BR112015015500B1 - Método para o rastreamento completo de um conjunto de amostras biológicas contendo dna ou rna através da identificação do código de barras molecular durante o fluxo de trabalho de laboratório e kit para coleta de amostras biológicas de dna ou rna - Google Patents
Método para o rastreamento completo de um conjunto de amostras biológicas contendo dna ou rna através da identificação do código de barras molecular durante o fluxo de trabalho de laboratório e kit para coleta de amostras biológicas de dna ou rna Download PDFInfo
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Abstract
resumo patente de invenção: "método para o rastreamento completo de um conjunto de amostras biológicas contendo dna ou rna através da identificação do código de barras molecular durante o fluxo de trabalho de laboratório e kit para coleta de amostras biológicas de dna ou rna". a presente invenção refere-se a um método para o rastreamento completo de um conjunto de amostras biológicas que contêm dna ou rna, através do uso de identificação de código de barras molecular durante o curso de fluxo de trabalho de laboratório, em que a amostra é colocada em contato com os códigos de barras moleculares e iniciadores universais imediatamente após a sua coleta e a amplificação de regiões alvo ocorre concomitantemente com a inserção de código de barras, em uma ou ambas as extremidades da referida região alvo, na mesma temperatura de recozimento através de uma pcr de uma etapa. finalmente, a invenção também descreve kits para a coleta de amostras biológicas que contêm dna ou rna.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um método para o rastreamento completo de múltiplas amostras durante o fluxo de trabalho de laboratório através da adição de um código de barras molecular em sequências alvo através de reação em cadeia da polimerase de única etapa (PCR). Este método de PCR de uma etapa para rastrear várias amostras biológicas permite uma identificação precoce e fiável de amostras biológicas que requerem apenas uma quantidade muito pequena de amostra.
[002] O desenvolvimento da tecnologia de análise de sequencia- mento no campo de biologia molecular tem demonstrado ser um instrumento fundamental na pesquisa de todos os ramos da pesquisa biológica. Mais especificamente, na área médica, a análise de sequenciamento desempenha um papel importante no diagnóstico e prognóstico de doenças genéticas. Estes diagnósticos foram efetuados muito mais eficazes ao longo do tempo com o desenvolvimento de metodologias de sequenciamento mais recentes e mais rápidas e equipamentos.
[003] O sequenciamento de Sanger automatizado tem sido o método de sequenciamento mais importante na área científica por quase duas décadas (Metzker, M. Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews Genetics (11). 2010). A conclusão da sequência de genoma humano apenas de graus de finalização, entre outras realizações relevantes, foi possível devido ao sequenciamento de Sanger.
[004] Recentemente, novas metodologias de sequenciamento têm sido desenvolvidas. Estas tecnologias chamadas de sequenciamento de próxima geração (NGS) têm a capacidade de produzir grandes quantidades de dados de forma rápida e barata, que consiste, basicamente, das etapas da preparação modelo, sequenciamento e análise de dados (Metzker, M. Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews Genetics (11). 2010).
[005] NGS pode sequenciar até bilhões de bases em um único dia, a um custo baixo (Pop, M. & Salzberg, S. Bioinformatics challenges of new sequencing technology. Trends Genet. 24(3). 2008). Embora alcançar uma taxa de transferência maior seja o objetivo final da tecnologia NGS, este maior rendimento também apresente desafios consideráveis para a tecnologia.
[006] Neste sentido, a enorme quantidade de dados produzidos por metodologias NGS colocam demandas substanciais no desenvolvimento de rotinas mais eficientes em termos de armazenamento de dados, monitoramento e controle de qualidade.
[007] Novas descobertas na área médica referem-se a doenças comuns, como o câncer, a fenilcetonúria, entre outros, com mutações no genoma humano. Portanto, o diagnóstico e prognóstico de tais distúrbios beneficia avanços em metodologias de sequenciamento. Atualmente, processos laboratoriais envolvidos no diagnóstico molecular são muito complexos e têm-se descrito difíceis para padronizar e automatizar (Gomah, M. et al. Modeling Complex Workflow in Molecular Diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics 12(1). 2010). A taxa de transferência de muitas amostras traz um desafio extra; isto é, a troca de amostras quando se analisa um número considerável de experiências. Erros no acompanhamento e no intercâmbio de amostras resultam em acidentes caros em um fluxo de trabalho de laboratório clínico, consequências para os pacientes, laboratórios e operadores.
[008] Testes laboratoriais, em particular neste campo biotecno- lógico, devem, portanto, ser realizados sob um sistema de controle de alta qualidade que é capaz de identificar facilmente e com precisão amostras biológicas ao longo de todo o tempo de vida da amostra biológica no laboratório. No entanto, particularmente quando números consideravelmente elevados de amostras são gerados, o fluxo de trabalho torna-se cada vez mais dispendioso e complexo. Portanto, grandes investimentos são necessários para manter uma estrutura em elevados padrões de qualidade.
[009] O sistema de identificação comum utilizado em laboratórios consiste em rotulagem da amostra contida nos tubos de ensaio. Embora esta rotina seja muito útil, o objeto a ser rastreado é um tubo ou recipiente e não especificamente o analito, o material biológico ou químico específico contido no tubo, por si só. Por isso, esta rotina laboratorial de amostras de rastreamento apenas por rotulagem dos tubos de ensaio não exclui a possibilidade de erros humanos durante a manipulação das amostras ao longo do fluxo de trabalho de laboratório.
[0010] Neste sentido, os códigos de barras moleculares são uma opção que podem ser usados para rastrear analitos durante o fluxo de trabalho de ensaio molecular, uma vez que representam uma entidade com propriedades semelhantes ao analito. Código de barras moleculares são, simplesmente, moléculas únicas usadas para identificar uma determinada amostra em um grupo de amostras. E, neste caso em presente pode ser inserido diretamente no interior do material biológico a ser analisado, de modo a identificar de forma fácil e rapidamente os seus conteúdos.
[0011] US 2010/0227329 A1 descreve processos de marcação de um DNA alvo, através de uma reação de PCR em duas etapas, utilizando duas temperaturas de anelamento diferentes e códigos de barras para os iniciadores e na presença de moléculas de ligação, tal como avidina ou estreptavidina, para ligar moléculas funcionais e moléculas de núcleo.
[0012] O documento WO 2010/115154 refere-se a um método multietapa de códigos de barras no sentido de ácidos nucleicos alvo, em que três iniciadores são empregues: iniciadores de amplificação reversos e diretos ligados a uma marcação de nucleotídeos e um iniciador de código de barras ligado a uma porção específica para a marcação.
[0013] O documento WO 2012/019765 descreve também um método para o rastreamento combinatório de amostras para análise paralela e, em particular, um método para aleatoriamente misturar membros de bibliotecas diferentes, cada um com um identificador único. Também é descrito que a inserção de códigos de barras e os iniciadores específicos ocorre em diferentes temperaturas de anelamento; Assim, fazendo uso de uma reação de PCR de duas etapas.
[0014] Estes documentos mostram estratégias para inserções de código de barras após a extração de material genético; no entanto, os documentos citados não adequadamente resolvem os problemas acima mencionados em relação à eliminação de erros como caracterizados pela rotulagem tradicional de coleções de tubo de ensaio, devido em grande parte ao número de etapas e transferências subsequentes do material de amostra antes de serem rotulados de forma confiável.
[0015] Neste sentido, é fundamental o desenvolvimento de métodos destinados a reduzir o número de etapas na rotulagem do material de amostra ao longo do fluxo de trabalho de laboratório, particularmente quando da preparação e marcação de amostras para análises de sequenciamento de rotina. Idealmente, esses métodos permitiriam rastreamento de amostra completo e concomitantemente reduziriam as chances de erro.
[0016] Por conseguinte, segue-se que a presente invenção descreve um novo processo compreensivo de rastreamento de amostra completa de única etapa, permitindo o rastreamento de amostra biológica a partir do momento da coleta da amostra através do relatório de análise final, em que a etapa de extração do material genético pode ser omitida e, em que ocorre a inserção do código de barras em uma reação em cadeia polimerase de única etapa, tal como definido nas reivindicações anexas.
[0017] Na presente invenção, os códigos de barras e os iniciadores universais estão em contato com a amostra, desde a sua primeira coleta, fornecendo, assim, um rastreamento completo dos mesmos a partir da introdução inicial da coleta da amostra biológica. Além do mais, na reação de PCR de uma etapa detalhada na presente invenção, o anelamento de iniciadores específicos para a amplificação e a hibridação de adaptadores para inserção de códigos de barras ocorre à mesma temperatura; Assim, não há separação física ou de tempo entre a amostra e código de barras ao longo de todo o processo.
[0018] Assim, a presente invenção traz como vantagem sobre a técnica anterior, a habilidade para rastrear amostras biológicas que contêm o material genético a partir do momento da primeira coleta de materiais biológicos até sua análise final e isto é conseguido através de uma reação em cadeia polimerase de única etapa. Em outras palavras, a presente invenção apresenta um meio pelo qual as amostras biológicas são rapidamente e confiavelmente identificadas ao longo de um fluxo de trabalho de laboratório, minimizando as possibilidades de erros ocorrerem, e, consequentemente, melhorando a eficiência do fluxo de trabalho de laboratório e investigação e desenvolvimento global envolvendo amostras biológicas.
[0019] Finalmente, como um benefício adicional, uma quantidade muito pequena de amostra é necessária de acordo com a presente invenção quando comparada com o estado da técnica. Por exemplo, em geral, os métodos da técnica anterior requerem em torno de 3 mL de sangue por meio de punção venosa, enquanto que o método da presente invenção requer quantidades tão baixas quanto 2 μl de sangue. Portanto, é possível obter a amostra biológica através de uma simples coleta de sangue picada no dedo seguido por contato da gota de sangue com um papel de filtro.
[0020] A possibilidade de utilizar uma quantidade muito pequena de amostra é extremamente importante para melhorar a eficiência do fluxo de trabalho de laboratório, em particular no que diz respeito a laboratórios de análises clínicas, como um resultado de uma redução do tempo necessário para a coleta de sangue, os custos das análises a serem realizadas, bem como também aumentar o conforto do paciente durante o processo de coleta.
[0021] A presente invenção refere-se a um método de rastrear toda a amostra biológica. Em particular, o próprio analito é rastreado a partir do momento da sua coleta por meio da inserção de códigos de barras moleculares e amplificação da sequência alvo. O método permite o rastreamento completo e fiável da amostra biológica, eliminando as possibilidades de não identificação das amostras biológicas coletadas.
[0022] Em certas modalidades, a invenção descreve um método de rastreamento de amostra completa desde a sua coleta, em que inserção de códigos de barras moleculares ocorre simultaneamente com a amplificação da sequência alvo em uma PCR de única etapa.
[0023] Em uma determinada modalidade, a amostra é colocada em um tubo compreendendo um primeiro par de oligonucleotídeos primários que consistem em um código de barras molecular que se liga aos iniciadores universais primários. A etapa seguinte compreende a remoção de uma alíquota e colocação dela no tubo de PCR compreendendo um segundo par de oligonucleotídeos primários que consiste em um iniciador primário específico para a região primária universal em que primários específicos são específicos para uma região destino da amostra biológica e regiões primárias universais são complementares a universal primária do primeiro par de oligonucletídeos. Em seguida, a amplificação de regiões alvo ocorre concomitantemente com a inserção de códigos de barras na mesma temperatura de anelamento através de uma PCR de uma etapa, sem a necessidade de etapas de extração ou purificação inicial antes da análise de sequenciamento. No entanto, se se preferido, a extração inicial ou as etapas de purificação podem ser realizadas.
[0024] Essa estratégia pode ser aplicada, mas não se limita, aos métodos de diagnóstico que envolvem sequenciamento de Sanger e de próxima geração (NGS), como por exemplo, mas não limitado a, amplicons específicos ou capturados, transcriptomas, exomas, miRNomease e genomas.
[0025] As figuras seguintes são apenas para fins ilustrativos e não limitam a invenção descrita acima de modo algum.
[0026] Figura 1. Exemplo de uma amostra marcada com código de barras 1 para o sequenciamento de Sanger. Diferenças em relação a oligonucleotídeos usados para NGS são descritas no texto. A) Fluxo de trabalho de amostra de código de barras. A amostra é coletada em um tubo contendo oligonucleotídeos com os códigos de barras e iniciadores universais I (UP I) e iniciadores universais II (UP II). Uma alíquota desta mistura (amostra + código de barras) é adicionada aos reagentes de PCR (mostrados aqui apenas pelos iniciadores específicos (SP F ou SP R) com os iniciadores universais) que permitem amplificar a região alvo e inserir os códigos de barras em uma única reação de PCR. B) Montagem de região alvo. A região alvo é amplificada pelo anelamento dos iniciadores específicos, que contêm os iniciadores universais. O anelamento de iniciadores específicos e de iniciadores universais em conjunto com sequências de código de barras ocorre à mesma temperatura e tempo, de modo diferente do estado da técnica, em que as temperaturas de anelamento são diferentes e o PCR ocorre em duas etapas.
[0027] Figura 2. Visão geral de amostra de código de barras de Sanger: um par de oligonucleotídeos (código de barra - iniciador universal F e R) já está dentro do dispositivo de coleta. Seguindo o fluxo de trabalho de diagnóstico, uma alíquota da amostra que contém o código de barras é utilizada para amplificação. Esta etapa permite a inserção do código de barras em ambas as extremidades da região alvo. Sequenciamento bidirecional com iniciadores universais ou com iniciadores específicos pode detectar variações de região alvo e concomitantemente identificar o respectivo código de barras.
[0028] Figura 3. Amostra de preparação de código de barras para sequenciamento de próxima geração. O método utiliza um oligonucleo- tídeo (aqui exemplificado como adaptador NGS 2 - código de barras - iniciador universal II), que irá ser inserido na região alvo gerada. Tal como é descrito por código de barras Sequenciamento de Sanger, o método utiliza uma reação de PCR de única etapa. Além dos iniciadores F e R específicos, um deve-se utilizar um oligonucleotídeo contendo uma sequência de iniciador universal 1 adaptador NGS, de modo a ter uma região alvo que possa ser sequenciada em um sistema de NGS. Apenas fragmentos alvo corrigidos podem ser sequenciadas, adaptadores "NGS 1" e "NGS 2" precisam estar na posição e estrutura correta. Descrição Detalhada.
[0029] A presente invenção descreve um método para preparar uma pluralidade de sequências alvo de ácidos nucleicos de uma amostra biológica, que primeiramente facilita a análise da amostra biológica, através da utilização de métodos moleculares, principalmente por metodologias de sequenciamento, e, em segundo lugar, identifica rapidamente e fiavelmente cada amostra biológica em um grupo de amostra.
[0030] Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos compreendendo o iniciador específico e iniciador universal, bem como o código de barras e iniciador universal, respectivamente, estão ligados à sequência alvo em uma reação em cadeia polimerase de uma etapa (PCR), em que a temperatura de hibridação é a mesma para ambos os oligonucleotídeos.
[0031] Portanto, as modalidades descritas na presente invenção, bem como as vantagens sobre o estado da técnica devem ser lidas em simultâneo com os exemplos e figuras também divulgados pela presente invenção.
[0032] O termo "iniciadores universais" refere-se a quaisquer sequências conhecidas para anelamento com sequências alvo que não interferem na amplificação do genoma alvo / transcriptoma / exoma / região miRNoma, mesmo entre si.
[0033] Os termos "PCR de uma etapa" significa uma reação em cadeia polimerase em que a temperatura de hibridação dos dois conjuntos de iniciadores (iniciadores universais e de código de barras bem como os iniciadores específicos e iniciadores universais) é a mesma e as reações ocorrem ao mesmo tempo.
[0034] O termo "tubo de coleta" significa o primeiro recipiente onde a amostra biológica é condicionada após a sua coleta.
[0035] O termo "códigos de barras" significa um oligonucleotídeo presente em uma sequência de ácido nucleico de modo a identificá-lo. Essa identificação é feita através de diferentes abordagens laboratoriais.
[0036] Em uma modalidade da invenção, é provido um método que permite o rastreamento completo de um conjunto de amostras biológicas que contêm DNA ou RNA através da identificação de código de barras molecular durante fluxo de trabalho de laboratório que compreende as seguintes etapas: i) contatar códigos de barras moleculares e iniciadores universais com as amostras biológicas contendo DNA ou RNA em um meio de coleta, portanto, formando a mistura A; ii) contatar a mistura A com uma mistura de PCR compreendendo iniciadores específicos e iniciadores universais, formando assim a mistura B; iii) amplificar a região alvo das amostras biológicas contendo DNA ou RNA e inserir os códigos de barras moleculares em uma ou ambas as extremidades da referida região alvo em uma única e concomitante etapa realizando uma PCR de uma etapa multiplex exclusiva na mistura B; iv) analisar o produto obtido na etapa iii) por qualquer tecnologia molecular.
[0037] Em uma modalidade preferida, os códigos de barras moleculares são sintetizados, ou gerados por meio de metodologias de biologia molecular, em conjunto com os iniciadores universais.
[0038] Em uma outra modalidade, os códigos de barras moleculares são de 4 a 30 nucleotídeos de comprimento, de preferência, compostos entre 8 a 12 nucleotídeos e mais preferivelmente 10 nucleotídeos de comprimento.
[0039] Em uma outra modalidade, o volume das referidas amostras biológicas contendo DNA ou RNA é de 0,5 μL para 5 mL, mais preferivelmente de 1 μL a 10 μL e mais preferivelmente 2 μL.
[0040] Em uma outra modalidade, as temperaturas de anelamento para amplificação e para inserção de código de barras em PCR de uma etapa multiplex de etapa iii) são mantidas constantes.
[0041] Em uma modalidade preferida, a temperatura de anelamento está entre 35 °C a 80 °C, mais preferivelmente entre 45 °C e 70 °C, e mais preferivelmente 56 °C.
[0042] Em uma outra modalidade, o número de ciclos da PCR de uma etapa multiplex da etapa iii) está entre 10 e 60 ciclos, mais de preferência, entre 20 e 50 ciclos e, o mais preferivelmente 45 ciclos.
[0043] O método da presente invenção é útil para uma série de diferentes amostras biológicas de humanos ou de quaisquer outros organismos eucariotas ou procariotas selecionados a partir do grupo que consiste em sangue e outros fluidos, parafina ou outras formas de tecidos fixos, amostras criopreservadas, células cultivadas, tecidos, sementes, folhas, exsudados, lavagens e material de cotonetes.
[0044] Em uma modalidade preferida, a amostra contendo DNA ou RNA biológico é o sangue.
[0045] Em uma outra modalidade, o sangue é colocado em contato com anticoagulantes selecionados a partir do grupo que consiste em EDTA, heparina ou anticoagulantes à base de citrato.
[0046] O método da presente invenção também é útil para uma série de diferentes amostras sintéticas que pode ser produzida através estratégias in vivo ou in vitro.
[0047] Em uma outra modalidade, os iniciadores universais de etapas i) e ii) são os iniciadores universais M13 e T7.
[0048] Em uma modalidade preferida, a tecnologia molecular é uma metodologia de sequenciamento.
[0049] Em uma modalidade ainda mais preferida, a metodologia de sequenciamento é de Sanger Sequenciamento de próxima geração.
[0050] Em uma outra modalidade, o meio de coleta é selecionado a partir do grupo consistindo em barras, tubos, placas, recipientes, papéis, compressas e pipetas.
[0051] Em uma outra modalidade, os códigos de barras molecu lares e iniciadores universais já estão presentes nos meios de coleta na etapa (i).
[0052] Em uma outra modalidade, a etapa (i) é realizada imediatamente após a coleta das referidas amostras biológicas contendo DNA ou RNA.
[0053] Em uma outra modalidade, as etapas (i) e (ii) são realizadas simultaneamente.
[0054] Em uma outra modalidade, a etapa (ii) é realizada após a etapa (i) em um tubo de reação ou recipiente.
[0055] A invenção também descreve um método para rastreamento completo de um conjunto de amostras biológicas que contêm DNA ou RNA, através da identificação de código de barras molecular durante o fluxo de trabalho de laboratório, compreendendo as etapas seguintes: i) contatar códigos de barras moleculares e iniciadores universais com as amostras biológicas contendo DNA ou RNA em um meio de coleta, portanto, formando a mistura A; ii) transferir uma alíquota da mistura A para um tube de reação ou recipiente, em que o referido tubo de reação ou recipiente compreende mistura de PCR compreendendo iniciadores específicos e iniciadores universais, formando assim a mistura B; iii) amplificar a região alvo das amostras biológicas contendo DNA ou RNA e inserir os códigos de barras moleculares em uma ou ambas as extremidades da referida região alvo em uma única e concomitante etapa realizando uma PCR de uma etapa multiplex exclusiva na mistura B usando a mesma temperatura de anelamento para amplificação e para inserção de código de barras; iv) analisar o produto obtido na etapa iii) por qualquer tecnologia molecular.
[0056] Além disso, a invenção também descreve um método para o rastreamento completo de um conjunto de amostras biológicas que contêm DNA ou RNA, através da identificação de código de barras molecular durante o fluxo de trabalho de laboratório, compreendendo as etapas seguintes: i) adicionar amostras biológicas contendo DNA ou RNA em um meio de coleta contendo códigos de barras moleculares e iniciadores universais, formando, assim, a mistura A; ii) transferir uma alíquota da mistura A para um tubo de reação ou recipiente em que o referido tubo de reação ou recipiente compreende mistura de PCR compreendendo iniciadores específicos e iniciadores universais, formando assim a mistura B; iii) amplificar a região alvo das amostras biológicas contendo de DNA ou RNA e inserir os códigos de barras moleculares em uma ou ambas as extremidades da referida região alvo em uma única e concomitante etapa realizando uma PCR de uma etapa multiplex exclusiva na mistura B, utilizando a mesma temperatura de anelamento para a amplificação e para a inserção do código de barras; iv) analisar o produto obtido na etapa (iii) por qualquer tecnologia molecular.
[0057] Uma modalidade da invenção proporciona um kit para a coleta de amostras biológicas que contêm DNA ou RNA que compreende um conjunto de tubos de coleta ou recipientes que compreendem, adicionalmente os códigos de barras moleculares, iniciadores universais, iniciadores específicos e mistura de PCR em cada tubo de coleta ou recipiente para utilização em um método como descrito pela presente invenção.
[0058] Em uma outra modalidade, a invenção também fornece um kit adicional para a coleta de amostras biológicas que contêm DNA ou RNA que compreende um primeiro conjunto de tubos de coleta ou recipientes que compreendem códigos de barras moleculares e iniciadores universais em cada tubo de coleta ou recipiente, e um segundo conjunto de tubos de reação ou recipientes compreendendo os iniciadores específicos e mistura de PCR em cada tubo de reação ou recipiente, para utilização em um método tal como descrito pela presente invenção.
[0059] O método da presente invenção é útil para uma série de diferentes amostras biológicas humanas, ou outros organismos eucarió- ticos e procarióticos, ou sequências sintéticas geradas através de estratégias in vivo ou in vitro. Amostras alvo podem ser, mas não estão limitadas a qualquer um dos seguintes: sangue e outros fluidos, parafina ou outras formas de tecidos fixos, amostras criopreservadas, células em cultura, tecidos, sementes, folhas, exsudados, lavagens e material de cotonetes.
[0060] A presente invenção proporciona a vantagem da coleta de sangue através de uma coleta de picada no dedo, seguido pelo contato da gota de sangue com um papel de filtro ou um pequeno volume de anticoagulante, uma vez que o volume de sangue utilizado pela metodologia pode ser muito baixo.
[0061] No caso de amostras de sangue, dependendo da aplicação, pode ser necessário que o tubo de coleta compreenda um anticoa- gulante. Exemplos de anticoagulantes que podem ser utilizados são aqueles selecionados dentre o grupo que consiste em EDTA, heparina ou anticoagulantes à base de citrato.
[0062] Antes da coleta de material, rastreamento de amostra é normalmente feito com a utilização de códigos de barras numéricos e informações individuais em um sistema adequado. Em uma modalidade preferida, a amostra é coletada usando um dispositivo de coleta contendo os códigos de barras moleculares. Em uma modalidade preferida, uma alíquota de amostra (com o oligonucleotídeo compreendendo códigos de barras moleculares + iniciadores universais) é adicionada a reagentes de lise. Em uma outra modalidade, após a lise, uma alíquota desta mistura (com o oligonucleotídeo compreendendo códigos de barras moleculares + iniciadores universais) é adicionada à mistura de PCR (entre os componentes, o oligonucleotídeo compreendendo os iniciadores específicos + iniciadores universais). A reação ocorre com a amplificação da região alvo seguido de inserção de código de barras, sem a necessidade de parar a reação e com a mesma temperatura de anelamento para ambos os oligonucleotídeos.
[0063] Em uma outra modalidade, a região alvo é analisada por procedimentos de sequenciamento de Sanger, que pode ser feito por iniciadores específicos ou universais. Os códigos de barras estão presentes no final de cada uma das regiões alvo. Usando sequencia- mento bidirecional é possível garantir a presença do código de barras em cada uma das reações (direta e inversa).
[0064] Neste sentido, no final de um fluxo de trabalho de laboratório, o técnico será capaz de verificar o código de barras único contra o número da amostra, provando assim que o resultado refere-se à leitura do número individual mencionado no momento da coleta da amostra e identificando.
[0065] Uma vista geral simplificada dos processos inteiros é mostrada na figura 2.
[0066] É também importante notar que a estratégia aqui descrita pode ser aplicada se a extração de um material genético for necessária. A utilização de processos automatizados para efetuar uma extração não restringe de forma alguma a invenção. Finalmente, uma vez que o material genético é coletado, a amostra está pronta para ser marcada, ou identificada com um código de barras. Fluxo de Trabalho de Sequenciamento de Próxima Geração
[0067] Em uma outra modalidade, a preparação da amostra para finalidades de NGS usa uma estratégia muito similar a descrita por sequenciamento de Sanger. No entanto, para algumas aplicações NGS é necessário inserir adaptadores na extremidade de cada uma das regiões alvo, a fim de ter uma preparação adequada do sequenciamento de amostra. Como um exemplo, para utilização no sistema PGM de íon, é necessária a presença de adaptadores definidos como "A" e "P1". Os oligonucleotídeos contendo o adaptador "A" e "P1" foram sintetizados em um formato que os adaptares estão na extremidade 5' do código de barras e os iniciadores universais na extremidade 3', aqui descritos como M13 e T7. Neste exemplo, o oligonucleotídeo que contém a sequência T7Universal Primer_Barcode_A-Adapter é, mas não se restringe a, a sequência que deve estar presente no tubo de coleta. Além disso, por este sistema, é necessário utilizar um oligonucleotídeo sintetizado como iniciador P1_Universal, aqui exemplificado como P1_M13, a fim de ter um fragmento de região alvo de sequenciamento NGS viável. O iniciador P1_M13 foi adicionado apenas na preparação da mistura de PCR, concomitantemente com iniciadores específicos contendo sequências M13 e T7. Para o sequenciamento bidirecional, neste exemplo, deve-se considerar o uso de adaptadores com M13 e T7 trocados em sequências descritas.
[0068] Neste momento, e para este exemplo, pode-se esperar os seguintes fragmentos para o sequenciamento do sistema PGM: P1_M13_SpecificF_TARGET_REGION_SpecificR_T7_BAR CODE_A_Adapter P1_T7_SpecificF_TARGET_REGION_SpecificR_M13_BAR CODE_A_Adapter P1_M13_SpecificR_TARGET_REGION_SpecificF_T7_BAR CODE_A_Adapter P1_T7_SpecificR_TARGET_REGION_SpecificF_M13_BAR CODE_A_Adapter
[0069] Após estas etapas regiões alvo são tratadas como descrito nos protocolos de fluxo de trabalho NGS. Uma vista geral simplificada dos processos inteiros é mostrada na figura 3.
[0070] A tabela 1 mostra exemplos de sequências de oligonucleo- tídeos utilizadas nas metodologias de NGS descritas neste documento. Sequências de iniciadores específicos foram concebidas para hibridar com uma porção do gene HFE humano. Tabela 1
[0071] Uma série de temperaturas, enzimas e tampões foi avaliada a fim de alcançar a amplificação de uma região única de genoma que contém os códigos de barras moleculares. Os exemplos descritos na presente invenção são apenas para fins ilustrativos e não limitam a invenção de qualquer maneira.
[0072] Em uma modalidade preferida, a temperatura de anelamento para a amplificação e inserção de código de barras é entre 35 °C e 80 °C. Em uma modalidade mais preferida, a temperatura de anelamento está entre 45 °C e 70 °C. Em uma modalidade ainda mais preferida, a temperatura de anelamento é 56 °C.
[0073] Em uma modalidade preferida, o número de ciclos da PCR de uma etapa é entre 10 e 60 ciclos. Em uma modalidade mais preferida, o número de ciclos é entre 30 e 50 ciclos. Em uma modalidade ainda mais preferida, o número de ciclos é 45.
[0074] Em uma modalidade preferida para um molde, é utilizada uma mistura pré-preparada da PROMEGA. Cada reação irá conter dois pares de iniciadores. Neste exemplo, um par (iniciador F específico M13 + iniciador R específico T7) irá amplificar a região alvo e o segundo par, no presente exemplo, (Bar-code_M13 + Barcode_T7) irá inserir as sequências de código de barras. Estas duas ações são efetuadas com a mesma temperatura de anelamento e em uma etapa. A Figura 2 exemplifica esta modalidade.
[0075] Em uma modalidade preferida adicional, uma estratégia seme lhante foi utilizada da modalidade acima, no entanto utilizou-se reagentes HotStarTaq (Qiagen). Condições análogas foram usadas para preparar modelos para NGS; no entanto, esta metodologia de sequenciamento usa oligonucleotídeos e adaptadores como descrito acima e na Figura 3.
[0076] Nos exemplos seguintes dois sistemas de reagentes distintos são utilizados para amplificação: (1) enzima HotStarTaq (QIAGEN 203.205 e os outros componentes do kit; (2) PROMEGA PCR Master Mix (catálogo M7501) Os parâmetros para cada aplicação encontram-se descritos na. respectivas seções.
[0077] Os seguintes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não limitam a invenção descrita acima de modo algum.
[0078] Uma amostra consistindo em 2 μl de sangue foi transferida para um tubo de amostra compreendendo anticoagulante (1 μl) e códigos de barras (0,2 μl na concentração de 100 μM). Em seguida, 20 μl de reagente de lise da amostra Kit TaqMan para SNP foram adicionados ao tubo de coleta, seguido pela mistura dos componentes em um vórtex à temperatura ambiente durante 5 minutos. Finalmente, 20 μl de reagente de estabilização de DNA da amostra Kit TaqMan para SNP também foram adicionados ao tubo de ensaio.
[0079] Em seguida, uma alíquota de 10 μl da solução resultante foi removida e usada na etapa de amplificação da região alvo no gene HFE.
[0080] Os iniciadores específicos usados na amplificação de uma região do gene HFE, no cromossoma 6, para detectar a alteração c.845G>A (C282Y). foram: F 5'CTGGATAACCTTGGCTGTACC3' e R 5'GGCTCTCATCAGTCACATACC3'. Estes iniciadores específicos foram concebidos de modo que na extremidade 5' a sequência de M13 universal (5'TGTAAAACGACGGCCAGT3') ou T7 (5'TAATACGACTCACTATAGGG3') foi inserida.
[0081] Nesta etapa, a diferença entre a preparação para métodos de Sanger ou NGS permanece no uso de oligonucleotídeos contendo adaptadores ("P1" e "A") para o método de NGS exemplificado.
[0082] A amplificação foi realizada no termociclador Veriti (Applied Biosystems - Life Technologies) e o ciclo foi a seguinte: • 95 °C - 15 min • 95 °C - 30 s / 56 °C - 30 s / 72 °C - 30 s (45 ciclos) • 72 °C - 10 min • 4 °C - não determinado
[0083] Após a amplificação, os produtos de PCR foram purificados utilizando o Kit de GFX (GE Healthcare 28.903.471) e quantificado por espectrofotometria utilizando Nanodrop 2000 (ThermoScientific). É importante notar que, dependendo das abordagens de otimização em particular, esta etapa é opcional.
[0084] Para aplicações de sequenciamento de Sanger foi utilizado um protocolo padrão descrito em kit BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies), disponível no site da empresa e para aplicações NGS foi utilizado protocolo padrão para sequenciamento de regiões alvo de acordo com Ion PGM (Life Technologies ).
[0085] Uma amostra consistindo em 2 μl de sangue foi transferida para um tubo de amostra compreendendo anticoagulante (1 μl) e códigos de barras (0,2 μl na concentração de 100 μM). Em seguida, 20 μl de reagente de lise da amostra Kit TaqMan para SNP foram adicionados ao tubo de coleta, seguido pela mistura dos componentes em um vórtex à temperatura ambiente durante 5 minutos. Finalmente, 20 μl de reagente de estabilização de DNA da amostra Kit TaqMan para SNP também foram adicionados ao tubo de ensaio.
[0086] Em seguida, uma alíquota de 10 μl da solução resultante foi removida e usada na etapa de amplificação da região alvo no gene JAK2.
[0087] Os iniciadores específicos usados na amplificação de uma região do gene JAK2, no cromossoma 9, para detectar a alteração c. c.1849G>T (V617F) foram: F 5'GCAGCAAGTATGATGAGCAAGCTT3' e R 5'GGCATTAGAAAGCCTGTAGTTTTACTTAC3'. Estes iniciadores específicos foram concebidos de modo que na extremidade 5' a sequência de M13 universal (5'TGTAAAACGACGGCCAGT3') ou T7 (5'TAATACGACTCACTATAGGG3') foi inserida.
[0088] Nesta etapa, a diferença entre a preparação para métodos de Sanger ou NGS permanece no uso de oligonucleotídeos contendo adaptadores ("P1" e "A") para o método de NGS exemplificado. A amplificação foi realizada no termociclador Veriti (Applied Biosystems - Life Technoloogys) e o ciclo foi o seguinte: • 95 °C - 15 min • 95 °C - 30 s / 56 °C - 30 s / 72 °C - 30 s (45 ciclos) • 72 °C - 10 min • 4 °C - não determinado
[0089] Após a amplificação, os produtos de PCR foram purificados utilizando o Kit de GFX (GE Healthcare 28.903.471) e quantificados por espectrofotometria utilizando Nanodrop 2000 (ThermoScientific). É importante notar que, dependendo das abordagens de otimização em particular, esta etapa é opcional.
[0090] Para aplicações de sequenciamento de Sanger, foi utilizado protocolo padrão descrito no kit BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies), disponível no site da empresa; e para aplicações de NGS, utilizou-se protocolo padrão para a sequenciamento de regiões alvo de acordo com Ion PGM (Life Technologies).
Claims (20)
1. Método para o rastreamento completo de um conjunto de amostras biológicas contendo DNA ou RNA, através do uso de identificação de código de barras molecular durante o fluxo de trabalho de laboratório, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: i) contatar um primeiro par de oligonucletídeos iniciadores, cada um compreendendo o mesmo código de barras molecular vinculado a um iniciador universal, com cada amostra biológica contendo DNA ou RNA em um meio de coleta, formando assim uma mistura A; em que os referidos iniciadores já estão presentes no meio de coleta no qual a amostra biológica é coletada, ou em que a etapa de contato i) é executada imediatamente após a referida amostra biológica ser coletada no referido meio de coleta; ii) contatar a mistura A, ou uma alíquota da mesma, com uma mistura de PCR, formando assim uma mistura B, em que a mistura de PCR compreende um segundo par de oligonucleotídeos iniciadores, cada um compreendendo um iniciador específico vinculado a uma região iniciadora universal, em que os iniciadores específicos são específicos para a região alvo da referida amostra biológica e da região iniciadora universal é complementar aos iniciadores universais dos oligonucleotídeos da mistura A; iii) amplificar a região alvo das amostras biológicas contendo DNA ou RNA e inserir os códigos de barras moleculares em ambas as extremidades da referida região alvo em uma única e concomitante etapa realizando uma PCR multiplex de uma etapa na mistura B usando a mesma temperatura de anelamento para amplificação e para inserção do código de barras; iv) analisar o produto obtido na etapa iii) por qualquer tecnologia molecular.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa i), os códigos de barras moleculares são sintetizados, ou gerados por meio de metodologias de biologia molecular, em tandem com os iniciadores universais.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os códigos de barras moleculares é de 4 a 30 nucleotídeos de comprimento, de preferência, compostos entre 8 a 12 nucleotídeos e mais preferivelmente 10 nucleotídeos de comprimento.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o volume das referidas amostras biológicas contendo DNA ou RNA é de 0,5 μL a 5 mL, mais preferivelmente de 1 μl a 10 μl e mais preferivelmente 2 μl.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a temperatura de anelamento é entre 35°C a 80°C, mais preferivelmente entre 45°C e 70 °C, e mais preferivelmente 56 °C.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o número de ciclos da PCR de uma etapa multiplex da etapa iii) está entre 10 e 60 ciclos, mais preferivelmente entre 20 e 50 ciclos, e mais preferivelmente de 45 ciclos.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é útil para uma série de diferentes amostras biológicas de humano ou de quaisquer outros organismos eucarióticos e procarióticos selecionados a partir do grupo consistindo em sangue e outros fluidos, parafina ou outras formas de tecidos fixados, amostras criopreservadas, células cultivadas, tecidos, sementes, folhas, exsudato, lavagens e material de cotonete.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica contendo DNA ou RNA é o sangue.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que, o sangue é colocado em contato com anticoagulantes selecionados a partir do grupo que consiste em EDTA, heparina ou anticoagulantes à base de citrato.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é útil para uma série de diferentes amostras sintéticas que podem ser produzidas através de estratégias in vivo ou in vitro.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que os iniciadores universais das etapas i) e ii) são os iniciadores universais M13 e T7.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que, a tecnologia molecular é uma metodologia de sequenciamento.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a metodologia de sequenciamento é de Sanger ou de próxima geração.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o meio de coleta é selecionado a partir do grupo consistindo em, tubos, placas, recipientes, papéis, esfregões e pipetas.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as etapas i) e ii) são realizadas simultaneamente.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) é realizada após a etapa i) em um tubo de reação ou recipiente.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato de uma alíquota da mistura A com a mistura de PCR na etapa (ii) é feito por meio da transferência da referida alíquota da mistura A para um tubo de reação ou recipiente compreendendo a referida mistura de PCR.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (i) é realizada por meio da adição de cada uma das amostras biológicas contendo DNA ou RNA em um meio de coleta contendo um primeiro par de oligonucleotídeos iniciadores.
19. Uso de um kit, caracterizado pelo fato de que é para executar o método como definido na reivindicação 15, em que o kit compreende um conjunto de tubos ou recipientes de coleta compreendendo um par de oligonucleotídeos indicadores, cada um compreendendo um código de barras molecular vinculado a um iniciador universal, e um segundo par de oligonucleotídeos iniciadores, cada um compreendendo um iniciador específico vinculado a uma região iniciadora universal e mistura PCR em cada tubo ou recipiente de coleta.
20. Uso de um kit, caracterizado pelo fato de que é para executar o método como definido na reivindicação 17 ou 18, em que o kit compreende um primeiro conjunto de tubos ou recipientes de coleta compreendendo um primeiro par de oligonucleotídeos indicadores, cada um compreendendo um código de barras molecular vinculado a um iniciador universal em cada tubos ou recipientes de coleta, e um segundo conjunto de tubos ou recipientes de coleta compreendendo um segundo par de oligonucleotídeos iniciadores, cada um compreendendo um iniciador específico vinculado a uma região iniciadora universal e mistura PCR em cada tubo ou recipiente de coleta.
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