia ou diagnóstico.

[0052] Em um sétimo aspecto, fornece-se a polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto, ou a antagonista de receptor de acordo com o segundo aspecto, ou o modulador alostérico de receptor do quarto aspecto, para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio neurodegenerativo.

[0053] Em um oitavo aspecto, fornece-se um método de tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo, sendo que o método compreende, a administração em um indivíduo com necessidade de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto, ou do antagonista de receptor de acordo com o segundo aspecto, ou do modulador alostérico de receptor do quarto aspecto.

[0054] De preferência, o distúrbio neurodegenerativo é selecionado a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer; doença de Parkinson; doença de Huntington; doença neuromotora; Espino cerebelar tipo 1, tipo 2 e tipo 3; Esclerose Lateral Aminotrópica (ALS); e Demência Frontotemporal, e é, de preferência, doença de Alzheimer.

[0055] O distúrbio neurodegenerativo que é tratado é, de preferência, um que é distinguido pelos danos ou a morte dos neurônios "Globais". Por exemplo, o distúrbio neurodegenerativo é selecionado a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer; doença de Parkinson; doença de Huntington; doença neuromotora; Espino cerebelar tipo 1, tipo 2 e tipo 3; Esclerose Lateral Aminotrópica (ALS); Demência Frontotemporal; e Esquizofrenia.

[0056] De preferência, o distúrbio neurodegenerativo, que é tratado, é doença de Alzheimer, doença de Parkinson ou doença neuromotora. Com mais preferência, o distúrbio neurodegenerativo, que é tratado, é doença de Alzheimer.

[0057] Será observado que o polipeptídeo cíclico ou o antagonista de receptor ou o modulador alostérico de receptor de acordo com a invenção pode ser usado em um medicamento que pode ser usado em uma monoterapia (isto é, o uso do polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo), para tratar, aliviar ou prevenir contra o distúrbio neurodegenerativo, como a doença de Alzheimer. Alternativamente, o polipeptídeo cíclico ou o antagonista de receptor ou o modulador alostérico de receptor de acordo com a invenção pode ser usado como um adjunto para, ou em combinação com, as terapias conhecidas para tratar, aliviar ou prevenir contra doença de Alzheimer, como outros inibidores de acetilcolinesterase.

[0058] O polipeptídeo cíclico de acordo com a invenção pode ser combinado em composições que têm inúmeras formas diferentes dependendo, em particular, da maneira na qual a composição deve ser usada. Assim, por exemplo, a composição pode estar na forma de um pó, tablete, cápsula, líquido, pomada, creme, gel, hidrogel, aerosol, pulverização, solução micelar, emplastro transdérmico, suspensão de lipossoma ou outra forma adequada que possa ser administrada a uma pessoa ou animal com necessidade de tratamento. Será observado que o veículo de medicamentos de acordo com a invenção deve ser um que seja bem tolerado pelo indivíduo à qual é dado, e, de preferência, possibilite a entrega do polipeptídeo cíclico através da barreira entre sangue e cérebro.

[0059] Será observado que a eficiência de qualquer tratamento para distúrbios cerebrais depende da habilidade de o composto terapêutico candidato cruzar a barreira entre sangue e cérebro (BBB). O inventor acredita que os peptídeos do tamanho de T14 cíclico podem não ganhar pronto acesso seguindo a administração oral. No entanto, é bem conhecido que, durante a doença de Alzheimer, a barreira entre sangue e cérebro aumenta na permeabilidade que poderia permitir que o T14 cíclico alcance o sistema nervoso central, idealmente, de fato, apenas nos locais de degeneração onde é necessário, isto é, onde o BBB está comprometido.

[0060] Duas estratégias principais podem ser aplicadas para cruzar o BBB com uma molécula grande, como T14 Cíclica (isto é, NBP-14), que inclui: (1) uso de nanopartículas como transportadores para alvejar especificamente o cérebro e entregar o composto ativo. Esse método foi usado com sucesso para entregar peptídeos, proteínas e fármacos anticâncer entregues ao cérebro; (2) uso de peptídeos de carga. A adição de tal peptídeo especificamente transportado através do BBB permite a transferência do peptídeo cíclico através de uma maneira facilitada.

[0061] Os medicamentos que compreendem polipeptídeos cíclicos de acordo com a invenção podem ser usados de inúmeros modos. Por exemplo, a administração oral pode ser exigida, em cujo caso o polipeptídeo cíclico pode estar contido dentro de uma composição que pode, por exemplo, ser ingerida oralmente na forma de um tablete, cápsula ou líquido. Uma opção alternativa para administrar T14 cíclico (isto é, NBP14) seria usar um spray nasal, uma vez que a administração de peptídeo através de spray nasal chega ao cérebro mais rápido e de modo mais eficiente do que as vias orais ou intravenosas de administração (consulte http://memoryzine.com/2010/07/26/nose- sprays-cross-blood-brain-barrier-faster-e-safer/). Por isso, as composições que compreendem polipeptídeos cíclicos da invenção podem ser administradas através de inalação (por exemplo, de modo intranasal). As composições também podem ser formuladas para uso tópico. Por exemplo, os cremes ou pomadas podem ser aplicados à pele, por exemplo, adjacente ao cérebro.

[0062] Os polipeptídeos cíclicos de acordo com a invenção também podem ser incorporados dentro de um dispositivo de liberação lenta ou retardada. Tais dispositivos podem, por exemplo, ser inseridos na pele ou sob a mesma e o medicamento pode ser liberado durante semanas ou até mesmo meses. O dispositivo pode estar localizado pelo menos adjacente ao local de tratamento, por exemplo, a cabeça. Tais dispositivos podem ser particularmente vantajosos quando o tratamento a longo prazo com polipeptídeos cíclicos usados de acordo com a invenção é necessário e que precisaria, normalmente, de administração frequente (por exemplo, pelo menos injeção diária).

[0063] Em uma modalidade preferencial, os medicamentos de acordo com a invenção podem ser administrados a um indivíduo através de injeção na corrente sanguínea ou diretamente em um local que exige tratamento. Por exemplo, o medicamento pode ser injetado pelo menos adjacente ao cérebro. As injeções podem ser intravenosas (bolo ou infusão) ou subcutâneas (bolo ou infusão) ou intradérmicas (bolo ou infusão).

[0064] Será observado que a quantidade do polipeptídeo cíclico que é necessária é determinada por sua atividade biológica e biodisponibilidade, que depende, sucessivamente, do modo de administração, das propriedades fisioquímicas do polipeptídeo cíclico e se está sendo usada como uma monoterapia ou em uma terapia combinada. A frequência de administração também será influenciada pela meia vida do polipeptídeo cíclico dentro do indivíduo que é tratado. As dosagens ideais a serem administradas podem ser determinadas pelos versados na técnica, e irão variar de acordo com o polipeptídeo cíclico específico em uso, a resistência da composição farmacêutica, o modo de administração e o avanço da doença neurodegenerativa. Os fatores adicionais que dependem do fato de o indivíduo específico ser tratado irão resultar em uma necessidade de ajustar as dosagens, inclusive idade, peso, gênero, dieta do indivíduo e tempo de administração.

[0065] Em geral, uma dose diária entre 0,001 μg/kg de peso corporal e 10 mg/kg de peso corporal do polipeptídeo cíclico de acordo com a invenção podem ser usados para tratar, aliviar ou prevenir contra a doença neurodegenerativa, dependendo de qual polipeptídeo cíclico é usado. Com mais preferência, a dose diária é entre 0,01μ g/kg de peso corporal e 1 mg/kg de peso corporal e, com máxima preferência, entre aproximadamente 0,1μ g/kg e 10μ g/kg de peso corporal.

[0066] O polipeptídeo cíclico pode ser administrado antes, durante e depois do início da doença neurodegenerativa. As doses diárias podem ser dadas como uma única administração (por exemplo, uma única injeção diária ou inalação de um spray nasal). Alternativamente, o polipeptídeo cíclico pode exigir a administração duas ou mais vezes durante um dia. Como um exemplo, os polipeptídeos cíclicos podem ser administrados como duas (ou mais dependendo da severidade da doença neurodegenerativa que é tratada) doses diárias entre 0,07 μ g e 700 mg (isto é, supondo-se um peso corporal de 70 kg). Um paciente que recebe tratamento pode tomar uma primeira dose quando acordar e, então, uma segunda dose de noite (se estiver em um regime de duas doses) ou em intervalos de 3 em 3 ou de 4 em 4 horas depois disso. Alternativamente, um dispositivo de liberação lenta pode ser usado para fornecer doses ideais de polipeptídeo cíclico de acordo com a invenção a um paciente sem a necessidade de administrar doses repetidas.

[0067] Os procedimentos conhecidos, como aqueles convencionalmente empregados pela indústria farmacêutica (por exemplo, experimentação in vivo, testes clínicos, etc.), podem ser usados para formar formulações específicas do polipeptídeo cíclico de acordo com a invenção e regimes terapêuticos precisos (como doses diárias dos agentes e a frequência da administração). O inventor acredita que é o primeiro a sugerir uma composição antidoença neurodegenerativa, baseada no uso de um polipeptídeo cíclico da invenção.

[0068] Por isso, em um nono aspecto da invenção, fornece-se uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto, ou a antagonista de receptor de acordo com o segundo aspecto ou o modulador alostérico de receptor do quarto aspecto, e opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0069] A composição farmacêutica é, de preferência, uma composição antidoença neurodegenerativa, isto é, uma formulação farmacêutica usada no alívio terapêutico, prevenção ou tratamento de um distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo, como doença de Alzheimer.

[0070] A invenção também fornece, em um décimo aspecto, um processo para produzir a composição farmacêutica de acordo com o nono aspecto, sendo que o processo compreende combinar uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto ou do antagonista de receptor de acordo com o segundo aspecto ou do modulador alostérico de receptor do quarto aspecto, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0071] O polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo é, de preferência, T14 cíclico (isto é, NBP14) conforme descrito no presente documento, isto é, SEQ ID No:4.

[0072] Um “indivíduo” pode ser um animal vertebrado, mamífero ou animal doméstico. Por isso, os medicamentos de acordo com a invenção podem ser usados para tratar qualquer mamífero, por exemplo, gado (por exemplo, um cavalo), animais de estimação ou podem ser usados em outras aplicações veterinárias. Com mais preferência, no entanto, o indivíduo é um ser humano.

[0073] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de polipeptídeo cíclico é qualquer quantidade que, quando administrada a um indivíduo, é a quantidade de agente ativo que é necessária para tratar a afecção de distúrbio neurodegenerativo ou produzir o efeito desejado.

[0074] Por exemplo, a quantidade terapeuticamente eficaz de polipeptídeo cíclico usada pode ser de cerca de 0,001 mg a cerca de 800 mg, e, de preferência, de cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg. É preferencial que a quantidade de polipeptídeo cíclico seja uma quantidade de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg.

[0075] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” conforme referido no presente documento, é qualquer composto ou combinação de compostos conhecidos que seja conhecida para aqueles versados na técnica para ser útil na formulação de composições farmacêuticas.

[0076] Em uma modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um sólido e a composição pode estar na forma de um pó ou tablete. Um veículo farmaceuticamente aceitável sólido pode incluir uma ou mais substâncias que também possa agir como agentes flavorizantes, lubrificantes, solubilizadores, agentes de suspensão, corantes,preenchedores, deslizantes, auxílios de compressão,aglutinantes inertes, adoçantes, conservantes, revestimentos ou agentes de desintegração de tablete. O veículo também pode ser um material de encapsulação. Nos pós, o veículo é um sólido finamente dividido que está em mistura por adição com os agentes ativos finamente divididos de acordo com a invenção. Nos tabletes, o agente ativo (isto é, o modulador) pode ser misturado com um veículo que tem as propriedades de compressão necessárias nas proporções adequadas e compactado no formato e tamanho desejados. Os pós e tabletes, de preferência, contém até 99% dos agentes ativos. Os veículos sólidos adequados incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, estearato de magnésio, talco, açúcares, lactose, dextrina, amido, gelatina, celulose, polivinilpirrolidina, ceras de ponto de fusão baixo e resinas de troca de ferro. Em uma outra modalidade, o veículo farmacêutico pode ser um gel e a composição pode estar na forma de um creme ou semelhante.

[0077] No entanto, o veículo farmacêutico pode ser um líquido, e a composição farmacêutica está na forma de uma solução. Os veículos líquidos são usados no preparo de soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires e composições pressurizadas. O agente ativo de acordo com a invenção (o polipeptídeo cíclico) pode ser dissolvido ou suspenso em um veículo líquido farmaceuticamente aceitável como água, um solvente orgânico, uma mistura de ambos ou de óleos ou gorduras farmaceuticamente aceitáveis. O veículo líquido pode conter outros aditivos farmacêuticos adequados como solubilizadores, emulsificantes, tampões, conservantes, adoçantes, agentes flavorizantes, agentes de suspensão, agentes espessantes, cores, reguladores de viscosidade, estabilizadores ou osmorreguladores. Os exemplos adequados de veículos líquidos para administração oral e parenteral incluem água (que contém parcialmente aditivos conforme acima, por exemplo, derivados de celulose, de preferência, carboximetil sódico), álcoois (que incluem álcoois monoídricos e álcoois poliídricos, por exemplo, glicóis) e seus derivados, e óleos (por exemplo, óleo de coco e óleo de arachis fracionados). Para a administração parenteral, o veículo também pode ser um éster oleoso como oleato de etila e miristato de isopropila. Os veículos líquidos estéreis são úteis em composições na forma líquida estéreis para administração parenteral. O veículo líquido para composições pressurizadas pode ser um hidrocarboneto halogenado ou outro propulsor farmaceuticamente aceitável.

[0078] As composições farmacêuticas líquidas, que são soluções ou suspensões estéreis, podem ser utilizadas, por exemplo, por injeção intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa e particularmente subcutânea. O polipeptídeo cíclico pode ser preparado como uma composição sólida estéril que pode ser dissolvida ou suspensa no momento da administração com o uso de água estéril, solução salina ou outro meio injetável estéril adequado.

[0079] O polipeptídeo cíclico e as composições da invenção podem ser administrados oralmente na forma de uma solução ou suspensão estéril que contém outros solutos ou agentes de suspensão (por exemplo, solução salina ou glicose suficiente para produzir a solução isotônica), sais biliares, acácia, gelatina, monoleato de sorbitan, polisorbato 80 (ésteres de oleato de sorbitol e seus anidridos copolimerizados com óxido de etileno) e semelhantes. O polipeptídeo cíclico usado de acordo com a invenção também pode ser administrado oralmente na forma de composição líquida ou sólida. As composições adequadas para a administração oral incluem formas sólidas, como pílulas, cápsulas, grânulos, tabletes e pós, e formas líquidas, como soluções, xaropes, elixires e suspensões. As formas úteis para a administração parenteral incluem soluções, emulsões e suspensões estéreis.

[0080] Embora os inventores tenham demonstrado os efeitos terapêuticos surpreendentes do polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto, devido a essa natureza antagonista, eles acreditam que também será útil em experimentos relacionados não clinicamente projetados para investigar a estrutura e/ou a função do α7 receptor nicotínico.

[0081] Por isso, em um aspecto adicional, fornece-se o uso do polipeptídeo cíclico, derivado ou análogo do mesmo de acordo com o primeiro aspecto, em um método analítico in vitro ou ex vivo para investigar o α7 receptor nicotínico.

[0082] De preferência, o método compreende investigar o local alostérico do α7 receptor nicotínico. De preferência, o método compreende usar o peptídeo cíclico para impedir o fluxo de entrada adicional de cálcio através do α7 receptor nicotínico. O peptídeo cíclico, de preferência, age como um antagonista e bloqueia os íons de cálcio.

[0083] Será observado que a invenção se estende até qualquer ácido nucleico ou peptídeo ou variante, derivado ou análogo do mesmo, que compreenda substancialmente as sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos de quaisquer das sequências referidas no presente documento, inclusive variantes funcionais ou fragmentos funcionais dos mesmos. Os termos “substancialmente a sequência de aminoácidos/nucleotídeos/peptídeos”, “variante funcional” e “fragmento funcional”, podem ser uma sequência que tem pelo menos 40% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos/nucleotídeos/peptídeos de qualquer uma das sequências referidas no presente documento, por exemplo, 40% de identidade com a sequência identificada como SEQ ID No:1 a 6, e assim por diante.

[0084] As sequências de aminoácidos/polinucleotídeos/polipeptídeos com uma identidade de sequência que é maior do que 65%, com mais preferência, maior do que 70%, ainda com mais preferência, maior do que 75%, e ainda com mais preferência, maior do que 80% de identidade de sequência para qualquer uma das sequências referidas também são contempladas. De preferência, a sequência de aminoácidos/polinucleotídeos/polipeptídeos tem pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das sequências referidas, com mais preferência, pelo menos 90% de identidade, com ainda mais preferência, pelo menos 92% de identidade, com ainda mais preferência, pelo menos 95% de identidade, com ainda mais preferência, pelo menos 97% de identidade, com ainda mais preferência, pelo menos 98% de identidade e, com máxima preferência, pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das sequências referidas no presente documento.

[0085] O técnico versado irá observar como calcular a identidade em porcentagem entre duas sequências de aminoácidos/polinucleotídeos/polipeptídeos. A fim de calcular a identidade em porcentagem entre duas sequências de aminoácidos/polinucleotídeos/polipeptídeos, um alinhamento das duas sequências deve ser primeiro preparado, seguido pelo cálculo do valor de identidade de sequência. A identidade em porcentagem para duas sequências pode assumir diferentes valores que dependem de:- (i) o método usado para alinhar as sequências, por exemplo, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman (implantado em diferentes programas), ou alinhamento estrutural a partir da comparação em 3D; e (ii) os parâmetros usados pelo método de alinhamento, por exemplo, alinhamento local contra global, a mistura de classificação de par usada (por exemplo, BLOSUM62, PAM250, Gonnet etc.), e gap penalty, por exemplo, forma funcional e constantes.

[0086] Tendo feito o alinhamento, há muitos modos diferentes de calcular a identidade em porcentagem entre as duas sequências. Por exemplo, pode-se dividir o número de identidades por: (i) o comprimento da sequência mais curta;(ii) o comprimento do alinhamento; (iii) o comprimento médio da sequência; (iv) o número de posições sem lacuna; ou (iv) o número de posições equivalentes que excluem as projeções. Ademais, será observado que a identidade em porcentagem também depende fortemente do comprimento. Portanto, quanto mais curto for um par de sequências, maior a identidade de sequência que pode-se esperar que ocorra por acaso.

[0087] Por isso, será observado que o alinhamento preciso de proteína ou sequências de DNA é um processo complexo. O programa de múltiplos alinhamentos popular ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acid Research, 22, 4.673 a 4.680;Thompson et al., 1997, Nucleic Acid Research, 24, 4.876 a 4.882) é um modo preferencial para gerar múltiplos alinhamentos de proteínas ou DNA de acordo com a invenção. Os parâmetros adequados para ClustalW podem ser conforme segue: Para alinhamentos de DNA: Gap Open Penalty = 15,0, Gap Extension Penalty = 6,66 e Matriz = Identidade. Para alinhamentos de proteína: Gap Open Penalty = 10,0, Gap Extension Penalty = 0,2 e Matriz = Gonnet. Para alinhamentos de DNA e de Proteína: ENDGAP = -1, e GAPDIST = 4. Aqueles versados na técnica estarão mais cientes de que pode ser necessário variar esses e outros parâmetros para o alinhamento de sequência ideal.

[0088] De preferência, o cálculo de identidades em porcentagem entre duas sequências de aminoácidos/polinucleotídeos/polipeptídeos pode ser então calculado a partir de tal alinhamento como (N/T)*100, em que N é o número de posições nas quais as sequências compartilham um resíduo idêntico, e T é o número total de posições comparadas que incluem lacunas, mas excluem projeções. Por isso, um método com máxima preferência para calcular a identidade em porcentagem entre duas sequências compreende (i) preparar um alinhamento de sequência com o uso do programa ClustalW com o uso de um conjunto de parâmetros adequado, por exemplo, conforme estabelecido acima; e (ii) inserir os valores de N e T na fórmula a seguir:- identidade de sequência = (N/T)*100.

[0089] Os métodos alternativos para identificar sequências semelhantes serão conhecido pelos versados na técnica. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos substancialmente semelhante será codificada por uma sequência que hibridiza as sequências de DNA ou seus complementos sob condições estringentes. Por condições estringentes, entende-se que o nucleotídeo hibridiza ao DNA ou RNA com ligação de filtro em 3x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em aproximadamente 45°C seguido por pelo menos uma lavagem em 0,2x de SSC/0,1% de SDS em aproximadamente 20 a 65°C. Alternativamente, um polipeptídeo substancialmente semelhante pode diferir por pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 20, 50 ou 100 aminoácidos das sequências mostradas em SEQ ID No: 1 a 6.

[0090] Devido à degenerescência do código genética, é claro que qualquer sequência de ácido nucleico descrita no presente documento poderia ser variada ou alterada sem afetar substancialmente a sequência da proteína codificada desse modo, para fornecer uma variante funcional do mesmo. As variantes de nucleotídeo adequadas são aquelas que têm uma sequência alterada pela substituição de diferentes códons que codificam o mesmo aminoácido dentro da sequência produzindo, assim uma alteração silenciosa. Outras variantes adequadas são aquelas que têm sequências de nucleotídeos homólogas, mas que compreendem todas as sequências, ou parte das mesmas, que são alteradas pela substituição de diferentes códons que codificam um aminoácido com uma cadeia lateral de propriedades biofísicas semelhantes para o aminoácido que o mesmo substitui, para produzir uma alteração conservadora. Por exemplo, os aminoácidos hidrofóbicos não polares pequenos incluem glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina e metionina. Os aminoácidos hidrofóbicos não polares grandes incluem fenilalanina, triptofano e tirosina. Os aminoácidos neutros polares incluem serina, treonina, cisteína, asparagina e glutamina. Os aminoácidos (básicos) positivamente carregados incluem lisina, arginina e histidina. Os aminoácidos (acídicos) negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Será observado, no entanto, quais aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido que tem propriedades biofísicas semelhantes, e o técnico versado saberá as sequências de nucleotídeos que codificam esses aminoácidos.

[0091] Todos os recursos descritos no presente documento (que incluem quaisquer reivindicações, resumo e desenhos anexos) e/ou todas as etapas de qualquer método ou processo então revelados, podem ser combinados em qualquer um dos aspectos acima em qualquer combinação em que pelo menos alguns dos recursos e/ou das etapas sejam mutuamente exclusivos.

[0092] Para uma melhor compreensão da invenção, e para mostrar como as modalidades da mesma podem proceder às notificações, a referência será feita, agora, por meio de exemplo, às Figuras anexas, em que:-

[0093] A Figura 1 é um gráfico em barras que não mostra efeito de T14 cíclico por si só em viabilidade de célula PC12 após tratamento de 1 hora. Os dados representam a média ± SEM, N=6;

[0094] A Figura 2 é um gráfico que não mostra alteração na atividade enzimática de AChE (determinada por sua habilidade de clivar concentrações crescentes de um substrato) na presença ou ausência de T14 cíclico. Em contrapartida, a galantamina exibe inibição competitiva altamente significativa de atividade enzimática. Os dados representam a média ± SD, N=4;

[0095] A Figura 3 é um gráfico em barras que mostra o efeito tóxico não específico de H2O2 (100 μM) por si só, e sua persistência quando combinado com T14 cíclico (100 nM) em viabilidade celular. Os dados representam a média ± SEM, N=6. * contra Controle; * P<0,05, **P<0,01;

[0096] A Figura 4 mostra o efeito após 1 hora de tratamento de (A) β-amiloide (10 μM), (B) T14 (10 μM) e (C) T30 (10 μM) por si só, e combinados em tempo zero com T14 cíclico (100 nM). Os dados representam a média ± SEM, N=12. * contra Controle; * P<0,05, *** P<0,001;

[0097] A Figura 5 é um gráfico em barras que mostra a atividade de AChE após o tratamento de células PC12 com T30 (10 μM) por si só, T14 (10 μM) por si só ou combinadas com T14 cíclico (100 nM). Os dados representam a média ± SEM, N=6. * contra Controle, *** P < 0,001; # dentro de grupos, ### P < 0,001;

[0098] A Figura 6 mostra curvas de competição da inibição de ligação de Ivermectina [3H] por β-amiloide, T30 e T14 em membranas de células PC12, conforme mostrado também em membranas cerebrais de rato. Os dados representam a média ± SEM, N=3;

[0099] A Figura 7 mostra curvas de competição da inibição de ligação de Ivermectina [3H] por T14 cíclico e galantamina em membranas de células PC12, conforme também mostrado em membranas cerebrais de rato. Os dados representam a média ± SEM, N=6;

[00100] A Figura 8 é um gráfico em barras que mostra a concentração efetiva mínima de galantamina (100 nM) e T14 cíclico (1 nM) contra β-amiloide (10 μM) em viabilidade celular. Os dados representam a média ± SEM, N=6. * contra Controle; * P<0,05;

[00101] A Figura 9 é um gráfico que mostra o efeito de resposta à dose de T14 cíclico (1 nM) contra β-amiloide (10 μM) em viabilidade celular. Os dados representam a média ± SEM, N=6. * contra Controle; * P<0,05;

[00102] A Figura 10 é um gráfico em barra que mostra os níveis intracelulares de Ca2+ em cortes do cérebro de rato após 2 horas de tratamentos diferentes. Os dados representam a média ± SEM, N=4.

[00103] A Figura 11 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos dos peptídeos, T30, T15, T14 e β-amiloide (Aβ);

[00104] A Figura 12 é um diagrama que mostra os locais de ligação de β-amiloide e T30 na α7-nAChR;

[00105] A Figura 13 é um gráfico que mostra o efeito protetor de diferentes concentrações de NBP-14 (5, 7, 9, 10, 20, 50, 70, 1.000, 5.000 nM) no fluxo de entrada de cálcio induzido por T30. Os valores foram ajustados para uma curva não linear com o logaritmo das concentrações de inibidor, NBP-14, contra a resposta do T30, com o uso de GraphPad Prism;

[00106] A Figura 14 é um gráfico que mostra o efeito protetor de diferentes concentrações de NBP-14 (5, 7, 9, 10, 20, 50, 70, 1.000, 5.000 nM) na liberação de AChE induzida por T30. Os valores foram ajustados para uma curva não linear com o logaritmo das concentrações de inibidor, NBP-14, contra a resposta do T30, com o uso de GraphPad Prism;

[00107] A Figura 15 é um gráfico que mostra o efeito protetor de diferentes concentrações de NBP-14 (5, 7, 9, 10, 20, 50, 70, 1.000, 5.000 nM) na viabilidade celular induzida por T30. Os valores foram ajustados para uma curva não linear com o logaritmo das concentrações de inibidor, NBP-14, contra a resposta do T30, com o uso de GraphPad Prism;

[00108] A Figura 16 é um gráfico que mostra a resposta cortical geral para o estímulo elétrico talâmico em concentrações de T30 diferentes. (A) Sincronia de atividade de população neuronal, medida como alteração de fração em intensidade de fluorescência. (B) Dispersão de atividade de população, medida como o número de pixels ativos - definidos como pixels que mostram mais de 20% de intensidade máxima dada por qualquer único pixel dentro da Região de Interesse;

[00109] A Figura 17 mostra isolamento e análise linear da fase de elevação da dispersão de conjuntos em diferentes concentrações de T30, conforme visto a partir da Figura 16. As concentrações crescentes de T30 mostram uma diminuição dependente de dose no declive linear, equivalente à velocidade de propagação do conjunto;

[00110] A Figura 18 mostra a análise de dinâmica de dispersão de conjuntos neuronais evocados de modo cortical de tálamo em tratamento de T30 e NBP-14, n=3. A análise da fase de elevação (painel esquerdo) mostra um efeito latente de T30 no aumento do declive (velocidade) de propagação. O declive mostra aumentos significativos de apenas cerca de 45 a 60 minutos após perfusão de T30 inicial (barra amarela, os efeitos se torna evidentes durante a perfusão laranja - com perfusão de 5 nM de NBP-14). Essa tendência de aumento brusco é desacelerada durante a perfusão de 100 nM de NBP-14 (barra vermelha), e então, reservada para os níveis basais durante a perfusão final de 300 nM de NBP-14 (barra preta). A análise de fase de platô (painel direito) mostra um perfil de efeitos semelhante. O painel superior mostra um gráfico de bigode que calcula o comportamento da dispersão dos conjuntos em diferentes tratamentos com fármaco: uma tendência semelhante àquela na análise de declive de fase de elevação pode ser vista, e embora não significativa, a tendência permanece que T30 aumenta gradualmente a dispersão de conjuntos evocados até que uma concentração de NBP-14 suficientemente alta alcance o banho recorde (100 nM) em que essa tendência excitante seja revertida em direção aos níveis de controle (azul) em perfusão de 300 nM de NBP-14 (preta);

[00111] A Figura 19 mostra resultados quantitativos de três experimentos (isto é, colunas da esquerda, central e direita) em que os efeitos de T30 foram testados contra as concentrações crescentes de NBP-14 (0,1, 5, 100 e 300 nM). O painel superior mostra os dois gráficos de dados de média principais: esquerda - Intensidade de sinal de fluorescência e direita - dispersão de conjuntos evocados. O painel de fundo mostra mapas de "espaço-tempo" que mapeiam a atividade de uma fileira de pixels que se estende sobre a área de interesse (eixo geométrico y) com o tempo (310 ms no total, eixo geométrico x) para cada uma das condições de perfusão. A redução drástica na intensidade de fluorescência como um resultado da coperfusão de T30 e NBP-14 é claramente evidente, conforme está no gráfico de Intensidade. Nota: os mapas de espaço e tempo são rotulados com sua respectiva perfusão (esquerda), e são codificados por cor para seus traços correspondentes nos gráficos de intensidade (direita) e dispersão (esquerda);

[00112] A Figura 20 mostra um esquema do procedimento seguido durante o teste in vivo de NBP-14. No dia antes da cirurgia todos os animais são testados a fim de revelar qualquer debilitamento. O dia da cirurgia é considerado como o dia 0 do estudo. No dia um, um teste de colocação de pata permitiu a seleção de 16 de 24 melhores indivíduos a fim de injetar com o veículo ou NPB-14. No dia 2, o teste de colocação de pata foi realizado;

[00113] A Figura 21 mostra o efeito de NBP-14 contra 6-OHDA em comparação com a linha de base e 6OHDA por si só no teste de colocação de pata. 6-OHDA **P<0,01 e 6OHDA+NBP14 ***P<0,001 contra linha de base. (N=8);

[00114] A Figura 22 mostra a cascata de eventos que resultam do efeito de T30 em uma célula;

[00115] A Figura 23 mostra que o APP de comprimento total é reduzido por NBP-14. Os dados representam a expressão de APP em células PC12 solubilizadas após 3 tratamentos diferentes de 1 hora. Os dados são representados como a média ± SEM, n=2; e

[00116] A Figura 24 mostra a imunodetecção através de western blot representada no gráfico. Os 3 tratamentos diferentes mostram diferentes níveis de expressão de APP (valores representados na Figura 24). Para cada condição a proteína é corrigida por níveis de GAPDH.

[00117] A Figura 25 mostra que o T30 induz a liberação de Aβ42, um efeito invertido por NBP14. O gráfico que mostra a liberação de Aβ42 nas condições de controle, na presença de T30 e na presença de T30 e NBP-14. Os resultados são representados como a média ± SEM (n=4).

EXEMPLOS

[00118] Deve-se notar que SEQ ID No:4 é referida no presente documento como “T14 ciclado”, “CT14” ou “NBP14”.

MATERIAIS E MÉTODOS CICLIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS

[00119] As três técnicas foram usadas para alcançar a ciclização de peptídeos lineares descrita no presente documento, isto é, ciclização de cadeia lateral para cadeia lateral, cadeia lateral para cadeia principal e cabeça a cauda (C-terminal a N-terminal). A ciclização de cabeça a cauda foi investigada extensivamente e pode envolver ciclização de dissulfeto Cys-Cys (até dois por molécula). O monitoramento cuidadoso da reação garante 100% de ciclização. Duas abordagens gerais são usadas para síntese: (1) ciclização de peptídeo linear de fase de solução clássica sob condições de alta diluição; e (2) ciclização baseada em resina. Dois protocolos distintos foram empregados na síntese de fase sólida (1):-

[00120] (a) A ciclização em resina em um peptídeo ancorado por meio de uma grupo funcional de cadeia lateral, como imidazol, 3 ácido,4 amina’ ou álcool, foi realizada. O peptídeo foi ortogonalmente protegido como um éster no C- terminal, e o peptídeo foi então montado através de síntese F- moc ou Boc regular seguida de saponificação, ciclização e clivagem.

[00121] (b) Um outro protocolo que foi usado foi a abordagem de clivagem de ciclização, em que o peptídeo cíclico foi sintetizado através ciclização síntese de peptídeo linear gradual. Uma vantagem desse método é que a cadeia lateral não precisa ser ancorada, tornando a abordagem mais geral do que (a). (Christopher J. White e Andrei K. Yudin (2011) Nature Chemistry 3; Valero et al. (1999) J Peptide Res. 53, 76 a 67; Lihu Yang e Greg Morriello(1999) Tetrahedron Letters 40, 8.197 a 8.200; Parvesh Wadhwani et al. (2006) J. Org. Chem. 71, 55 a 61).

[00122] As amostras resultantes de peptídeos cíclicos foram analisados por MALDI-TOF MS.

CULTURA DE CÉLULA PC12

[00123] As células PC12 são uma linhagem de células feocromocitoma clonada derivada da medula adrenal (Greene e Tischler, 1976, Proc Natl Acad Sci EUA 73: 2.424 a 2.428; Mizrachi et al., 1990, Proc Natl Acad Sci EUA 87: 6.161 a 6.165). As mesmas são facilmente cultivadas e prontamente acessíveis para manipulações experimentais. Uma vez que as células de cromafina são derivadas da crista neural, mas são localizadas no centro de um órgão periférico acessível (a medula adrenal) foram descritas como oferecendo uma "janela" para o cérebro (Bornstein et al., 2012, Mol Psychiatry 17: 354 a 358). Essas células servem como um modelo in vitro potente, porém, inovador para estudar o processo de neurodegeneração primário ainda que desconhecido e as razões pelas quais são úteis para esse projeto são as seguintes: a medula adrenal nos pacientes com Alzheimer mostra várias características patológicas sugestivas daquelas vistas no CNS, por exemplo, inúmeras inclusões do tipo corpo de Lewy, novelos neurofibrilares e filamentos helicoidais emparelhados, assim como a expressão de proteína de precursor de amiloide (APP) (Takeda et al., 1994, Neurosci Lett 168: 57 a 60). Moreover Appleyard and Macdonald (1991, Lancet 338: 1.085 a 1.086) demonstrou uma redução seletiva apenas na forma solúvel, isto é, liberável de AChE da glândula adrenal em AD, talvez devido a sua secreção intensificada no plasma, em que é elevada em pacientes AD (Atack et al., 1985, J Neurol Sci 70: 1 a 12; Berson et al., 2008, Brain 131: 109 a 119).

[00124] A célula PC12 do tipo selvagem foi fornecida por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). A cultura foi rotineiramente colocada em pratos de 100 mm (Corning) revestida com colágeno (2 μg/cm2) e mantida e crescimento médio com Meio Essencial Mínimo Apropriado (Minimum Essential Medium Eagle - MEM) complementado com soro de cavalo a 10% inativado por calor (HS) e soro bovino fetal a 5% (FBS), 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina e 1:400 de solução de Penicilina/estreptomicina. As células foram mantidas a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 e o meio foi substituído a cada 2 dias. Para a divisão, as células foram deslocadas do prato com o uso de uma pipeta com meio, com uma porção delas substituída em novos discos de cultura. As células foram usadas entre as passagens 12 e 25.

PREPARAÇÃO DE MEMBRANA CELULAR

[00125] As membranas PC12 foram obtidas para realizar os ensaios de ligação. As células PC12 foram cultivadas até a confluência em placas de 100 mm. O meio de crescimento foi removido e 50 mM gelado de tampão Tris-HCl (pH 7,4) que contém 4,5 μg/μl de aprotinina e 0,1 mM de fenilmetilssulfonilfluoreto (PMSF) foram adicionados. As células foram mecanicamente separadas e peletizadas através de centrifugação (1.040 x g) por 4 minutos a 4°C. Os péletes foram homogeneizados com um Polytron e centrifugados (13.000 x g) por 20 minutos a 4°C. Os péletes foram ressuspensos em tampão fresco e incubados a 37 °C por 10 minutos para remover os neurotransmissores endógenos. As amostras foram subsequentemente recentrifugadas. O pélete final foi ressuspenso em tampão e a concentração de proteína determinada com o uso de Reagente Bradford (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A preparação de membrana celular foi armazenada a -80

PREPARAÇÃO DE B-AMILOIDE

[00126] As fibrilas de β-amiloide (1-42) foram preparadas conforme descritas pelo fornecedor (Abcam, Cambridge, Reino Unido)). 1 mg de β-amiloide (1-42) foi dissolvido em 212 μl de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) e 10 μl de NH4OH. Após sonicação e distribuição de 10 μl de amostra por tubo, as amostras foram secas em um secador a vácuo por velocidade (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) e armazenadas a -20 °C. Para os experimentos, as amostras foram diluídas em 2 μl de DMSO (5 mM) e 98 μl de HCl (0,01 N) para garantir a formação de fibrila e incubadas durante a noite a 37 °C.

ENSAIO DE LIGAÇÃO DE IVERMECTINA [3H]

[00127] Para a ligação com membranas de PC12, cada incubação foi realizada em tubo de poliestireno (VWR International Ltd; Leicestershire, Reino Unido) que contém 0,25 ml de membranas diluída em 50 mM de tampão de Tris-HCl (que contém 50 μg de membranas de PC12) com 5 nM de Ivermectina [3H] (American Radiolabeled Chemicals, EUA) na ausência ou presença de concentrações diferentes de peptídeo T30 de AChE, β-amiloide ou T14 cíclico (0,1 , 0,5, 0,7, 1, 2, 10 μM) diluídas em 50 mM de Tris-HCl, em um volume final de 0,5 ml por 2 h a 4°C. Desde então, as amostras foram filtradas através de filtros de fibra de vidro Brandel GB (MD, EUA); pré-molhado em 0,5% de polietilenomina por uma Ceifadeira (Brandel; MD, EUA). Os tubos foram lavados 3 vezes com tampão gelado de 50 mM de Tris-HCl. A radioatividade nos tubos foi contada através de espectrometria de cintilação com o uso de um contador por cintilação líquida (Lablogic Systems Limited, Reino Unido). A ligação específica foi determinada subtraindo-se o valor não específico (células tratadas com 30 μM de Ivermectina) para todos os tubos.

ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR

[00128] O ensaio de viabilidade celular usado foi o ensaio colorimétrico de sulfo rodamina B (SRB) para triagem por toxicidade. O dia antes de as células do experimento serem semeadas nas placas de 96 poços revestidas com colágeno em uma concentração de 40.000 células/poço. A concentração celular foi determinada pela câmara Fuchs-Rosenthal. Os fármacos foram preparados em MEM que contém L-glutamina e as células foram tratadas com diferentes concentrações de T14 cíclico (0,1 a 100 μM) e T30, T14 e Aβ (10 μM) por si só ou combinados com T14 cíclico (0,1 e 0,7 μM). Após tratamento, o meio foi substituído e as células foram fixadas adicionando-se 100 μl de 10% de Ácido Tricloroacético (TCA) por 1 h a 4 °C. Depois disso, as células foram lavadas com H2O e manchadas com 100 μl de uma solução de 0,057% de SRB em 1% de Ácido Acético (HAc) por 30 minutos em temperatura ambiente. Após o manchamento, as células foram lavadas com 1% de HAc para remover o excesso de SRB e, então, incubadas com 200 μl de 10 mM de base Tris (pH 10,5) e agitadadas por 5 minutos para solubilizar o corante ligado por proteína. A medição da absorvância ocorreu em um Leitor de Microplaca Cinético VMax (Dispositivos Moleculares) em 490 nm.

ENSAIO DE ATIVIDADE DE ACETILCOLINESTERASE

[00129] A atividade de AChE foi medida com o uso do reagente Ellman que mede a presença de grupos tiol como um resultado da atividade de AChE. As células foram colocadas em placas no dia antes do experimento para o ensaio de viabilidade celular. As células foram tratadas com diferentes concentrações de T14 cíclico (0,1 a 100 μM) e T30, T14 e Aβ com 10 μM por si só ou combinados com T14 cíclico (0,1 e 0,7 μM). Após tratamento, o supernadante (perfusato) de cada tratamento foi coletado e 25 μl de cada condição foram adicionados a uma nova placas de 96 poços com fundo plano seguido de adição de 175 μl de reagente Ellman (Solução A: KH2PO4 com 139 mM e K2HPO4 com 79,66 mM, pH 7,0; solução B (substrato): 11,5 mM de Iodeto de Acetiltiocolina; Solução C (Reagente): 5, 5’-Ditiobis (2-ácido nitrobenzoico) a 8 mM e NaHCO3 a 15 mM). O reagente Ellman foi preparado como uma mistura das 3 soluções em uma razão de 33(A):3(B):4(C). As medições de absorvância foram extraídas em intervalos regulares (3, 10, 30 e 60 minutos) através dos experimentos a 405 nm.

FLUOROMETRIA DE CÁLCIO

[00130] Os aumentos em Ca2+ intracelular foram monitorados medindo-se as alterações em fluorescência em células carregadas com Fluo-4 (Life Technologies Corporation, Reino Unido). Os cortes do cérebro foram incubados por 2 horas em 124 mM de NaCl, 3,7 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 2 mM de CaCl2, 1,3 mM de MgSO4, 1,3 mM de KH2PO4 e 10 mM de glicose; pH: 7,1 que contém β-amiloide, T14 Cíclico ou β-amiloide + T14 Cíclico. Após as 2 horas, os corte foram incubados no escuro por 40 minutos em temperatura ambiente com 1,2 ml/poço de meio de carregamento que continha: A solução salina de Tyrode (TSS; 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1,0 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 0,2 mM de NaH2PO4, 12,0 de NaHCO3, 5,5 de glicose, pH 7,4), Fluo-4 (2 μM), Pluronic F127 (0, 02 %) e probenecid (2 mM). O probenecid é um bloqueador da proteína resistente à multifármaco, um transportador de íon e evita a excreção da molécula fluorescente da célula. Após a incubação, os cortes foram lavados com TSS e 1.200 μl/poço de meio de desesterificação, que contém TSS e probenecid, foram adicionados. Os cortes foram incubados no escuro por 20 minutos a 22 °C. As medições de fluorescência (excitação de 485 nm, emissão de 538 nm) foram registrados em um leitor de placa Fluostar Optima (BMG, Reino Unido).

FÁRMACOS E REAGENTES

[00131] MEM, soros de cultura, antibióticos, colágeno, sulfo rodamina B, Ivermectina e reagentes de tampões foram fornecidos por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Os peptídeos de AChE T30, T14 e T14 cíclico foram sintetizados através de Genosphere Biotechnologies (França). Os estoques de peptídeos foram diluídos em água destilada.

ANÁLISE DOS DADOS

[00132] Em cada uma das técnicas diferentes, a análise estatística foi realizada com a média dos valores de porcentagem de 12 ou mais experimentos. As comparações entre diversos grupos de tratamento e o mesmo controle foram realizadas através de análise de variância unidirecional (ANOVA) e testes post-hoc de Tukey com o uso de GraphPAD Instat (software GraphPAD, San Diego, CA). Esses testes comparam os meios de todo tratamento aos meios de todos os outros tratamentos; ou seja, aplicam simultaneamente ao conjunto de todas as comparações de formação de par e identificam onde a diferença entre dois meios é maior do que o erro padrão esperaria ser permitida. A significância estatística foi produzida em um valor P < 0,05. Os gráficos foram plotados com o uso de GraphPAD Prism 6 (software GraphPAD, San Diego, CA). No caso do experimento de ligação, os resultados foram obtidos como contagens por minuto (cpm) e transformados em porcentagens relacionadas ao controle. Os resultados foram ajustados a um modelo de uma ligação de competição de local com o uso de GraphPad Prism. No caso dos resultados de cálcio, os valores EC50 foram calculados ajustando-se o logaritmo dos pontos de dados experimentais para uma equação de Hill de único local com o uso de uma curva de regressão não linear com o uso de GraphPad Prism.

EXEMPLO 1 - CICLIZAÇÃO DE T14

[00133] O inventor sintetizou um agente que alveja seletivamente o local alostérico no a7 receptor de acetilcolina nicotínico, para competir pela ligação com T14/T30 e também para antagonizar o β-amiloide. O agente é uma forma cíclica de T14 que tem a sequência de aminoácidos: AEFHRWSSYMVHWK [SEQ ID No:4], com o resíduo de alanina de N- terminal que é conectado ao resíduo de lisina de C-terminal. O Genosphere Biotechnologies (França) realizou a ciclização de T14 transformando-se o peptídeo linear em uma lactama de N- terminal em C-terminal. Os exemplos a seguir demonstram, pela primeira vez, como o peptídeo de T14 cíclico bloqueia os efeitos tóxicos estabilizados do peptídeo de T30 e amiloide in vitro.

EXEMPLO 2 - T14 CÍCLICO NÃO É TÓXICO QUANDO APLICADO SOZINHO

[00134] Com o uso de sulfo rodamina B (SRB) como um método de detecção de viabilidade celular, as células PC12 foram tratadas por 1 hora com T14 cíclico produzido no exemplo 1. Como resultado, nenhuma alteração na viabilidade celular foi observada sugerindo toxicidade alguma em concentrações tão elevadas quanto 100 μM (100 nM: 98,76 ± 15,15; 700 nM: 106,94 ± 19,92; 1 μM: 104,82 ± 10,9; 100 μM: 93,58 ± 11,62) (consulte a Figura 1).

EXEMPLO 3 - T14 CÍCLICO NÃO AFETA A ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE ACHE

[00135] O inventor decidiu, em seguida, confirmar se o T14 cíclico afeta ou não a atividade enzimática de acetilcolinesterase (AChE). A atividade enzimática de AChE foi medida com o uso do ensaio de atividade de acetilcolinesterase. O inventor concluiu que a presença de T14 cíclico (2 μM) não afetou a atividade enzimática de acetilcolinesterase: em contrapartida, a galantamina (2 μM) era fortemente inibitória (consulte a Figura 2).

EXEMPLO 4 - T14 CÍCLICO NÃO PROTEGE CONTRA TOXICIDADE NÃO ESPECÍFICA DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

[00136] Os inventores determinaram então se o T14 cíclico protege ou não as células PC 12 contra os efeitos citotóxicos não específicos do peróxido de hidrogênio. Conforme pode ser visto na Figura 3, não há diferença significativa quando H2O2 é dada por si só ou em combinação com T14 cíclico.

EXEMPLO 5 - T14 CÍCLICO PROTEGE AS CÉLULAS CONTRA A TOXICIDADE DE T14, T30 E B-AMILOIDE

[00137] Com o uso de SRB como um método de detecção de viabilidade celular, as células PC12 foram tratadas por 1 hora com (4A) β-amiloide, (4B) T14 linear ou (4C) T30, por si só ou combinadas com T14 cíclico (100 nM). Conforme mostrado na Figura 4, os três peptídeos por si só induzem uma diminuição na viabilidade celular (Aβ: 69,875 ± 4,38; T14: 83,02 ± 5,385 e T30: 68,395 ± 3,095), mas quando combinadas com as células de T14 cíclico foram surpreendentemente protegidas da morte (Aβ + C14: 94,475 ± 7,4; T14 + C14: 99,4 ± 12,475; T30 + C14: 88,59 ± 8,785).

EXEMPLO 6 - T14 CÍCLICO BLOQUEIA A LIBERAÇÃO DE ACHE INDUZIDA POR T14 E T30

[00138] O ensaio de Ellman colorimétrico foi usado para avaliar a atividade de AChE como uma resposta compensatória após um estímulo tóxico. As células foram tratadas por 1 hora com T14 e T30 linear (10 μM) por si só e combinadas com T14 cíclico (100 nM) (consulte a Figura 5). Todos os peptídeos induzem a um aumento de atividade de AChE (T30: 129,10 ± 1,18; T14: 123.0 ± 0,62) que foi parcialmente bloqueado quando combinado com o T14 cíclico (T30 + C14: 110,58 ± 0,80; T14 + C14: 112,30 ± 1,39).

EXEMPLO 7 - B-AMILOIDE, T30 E T14 DESLOCAM A LIGAÇÃO DE IVERMECTINA [3H]

[00139] A fim de demonstrar que o α7nAChR (o α7 receptor de acetilcolina nicotínico) é um alvo para o β-amiloide, T30 e T14 nas preparações usadas no presente documento. Os ensaios de ligação de Ivermectina [3H] foram realizados na membrana celular de PC12 e demonstraram de uma maneira de resposta à dosagem registrada uma diminuição da afinidade do local alostérico do receptor onde o ligante Ivermectina [3H] faz ligação (consulte a Tabela 1, Figura 6). TABELA 1 - OS DADOS MOSTRAM A PORCENTAGEM DE IVERMECTINA [3H] QUE LIGA AS CÉLULAS PC12 NA PRESENÇA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE β-AMILOIDE, T30 E T14, N=3.

EXEMPLO 8 - T14 CÍCLICO DESLOCA IVERMECTINA [3H] QUE FAZ LIGAÇÃO COM MAIOR EFICÁCIA DO QUE A GALANTAMINA

[00140] As concentrações micromolares baixas de T14 cíclico deslocaram a Ivermectina [3H] com afinidade semelhante, mas com eficácia significativamente maior do que a galantamina. TABELA 2 - OS DADOS MOSTRAM A PORCENTAGEM DE IVERMECTINA [3H] QUE LIGA AS CÉLULAS PC12 NA PRESENÇA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE T14 CÍCLICO E GALANTAMINA, N=6

EXEMPLO 9 - T14 CÍCLICO PROTEGE AS CÉLULAS CONTRA A TOXICIDADE DE B-AMILOIDE COM MAIOR EFICÁCIA DO QUE A GALANTAMINA

[00141] Com o uso de SRB como um método de detecção de viabilidade celular, as células PC12 foram tratadas por 1 hora com β-amiloide por si só ou combinadas com T14 cíclico (1nM) ou galantamina (100 nM). Conforme mostrado na Figura 8, o T14 cíclico protegeu contra a toxicidade de Aβ (97,34 ± 9,57) em uma ordens de magnitude de dosagem menor do que a galantamina (98,79 ± 14,21).

EXEMPLO 10 - CONCENTRAÇÃO MÍNIMA DE T14 CÍCLICO EXIGIDA PARA 100 % DE PROTEÇÃO CONTRA B-AMILOIDE

[00142] Com o uso de SRB como um método de detecção de viabilidade celular, as células PC12 foram tratadas por 1 hora com β-amiloide combinadas com T14 cíclico em concentrações que aumentam de 0,5 nM a 100 nM (0,5: 88,49 ± 10; 1: 97,34 ± 9,57; 10: 102,28 ± 8,53; 50: 101,79 ± 13,99; 100: 103,68 ± 6,34). A dose limítrofe para a proteção total era 1 nM (Figura 9).

EXEMPLO 11 - T14 CÍCLICO REDUZ OS NÍVEIS DE CA2+ EM CORTES DO CÉREBRO DE RATO

[00143] A fluorometria foi usada para detectar variações de níveis de cálcio após o tratamento por duas horas com T14 cíclico de 1 μM, β-amiloide de 10 μM e ambos combinados. O T14 cíclico não altera o nível basal de cálcio intracelular enquanto o β-amiloide induz o nível de intracelular de cálcio, que é retornado para a linha de base por T14 cíclico (consulte a A Figura 10).

EXEMPLO 12 - T30 EXIBE UMA AFINIDADE DE LIGAÇÃO ELEVADA PARA O LOCAL ALOSTÉRICO DO A7 RECEPTOR NICOTÍNICO

[00144] Com o uso de testes para viabilidade, o inventor mostrou que o T30 tem uma afinidade de ligação de aproximadamente três ordens de magnitude superiores (5 nM) para o local alostérico no a7 receptor nicotínico, do que os fármacos atualmente em uso clínico, por exemplo, galantamina (10 μM).

DISCUSSÃO GERAL

[00145] O T14 cíclico é um modulador alostérico inerte de α7 receptor nicotínico inovador do α7 receptor nicotínico que antagoniza a ação de peptídeos T30 e de beta amiloide

[00146] O T14 cíclico é um antagonista do α7 receptor nicotínico. A ineficácia de proteção contra o peróxido de hidrogênio de agente não específico sugere que a ação de bloqueio de T14 cíclico é seletiva e o receptor mediado. O T14 cíclico antagoniza os efeitos tóxicos de T30 em uma variedade de testes que indicam que o mesmo impede o fluxo de entrada adicional de cálcio através de um local alostérico no a7 receptor através da competição para a ligação com T30 assim como com amiloide. A estabilidade otimizada de peptídeos cíclicos justificaria esse deslocamento eficaz.

[00147] Por que um fármaco a base de T14 cíclico seria mais eficaz do que os tratamentos atualmente disponíveis?

[00148] O inventor mostrou recentemente que o T30 tem uma afinidade de ligação de aproximadamente três ordens de magnitude superiores (5 nM) para o local alostérico no a7 receptor, do que os fármacos atualmente em uso clínico, por exemplo, galantamina (10 μM). De fato, essa observação sugeriria a razão pela qual tais fármacos que são atualmente prescritos provaram ser relativamente decepcionantes (consulte a Tabela 1; Kramp & Herrling, 2011, Neurodegenerative Dis 8,44 a 94): se o T30 endógeno, em excesso no cérebro do paciente com Alzheimer, já ocupa o local chave, o mesmo não será deslocado pela competição de baixa afinidade. No entanto, o mesmo seria bloqueado por um agente com afinidades de ligação muito semelhantes ou, de fato, superiores, conforme sugerido no presente documento (consulte a Figura 7). Tal agente tem, portanto, o potencial para ser um fármaco altamente eficaz.

[00149] Uma vantagem adicional do T14 cíclico é que, ao contrário da galantamina, que é adicionalmente um inibidor de AChE, não teria outras ações biológicas, além de se ligar ao receptor. Se, conforme o trabalho anterior do inventor sugere (Greenfield, 2013, Chem Biol Interact. 203(3):543 a 546), T30 é, de fato, a molécula de sinalização central em doenças neurodegenerativas, então, seu antagonismo combateria essas doenças no nível mais fundamental e específico. Em qualquer caso, a observação de que esse agente inovador também antagoniza o amiloide seria de grande interesse clínico, onde o amiloide é implicado no processo degenerativo, independente de seu papel preciso. Seria notado que enquanto outros candidatos terapêuticos que alvejam a disponibilidade de β- amiloide (por exemplo, inibidores de gama secretase) era ineficazes, essa é a primeira ocasião, do bloqueio efetivo de toxicidade de amiloide.TABELA 3 - COMPARAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS DE GALANTAMINA CONTRA FÁRMACO À BASE DE T14 CÍCLICO

[00150] O inventor acredita que os resultados atuais sugerem que a conformação de T14 cíclico permite que o mesmo se ligue ao α7receptor nicotínico alvo específico. Com referência à Figura 12, mostra-se um diagrama esquemático do α7 receptor nicotínico. O receptor homomérico contém cinco a7 subunidades idênticas, que são, cada uma, simetricamente dispostas ao redor de um poro central através dos quais os íons, como Na+ e Ca2+, passam quando o receptor é ativado. Cada a7 subunidade contém um local de ligação ortoestética (isto é, o local ativo) e um local de ligação alostérica. A ativação fisiológica normal do receptor é alcançada pela ligação de uma única molécula de acetilcolina à interface de duas a7 subunidades por meio de cada um de seus locais ortoestéricos. Outros ligantes conhecidos do local ortoestérico incluem (mas sem limitação) colina e metilicaconitina (MLA). Os ligantes do local alostérico incluem (mas sem limitação) T14 linear e cíclico, T30 linear e cíclico, galantamina, ivermectina e PNU12.

[00151] Conforme mostrado na Figura 10, embora não se deseje se ater a essa teoria, o inventor acredita que o β-amiloide (Aβ) tem a capacidade de (i) simultaneamente se ligar tanto aos locais ligação ortoestériocos quanto alostéricos do a7 receptor nicotínico, ou (ii) se ligar não especificamente a um local qualquer dentre esses locais. O inventor conclui que o T14 cíclico age como um antagonista no local alostérico.

PROJETO DO FÁRMACO

[00152] O inventor acredita que será possível usar a conformação específica de T14 cíclico para projetar um composto químico muito menor que ainda imita, não obstante, a forma tridimensional de T14 cíclico e tem a capacidade de cruzar a barreira entre sangue e cérebro mais rapidamente.

EXEMPLO 13 - DISTINÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE T-14 CÍCLICO (ISTO É, REFERIDO COMO “NBP14”) ANTECEDENTES

[00153] A solubilidade de um composto em soluções aquosas e orgânicas afeta fortemente sua habilidade de cruzar as barreiras fisiológicas no corpo, como gástrica ou enteral. No caso de fármacos que alvejam doenças cerebrais, por exemplo, demência, uma barreira adicional foi cruzada, a barreira entre sangue e cérebro. O coeficiente de separação, também conhecido como Log P, avalia a habilidade de um composto para a solubilização em água e solvente orgânico, que se correlaciona com a capacidade de um composto cruzar as diferentes barreiras biológicas.

MÉTODOS DETALHADOS PREPARAÇÃO DE SOLVENTE

[00154] A saturação dos solventes foi realizada conforme segue. 1-octanol foi agitado na presença de água por 24 h em temperatura ambiente. mQ de água foi agitado na presença de 1- octanol por 24 h em temperatura ambiente. Então, as soluções foram deixadas para equilibrar de um dia para o outro em temperatura ambiente. Os solventes saturados foram coletados, com o uso de seringas e agulhas e armazenados em temperatura ambiente até o próximo uso.

MÉTODO DE TUBO DE AGITAÇÃO

[00155] A água saturada e o 1-octanol saturado foram colocados em um tubo de vidro nas razões a seguir: Cada tubo continha o equivalente de 0,25 mg de T14 cíclico. Todos os tubos foram, então, misturados por 4 h em temperatura ambiente. Após agitação, os tubos foram deixados em temperatura ambiente para equilibrar.

CURVA PADRÃO

[00156] As concentrações de T14 cíclico usadas para a curva padrão eram: 0,5mg.ml-1, 0,25mg.ml-1, 0,13mg.ml-1, 0,066mg.ml-1,0,033mg.ml-1 e 0,016mg/ml-1. A absorvância da curva padrão foi medida em 280 nm.

ANÁLISE DE AMOSTRA

[00157] Ambas as frações de cada amostra foram coletadas separadamente com o uso de uma seringa com agulha. A absorbância de todas as frações foi medida em 280 nm e a concentração de toda a fração foi estimada com base na curva padrão. O coeficiente de separação de T14 cíclico foi calculado com o uso da equação a seguir:Log P = Log (Concentração em Octanol/ Concentração em Água)

[00158] Os resultados de cada condição tiveram a média calculada a fim de obter o Log P de T14 cíclico.

RESULTADOS E SUAS IMPLICAÇÕES

[00159] O Log P médio de T14 cíclico é -0,5899. Um valor negativo para Log P significa que o composto é mais provável de ser hidrofílico. No entanto, um Log P perto de 0 corresponde a um composto com a habilidade de ser solúvel em um ambiente lipofílico também. Por isso, NBP14 pode ser formulado para cruzar o BBB.

EXEMPLO 14 - EFEITOS DE T30 E T-14 CÍCLICO (ISTO É, NBP-14) EM CÉLULAS PC12

[00160] Para distinguir adicionalmente os efeitos protetores da toxicidade de NBP-14 contra T30, os inventores determinaram que o efeito de concentração em três sistemas in vitro ((A) fluxo de entrada de cálcio; (B) liberação de AChE; (C) viabilidade celular), conforme detalhado na seção de métodos abaixo.

MÉTODOS (A) FLUXO DE ENTRADA DE CÁLCIO

[00161] As células PC12 são colocadas em placas em 200 μl de meio de crescimento completo no dia antes do experimento em placas de 96 poços. No dia do experimento, a solução Fluo-8 (Abcam) é preparada (conforme o protocolo do fornecedor). Subsequentemente, 100 μl de meio de crescimento é removido e 100 μl de solução Fluo-8 é adicionado. Os tratamentos com T30 e NBP-14 são adicionados e incubados por 30 minutos na incubadora e 30 minutos em temperatura ambiente.

[00162] Após 1 hora, a placa é colocada no leitor de placa de fluorescência (Fluostar). Antes da leitura de fluorescência, os 100 μM de acetilcolina (ACh) são preparados e colocados no injetor de Fluostar. Para cada poço, a leitura será formada por uma fluorescência basal seguida de injeção de acetilcolina que irá induzir um aumento de cálcio por meio de receptores nicotínicos. Os efeitos de T30 e NBP-14 são, então, avaliados.

(B) Liberação de ACHE

[00163] O protocolo usado para detectar alterações na atividade de AChE é o mesmo que o descrito anteriormente.

(C) VIABILIDADE CELULAR

[00164] Um Kit de Contagem de Célula 8 (CCK-8) foi usado como um aprimoramento da técnica de SRB usada antes. Com a utilização de WST-8 de sal de tetrazólio altamente solúvel em água, CCK-8 produz um corante de formazan solúvel em água na redução na presença de um carreador de elétron. WST-8 é reduzido através de desidrogenase em células para fornecer um produto colorido amarelo (formazan), que é solúvel no meio de cultura de tecido. A quantidade do corante de formazan gerada pela atividade de desidrogenases em células é diretamente proporcional ao número de células vivas. As células PC12 são colocadas em placas em 200 μl de meio de crescimento completo no dia antes do experimento em placas de 96 poços. Os tratamentos com T30 e NBP-14 são adicionados e incubados por 1 hora na incubadora.

[00165] Subsequentemente, 100 μl de meio de crescimento é removido e 10 μl de solução de CCK-8 (Kit de Contagem de Célula 8) é adicionado. A placa é incubada por 2 horas na incubadora e, então colocada no leitor de placa de absorbância. A absorbância deve ser medida em 450 nm.

(A) FLUXO DE ENTRADA DE CÁLCIO

[00166] Conforme afirmado anteriormente, T30 é um modulador alostérico positivo do α7 receptor nicotínico. Por isso, a acetilcolina de agonista primário foi usado para analisar comparativamente o fluxo de entrada de cálcio de controle como 100%). T30 (5 uM) intensificou esse efeito até 171,05 % ± 6,21%; N=3. As concentrações crescentes de NBP-14 (5, 7, 9, 10, 20, 50, 70, 1.000, 5.000 nM) foram subsequentemente adicionadas para determinar o antagonismo desses aumentos induzidos por T30. Os valores são (respectivamente) (%): 134,2497 ± 6,85, 120,8612 ± 8,65, 113,9162 ± 8,82, 140,776 ± 12,16, 115,83 ± 7,67, 110,3213 ± 13,21, 125,9596 ± 0,1, 99,85 ± 0,32, 115,1942 ± 9,84, 79,99 ± 14,04. A Figura 13 mostra que NBP-14 bloqueia os efeitos de T30 de uma maneira de concentração, que é protetora na faixa nanomolar baixa.

(B) Liberação de ACHE

[00167] Conforme descrito acima, as células PC12 respondem ao efeito tóxico de T30 com uma resposta "compensatória", isto é, um aumento na atividade de AChE liberada: 169,45 % ± 2,11 %; N=3. Os inventores determinaram o efeito dependente de dose de NBP-14 contra 5uM de T30. Os resultados mostram (Figura 14) que NBP-14 protege contra os efeitos compensatórios de AChE em concentrações nanomolares elevadas. Os valores são (respectivamente) (%): 130,73 ± 1,84, 111,68 ± 2,26, 92,78 ± 0,99, 82,56 ± 2,38, 68,90 ± 0,92, 65,12 ± 1,32, 61,04 ± 0,97,79,43 ± 1,69 ± 1,24, 83,91 ± 1,24, 89,55 ± 1,25.

(C) VIABILIDADE CELULAR

[00168] O T30 (5 uM) induz uma diminuição de 25% (74,309% ± 2,87%; N=3) de viabilidade celular que é progressivamente bloqueada por NBP-14 de uma maneira de efeito e concentração (Figura 15). Os valores são (respectivamente) (%): 76,25 ± 7,51, 67,04 ± 4,35, 76,04 ± 4,22, 71,36 ± 1,64, 79,02 ± 10,22, 75,19 ± 3,9, 62,43 ± 3,01, 78,10 ± 2,16, 116,65 ± 3,62, 107,79 ± 5,10. O NBP-14 protege contra a morte celular induzida por T30 na faixa nanomolar elevada.

EXEMPLO 15 - EFEITOS DE T30 E T-14 CÍCLICO (ISTO É, NBP14) EM REDES CORTICAIS IN VITRO EM CORTES DO CÉREBRO DE RATO ANTECEDENTES

[00169] O peptídeo de T30 é um segmento de acetilcolinesterase (AChE) de 30 aminoácidos, do qual o T14 também é clivado. Ambos induzem o mesmo efeito que sugere que sua sequência ativa está presente no T14 e, sucessivamente, presente no T30. A pesquisa já mostrou a bioatividade de T14 em cortes do cérebro de mamífero como um agente altamente modulador. Os efeitos do T14 foram relatados para modular redes corticais, que induzem tanto a excitação quanto a inibição em diferentes concentrações: em baixas concentrações o peptídeo dispara o fluxo de entrada de cálcio intensificado por meio do alfa-7 receptor, mas altas concentrações induzem tais quantidades excessivas de cálcio que o canal inativa (Badin et al., 2013; Bon and Greenfield, 2003), assim como dispara a plasticidade neuronal (Greenfield et al., 2004).

[00170] A fim de ganhar compreensão adicional das ações de T14/30 em todas as redes corticais, a técnica relativamente recente de imageamento de corante sensível à tensão (VSDI) foi usada a fim de monitorar a dinâmica de atividade de população neuronal coletiva, "conjuntos neuronais", em cortes do cérebro em uma escala temporal de milissegundos (ms, proporcional aos eventos fisiológicos) e micrômetros (μm). Tal técnica explora a sensibilidade de moléculas lipofílicas específicas que contêm um núcleo fluorescente às alterações em potenciais elétricos (Tominaga et al., 2000). Devido a sua natureza lipofílica, essas moléculas de corante se incrustam em membranas celulares, e alteram sua leitura de fluorescência em relação ao potencial de tensão através dessa membrana específica, que é capturada com uma câmera de alta velocidade e resolução de milissegundos. Como resultado, o imageamento que causa corantes sensíveis à tensão fornece uma leitura direta e on-line de alterações de potencial elétrico através de membranas celulares neuronais com uma resolução espaço- temporal inigualável.

[00171] Com o uso dessa técnica, os inventores podem obter conjuntos de dados compreensivos quanto à atividade de população neuronal como (a) a intensidade da resposta de qualquer dada área, da qual (b) a dispersão de conjuntos neuronais produzidos pode ser medida, e a partir desse parâmetro (c) a velocidade de propagação da frente de onda de atividade a partir do ponto de iniciação (d) medida como o declive da dispersão. Cada um desses parâmetros foi medido independentemente para dois experimentos realizados até o momento: 1) uma investigação dos efeitos induzidos aumentando- se as concentrações (0,5, 0,75, 1 & 5 μM) de T30 em atividade de população cortical e responsividade, e 2) a avaliação dos efeitos antagonísticos de NBP-14 em uma única e relativamente alta (1 uM) concentração de T30.

[00172] • Técnica usada: imageamento de corante sensível à tensão (Di-4-ANEPPS) de cortes do cérebro (Wistar) de rato p14 de tálamo-cortical (TC).

[00173] • Paradigma de estímulo: 40 Hz (consistente com estímulos recorrentes tálamo-corticais) de estímulo de pulso emparelhado.

[00174] • Paradigma de perfusão: períodos realizados em duas fases - para toda perfusão de fármaco (diga-se: controle, 0,1 uM de T30 etc.), a nova perfusão foi aplicada e deixada para perfundir por 15 minutos antes de iniciar o período de registro (15 minutos também), de modo que o fármaco tenha tempo para alcançar sua concentração real e induza seus efeitos dependentes de concentração uma vez no registro. O significado é que um período de perfusão durou 30 minutos, com o registro apenas levando em consideração os últimos 15 minutos de seu respectivo período de perfusão.

MÉTODOS DETALHADOS PREPARAÇÃO DE CORTE CEREBRAL

[00175] Os ratos machos Wistar (14 a 17 dias de idade; 15 animais individuais no total) foram anestesiados com o uso de isoflurano: 10 ml de 100% p/p de isoflurano foram aplicados ao leito de algodão no fundo de uma câmara de anestesia (caixa de vidro 20x15x15 cm) onde os ratos foram então colocados por ~45 segundos até o início da anestesia. A pata posterior de cada rato anestesiado foi beliscado para verificar a profundidade adequada da anestesia. Uma vez que a anestesia foi confirmada, os ratos foram rapidamente decapitados antes de imergir o cérebro em fluido cerebroespinhal artificial gelado oxigenado ("corte" de aCSF em mmol: 120 de NaCl, 5 de KCl, 20 de NaHCO3, 2,4 de CaCl2, 2 de MgSO4, 1,2 de KH2PO4, 10 de glicose, 6,7 HEPES de sal e 3,3 HEPES de ácido; pH: 7,1) por 7 a 8 minutos, o tempo tomado para cortar o cérebro em cortes. As seções parassagitais (400 μm de espessura) foram cortadas a partir de um bloco de cérebro que contém tanto tálamo (VPN) quanto córtex somatossensorial primário (campo de barril) com o uso de um Vibratome (Leica VT1000S) e transferido para um recipiente borbulhador que contém aCSF em temperatura ambiente ("registro" de aCSF em mmol: 124 de NaCl, 3,7 de KCl, 26 de NaHCO3, 2 de CaCl2, 1,3 de MgSO4, 1,3 de KH2PO4 e 10 de glicose; pH: 7,1), que era idêntico àquele que foi usado durante os registros eletrofisiológicos e VSDI. Os cortes foram deixados em "registros" de aCSF oxigenados (95% de O2 a 5% de CO2) para recuperar por pelo menos 1 hora antes do manchamento de VSD.

CONFIGURAÇÃO DE VSD

[00176] Os cortes foram colocados em uma câmara com alta umidade escura cheia com aCSF borbulhando com 95% de O2 a 5% de CO2. A solução de corante (4% de 0,2 mM de corante de estirila piridínio 4-[2-[6-(dibutilamino)-2-naftalenil]-etenil]-1-(3-sulfopropil)hidróxido (Di-4-ANEPPS, Invitrogen, Paisley, Reino Unido) (Tominaga et al., 2000) em aCSF a 46%, soro bovino fetal a 46%, DMSO a 3,5% e cremoforo EL a 0,4%) foi então aplicada aos cortes conforme descrito anteriormente (Badin et al., 2013). Quando começaram os registros de VSD, os cortes foram colocados no banho em um pequeno pedaço de papel de filtro para manter o corte vivo e foi pesado de modo adequado com o uso de uma grade de plástico feita em casa colocada em cima do corte. Por causa do VSD fluorescente, todo o manuseio dos cortes durante e após o manchamento com Di-4-ANEPPS foi realizado em escuridão quase total a fim de manter os efeitos prejudiciais de fototoxicidade e o alvejamento em um mínimo. O VPN (onde os eletrodos estimulantes foram colocados) foi identificado em relação à distância a partir da ponta do hipocampo e até o lado da cápsula interna.

[00177] Os eletrodos estimulantes, com impedância (medidos em 1.000 Hz): 500 kQ, foram colocados em VPN, onde os estímulos de pulso emparelhado (2x 100 μs de duração; 25 milissegundos de intervalo interestímulo - ISI - pulso emparelhado em 40 Hz) foram disparados para incitar ondas de propagação com passo rápido de atividade nos barris inervados com o uso de Spike 2 V6.0 (CED Ltd, Cambridge, Reino Unido) em relação ao ISI adequado. Tais "conjuntos neuronais" transientes foram registrados adquirindo-se imagens de 16 bits com uma resolução de 1 ms com o uso de sistema de imageamento ultrarrápido MiCAM Ultima acoplado a uma câmera digital (Brain Vision MiCAM Ultima R3-V20 Master) com software de imageamento Ultima 2004/08 (Brain Vision). A luz foi gerada com o uso uma lâmpada óptica/visor de xenophot de halogênio da Osram 64634 HLX EFR e foi filtrada para emitir luz verde (530 ± 10 nm) com o uso de um MHF-G150LR (Moritex Corporation). A fluorescência emitida foi passada através de um espelho dicróico e um filtro de passa alta de >590 nm conforme anteriormente descrito (Collins et al., 2007; Devonshire et al., 2010a; Devonshire et al., 2010b; Grandy et al., 2012; Mann et al., 2005).

PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO DE FÁRMACO

[00178] As soluções de T30 e NBP-14 foram preparadas frescas no início de cada experimento, as alíquotas de solução de estoque foram adicionadas ao aCSF de "registro" conforme adequado e o banho foi aplicado em uma taxa constante de 1,5 ml por min. de perfusão com o uso de uma bomba Minipulse 3 (Gilson Scientific Ltd, Bedfordshire, Reino Unido). As condições de perfusão foram separadas em 2: a primeira parte consistia em uma perfusão de 15 minutos sem ocorrer registro, de modo que a concentração adequada poderia ser alcançada no banho de registro registrado antes de iniciar a segunda parte da condição de perfusão - onde ocorreu gravação para os próximos 15 minutos de perfusão (30 fotos instantâneas em média) - dando um total de 30 minutos por condição de perfusão.

ANÁLISE DE DADOS E ESTATÍSTICA

[00179] O VSDI produziu 4 x 4 mm (100 x 100 pixels) de imagens bidimensionais das quais os dados críticos foram extraídos como o curso do tempo de ativação, dispersão e intensidade do sinal produzido em geral. Para cada experimento de VSDI, cada um dos dados de foto instantânea entre 0 e 200 ms após o estímulo, encapsulação da resposta de pico, teve seus parâmetros medidos e com a média calculada para cada condição (total de 30 fotos instantâneas por condição para experimentos tanto de T30 quanto para T30 v NBP-14). A fim de alcançar isso, uma região de interesse (ROI) foi selecionada na área ativa, que abrangeu a largura da resposta máxima após ter sido filtrada com um limite que isolou pixels ativos como aqueles que mostram atividade maior do que 20% da atividade máxima registrada dentro dessa região de interesse. Tais dados foram, então, compilados para produzir gráfico quantitativos detalhados da extensão da intensidade de ativação (Figura 16, 17, 18) assim como mapas de "espaço-tempo" quantitativos (Figura 19) para medir os efeitos registrados assim como para produzir representações visuais precisas dos dados espaço- temporais adquiridos. Todos os testes estatísticos (Análise de Variância - ANOVA) foram realizados com o uso de efeitos misturados não lineares ajustados aos dados com o uso de R Studio enquanto todo o manuseio de dados e análise foi realizado com o uso de Mathematica 8 (Wolfram Research, EUA). Para todos os testes estatísticos P<0,05 foi considerado significativo. Os dados são expressos como a média ± EPM.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[00180] A Figura 16 mostra o efeito de aumentar a dose de T30 em (A) intensidade de fluorescência emitida, assim como em (B) dispersão de pixels ativos. Cada pixel tem dimensões de 40x40 μm que significa que sua fluorescência específica aumenta a partir da atividade de menos de 10 neurônios independentes. À medida que a concentração de T30 aumenta dentro do banho registrado, a intensidade de fluorescência dada pelos pixels ativos diminui. Isso indica uma dessincronização de atividade de população neuronal disparada, como despolarização de membrana neuronal simultânea e dimensionável de uma única quantidade de pixel para uma leitura de fluorescência maior, o efeito oposto é visto no presente (menor sincronia). Adicionalmente, aqui, um paradigma de estímulo de pulso emparelhado de 40 Hz é usado, conforme pode ser visto a partir do gráfico de intensidade (Figura 16A). Os resultados mostram que não só a fluorescência geral é reduzida como resultado do tratamento de T30, como também o segundo pulso (que é disparado em 75 ms, 25 ms após o primeiro - 40 Hz de pulso emparelhado) mostra uma facilitação muito reduzida em comparação com a grandeza do pulso original.

[00181] Ademais, conforme pode ser visto a partir do gráfico de dispersão (Figura 16B), a dispersão de conjuntos corticais não é significativamente afetada por tratamento de T30 até que níveis muito elevados (5 uM) sejam alcançados, isso corrobora com a teoria de que T30 age como um agente modulador em todas as redes corticais. Também é importante manter em mente que os diferentes parâmetros realçados por VSDI, como a velocidade de propagação, a dispersão e a intensidade de fluorescência, frequentemente contam com os princípios fundamentais da dinâmica cortical que não são necessariamente relatados, o que significa que cada um desses parâmetros devem ser analisados separadamente e que seus resultados devem, à princípio, ser interpretados independentemente uns dos outros.

[00182] A Figura 17 mostra o efeito de aumentar a aplicação de T30 na dinâmica de iniciação de conjunto e a propagação foi investigada em mais detalhes. A Figura 17 mostra que o T30 induz uma redução na velocidade de propagação de atividade neuronal (no presente adquirida como o declive da fase de elevação), consistente com uma diminuição na sincronia de redes corticais, conforme mostrado na Figura 16, com uma máxima de uma diminuição de 3,5 vezes na velocidade de propagação sob 5 μM de tratamento de T30. Resultante dos experimentos acima e anteriores, concluiu-se que a concentração de T30 a 5 μM era muito alta à medida que induzia, provavelmente, fluxo de entrada de cálcio suficiente para estar no limite para inativação do canal de íon, levando assim a uma mistura de efeitos de excitação/inibição dependendo da sensibilidade da preparação específica, conforme relatado anteriormente (Bon and Greenfield, 2003). Os inventores, portanto, usaram uma concentração inferior, porém suficientemente potente de T30 a 1 μM, para realizar os experimentos subsequentes que exploram os efeitos antagonísticos possíveis de NBP14. Essa concentração de T30, embora ainda um tanto elevada, foi escolhida por causa da natureza do presente estudo, em que um efeito de diluição inevitável deve ser esperado à medida que o peptídeo penetra no corte cerebral. Enquanto isso, para NPB14, foram usadas concentrações crescentes de: 0,1, 5, 100 e 300 nM, isto é, 2 a 4 ordens de magnitude menores do que as concentrações de T30, uma vez que os estudos in vitro anteriores em células PC 12 indicaram uma afinidade muito maior para alfa-7 receptores de acetilcolina nicotínicos em comparação com aquelas de T30.

[00183] A Figura 18 mostra o antagonismo de efeitos de T30 aumentando-se as concentrações de NBP-14. A Figura mostra a natureza antagonista de NBP-14 nos efeitos modulatórios induzidos pela perfusão de T30 em populações neuronais. Uma importante consideração é o fator de diluição à medida que o T30 penetra nos cortes, que inclui todos os processos fisiológicos potencialmente ainda presentes e ativos dentro de cortes do cérebro, como proteases, admissão de neurotransmissor e a densidade da matriz extracelular; portanto, parece altamente provável que uma concentração de 1 μM de T30 levaria tempo para induzir seus efeitos totais (45 a 60 minutos, conforme sugerido pelos dados apresentados acima).Mantendo isso em mente, os efeitos de T30 se tornam evidentes durante a perfusão de 5 nM de NBP-14 (linha/barra laranja), após a qual a tendência induzida por T30 é revertida de volta para a linha de base (barra/linha azul).

[00184] É importante notar também que o NBP-14 foi mostrado para ser inerte, nunca induzindo quaisquer efeitos moduladores em si próprio, que implica que os efeitos vistos no presente documento são, à princípio, atribuíveis ao T30, e sua inversão ao antagonismo aumentando-se as concentrações de NBP-14. De modo importante, a grande maioria dos efeitos de T14 são reduzidos de volta para os níveis de controle sob a perfusão de 300 nM de NBP-14, enquanto T30 é perfundido em uma concentração de 1.000 nM. Isso sugere uma afinidade significativamente maior de NBP-14 para seu alvo em comparação com T30.

[00185] A Figura 19 mostra resultados quantitativos de três experimentos (isto é, colunas esquerda, central e direita) onde os efeitos de T30 (1 μM) foram testados contra as concentrações crescentes de NBP-14 (0,1, 5, 100 e 300 nM). O painel superior mostra os dois gráficos de dados de média principais: esquerda - Intensidade de sinal de fluorescência e direita - dispersão de conjuntos evocados. O painel de fundo mostra mapas de "espaço-tempo" que mapeiam a atividade de uma fileira de pixels que se estende sobre a área de interesse (eixo geométrico y) com o tempo (310 ms no total, eixo geométrico x) para cada uma das condições de perfusão. A redução drástica na intensidade de fluorescência como um resultado da coperfusão de T30 e NBP-14 é claramente evidente, conforme está no gráfico de Intensidade. Nota: os mapas de espaço-tempo são rotulados com sua respectiva perfusão (esquerda), e são codificados por cor para seus traços correspondentes tanto nos gráficos de intensidade (direita) quanto de difusão (esquerda). REFERÊNCIAS Badin, A.S., J. Eraifej, e S. Greenfield. 2013. High- resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73C:10 a 18. Bon, C.L., e S.A. Greenfield. 2003. Bioactivity of a peptide derived from acetylcholinesterase: electrophysiological characterization in guinea-pig hippocampus. Eur J Neurosci. 17:1991 a 1995. Collins, T.F., E.O. Mann, M.R. Hill, E.J. Dommett, e S.A. Greenfield. 2007. Dynamics of neuronal assemblies are modulated by anaesthetics but not analgesics. Eur J Anaesthesiol. 24:609 a 614. Devonshire, I.M., E.J. Dommett, T.H. Grandy, A.C. Halliday, e S.A. Greenfield. 2010a. Environmental enrichment differentially modifies specific components of sensory-evoked activity in rat barrel cortex as revealed by simultaneous electrophysiological recordings and optical imaging in vivo. Neuroscience. 170:662 a 669. Devonshire, I.M., T.H. Grandy, E.J. Dommett, e S.A. Greenfield. 2010b. Effects of urethane anaesthesia on sensory processing in the rat barrel cortex revealed by combined optical imaging and electrophysiology. Eur J Neurosci. 32:786 a 797. Grandy, T.H., S.A. Greenfield, e I.M. Devonshire. 2012. An evaluation of in vivo voltage-sensitive dyes: pharmacological side effects and signal-to-noise ratios after effective removal of brain-pulsation artifacts. Journal of neurophysiology. 108:2.931 a 2.945. Greenfield, S.A., T. Day, E.O. Mann, e I. Bermudez. 2004. A novel peptide modulates alpha7 nicotinic receptor responses: implications for a possible trophic-toxic mechanism within the brain. J Neurochem. 90:325 a 331. Mann, E.O., T. Tominaga, M. Ichikawa, e S.A. Greenfield. 2005. Cholinergic modulation of the spatiotemporal pattern of hippocampal activity in vitro. Neuropharmacology. 48:118 a 133. Tominaga, T., Y. Tominaga, H. Yamada, G. Matsumoto, e M. Ichikawa. 2000. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4- ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of neuroscience methods. 102:11 a 23.

EXEMPLO 16 - EFEITOS DE NBP 14 NO RATO QUE SE MOVE LIVREMENTE ANTECEDENTES

[00186] Ao contrário dos modelos animais para doença de Alzheimer, o modelo de rato para hemi-Parkinsonismo é muito bem estabelecido e prontamente quantificável. Dessa maneira, uma injeção intraestriado unilateral do T30 foi administrada para observar quaisquer efeitos comportamentais da toxina. Em um experimento subsequente, os efeitos protetores potenciais de NBP14 foram observados contra a neurotoxina bem conhecida 6-hidroxidopamina (6-OHDA), que leva à perda de neurônio DA no lado injetado enquanto limita os neurônios DA contralaterais. O NBP-14 foi administrado por meio a cânula implantada no feixe de prosencéfalo medial (MFB). A 6-hidroxidopamina foi injetada a 10 mg/kg.

MÉTODOS DETALHADOS

[00187] Os animais são anestesiados com o uso de Cetamina (10%; 0,1 ml/kg de peso corporal) e Xilazina (2%; 0,01 ml/kg).Os animais são então estereotaticamente injetados no MFB com 2μl de 6-OHDA em uma concentração de 20 mg/ml em 0,02% de ácido ascórbico. As coordenadas de lesões são estabelecidas de acordo com bregma e dura-máter em cm: L-1,7 mm; AP-3,6 mm; DV- 8,0 mm. Seguindo a injeção (taxa de injeção 2 μl/5 min), a agulha de injeção é deixada por mais um 1 minuto para evitar o fluxo de retorno e, então, lentamente retardado.

[00188] Teste de colocação de pata (Teste de Cilindro): Esse teste avalia o uso de uma pata dianteira independente do rato para sustentar o corpo contra as paredes de um confinamento cilíndrico. Os testes levam a vantagem do impulso inato dos animais para explorar um ambiente inovador sustentando-se nas patas posteriores e se inclinando para as paredes de confinamento. Para realizar esse teste, os ratos foram colocados individualmente em um cilindro de vidro (21 cm de diâmetro, 34 cm de altura) e a exploração da parede é registrada por 3 minutos. Nenhuma habituação ao cilindro antes do registro é permitida. A exploração de parede é expressa em termos da razão entre as pernas intactas (R) e prejudicadas (L) e calculada como os valores de patas dianteiras direitos intactos +ambas as patas divididos nos valores de patas dianteiras esquerda prejudicadas +ambas as patas dianteiras (R/L). O teste de colocação de pata é conduzido no Dia -1 para obter dados de linha de base, no Dia 1 para seleção e nos dias 2.

[00189] Critérios de seleção (Dia1): De acordo com o teste de colocação de pata, todos os animais com diferença estatisticamente significativa entre as patas serão incluídos no estudo (razão entre as pernas intactas (R) e prejudicadas (L) é expressa como os valores de patas dianteiras direitas intactas +ambas as patas dianteiras divididos nos valores de patas dianteiras esquerdas intactas +ambas as patas dianteiras).

[00190] Os resultados de todos os testes serão apresentados como um valor de grupo MÉDIO ± EPM. A análise dos dados por uma ANOVA unidirecional que segue o teste de Tukey será aplicada para determinar a significância de efeitos de tratamento. Esse estudo foi realizado seguindo a aprovação de uma forma de aplicação submetida ao Comitê para Conduta Ética nos Cuidados e Uso de Animais de Laboratório que determina que o presente estudo está de acordo com as regras e regulamentos estabelecidos.

[00191] A Figura 20 resume o procedimento seguido durante o teste in vivo de NBP-14.

RESULTADOS EFEITOS DE NBP14

[00192] A análise da razão entre R/L de colocação de pata reflete a lesão unilateral da função de motor. No dia 2, isto é, dois dias após a injeção de 6-OHDA e um dia após a injeção de NBP-14, havia uma diferença significativa na razão entre R/L de colocação de pata entre o veículo de 6-OHDA e tratou: 7,54±1,63 contra 3,62±0,55, respectivamente (p<0,05). O tratamento com NBP-14 aprimorou a mobilidade da pata anterior prejudicada após uma dosagem conforme foi mostrado no teste de colocação de pata (Figura 21).

EXEMPLO 17 - EFEITOS DE T30 E NBP14 EM APP E AMILOIDE ANTECEDENTES

[00193] Já foi estabelecido que um excesso de cálcio pode disparar a clivagem anormal de proteína de precursor de amiloide (APP) e, por isso, a liberação de amiloide beta (Aβ) (Hartigan e Johnson, 1999; Cai et al., 2012). Uma vez que os inventores mostraram que T30 aumenta o fluxo de entrada de cálcio pro cerca de 70% nas células PC12, é possível que tal aumento de cálcio irá disparar a produção de amiloide e uma diminuição consequente na molécula de APP de comprimento total.

METODOLOGIA DETALHADA: DETECÇÃO DE APP PROTOCOLO PARA SOLUBILIZAR PROTEÍNA

[00194] As células PC12 são colocadas com o meio de crescimento em discos de Petri por uma semana a fim de ter proteína suficiente para detectar o APP em membranas de PC12 e tratou por 1 hora com T30 e NBP-14 antes de solubilizar a proteína. Uma vez que as células foram cultivadas até 90% de confluência, o meio de crescimento é removido e as células são ressuspensas em 2 ml de HBSS. A suspensão de células é transferida para um tubo de 15 ml e centrifugada por 5 minutos a 1.000 rpm. Então, o supernadante é descartado e o pélete é ressuspenso em tampão de Lise (20 mM de Tris, 137 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 2mM de EDTA; pH 8) mais inibidores de protease (1 μl:1 ml de PMSF e 3 μl:1 ml de aprotinina) e triturado com o uso de um Polytron por 10 segundos. Subsequentemente, o pélete triturado é distribuído em tubo eppendorf de 1,5 ml girado ou agitado por 2 h a 4 °C. Após 2 h, os tubos de eppendorf são centrifugados a 15.000 rpm por 20 minutos e o supernadante é mantido. O reagente Bradford é usado para quantificar a proteína contida em cada tubo eppendorf.

PROTOCOLO PARA ELETROFORESE

[00195] Para a detecção de APP, uma alíquota de 25 μg de proteína é usada. Antes de iniciar o protocolo os reagentes são preparados conforme segue:

GEL INFERIOR (10%) (20 MIN PARA POLIMERIZAR)

[00196] Para 10 ml (2 géis):3,6 ml de H2O MQ, 2,42 ml de Acrilamida e 1,3 ml de Bis-Acrilamida, 2,5 ml de Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, 0,11 ml de SDS a 10%, 0,06 ml de persulfato de amônio a 10%, 6,67 μl de TEMED (último ingrediente).

GEL SUPERIOR (5%) (20 MIN PARA POLIMERIZAR)

[00197] Para 5 ml (2 géis): 3,67 ml de H2O MQ, 0,48 ml de Acrilamida e 0,26 ml de Bis-Acrilamida, 0,625 ml de Tris-HCl 1 M pH 6,8, 0,05 ml de SDS a 10%, 25 μl de persulfato de amônio a 10%, 5 μl de TEMED.

TRIS-HCL COM 1,5 M, PH 8,8

[00198] Para 100 ml: 18,16 g de base Tris, qsp 100 ml de H2O MQ, pH 8,8.

TRIS-HCL COM 1 M, PH 6,8

[00199] Para 100 ml: 12,1 g de base Tris, qsp 100 ml de H2O MQ, pH 6,8.

TAMPÃO DE AMOSTRA (4X)

[00200] Para 8 ml: 3,2 ml de SDS a 10%, 1,6 ml de Glicerol, 2 ml de Tris-HCl a 1 M, pH 6,8, 0,8 ml de B-Mercaptoetanol, 0,4 ml de Azul de Bromofenol a 0,1% ou Vermelho. (Uso de 1X por experimento)

TAMPÃO CONTÍNUO (10X)

[00201] Para 1 l: 30,3 g de base Tris, 144 g de glicina, 10 g de SDS, qsp 1 l de H2O MQ. (Uso de 1X por experimento)

[00202] As etapas para a eletroforese são as seguintes: a) Preparar os géis de Acrilamida inferior e superior. A % para gel de APP é 10% de gel inferior e 5% de gel de empilhamento. b) Preparar 24 μl de amostra em uma concentração de 25 μg (determinada pelo Ensaio de Bradford) (6 μl de SB 4X que contém β-mercaptoetanol + proteína + lise) e ferver os mesmos a 100 °C por 5 minutos para desnaturalizá-los. c) Colocar o marcador de proteína e as amostras nas paredes do gel (20 a 30 μl). d) Prosseguir para Migração: 35 mA (quase 1 hora).

PROTOCOLO PARA WESTERN BLOT

[00203] Antes de iniciar o protocolo os reagentes são preparados conforme segue:

TAMPÃO DE TRANSFERÊNCIA (1X)

[00204] Para 1 l: 3,03 g de base Tris, 14,4 g de glicina, 200 ml de Metanol, qsp 1 l de H2O MQ.

TAMPÃO DE TBS (4X)

[00205] Para 1 l: 24,25 g de base Tris, 60 g de NaCl, qsp 1 l de H2O MQ, pH 7,5.

TAMPÃO DUPLO DE TBS

[00206] Para 1 l: 250 ml de TBS 4X, 0,5 ml de Tween 20, qsp 1 l de H2O MQ.

[00207] Há 2 etapas para seguir, a eletrotransferência e a imunodetecção de proteína, consulte as etapas abaixo: 1) ELETROTRANSFERÊNCIA a) Ativar a membrana de PVDF: 1 minuto em MeOH e 2 minutos em MQ H2O. b) Colocar as membranas de PVDF, papéis e esponjas em Tampão de transferência durante 10 minutos. c) Preparar o sanduíche e prosseguir com a transferência das proteínas do gel para a membrana de PDVF: 0,2 A durante 2 horas. 2) IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS a) Bloquear os locais não específicos da membrana com leite a 5% (dissolver o mesmo em TBS-T). b) Incubação com o anticorpo primário (dissolvido em TBST/leite a 5%): Proteína de precursor de anti-amiloide (ab2072, coelho) em uma diluição de 1:500 (20 μl em 10 ml), durante a noite a 4 °C c) Lavar a membrana com TBS-T (5 min x2). d) Incubação com o anticorpo secundário dissolvido em TBS-T: Diluição de HRP anticoelho (cabra) 1:5000 (20 μl em 10 ml) por 45 minutos em temperatura ambiente. e) Lavar a membrana com TBS-T (5 min x2 + 10 min x1). f) Tirar uma foto com a opção de Chemibox (luz branca) para ver a posição das banda do marcador. g) Adicionar reagente ECL (HRP) para detecção de anticorpo (1 ml de cada componente) e tirar várias fotos com a opção de Chemibox (sem luz).

METODOLOGIA DETALHADA: DETECÇÃO DE Aβ42 EM MEIOS DE CULTURA CELULAR

[00208] Após 1 hora de tratamento, os meio de cultura foram coletados e diluídos para 1:100, com o uso de meios de cultura como diluente. Quatro repetições de cada amostra diluída foram então colocadas na placa fornecida pelo kit de detecção ELISA, da AnaSpec (Fremont, CA, EUA). A detecção foi então realizada seguindo o protocolo do fabricante. Brevemente, a amostra foi incubada por 4 h na presença de 50 μl de anticorpo de detecção. A placa foi então lavada sete vezes com a solução de lavagem, as amostras foram então incubadas com a 3,3’,5,5’- Tetrametilbenzidina (TMB) fornecida com o kit por 15 min. Após a revelação da amostra, a reação foi parada com a solução de paragem e a densidade óptica foi lida a 450 nm.

[00209] A Figura 22 é um diagrama que mostra a cascata de eventos que resultam do efeito de T30 em uma célula: (1) T30 se liga ao local alostérico do receptor para intensificar a abertura do canal para o fluxo de entrada Ca2+ para a célula (Greenfield et al. 2004). (2) A entrada de cálcio induz a despolarização e a abertura do canal dependente de tensão (L- VOCC) que permite ainda mais Ca2+ na célula (Dickinson et al., 2007). (3) Esse cálcio intracelular induz um aumento na liberação de AChE G4 que inclui T30 (Greenfield, 2013). (4) O cálcio também induz o aumento de produção do α7 receptor nicotínico que irá permitir que mais Ca2+ entre na célula fornecendo-se ainda mais alvos para T30 (Bond et al.,2009). (5) O cálcio ativa as enzimas (isto é, GSK-3) que irá (a) aumentar Tau, (b) ativar a Y-secretase/β-secretase que irá acionar a clivagem de amiloide tóxico extracelular que (c) juntamente com T30 irá promover uma quantidade ainda mais tóxica de Ca2+ para a célula. (Hartigan & Johnson (1999), Cai et al.(2012), Garcia-Ratés et al. (2013)).

[00210] Dessa maneira, com o uso de imunodetecção, os inventores determinaram (i) níveis de APP e (ii) liberação de amiloide que segue a administração de T30 (5 uM) e NBP14 (0,5 μM). RESULTADOS (i) Conforme mostrado na Figura 23, o T30 reduz os níveis do APP de comprimento total nas membranas celulares PC12, um efeito invertido por NBP14. Os valores são: Controle (100 % ± 10,98); T30 5 μM (67,82% ± 6,23%) e T30 + NBP-14 0,5 μM (126% ± 1,12%).

[00211] A Figura 24 mostra a imunodetecção através de western blot representada no gráfico. Os 3 tratamentos diferentes mostram diferentes níveis de expressão de APP (valores representados na Figura 24). Para cada condição a proteína é corrigida por níveis de GAPDH.

[00212] A produção de APP é reduzida pelo peptídeo de T30, um efeito que é invertido por NBP-14. Isso sugere que o APP poderia ser clivado, liberando amiloide-β 1-42 peptídeo (Aβ42). (ii) A fim de determinar a liberação de Aβ42 usou-se um kit ELISA, comercialmente disponível, que mede o Aβ42 presente na solução. Esse teste mostrou que o T30 aumenta a liberação de Aβ42 até aproximadamente 175% em comparação com o controle e o NBP-14 leva a liberação de Aβ42 a um valor perto do controle (consulte a Figura 25).

Claims

1. Polipeptídeo cíclico, caracterizado pelo fato de que consiste na SEQ ID No:4, em que o resíduo de alanina de N- terminal é conectado ao resíduo de lisina de C-terminal.

2. Uso do polipeptídeo cíclico conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para terapia ou diagnóstico.

3. Uso do polipeptídeo cíclico conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio neurodegenerativo.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o distúrbio neurodegenerativo é selecionado a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer; doença de Parkinson; doença de Huntington; doença neuromotora; Espino cerebelar tipo 1, tipo 2 e tipo 3; Esclerose Lateral Aminotrópica (ALS); e Demência Frontotemporal.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o distúrbio neurodegenerativo é a doença de Alzheimer.

6. Polipeptídeo cíclico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo cíclico: - é um modulador alostérico seletivo do receptor nicotínico α7; e/ou - supera a ligação para β-amiloide; e/ou - é isolado ou purificado.

7. Polipeptídeo cíclico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso como um modulador alostérico de receptor.

8. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo cíclico conforme definido na reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Processo para produzir a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 8, sendo que o processo é caracterizado pelo fato de que compreende combinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo cíclico conforme definido na reivindicação 1 com um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Uso do polipeptídeo cíclico conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser em um método analítico in vitro ou ex vivo para investigar um receptor nicotínico α7.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o método compreende investigar o local alostérico do receptor nicotínico α7, opcionalmente, em que o método compreende impedir o fluxo de entrada adicional de cálcio através do receptor nicotínico α7.