FR3067720A1 - Etiquette moleculaire pour la tracabilite d'echantillons soumis a une analyse ulterieure - Google Patents

Etiquette moleculaire pour la tracabilite d'echantillons soumis a une analyse ulterieure Download PDF

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FR3067720A1
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Withdrawn
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Inventor
Pierre Sujobert
Sandrine Hayette
Kaddour Chabane
Carole Charlot
Isabelle Mosnier
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Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Hospices Civils de Lyon HCL
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Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Hospices Civils de Lyon HCL
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Abstract

L'invention se rapporte à une étiquette moléculaire pour l'identification d'un échantillon à analyser, consistant en un acide nucléique composite, distinct d'un acide nucléique susceptible d'être contenu dans ledit échantillon, l'acide nucléique composite ayant la formule (I) suivante : 5'-[GENOM1]-[ID]-[GENOM2]-3' (I), dans laquelle : - [GENOM1] désigne une séquence polynucléotidique comprise dans un polynucléotide génomique de formule 5'-[GENOM1]-[GENOM2]-3'(II), susceptible d'être présent dans un échantillon à analyser, - [GENOM2] désigne une séquence polynucléotidique comprise dans ledit polynucléotide génomique de formule (II), - [ID] désigne une séquence polynucléotidique d'identification ayant une longueur d'au moins 4 nucléotides.

Description

DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention se rapporte à la traçabilité des échantillons soumis à une analyse ultérieure, et notamment des prélèvements sanguins soumis à une analyse biologique, depuis le moment du prélèvement jusqu’au rendu de l’analyse, en particulier aux fins d’éviter le risque d’inversion des échantillons de sources distinctes.
En pratique, l’invention fournit une étiquette moléculaire unique, en particulier à l’intérieur d’un récipient adapté à la collecte d’un échantillon, permettant d’associer l’échantillon à cette étiquette moléculaire unique et le récipient la contenant.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les analyses médicales, les analyses médico-légales et les analyses écologiques reposent sur la collecte d’échantillons à partir d’un organisme identifié ou d’un site identifié et le traitement de ces échantillons aux fins d’y mesurer certains paramètres.
Néanmoins, il a été estimé que les erreurs d’identification concernent environ 1 échantillon pour 1000, avec une fréquence des conséquences dommageables aux alentours de 1/20 000 (Bonini et al. Errors in laboratory medicine. Clin Chem. 2002;48:691-698; Plebani et Carraro. Mistakes in a stat laboratory: types and frequency. Clin Chem. 1997;43:1348-1351; Yuan et al. Clinical impact associated with corrected results in clinical microbiology testing. J Clin Microbiol. 2005;43:2188-2193 ; Astion et al. Errors and patient outcomes associated with problems in stat chemistry testing. Clin Chem. 2004;50(suppl 6):A114-A115).
Les erreurs d'identification peuvent conduire à des conséquences graves voire mortelles, en induisant des erreurs dans la démarche diagnostique ou dans l'évaluation de biomarqueurs pronostiques ou théranostiques.
Actuellement, il n’existe aucune technique fiable normalisée, utilisée en routine, permettant de s’assurer de l’absence d’inversion entre les patients. La seule alternative existante est de comparer le prélèvement du patient à un autre prélèvement du même patient, ou de répéter toutes les étapes de l'analyse, mais ces approches sont coûteuses, nécessitent un prélèvement supplémentaire du patient et éventuellement un consentement spécifique.
Par ailleurs, les techniques de séquençage récentes permettent désormais d’identifier rapidement, et avec un coût raisonnable, des variants génétiques qui peuvent être responsables de certains dysfonctionnements physiologiques, voire de certaines maladies. La médecine personnalisée compte tirer parti de ces progrès récents pour diagnostiquer certaines pathologies, proposer des traitements adaptés, et ainsi améliorer la qualité de vie des patients.
Avec le plan France Médecine Génomique 2025, l'objectif est d'intégrer les analyses génomiques dans la pratique courante, avec plus de 200 000 équivalents génomes séquencés par an sur un nombre restreint de plateformes centralisées.
Il existe donc un besoin grandissant de fournir des outils adaptés et fiables permettant la traçabilité des échantillons aux fins d’éviter les erreurs d’identification au cours de leur manipulation.
A ce jour, plusieurs approches ont été suivies pour tenter de tracer des échantillons biologiques et/ou des produits manufacturés.
Par exemple, il a été proposé d’insérer des codes-barres moléculaires dans des régions cibles des acides nucléiques contenus dans des échantillons biologiques (WO 2014/100866). Cette technique a l’inconvénient de mettre en œuvre les étapes de PCR multiplexe, qui sont lourdes à réaliser et peuvent aboutir à une dénaturation de l’échantillon lui-même.
US 2015/0322426 décrit un procédé de traçage d’un produit alimentaire contenant un ADN naturel ou synthétique, qui sera détecté par PCR.
EP 1 647 600 décrit un procédé de marquage d’un échantillon biologique par une pluralité d’acides nucléiques, notamment sous la forme plasmidique.
Il a par ailleurs été proposé un marquage d’échantillons biologiques par des codes barres moléculaires constitués de molécules d’ARN ou de protéines (WO 03/052101). Cependant, il est bien connu que les ARNs sont sujet à une dégradation rapide, et que l'analyse des protéines est moins fiable et robuste que celle des acides nucléiques.
Le brevet US 5,776,737 décrit, quant à lui, des étiquettes moléculaires, sous la forme d’un polynucléotide, comprenant, (a) un site ‘amorce’, qui n’est pas homologue avec l’ADN de l’organisme à partir duquel est issu l’échantillon, et (b) une région d’identification de formule générale -(M-N)x- ou -(M-N-N)x-, pour laquelle N représente un nucléotide qui est identique au 1er nucléotide du polynucléotide, et M représente un nucléotide qui peut être identique au 1er nucléotide du polynucléotide, sous réserve qu’au moins un nucléotide M soit différent du 1er nucléotide du polynucléotide, et pour laquelle x représente un indice compris entre 3 et 20. Cependant, ce système est contraignant par rapport à la séquence de la région d’identification, et nécessite une région amorce nécessairement d’une origine différente de l’acide nucléique contenu dans l’échantillon.
Enfin, il a été décrit un procédé de marquage d’un échantillon biologique dans lequel est introduit au moins un fragment d’un acide nucléique de type ADN de longueur prédéterminée, ledit fragment n’interférant pas avec l’analyse de l’acide nucléique contenu dans l’échantillon biologique (US 6,153,389). En d’autre terme, la nature du fragment d’ADN utilisé pour le marquage de l’échantillon est nécessairement « inerte » vis-à-vis de l’acide nucléique endogène contenu dans l’échantillon.
Comme mentionné ci-dessus, ces systèmes et procédés concentrent des limitations liées à la nature des étiquettes moléculaires proposées, notamment des contraintes structurelles drastiques.
Par ailleurs, ces outils ne permettent pas de considérer la génération rapide et facile d’un nombre d’étiquettes moléculaires suffisamment grand, tout en conservant une haute spécificité et la possibilité d’identifier ces étiquettes moléculaires sans interférences avec les étapes mises en œuvre lors de l’analyse des échantillons.
Il existe donc un besoin de fournir des outils de conception simple, faciles et peu onéreux à produire, stables dans le temps, et adaptés pour le traçage d’une pluralité d’échantillons à analyser.
RESUME DE L’INVENTION
Un premier aspect de l’invention se rapporte à une étiquette moléculaire pour l’identification d’un échantillon à analyser, consistant en un acide nucléique composite, distinct d’un acide nucléique susceptible d’être contenu dans ledit échantillon, l’acide nucléique composite ayant la formule (I) suivante :
5’-[GENOMl]-[ID]-[GENOM2]-3’(I), dans laquelle :
- [GEN0M1] désigne une séquence polynucléotidique comprise dans un polynucléotide génomique de formule 5’-[GENOMl]-[GENOM2]-3’(II), susceptible d’être présent dans un échantillon à analyser,
- [GENOM2] désigne une séquence polynucléotidique comprise dans ledit polynucléotide génomique de formule (II),
- [ID] désigne une séquence polynucléotidique d’identification ayant une longueur d’au moins 4 nucléotides.
Un autre aspect de l’invention se rapporte à un récipient comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description.
Un autre aspect de l’invention se rapporte également à un échantillon à analyser comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte à un kit pour l’identification d’un échantillon à analyser, ledit kit comprenant une pluralité de récipients, chaque récipient comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description.
Enfin, un dernier aspect de l’invention concerne un procédé d’identification d’un échantillon à analyser comprenant les étapes suivantes :
a) disposer un échantillon dans un récipient approprié, lequel récipient comprend (i) une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description, et (ii) une marque d’identification lisible depuis l’extérieur du récipient;
b) extraire les acides nucléiques totaux contenus dans ledit échantillon ;
c) identifier l’étiquette moléculaire unique à partir de l’extrait obtenu à l’étape b);
d) disposer d’un support d’information spécifiant la correspondance entre (i) ladite étiquette moléculaire et (ii) ladite marque d’identification, et
e) déterminer que l’identification de l’étiquette moléculaire unique correspond à la marque d’identification.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Schéma illustrant la mise en œuvre d’une étiquette moléculaire selon l’invention pour valider les résultats d’analyses d’échantillons biologiques obtenus à partir de deux patients.
Figure 2 : Schéma illustrant la mise en œuvre d’une étiquette moléculaire selon l’invention pour ne pas valider les résultats obtenus à partir de deux patients. Les flèches horizontales indiquent que les échantillons obtenus à partir des patients A et B ont été inversés lors de leur manipulation.
Figure 3 : Courbes de cinétique de fusion illustrant la détection par HRM de l’étiquette moléculaire double brin EM-2 dans les échantillons B2S (sang+EM-2 ; courbes supérieures), T1P, T2P et T2Pe (EM ; courbes intermédiaires) et TOS (sang pur ; courbes inférieures). L’axe des abscisses représente la température (°C). L’axe des ordonnées représente la cinétique de perte de fluorescence des échantillons, par rapport à l’échantillon témoin TOS
Figure 4 : Chromatogramme illustrant le produit du séquençage par la technique de Sanger des échantillons TOS, T2P et B2S, telles que définis dans la figure 3.
Figure 5 : Courbes de cinétique de fusion illustrant la détection par HRM de l’étiquette moléculaire double brin EM-2 dans les échantillons B2S à JO, J2, J4, J8, J10 et J15 (sang+EM-2 ; courbes supérieures), T2P (EM ; courbes intermédiaire) et TOS à JO, J2, J4, J8, J10 et J15 (sang pur; courbes inférieures). L’axe des abscisses représente la température (°C). L’axe des ordonnées représente la cinétique de perte de fluorescence des échantillons, par rapport à l’échantillon témoin TOS à JO.
Figure 6 : Courbes illustrant la quantification de l’étiquette moléculaire double brin EM-2 estimée dans échantillons B2S (courbe 1) et TOS (courbe 4), et mesurée par rqPCR dans les échantillons B2S (courbe 2) et TOS (courbe 3). L’axe des abscisses représente le temps (jour) et Taxe des ordonnées représente le nombre de copies mesuré.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Les inventeurs ont développé des outils adaptés pour le traçage d’échantillons provenant de sources identifiées distinctes et contenus dans des tubes de prélèvement distincts, tout au long de leur manipulation, et ainsi éviter les erreurs d’inversion de ces tubes.
A titre illustratif, les inventeurs ont montré qu’il était possible de tracer des échantillons de sang humain, au moyen d’une introduction dans un tube de prélèvement d’une étiquette moléculaire unique, sous la forme d’une séquence d’ADN unique, qui est par ailleurs identifiée par un code barre correspondant sur le tube lui-même. L’étiquette moléculaire, présente dans l’échantillon, est soumise à l’ensemble des étapes préanalytiques et analytiques, et pourra être identifiée, à tout moment lors de l’analyse, pour s’assurer de la concordance entre l’étiquette moléculaire et le code barre figurant sur le tube de prélèvement identifiant l’échantillon.
Les inventeurs montrent que les outils et procédés conformes à la présente description permettent de réduire à néant les risques d’inversion au laboratoire d’échantillon de sources distinctes, de manière simple et pour un coût extrêmement réduit.
Par ailleurs, ces outils et procédés répondent particulièrement aux besoins actuels, car il est attendu par les experts que le risque d’inversion prenne de l’ampleur avec la généralisation des analyses moléculaires par NGS (Next Génération Sequencing), et la structuration de ces analyses sur un nombre réduit de plateformes à l’échelle nationale (Plan France Médecine Génomique 2025).
Enfin, ces outils présentent une stabilité de plus de 1 mois, voire 3 mois, dans un tube de prélèvement sans échantillons (stockage) et d’au moins 15 jours dans un prélèvement, par exemple un prélèvement de sang.
• Etiquette moléculaire
Un aspect de l’invention se rapporte à une étiquette moléculaire pour l’identification d’un échantillon à analyser, consistant en un acide nucléique composite, distinct d’un acide nucléique susceptible d’être contenu dans ledit échantillon, l’acide nucléique composite ayant la formule (I) suivante :
5’-[GENOMl]-[ID]-[GENOM2]-3’(I), dans laquelle :
- [GEN0M1] désigne une séquence polynucléotidique comprise dans un polynucléotide génomique de formule 5’-[GENOMl]-[GENOM2]-3’(II), susceptible d’être présent dans un échantillon à analyser,
- [GEN0M2] désigne une séquence polynucléotidique comprise dans ledit polynucléotide génomique de formule (II),
- [ID] désigne une séquence polynucléotidique d’identification ayant une longueur d’au moins 4 nucléotides.
Dans certains modes de réalisation, l’acide nucléique composite est un ADN simple brin.
Dans certains modes de réalisation alternatifs, l’acide nucléique composite est un ADN double brin.
Au sens de l’invention, un polynucléotide génomique de formule 5’-[GENOMl]-[GENOM2]-3’(II) doit se comprendre comme toute séquence d’acide nucléique linéaire présente dans un génome, pouvant être arbitrairement scindée en deux fragments.
Il est entendu que les séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GENOM2] doivent présenter une longueur suffisante pour pouvoir être détectée et/ou séquencées par les techniques habituelles utilisées en routine dans les laboratoires, et donc bien connues de l’état de l’art.
Dans un mode de réalisation particulier, les séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GENOM2] présentent une longueur d’au moins 25 nucléotides.
Dans certains modes de réalisation, les séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GENOM2] présentent indépendamment une longueur variant de 50 à 400 nucléotides, de préférence de 75 à 250 nucléotides.
En pratique, les séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GENOM2] ont des tailles distinctes ou similaires, ou peuvent être de longueurs identiques.
Dans le cadre de l’invention, les séquences polynucléotidiques [GENOM1] et [GENOM2] ont des tailles distinctes lorsque le ratio de tailles [GENOM1]/[GENOM2] ou [GENOM2]/[GENOM1] varie de 1/25 à 1/2, ce qui inclut 1/24, 1/23, 1/22, 1/21, 1/20, 1/19, 1/18, 1/17, 1/16, 1/15, 1/14, 1/13, 1/12, 1/11, 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3.
Dans le cadre de l’invention, les séquences polynucléotidiques [GENOM1] et [GENOM2] ont des tailles comparables lorsque le ratio de tailles [GENOM1]/[GENOM2] ou [GENOM2]/[GENOM1] est strictement inférieur à 1/2, ce qui inclut 1/1,9, 1/1,8, 1/1,7, 1/1,6, 1/1,5, 1/1,4, 1/1,3, 1/1,2, 1/1,1 et 1/1.
Dans certains modes de réalisation préférés, le ratio de tailles [GENOM1]/[GENOM2] ou [GENOM2]/[GENOM1] est inférieur à 1/1,15. Il est entendu que la séquence polynucléotidique [ID] est alors positionnée sensiblement au milieu du polynucléotide génomique de formule (II).
Dans un mode de réalisation, [ID] désigne une séquence polynucléotidique d’identification ayant une longueur d’au maximum 24 nucléotides.
Par « au maximum 24 nucléotides » on comprend 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 et 24 nucléotides.
Dans certains modes de réalisation, [ID] désigne une séquence polynucléotidique d’identification ayant une longueur comprise entre 4 et 12 nucléotides, de préférence comprise entre 6 et 8 nucléotides.
Il est entendu qu’une séquence polynucléotidique d’identification [ID] de 4 nucléotides permet de générer 44 (soit 256) combinaisons possibles, c’est-à-dire 44 étiquettes moléculaires distinctes pour une des séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GEN0M2] identiques. Une séquence polynucléotidique d’identification [ID] de 6 nucléotides permet de générer, quant à elle, 46 (soit 4096) étiquettes moléculaires distinctes pour une des séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GEN0M2] identiques.
Dans certains modes de réalisation, [ID] désigne une séquence polynucléotidique d’identification possédant au maximum de 0 à 5 sites de restriction, de préférence de 0 à 4 sites de restriction, de préférence de 0 à 3 sites de restriction, de préférence de 0 à 2 sites de restriction, de manière plus préférée 0 ou 1 site de restriction.
Par site de restriction, il est entendu une séquence polynucléotidique reconnue et clivée par une ou plusieurs enzymes de restriction, encore appelées nucléases, dans des conditions opératoires appropriées.
Il est entendu qu’il est très avantageux que la séquence polynucléotidique d’identification [ID] selon l’invention ne soit pas clivée par une enzyme de restriction susceptible d’être présente dans l’échantillon à analyser et/ou utilisée lors du traitement pré-analytique et/ou analytique de l’échantillon.
En pratique, les sites reconnus par une ou plusieurs enzymes de restriction sont souvent des séquences palindromiques.
Dans certains modes de réalisation particuliers, il peut être avantageux que le dernier nucléotide des séquences polynucléotidiques d’identification [ID] d’une pluralité d’étiquettes moléculaires soit de même nature.
Dans ce dernier mode de réalisation, le dernier nucléotide des séquences polynucléotidiques d’identification [ID] peut être de préférence distinct du dernier nucléotide de la séquence polynucléotidique [GEN0M1], afin de permettre une identification plus aisée des étiquettes moléculaires.
Dans un mode de réalisation préféré, le polynucléotide génomique de formule (II) est issu d’un génome sélectionné dans un groupe comprenant un génome viral, un génome procaryote, un génome d’archaebaciérie et un génome eucaryote.
Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide génomique de formule (II) est issu d’un génome eucaryote, de préférence d’un génome de mammifère, de manière plus préférentielle d’un génome humain.
Selon un mode de réalisation particulier, il peut être avantageux que le polynucléotide génomique de formule (II) présente un taux de polymorphismes inférieur à 10%.
Dans le cadre de l’invention, un taux de polymorphismes inférieur à 10% inclut un taux inférieur à 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% et 0,01%.
Ceci a un intérêt particulier quand sont envisagés des régions des séquences polynucléotidiques [GENOM1] et [GENOM2] destinées à être hybridées avec des amorces aux fins du séquençage de l’acide nucléique composite de formule (I).
Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide génomique de formule (II) est un exon, de préférence un exon d’un gène dont la séquence est disponible dans une base de données et dont l’exon n'est pas altéré de manière récurrente dans les processus pathologiques.
A titre illustratif, il existe environ 20000 séquences d’acide nucléique codantes chez l’homme. Sachant que pour chaque séquence d’acide nucléique codante il existe plusieurs exons, le réservoir possible d’exons envisageables figurant une séquence polynucléotidique de formule (II) est vaste.
Dans un mode de réalisation particulier, le polynucléotide génomique de formule (II) est un exon du gène humain ABL1, de préférence l’exon 3 du gène humain ABL1.
• Récipient comprenant une étiquette moléculaire
Un autre aspect de l’invention se rapporte à un récipient comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la description ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, le récipient comprend une marque d’identification lisible depuis l’extérieur dudit récipient.
Dans certains modes de réalisation, le récipient se présente sous la forme d’un tube de prélèvement, de préférence un tube de prélèvement sanguin.
Le tube de prélèvement peut être un tube qui n’a pas été traité, c’est-à-dire un tube qui ne comprend pas d’agent chimique exogène. Dans ce cas, le tube de prélèvement est qualifié de tube « sec ».
De manière alternative, le récipient peut comprendre en outre un agent chimique, notamment un agent chimique utile pour l’analyse de l’échantillon.
En pratique, l’agent chimique peut être choisi dans un groupe comprenant un agent antioxydant, un inhibiteur de protéase, un inhibiteur de nucléase, un agent modulant le pH, un agent anticoagulant, un milieu de culture pour bactéries.
Selon un mode de réalisation particulier, l’agent anticoagulant est préférentiellement sélectionné dans un groupe comprenant l’EDTA, l’héparine, un sel d’héparine, le citrate, un sel de citrate, un sel de fluor, un sel d’oxalate, et leur mélange.
• Echantillon à analyser
Il est entendu que l’étiquette moléculaire conforme à la présente description est destinée à se trouver au contact d’un échantillon à analyser.
Ainsi, un autre aspect de l’invention se rapporte à un échantillon à analyser comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description.
En pratique, tout type d’échantillon peut être envisagé, en particulier un échantillon à l’état solide, liquide, gazeux ou leur mélange.
De manière non limitative, un échantillon est choisi dans un groupe comprenant un échantillon destiné à une analyse biologique, un échantillon destiné à une analyse écologique, un échantillon destiné à une analyse médico-légale.
Selon l’invention, le terme « échantillon destiné à une analyse biologique » se réfère à tout tissu ou liquide biologique soumis à une analyse agroalimentaire, médicale ou vétérinaire.
Dans un mode de réalisation particulier, un échantillon destiné à une analyse biologique est avantageusement choisi dans un groupe comprenant un échantillon de sang, un échantillon de salive, un échantillon d’urine, un échantillon de moelle osseuse, un échantillon de liquide céphalo-rachidien, un échantillon de liquide d’épanchement (ascite, liquide pleural), un échantillon de sperme.
Il est entendu que ces échantillons peuvent contenir au moins un acide nucléique, en particulier un acide nucléique distinct de l’étiquette moléculaire décrite dans la présente description.
Dans un mode de réalisation particulier, l’échantillon destiné à une analyse biologique comprend au moins un acide nucléique, de type ADN et/ou ARN, lequel acide nucléique est le produit d’une extraction d’un échantillon comprenant ledit acide nucléique.
Il est entendu que l’échantillon destiné à une analyse biologique peut être d’origine humaine, animale, bactérienne, virale ou végétale.
Dans le cadre de l’invention, un échantillon d’origine animale, destiné à une analyse biologique vétérinaire, peut être avantageusement provenir d’un animal de compagnie, comme par exemple un chat, un chien ; un rongeur, comme par exemple un rat, une souris, un hamster ; un bovin, comme par exemple une vache, un veau ; un ovin, comme par exemple un mouton, une chèvre ; un équidé, comme par exemple un cheval, une jument, un âne ; un volatile, comme par exemple une poule, un canard, une oie ; un primate, comme par exemple un chimpanzé, un macaque ; un poisson ; un crustacé ; un gastéropode.
Selon l’invention, un échantillon d’origine bactérienne peut provenir d’une bactérie pathogène ou non-pathogène, à coloration de gram positive ou négative.
Dans le cadre de l’invention, un échantillon d’origine virale peut provenir d’un virus à ADN à double brin (groupe I) ou à simple brin (groupe II) ; un virus à ARN à double brin (groupe IV) ou à simple brin (groupe V) ; un rétrovirus à ARN simple brin (groupe VI) ; un pararétrovirus à ADN double brin (groupe VII).
A titre illustratif et non limitatif, un échantillon d’origine végétale peut provenir d’une plante comestible ou non comestible ; d’un arbre ; d’un arbuste ; d’une fougère ; d’un fruit ; d’un légume ; d’une légumineuse ; d’une céréale.
Selon l’invention, le terme « échantillon destiné à une analyse écologique » se réfère à tout élément retrouvé dans la nature et capable d’être capturé, et englobe un échantillon d’air ; un échantillon d’eau, en particulier une eau de mer, une eau douce, une eau polluée ; un échantillon de sable ; un échantillon de boue ; un échantillon de terre ; un échantillon de glace ; un échantillon de roche.
Dans le cadre de l’invention, le terme « échantillon destiné à une analyse médico-légale » se rapporte à tout échantillon prélevé à la demande d’un magistrat et/ou des forces de l’ordre.
Dans un mode de réalisation particulier, l’échantillon à analyser comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description comprend en outre un ou plusieurs acides nucléiques, de préférence une ou plusieurs molécules d’ADN.
Dans certains modes de réalisation particuliers, l’acide nucléique est un polynucléotide de formule (II), d’origine distincte ou de même origine que l’acide nucléique composite constituant l’étiquette moléculaire conforme à la présente description.
L’échantillon peut comprendre une concentration finale d’étiquette moléculaire conforme à la présente description comprise entre 0,01 pM et 10 μΜ, de préférence entre 0,1 pM et 100 nM, encore plus préférentiellement entre 0,5 pM et 10 nM.
Dans le cadre de l’invention l’expression « entre 0.01 pM et 10 μΜ» inclut une concentration finale de l’étiquette moléculaire dans l’échantillon de 0,02 pM, 0,03 pM, 0,04 pM, 0,05 pM, 0,06 pM, 0,07 pM, 0,08 pM, 0,09 pM, 0,1 pM, 0,2 pM, 0,3 pM, 0,4 pM, 0,5 pM, 0,6 pM, 0,7 pM, 0,8 pM, 0,9 pM, 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM, 900 pM, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 μΜ, 2 μΜ, 3 μΜ, 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ et 9 μΜ.
• Kits
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte à un kit pour l’identification d’un échantillon à analyser, ledit kit comprenant une pluralité de récipients, chaque récipient comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description.
Dans un mode de réalisation, ladite pluralité de récipients comprend une étiquette moléculaire unique identique.
Ce mode réalisation est particulièrement avantageux pour identifier des échantillons :
- prélevés à partir d’un même individu ;
- prélevés à partir d’un même site ;
- distincts et analysés au sein d’un même établissement.
Dans un autre mode de réalisation, ladite pluralité de récipients comprend une étiquette moléculaire unique distincte d’un récipient à l’autre.
Ce mode réalisation particulier est particulièrement préféré lorsqu’il s’agit d’identifier des échantillons :
- prélevés à partir d’individus distincts ;
- prélevés à partir de sites de prélèvement distincts ;
- identiques et analysés au sein d’établissements distincts.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte également à un kit pour l’identification d’un échantillon à analyser, ledit kit comprenant :
- un récipient, ou une pluralité de récipients, comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description ; et optionnellement
- la séquence d’un couple d’oligonucléotides adaptés pour l’amplification et/ou le séquençage de ladite étiquette moléculaire unique.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte également à un kit pour l’identification d’un échantillon à analyser, ledit kit comprenant :
- un récipient, ou une pluralité de récipients, comprenant une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description ; et optionnellement
- un couple d’oligonucléotides adaptés pour l’amplification et/ou le séquençage de ladite étiquette moléculaire unique.
Il est entendu que la pluralité de récipients comprend des récipients comprenant une étiquette moléculaire unique distincte d’un récipient à l’autre.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit comprend un récipient qui comprend lui-même une marque d’identification visible depuis l’extérieur, ledit kit comprenant en outre un support d’information spécifiant la correspondance entre (i) ladite étiquette moléculaire et (ii) ladite marque d’identification.
Dans certains modes de réalisation, le couple d’oligonucléotides contient :
- un oligonucléotide s’hybridant avec une séquence nucléotidique comprise dans la séquence polynucléotidique [GEN0M1] ;
- un oligonucléotide s’hybridant avec une séquence nucléotidique inverse et complémentaire d’une séquence nucléotidique comprise dans la séquence polynucléotidique [GEN0M2],
Dans certains modes de réalisation, l’oligonucléotide s’hybridant avec la séquence polynucléotidique [GEN0M1] s’hybride avec une séquence nucléotidique incluant le premier nucléotide en 5’de [GEN0M1] et/ou l’oligonucléotide s’hybridant avec la séquence polynucléotidique [GEN0M2] s’hybride avec une séquence nucléotidique incluant le dernier nucléotide en 3’de [GEN0M2],
Dans ce dernier mode de réalisation, le couple d’oligonucléotides peut être choisi de telle manière à ce que l’intégralité de l’étiquette moléculaire figurée par l’acide nucléique composite de formule (I) soit amplifiée et/ou séquencée.
Dans d’autres modes de réalisation, le couple d’oligonucléotides peut être choisi de telle manière à ce que seule la séquence polynucléotidique d’identification [ID] soit amplifiée et/ou séquencée, optionnellement avec les régions adjacentes en 5’ et 3’, correspondant respectivement à la région 3’ de la séquence polynucléotidique [GEN0M1] et la région 5’ de la séquence polynucléotidique [GEN0M2],
Par région adjacente, on entend une séquence nucléique d’une longueur comprise entre 10 et 30 nucléotides, de préférence comprise entre 15 et 25 nucléotides, encore plus préférentiellement compris entre 17 et 23 nucléotides.
Dans un mode de réalisation, chaque oligonucléotide a une taille comprise entre 15 et 30 nucléotides, de préférence entre 15 et 25 nucléotides.
• Procédés
Un autre aspect de l’invention concerne un procédé d’identification d’un échantillon à analyser comprenant les étapes suivantes :
a) disposer un échantillon dans un récipient approprié, lequel récipient comprend (i) une étiquette moléculaire unique conforme à la présente description, et (ii) une marque d’identification lisible depuis l’extérieur du récipient;
b) extraire les acides nucléiques totaux contenus dans ledit échantillon ;
c) identifier l’étiquette moléculaire unique à partir de l’extrait obtenu à l’étape b);
d) disposer d’un support d’information spécifiant la correspondance entre (i) ladite étiquette moléculaire et (ii) ladite marque d’identification, et
e) déterminer que l’identification de l’étiquette moléculaire unique correspond à la marque d’identification.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé met en œuvre un échantillon biologique.
En pratique, l’échantillon biologique est sélectionné dans un groupe comprenant un échantillon de sang, un échantillon de salive, un échantillon d’urine, un échantillon de moelle osseuse, un échantillon de liquide céphalo-rachidien, un échantillon de liquide d’épanchement (ascite, liquide pleural), un échantillon de sperme.
Selon certains modes de réalisation particuliers, l’échantillon biologique est un échantillon de sang sans séparation cellulaire et sans lavage.
De manière avantageuse, le récipient est un tube de prélèvement sanguin, comprenant optionnellement un agent anticoagulant.
Il est entendu que l’identification de l’étiquette moléculaire sous la forme d’un acide nucléique composite conforme à la présente description peut être réalisée par toute technique adaptée, notamment les techniques connues de l’état de l’art.
Par exemple, l’identification de l’acide nucléique composite à l’étape d) peut être réalisée par amplification PCR et généralement par toute technique permettant l’identification d’une séquence nucléotidique, à savoir un séquençage Sanger, un pyroséquençage, un séquençage haut débit (appelé encore séquençage de nouvelle génération), ou tout autre type de séquençage adapté.
En outre, l’identification de l’acide nucléique composite à l’étape d) peut être également réalisée par des techniques d’hybridation au moyen de sondes spécifiques.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé met en œuvre un échantillon contenant en outre des acides nucléiques distincts de l’étiquette moléculaire unique conforme à la présente description.
A titre illustratif, une étiquette moléculaire dont les séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GEN0M2] sont d’origine humaine peut être mise en œuvre au sens de l’invention dans un échantillon comprenant des acides nucléiques non humains, en particulier, et de manière non limitative, des acides nucléiques de souris, de rat, de chat, de chien, de cheval, de vache, de mouton, de hamster.
Dans un mode de réalisation alternatif, le procédé met en œuvre une séquence polynucléotidique [GEN0M1] et une séquence polynucléotidique [GEN0M2] de la même origine génomique (espèce) que les acides nucléiques contenus dans ledit échantillon.
Lors de l’identification de l’étiquette moléculaire, notamment aux moyens d’un couple d’oligonucléotides choisi de sorte à amplifier et/ou séquencer l’intégralité de l’étiquette moléculaire, figurée par l’acide nucléique composite de formule (I), 2 produits d’amplification PCR et/ou 2 produits issus du séquençage pourront être générés, un premier produit correspondant à l’amplification et/ou au séquençage de l’étiquette moléculaire et un deuxième produit correspondant à l’amplification et/ou au séquençage d’une séquence nucléique correspondant à une séquence polynucléotidique de formule (II).
A titre d’exemples, et de manière non limitative, un échantillon comprenant des acides nucléiques d’origine humaine pourra comprendre une étiquette moléculaire dont les séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GEN0M2] sont d’origine humaine ; un échantillon comprenant des acides nucléiques d’origine murine pourra comprendre une étiquette moléculaire dont les séquences polynucléotidiques [GEN0M1] et [GEN0M2] sont d’origine murine.
EXEMPLES
Exemple 1 — Conception d’une étiquette moléculaire simple brin selon l’invention
Une étiquette moléculaire EM-1 correspondant à une séquence de 120 nucléotides a été synthétisée (SEQ ID NO. 1). Cette étiquette correspond à l’exon 3 du gène ABL (SEQ ID NO. 2) dans lequel une insertion de 6 nucléotides a été effectuée, à savoir CAGATA (SEQ ID NO. 7). Comme il existe 4 nucléotides possibles par position (A, T, G, C), cette insertion de 6 nucléotides permet la génération au total de 46 = 4096 tags différents.
L’étiquette moléculaire EM-1 est donc définie comme ayant la séquence suivante : 5 -(SEQ ID NO. 3)-([ID])-(SEQ ID NO. 4)-3’, dans laquelle :
- SEQ ID NO. 3 correspond à la séquence polynucléotidique [GEN0M1] de l’acide nucléique composite de formule (I) ;
- SEQ ID NO. 7 correspond à la séquence polynucléotidique d’identification [ID] de l’acide nucléique composite de formule (I) ; et
- SEQ ID NO. 4 correspond à la séquence polynucléotidique [GEN0M2] de l’acide nucléique composite de formule (I).
EM-1 a été synthétisé par Eurofins Genomics® (Ebersberg, Allemagne) et ses caractéristiques sont les suivantes :
- Poids moléculaire : 37055 g/mol ;
- Taux GC : 49.2% ;
- Purification : HPLC ;
- Echelle de synthèse : 0,2 pmol ;
- Quantité : 5,8 mol (215 pg).
EM-1 est mis en solution dans 58 μΐ d’un tampon Tris, EDTA pour constituer une solution stock à 100 μΜ (soit 6.1013 copies d’EM-1/μΙ). Cette solution est stockée à une température de -20°C.
Une dilution au 1/100 de la solution stock est ensuite réalisée pour avoir une solution A à 1 μΜ (soit 6.1011 copies d’EM-1/μΙ). Des aliquots de 100 μΐ sont préparés et stockés sous une forme congelée à une température de -20°C.
Exemple 2 — Préparation d’une étiquette EM-2 double brin
1. Matériels et méthodes
L’étiquette moléculaire EM-1 simple brin est transformée en oligonucléotide double brin EM-2. Il est ensuite ajouté au tube de prélèvement, dans lequel il a été démontré sa stabilité pendant au moins 3 mois par les techniques d’extraction d’ADN, PCR quantitative et séquençage.
a) Synthèse du deuxième brin d’ADN
La synthèse du deuxième brin est réalisée à partir de la solution A (1 μΜ soit 6.1011 copies d’EM-1 simple brin/μΐ)
Mix réactionnel pour l’échantillon (40 μΐ final) :
Tag Solution A :
20μΐ (20 pmol soit 1,2. 109 copies simple brin)
Tampon Herculase 5X: 8 μΐ dNTPs 2,5 mM: Amorces, 20 μΜ: Herculase :
6μ1
5μΐ (soit 100 pmol SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO. 6) lpl
Les conditions pour réaliser la synthèse du deuxième brin sont les suivantes :
- Dénaturation : 5 min, à une température de 95° ;
- Hybridation : 1 min, à une température de 60°C ;
- Elongation : 10 min, à une température de 72°C.
Cette nouvelle solution, nommée solution A2, a un volume final de 40μΐ à 0,5 μΜ de tag double brin EM-2 soit 3.1011 copies double brin/μΐ, si le rendement est de 100%.
Les solutions de travail suivantes ont été préparées :
- Solution B : dilution au 1/1000 de la solution A en tampon tris, EDTA de l’étiquette EM-1 simple brin (1 nM soit 6.108 copies /μΐ) ;
- Solution B2 : dilution au 1/500 de la solution A2 en tampon tris, EDTA de l’étiquette EM-2 double brin (1 nM soit 6.108 copies /μΐ).
Les échantillons suivants sont préparés :
- Tube B2S : 2 ml de sang en tube EDTA + 2 μΐ de solution B2 (soit 6.105 copies/μΐ d’EM-2) ;
- Tube T0S : 2 ml de sang en tube EDTA (0 copies/μΐ d’EM-2) ;
- Tube T2P : 2 ml de tampon PB S (phosphate buffer saline) + 2 μΐ de solution B2 (soit 6.105 copies/μΐ d’EM-2).
- Tube T1P : 2 ml de tampon PB S (phosphate buffer saline) + 2 μΐ de solution B (soit 6.105 copies/μΐ d’EM-l).
b) Extraction d’ADN
L’extraction de l’ADN total est réalisée au moyen du kit Qiacube® (Qiagen®), à partir de 200 μΐ d’échantillon des tubes B2S, T0S et T2P, élution dans 100 μΐ. L’ADN des échantillons B2S (sang + tag) et T0S (sang seul) est dosé et une dilution à 5 ng/μΐ sera utilisé pour la suite, l’ADN extrait du tube T2P (tag seul) sera dilué dans les mêmes rapports que l’ADN B2S.
c) PCR quantitative et HRM
La présence du tag dans les échantillons d’ADN extraits est évaluée par qPCR suivi d’une courbe de fusion HRM (‘High Resolution Melting’). La qPCR en utilisant les amorces de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO. 6 permet l’amplification du tag ([GENOM1]-[ID]-[GENOM2]) ou de de Texon 3 d’ABLl ([GENOM1][GENOM2]), la technique d’HRM permet de déceler la présence de produits de PCR différents dans le milieu réactionnel.
Les échantillons d’ADN B2S (sang+tag), TOS (sang seul) T2P (tag seul), T2Pe (tag seul, ayant subi l’étape d’extraction d’ADN) et en parallèle une gamme de T1P (tag simple brin) dont on connaît la concentration sont testés en PCR quantitative et HRM sur un Light Cycler 480 (Roche Diagnosis).
d) Séquençage des produits de PCR quantitative
Les produits de PCR des échantillons B2S, TOS et T2P sont séquencés par technique de séquençage Sanger classique en utilisant les amorces de séquences SEQ ID
NO. 5 et SEQ ID NO. 6
2. Résultats
- La gamme d’oligonucléotides tagués simple brin en qPCR a bien fonctionné, efficacité: 1.973, pente : -3.388 Yintercept : 39.08, elle permet une quantification précise d’ABL dans la zone du tag introduit.
- La quantité d’oligonucléotides tagués mélangée au sang (6.105 copies/μΐ) est suffisante pour une détection par HRM (Figure 3) et séquençage en Sanger (Figure 4).
- Lorsqu’on compare, pour le tube B2S, la quantité d’ABLl estimé (ABL1 sanguin endogène +ABL1 apporté par le tag) à la quantité d’ABLl quantifiée grâce à la gamme, on constate que environ 90% des tags ont été perdus ou dégradés au cours de l’exposition au sang et de l’extraction d’ADN.
- Lorsqu’on compare les témoins tags double brins purs quantifiés après avoir subi une extraction d’ADN au QiaCube (T2Pe) ou non (T2P), on constate environ 25% de perte due à l’extraction d’ADN.
Conclusion :
La solution B2 (1 nM d’EM-2 double brin soit 6.108 copies /μΐ) parait être une solution de travail de choix, et pourra être mise en œuvre par une dilution au 1/1000 dans le prélèvement. Des aliquots de la solution B2 peuvent être préparés et conservés de manière stable à une température de -20°C.
Exemple 3 — test de stabilité de l’étiquette EM-2 dans le sang
La mesure du taux d’étiquette EM-2 par PCR quantitative semble indiquer une différence entre la quantité d’étiquettes EM-2 introduites et la quantité mesurée après exposition au sang et extraction d’ADN. Il y a donc une perte de matériel au cours de ces différentes étapes, la détection de l’étiquette EM-2 reste cependant possible. La stabilité de l’étiquette EM-2 a été testée en mettant en contact cette dernière avec du sang humain dans un tube EDTA pendant des temps allant de 0 à 15 jours.
1. Matériels et méthodes
- Utilisation de la solution de travail B2 (1 nM d’EM-2 double brin soit 6.108 copies/μΐ) :
- Deux tubes EDTA d’un même patient sont utilisés :
Le tube B2S : 3 ml de sang en tube EDTA + 3 μΐ de solution B2 (soit 6.105 copies/μΐ d’EM-2) ;
Tube T0S : 3 ml de sang en tube EDTA (0 copies/μΐ d’EM-2).
- Les tubes sont conservés à 4°C et des aliquots de 200 μΐ sont prélevés puis congelés à -20°Cà J0, J2, J4, J8, J10 et J15.
a) Extraction d’ADN
L’extraction de l’ADN total est réalisée au moyen du kit Qiacube® (Qiagen®), à partir de 200 μΐ d’échantillon des tubes B2S (J0, J2, J4, J8, J10 et J15) et T0S (J0, J2, J4, J8, J10 et J15), élution dans 100 μΐ. L’ADN des échantillons est dosé et une dilution à 5 ng/μΐ sera utilisée pour la suite.
b) PCR quantitative et HRM
La présence du tag dans les échantillons d’ADN extraits est évaluée par qPCR suivi d’une courbe de fusion HRM (High Resolution Melting). La qPCR en utilisant les amorces de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO. 6 permet l’amplification du tag ([GEN0Ml]-[ID]-[GEN0M2]) ou de de l’exon 3 d’ABLl ([GEN0Ml]-[GEN0M2]), la technique d’HRM permet de déceler la présence de produits de PCR différents dans le milieu réactionnel.
Les échantillons d’ADN B2S à JO, J2, J4, J8, J10 et J15 (sang + tag), TOS à JO, J2, J4, J8, J10 et J15 (sang seul), et T2P (tag seul) sont testés en PCR quantitative et HRM sur un Light Cycler 480 (Roche Diagnosis).
2. Résultats
L’étiquette EM-2 est détectée dans tous les échantillons B2S de JO à J15 par la technique d’HRM (Figure 5).
Les dosages des échantillons sanguins B2S par RQ-PCR révèlent un taux d’étiquettes EM-2 stable entre JO et J15 (Figure 6, courbe 3).
3. Conclusion :
L’étiquette EM-2 est stable au contact du sang pendant une durée au moins 20 égale à 15 jours à la température de 4°C.
Tableau 1 : Séquences d’intérêt (toutes les séquences ADN sont orientées dans le sens conventionnel 5’-3’)
SEQ ID NO. Séquence Description
1 aggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaac caaaaatggcagataccaaggctgggtcccaagcaact acatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggt acca Etiquette moléculaire EM-1
2 aggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaac caaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatca cgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtacca Séquence ADN de l’exon 3 du gène ABL1 humain ([GEN0Ml]-[GEN0M2])
3 aggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaac Séquence ADN 5’ de l’exon 3

Claims (11)

  1. REVENDICATIONS
    1. Etiquette moléculaire pour l’identification d’un échantillon à analyser, consistant en un acide nucléique composite, distinct d’un acide nucléique susceptible d’être contenu dans ledit échantillon, l’acide nucléique composite ayant la formule (I) suivante :
    5’-[GENOMl]-[ID]-[GENOM2]-3’(I), dans laquelle :
    - [GENOM1] désigne une séquence polynucléotidique comprise dans un polynucléotide génomique de formule 5’-[GENOMl]-[GENOM2]-3’(II), susceptible d’être présent dans un échantillon à analyser,
    - [GENOM2] désigne une séquence polynucléotidique comprise dans ledit polynucléotide génomique de formule (II),
    - [ED] désigne une séquence polynucléotidique d’identification ayant une longueur d’au moins 4 nucléotides.
  2. 2. Etiquette moléculaire selon la revendication 1, caractérisée en ce que l’acide nucléique composite est un ADN double brin.
  3. 3. Etiquette moléculaire selon l’une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que les séquences polynucléotidiques [GENOM1] et [GENOM2] présentent une longueur d’au moins 25 nucléotides.
  4. 4. Etiquette moléculaire selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que [ID] désigne une séquence polynucléotidique d’identification ayant une longueur variant de 4 à 12 nucléotides, de préférence variant de 6 à 8 nucléotides.
  5. 5. Récipient comprenant une étiquette moléculaire unique telle que définie dans l’une des revendications 1 à 4.
  6. 6. Echantillon à analyser comprenant une étiquette moléculaire unique telle que définie dans l’une des revendications 1 à 4.
    ‘
  7. 7. Echantillon selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il est choisi dans un groupe comprenant un échantillon destiné à une analyse biologique, un échantillon destiné à une analyse écologique, un échantillon destiné à une analyse médico-légale.
    5
  8. 8. Kit pour l’identification d’un échantillon à analyser, ledit kit comprenant une pluralité de récipients, chaque récipient comprenant une étiquette moléculaire unique selon l’une des revendications 1 à 4.
  9. 9. Procédé d’identification d’un échantillon à analyser comprenant les étapes suivantes :
  10. 10 a) disposer un échantillon dans un récipient approprié, lequel récipient comprend (i) une étiquette moléculaire unique selon l’une des revendications 1 à 4, et (ii) une marque d’identification lisible depuis l’extérieur du récipient;
    b) extraire les acides nucléiques totaux contenus dans ledit échantillon ;
    c) identifier l’étiquette moléculaire unique à partir de l’extrait obtenu à
  11. 15 l’étape b) ;
    d) disposer d’un support d’information spécifiant la correspondance entre (i) ladite étiquette moléculaire et (ii) ladite marque d’identification, et
    e) déterminer que l’identification de l’étiquette moléculaire unique correspond à la marque d’identification.
    10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l’échantillon contient en outre des acides nucléiques distincts de ladite étiquette moléculaire unique.
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