KR20160078950A - 신경퇴행성 장애 - Google Patents

신경퇴행성 장애 Download PDF

Info

Publication number
KR20160078950A
KR20160078950A KR1020167003432A KR20167003432A KR20160078950A KR 20160078950 A KR20160078950 A KR 20160078950A KR 1020167003432 A KR1020167003432 A KR 1020167003432A KR 20167003432 A KR20167003432 A KR 20167003432A KR 20160078950 A KR20160078950 A KR 20160078950A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
derivative
cyclic
analogue
polypeptide
cyclic polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020167003432A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102436886B1 (ko
Inventor
수잔 그린필드
Original Assignee
뉴로-바이오 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 뉴로-바이오 엘티디 filed Critical 뉴로-바이오 엘티디
Publication of KR20160078950A publication Critical patent/KR20160078950A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102436886B1 publication Critical patent/KR102436886B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01007—Acetylcholinesterase (3.1.1.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)의 C-말단, 또는 이의 절단물(truncation)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue).

Description

신경퇴행성 장애{NEURODEGENERATIVE DISORDERS}
본 발명은 신경 퇴행성 장애에 관한 것이고, 특히 이와 같은 상태, 예를 들면 알츠하이머 병과 같은 상태의 치료법 및 치료 방법, 신규한 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머 병은 주로 65세가 넘는 남성 및 여성에 영향을 주며 질환을 가진 것으로 진단될 가능성은 주로 나이와 함께 증가한다. 65세가 넘는 성인의 비율은 이후 40년에 걸쳐 세계적으로 증가할 것으로 예측되며 알츠하이머 병 가능성은 2배 이상, 2010년도에 2천백만에서 2050년에 5천3백만으로 가속화하여 증가될 것으로 예상된다(www.alzheimersresearchuk.org 및 www.alz.org의 통계). 알츠하이머 병을 나타낼 것으로 예상되는 환자 수의 기하급수적인 증가는 이것이 의료적 필요성이 충족되지 못하는 주요 분야라는 것을 나타낼 뿐만 아니라, 이와 같은 질환을 치료하기 위한 효과적인 방법이 현재 충족되지 않기 때문에 치료법 및 진단법에 대한 상당한 시장성을 제공한다.
지난 10년 동안 특히 알츠하이머 질환을 특이적으로 방지할 수 있는 새로운 치료제가 없었고, 신경퇴행은 더욱 일반적이지 않았다. 이는 결과적으로 약학적으로 표적이 될 수 있는 기본적인 근본 뇌 메커니즘이 아직까지 확인되지 않았기 때문이다. 신경퇴행 과정에 대한 주요 원인을 다투는 것은 '아밀로이드 가설'이며, 여기에서 신경 사멸은 사후 알츠하이머 뇌의 특징인 아밀로이드 독소 침착에 의한 세포막의 파괴가 원인이 되며, 아밀로이드 전구체 단백질의 비정상적인 절단에 기인한다. 그러나 이와 같은 '아밀로이드 가설'은 알츠하이머 및 파킨슨 병에서 빈번하게 관찰되는 공통-병변을 설명하지 못할 뿐만 아니라, 또는 퇴화에 취약한 세포의 특징적인 선택, 또는 치매 동물 모델에서 아밀로이드 침착의 부재, 또는 사실 인지 결핍이 뚜렷하지 않은 특정 뇌 부위에서의 아밀로이드의 발생을 설명하지 못한다. 지난 이십 년 이상의 약학 표적으로서의 아밀로이드 형성 침착의 인기에도 불구하고, 이와 같은 가설에 기초한 어떠한 치료법도 아직까지 효과적인 것으로 입증되지 못했다. 더 그럴듯한 가능성은 신경퇴행 과정이 발생하면, 그 후 아밀로이드가 이차적인, 덜 특이적인 악화 효과로 추가적으로 생성된다는 것이다.
신경퇴행의 주요 메커니즘 동정에 대한 한가지 힌트는, 단지 다양한 신경세포성 그룹만이 주로 취약하다는 것이 될 수 있다. 또한, 알츠하이머, 파킨슨 및 운동뉴런 질환 경향이 있는 다양한 세포 서브그룹들이 그럼에도 불구하고 서로 인접해 있으며, 뇌간(brainstem)으로부터 전뇌까지 확장되는 연속적인 '허브'를 형성하고 이들은 모두 더 높은 뇌의 중앙에 대하여 위쪽 및 바깥쪽으로 광범성 투사(diffuse projections)를 보낸다. 그러므로 전달물질로서 이들의 이질성에도 불구하고, 이들 신경 세포 군은 이들을 뇌의 다른 대부분, 예컨대 소뇌, 시상, 대뇌피질 등에 있는 더 친숙한 세포 및 국부적으로 순환하는 세포와 구별하기 위하여 집합적으로 '전(Global)' 신경세포로 명명된다. 비록 수십 년 전에는 신경퇴행의 중심축으로서 다른 용어('isodendritic core')를 이용하였으나, 이들 선택적인 취약 전신경세포는 이전에 동정된 바 있다.
전신경세포의 서브-그룹은 공통적인 특이적 특징을 가지며, 이는 상기의 수수께끼 및 심지어 뇌졸중에 의해 손상을 받았을 때도 그렇지 않은 그들의 대응되는 뇌 내 다른 위치와 달리, 왜 이들 세포들만이 점차적인 사멸에 불복하는지에 대한 해답이 없는 질문에 대하여 설명할 수 있을 것이다: 이들은 성장을 돕고 유지하는 물질- '영양인자 (trophic factors)' 에 대한 특이적인 민감도를 수반하며, 성숙기로의 및 성숙기 동안에 견고한 가소성을 유지한다. 뇌 발달에 있어서, 영양인자는 칼슘 유입 자극에 의하여 작동하며, 이는 세포 내에서 캐스케이드 현상을 유발하고, 결과적으로 선택적 분화와 성장을 야기한다. 그러나 고용량 또는 장기간의 노출, 칼슘 유입의 유지는 신경세포에 독성을 나타낼 수 있다. 가장 뚜렷하게, 칼슘 유입이 영양적인지 또는 독소 효과를 유발하는지 여부를 결정하는 추가적인 인자는 나이이다: 신경세포가 성숙함에 따라, 이전까지의 세포 내 칼슘의 영양수준은 치명적이 된다.
본 발명자는 신경 퇴행성 과정이 사실 발달 과정의 비정상적인 활성화임을 이전에 제안한 바 있다. 이러한 가설을 지지함에 있어서, 뇌간 '허브' 신경세포의 고 영양이 실제로 알츠하이어 뇌에서 보고된바 있다(Bowser et al., 1997, Brain Pathol. 7:723-30). 만약 이러한 허브의 큰 영역이 손상을 입는다면, 빈번하게 관찰되나 아직까지 설명되지 않는 알츠하이머 및 파킨슨 병을 갖는 공통-병변의 케이스가 나타나는 것처럼 그 후 하나 이상의 신경퇴행성 질환이 나타날 것이다. 흥미롭게도, 모든 전신경세포의 취약성 허브 내의 신경세포들은, 전달 이질성에도 불구하고, 모두 친숙한 효소 아세틸콜린에스테라제(AChE)를 포함한다. AChE는 그러므로 정상 기능을 수행할 수 없는 신경세포 내 존재하고, 노르아드레날린에 의해 활성화된 청반, 도파민 작동성 흑질, 또는 세라토닌 작동성 라페핵(raphe nuclei)과 같은 이러한 세포의 서브-그룹이기 때문에 어떤 경우에도 일반적인 기질, 아세틸콜린을 포함하지 않는다. 정상적인, 효소적 역할에서 예측하지 못한 추가적인 예외는 AChE가 실제로 전신경세포로부터 방출되고, 아마도 그 자체로 내부-세포성 메신저의 일부 종류라고 추정된다는 것이다. 일반적으로, AChE는 현재 신경 및 비-신경 조직에서 다양한 상황에서 다양한 영양 활성을 갖는 신호 분자로서 널리 그리고 잘 확립되어 있다.
본 발명자들은 이전에 이것의 신경세포로의 칼슘의 유입을 유도하는 효소 작용과는 독립적으로 영양 물질로서 작동하는 AChE를 보인 바 있다. 그러므로 전신경세포에서, AChE가 양, 이용 가능한 기간 및 가장 뚜렷하게는 나이 의존적으로 영양-독소 축에 따른 범위의 이중 비-전통적 역할을 갖는다는 것이 가능하다. 만약 표준 신경세포들이 성인기에, 뇌졸중에서와 같이 손상을 입은 경우, 다른 것들은 기능적으로 보상된다. 반면, 전신경세포는 재건을 위한 시도에 있어서 그들의 영양원에서의 요청에 의하여 반응하게 된다. 그러나 연속적인 칼슘의 유입이 노화하고 성숙한 세포에서는 치명적이기 때문에, 결과적 손상은 신경퇴행을 특징으로 하는 치명적인 사이클에서의 추가적인 보상 시도를 유발한다.
아세틸콜린에스테라제(AChE)는 다양한 형태의 다른 발달 단계에서 발현되며, 이들은 모두 동일한 효소적 활성을 가지나, 매우 다른 분자 조성을 갖는다. 'tailed' (T-AChE)는 시냅스에서 발현되고, 본 발명자들은 하나는 "T14"로 언급되고, 다른 것은 "T-30"으로 알려져 있는 C-말단으로부터 절단될 수 있는 두 개의 펩티드를 이전에 동정하였으며, 이들은 모두 β-아밀로이드의 대응가능한 영역에 대하여 강한 서열 상동성을 갖는다(도 11; 및 서열번호: 2 - 5 참조). AChE C-말단 펩티드 "T14"는 비-가수분해 활성 범위에 책임이 있는 AChE 분자의 가장 중요한 부분으로 확인된 바 있다. 합성 14 아미노산 펩티드 유사체(즉, "T14"), 그리고 파묻혀 있는 서열 내부 뒤의 더 크고, 더 안정하며, 더 강력한 아미노산 서열 (즉, "T30")은 '비-콜린성' AChE에 대하여 보고된 그들과 비교할 만한 활성을 나타내고, 여기서 T30 서열 내 비활성화 잔기(즉, "T15")는 효과를 갖지 않는다
T14 및 T30의 급성 효과는 다음과 같다: (i) 그들은 1000분의 1초 내지 수시간에 이르는 시간 단위에 따라 뇌 단편에서 뉴런으로 칼슘의 유입을 조절하고; (ii) PC12 세포 및 시험관 내 신경 세포 기관형 배양에서도 세포의 생존률을 절충하고, (ⅲ) 신경세포 및 PC12 세포로부터 '보상적(compensatory)' 칼슘-유도된 AChE 방출을 조절하며; (iv) 난자 내의 칼슘 전류와 뇌 절편의 신경세포를 활성화시키고; (v) 독소 효과에서 아밀로이드와 시너지를 일으키며; 그리고 (vi) 아밀로이드 전구체 단백질의 생산 및 아밀로이드 베타 펩티드 방출에 관여한다. T14 및 T30의 만성 효과는 다음과 같다: (i) 신경세포 성장 감소; (ii) 세포자멸사 유도; (ⅲ) AChE 방출 증가; (iv) α7 니코틴성-수용체에 결합 및 조절; 그리고 (v) 24시간 동안 세포 표면에서 α7 수용체의 발현 증가, 이에 따른 추가적 독성에 대한 피드 포워드(feedforward) 메카니즘 제공.
T14 및 T30이 독성 유도에 있어서 β-아밀로이드보다 더 선택적이고, 그들이 또한 악화된 독성 아밀로이드와 시너지를 내기 때문에, T14 또는 T30의 효과를 차단하는 임의의 제제가 아밀로이드의 후속 독성 효과 및 낮은 선택성을 감소시킬 수 있다는 것이 가정된다. 본 발명자들은 이전에 T30 및 T14 펩티드가 영양-독소(trophic-toxic) 효과의 스펙트럼을 유도하기 위하여 α7 니코틴성-수용체 상의 알로스테릭 부위(allosteric site)에 결합한다는 것을 보인 바 있다. 이러한 수용체는 뇌 발달의 필수적인 기간 동안 AChE와 공동-발현될 뿐만 아니라 성인의 뇌에서 밀접한 병렬 분포를 보여주고, 이는 뇌에서 가장 강력한 칼슘 이온투과 담체(ionophores)의 하나이다. 이는 또한 콜린성 전달과 독립적으로 기능할 수 있으며, 이는 (식이유래의) 콜린이 대안적인 일차 리간드로서 작용할 수 있기 때문이다. 게다가, 이들 수용체들은 이미 전류 치료법 갈란타민(galanthamine) (Reminyl (RTM))의 표적 중 하나로 알츠하이머 질환과 연관되어 있을 뿐만 아니라 아밀로이드 활성과 연결되어 있다.
그러나 갈란타민의 효과는 제한적인 것으로 입증되었고, 다른 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 길항제(antagonist)들은 여전히 임상 시험 중에 있다. 갈란타민은 α7 니코틴성-수용체에 대하여 더 높은 친화도(즉, 5nM)를 갖는 T30 및 T14의 친화도와 비교하여 α7 니코틴성-수용체에 대하여 낮은 친화도를 갖는다 (즉, 단 10 μΜ). 그러므로 만약 알츠하이머의 뇌에서 T30 펩티드의 내생적 당량이 이미 각 수용체 위치를 차지하고 있다면, 갈란타민은 비-생리학적인, 피할 수 없는 부작용 및 가장 중요하게는, 의심스러운 효과를 갖는 높은 용량을 투여받을 필요가 있다.
그러므로 신경 퇴행성 장애, 예컨대 알츠하이머 병 및 파킨슨 병의 치료를 위한 개선된 의약품 제공의 필요성이 있다.
실시예에 개시된 바와 같이, 본 발명자는 놀랍게도 AChE C-말단으로부터 유래된 고리형 폴리펩티드가 시험관 내에서 AChE 및/또는 이의 말단 펩티드의 비-전형적인 효과(즉, AChE의 효소적 활성과 독립적인 효과)를 선택적으로 억제하는데 사용될 수 있으며, 그러므로 신경퇴행성 장애를 효과적으로 치료할 수 있음을 입증하였다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)의 C-말단, 또는 이의 절단물(truncation)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue)를 제공한다.
고리형 폴리펩티드는 펩티드 체인이며, 이의 N- 및 C-말단은 그들 자체를 펩티드 결합으로 서로 연결되게 하고 아미노산의 고리 체인을 형성하게 하며, 지금까지 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)의 C-말단, 또는 이의 절단물로부터 유래된 어떠한 고리형 펩티드도 개발된 바 없다. 실시예에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 과산화수소의 비특이적 작용에 대한 보호의 무효력이 상기 제1 양태의 고리형 폴리펩티드의 차단 활성이 매우 선택적이고, 수용체-매개된 것이라는 것을 암시한다는 것을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 고리형 폴리펩티드가 α7 니코틴성-수용체의 알로스테릭 부위(예를 들어, 이버멕틴- 민감성 (Ivermectin-sensitive) 알로스테릭 부위)를 통한 추가적인 칼슘의 유입을 막는다는 것 및 β-아밀로이드뿐만 아니라 선형 T14 및 T30 펩티드에 대한 결합 경쟁에서 효과적으로 우위를 가질 수 있다는 것을 나타내는 다양한 시험에서 선형 펩티드, T14 및 T30의 알려진 독성 효과를 상쇄한다는 매우 놀라운 결과를 확인하였다. 그러므로 선형 폴리펩티드, 이들의 유사체 또는 유도체는 α7 니코틴성-수용체의 선택적 길항제(selective antagonist)일 수 있다.
그러나 발명자들은 본 발명의 고리형 폴리펩티드가 T30 및 아밀로이드 베타 펩티드의 활성을 상쇄하는 α7 니코틴성-수용체의 비활성 알로스테릭 조절자로서 작용한다는 것을 보였다. 그러므로 바람직하게는 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 α7 니코틴성-수용체의 선택적인 알로스테릭 조절자이며, 더 바람직하게는 이의 비활성(inert) 선택적인 알로스테릭 조절자이다. 상기 용어 "비활성(inert)"은 본 발명의 폴리펩티드가 오직 독소 화합물, 즉, T30 및 아밀로이드 베타 펩티드(β-아밀로이드)의 존재 하에서만 수용체의 알로스테릭 조절자로서 작용하는 것을 의미할 수 있다.
바람직하게는, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 α7 니코틴성-수용체의 알로스테릭 부위(가장 바람직하게는, 이버멕틴-민감성 알로스테릭 부위)를 통한 칼슘의 추가적인 유입을 막는다. 고리형 폴리펩티드, 이의 유사체 또는 유도체는 β-아밀로이드에 대한 결합에 대한 경쟁에서 우위인 것이 바람직하다.
본 발명의 펩티드가 이미 각 수용체 부위를 차지하고 있는 T30 펩티드의 내생적 등가물(endogenous equivalent)에 대한 경쟁에서 우위라는 것은 예측될 수 없다. 게다가, 고리형 펩티드의 강화된 안정성은 이러한 효과적인 대체를 설명한다. 따라서, 본 발명의 고리형 폴리펩티드는 선형 T14, T30 펩티드 및 β-아밀로이드의 이전에 확립된 독성 효과를 차단한다. 본 발명자들은 그러므로, 본 발명의 고리형 폴리펩티드가 안정된 임의의 추가적인 세포 손실에서의 신경퇴화성 장애의 치료에 매우 유용하다는 것임을 생각하였다.
용어 "이의 유도체 또는 유사체"는 내부 아미노산 잔기가 유사한 측쇄 또는 펩티드 백본 능력을 갖는 잔기(천연 아미노산, 비-천연 아미노산 또는 아미노산 유사체(mimics))에 의해 치환된 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
용어 "~로부터 유래된"은 AChE의 C 말단, 및 이의 부분의 내부 또는 이의 형태에 존재하는 아미노산 서열의 유도체 또는 변형인 아미노산 서열을 의미할 수 있다.
용어 "이의 절단물(truncation)"은 AChE로부터 유래된 고리형 폴리펩티드가 아미노산의 제거에 의해서 크기가 감소된 것을 의미할 수 있다. 아미노산의 감소는 본 발명의 고리형 폴리펩티드로의 환형화 전의 펩티드의 C- 또는 N-말단 유래의 잔기의 제거에 의해서 달성될 수 있거나 또는 환형화 전의 펩티드의 코어 내로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결실에 의해서 달성될 수 있다.
바람직하게는, 상기 고리형 폴리펩티드는 정제되고 및/또는 단리된, 즉, 천연에서 발견되지 않는 것이다.
아세틸콜린에스테라제는 아세틸콜린을 가수분해하는 세린 프로테아제이며, 당업자에 잘 알려져 있다. 뇌에서 발견되는 아세틸콜린에스테라제의 주요 형태는 T-AChE(tailed acetylcholinesterase)로 알려져 있다. 본 발명은 신경퇴행성 장애를 치료하는 것에 주된 관심을 갖고 있다는 것을 감안하면, 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 T-AChE(tailed acetylcholinesterase)의 C-말단, 또는 이의 절단물 유래의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
인간 T-AChE(tailed acetylcholinesterase)(Gen Bank: AAA68151.1)의 일 구현예의 단백질 서열은 614 아미노산 서열 길이이며, 하기와 같은 서열번호 1로 제공된다:
Figure pct00001
[서열번호 1]
단백질이 방출되는 동안 먼저 서열번호 1의 첫번째 31 아미노산 잔기가 제거되고, 이에 따라 583 아미노산 서열이 남는 것이 적절하다. 이에 따라 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 아세틸콜린에스테라제의 C-말단 또는 이의 절단물로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하며, 여기에서 상기 아세틸콜린에스테라제는 서열번호 1로 표시되는 것과 같은 실실적인 아미노산 서열, 바람직하게는 N-말단에서 31 아미노산이 제외된 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
바람직하게는, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 아세틸콜린에스테라제의 C-말단, 또는 이의 절단물을 형성하는 300, 200, 100 또는 50 이상의 아미노산으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 아세틸콜린에스테라제는 실질적으로 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 바람직하게는 아세틸콜린에스테라제의 C-말단, 또는 이의 절단물을 형성하는 40 아미노산 이상으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 이의 유사체는 8 내지 40 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 10 내지 30 아미노산, 가장 바람직하게는 12 내지 20 아미노산을 포함한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 β-아밀로이드(Αβ) 및 AChE의 C-말단으로부터 유래된 T30, T14 및 T15로 언급되는 세가지 펩티드 사이에 서열 정렬을 준비하였다. β-아밀로이드(Αβ)의 부분 아미노산 서열은 하기와 같은 서열번호 2로 제공된다:
Figure pct00002
[서열번호 2]
T30의 아미노산 서열(서열번호 1의 마지막 30 아미노산 잔기에 상응)은 하기와 같이 서열번호 3으로 제공된다:
Figure pct00003
[서열번호 3]
T14의 아미노산 서열(서열번호 1의 말단 쪽으로 위치한 14 아미노산 잔기에 상응하며, 그리고 T30에서 확인되는 마지막 15 아미노산의 결핍)은 하기와 같이 서열번호 4로 제공된다:
Figure pct00004
[서열번호 4]
T15의 아미노산 서열(서열번호 1의 마지막 15 아미노산 잔기에 상응)은 하기와 같이 서열번호 5로 제공된다:
Figure pct00005
[서열번호 5]
본 발명자들은 서열번호 2 내지 5에 기초하여 공통 서열(consensus sequence)을 생성하였고, 이는 하기와 같이 서열번호 6으로 제공된다:
Figure pct00006
[서열번호 6]
바람직하게는, 서열번호 6에서, x1은 염기성 아미노산 잔기, 바람직하게는 히스티딘(H)일 수 있고; X2는 염기성 잔기, 바람직하게는 아르기닌(R)일 수 있으며, X3는 방향족 아미노산 잔기, 바람직하게는 트립토판(W)일 수 있고; X4는 지방족 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린(S)일 수 있고; X5는 트립토판(W) 또는 메티오닌(M)일 수 있다.
서열번호 2 내지 6으로 표시되는 서열 중 임의의 서열은 제1 양태의 고리형 폴리펩티드를 형성하기 위해 쉽게 고리화 될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 펩티드의 고리화는 측쇄-측쇄, 또는 측쇄-백본, 또는 머리-꼬리(C-말단-N-말단)고리화 기술에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 머리-꼬리 고리화(head-to-tail cyclization)는 고리형 폴리펩티드가 생산되기 위해 바람직한 방법이다. 고리형 폴리펩티드는 전통적인 용액-상 선형 펩티드 고리화 또는 수지-기반 고리화를 이용하여 합성될 수 있다. 바람직한 고리화 방법이 실시예에서 기술된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 순차적인 선형 펩티드 합성 이후 고리화에 의해 고리형 폴리펩티드가 합성되는 고리화 절단 접근법에 의해서 생산된다. 이러한 방법의 장점은 측쇄가 고정될 필요가 없어, 일반적인 접근법이 되도록 한다. 바람직하게는, 사용하기 전에, 고리형 펩티드의 결과 시료는 MALDI-TOF MS로 분석할 수 있다.
이에 따라 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 고리화 서열번호 3, 4, 5 또는 6 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 고리형 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, N-말단 리신 잔기는 아미노산 환형 체인을 형성하기 위하여 C-말단 류신 잔기와 연결된다. 또 다른 구현예에서, 상기 고리형 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, N-말단 알라닌 잔기는 C-말단 리신 잔기와 연결된다. 또다른 구현예에서, 상기 고리형 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, N-말단 아스파라긴 잔기는 C-말단 류신 잔기와 연결된다. 또 다른 구현예에서, 상기 고리형 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 x1은 염기성 아미노산 잔기, 바람직하게는 히스티딘(histidine, H)이며; 상기 x2는 염기성 아미노산 잔기, 바람직하게는 아르기닌(arginine, R)이고; x3는 방향족(aromatic) 아미노산 잔기, 바람직하게는 트립토판(tryptophan, W)이고; x4는 지방족 히드록실 측쇄(aliphatic hydroxyl side chain)를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린(serine, S)이고; x5는 트립토판(tryptophan, W) 또는 메티오닌(methionine, M)이다.
본 발명자들은 고리화 서열번호 4(즉, 본원에서 "고리화 T14(cyclated T14)" "CT14" 또는 "NBP14"로 언급됨)가 놀랍게도 실제 α7 니코틴성-수용체의 길항체로 작용하며, 즉, 고리화 서열번호 4가 세포를 선형 T14, T30 및 β-아밀로이드 독성으로부터 보호한다는 것을 발견하였다. 게다가 고리화 T14는 선형 T14 및 T30의 독성에 의해 유도되는 보상성 AChE 방출을 차단한다. 게다가, 이들은 단독으로 주어진 고리형 T14는 랫트 뇌 절편에서 Ca2 + 농도에 뚜렷한 영향을 주지 않지만, β-아밀로이드의 영향을 차단할 수 있음을 관찰하였다. 따라서, 바람직한 제1 양태의 고리형 폴리펩티드는 고리형 서열번호 4 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함한다.
당업자는 기능적 변이체 및 유사체가 실질적으로 실시예에 기술된 임의의 실험에서의 고리형 T14와 같은 생물학적 활성을 보유하고 있다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 기능적 변이체 또는 유사체는 α7 니코틴성-수용체 상의 이버멕틴-민감성 알로스테릭 부위에서의 이것의 길항제 활성에 기초하여, 또는 AChE 방출을 차단하는 정도 또는 선형 T14, T30 및 β-아밀로이드 독성으로부터 세포를 보호하는 정도 또는 랫트의 뇌 절편에서 Ca2 + 수준을 조절하는 정도에 의하여 선택될 수 있다.
본 발명자들은 제1 양태에 따른 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체에 의해서 제공되는 수용체 길항체를 명백하게 확인하였으며, 이는 당 분야의 통상의 기술자에게 전혀 자명하지 않은 놀라운 사실이다. 이에 따라 본 발명자들은 임의의 폴리펩티드의 고리화가 수용체 길항, 예컨대 α7 니코틴성-수용체 대하여 사용할 수 있음을 인지한다.
그러므로 제2 양태에 있어서, 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체를 포함하는 수용체 길항제가 제공된다.
또한, 제3 양태에 있어서, 수용체 길항제로 사용하기 위한 용도의 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체를 제공한다.
상기 논의한 바와 같이, 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 고리형 폴리펩티드가 T30 및 아밀로이드 베타 펩티드의 활성을 길항하는 α7 니코틴성-수용체의 비활성 알로스테릭 조절자로서 작용한다는 것을 보였다.
그러므로, 제4 양태에 있어서, 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체를 포함하는 수용체 알로스테릭 조절자를 제공한다.
제5 양태에 있어서, 수용체 알로스테릭 조절자로 사용하기 위한 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체를 제공한다.
상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 바람직하게는 제1 양태에 따른 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체이다. 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체 제제가 길항적으로 또는 알로스테릭적으로 조절하는 상기 수용체는 임의의 수용체 일 수 있으나, 바람직하게는 α7 니코틴성-수용체이다. 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 수용체 상의 알로스테릭 부위, 바람직하게는 수용체의 이버멕틴-민감성 알로스테릭 부위를 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명자는 예를 들어, 알츠하이머 병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료에서 고리형 폴리펩티드가 사용될 수 있다는 것을 처음으로 보여준 것이라고 믿는다.
따라서, 또 다른 양태에 있어서, 치료 또는 진단에 사용하기 위한 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue)를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 신경퇴행성 장애(neurodegenerative disorder)의 치료, 개선 또는 예방에 사용하기 위한 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 대상에서 신경퇴행성 장애의 치료, 개선 또는 예방 방법을 제공하고, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체의 치료적 유효량의 투여를 포함한다.
상기한 바와 같이, 본 발명자는 본 명세서에 개시된 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체 또는 수용체 길항제 또는 알로스테릭 조절자가 신형퇴행성 장애를 치료하기 위한 기초를 형성하는데 사용될 수 있다는 것을 믿는다.
따라서, 본 발명의 제6 양태에 있어서, 치료 또는 진단에 사용하기 위한 제1 양태에 따른 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체, 또는 제2 양태에 따른 수용체 길항제, 또는 제4 양태의 수용체 알로스테릭 조절자를 제공한다.
제7 양태에 있어서, 신경퇴행성 장애의 치료, 개선 또는 예방에 사용하기 위한 제1 양태에 따른 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체, 또는 제2 양태에 따른 수용체 길항제, 또는 제4 양태의 수용체 알로스테릭 조절자를 제공한다.
제8 양태에 있어서, 대상에서 신경퇴행성 장애의 치료, 개선 또는 예방 방법을 제공하고, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에 제1 양태에 따른 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체, 또는 제2 양태에 따른 수용체 길항제, 또는 제4 양태의 수용체 알로스테릭 조절자의 치료적 유효량의 투여를 포함한다.
바람직하게는, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease); 파킨슨 병(Parkinson's disease); 헌팅톤병(Huntington's disease); 운동 뉴런 질환(Motor Neurone disease); 척수 소 뇌성(Spinocerebellar) 1 형, 2 형 및 3 형; 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS); 및 전측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 알츠하이머 병이다.
치료되는 상기 신경퇴행성 장애는 바람직하게는 '전신경세포(Global neuron)'의 손상 또는 사멸에 의한 것을 특징으로 한다.
예를 들어, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease); 파킨슨 병(Parkinson's disease); 헌팅톤병(Huntington's disease); 운동 뉴런 질환(Motor Neurone disease); 척수 소 뇌성(Spinocerebellar) 1 형, 2 형 및 3 형; 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS); 및 전측두엽 치매(Frontotemporal Dementia); 및 조현병(Schizophrenia)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 치료되는 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 병, 파킨슨 병 또는 운동 뉴런 질병이다. 더욱 바람직하게는, 치료되는 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 병이다.
본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드 또는 수용체 길항제 또는 수용체 알로스테릭 조절자는 예를 들어, 알츠하이머 병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료, 완화 또는 예방을 위한 단일약물요법(즉, 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체의 이용)에서 사용될 수 있는 약제로 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 대안적으로, 본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드 또는 수용체 길항제 또는 수용체 알로스테릭 조절자는 다른 아세틸콜린에스테라제 억제제와 같은 알츠하이머 병의 치료, 완화 또는 예방을 위한 공지된 치료제의 보조물 또는 조합으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드는 특히, 조성물이 사용되는 방식에 따라 다수의 다른 형태를 갖는 조성물에 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물은 분말, 정제(tablet), 캡슐, 액체, 연고, 크림, 겔, 하이드로겔, 에어로졸, 스프레이, 마이셀 용액, 경피 패치, 리포좀 현탁액 또는 치료를 필요로 하는 사람 또는 동물에게 투여될 수 있는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 약제의 부형제(vehicle)는 이것이 주어지는 대상에 내성 좋은 물질이어야만 하고, 바람직하게는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 고리형 폴리펩티드의 전달을 가능하게 하는 것임을 이해할 것이다.
뇌 장애에 대한 치료 효율이 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통과하는 후보 치료 화합물의 능력에 달려 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명자는 고리형 T14의 크기의 펩티드는 경구 투여 후에 빠른 접근을 못할 수 있다고 믿는다. 그러나 알츠하이머 병 중에, 상기 혈액-뇌 장벽은 실제 이론적으로 필요한, 즉, BBB가 손상되는 변성 부위에서만 고리형 T14가 중앙 신경계로 도달하는 것을 가능하게 하도록 투과성이 증가한다고 알려져있다.
두 가지 주요 전략은 고리형 T14(즉, NBP-14)와 같은 큰 분자로 BBB를 통과하기 위해 적용될 수 있고, 포함한다: (1) 특이적으로 뇌를 표적하고 상기 활성 화합물을 운반하기 위한 운반체(transporter)로서 나노물질의 이용. 이 방법은 뇌로 펩티드, 단백질 및 항암 약물을 전달하기 위해 성공적으로 이용된다; (2) 카르고(cargo) 펩티드의 이용. BBB를 가로질러 특이적으로 운반된 이와 같은 펩티드의 부가는 용이한 방식을 통해 고리형 펩티드의 운반을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드를 포함하는 약제는 다양한 방식으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여는 고리형 콜리펩테드가 예를 들어, 정제, 캡슐 또는 액체의 형태로 경구 섭취될 수 있는 조성물 내에 포함되는 경우에 요구될 수 있다. 고리형 T14(즉, NBP14)의 투여를 위한 대안적인 선택은 비강 스프레이의 이용일 수 있다. 비강 스프레이에 의한 펩티드 투여는 뇌에 빠르게 도달하고, 경구 또는 정맥 투여 방식보다 더욱 효율적이다 (http://memoryzine.com/2010/07/26/nose-sprays-cross-blood-brain-barrier-faster-and-safer/을 참고). 따라서, 본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 흡입(예를 들어, 비강 내)에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 또한 국소 사용을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 크림 또는 연고는 예를 들어, 뇌에 인접한 피부에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드는 또한 저속- 또는 지연-방출 장치 내에 통합될 수 있다. 상기 장치는 예를 들어, 피부 위에 또는 아래에 삽입될 수 있고, 약제는 수두 또는 수개월에 걸쳐 방출될 수 있다. 상기 장치는 예를 들어, 머리와 같이 최소한 치료 부위에 근접하게 위치할 수 있다. 이러한 장치는 본 발명에 따라 사용된 고리형 폴리펩티드를 이용한 장기간 치료시 특히 유용할 수 있으며, 일반적으로 빈번한 투여(예를 들어, 적어도 매일 주사)를 요구한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제는 주사를 통해 혈류로 또는 치료가 필요한 부위에 직접적으로 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 적어도 뇌 부근에 주입될 수 있다. 주사는 정맥(볼루스(bolus) 또는 주입제(infusion)) 또는 피하(볼루스 또는 주입제), 또는 피내(볼루스 또는 주입제) 주사일 수 있다.
요구되는 고리형 폴리펩티드의 양은 이의 생물학적 활성 및 생체이용률에 의해 판단되며, 결과적으로 이는 투여 방식, 고리형 폴리펩티드의 물리화학적 특성 및 단독 치료 또는 결합 치료에 사용되는지 여부에 따라 판단된다고 이해될 것이다. 투여 빈도는 또한 치료되는 대상 내 고리형 폴리펩티드의 반감기에 의해 영향을 받을 것이다. 최적의 투여량은 당업자에 의해 판단될 수 있으며, 사용되는 특정 고리형 폴리펩티드, 약학적 조성물의 강도, 투여 방식, 신경퇴행성 질환의 발전에 의해 변할 수 있다. 대상 연령, 체중, 성별, 식이 요법, 및 투여 시간을 포함하는 치료되는 특정 대상에 따른 추가적 요인은 투여량을 조절할 필요성이 발생한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드는 신경퇴행성 질환의 치료, 개선, 또는 예방을 위해 어느 고리형 폴리펩티드가 사용되느냐에 따라 체중의 0.001 μg/kg 내지 체중의 10 mg/kg의 일일투여량이 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 일일투여량은 체중의 0.01 μg/kg 내지 체중의 1 mg/kg이며, 가장 바람직하게는 대략 체중의 0.1 μg/kg 내지 10 μg/kg이다.
고리형 폴리펩티드는 신경퇴행성 질환의 발병 전, 동안, 후 투여될 수 있다. 일일투여량은 단일 투여(예를 들어 단일 일일 주사 또는 비강 스프레이의 흡입)로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 고리형 폴리펩티드는 하루 동안 두 번 이상 투여가 요구될 수 있다. 예를 들어, 고리형 폴리펩티드는 0.07 μg 내지 700 mg의 투여량(즉, 70 kg의 체중을 가정)이 하루에 두 번(또는 그 이상, 치료될 신경퇴행성 질환의 심각성에 따라) 투여될 수 있다. 치료를 받는 환자는 깨어났을 때 첫 번째 복용한 후 저녁에(만일 두번 복용 체계라면) 또는 3- 또는 4-시간 간격 후 두 번째 복용할 수 있다. 대안적으로, 서방형 장치는 적절한 투여량의 본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드를 반복되는 복용량을 투여할 필요 없이 환자에게 제공하는데 사용될 수 있다.
제약 산업(예를 들어 체내실험, 임상실험, 등)에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 공지된 절차는 본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드의 특정 제형 및 정확한 치료 체계(제제의 일일투여량 및 투여의 빈도와 같은)를 형성하기 위해 사용될 수 있다.　본 발명자는 본 발명의 고리형 폴리펩티드의 사용에 기반하여 항-신경퇴행성 질환 조성물을 처음으로 제안하는 것으로 믿는다.
따라서, 본 발명의 제9 양태에 있어서, 제1 양태에 따른 치료적 유효량의 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체 또는 제2 양태에 따른 수용체 길항제 또는 제4 양태의 수용체 알로스테릭 조절자, 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 e담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 바람직하게는 항-신경퇴행성 질환 조성물, 즉, 알츠하이머 병과 같은 대상의 신경퇴행성 장애의 치료적 개선, 예방 또는 치료에 사용되는 약학적 제형이다.
본 발명은 또한 제10 양태에 있어서, 제9 양태에 따른 약학적 조성물을 제조하는 공정, 제1 양태에 따른 치료적 유효량의 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체 또는 제2 양태에 따른 수용체 길항제 또는 제4 양태의 수용체 알로스테릭 조절자와, 약학적으로 허용되는 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 공정을 제공한다.
고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같이 고리형 T14(즉, NBP14), 즉, 서열번호 4이다.
"대상"은 척추동물, 포유동물, 또는 가축일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약제는 임의의 포유동물, 예를 들어 가축(예를 들어, 말), 애완 동물을 치료하는데 사용되거나, 또는 다른 수의학적 용도로 사용될 수 있다.　그러나 가장 바람직하게는 대상은 인간이다.
대상에 투여되는 임의의 양인 고리형 폴리펩티드의 "치료적 유효량"은, 신경퇴행성 장애 조건을 치료하거나, 또는 원하는 효과를 생성하는데 필요한 활성 제제의 양이다.
예를 들어, 사용되는 고리형 폴리펩티드의 치료적 유효량은 약 0.001 mg 내지 약 800 mg, 바람직하게는 약 0.01 mg 내지 약 500 mg일 수 있다. 고리형 폴리펩티드의 양은 약 0.1 mg 내지 약 100 mg인 것이 바람직하다. 　
본원에 언급된 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 조성물의 제형화에 유용한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 공지된 화합물 또는 공지된 화합물의 조합이다.　
일 구현예에서, 약학적으로 허용되는 담체는 고체일 수 있으며, 조성물은 분말 또는 정제의 형태일 수 있다.　약학적으로 허용되는 고체 담체는 또한 방향제(flavouring agents), 윤활제(lubricants), 가용화제(solubilisers), 현탁제(suspending agents), 염료(dyes), 충전제(fillers), 유동화제(glidants), 압축보조제(compression aids), 불활성 결합제(inert binders), 감미료(sweeteners), 방부제(preservatives), 코팅제(coatings), 또는 정제-붕해제(tablet-disintegrating agents)로서 작용할 수 있는 1 이상의 물질을 포함할 수 있다.　담체는 또한 캡슐화제일 수 있다.　분말에서, 담체는 본 발명에 따른 미세하게 나뉜 활성 제제와의 혼합물 내에 있는 미세하게 나뉜 고체이다.　정제에서, 활성 제제(즉, 조절자)는 적절한 비율의 필요한 압축 특성을 갖는 담체와 혼합될 수 있으며 원하는 모양 및 크기로 압축될 수 있다.　분말 및 정제는 바람직하게는 활성 제제를 99%까지 포함한다.　적절한 고체 담체는 예를 들어 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토오스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 저융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학적 담체는 겔(gel)일 수 있으며 조성물은 크림(cream) 또는 이와 유사한 형태일 수 있다.　
그러나, 약학적 담체는 액체일 수 있으며, 약학적 조성물은 용액의 형태이다.　액체 담체는 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르제(elixirs) 및 가압된 조성물을 제조하는데 사용된다.　본 발명에 따른 활성 제제(고리형 폴리펩티드)는 물, 유기 용매, 이들의 혼합물과 같은 약학적으로 허용되는 액체 담체 또는 약학적으로 허용되는 오일 또는 지방에 용해 또는 현탁될 수 있다.　액체 담체는 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 방향제, 현탁제, 증점제, 색료, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압 조절제와 같은 다른 적절한 약학적 첨가제를 포함할 수 있다.　 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 담체의 적절한 예시는 물(상기, 예를 들어 셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 카복시메틸 셀룰로오스 나트륨 용액과 같은 첨가제를 부분적으로 포함), 알코올(1가 알코올 및 다가 알코올, 예를 들어 글리콜을 포함) 및 이의 유도체, 및 오일(예를 들어 분별 코코넛 오일 및 아라키스 오일)을 포함한다.　비경구 투여의 경우, 담체는 또한 에틸 올리에이트(ethyl oleate) 및 이소프로필 미리스테이트(isopropyl myristate)와 같은 유상 에스테르일 수 있다. 무균 액체 담체는 비경구 투여를 위한 무균 액체 형태 조성물에서 유용하다.　가압된 조성물을 위한 액체 담체는 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용되는 압축가스(propellant)일 수 있다.
무균 용액 또는 현탁액인 액체 약학적 조성물은, 예를 들어, 근육 내, 척추 강내, 경막 내, 복강 내, 정맥 내 및 특히 피하 주사를 통해 활용될 수 있다.　고리형 폴리펩티드는 멸균수, 식염수, 또는 다른 적절한 무균 주사가능한 배지를 이용한 투여시 용해 또는 현탁될 수 있는 무균 고체 조성물로서 제조될 수 있다.　
본 발명의 고리형 폴리펩티드 및 조성물은 다른 용질 또는 현탁제(예를 들어, 용액을 등장성으로 만드는 충분한 식염수 또는 글루코오스), 담즙염, 아카시아, 젤라틴, 소르비탄 모노올리에이트, 폴리소르베이트 80(소르비톨의 올리에이트 에스테르 및 에틸렌 옥사이드로 공중합된 이의 무수물) 및 이와 유사한 것을 포함하는 무균 용액 또는 현탁액의 형태로 경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 고리형 폴리펩티드는 또한 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수 있다.　경구 투여를 위한 적절한 조성물은 알약, 캡슐, 과립, 정제 및 분말과 같은 고체 형태, 및 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르제, 및 현탁액과 같은 액체 형태를 포함한다.　비경구 투여에 유용한 형태는 무균 용액, 에멀젼, 및 현탁액을 포함한다.　
본 발명자들은 이들의 길항적 성질로 인한 제1 양태에 따른 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체의 놀라운 치료적 효과를 증명하였으나, 이는 또한 α7 니코틴성-수용체의 구조 및/또는 기능을 조사하기 위한 비-임상적 관련 실험에 유용할 것이라 생각된다.
따라서, 추가적 양태에서, α7 니코틴성-수용체를 조사하는 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo) 분석 방법에 있어 제1 양태에 따른 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체의 용도가 제공된다.
바람직하게는, 상기 방법은 α7 니코틴성-수용체의 알로스테릭 부위를 조사하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 고리형 펩티드를 이용하여 α7 니코틴성-수용체를 통한 칼슘의 추가적인 유입을 방지하는 단계를 포함한다. 상기 고리형 펩티드는 바람직하게는 길항제로서 작용하며 칼슘 이온을 차단한다.
본 발명은 이의 기능적 변이체 또는 기능적 단편을 포함하는 본원에 언급된 임의의 서열 중 실질적으로 아미노산 또는 핵산 서열을 포함하는 임의의 핵산 또는 펩티드 또는 이의 변이체, 유도체 또는 유사체로 확장된다고 이해될 것이다. 용어 "실질적으로 아미노산/뉴클레오티드/펩티드 서열(substantially the amino acid/nucleotide/peptide sequence)", "기능적 변이체(functional variant)" 및 "기능적 단편(functional fragment)"은 본원에 언급된 임의의 서열 중 아미노산/뉴클레오티드/펩티드 서열과 적어도 40% 서열 동일성, 예를 들어 서열번호 1 내지 6 등으로 확인된 서열과 40% 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
언급된 임의의 서열에 대해 65%보다 큰, 더 바람직하게는 70%보다 큰, 더욱 바람직하게는 75%보다 큰, 더욱 바람직하게는 80%보다 큰 서열 동일성을 갖는 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열이 또한 예상된다. 바람직하게는, 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열은 언급된 임의의 서열과 적어도 85% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 92% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 97% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 동일성 및, 가장 바람직하게는 본원에 언급된 임의의 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는다.
숙련된 기술자는 두 개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율을 어떻게 계산하는지 이해할 것이다. 두 개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하기 위하여, 먼저 두 개의 서열을 정렬한 뒤 서열 동일성 값을 계산하였다. 두 개의 서열의 동일성 백분율은 하기에 따라 다른 값을 가질 수 있다:- (i) 서열을 정렬하는데 사용되는 방법, 예를 들어, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman(다른 프로그램에서 수행되는), 또는 3D 비교로부터 구조적 배열; 및 (ii) 배열 방법에 사용되는 파라미터, 예를 들어, 일부 (local) vs 전역 정렬(global alignment), 사용되는 한 쌍의-스코어 매트릭스(pair-score matrix)(예를 들어 BLOSUM62, PAM250, Gonnet 등), 및 갭-패널티(gap-penalty), 예를 들어 함수 형태 및 상수.
정렬을 만드는데 있어서, 두 개의 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하는 많은 다른 방법이 있다. 예를 들어, 하나는 하기에 의해 많은 동일성(identities)들로 나눌 수 있다: (i) 가장 짧은 서열의 길이; (ii) 정렬의 길이; (iii) 서열의 평균 길이; (iv) 비-간격 위치(non-gap positions)의 수; 또는 (iv) 돌출부(overhangs)를 제외하고 동등한 위치의 수. 또한, 동일성 백분율이 강하게 길이 의존적이라는 것은 이해될 것이다. 따라서, 서열 쌍이 더 짧을수록, 우연히 발생하는 것으로 예상되는 서열 동일성은 더 높다.
따라서, 단백질 또는 DNA 서열의 정확한 정렬이 복잡한 공정이라는 것은 이해될 것이다. 유명한 다중 정렬 프로그램 ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)는 본 발명에 따른 단백질 또는 DNA의 다중 정렬을 생성하기 위한 바람직한 방법이다. ClustalW의 적절한 파라미터는 하기일 수 있다: DNA 정렬에서: 갭 오픈 패널티(Gap Open Penalty) = 15.0, 갭 확장 패널티(Gap Extension Penalty) = 6.66, 및 매트릭스(Matrix) = 동일. 단백질 정렬에서: 갭 오픈 패널티 = 10.0, 갭 확장 패널티 = 0.2, 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬에서: ENDGAP = -1, 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적의 서열 정렬을 위하여 이들 및 다른 파라미터를 변화시킬 필요가 있을 수 있다는 것을 인식할 것이다.
바람직하게는, 두 개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율 계산은 (N/T)*100과 같은 정렬로부터 계산될 수 있다, 여기서 N은 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 수이며, T는 갭을 포함하나 돌출부를 제외하고 비교된 위치의 총 수이다. 따라서, 두 개의 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하는 가장 바람직한 방법은 하기를 포함한다 (i) 적절한 파라미터의 집합, 예를 들어, 상기에 제시된 바를 이용한 ClustalW 프로그램을 이용하여 서열을 정렬하는 단계; 및 (ii) N 및 T의 값을 하기 식에 삽입하는 단계:- 서열 동일성 = (N/T)*100.
유사한 서열을 식별하기 위한 대안적 방법은 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 엄격한 조건하에서 DNA 서열 또는 이들의 보체(complements)에 혼성화되는 서열에 의해 암호화될 것이다. 엄격한 조건으로, 뉴클레오티드가 대략 45 ℃의 3X 염화나트륨/구연산 나트륨(SSC)에서 필터-결합 DNA 또는 RNA에 혼성화한 후 대략 20-65 ℃의 0.2X SSC/0.1% SDS에서 적어도 한번 세척한다는 것을 의미한다. 대안적으로, 실질적으로 유사한 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 6에 나타낸 서열과 적어도 1, 그러나 5, 10, 20, 50 또는 100 미만의 아미노산이 다를 수 있다.
유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여, 본원에 기술된 임의의 핵산 서열이 이의 기능적 변이체를 제공하기 위하여 암호화됨으로써 단백질의 서열에 실질적인 영향 없이 변경되거나 변화할 수 있음이 명백하다. 적절한 뉴클레오티드 변이체는 서열 내 동일한 아미노산을 암호화하는 다른 코돈의 치환에 의해 변경된 서열을 갖는 것들이며, 따라서 침묵 변화(silent change)를 생성한다. 다른 적절한 변이체는 상동의 뉴클레오티드 서열을 가지나 서열의 모두, 또는 부분을 포함하는 것들이며, 이는 유사한 생물리학적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산을 암호화하는 다른 코돈의 치환에 의해 보존적 변화(conservative change)를 생성하기 위하여 대신하는 아미노산으로 변경된다. 예를 들어 작은 비-극성, 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 큰 비-극성, 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하성(염기성) 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 음전하성(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 따라서 아미노산이 유사한 생물리학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있다는 것은 이해될 것이며, 숙련된 기술자는 이들 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 알 것이다.
본원에 기재된 모든 특성(수반되는 모든 청구항, 요약 및 그림을 포함), 및/또는 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는, 적어도 이러한 특성 및/또는 단계의 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 임의의 상기 양태와 결합될 수 있다.
본 발명의 더 나은 이해를 위해, 본 발명의 구현예가 수행되는 방법을 보이기 위해, 참조는 예시, 하기 첨부되는 도면의 방법으로 설명될 것이다:
도 1은 1 시간 처리 후 PC12 세포 생존율에 있어서 고리형 T14의 비효과를 보여주는 막대 차트이다. 데이터는 평균 ± SEM, N=6으로 나타낸다;
도 2는 고리형 T14의 존재 또는 부재하에서 AChE의 효소 활성(증가하는 농도의 기질을 절단할 수 있는 능력에 의해 결정)의 비변화를 보여주는 그래프이다. 반면, 갈란타민은 효소 활성의 매우 유의한 경쟁적인 억제를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD, N=4로 나타낸다;
도 3은 세포 생존율에 있어서 고리형 T14(100 nM)와 조합한 경우 H2O2(100 μM) 단독의 비-특이적 독성 효과 및 이의 지속성을 보여주는 막대 차트이다. 데이터는 평균 ± SEM, N=6으로 나타낸다. * vs 대조군; * P<0.05, **P <0.01;
도 4는 (A) β-아밀로이드(10 μM), (B) T14(10 μM) 및 (C) T30(10 μM) 단독, 및 시간 0에서 고리형 T14(100 nM)와 조합하여 1 시간 처리 후의 효과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM, N=12로 나타낸다. * vs 대조군; * P<0.05, *** P <0.001;
도 5는 T30(10 μM) 단독, T14(10 μM) 단독 또는 고리형 T14(100 nM)와 조합하여 PC12 세포 처리 후 AChE 활성을 보여주는 막대 차트이다. 데이터는 평균 ± SEM, N=6으로 나타낸다. * vs 대조군; *** P <0.001; #그룹 내, ### P <0.001;
도 6은 랫트 뇌 막에 나타낸 바와 같이, PC12 세포의 세포막에서 β-아밀로이드, T30 및 T14에 의한 [3H] 이버멕틴 결합의 억제의 경쟁 곡선을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM, N=3으로 나타낸다;
도 7은 랫트 뇌 막에 나타낸 바와 같이, PC12 세포의 세포막에서 고리형 T14 및 갈란타민에 의한 [3H] 이버멕틴 결합의 억제의 경쟁 곡선을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM, N=6으로 나타낸다;
도 8은 세포 생존율에서 β-아밀로이드(10 μM)에 대한 갈란타민(100 nM) 및 고리형 T14(1 nM)의 최소 유효 농도를 나타내는 막대 차트이다. 데이터는 평균 ± SEM, N=6으로 나타낸다. * vs 대조군; * P<0.05;
도 9는 세포 생존율에서 β-아밀로이드(10 μM)에 대한 고리형 T14(1 nM)의 용량 반응 효과를 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM, N=6으로 나타낸다. * vs 대조군; * P<0.05;
도 10은 다양한 처리 2 시간 후 랫트 뇌 절편에서의 Ca2 +의 세포 내 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM, N=4로 나타낸다;
도 11은 펩티드, T30, T15, T14 및 β-아밀로이드(Aβ)의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다;
도 12는 α7-nAChR에 대한 β-아밀로이드와 T30의 결합 부위를 나타내는 도면이다;
도 13은 T30에 의해 유도된 칼슘 유입에서 다양한 농도의 NBP-14(5, 7, 9, 10, 20, 50, 70, 1000, 5000 nM)의 보호 효과를 나타내는 그래프이다. 값은 GraphPad Prism을 사용하여, 억제제 농도의 대수, NBP-14 대 T30의 반응으로 비선형 곡선에 적용하였다;
도 14는 T30에 의해 유도된 AChE 방출에서 다양한 농도의 NBP-14(5, 7, 9, 10, 20, 50, 70, 1000, 5000 nM)의 보호 효과를 나타내는 그래프이다. 값은 GraphPad Prism을 사용하여, 억제제 농도의 대수, NBP-14 대 T30의 반응으로 비선형 곡선에 적용하였다;
도 15는 T30에 의해 유발된 세포 생존율에서 다양한 농도의 NBP-14(5, 7, 9, 10, 20, 50, 70, 1000, 5000 nM)의 보호 효과를 나타내는 그래프이다. 값은 GraphPad Prism을 사용하여, 억제제 농도의 대수, NBP-14 대 T30의 반응으로 비선형 곡선에 적용하였다;
도 16은 다양한 T30 농도 하에서 시상 전기적 자극에 대한 전체 대뇌 피질 반응을 나타내는 그래프이다. (A) 형광 강도의 변화 부분으로서 측정된 신경 집단활성의 동시성(Synchrony). (B) 활성 픽셀의 수로서 측정된 집단 활성의 확산 - 관심 영역 내의 임의의 하나의 픽셀에 의해 방출되는 최대 강도의 20% 이상을 나타내는 픽셀로 정의;
도 17은 도 16에서 보여주는 바와 같이, 다양한 T30 농도 하에서 어셈블리의 확산의 상승 단계(rise phase)의 분리 및 선형 분석을 보여준다. T30의 증가하는 농도는 어셈블리의 전파 속도에 상응하는 직선의 기울기에서 용량-의존적인 감소를 보여준다;
도 18은 T30 및 NBP-14 처리 하에서 시상-피질-유발 신경 어셈블리의 확산된 동역학의 분석을 보여준다, n=3. 상승 단계(왼쪽 패널)의 분석은 전파의 기울기 (속도)를 높이는 T30의 잠재 효과를 보여준다. 기울기는 초기 T30 관류 후 약 45~60분에서만 상당한 증가를 보여준다(노란색 막대, 오렌지색 관류 동안 효과가 명확해진다 - 5 nM NBP-14의 관류). 이러한 급격한 증가 추세는 100 nM NBP-14 관류(빨간색 막대) 동안 둔화하고 최종 300 nM NBP-14 관류(검은 색 막대) 동안 기본 수준으로 다시 역전된다. 안정(Plateau) 단계 분석(오른쪽 패널)은 효과의 유사한 프로파일을 보여준다. 상단 패널은 다양한 약물 처리하에서 어셈블리의 확산의 행동을 평균화하는 휘스커 플롯을 나타낸다: 상승-단계 기울기 분석과 유사한 경향을 볼 수 있고, 비-유의함에도 불구하고, 이러한 흥분성 경향이 300 nM NBP-14 관류(블랙)에서 대조군 수준(파란색)으로 다시 반전되는 경우 충분히 높은 NBP-14 농도가 기록 욕조(100 nM)에 도달할 때까지 T30은 유발된 어셈블리의 확산을 점차 증가시키는 경향이 유지된다.
도 19는 T30 효과를 NBP-14(0.1, 5, 100 및 300 nM)의 증가하는 농도에 대해 테스트한 경우의 세 가지 실험(즉, 왼쪽, 중간 및 오른쪽 컬럼)으로부터의 정성적 결과를 보여준다. 상단 패널은 두 가지 주요 평균-데이터 그래프를 보여준다: 왼쪽 - 형광 시그널의 강도, 및 오른쪽 - 유발된 어셈블리의 확산. 하부 패널은 각 관류 조건에 대한 전체 관심 영역(Y 축) 전체 시간(310 ms 총, X 축)에 놓여있는 한 행의 픽셀의 활성을 맵핑한 '시공간' 맵을 보여준다. 이 강도 그래프에서와 같이, T30 및 NBP-14 동시-관류한 결과로서 형광 강도의 급격한 감소가 분명히 명백하다. 주의: 시공간 맵은 각각의 관류(왼쪽)로 표지되며, 강도(오른쪽) 및 확산(왼쪽) 그래프 모두에 해당하는 이들의 흔적을 색상-코드화하였다;
도 20은 NBP-14의 생체 내 시험에 따른 개략적인 절차를 보여준다. 수술 하루 전에 모든 동물을 테스트하여 임의의 손상을 표시한다. 수술 당일을 연구의 0 일로 간주한다. 1 일차 발 배치 테스트로 비히클 또는 NPB-14를 주입하는 데 가장 좋은 대상을 16 내지 24 중에서 선택하였다. 2 일차에 발 배치 테스트를 실시하였다;
도 21은 발 배치 테스트에서 기준 및 6-OHDA 단독에 대하여 비교한 6-OHDA에 대한 NBP-14의 효과를 보여준다. 6-OHDA ** P <0.01 및 6-OHDA + NBP14 *** P <0.001 대 기준. (N=8);
도 22는 세포에서 T30의 영향으로 인한 사건의 연속을 나타낸다;
도 23은 전장 APP가 NBP-14에 의해 감소되는 것을 보여준다. 데이터는 3 가지 다른 1 시간 처리 후 가용화된 PC12 세포에서의 APP의 발현을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다, n=2; 및
도 24는 그래프에 나타낸 웨스턴 블롯에 의한 면역검출을 나타낸다. 3 가지 의 다른 처리는 상이한 수준의 APP 발현을 보여준다(도 24에 나타낸 값). 각 조건 단백질은 GAPDH의 수준에 의해 보정된다.
도 25는 T30이 Aβ42의 방출, NBP14에 의해 반전된 효과를 유도한다는 것을 보여준다. 그래프는 T30의 존재 및 T30과 NBP-14의 존재시 대조군 조건에서 Aβ42의 방출을 보여준다. 결과는 평균 ± SEM으로 나타낸다(n=4).
실시예
서열번호 4는 본 명세서에서 "고리형(cyclated) T14", "CT14" 또는 "NBP14"로 지칭된다는 것을 주목해야 한다.
물질 및 방법
펩티드의 고리화( Cyclisation )
세 가지 기술을 이용하여 본 명세서에 개시된 선형 펩티드의 고리화, 예를 들어, 측쇄-측쇄, 측쇄-백본, 및 머리-꼬리(C 말단-N 말단) 고리화를 달성하였다. 머리-꼬리 고리화는 광범위하게 조사되고 있으며, Cys-Cys 이황화의 고리화(분자 당 2 개까지)를 포함할 수 있다. 반응물의 세심한 모니터링은 100% 고리화를 보장한다. 두 가지 일반적인 접근법이 합성에 사용된다: (1) 높은 희석 조건하에서의 고전적인 용액-상 선형 펩티드 고리화; 및 (2) 레진-기반 고리화. 두 가지 고유의 프로토콜은 고체상 합성 (1)에서 사용되었다:-
(a) 이미다졸, 3 아시드,4 아민' 또는 알코올과 같은 측쇄 작용기를 통해 고정된 펩티드의 레진-상(on-resin) 고리화가 실시되었다. 펩티드는 C-말단의 에스테르로서 직교로 보호되고, 이후 펩티드는 비누화(saponification), 고리화 및 절단에 의해 일반적 Boc 또는 Fmoc 합성을 통해 조립되었다.
(b) 사용된 다른 프로토콜은 고리화 절단 접근법이며, 이는 고리형 펩티드를 단계별 선형 펩티드 합성 후 고리화에 의해 합성하였다. 이 방법의 장점 중 하나는 측쇄가 고정될 필요가 없다는 것이고, 이는 (a)보다 일반적인 접근법이 되도록 한다. (Christopher J. White and Andrei K. Yudin (2011) Nature Chemistry 3; Valero et al (1999) J Peptide Res. 53, 76-67; Lihu Yang and Greg Morriello(1999) Tetrahedron Letters 40, 8197-8200; Parvesh Wadhwani et al (2006) J. Org. Chem. 71, 55-61).
고리형 펩티드의 결과물 샘플을 MALDI-TOF MS로 분석하였다.
PC12 세포 배양
PC12 세포는 부신 수질 유래의 복제된, 크롬친화세포종(pheochromocytoma) 세포 라인이다(Greene and Tischler, 1976, Proc Natl Acad Sci U S A 73: 2424-2428; Mizrachi et al., 1990, Proc Natl Acad Sci U S A 87: 6161-6165). 상기 세포들은 용이하게 배양하여 실험 조작에 쉽게 이용할 수 있다. 크롬친화세포들은 신경 관(neural crest)으로부터 유래되나, 접근가능한 주변 기관(부신 수질)의 중심에 위치하고 있기 때문에 이들은 뇌에 '창'을 제공하는 것으로 기술되었다(Bornstein et al., 2012, Mol Psychiatry 17: 354-358). 이러한 세포들은 신경 변성의 아직 밝혀지지 않은 일차 과정을 연구하는 데, 비록 신규하긴 하나, 강력한 시험관 내 모델 역할을 하며 이 프로젝트에 있어 유용한 이유는 다음과 같다: 알츠하이머 환자의 부신 수질은 CNS에서 이를 연상시키는 다양한 병리학적 특징, 예를 들어, 수많은 루이소체(Lewy-body) 유사 함유물(inclusion), 신경원섬유 엉킴과 쌍 나선형 필라멘트, 뿐만 아니라 APP(amyloid precursor protein)의 발현을 보여준다(Takeda et al., 1994, Neurosci Lett 168: 57-60). 또한, Appleyard 및 Macdonald(1991, Lancet 338: 1085-1086)는 AD의 부신으로부터 AChE의 가용성, 즉, 방출형만의 선택적 감소를 확인하였고, 이는 아마도 AD 환자에서 증가한 경우 혈장으로의 향상된 분비 때문일 것이다(Atack et al., 1985, J Neurol Sci 70: 1-12; Berson et al., 2008, Brain 131: 109-119).
야생형 PC12 세포는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에 의해 제공되었다. 배양물은 통상적으로 콜라겐(2㎍/cm2)으로 코팅된 100 mm 접시(Corning)에 플레이팅하여 열-불활성화 10% 말 혈청(HS), 5% 우태아(FBS), 10 mM HEPES, 2mM L-글루타민 및 1:400 페니실린/스트렙토마이신 용액이 보충된 MEM(Minimum Essential Medium Eagle)이 있는 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 습윤 대기 5% CO2에서 37 ℃로 유지하고, 배지는 2 일마다 교체하였다. 분할하는 경우, 세포는 배지와 함께 피펫을 사용하여 접시로부터 제거하고, 이들 중 일부로 새로운 배양 접시에 재플레이팅하였다. 세포를 계대 12 및 25 사이에 사용하였다.
세포막 준비
결합 분석을 실시하기 위해 획득한 PC12 막. PC12 세포를 100 mm 플레이트에 컨플루엔스될 때까지 성장시켰다. 성장 배지를 제거하고, 4.5 ㎍/㎕ 아프로티닌 및 0.1 mM PMSF(phenylmethylsulphonylfluoride)를 함유하는 차가운 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)을 첨가하였다. 세포들을 기계적으로 분리한 후 4℃에서 4 분 동안 원심 분리(1040 ×g)하여 펠렛을 생성하였다. 펠렛을 폴리트론으로 균질화하고 4℃에서 20 분 동안 원심분리(13000 ×g)하였다. 펠렛을 새로운 완충액에 재현탁시키고, 37℃에서 10 분간 배양하여 내인성 신경전달물질을 제거하였다. 이어서 샘플들을 재-원심분리하였다. 최종 펠렛을 완충액에 재현탁시키고, 브래드포드 시약(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하여 단백질 농도를 확인하였다. 세포막결과물은 -80℃에 보관하였다.
β-아밀로이드 준비
공급자(Abcam, Cambridge UK)에 의해 설명한 바와 같이 β-아밀로이드(1-42) 원섬유(fibril)를 준비하였다. β-아밀로이드(1-42) 1 mg을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로 -2-프로판올(HFIP) 212 ㎕ 및 NH4OH 10 ㎕에 용해시켰다. 초음파 처리 및 튜브 당 샘플 10 ㎕씩 분배 후, 샘플을 속도 진공 건조기(Thermo Fisher Scientific, Loughborough, UK)에서 건조시키고 -20℃에서 보관하였다. 실험을 위해, 샘플을 DMSO(5 mM) 2 ㎕ 및 염산(0.01 N) 98 ㎕에 희석시켜서 원섬유가 형성되도록 하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
[ 3 H] 이버멕틴 ( Ivermectin ) 결합 분석
PC12 막과의 결합을 위해, 4℃에서 2 시간 동안 0.5 ㎖의 최종 부피로, Tris-HCl 50 mM에 희석한 다양한 농도의 AChE 펩티드 T30, β-아밀로이드 또는 고리형(Cyclic) T14(0.1, 0.5, 0.7, 1, 2, 10 μM)의 부재 또는 존재하에서, 5 nM [3H] 이버멕틴(Ivermectin)(American Radiolabeled Chemicals, USA)이 있는 Tris-HCl 50 mM 완충액(50㎍의 PC12 막 함유)에 희석한 막 0.25 ㎖를 함유한 폴리스티렌 튜브(VWR International Ltd; Leicestershire, UK)에서 각 배양을 실시하였다. 이 후, 샘플을 Brandel GB 유리 섬유 필터(MD, USA)를 통해 여과시켰다; 수확기(Brandel; MD, USA)에 의해 0.5% 폴리에틸에네민에 미리 담가두었다. 튜브를 차가운 50 mM Tris-HCl 완충액으로 3 회 세척하였다. 튜브 내 방사능을 300SL 액체 섬광 계수기(Lablogic Systems Limited, UK)를 사용하여 섬광 분광 분석법으로 계수하였다. 모든 튜브에 대한 비특이적(이버멕틴 30 μM로 처리한 세포) 값을 감산함으로써 특이 결합을 측정하였다.
세포 생존율 분석
사용된 세포 생존율 분석은 독성 스크리닝을 위한 SRB(sulforhodamine B) 비색 분석이었다. 실험 전날에 세포들을 40,000 세포/웰의 농도로 콜라겐-코팅된 96 웰 플레이트 상에 접종하였다. 세포 농도는 Fuchs-Rosenthal 챔버에 의해 결정하였다. 약물들을 L 글루타민을 포함하는 MEM으로 제조하고, 세포들을 다양한 농도의 고리형 T14(0.1 내지 100 μM) 및 T30, T14 및 Aβ(10 μM) 단독으로 처리하거나 또는 고리형 T14(0.1 및 0.7 μM)과 조합하여 처리하였다. 처리 후, 배지를 교환하고 세포를 4℃에서 1 시간 동안 10 % 트리클로로아세트산(TCA) 100 ㎕를 첨가하여 고정시켰다. 이 후, 세포를 H2O로 세척하고 상온에서 30 분 동안 1% 아세트산(HAc)에 녹인 0.057% SRB 용액 100 ㎕으로 염색하였다. 염색 후, 세포를 1% HAc로 세척하여 과량의 SRB를 제거하고 10 mM Tris 베이스(pH 10.5) 200 ㎕로 배양한 후, 5 분간 교반하여 단백질-결합 염료를 가용화시켰다. 흡광도의 측정은 490 nm에서 VMAX 운동 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices)로 실시하였다.
아세틸콜린에스테라제 ( acetylcholinesterase , AChE ) 활성 분석
AChE 활성의 결과로서 티올 기의 존재를 측정하는 Ellman 시약을 이용하여 AChE 활성을 측정하였다. 세포 생존율 분석을 위해서 세포들을 실험 전날 플레이팅하였다. 다양한 농도의 고리형 T14(0.1 내지 100 μM) 및 T30, T14 및 Aβ 10 μM 단독으로 또는 고리형 T14(0.1 및 0.7 μM)과 조합하여 세포에 처리하였다. 처리 후, 각 처리의 상층액(관류물)을 수집하고, 각 조건의 25 ㎕를 새로운 평평한 바닥 96 웰 플레이트에 첨가한 후 Ellman 시약(용액 A: KH2PO4 139mM 및 K2HPO4 79.66mM, pH 7.0; 용액 B(기질): Acetylthiocholine Iodide 11.5mM; 용액 C(시약): 5, 5' Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) 8mM and NaHCO3 15mM) 175 ㎕를 첨가하였다. 33(A):3(B):4(C) 비율로 3 개 용액을 혼합하여 Ellman 시약을 제조하였다. 흡광도 측정은 405 ㎚에서 실험 전체 동안 일정 간격(3, 10, 30 및 60 분)으로 실시되었다.
칼슘 형광측정
세포내 Ca2 +의 증가를 Fluo-4 (Life Technologies Corporation, UK)가 로딩된 세포 내 형광의 변화를 측정함으로써 모니터링하였다. 뇌 절편을 124 mM 염화나트륨, 3.7 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4, 1.3 mM KH2PO4 및 10 mM 글루코오스에서 2 시간 동안 배양하였다; β-아밀로이드, 고리형 T14 또는 β-아밀로이드 + 고리형 T14를 함유한 pH:7.1. 2 시간 후, 절편들을 다음을 함유한 로딩 배지 1.2 ㎖/웰로 상온에서 40 분간 어둠 속에서 배양하였다: Tyrode’s 염 용액 (TSS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.0 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 0.2 mM NaH2PO4, 12.0 NaHCO3, 5.5 글루코오스, pH 7.4), Fluo-4(2 μM), 플루로닉 F127(0.02 %) 및 프로베네시드(2 mM). 프로베네시드는 약제 내성 단백질, 이온 수송체의 차단제이고, 세포로부터의 형광 분자의 방출을 방지한다. 배양 후, 절편을 TSS로 세척하고 TSS 및프로베네시드를 함유한 탈-에스테르화 배지 1200 ㎕/웰을 첨가하였다. 절편을 22 ℃에서 20 분 동안 어둠 속에서 배양하였다. 형광 측정(여기 485 nm, 방출 538 nm)을 Fluostar Optima (BMG, UK) 플레이트 리더로 기록하였다.
약물 및 시약
MEM, 배양 혈청, 항생제, 콜라겐, 술포로다민 B, 이버멕틴 및 완충액 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에 의해 제공되었다. T30, T14 AChE 펩티드 및 고리형 T14는 Genosphere Biotechnologies(France)에 의해 합성되었다. 펩티드의 저장분은 증류수로 희석하였다.
데이터 분석
다른 기술들 각각에서, 상기 통계 분석은 12 개 이상 실험의 백분율 값의 평균으로 실시하였다. 다중 처리군과 동일한 대조군 간의 비교는 일방향 분산 (ANOVA) 및 GraphPAD Instat (GraphPAD software, San Diego, CA)를 사용하는 Tukey's 사후 분석 시험으로 실시하였다. 이러한 테스트는 모든 처리의 평균을 모든 다른 처리의 평균과 비교한다; 즉, 두 평균간 차이가 표준 오차를 허용할 것으로 예상되는 것보다 큰 경우 모든 쌍대 비교의 집합에 동시 적용하고 식별한다. 통계적 유의성은 P 값 < 0.05에서 달성하였다. 그래프는 GraphPAD Prism 6 (GraphPAD software, San Diego, CA)을 사용하여 플롯팅하였다. 결합 실험의 경우, 결과는 분당(CPM) 카운트로서 수득하고, 대조군과 관련된 백분율로 변환하였다. 결과는 GraphPad Prism을 사용하여 하나의 부위 경쟁 결합의 모델에 적용되었다. 칼슘 결과의 경우, EC50 값은 GraphPad Prism을 사용하는 비선형 회귀 곡선을 이용하여 단일 부위 Hill 방정식에 대하여 실험적 데이터 포인트의 대수를 맞춤으로써 계산하였다.
실시예 1 - T14 의 고리화
본 발명자는 T14/T30과의 결합에 대해 경쟁하고 또한 β-아밀로이드를 길항시키기 위하여 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 상에 있는 알로스테릭 부위(allosteric site)를 선택적으로 타겟팅하는 제제(agent)를 합성하였다. 상기 제제는 N- 말단 알라닌 잔기가 C-말단 리신 잔기에 연결되면서, 아미노산 서열 AEFHRWSSYMVHWK [서열번호 4]을 갖는 T14의 고리형이다. Genosphere Biotechnologies(France)은 선형 펩티드 N-말단을 C-말단 락탐으로 변환하여 T14의 고리화를 실시하였다. 하기 실시예들은 고리형 T14 펩티드가 시험관 내에서 T30 펩티드 및 아밀로이드의 구축된 독성 효과를 차단하는 방법을 처음으로 입증한다.
실시예 2 - 단독 적용시 고리형 T14 는 독성이 없다
세포 생존율 검출 방법으로서 술포로다민 B(SRB)를 이용하여, PC12 세포에 실시예 1에서 제조된 고리형 T14를 1 시간 동안 처리하였다. 그 결과, 세포 생존율에 있어 변화가 관찰되지 않았고 이는 100 μM 만큼 높은 농도에서 독성을 나타내않는다는 것을 제시한다(100 nM: 98.76 ± 15.15; 700 nM: 106.94 ± 19.92; 1 μM: 104.82 ± 10.9; 100 μM: 93.58 ± 11.62)(도 1 참고).
실시예 3 - 고리형 T14 는 AChE 효소적 활성에 영향을 주지 않는다
다음으로 본 발명자는 고리형 T14가 AChE(acetylcholinesterase)의 효소적 활성에 영향을 미치는 지 여부를 확인하고자 하였다. AChE 효소적 활성을 아세틸콜린에스테라제 활성 분석을 사용하여 측정하였다. 본 발명자는 고리형 T14(2 μM)의 존재가 아세틸콜린에스테라제의 효소적 활성에 영향을 미치지 않는 반면, 갈란타민 (2 μM)은 강하게 억제한다는 것을 발견하였다(도 2 참조).
실시예 4 - 고리형 T14 는 과산화수소의 비-특이적 독성에 대하여 보호하지 않는다
이후 본 발명자는 고리형 T14가 과산화수소의 비-특이적 세포 독성 효과에 대해 PC12 세포를 보호하는 지의 여부를 확인하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, H2O2가 단독으로 또는 고리형 T14과 함께 조합하여 주어졌을 때, 유의한 차이가 없다.
실시예 5 - 고리형 T14 는 T14 , T30 및 β-아밀로이드 독성으로부터 세포를 보호한다
세포 생존율 검출 방법으로 SRB를 사용하여, PC12 세포에 (4A) β-아밀로이드, (4B) 선형 T14, 또는 (4C) T30을 단독으로 또는 고리형 T14(100 nM)와 조합하여 1 시간 동안 처리하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 단독으로 처리한 세 펩티드들은 세포 생존율의 감소를 유도하였으나(Aβ: 69.875 ± 4.38; T14: 83.02 ± 5.385 and T30: 68.395 ± 3.095), 고리형 T14 세포와 조합한 경우에는 놀랍게도 사멸로부터 보호되었다(Aβ + C14: 94.475 ± 7.4; T14 + C14: 99.4 ± 12.475; T30 + C14: 88.59 ± 8.785).
실시예 6 - 고리형 T14 는 T14 및 T30 에 의해 유도된 AChE 의 방출을 차단한다
엘만(Ellman) 비색 분석법을 이용하여 독성 자극 후 보상성 반응으로 AChE 활성을 평가하였다. 세포에 선형 T14 및 T30(10 μM)을 단독 및 고리형 T14(100 nM)와 함께 조합하여 1 시간 동안 처리하였다(도 5 참조). 모든 펩티드는 고리형 T14와 조합했을 때 일부 차단된 AChE 활성(T30: 129.10 ± 1.18; T14: 123.0 ± 0.62)의 증가를 유도한다(T30 + C14: 110.58 ± 0.80; T14 + C14: 112.30 ± 1.39).
실시예 7 - β-아밀로이드, T30 및 T14 는 [3H] 이버멕틴 결합을 대체한다
α7nAChR(α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체)가 β-아밀로이드에 대한 타겟임을 입증하기 위해, 준비된 T30 및 T14가 본 명세서에서 사용되었다. [3H] 이버멕틴 결합 분석을 PC12 세포막에서 실시하여 리간드 [3H] 이버멕틴이 결합하는 경우 수용체의 알로스테릭 부위의 친화성의 감소를 로그 용량-반응 방식으로 입증하였다(표 1, 도 6 참조).
다양한 농도의 β-아밀로이드, T30 및 T14 가 존재하는 경우 PC12 세포에서 [ 3 H] 이버멕틴 결합의 백분율을 보여주는 데이터, N=3.
% [ 3 H] 이버멕틴
(평균 ± SEM ) 		β-아밀로이드 T30 T14
1 nM 100.00 ± 9.70 109.16 ± 11.9 100 ± 9.91
10 nM 73.61 ± 11.12 116.63 ± 13.25 90.92 ± 2.38
100 nM 41.17 ± 8.90 106.15 ± 8.04 88.92 ± 3.82
1 μM 29.98 ± 12.20 97.41 ± 7.9 85.17 ± 3.03
5 μM 34.49 ± 17.29 80.22 ± 3.81 85.36 ± 3.96
실시예 8 - 고리형 T14 는 갈란타민보다 더 큰 효능으로 [3H] 이버멕틴 결합을 대체한다
낮은 마이크로 몰 농도의 고리형 T14는 유사한 친화성이나, 갈란타민보다 훨씬 더 큰 효능으로 [3H] 이버멕틴을 대체하였다.
다양한 농도의 고리형 T14 및 갈란타민이 존재하는 경우 PC12 세포에서 [ 3 H] 이버멕틴 결합의 백분율을 보여주는 데이터, N=6.
% [ 3 H] 이버멕틴
(평균 ± SEM ) 		고리형 T14 갈란타민
100 nM 98.10 ± 3.28 100.00 ± 11.48
200 nM 80.81 ± 4.37 97.86 ± 1.40
500 nM 79.72 ± 6.76 90.96 ± 1.87
700 nM 62.26 ± 17.63 69.68 ± 9.87
1 μM 29.006 ± 8.23 67.17 ± 6.64
2 μM 13.46 ± 10.40 66.32 ± 4.29
실시예 9 - 고리형 T14 는 갈란타민보다 더 큰 효능으로 β-아밀로이드 독성 으로부터 세포를 보호한다
세포 생존율 검출 방법으로 SRB를 사용하여, PC12 세포에 β-아밀로이드를 단독으로 또는 고리형 T14(1 nM) 또는 갈란타민(100 nM)과 조합하여 1 시간 동안 처리하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 고리형 T14는 갈란타민(98.79 ± 14.21)보다 두 자릿수가 더 낮은 농도에서 Aβ 독성(97.34 ± 9.57)에 reo하여 보호하였다.
실시예 10 - β-아밀로이드에 대하여 100% 보호하는데 필요한 고리형 T14 의 최소 농도
세포 생존율 검출 방법으로 SRB를 사용하여, PC12 세포에 β-아밀로이드를 0.5 nM부터 100 nM까지 증가하는 농도의 고리형 T14와 조합하여 1 시간 동안 처리하였다(0.5: 88.49 ± 10; 1: 97.34 ± 9.57; 10: 102.28 ± 8.53; 50: 101.79 ± 13.99; 100: 103.68 ± 6.34). 완전한 보호를 위한 임계 용량은 1nM이었다(도 9).
실시예 11 - 고리형 T14 는 랫트 뇌 절편에서의 Ca 2 + 수준을 감소시킨다
형광측정을 이용하여 고리형 T14 1 μM, β-아밀로이드 10 μM 및 둘다 조합하여 2 시간 동안 처리 후 칼슘 수준의 변화를 검출하였다. β-아밀로이드가 세포내 칼슘 수준의 증가를 유도하는 동안 고리형 T14는 세포내 칼슘의 기본 수준을 변화시키지 않으며, 이는 고리형 T14에 의해 기본 수준으로 되돌려진다(도 10 참조).
실시예 12 - T30 은 α7 니코틴성 -수용체의 알로스테릭 부위에 대하여 높은 결합 친화성을 나타낸다
생존율을 위한 테스트를 사용하여, 본 발명자는 T30이 현재 임상적으로 이용되는 약물, 예를 들어, 갈란타민(10 μM)보다 α7 니코틴성-수용체의 알로스테릭 부위에 대하여 약 세 자릿수가 더 높은(5 nM) 결합 친화성을 갖는다는 것을 확인하였다.
일반적인 논의
고리형 T14는 T30 및 아밀로이드 베타 펩티드의 작용을 상쇄시키는 α7 니코틴성-수용체의 신규한 α7 니코틴성-수용체 불활성 알로스테릭 조절자이며 고리형 T14는 신규한 α7 니코틴성-수용체 길항제이다. 비-특이적 제제인 과산화수소에 대한 보호의 비효율성은 고리형 T14의 차단 작용이 선택적 및 수용체-매개임을 제시한다. T30 뿐만 아니라 아밀로이드와 결합에 대해 경쟁함으로써 α7 수용체에 있는 알로스테릭 부위를 통해 칼슘의 추가 유입을 방지한다는 것을 나타내는 다양한 테스트에서 고리형 T14는 T30의 독성 효과를 상쇄시킨다. 고리형 펩티드의 향상된 안정성은 이러한 효과적인 대체를 차지할 수 있다.
왜 고리형 T14 -기반 약물은 현재 이용가능한 치료보다 더 효과적일 수 있는 것인가?
본 발명자는 T30이 현재 임상적으로 이용되는 약물, 예를 들어, 갈란타민(10 μM)보다 α7 수용체의 알로스테릭 부위에 대하여 약 세 자릿수가 더 높은(5 nM) 결합 친화성을 갖는다는 것을 확인하였다. 사실, 상기 관찰은 현재 처방되고 있는 이러한 약물이 상대적으로 실망스러운 결과를 나타내는 이유를 제시할 수 있다(표 1 참조; Kramp & Herrling, 2011, Neurodegenerative Dis 8, 44-94): 만약 알츠하이머 환자의 뇌에서 초과된 내인성 T30이 이미 중요한 부위를 점유한 경우, 그것은 저-친화도 경쟁에 의해 대체되지 않을 것이다. 그러나, 본 명세서에서 제시한 바와 같이, 매우 유사하거나 실제로 우수한 결합 친화성을 갖는 제제에 의해 차단될 것이다(도 7 참조). 따라서, 이러한 제제는 매우 효과적인 약물이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있다.
고리형 T14의 또 다른 이점은 별도의 AChE 억제제인 갈란타민과 다르게, 수용체에 결합하는 것 이외의 다른 생물학적 작용을 하지 않는다는 점이다. 본 발명자의 이전 연구에서 알 수 있듯이(Greenfield, 2013, Chem Biol Interact. 203(3):543-6), 만약 T30이 신경퇴행성 질환의 중요한 신호전달 분자가 맞다면, 길항 작용은 가장 근본적이고 특이적 수준에서 이러한 질환과 맞서 싸우는 것일 수 있다. 또한, 어떤 경우에든, 아밀로이드는 그의 정확한 역할와 상관없이, 퇴행성 과정에 연루되는 경우, 이러한 신규한 제제가 아밀로이드를 길항시키는 관찰은 큰 임상적 관심이 될 것이다. 이는 β-아밀로이드의 가용성(예를 들어, 감마 세크레타 제 억제제)을 타겟팅하는 다른 치료제 후보들이 비효율적이나, 이것이 아밀로이드 독성의 효과적인 차단제의 첫번째 사례임을 주목해야한다.
갈란타민 vs 고리형 T14 -기반 약물의 특징 비교
갈란타민(Galanthamine) 관심 약물(Dream Drug) 고리형(Cyclic) T14
AChE 억제(부작용) AChE 활성에 영향을 미치지 않음 √
다양한 수용체에서의 작용이 공지됨 α7 수용체에서 특이적 작용 √
마이크로몰의 친화성 나노몰의 친화성 √
고용량(0.1 μM)에서 β-아밀로이드 차단 저용량(1 μM)에서 β-아밀로이드 차단 √
낮은 투과성 CNS 높은 투과성 CNS가 있어야 함
높은 생체이용률(bioavailability) 주변(periphery )(설사같은 부작용) 낮은 주변 생체이용률(bioavailability)이 있어야 함
후-증상(Post-symptomatic) 사전-증상(Pre-symptomatic)
본 발명자는 고리형 T14의 형태가 그것의 특정 타겟, α7 니코틴성-수용체에 결합할 수 있도록 한다는 것을 현재 결과가 시사한다고 생각한다. 도 12를 참조하면, α7 니코틴성-수용체의 개략도가 도시되어있다. 수용체가 활성화되는 경우, 동종체(homomeric) 수용체는 Na+ 및 Ca2 +와 같은 이온이 통과하는 중앙 구멍의 주위에 각각 대칭적으로 배치된 5개의 동일한 α7 서브유닛들을 함유한다. 각 α7 서브 유닛은 오르토스테릭 결합 부위(즉, 활성 부위) 및 알로스테릭 결합 부위를 함유한다. 수용체의 정상적인 생리적 활성은 각 오르토스테릭 부위를 통해 단일 아세틸콜린 분자가 두 α7 서브유닛의 인터페이스에 결합함으로써 달성된다. 오르토스테릭 부위의 다른 공지된 리간드는 콜린 및 MLA(Methyllycaconitine)를 포함한다(이에 제한되지 않음). 알로스테릭 부위의 리간드는 선형 및 고리형 T14, 고리형 및 선형T30, 갈란타민. 이버멕틴 및 PNU12를 포함한다(이에 제한되지 않음).
이 이론에 구애되지 않지만, 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명자는 β-아밀로이드(Aβ)가 (ⅰ) α7 니코틴성-수용체의 오르토스테릭 및 알로스테릭 결합 부위 모두에 동시 결합할 수 있거나, 또는 (ⅱ) 이러한 부위 중 하나에 비-특이적으로 결합할 수 있다고 믿는다. 본 발명자는 고리형 T14가 알로스테릭 부위에서 길항제로서 작용한다는 발견하였다.
약물 디자인
본 발명자는, 그럼에도 불구하고 여전히 고리형 T14의 3 차원 형태를 모방하고 더욱 용이하게 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있는 보다 작은 화합물을 설계하는 데 고리형 T14의 특정 형태를 사용할 수 있을 것으로 믿는다.
실시예 13 - 고리형 T-14(즉, " NBP14 "로 지칭)의 물리-화학적 특성
배경
수용액 및 유기 용액 내 화합물의 용해도는 위 또는 장관과 같은 신체의 생리적 장벽을 통과할 수 있는 능력에 크게 영향을 미친다. 뇌질환, 예컨대, 치매를 타겟팅하는 약물의 경우, 추가 장벽인 혈액-뇌 장벽을 통과해야 한다. 또한, Log P로 알려진 분배 계수는 물 및 유기 용매에 용해되는 화합물의 능력을 평가하며, 이는 다른 생물학적 장벽을 통과하는 화합물의 능력과 연관이 있다.
상세한 방법
용매 준비
다음과 같이 용매의 포화를 실시하였다. 1-옥탄올을 상온에서 24 시간 동안 물의 존재하에서 교반하였다. MQ 물을 상온에서 24 시간 동안 1-옥탄올의 존재하에서 교반하였다. 이후 용액을 상온에서 밤새 두어 평형화시켰다. 포화된 용매를 주사기와 바늘을 이용하여 수집하고, 추가로 사용할 때까지 상온에서 보관하였다.
진탕-튜브 방법
포화된 물 및 포화된 1-옥탄올을 하기 비율로 유리 튜브에 넣었다: 각 튜브는 동량의 0.25mg 고리화 T14를 함유하였다. 이후 모든 튜브를 상온에서 4 시간 동안 혼합하였다. 교반 후 튜브를 상온에서 두어 평형화시켰다.
표준 곡선
표준 곡선을 위해 사용된 고리형 T14의 농도는 0.5mg.ml-1, 0.25mg.ml-1, 0.13mg.ml-1, 0.066mg.ml-1, 0.033mg.ml-1 및 0.016mg/ml-1이었다. 표준 곡선의 흡광도를 280 ㎚에서 측정하였다.
샘플 분석
각 샘플의 분획물 모두를 바늘이 있는 주사기를 사용하여 개별적으로 수집하였다. 모든 분획물의 흡광도를 280 ㎚에서 측정하고, 모든 분획물의 농도를 표준 곡선을 기반으로 하여 추정하였다. 고리형 T14의 분배 계수는 다음 식을 이용하여 계산하였다:
Log P = Log(옥탄올에서의 농도/ 물에서의 농도)
각 조건에서의 결과는 고리형 T14의 Log P를 얻기 위해 평균화하였다.
결과 및 그 의미
고리형 T14의 평균 Log P는 -0.5899이다. Log P에 대한 음의 값은 화합물이 친수성이 될 가능성이 있음을 의미한다. 그러나, 0에 가까운 Log P는 친유성 환경에서도 용해될 수 있는 능력을 가진 화합물에 해당한다. 따라서, NBP14는 BBB를 통과하도록 제조될 수 있다.
실시예 14 - PC12 세포에서 T30 및 고리형 T-14(즉, NBP -14)의 영향
하기 방법에 기재된 바와 같이, T30 독성에 대한 NBP-14의 보호 효과를 특성화하기 위해, 본 발명자들은 아래의 방법 부분에 설명된 바와 같이 세 가지 시험관 내 시스템((A) 칼슘 유입; (B) AChE 방출; (C) 세포 생존율)에서 농도-효과를 확인하였다.
방법
(A) 칼슘 유입
실험 전날, PC12 세포를 96 웰 플레이트에 완전 성장 배지 200 ㎕로 플레이팅하였다. 실험 당일, Fluo-8 용액(Abcam)을 제조하였다(제공자 프로토콜). 이어서, 성장 배지 100 ㎕를 제거하고 Fluo-8 용액 100 ㎕를 첨가하였다. T30 및 NBP-14의 처리가 첨가되고, 인큐베이터에서 30 분 및 상온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다.
1 시간 후, 플레이트를 형광 플레이트 판독기(Fluostar)에 배치하였다. 형광을 판독하기 전에, 아세틸콜린(ACh) 100 μM을 준비하고 Fluostar 인젝터에 배치하였다. 각 웰의 경우, 판독 결과는 니코틴성 수용체를 통해 칼슘 증가를 유도하는 아세틸콜린의 주입 후에 기준 형광에 의해 형성된다. T30 및 NBP-14의 효과는 이후 평가되었다.
(B) AChE 의 방출
AChE 활성의 변화를 검출하기 위해 사용되는 프로토콜은 상술한 바와 동일하다.
(C) 세포 생존율
전에 사용된 SRB 기술의 개선으로 셀 카운팅 키트 8(CCK-8)을 사용하였다. 고도의 수용성 테트라졸리움 염 WST-8을 이용하여, CCK-8은 전자 전달체(electron carrier)의 존재 하에서 환원에 따라 수용성 포르마잔 염료를 생성한다. WST-8은 세포 내 탈수소효소에 의해 환원되어 조직 배양 배지에서 가용성인 황색 생성물(포르마잔)로 생성된다. 세포 내 탈수소 효소의 활성에 의해 생성된 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포 수와 직접적으로 비례한다. 실험 전날, PC12 세포를 96 웰 플레이트에 완전 성장 배지 200 ㎕로 플레이팅하였다. T30 및 NBP-14 처리를 첨가하고, 인큐베이터에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨다.
이어서, 성장 배지 100 ㎕를 제거하고, CCK-8 (셀 카운팅 키트 8) 용액 10 ㎕을 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이터에서 2 시간 동안 배양 후 흡광도 플레이트 판독기에 배치하였다. 흡광도를 450 nm에서 측정해야 한다.
(A) 칼슘 유입
상술한 바와 같이, T30은 α7 니코틴성 수용체의 양성 알로스테릭 조절제이다. 따라서, 주요 작용제(agonist)인 아세틸콜린을 100%로 대조군 칼슘 유입에 대한 기준으로 사용하였다. T30(5 μM)은 171.05 % ± 6.21%이 될 때까지 이러한 효과를 향상시켰다; N=3. 이어서, 증가하는 농도로 NBP-14(5, 7, 9, 10, 20, 50, 70, 1000, 5000 nM)를 첨가하여 이러한 T30-유도 증가의 길항 작용을 결정하였다. 그 값은 각각 다음과 같다(%): 134.2497 ± 6.85, 120.8612 ± 8.65, 113.9162 ± 8.82, 140.776 ± 12.16, 115.83 ± 7.67, 110.3213 ± 13.21, 125.9596 ± 0.1, 99.85 ± 0.32, 115.1942 ± 9.84, 79.99 ± 14.04. 도 13은 낮은 나노몰 범위에서 보호되는, 농도 의존적으로 NBP-14가 T30 효과를 차단하고 있음을 보여준다.
(B) AChE 방출
상술한 바와 같이, PC12 세포는 T30의 독성 효과에 대하여 '보상' 반응, 즉, 방출된 AChE 활성의 증가로 반응한다: 169.45 % ± 2.11 %; N=3. 본 발명자는 5 μM T30에 대한 NBP-14의 용량-의존적 효과를 결정하였다. 상기 결과는 NBP-14가 높은 나노몰 농도에서의 AChE 보상 효과로부터 보호한다는 것을 나타낸다(도 14). 그 값은 각각 다음과 같다(%): 130.73 ± 1.84, 111.68 ± 2.26, 92.78 ± 0.99, 82.56 ± 2.38, 68.90 ± 0.92, 65.12 ± 1.32, 61.04 ± 0.97, 79.43 ± 1.69 ± 1.24, 83.91 ± 1.24, 89.55 ± 1.25.
(C) 세포 생존율
T30(5 μM)은 농도-효과 방식으로 NBP-14에 의해 점진적으로 차단되는 세포 생존율의 25% 감소(74.309% ± 2.87%; N=3)를 유도한다(도 15). 그 값은 각각 다음과 같다(%): 76.25 ± 7.51, 67.04 ± 4.35, 76.04 ± 4.22, 71.36 ± 1.64, 79.02 ± 10.22, 75.19 ± 3.9, 62.43 ± 3.01, 78.10 ± 2.16, 116.65 ± 3.62, 107.79 ± 5.10. NBP-14는 높은 나노몰 범위에서 T30 유도 세포 사멸로부터 보호한다.
실시예 15 - 랫트 뇌 절편의 시험관 내 대뇌피질 네트워크에서의 T30 및 고리형 T-14(즉, NBP14 )의 효과
배경
T30 펩티드는 T14 또한 절단되는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase, AChE)의 30-아미노산 세그먼트이다. 둘다 동일한 효과를 유도하고, 이는 이들의 활성 서열이 T14에 존재하고, 결국 T30에 존재한다는 것을 제시한다. 이 연구는 이미 고도의 조절성 제제로서 포유 동물의 뇌 절편에서 T14의 생체 활성을 보여준 바 있다. T14의 효과는 다양한 농도에서 여기(excitation) 및 억제를 모두 유도하는 대뇌피질성 네트워크를 조절하는 것으로 보고되어있다: 낮은 농도에서 펩티드는 알파-7 수용체를 통해 향상된 칼슘 유입을 촉발시키나, 고농도에서는 채널이 비활성화(Badin et al., 2013; Bon and Greenfield, 2003)될 뿐만 아니라 신경 가소성을 촉발(Greenfield et al., 2004)하는 과도한 양의 칼슘을 유도한다.
전체 대뇌피질 네트워크에서의 T14/30의 작용을 추가적으로 이해하기 위해, 뇌 절편에서 ms(milliseconds, 생리학적 이벤트에 상응)의 시간 규모 및 μm(micrometres)에서 집합적 신경 집단 활성의 동역학, '신경 어셈블리'를 모니터링하기 위해 VSDI(voltage-sensitive dye imaging)의 상대적으로 최근 기술이 사용되었다. 이러한 기술은 전기 전위의 변화에 대하여 형광 코어를 함유하는 특정 친유성 분자의 민감도를 이용한다(Tominaga et al., 2000). 이들의 친유성 성질 때문에, 이러한 염료 분자는 세포막에서 자신을 포매하고, 밀리 초-해상도 고속 카메라로 촬영되는 특정 막의 전체에 걸친 전위에 대해서 판독하는 이들의 형광을 변경시킨다. 그 결과, 전압-민감 염료를 사용하는 영상은 신경 세포막 전체에 걸친 전위 변화의 직접 온-라인 판독을 비교할 수 없는 시공간 해상도로 제공한다.
이러한 기술을 이용하여, 본 발명자는 (a) 임의의 주어진 영역에서 반응의 강도와 같은, (b) 유발된 신경 어셈블리의 확산을 측정할 수 있는 것으로부터 및 확산의 기울기로 측정된 개시(d)의 시점으로부터의 활성 파면의 전파 속도 (c) 파라미터로부터 신경 집단 활성에 대한 데이터의 광범위한 세트를 획득할 수 있다. 이들 파라미터의 각각은, 지금까지 실시한 두 실험에 대하여 독립적으로 측정되었다: 1) 대뇌피질 집단 활성 및 반응성에 대한 T30의 농도(0.5, 0.75, 1 및 5 μM)를 증가시킴으로써 유도되는 효과 조사, 및 2) 단일, 상대적으로 높은 T30 농도(1 μM)에서의 NBP-14의 길항 효과 평가.
· 사용된 기술: TC(thalamocortical) p14 랫트(Wistar) 뇌 절편의 전압-민감 염료 이미징(Di-4-ANEPPS).
· 자극 패러다임: 40 Hz (thalamo-cortical 재발 자극과 일치) 펄스 자극쌍.
· 관류 패러다임: 두 단계로 실시된 시기 - 모든 약물 관류 (언급: 대조군, 0.1 μM T30 등)를 위해, 새로운 관류를 적용하고, 기록 기간(15 분)이 시작하기 전에 15 분 동안 관류하도록 방치하여, 일단 기록하면 약물이 실제 농도에 도달한 시간을 갖도록 하고 이의 농도-의존적 효과를 유도한다. 각각 관류 시기의 마지막 15 분을 계수한 것만을 기록하여, 의미있는 하나의 관류 시기는 30 분 지속되었다.
상세한 방법
뇌 절편 준비
이소플루란을 이용하여 수컷 위스타 랫트(14-17 일령; 총 15 마리 동물)를 마취하였다: 10 ㎖ 100% w/w 이소플루란을 랫트가 마취될 때까지 약 45초 동안 위치하는 곳인 마취 챔버(유리 상자 20×15×15 cm)의 바닥에 있는 면 침대에 적용하였다. 각 마취된 랫트의 뒷다리를 꼬집어서 마취의 적절한 정도를 확인하였다. 마취가 확인되면, 차가운 인공 뇌척수액(mmol의 '절편화' aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4, 10 글루코오스, 6.7 HEPES 염 및 3.3 HEPES 산; pH: 7.1)에 뇌를 절편으로 절단하는 데 걸리는 시간인 7-8 분 동안 뇌를 침지하기 전에 랫트를 신속하게 참수하였다. 시상부(Para-saggital section)(400 μm 두께)를 Vibratome(Leica VT1000S)을 이용하여 VPN(Thalamus) 및 일차 감각 피질(somato-sensory cortex, barrel field) 모두를 포함하는 뇌 블록으로부터 절단하고 상온에서 aCSF를 함유하는 버블러 포트로 옮겼으며(mmol의 '기록' aCSF: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2PO4 및 10 글루코오스; pH: 7.1), 이는 전기 생리적 기록 및 VSDI 동안 사용된 것과 동일하였다. 절편을 VSD 염색 전에 최소 1 시간 동안 회복시키기 위해 산소화된(95% O2 - 5% CO2) '기록' aCSF에 두었다.
VSD 설치
절편을 어둡고, 95% O2 - 5% CO2로 버블링된 aCSF가 채워진 고습 챔버에 두었다. 이미 기술된 바와 같이(Badin 외., 2013), 염료 용액(aCSF 46%, fetal bovine serum 46%, DMSO 3.5% 및 크레모포르(cremophore) EL 0.4%에 있는 4% 0.2 mM styryl dye pyridinium 4-[2-[6-(dibutylamino)-2-naphthalenyl]-ethenyl]-1-(3-sulfopropyl)hydroxide (Di-4-ANEPPS, Invitrogen, Paisley, UK) (Tominaga et al., 2000)을 절편에 적용하였다. VSD 기록을 시작할 때, 절편을 여과지의 작은 조각에 있는 기록 욕조에 두어서 절편이 신선하도록 유지하여, 슬라이스 위에 배치된 홈-메이드 플라스틱 격자를 사용하여 적절하게 눌렀다. 형광 VSD 때문에, Di-4-ANEPPS로 염색하는 동안 및 후에 모든 절편의 처리는 거의 완벽한 어둠속에서 실시하여 광-독성 및 표백에 대한 유해한 효과를 최소로 유지하였다. VPN(자극 전극을 배치한 경우)은 해마의 선단부로부터 거리 및 내부 캡슐의 측면 거리에 대하여 확인하였다.
적절한 ISI에 대해 Spike 2 V6.0 (CED Ltd, Cambridge, UK)을 이용하여 한 쌍의 펄스 자극(지속 시간 2x100 μs; 40 Hz에서 25 밀리초(milliseconds) 내부-자극 간격-ISI-한쌍-펄스)이 촉발되어 신경지배 배럴에서의 빠른-속도 전파(fast-paced propagating waves)의 활성을 발생한 경우, 500 kΩ의 임피던스를 갖는 자극 전극(1000 Hz로 측정)을 VPN에 배치하였다. Ultima 2004/08 이미징 소프트웨어(Brain Vision)와 디지컬 카메라(Brain Vision MiCAM Ultima R3-V20 Master)가 장착된 MiCAM Ultima ultra-fast 이미징 시스템을 이용하여 1 ms 해상도를 갖는 16-비트 이미지를 획득함으로써 이러한 일시적 '신경 어셈블리'를 기록하였다. Osram halogen xenophot 64634 HLX EFR Display/Optic lamp를 이용하여 빛을 생성하고 MHF-G150LR (Moritex Corporation)을 이용하여 녹색광(530 ± 10 nm)의 방출을 여과시켰다. 이미 공개된 바와 같이(Collins et al., 2007; Devonshire et al., 2010a; Devonshire et al., 2010b; Grandy et al., 2012; Mann et al., 2005), 방출된 형광은 다이크로익 미러 및 >590nm 하이-패스 필터를 통해 통과되었다.
약물 제조 및 적용
각 실험을 시작할 때 T30 및 NBP-14 용액을 새로 제조하였고, 원액 분취량을적절하게 '기록' aCSF에 첨가하고 Minipuls 3 펌프(Gilson Scientific Ltd, Bedfordshire, UK)를 이용하여 분당 1.5 mL의 일정한 속도로 욕조에 적용하였다. 관류 상태를 2 분할하였다: 관류 상태당 총 30 분이 주어진 관류의 다음 15분 동안 기록이 발생하는 경우(평균 30 스냅 샷), 첫 번째 부분은 기록이 발생하지 않는 15 분 관류로 이루어져서, 관류 상태의 두 번째 부분을 시작하기 전에 적절한 농도가 기록 욕조에서 달성될 수 있었다.
데이터 분석 및 통계
VSDI는 전반적으로 유발된 신호의 시간-경과, 확산 및 강도와 같이 추출된 중요한 데이터로부터 4 × 4 mm (100 × 100 픽셀) 2 차원 이미지를 생산하였다. 각 VSDI 실험의 경우, 피크 반응을 캡슐화하는 자극 후 0 및 200 ms 사이의 각 스냅 샷 데이터는, 측정된 자신의 파라미터를 갖고 각 조건에 대하여 평균화하였다 (T30 및 T30 v NBP-14 실험 모두에 대한 조건당 총 30 스냅 샷). 이를 달성하기 위해, 관심 영역(region of interest, ROI)을 전체 활성 영역으로 선택하였고, 이는 관심 영역 내 기록된 최대 활성의 20% 이상으로 큰 활성을 나타내는 것들로서 활성 픽셀이 분리된 역치로 필터링된 후 최대 반응의 정도로 포함하였다. 이후 이러한 데이터를 편집하여 활성화 강도 범위(도 16, 17, 18)의 상세한 정량적 그래프 뿐만 아니라 정성적 '시공간' 맵(도 19)을 생성하여, 기록된 효과를 측정할 뿐만 아니라 획득한 시공간 데이터의 정확한 시각화 표시를 생성한다. 모든 통계학적 테스트(분산 분석- ANOVA)는 모든 데이터를 처리하면서 R Studio를 사용하여 데이터에 적합한 비-선형 혼합 효과 모델을 이용하여 실시하고 Mathematica 8 (Wolfram Research, USA)을 사용하여 분석을 실시하였다. 모든 통계 테스트의 경우 P<0.05를 유의한 것으로 간주하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표현된다.
결과 및 고찰
도 16은 방출된 형광의 강도(A)뿐만 아니라, 활성 픽셀의 확산(B)에 대한 T30의 증가하는 용량의 효과를 나타낸다. 각 픽셀은 40×40 μm 크기를 가지며, 이는 10 미만의 독립적인 뉴런의 활성으로부터 발생하는 그것의 특정 형광을 의미한다. 기록 욕조 내의 T30 농도가 증가함에 따라, 활성 픽셀에 의해 방출되는 형광의 강도는 감소한다. 단일 픽셀 양부터 높은 형광 판독까지 상당히 많은 신경 막 탈분극이 동시에 진행되므로, 이는 촉발된 신경 집단 활성의 탈-동기화를 나타내고, 반대 효과를 여기에서 볼 수 있다(이하 동시성). 추가적으로, 강도 그래프(도 16A)로부터 알 수 있는 바와 같이, 여기에서 40 Hz 쌍-펄스의 자극 패러다임이 사용된다. 이러한 결과는, T30 처리의 결과로 감소된 총 형광뿐만 아니라 제2 펄스(제1 -40 Hz 쌍 펄스 후 75 ms, 25 ms에서 촉발되는)가 본래 펄스의 자릿수와 비교하여 훨씬 감소된 촉진을 나타낸다는 것을 보여준다.
또한, 확산 그래프(도 16B)에서 알 수 있는 바와 같이, 대뇌 피질 어셈블리의 확산은 매우 높은 수준(5 μM)으로 달성될 때까지 T30 처리에 의해 크게 영향을 받지 않고, 이는 전체 대뇌 피질의 네트워크에서 T30이 조절제로서 작용한다는 이론을 확증한다. 또한, 전파, 확산의 속도 및 형광의 강도와 같은 VSDI에 의해 강조된 다른 파라미터들이 종종 반드시 관련된 것은 아닌 대뇌 피질의 동역학의 기본 원리에 의존하는 것을 명심하는 것이 중요하며, 이는 이러한 파라미터 각각을 개별적으로 분석해야 하며 처음에는 이들의 결과들을 서로 독립적으로 해석해야 한다는 것을 의미한다.
도 17은 보다 상세히 조사된 어셈블리 개시 및 전파의 동역학에 따라 증가하는 T30 적용의 효과를 나타낸다. 도 17은 5 μM T30 처리시 최대 3.5 배 감소된 전파 속도를 갖는 도 16에 나타낸 바와 같이, T30이 신경 활성 전파 속도(상승 단계의 기울기로 획득)의 감소를 유발하고, 대뇌 피질 네트워크의 동시성의 감소와 일치한다. 상술한 이전 실험의 결과로부터, 아마도 이온 채널의 불활성화에 대한 임계치에서 있을 충분한 칼슘 유입이 유도될 정도로 5 μM T30 농도가 너무 높고, 이전에 보고된 바와 같이, 특정 제제의 민감도에 따라 흥분성/억제 효과의 혼합물을 초래하는 것으로 결론지었다(Bon and Greenfield, 2003). 따라서, 본 발명자들은 NBP14의 가능한 길항 효과를 탐구하는 후속 실험을 수행하기 위해, 더 낮고, 아직 충분히 강력한, 농도 1 μM T30을 사용하였다. 이러한 T30 농도는 여전히 꽤 높은 데도 불구하고, 펩티드가 뇌 절편을 투과하기 때문에 필연적인 희석 효과가 예상되는 본 연구의 특성 때문에 선택되었다. 한편, NPB14의 경우, PC12 세포에서의 이전 시험관 내 연구에서 T30에 비해 알파-7 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대해 훨씬 높은 친화성을 나타냈으므로, 이들은 0.1, 5, 100, 및 300 nM의 증가하는 농도, 즉, T30의 농도보다 2 내지 4 자릿수가 낮은 농도를 이용하였다.
도 18은 NBP-14의 농도의 증가에 의한 T30 효과의 길항 작용을 나타낸다. 상기 도면은 신경 집단에서의 T30 관류에 의해 유도되는 조절성 효과에 대한 NBP-14의 길항작용적 특성을 보여준다. T30이 절편을 투과하므로 중요한 고려사항은 희석 계수이고, 이는 단백질분해효소, 신경전달 물질의 유입 및 세포 외 매트릭스의 밀도와 같은 뇌 절편 내에서 여전히 잠재적으로 존재하고 활성화되는 모든 생리적 과정을 포함한다; 따라서, 1 μM T30의 농도는 그의 완전한 효과를 유도하는 데 시간이 걸릴 가능성이 매우 높은 것으로 보인다(상기 표시된 데이터에 의해 제시된 바와 같이, 40-60 분). 이 점을 유념하면, 5 nM NBP-14 관류 동안(오렌지색 선/막대) T30의 효과가 명백해지고, 그 후 T30에 의해 유도되는 추세는 다시 기저선(파란색 바/선)으로 반전된다.
또한, NBP-14가 그 자체로는 결코 임의의 조절성 효과를 유발하지 않는 불활성인 것으로 나타났다는 점을 주목해야하며, 이는 본 명세서에서 나타나는 이러한 효과가 T30 및, NBP-14의 증가되는 농도에 의한 길항작용에 대한 이들의 전환이 처음 원인임을 시사한다. 중요한 것은, 300 nM NBP-14 관류 하에서 T14 효과의 대부분이 대조군 수준으로 다시 감소된 반면, T30은 1000 nM의 농도로 관류된다. 이는 T30에 비해 그의 타겟에 대하여 NBP-14의 상당히 높은 친화성을 제시한다.
도 19는 T30(1 μM) 효과를 NBP-14(0.1, 5, 100 및 300 nM)의 증가하는 농도에 대해 테스트한 경우의 세 가지 실험(즉, 왼쪽, 중간 및 오른쪽 컬럼)으로부터의 정성적 결과를 보여준다. 상단 패널은 두 가지 주요 평균-데이터 그래프를 보여준다: 왼쪽 - 형광 시그널의 강도, 및 오른쪽 - 유발된 어셈블리의 확산. 하부 패널은 각 관류 조건에 대한 전체 관심 영역(Y 축) 전체 시간(310 ms 총, X 축)에 놓여있는 한 행의 픽셀의 활성을 맵핑한 '시공간' 맵을 보여준다. 이 강도 그래프에서와 같이, T30 및 NBP-14 동시-관류한 결과로서 형광 강도의 급격한 감소가 분명히 명백하다. 주의: 시공간 맵은 각각의 관류(왼쪽)로 표지되며, 강도(오른쪽) 및 확산(왼쪽) 그래프 모두에 해당하는 이들의 흔적을 색상-코드화하였다.
참고문헌
Badin, A.S., J. Eraifej, and S. Greenfield. 2013. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73C:10-18.
Bon, C.L., and S.A. Greenfield. 2003. Bioactivity of a peptide derived from acetylcholinesterase: electrophysiological characterization in guinea-pig hippocampus. Eur J Neurosci. 17:1991-1995.
Collins, T.F., E.O. Mann, M.R. Hill, E.J. Dommett, and S.A. Greenfield. 2007. Dynamics of neuronal assemblies are modulated by anaesthetics but not analgesics. Eur J Anaesthesiol. 24:609-614.
Devonshire, I.M., E.J. Dommett, T.H. Grandy, A.C. Halliday, and S.A. Greenfield. 2010a. Environmental enrichment differentially modifies specific components of sensory-evoked activity in rat barrel cortex as revealed by simultaneous electrophysiological recordings and optical imaging in vivo. Neuroscience. 170:662-669.
Devonshire, I.M., T.H. Grandy, E.J. Dommett, and S.A. Greenfield. 2010b. Effects of urethane anaesthesia on sensory processing in the rat barrel cortex revealed by combined optical imaging and electrophysiology. Eur J Neurosci. 32:786-797.
Grandy, T.H., S.A. Greenfield, and I.M. Devonshire. 2012. An evaluation of in vivo voltage-sensitive dyes: pharmacological side effects and signal-to-noise ratios after effective removal of brain-pulsation artifacts. Journal of neurophysiology. 108:2931-2945.
Greenfield, S.A., T. Day, E.O. Mann, and I. Bermudez. 2004. A novel peptide modulates alpha7 nicotinic receptor responses: implications for a possible trophic-toxic mechanism within the brain. J Neurochem. 90:325-331.
Mann, E.O., T. Tominaga, M. Ichikawa, and S.A. Greenfield. 2005. Cholinergic modulation of the spatiotemporal pattern of hippocampal activity in vitro. Neuropharmacology. 48:118-133.
Tominaga, T., Y. Tominaga, H. Yamada, G. Matsumoto, and M. Ichikawa. 2000. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of neuroscience methods. 102:11-23.
실시예 16 - 자유롭게 움직이는 렛트에서의 NBP 14의 효과
배경
알츠하이머 병의 동물 모델과 달리, 헤미-파킨슨(hemi-Parkinsonism)의 랫트 모델은 매우 잘 정립되어 있고 쉽게 정량화할 수 있다. 따라서, 독소의 임의의 행동 효과를 관찰하기 위해 T30의 한쪽 선조체 내의 주입을 투여하였다. 후속 실험에서, 잘 알려진 신경독소 6-OHDA(6-hydroxydopamine)에 대하여 NBP14의 잠재적 보호 효과를 관찰하였고, 이는 반대측 DA 신경을 살려주는 동안 주입된 측에서 DA 신경 손실을 초래하였다. NBP-14를 중간 전뇌 다발(medial forebrain bundle, MFB)에 이식된 캐뉼러를 통해 투여하였다. 6-히드록시도파민을 10 ㎎/㎏로 주입하였다.
상세한 방법
동물을 케타민(10%; 0.1 ㎖/kg 체중) 및 자일라진 (2%; 0.01 ㎖/kg)을 이용하여 마취시켰다. 이후 동물에게 0.02% 아스코르브산에 녹인 20 ㎎/㎖ 농도의 6-OHDA 2㎕을 MFB 내로 뇌정위적으로 주입하였다. 병변의 좌표는 cm로 브레그마 및 경질에 따라 설정된다: L-1.7mm; AP-3.6mm; DV-8.0mm. 주입(주입 속도 2 ㎕/5 분) 후, 주사 바늘을 또 다른 1 분간 방치하여서 역류를 방지하고 천천히 후퇴시켰다.
발 배치 테스트(실린더 시험): 이 테스트는 원통형 밀폐 공간의 벽에 몸을 지지하는 랫트의 독립적인 앞다리 사용을 평가한다. 본 테스트는 뒷다리로 서고 밀폐 공간 벽을 향해서 기댐으로써 신규한 환경을 탐험하는 동물의 선천적인 주행을 활용한다. 이 테스트를 수행하기 위해, 랫트를 유리 실린더(21 cm 직경, 34 cm 높이)에 각각 배치시키고 벽 탐사를 3 분 동안 기록하였다. 기록 이전의 실린더에 대한 습관화는 허용되지 않는다. 벽 탐사는 온전한 다리(R) 및 손상된 다리(L) 사이의 비율에 관하여 표시하고 온전한 오른쪽 + 양쪽 앞다리의 값을 손상된 왼쪽 + 양쪽 앞다리(R/L)의 값으로 나눠서 계산하였다. 발 배치 테스트는 기준 데이터를 얻기 위해 Day-1, 선택을 위해 Day 1 및 Day 2에 수행되었다.
선택 기준(Day 1): 발 배치 테스트에 따르면, 발 간의 통계적으로 유의한 차이를 갖는 모든 동물은 본 연구에 포함된다(온전한 다리(R) 및 손상된 다리(L) 사이의 비율은 온전한 오른쪽 + 양쪽 앞다리의 값을 손상된 왼쪽 + 양쪽 앞다리의 값으로 나눠서 표시한다).
모든 테스트의 결과는 평균 그룹 값 ±SEM으로 표시될 것이다. 일방향 ANOVA에 의한 분석 후 Tukey 테스트를 적용하여 처리 효과의 유의성을 결정할 것이다. 본 연구가 준수하는 규칙 및 규정은 실험실 동물의 관리 및 사용의 윤리적인 행동에 대한 위원회에 제출한 신청서의 승인에 따라 실시하였다.
도 20은 NBP-14의 생체 내 테스트 동안 다음 절차를 요약한 것이다
결과
효과 NBP14
발 배치 R/L 비율의 분석은 운동 기능의 일방적인 부상을 반영한다. Day 2, 즉, 6-OHDA 주입 후 2 일 및 NBP-14의 주입 후 1 일차에, 6-OHDA 비히클 및 처리 간의 발 배치의 R/L 비율에 유의한 차이가 있었다: 7.54±1.63 vs. 3.62±0.55, 각각(p<0.05). 발 배치 테스트에 나타낸 것처럼 NBP-14 처리는 일회 투여 후 손상된 앞다리의 이동성이 향상되었다(도 21).
실시예 17 - APP 및 아밀로이드에 대한 T30 및 NBP14 의 효과
배경
과량의 칼슘이 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 비정상적인 절단을 촉발할 수 있고 이에 따라 아밀로이드 베타(Aβ)가 방출된다는 것은 이미 정립되었다(Hartigan & Johnson,1999; Cai et al.,2012). 본 발명자가 T30이 PC12 세포 내에서 약 70%의 칼슘 유입을 증가시키는 것을 확인하였으므로, 이러한 칼슘 증가가 아밀로이드 생성 및 전장 APP 분자에 필연적 감소를 촉발할 가능성이 있다.
상세한 방법론: APP의 검출
가용화 단백질에 대한 프로토콜
APP를 검출하는 데 충분한 단백질을 확보하기 위하여 PC12 세포를 일주일 동안 페트리 접시에서 성장 배지와 함께 플레이팅하고 단백질을 가용화하기 전에 T30 및 NBP-14와 1 시간 동안 처리하였다. 세포가 90% 컨플루엔스될 때까지 배양시킨 후, 성장 배지를 제거하고 세포를 HBSS 2 ㎖에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 15 ㎖ 튜브로 옮기고 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이후 상등액을 제거하고, 단백질분해효소 억제제를 넣은(1 ㎕:1 ㎖ PMSF 및 3 ㎕:1 ㎖ 아프로티닌) 용해 완충액 (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA; pH 8)에 펠렛을 재현탁하고, 10 초 동안 폴리트론을 사용하여 파쇄하였다. 이어서, 파쇄된 펠렛을 1.5 ㎖의 에펜도르프에 넣고 4℃에서 2 시간 동안 회전 또는 진탕하였다. 2 시간 후, 에펜도르프를 20 분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하고 상등액을 유지하였다. 브래드포드 시약을 이용하여 각각의 에펜도르프에 함유된 단백질을 정량화하였다.
전기 영동을 위한 프로토콜
APP 검출을 위하여, 25 ㎍의 단백질 분취량을 사용하였다. 프로토콜을 시작하기 전에 다음과 같이 시약들을 제조하였다:
하부 겔(10%) (20 분 중합)
10 ㎖(2 겔):3.6 ㎖ H2O MQ, 2.42 ㎖ 아크릴아마이드 및 1.3 ㎖ 비스-아크릴아마이드, 2.5 ㎖ Tris-HCl 1.5 M pH 8.8, 0.11 ㎖ SDS 10%, 0.06 ㎖ 과황산암모늄 10%, 6.67 ㎕ TEMED (최근 성분).
상부 겔(5%) (20 분 중합)
5 ㎖ (2 gels): 3.67 ㎖ H2O MQ, 0.48 ㎖ 아크릴아마이드 및 0.26 ㎖ 비스-아크릴아마이드, 0.625 ㎖ Tris-hCl 1 M pH 6.8, 0.05 ㎖ SDS 10%, 25 ㎕ 과황산암모늄 10%, 5 ㎕ TEMED.
Tris -HCl 1.5 M pH 8.8
100 ㎖: 18.16 gr Tris Base, qsp 100 ㎖ H2O MQ, pH 8.8.
Tris -HCl 1 M pH 6.8
100 ㎖: 12.1 gr Tris Base, qsp 100 ㎖ H2O MQ, pH 6.8.
샘플 완충액(4X)
8 ㎖: 3.2 ㎖ SDS 10%, 1.6 ㎖ Glicerol, 2 ㎖ Tris-HCl 1 M pH 6.8, 0.8 ㎖ B-머캅토에탄올, 0.4 ㎖ 프로모페놀 블루 0.1 % 또는 레드.(실험용으로 1X 이용)
러닝 완충액(10X)
1 L: 30.3 g Tris base, 144 gr 글리신, 10 gr SDS, qsp 1 L H2O MQ.(실험용으로 1X 이용)
전기 영동하는 단계는 다음과 같다:
a) 하부 및 상부 아크릴아마이드 젤을 제조한다. APP 젤을 위한 %는 10% 하부 겔 및 5% 스태킹 겔이다.
b) 25 ㎍ 농도(브래드포드 어세이로 확인)의 샘플 24 ㎕(β-머캅토에탄올 + 단백질 + lisis를 함유하는 6 ㎕ SB 4X)를 준비한 후 5 분 동안 100℃에서 가열하여 변성시킨다.
c) 상기 겔의 웰에 단백질 마커 및 샘플을 넣는다(20 ~ 30 ㎕).
d) 이동을 진행한다: 35 mA(약 1 시간).
웨스턴 블롯을 위한 프로토콜
프로토콜을 시작하기 전에 다음과 같이 시약들을 제조한다:
트랜스퍼 완충액(1X)
1 L: 3.03 g Tris base, 14.4 gr 글리신, 200 ㎖ 메탄올, qsp 1 L H2O MQ.
TBS 완충액(4X)
1 L: 24.25 gr Tris base, 60 gr NaCl, qsp 1 L H2O MQ, pH 7.5.
TBS- 트윈 완충액
1 L: 250 ㎖ TBS 4X, 0.5 ㎖ 트윈 20, qsp 1 L H2O MQ.
전기이동 및 단백질의 면역검출과 같은 2 단계가 하기에 있다:
1) 전기이동( Electrotransfer )
a) PVDF 막을 활성화시킨다: MeOH에 1 분 및 MQ H2O에 2 분.
b) 10 분 동안 트랜스퍼 완충액에 PVDF 막, 페이퍼 및 스폰지를 넣어둔다.
c) 샌드위치를 준비하여 겔에서 PVDF 막으로 단백질의 전송을 진행한다: 2 시간 동안 0.2 A.
2) 단백질의 면역검출
a) 밀크 5%(TBS-T에 용해)로 막의 비특이적 부위를 블록킹한다.
b) 1차 항체(TBST/밀크 5%에 용해)로 4℃에서 밤새 인큐베이션한다: 1:500(10 ㎖에 20 ㎕)으로 희석한 항-아밀로이드 전구 단백질(ab2072, 래빗)
c) TBS-T(5 분×2)로 막을 세척한다.
d) TBS-T에 용해한 2차 항체(TBST/밀크 5%에 용해)로 상온에서 45 분 동안 인큐베이션한다: 1:5000(10 ㎖에 20 ㎕)으로 희석한 항-래빗-HRP(고트)
e) TBS-T(5 분×2 + 10 분×1)로 막을 세척한다.
f) Chemibox 옵션(백색광)으로 사진을 촬영하여 마커 밴드의 위치를 확인한다.
g) 항체 검출을 위한 ECL 시약(HRP)(각 구성 요소 1 ㎖)을 첨가하고 Chemibox 옵션(광 없음)으로 여러 사진을 촬영한다.
상세한 방법론: 세포 배양 배지에서 Aβ42의 검출
처리 1 시간 후, 배양 배지를 수집하고 희석제로서 배양 배지를 사용하여 1:100으로 희석하였다. 각각 희석된 샘플의 4 회 반복을 AnaSpec(Fremont, CA, USA)으로부터의 ELISA 검출 키트에 의해 제공된 플레이트에 넣었다. 이후 제조사의 프로토콜에 따라 검출을 실시하였다. 간단히, 샘플을 검출 항체 50 ㎕의 존재하에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 플레이트를 세척 용액으로 일곱 번 세척하고, 샘플을 15 분 동안 키트에서 제공된 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)과 함께 인큐베이션하였다. 샘플 노출 후 반응을 정지 용액으로 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 22는 세포에서 T30의 영향으로 인해 발생한 사건의 연속을 나타내는 도면이다: (1) T30이 수용체의 알로스테릭 부위에 결합하여 세포 내로의 Ca2 + 유입에 대한 채널의 개방이 강화된다(Greenfield et al. 2004). (2) 칼슘 도입은 탈분극 및 전압-의존성(L-VOCC) 채널의 개방을 유도하여 세포 내로 보다 더욱 Ca2 +이 유입되도록 한다(Dickinson et al., 2007). (3) 이러한 증가된 세포 내 칼슘은 T30을 포함하는 AChE G4 방출의 증가를 유도한다(Greenfield, 2013). (4) 또한, T30을 위한 보다 많은 타겟을 제공함으로써 많은 Ca2 +가 세포로 들어갈 수 있도록 하는 α7 니코틴성 수용체의 상향 조절을 칼슘이 유도한다(Bond et al.,2009). (5) 칼슘은 (a) Tau를 증가시키고,(b) γ-세크레타제/β-세크레타제를 활성화시키는 효소(즉, GSK-3)를 활성화하고, 이는 세포 외 독성 아밀로이드의 절단을 촉발하며 (c) T30과 함께 독성 양의 Ca2 +를 세포 내로 더욱 추가적으로 촉진한다.(Hartigan & Johnson (1999), Cai et al.(2012), Garcia-Rates et al (2013)).
따라서, 면역검출을 사용하여, 본 발명자는 T30(5 μM) 및 NBP14(0.5 μM)의 투여 후 (ⅰ) APP 수준 및 (ii) 아밀로이드의 방출을 확인하였다.
결과
(i)도 23에 나타낸 바와 같이, T30은 PC12 세포막에 있는 전장 APP의 수준, NBP14에 의해 반전되는 효과를 감소시킨다. 값: 대조군(100 % ± 10.98); T30 5 μM (67.82% ± 6.23%) 및 T30 + NBP-14 0.5 μM (126% ± 1.12%).
도 24는 그래프로 나타낸 웨스턴 블롯에 의한 면역검출을 보여준다. 3 가지 다른 처리는 APP의 발현의 상이한 수준을 보여준다(도 24에 표시한 값). 각 조건 단백질은 GAPDH 수준으로 보정된다.
APP의 생성은 T30 펩티드에 의해 감소되고, 이의 효과는 NBP-14에 의해 반전된다. 이는 APP가 절단되어 아밀로이드-β 1-42 펩티드(Aβ42)를 방출할 수 있음을 시사한다.
(ⅱ) Aβ42의 방출을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트를 사용하여 용액 내 존재하는 Aβ42를 측정하였다. 이 테스트는 T30이 대조군에 비해 약 175퍼센트까지 Aβ42의 방출을 증가시키고 NBP-14는 대조군에에 가까운 값으로 Aβ42를 방출시키는 것을 보여준다(도 25 참조).
SEQUENCE LISTING <110> Neuro-Bio Ltd <120> Neurodegenerative Disorders <130> AXH/70166PCT1 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 614 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Pro Pro Gln Cys Leu Leu His Thr Pro Ser Leu Ala Ser Pro 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Gly Gly Gly Val Gly Ala Glu 20 25 30 Gly Arg Glu Asp Ala Glu Leu Leu Val Thr Val Arg Gly Gly Arg Leu 35 40 45 Arg Gly Ile Arg Leu Lys Thr Pro Gly Gly Pro Val Ser Ala Phe Leu 50 55 60 Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Met Gly Pro Arg Arg Phe Leu Pro 65 70 75 80 Pro Glu Pro Lys Gln Pro Trp Ser Gly Val Val Asp Ala Thr Thr Phe 85 90 95 Gln Ser Val Cys Tyr Gln Tyr Val Asp Thr Leu Tyr Pro Gly Phe Glu 100 105 110 Gly Thr Glu Met Trp Asn Pro Asn Arg Glu Leu Ser Glu Asp Cys Leu 115 120 125 Tyr Leu Asn Val Trp Thr Pro Tyr Pro Arg Pro Thr Ser Pro Thr Pro 130 135 140 Val Leu Val Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Gly Ala Ser Ser 145 150 155 160 Leu Asp Val Tyr Asp Gly Arg Phe Leu Val Gln Ala Glu Arg Thr Val 165 170 175 Leu Val Ser Met Asn Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Ala Leu 180 185 190 Pro Gly Ser Arg Glu Ala Pro Gly Asn Val Gly Leu Leu Asp Gln Arg 195 200 205 Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln Glu Asn Val Ala Ala Phe Gly Gly Asp 210 215 220 Pro Thr Ser Val Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val 225 230 235 240 Gly Met His Leu Leu Ser Pro Pro Ser Arg Gly Leu Phe His Arg Ala 245 250 255 Val Leu Gln Ser Gly Ala Pro Asn Gly Pro Trp Ala Thr Val Gly Met 260 265 270 Gly Glu Ala Arg Arg Arg Ala Thr Gln Leu Ala His Leu Val Gly Cys 275 280 285 Pro Pro Gly Gly Thr Gly Gly Asn Asp Thr Glu Leu Val Ala Cys Leu 290 295 300 Arg Thr Arg Pro Ala Gln Val Leu Val Asn His Glu Trp His Val Leu 305 310 315 320 Pro Gln Glu Ser Val Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val Val Asp Gly 325 330 335 Asp Phe Leu Ser Asp Thr Pro Glu Ala Leu Ile Asn Ala Gly Asp Phe 340 345 350 His Gly Leu Gln Val Leu Val Gly Val Val Lys Asp Glu Gly Ser Tyr 355 360 365 Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp Asn Glu Ser Leu 370 375 380 Ile Ser Arg Ala Glu Phe Leu Ala Gly Val Arg Val Gly Val Pro Gln 385 390 395 400 Val Ser Asp Leu Ala Ala Glu Ala Val Val Leu His Tyr Thr Asp Trp 405 410 415 Leu His Pro Glu Asp Pro Ala Arg Leu Arg Glu Ala Leu Ser Asp Val 420 425 430 Val Gly Asp His Asn Val Val Cys Pro Val Ala Gln Leu Ala Gly Arg 435 440 445 Leu Ala Ala Gln Gly Ala Arg Val Tyr Ala Tyr Val Phe Glu His Arg 450 455 460 Ala Ser Thr Leu Ser Trp Pro Leu Trp Met Gly Val Pro His Gly Tyr 465 470 475 480 Glu Ile Glu Phe Ile Phe Gly Ile Pro Leu Asp Pro Ser Arg Asn Tyr 485 490 495 Thr Ala Glu Glu Lys Ile Phe Ala Gln Arg Leu Met Arg Tyr Trp Ala 500 505 510 Asn Phe Ala Arg Thr Gly Asp Pro Asn Glu Pro Arg Asp Pro Lys Ala 515 520 525 Pro Gln Trp Pro Pro Tyr Thr Ala Gly Ala Gln Gln Tyr Val Ser Leu 530 535 540 Asp Leu Arg Pro Leu Glu Val Arg Arg Gly Leu Arg Ala Gln Ala Cys 545 550 555 560 Ala Phe Trp Asn Arg Phe Leu Pro Lys Leu Leu Ser Ala Thr Asp Thr 565 570 575 Leu Asp Glu Ala Glu Arg Gln Trp Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser 580 585 590 Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln 595 600 605 Asp Arg Cys Ser Asp Leu 610 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn 1 5 10 15 Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu 20 25 30 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 'X' can be a basic amino acid residue, preferably histidine (H) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> "X" can be a basic amino acid residue, preferably arginine (R) <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> "X" can be an aromatic amino acid residue, preferably tryptophan (W) <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> "X" can be an amino acid residue having an aliphatic hydroxyl side chain, preferably serine (S) <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> "X" can be tryptophan (W) or methionine (M) <400> 6 Ala Glu Phe Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Xaa Val His 1 5 10

Claims (31)

  1. 치료 또는 진단에 사용하기 위한 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue).
  2. 신경퇴행성 장애(neurodegenerative disorder)의 치료, 개선 또는 예방에 사용하기 위한 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue).
  3. 제2항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease); 파킨슨 병(Parkinson's disease); 헌팅톤병(Huntington's disease); 운동 뉴런 질환(Motor Neurone disease); 척수 소 뇌성(Spinocerebellar) 1 형, 2 형 및 3 형; 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS); 및 전측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 바람직하게는 알츠하이머 병인 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  4. 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)의 C-말단, 또는 이의 절단물(truncation)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 α7 니코틴성-수용체의 선택적 알로스테릭 조절자(allosteric modulator)인 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 α7 니코틴성-수용체의 알로스테릭 부위(allosteric site)를 통해 칼슘의 추가적인 유입을 방지하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 β-아밀로이드에 대한 결합과 경쟁(outcompete)하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 분리 또는 정제된 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 T-AChE(tailed acetylcholinesterase)의 C 말단, 또는 이의 절단물(truncation)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)의 C 말단, 또는 이의 절단물(truncation)을 형성하는 마지막 300, 200, 100 또는 50 아미노산으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)의 C 말단, 또는 이의 절단물(truncation)을 형성하는 마지막 40 아미노산으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아세틸콜린에스테라제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 8 및 40 아미노산 잔기 사이, 또는 10 및 30 아미노산 사이, 또는 12 및 20 아미노산 잔기 사이에 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 고리형(cyclic) 서열번호 3, 4, 5 또는 6, 또는 이의 기능적 변이체(variant) 또는 단편(fragment)을 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 고리형(cyclic) 서열번호 6, 또는 이의 기능적 변이체(variant) 또는 단편(fragment)을 포함하고, 상기 x1은 염기성 아미노산 잔기, 바람직하게는 히스티딘(histidine, H)이며; 상기 x2은 염기성 아미노산 잔기, 바람직하게는 아르기닌(arginine, R)이고; x3은 방향족(aromatic) 아미노산 잔기, 바람직하게는 트립토판(tryptophan, W); x4은 지방족 히드록실 측쇄(aliphatic hydroxyl side chain)를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린(serine, S)이고; x5은 트립토판(tryptophan, W) 또는 메티오닌(methionine, M)인 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 고리형(cyclic) 서열번호 4, 또는 이의 기능적 변이체(variant) 또는 단편(fragment)을 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  17. 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue)를 포함하는 수용체 알로스테릭 조절자(receptor allosteric modulator).
  18. 수용체 알로스테릭 조절자(receptor allosteric modulator)로서 이용하기 위한 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue).
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체 또는 수용체는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것을 특징으로 하는 수용체 알로스테릭 조절자 또는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  20. 치료 또는 진단에 사용하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue), 또는 제17항의 수용체 알로스테릭 조절자(receptor allosteric modulator).
  21. 신경퇴행성 장애(neurodegenerative disorder)의 치료, 개선 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue), 또는 제17항의 수용체 알로스테릭 조절자(receptor allosteric modulator) 길항제(antagonist).
  22. 제21항에 있어서, 치료되는 상기 신경퇴행성 장애는 '전신경세포(Global neuron)'의 손상 또는 사멸을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease); 파킨슨 병(Parkinson's disease); 헌팅톤병(Huntington's disease); 운동 뉴런 질환(Motor Neurone disease); 척수 소 뇌성(Spinocerebellar) 1 형, 2 형 및 3 형; 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS); 및 전측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 치료되는 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 또는운동 뉴런 질환(Motor Neurone disease)인 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 치료되는 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 고리형(cyclic) 서열번호 4, 또는 이의 기능적 변이체(variant) 또는 단편(fragment)을 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체, 또는 수용체 알로스테릭 조절자.
  27. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue), 또는 제17항의 수용체 알로스테릭 조절자(receptor allosteric modulator)의 치료적 유효량, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  28. 제27항의 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue), 또는 제17항의 수용체 알로스테릭 조절자(receptor allosteric modulator)의 치료적 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체를 조합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 고리형 폴리펩티드, 이의 유도체 또는 유사체는 고리형(cyclic) 서열번호 4, 또는 이의 기능적 변이체(variant) 또는 단편(fragment)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법,
  30. α7 니코틴성-수용체를 조사하는 시험관 내 또는 생체 외 분석 방법에 있어서 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 고리형 폴리펩티드(cyclic polypeptide), 이의 유도체(derivative) 또는 유사체(analogue)의 용도.
  31. 제26항에 있어서, 상기 방법은 α7 니코틴성-수용체의 알로스테릭 부위(allosteric site)를 조사하는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 상기 α7 니코틴성-수용체를 통해 칼슘의 추가적인 유입을 방지하는 것을 특징으로 하는 용도.

KR1020167003432A 2013-07-09 2014-07-04 신경퇴행성 장애 KR102436886B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1312279.1A GB2516045A (en) 2013-07-09 2013-07-09 Neurodegenerative disorders
GB1312279.1 2013-07-09
PCT/GB2014/052041 WO2015004430A1 (en) 2013-07-09 2014-07-04 Neurodegenerative disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160078950A true KR20160078950A (ko) 2016-07-05
KR102436886B1 KR102436886B1 (ko) 2022-08-25

Family

ID=49033534

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167003432A KR102436886B1 (ko) 2013-07-09 2014-07-04 신경퇴행성 장애

Country Status (12)

Country Link
US (3) US10053677B2 (ko)
EP (1) EP3019591B1 (ko)
JP (1) JP6647199B2 (ko)
KR (1) KR102436886B1 (ko)
CN (1) CN105531383B (ko)
AU (2) AU2014289001C1 (ko)
BR (1) BR112016000565B1 (ko)
CA (1) CA2917389C (ko)
ES (1) ES2650543T3 (ko)
GB (1) GB2516045A (ko)
MX (1) MX2016000095A (ko)
WO (1) WO2015004430A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230165640A (ko) 2022-05-27 2023-12-05 가천대학교 산학협력단 혈액 엑소좀 단백질 양 및 아세틸콜린 에스터레이즈 활성도에 기초한 파킨슨 병 진단 방법

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2516045A (en) * 2013-07-09 2015-01-14 Neuro Bio Ltd Neurodegenerative disorders
GB2539161A (en) * 2014-11-26 2016-12-14 Neuro-Bio Ltd Neurodegenerative disorders
GB2538947A (en) * 2014-12-19 2016-12-07 Neuro-Bio Ltd Cancer
GB201613999D0 (en) * 2016-08-16 2016-09-28 Neuro-Bio Ltd Neurodegenerative disorders
GB201705044D0 (en) * 2017-03-29 2017-05-10 Neuro-Bio Ltd Biomarker
GB2587211A (en) * 2019-09-18 2021-03-24 Neuro Bio Ltd Animal model
GB202004803D0 (en) * 2020-04-01 2020-05-13 Neuro Bio Ltd Skin
GB202004804D0 (en) * 2020-04-01 2020-05-13 Neuro Bio Ltd Skin
GB202014080D0 (en) * 2020-09-08 2020-10-21 Neuro Bio Ltd Down's syndrome
AU2021421391A1 (en) 2021-01-24 2023-07-20 Michael David FORREST Inhibitors of atp synthase - cosmetic and therapeutic uses
WO2024052650A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Neuro-Bio Ltd Lateral flow device for diagnosing alzheimer's disease using the t14 peptide

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000073427A2 (en) * 1999-05-31 2000-12-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Acetylcholinesterase-derived peptides and uses thereof
WO2002014351A2 (en) * 2000-08-14 2002-02-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. α7 NICOTINIC RECEPTOR PEPTIDES AS LIGANDS FOR β AMYLOID P EPTIDES

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5777073A (en) * 1994-12-12 1998-07-07 The Salk Institute For Biological Studies Cyclic CRF antagonist peptides
DE69736976T2 (de) * 1996-03-29 2007-10-18 Trustees Of Boston University, Boston Mit Alzheimer Krankheit verknüpften Verfahren zur Diagnose, zur Herstellung von Medikamenten und zum Screenen von Substanzen sowie aus Beta-Amyloid abgeleiteten Peptiden
GB9930825D0 (en) * 1999-12-30 2000-02-16 Synaptica Limited Animal models for neurodegenerative disease
EP2670744B1 (en) * 2011-02-03 2015-05-27 Lupin Limited Pyrrole derivatives used as modulators of alpha7 nachr
GB2516045A (en) * 2013-07-09 2015-01-14 Neuro Bio Ltd Neurodegenerative disorders

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000073427A2 (en) * 1999-05-31 2000-12-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Acetylcholinesterase-derived peptides and uses thereof
WO2002014351A2 (en) * 2000-08-14 2002-02-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. α7 NICOTINIC RECEPTOR PEPTIDES AS LIGANDS FOR β AMYLOID P EPTIDES

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230165640A (ko) 2022-05-27 2023-12-05 가천대학교 산학협력단 혈액 엑소좀 단백질 양 및 아세틸콜린 에스터레이즈 활성도에 기초한 파킨슨 병 진단 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN105531383B (zh) 2020-04-21
GB201312279D0 (en) 2013-08-21
CN105531383A (zh) 2016-04-27
US20190100735A1 (en) 2019-04-04
US20210388331A1 (en) 2021-12-16
GB2516045A (en) 2015-01-14
AU2014289001B2 (en) 2018-08-09
WO2015004430A1 (en) 2015-01-15
WO2015004430A9 (en) 2015-03-12
ES2650543T3 (es) 2018-01-19
US10053677B2 (en) 2018-08-21
BR112016000565A2 (pt) 2019-03-19
JP6647199B2 (ja) 2020-02-14
EP3019591A1 (en) 2016-05-18
US20160369250A1 (en) 2016-12-22
CA2917389C (en) 2023-09-26
AU2014289001A1 (en) 2016-02-25
CA2917389A1 (en) 2015-01-15
AU2018260893A1 (en) 2018-11-29
NZ716647A (en) 2022-03-25
EP3019591B1 (en) 2017-08-30
JP2016525095A (ja) 2016-08-22
AU2018260893B2 (en) 2020-05-07
KR102436886B1 (ko) 2022-08-25
BR112016000565B1 (pt) 2023-11-07
MX2016000095A (es) 2016-08-12
AU2014289001C1 (en) 2019-04-04
US11091747B2 (en) 2021-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102436886B1 (ko) 신경퇴행성 장애
US20090156611A1 (en) Mammalian hedgehog signaling modulators
EP3372613A1 (en) Peptide having neuronal loss prevention and regeneration effects, and composition containing same
JP2010529128A (ja) レット症候群および他の障害の処置
US20170218023A1 (en) Synthetic analogues of neural regeneration peptides
US20170000846A1 (en) Use of a neurofilament peptide for the treatment of glioma
EP3313428A1 (en) New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of mild cognitive impairment
KR102489620B1 (ko) 신경변성 장애
NZ716647B2 (en) Neurodegenerative disorders
KR20170103491A (ko) 멜라토닌을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant