KR20230165640A - 혈액 엑소좀 단백질 양 및 아세틸콜린 에스터레이즈 활성도에 기초한 파킨슨 병 진단 방법 - Google Patents
혈액 엑소좀 단백질 양 및 아세틸콜린 에스터레이즈 활성도에 기초한 파킨슨 병 진단 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대상의 엑소좀 단백질양과 아세틸콜린에스터레이즈(AchE) 활성도 측정에 기반한 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법을 이용하는 경우, 효과적으로 파킨슨 병을 진단할 수 있으며 그 진행 상황을 효과적으로 파악할 수 있다.
Description
본 발명은 대상의 엑소좀 단백질 양과 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈(acetylcholinesterase, AchE) 활성도 측정에 기반한 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단 방법에 관한 것이다.
파킨슨병(Parkinson's disease, PD)의 병태생리학적 특징 중 하나는 뇌에 루이소체(Lewy body)가 형성된다는 것인데, 이는 주로 불용성 응집된 α-시누클레인(α-synuclein, α-syn)으로 구성된다. 따라서, α-시누클레인은 파킨슨병 및 관련 질병 진행의 잠재적인 바이오마커 및 지표로서 광범위하게 연구되었다. 그러나, 파킨슨병에서 일관되지 않은 혈장 α-시누클레인 데이터가 보고되었으며, α-시누클레인을 파킨슨병을 진단에 적용하기에는 부적합하였다. 파킨슨병에 대한 신뢰할 수 있는 생체 유체 바이오마커의 부재는 질병 진행 또는 치료 반응의 모니터링을 제한했다. 따라서 파킨슨병을 진단하기 위한 신뢰성 있는 새로운 바이오마커의 개발이 요구되는 실정이다.
파킨슨병은 단일 시스템 신경퇴행성 질환이라기 보다는 다중 신경 전달에 영향을 미치는 다면적이고 복잡한 장애로 인식되고 있다. 앞선 연구들은 파킨슨병에서 흑질선상체(nigrostriatal)의 도파민 시스템의 퇴화와 콜린성 탈신경화 사이의 연관성을 시사하고 있다.
본 발명자들은 파킨슨병을 진단할 수 있는 바이오마커를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도 및 엑소좀 단백질 양을 기반으로 파킨슨병을 진단하거나 중증도 경감 여부를 판단할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도 및 엑소좀 단백질 양을 기초로 한 파킨슨병의 진단 또는 중증도 경감 여부 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 파킨슨병 진단에 필요한 정보 제공 방법을 제공한다:
(a) (i) 대상(subject)의 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 및 (ii) 대상의 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀의 단백질 총량 중 어느 하나 이상을 측정하는 단계.
본 발명자들은 파킨슨병을 진단할 수 있는 바이오마커를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도 및 엑소좀 단백질 양을 기반으로 파킨슨병을 진단하거나 중증도 경감 여부를 판단할 수 있음을 규명하였다.
본 명세서의 "파킨슨병"은 신경 퇴행성 질환 중 하나로, 심각한 인식 장애와 미약한 언어 장애를 동반하는 만성 질환이다. 흑질의 불완전한 도파민 생성 및 작용으로 인한 운동신경 피질 자극의 감소, 뇌로 가는 혈류의 차단, 약물과 독의 장기간 노출, α-시누클레인 프로모터의 이상이 병의 원인으로 지적된다.
본 명세서의 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체으 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다. 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미하며, 예를 들어 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다.
본 명세서에서 용어 "대상", "개체", 또는 "환자"는 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 대상에는 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 포함된다.
본 명세서의 용어 "생물학적 시료"는 파킨슨병을 진단하거나 중증도 경감 여부를 판단하기 위해 피검체로부터 채취된 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들면, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
본 명세서의 용어 "엑소좀(Exosome)"은 단백질 및 기타 구성요소를 포함하는 작은 세포외 소포(Extracelluar vehicle, EV)이다. 엑소좀은 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재하고, 직경은 30 - 100 nm 정도이며 이는 LDL 단백질보다는 크지만, 적혈구보다는 훨씬 작은 수준이다. 엑소좀은 다중소포체가 세포막과 융합할 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출될 수 있다. 엑소좀은 세포 또는 조직간 신호전달 기능을 수행할 수 있다.
본 명세서의 아세틸콜린에스터레이즈는 부교감 신경을 지배하는 기관과 자유 신경절 등에 존재하는 아세틸콜린을 아세틸과 콜린으로 가수분해하는 효소를 말하며, 시냅스 신호 전달 물질을 제거하는 역할을 한다. 신경전달에서 아세틸콜린은 절전 뉴런에서 방출되어 절후 뉴런으로 신호를 전달하는데, 아세틸콜린에스터레이즈에 의해 아세틸콜린이 분해되면 신호전달이 종결된다.
본 명세서의 아세틸콜린에스터레이즈는, 아세틸콜린에스터레이즈와 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함한다.
본 명세서의 용어 "아세틸콜린에스터레이즈 활성도"는 아세틸콜린에스터레이즈가 아세틸콜린을 가수분해 분해할 수 있는 능력의 수준를 의미한다.
본 명세서의 용어 "엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도" 또는 "엑소좀 단백질 총량"은 전체 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 또는 단백질 총량, 표면에 CD9 분자를 포함하는 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 또는 단백질 총량, 또는 표면에 CD63 분자를 포함하는 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 또는 단백질 총량일 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 초고속원심분리를 통해 엑소좀을 분리한 경우 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 또는 엑소좀 단백질 총량은 전체 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 또는 단백질 총량일 수 있고, 자성비즈를 이용해 표면에 CD9 또는 CD63분자를 포함하는 엑소좀만 분리한 경우, 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 또는 엑소좀 단백질 총량은 표면에 CD9 또는 CD63 분자를 포함하는 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 또는 단백질 총량일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 다음 단계를 추가적으로 포함하는 파킨슨병 진단에 필요한 정보 제공 방법을 제공한다:
(b) (i) 상기 아세틸콜린에스터레이즈 활성도, (ii) 상기 단백질 총량 중 어느 하나 이상의 측정된 값을 정상 대조군에 대한 측정값과 비교하는 단계; (r1) 정상 대조군에 비해 대상의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도가 낮은 경우 (r2) 정상 대조군에 비해 대상에서 표면에 CD9 분자를 포함하는 엑소좀의 단백질 총량이 높은 경우, 및 (r3) 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값을 계산할 때, 정상 대조군의 보정값에 비해 대상의 보정값이 낮은 경우 중 적어도 어느 하나의 경우에 해당하는 경우, 대상이 파킨슨 병을 갖는 것으로 판단함.
본 명세서의 용어 "정상 대조군"은 파킨슨 병의 징후를 보이지 않는 건강한 대조군을 말하며, 예를 들면 도파민 시스템에 이상이 없는 군, 인지 능력이나 언어능력의 이상이 없는 군일 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 파킨슨병 진단에 사용되는 지표상 이상이 없는 군을 말한다.
본 명세서의 용어 "아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값"은 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈값을 의미한다.
본 명세서의 정상 대조군에 비해 대상의 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도의 보정값이 낮은 경우는 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도가 파킨슨병을 진단 할 수 있을 정도로 유의하게 낮은 경우를 말하며, 예를 들어, 5%이상, 10%이상, 15%이상, 20%이상, 25%이상, 30%이상 낮은 경우일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀은 초고속 원심 분리, 자성 비즈를 이용한 분리방법, 폴리머 기반 분리방법, 미세여과 분리방법, 및 크기배제 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 분리방법을 통해 얻어진 것이다. 다만 이에 한정되는 것은 아니고, 엑소좀을 분리할 수 있는 기타 화학, 물리적인 모든 방법을 포함한다.
본 명세서의 엑소좀 분리방법 중 자성 비즈를 이용한 분리방법은 엑소좀 표면에 존재하는 타겟 분자에 자성 비즈를 결합시켜 자석을 이용해 목표하는 분자를 분리하는 방법을 말한다. 엑소좀 분리에 사용되는 표면 분자는 CD63 (cluster of differentiation 63, CD63), CD9 (cluster of differentiation 9, CD9), 또는 L1CAM (L1 cell adhesion molecule)일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아세틸콜린에스터레이즈 활성도는 웨스턴 블랏 (western blotting), 효소 활성 분석(enzyme activity assay), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radial immunodiffusion), 면역 전기 영동 (immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피 (immunochromatography), FACS (fluorescenceactivated cell sorter analysis), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 분석방법을 통해 얻어진 것이다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니고 아세틸콜린에스터레이즈와 결합 또는 반응하여 그 활성도를 측정할 수 있는 모든 방법을 포함한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 파킨슨병 중증도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법을 제공한다.
(a) 제1 시점 내지 제n 시점(n은 n≥2인 정수)의 (i) 대상의 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 및 (ii) 대상의 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀의 단백질 총량 중 어느 하나 이상을 측정하는 단계;
(b) 측정된 제n 시점의 (i) 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도, (ii) 엑소좀 단백질 총량 중 어느 하나 이상의 측정된 값을 제1시점 내지 제n-1시점으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시점에서의 측정값, 또는 제1시점 내지 제 n-1시점으로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 시점에서의 측정값들의 평균값과 비교하는 단계; (r1) 제 n 시점의 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도가 높은 경우, (r2) 제 n시점의 표면에 CD9 분자를 포함하는 엑소좀의 단백질 총량이 낮은 경우, 및 (r3) 각 시점에서 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 보정값을 계산할 때, 제 n시점의 보정값이 높은 경우 중 적어도 어느 하나의 경우에 해당하는 경우, 대상의 파킨슨 병의 중증도가 경감된 것으로 판단함.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 단계(b)에서의 어느 하나의 시점에서의 측정값은 n-1 시점에서의 측정값인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 중등도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 단계(b)에서의 둘 이상의 시점에서의 측정값은 제 n-1시점에서의 측정값을 포함하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 중증도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 대상의 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도의 측정 시점의 간격은 파킨슨 병의 진행 상황이 변동될 수 있는 임의의 시간 간격을 말한다. 예를 들면, 7일, 14일, 21일, 28일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 12개월, 2년, 3년 일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 제 n시점의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값이 제 1 내지 제 n-1 시점의 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도의 보정값보다 높아졌다는 것은, 파킨슨 병의 진행정도를 파악할 수 있을 정도로 유의하게 활성도의 보정값이 증가하였음을 의미한다. 예를 들면, 제n시점의 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도 보정값 보다 제1시점 내지 제n-1 시점의 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도 보정값이 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 또는 30% 이상 높아진 경우 일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 생물학적 시료의 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 및 엑소좀 단백질 총량 중 어느 하나 이상을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 조성물 을 제공한다.
상기 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 조성물에 포함될 수 있는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 대상의 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변, 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 측정하는 제제는 아세틸콜린에스터레이즈에 특이적으로 반응하는 화합물, 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭 항체, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 또는 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 1이상의 제제인 것이다. 다만 이에 한정되지는 않고, 대상의 생물학적 시료의 검체에서 아세틸콜린에스터레이즈와 결합 또는 반응하여 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도를 확인하는 데 사용할 수 있는 모든 분자를 말한다.
본 발명의 아세틸콜린에스터레이즈에 특이적으로 반응하는 화합물은, 예를 들어 β-나프틸아세테이트 (β-naphthyl acetate) 또는 아세틸콜린일 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 아세틸콜린에스터레이즈의 작용으로 분해되어 아세트산 또는 콜린을 생성할 수 있는 모든 화합물을 포함한다.
본 발명의 용어 '항체'는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날(단일클론) 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 생물학적 시료의 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 측정하는 제제 또는 엑소좀 단백질 총량을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 키트를 제공한다.
본 발명의 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예를 들어, 상기 키트에는 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도를 측정할 수 있는 방법이라면 그 방법이 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 항체 또는 반응 화합물을 이용하여 아세틸콜린에스터레이즈의 활성도를 확인하는 방법이 적용될 수 있고, 더욱 바람직하게는 본 발명의 파킨슨 병 진단 또는 중등도 경감 여부 판단용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 파킨슨병 진단에 필요한 정보 제공 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 파킨슨병 중증도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법을 제공한다.
(c) 본 발명은 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 또는 엑소좀 단백질 총량을 측정하는 제제 또는 엑소좀 단백질 총량을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 조성물을 제공한다
(d) 본 발명의 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법을 이용하는 경우, 효과적으로 파킨슨 병을 진단할 수 있으며 그 진행 상황을 효과적으로 파악할 수 있다.
도 1은 초고속 원심분리에 의한 분리된 엑소좀의 특성을 나타낸다. (A)는 분리된 혈장 엑소좀의 투과 전자 현미경 사진이다 (스케일 바 = 100nm). (B)는 엑소좀의 크기 분포와 농도를 나타낸다. (C)는 파킨슨병(PD) 및 건강한 대조군(HC) 개인의 엑소좀 웨스턴 블롯 결과이다.
도 2는 혈장 엑소좀의 특성을 나타낸다. (A)는 파킨슨병(PD) 및 건강한 대조군(HC)에서 엑소좀 크기의 중간 값, (B)는 엑소좀 농도의 중간 값을 나타낸다. (C)는 엑소좀의 이미지를 나타낸다.
도 3은 엑소좀 농도 (A) 및 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도(B)와엑소좀 총 단백질(exosomal total protein) 양 사이의 연관성을 나타낸다.
도 4는 엑소좀 바이오마커에 대한 평가를 나타낸다. 엑소좀 α-시누클레인 수준(A), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도(B)를 나타내며 상자는 사분위수 범위를, 수평선은 중앙값을 나타낸다. (C)는 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 ROC 분석을 나타낸다. 여기서 아세틸콜린에스터레이즈 활성도란, 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 아세틸콜린에스터레이즈 보정값을 의미한다.
도 5는 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 및 임상 데이터의 산점도를 나타낸다. 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 H&Y 점수간의 상관관계 (A), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 UPDRS 파트 III 점수간의 상관관계 (B), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 유병 기간 간의 상관관계 (C), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 MMSE 점수간의 상관관계 (D), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 아세틸콜린에스터레이즈 억제제 사용간의 상관관계 (E)를 나타낸다. 여기서 아세틸콜린에스터레이즈 활성도란, 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 아세틸콜린에스터레이즈 보정값을 의미한다.
도 6은 CD63, CD9, 또는 L1CAM을 사용해 분리한 엑소좀의 단백질 총량과 아세틸콜린에스터레이즈 활성도, 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값을 나타낸다.
도 7은 아세틸콜린에스터레이즈에 특이적으로 반응하는 화합물의 예시를 나타낸다.
도 2는 혈장 엑소좀의 특성을 나타낸다. (A)는 파킨슨병(PD) 및 건강한 대조군(HC)에서 엑소좀 크기의 중간 값, (B)는 엑소좀 농도의 중간 값을 나타낸다. (C)는 엑소좀의 이미지를 나타낸다.
도 3은 엑소좀 농도 (A) 및 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도(B)와엑소좀 총 단백질(exosomal total protein) 양 사이의 연관성을 나타낸다.
도 4는 엑소좀 바이오마커에 대한 평가를 나타낸다. 엑소좀 α-시누클레인 수준(A), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도(B)를 나타내며 상자는 사분위수 범위를, 수평선은 중앙값을 나타낸다. (C)는 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 ROC 분석을 나타낸다. 여기서 아세틸콜린에스터레이즈 활성도란, 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 아세틸콜린에스터레이즈 보정값을 의미한다.
도 5는 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 및 임상 데이터의 산점도를 나타낸다. 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 H&Y 점수간의 상관관계 (A), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 UPDRS 파트 III 점수간의 상관관계 (B), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 유병 기간 간의 상관관계 (C), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 MMSE 점수간의 상관관계 (D), 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 아세틸콜린에스터레이즈 억제제 사용간의 상관관계 (E)를 나타낸다. 여기서 아세틸콜린에스터레이즈 활성도란, 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 아세틸콜린에스터레이즈 보정값을 의미한다.
도 6은 CD63, CD9, 또는 L1CAM을 사용해 분리한 엑소좀의 단백질 총량과 아세틸콜린에스터레이즈 활성도, 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값을 나타낸다.
도 7은 아세틸콜린에스터레이즈에 특이적으로 반응하는 화합물의 예시를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 실험 재료 및 방법
1-1. 실험 참가자
파킨슨병 환자는 2019년 5월에서 2020년 6월 사이에 재향 군인 건강 서비스 의료 센터에서 모집되었다. 파킨슨 병은 UK Parkinson's Disease Society Brain Bank 기준에 따라 진단되었다. 모든 환자는 FP-CIT PET 검사를 받았고 Hoehn and Yahr (H&Y) 기준에 따라 질병 진행정도(stage)를 분류하고 통합 파킨슨병 평가 척도 (Unified Parkinson's Disease Rating Scale, UPDRS)로 평가했다. 병력에 신경학적 또는 심각한 질병의 증거가 없거나 신경학적 검사를 통해 연령이 일치하는 사람을 건강한 대조군으로 (health control, HC) 모집하였다. 모든 참가자는 전반적인 인지 장애를 평가하기 위해 뇌 자기 공명 영상과 MMSE(Mini-Mental State Examination) 검사를 받았다. 연구 프로토콜은 재향 군인 의료 센터의 기관 검토 위원회(2019-05-004)의 승인을 받았다.
1-2. 혈액 샘플
혈액 응고를 방지하기 위해 EDTA가 포함된 튜브에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 수집 후 4시간 이내에 혈장을 분리하였다. 샘플을 1,500g에서 10분 동안 원심분리하여 적혈구, 혈소판 및 세포 파편(debris)을 제거했다. 분리된 혈장은 폴리프로필렌 튜브로 옮겨 분석될 때까지 -80℃에서 보관하였다.
1-3. 초고속 원심분리를 통한 혈장 엑소좀 분리
혈장(1 ml)을 20,000g에서 1시간 동안 원심분리하여 크기가 큰 세포외 소포를 제거했다. 상층액을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS; 28348, Thermo Fisher)로 채워진 초고속 원심분리 튜브로 옮기고 100,000g에서 1.5시간 동안 초고속 원심분리(Optima XE-90 with 90Ti 로터, Beckman Coulter)하여 엑소좀을 펠렛화했다. 상층액을 버리고 펠렛을 인산염(4906845001, Roche) 및 프로테아제(5892970001, Roche) 억제제가 포함된 PBS에 재현탁했다. 비변성 상태에서 고효율 가용성 단백질을 생성하는 마일드 세제 용해 완충액인 M-PER (Cat. #78501; Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하여 엑소좀을 용해했다 (Guix et al., 2018). BCA assay (23227, Thermo Fisher Scientific, USA)를 제조사의 지침에 따라 수행하여 엑소좀 단백질 농도를 정량화하였다. 플레이트는 540 nm에서 플레이트 판독기 (SpectraMax Plus 384; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 판독했다.
1-4. 자성 비즈를 이용한 혈장 엑소좀 분리
혈장을 300g, 2,000g, 10,000g에서 각각 10분, 20분, 30분 동안 원심분리하여 상층액을 분리했다. 상층액은 PBS에 희석한 뒤 엑소좀 표면 분자와 특이적으로 결합하는 항체가 붙은 자성 비즈(magnetic bead)를 넣고 상온에서 3시간 동안 엑소좀을 분리하였다. 분리한 엑소좀은 PBS로 재현탁하였다. 엑소좀 표면의 CD63과 결합하는 항체는 Anti-human CD63 Antibody (BioLegend), CD9와 결합하는 항체는 CD9 Monoclonal Antibody (Thermo), L1CAM과 결합하는 항체는 L1CAM antibody (GeneTex)를 사용하였다.
1-5. 투과 전자 현미경 관찰
엑소좀은 4% 포름알데히드 포함 PBS로 4℃에서 1시간 동안 고정되었다. 고정된 샘플을 1분 동안 formvar 탄소 필름으로 코팅된 150 메쉬 구리 그리드 (mesh copper grid) 에 떨어뜨렸다. 여과지를 사용하여 여분의 샘플을 제거하였다. 그리드는 2% 우라닐 아세테이트로 음성 염색되었다. 여분의 액체는 여과지를 사용하여 세척하고 80kV에서 작동되는 Hitachi H7600 투과 전자 현미경에서 이미징을 수행했다.
1-6. 나노입자 추적 분석 (nanoparticle tracking analysis)
ZetaView(Particle Metrix)를 사용하여 분리된 혈장 엑소좀에 나노입자 추적 분석을 수행하여 입자의 농도 및 크기 분포를 확인했다. 샘플을 입자가 없는 PBS로 적절하게 희석했다. 빛 굴절(light-refracting) 입자의 영상은 다음 설정과 같이 녹화되었다: 25℃ 고정 온도, 11개 위치, 3개 주기, 감도 80, 셔터 100, 30fps, 5초 비디오/위치, 3개 측정. 개수 및 크기 분포는 ZetaView Analyze 08.05.12 SP2.로 분석되었다.
1-7. 웨스턴 블롯
분리된 엑소좀( ~20㎍ 단백질)을 Laemmli 샘플 완충액으로 가용화하고 98℃에서 5분 동안 가열했다. 단백질을 SDS-PAGE 젤에서 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 실온(Room temperature, RT)에서 1시간 동안 TBST(Thermo, #28360)에서 3% 탈지분유(Sigma, M7409) 로 블로킹했다. Alix(Cell Signaling Technology, #2171) 및 GM130(Cell Signaling Technology, #12480)에 대한 1차 항체를 3% 탈지분유와 함께 TBST에서 1:1,000으로 희석하고 4℃에서 오버나잇 배양했다. 멤브레인을 TBST로 세척하고 HRP-결합 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. 면역염색된 단백질은 화학발광 기질(Thermo, #34577)을 적용하여 검출하고 DAVINCH-Chemi 이미저로 이미지화했다.
1-8. 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 측정
엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도는 형광측정 아세틸콜린에스터레이즈 분석 키트(ab138872, Abcam)를 사용하여 측정되었다. 제조사의 지침에 따라 다음 절차를 수행했다. 간단히 말해서, 아세틸콜린에스터레이즈 표준 및 샘플을 분석 완충액에 희석하고 96웰 플레이트에 적용하고, 반복하였다. 반응 혼합물을 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 형광 마이크로플레이트 판독기(FLUOstar Omega; BMG Labtech Inc., Cary, NC, USA; λex. = 490 nm, λem. = 520 nm)를 사용하여 형광 신호를 모니터링했다.
1-9. 엑소좀 α-시누클레인 (α-synuclein) 정량
엑소좀 α-시누클레인은 제조업체의 지침에 따라 상용 ELISA 키트(AS-55550-H, Anaspec)로 측정되었다. 간단히 말해서, 엑소좀 용해물을 샘플 완충액에 희석하고 각 웰에 첨가하고, 반복하였다. 실온에서 4시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트를 6회 세척한 다음 TMB를 각 웰에 적용했다. 정지용액(stop solution)을 첨가하여 반응을 종결시키고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 광신호를 측정하였다.
1-10. 통계적 분석
통계 분석은 SPSS 24(SPSS Inc., Chicago, IL)를 사용하여 수행되었다. Fisher의 정확한 테스트을 사용하여 성별 차이를 평가했다. 그룹 간의 바이오마커를 비교하기 위해 Student's t- 및 Mann-Whitney U 테스트를 수행했다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. Spearman 상관 계수를 사용하여 유의한 상관 관계를 평가했다. ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선을 분석하여 AUC(area under the curve)를 계산하여 진단 성능의 정확도를 평가했다. 민감도와 특이도의 합이 Youden index를 최대화했을 때 cutoff 값을 결정하였다.
실시예 2: 참가자의 인구통계학적 및 임상적 특징
참가자의 인구통계학적 및 임상적 특징은 표 1에 요약되어 있다. 연령이나 성별의 유의한 차이는 그룹 간에 발견되지 않았다. 그러나 퇴역 군인 병원에서 모집하는 특수성으로 인해 남성이 여성보다 더 많이 모집되었다. 그룹 간의 MMSE (Mini-Mental State Exam) 점수에는 차이가 없었다. FP-CIT PET가 파킨슨병이 있는 모든 환자에서 수행되었으며, 모든 환자가 도파민 수송 활성도가 감소된 것으로 나타났다. 건강한 대조군(HC, healthy control) 그룹에서 7명이 FP-CIT PET를 받았으며, 정상적인 도파민 수송 활성도를 나타냈다.
| 파킨슨병(PD) | 건강한 대조군(HC) | P -value | |
| 수 | 34 | 29 | - |
| 연령 | 74.2 (4.7) | 73.9 (4.6) | 0.816a |
| 성별 (남/여) | 30/4 | 24/5 | 0.721b |
| MMSE | 24.7 (3.8) | 25.8 (2.5) | 0.232c |
| H&Y 점수(1/1.5/2/2.5) | 15/8/6/5 | - | - |
| UPDRS part III | 40.0 (13.1) | - | - |
| 유병 기간 | 5.1 (4.3) | - | - |
| FP-CIT PET (P/N) | 34/0 | 0/7 | 0.000b |
수치는 평균으로 나타내었음. a는 Student's t-test, b는 Fisher's Exact test, c는 Mann-Whitney test임.
실시예 3: 혈장 엑소좀 바이오마커 분석 - 초고속 원심분리
3-1. 초고속 원심분리기로 추출된 엑소좀 바이오마커 분석
진단 성능은 분리된 혈장 엑소좀에서 AChE 활성도 및 α-시누클레인 수준을 측정하여 평가되었다. 엑소좀은 초고속 원심분리를 통해 분리되었으며, 이는 투과 전자 현미경 및 나노입자 추적 분석으로 시각화하여 확인하였다 (도 1의 A 및 도 2의 C). 추정된 엑소좀의 크기는 나노입자 추적 분석에 의해 약 140 nm에 분포되었다 (도 1의 B). Western blot에서 엑소좀은 Alix에서 농축되었지만 GM130에서는 농축되지 않았다 (도 1의 C). 파킨슨 병 환자군(PD)와 건강한 대조군(HC) 사이에 혈장 엑소좀 크기와 농도의 차이는 발견되지 않았다 (도 2의 A, B). 분리된 엑소좀에 있는 단백질의 총량은 개인마다 다를 수 있다. 따라서 총 엑소좀 단백질 함량을 측정해 두 바이오마커를 정규화(normalize)하는 데 사용했다. 총 엑소좀 단백질 수준은 엑소좀 농도 및 엑소좀 AChE 활성과 높은 상관관계를 나타내었으므로 정규화 인자로서 적절함을 알 수 있다 (도 3). 엑소좀 α-syn의 농도는 그룹 간에 차이가 없었다 (PD, 234.0 ± 183.2 pg/mg; HC, 219.7 ± 135.3 pg/mg; 도 4의 A). 놀랍게도, 엑소좀 AchE 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 엑소좀 AChE 활성도의 보정값은 건강한 대조군 그룹(4.7 ± 1.0 mU/mg)과 비교할 때 파킨슨병 환자군(3.9 ± 1.0 mU/mg, P = 0.002)에서 유의하게 감소하였다 (도 4의 B). ROC 곡선 분석은 파킨슨병 진단에서 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈, 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 보정값을 사용할 수 있는 가능성을 제시하였으며(AUC = 0.709; 95% 신뢰 구간, 0.582-0.836; 도 4의 C), 파킨슨병 환자군과 건강한 대조군간에 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 보정값이 통계적으로 유의한 차이를 보였기 때문에 파킨슨병 관련 바이오마커로 활용할 수 있을 것으로 판단된다. 컷오프 값 4.05를 적용했을 때 민감도와 특이도는 각각 61.8%와 79.3%였다.
3-2. 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도와 파킨슨병의 상관관계 분석
질병의 중증도와 엑소좀 바이오마커와의 관계를 분석하기 위해 파킨슨병 증상을 나타내는 수치인 H&Y 점수와 UPDRS를 파킨슨병 환자의 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 보정값(엑소좀 아세틸콜린 에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 보정값)과 비교하였다. 비교 결과, 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 보정값은 H&Y 점수가 증가함에 따라 감소하는 음의 상관관계 (p = 0.007, r2 = 0.197, ρ = -0.451)를 나타냈다. 또한, UPDRS part III 점수가 증가함에 따라 감소하는 음의 상관관계 (p = 0.047, r2 = 0.109, ρ = -0.342)를 나타냈다 (도 5의 A, B). 유병 기간은 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 보정값과 중간 정도의 음의 상관관계가 있었다(ρ = 0.101; 도 5의 C). MMSE 점수와 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine) 및 리바스티그민(rivastigmine)을 포함한 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 억제제의 투여는 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값과 유의한 상관관계가 없었다(도 5의 D, E).
실시예 4: 자성비즈로 분리된 엑소좀 바이오마커와 파킨슨병의 상관관계 분석
엑소좀의 CD63, CD9, 또는 L1CAM에 결합하는 항체를 가진 비즈를 이용해 엑소좀을 분리하였다. 각 엑소좀의 단백질 총량 측정에서, CD9 결합 비즈로 분리한 엑소좀 단백질 총량은 건강한 대조군 대비 파킨슨병 환자군에서 매우 높게 측정되었으나, CD63 또는 L1CAM 결합 비즈로 분리한 엑소좀 단백질 총량은 그룹간 차이가 없었다(도 6). 각 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 측정에서, CD63 또는 CD9 결합 비즈로 분리한 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도는 건강한 대조군과 파킨슨병 환자군에서 차이가 없었으나, L1CAM 결합 비즈로 분리한 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도는 건강한 대조군 대비 파킨슨병 환자군에서 높은 결과를 나타내었다 (도 6). 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도에 엑소좀 단백질 총량을 나누어 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값을 비교한 결과, CD63, CD9, 또는 L1CAM 엑소좀 모두에서 건강한 대조군 대비 파킨슨병 환자군에서 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값이 낮음을 확인할 수 있었다. 이는 초고속 원심분리에서 확인한 것과 유사하다. CD9 엑소좀의 경우 그 단백질 총량이 건강한 대조군 대비 파킨슨병 환자군에서 단백질 총량이 높았기 때문에, 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 단백질 총량으로 나눈 보정값에서 그 결과값이 매우 낮아짐을 확인할 수 있었는데, 이는 해당 엑소좀의 단백질 총량과 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 기초로 파킨슨 병을 효과적으로 진단할 수 있음을 나타낸다 (도 6).
자성 비즈를 통한 특정 엑소좀의 분리는 파킨슨병 진단의 가능성을 향상 시켰으며, CD9 엑소좀에서는 특히 단백질 총량이 파킨슨병에서 유독 높아 높은 성능으로 파킨슨 병의 진단이 가능하였다. 또한 L1CAM 엑소좀, 또는 CD63 엑소좀과의 조합을 통해 파킨슨병의 진단 성능을 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.
Claims (11)
- 다음 단계를 포함하는 파킨슨병 진단에 필요한 정보 제공 방법:
(a) (i) 대상(subject)의 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 및 (ii) 대상의 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀의 단백질 총량 중 어느 하나 이상을 측정하는 단계.
- 제1항에 있어서, 다음 단계를 추가적으로 포함하는 파킨슨병 진단에 필요한 정보 제공 방법:
(b) (i) 상기 아세틸콜린에스터레이즈 활성도, (ii) 상기 단백질 총량 중 어느 하나 이상의 측정된 값을 정상 대조군에 대한 측정값과 비교하는 단계; (r1) 정상 대조군에 비해 대상의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도가 낮은 경우 (r2) 정상 대조군에 비해 대상에서 표면에 CD9 분자를 포함하는 엑소좀의 단백질 총량이 높은 경우, 및 (r3) 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 아세틸콜린에스터레이즈 활성도의 보정값을 계산할 때, 정상 대조군의 보정값에 비해 대상의 보정값이 낮은 경우 중 적어도 어느 하나의 경우에 해당하는 경우, 대상이 파킨슨 병을 갖는 것으로 판단함.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀은 초고속 원심 분리, 자성 비즈를 이용한 분리방법, 폴리머 기반 분리방법, 미세여과 분리방법, 및 크기배제 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 분리방법을 통해 얻어진 것인, 정보 제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 아세틸콜린에스터레이즈 활성도는 웨스턴 블랏 (western blotting), 효소 활성 분석 (Enzyme activity assay), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radial immunodiffusion), 면역 전기 영동 (immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피 (immunochromatography), FACS (fluorescence activated cell sorter analysis), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 분석방법을 통해 얻어진 것인, 정보 제공 방법.
- 다음 단계를 포함하는 파킨슨병 중증도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법:
(a) 제1 시점 내지 제n 시점(n은 n≥2인 정수)의 (i) 대상의 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀의 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 및 (ii) 대상의 생물학적 시료에서 분리된 엑소좀의 단백질 총량 중 어느 하나 이상을 측정하는 단계;
(b) 측정된 제n 시점의 (i) 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도, (ii) 엑소좀 단백질 총량 중 어느 하나 이상의 측정된 값을 제1시점 내지 제n-1시점으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시점에서의 측정값, 또는 제1시점 내지 제 n-1시점으로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 시점에서의 측정값들의 평균값과 비교하는 단계; (r1) 제 n 시점의 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도가 높은 경우, (r2) 제 n시점의 표면에 CD9 분자를 포함하는 엑소좀의 단백질 총량이 낮은 경우, 및 (r3) 각 시점에서 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 엑소좀 단백질 총량으로 나눈 보정값을 계산할 때, 제 n시점의 보정값이 높은 경우 중 적어도 어느 하나의 경우에 해당하는 경우, 대상의 파킨슨 병의 중증도가 경감된 것으로 판단함.
- 제5항에 있어서, 상기 단계(b)에서의 어느 하나의 시점에서의 측정값은 n-1 시점에서의 측정값인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 중등도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 단계(b)에서의 둘 이상의 시점에서의 측정값은 제 n-1시점에서의 측정값을 포함하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 중증도 경감 여부 판단에 필요한 정보 제공 방법.
- 생물학적 시료의 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도 및 엑소좀 단백질 총량 중 어느 하나 이상을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 대상의 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변, 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 엑소좀 아세틸콜린에스터레이즈 활성도를 측정하는 제제는 아세틸콜린에스터레이즈에 특이적으로 반응하는 화합물, 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭 항체, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 또는 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 1이상의 제제인 것인, 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 조성물.
- 제8항의 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단 또는 중증도 경감 여부 판단용 키트.
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