BR112015005911B1

BR112015005911B1 - Vetor de expressão e método para melhorar a produção de uma proteína recombinante em uma planta

Info

Publication number: BR112015005911B1
Application number: BR112015005911-2A
Authority: BR
Inventors: Freydoun Garbagi; Michael D. Mclean; Christopher J. Hall
Original assignee: University Of Guelph
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2022-07-12
Also published as: WO2014043786A1; US20160289692A1; US20140090108A1; MX2015003403A; AR092616A1; BR112015005911A2

Abstract

VETORES E MÉTODOS PARA MELHORAR A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM PLANTAS. São descritos vetores de expressão e métodos de uso dos mesmos para melhorar a produção de proteínas recombinantes em plantas ou células vegetais. A produção pode ser melhorada mediante coexpressão do supressor P19 de silenciamento de genes do tomato bushy stunt virus. De preferência, as proteínas recombinantes são enzimas terapêuticas e/ou anticorpos, e são realizados métodos em Nicotiana benthamiana- opcionalmente uma cepa glicomodificada baseada em RNAi - ou no cultivar de Nicotiana tabacum Little Crittenden.

Description

Campo da Divulgação

[0001] O presente pedido refere-se a um conjunto de vetores de expressão projetados para aumentar a produção de proteínas recombinantes em plantas e métodos para utilizar os mesmos.

Fundamentos da Divulgação

[0002] Os mecanismos de silenciamento de genes das plantas estão envolvidos na regulação da expressão dos genes endógenos transcritos, bem como na redução ou eliminação dos efeitos dos agentes patogênicos invasores, tais como vírus (Baulcombe, 2004; Reinhart et al, 2002). Como uma contramedida para esse mecanismo de defesa, os vírus codificam as proteínas que atuam como supressores de silenciamento de gene (SGS). A P19 do Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) é um exemplo de proteínas conhecidas por funcionar como um potente supressor de silenciamento de genes em plantas, bem como em animais (Scholthof, 2006; Voinnet et al., 1999). As plantas também reagem à maioria dos transgenes do DNA de transferência (T-DNA) que invadem seus genomas iniciando uma resposta de silenciamento de gene pós-transcricional (Baulcombe, 2004; Brodersen e Voinnet, 2006). O efeito inibitório da P19 na via de silenciamento dos genes tem sido explorado para melhorar os níveis de expressão de proteínas recombinantes em plantas (Voinnet et al., 2003), mas sua utilização tem sido limitada a expressão transiente, principalmente devido aos efeitos deletérios desta proteína quando expressa constitutivamente em níveis elevados em uma configuração transgênica (Siddiqui et al., 2008).

[0003] Existem dois principais mecanismos de silenciamento de gene celulares em plantas, as vias de silenciamento por RNA de interferência pequena (siRNA) e o micro RNA (miRNA) (Carthew e Sontheimer, 2009), que são coletivamente referidos como interferência de RNA (RNAi). Os dois sistemas mostram muita semelhança em seus mecanismos de ação, como eles compartilham algumas enzimas chaves (Brodersen and Voinnet, 2006). Ambos os sistemas identificam seu alvo de ácidos nucleicos (RNA viral, DNA virai, RNAm transgene, mRNA endógeno) por um complexo conhecido como complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). RISC carrega uma cadeia única complementar da sonda de RNA para seu alvo, que em cima da ligação, está bloqueada ou degradada.

[0004] O mecanismo de ação da P19 para suprimir o silenciamento de genes a nível molecular torna-se melhor compreendido nos últimos tempos (Burgyan et al., 2004), mas certos aspectos ainda permanecem obscuros. P19 é uma proteína multifuncional que é ativa como um dímero e encontrado no citoplasma e núcleo (Park et al., 2004). Ele é capaz de ligar as moléculas de siRNA e miRNA de forma não específica (Dunoyer et al., 2004). Desde que exista um aumento nos níveis de siRNA derivados de vírus em plantas em resposta à infecção (Scholthof et al., 1995), P19 atua para reduzir a quantidade de duplex do siRNA gratuito através da ligação não específica e reprime a resposta silenciosa, interferindo com o carregamento de siRNA de RISC (Hsieh et al., 2009). Estudos sobre os mutantes TBSV com níveis baixos da P19 têm demonstrado que uma alta concentração da proteína é fundamental para exercer a sua atividade biológica (Qiu et al., 2002; Scholthof et al., 1999). Apesar da ligação de siRNA inespecífica da P19, os efeitos provocados por esta proteína mostra a especificidade do hospedeiro (Ahn et al., 2011; Anjo et al, 2011; Siddiqui et al., 2008).

[0005] Espécies de nicotiana apresentam uma variação na indução da resposta hipersensível (HR) à proteína P19 do TBSV, que é indicado por uma descoloração da folha inicial que leva à necrose no local da infecção (Angel et al., 2011). No N. tabacum cv. Samsun, s descoloração do HR se desenvolve em 2-3 dias após infiltração de folhas com P19, levando a manchas totalmente desidratadas no dia 7, enquanto o mesmo tratamento rende sem necrose ou descoloração no N. benthamiana. A expressão transgênica estável da P19, no entanto, não elicia HR em qualquer N. tabacum cv. Xanthi ou N. benthamiana, indicando que uma concentração elevada da P19 é necessária para desencadear essa resposta (Siddiqui et al., 2008). A diferença do HR gerado no N. tabacum e N. benthamiana em resposta ao P19 tem sido atribuída a uma proteína do hospedeiro que é o produto de um gene de resistência putativa (R) (Jovel et al., 2011). O produto de gene putativo R é considerado para identificar P19 e desencadear uma cascata de eventos que levam à necrose local para retardar a propagação do vírus. Embora o produto do gene R que interage especificamente com P19 não foi identificado, as experiências mostram que a resistência conferida por este produto do gene é herdada de forma dominante (Jovel et al., 2011).

[0006] Na medida em que o P19 aumenta, a expressão parece variar para diferentes proteínas recombinantes. Vários relatos indicam que a expressão da Proteína Verde Fluorescente (GFP), comumente usado para informar, é aumentada cerca de 50 vezes quando é co-expressa com P19 (Voinnet et al., 2003; Zheng et al., 2009). Expressão de anticorpos e outras proteínas terapêuticas, por outro lado, apenas foram aprimoradas por cinco vezes (Saxena et al., 2011; Zheng et al., 2009).

[0007] No contexto das proteínas terapêuticas derivadas da planta, outra consideração muito importante é o seu perfil de glicano, desde que essa modificação pós-traducional impacta a eficácia das proteínas terapêuticas e pode ser um fator importante em lotes de variabilidade de proteínas terapêuticas recombinantes (Gomord et al, 2010; Schiestl et al., 2011). Resíduos de açúcar vegetal específico no núcleo de glicano N, designadamente de núcleo α1,3-fucose e β1,2-xilose, são imunogênicas em mamíferos (Bardor et al., 2003; Jin et al., 2008). Como resultado, uma grande quantidade de esforço tem sido direcionada para a criação de plantas com padrões de glicosilação modificados humanizados (Cox et al., 2006; Sourrouille et al., 2008; Strasseret al., 2008). Na maior parte, as plantas glicomodificadas foram criadas através de tecnologia silenciamento de RNAi, principalmente devido à existência fucosiltransferase de endógenos múltiplos e genes xilosiltransferase e na maioria das plantas (Cox et al., 2006; Sourrouille et al., 2008; Strasser et al., 2008). Consequentemente, a interferência na via siRNA por P19 torna-se uma preocupação quando fundamentos genéticos gerados por RNAi são para serem usados como expressão para produzir proteínas terapêuticas, especialmente desde que em um caso não relacionado, P19 foi mostrado para reprimir o knockdown de uma linha de transgênicos RNAi e previamente estabelecido (Ahn et al., 2011).

Resumo da Divulgação

[0008] Os inventores presentes projetaram e testaram um conjunto de vetores de expressão de planta que são apropriados para reforçar a expressão da proteína recombinante em expressão transiente e plantas transgênicas estáveis. A combinação única de promotor, 5' UTR e 3' UTR/terminador nestes níveis elevados de unidades de vetores da expressão heteróloga de proteínas em plantas, incluindo Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum.

[0009] Nesse sentido, o presente recurso fornece um vetor de expressão que compreende: (a) um promotor selecionado a partir (i) do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) ou (ii) do promotor do gene da pequena subunidade da ribulose bifosfato carboxilase (rbc) de Chrysanthemum morifoliunr, (b) uma região não traduzida 5’ (UTR) selecionada a partir (i) da 5' UTR 35S do CaMV ou (ii) da 5' UTR do gene da pequena subunidade da rbc subunidade pequena do gene de C. morífoliurrr, e (c) uma 3' UTR e sequência terminadora selecionadas a partir (i) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium, (ii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da osmotina (osm) de Oryza sativa, (iii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium ou (iv) de uma versão truncada, por 162 bp conforme definido por um local de reconhecimento de BspE\, da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium.

[0010] Em uma modalidade, uma sequência do ácido nucleico codificando uma proteína recombinante foi clonada em vetores acima mencionados.

[0011] O presente recurso adicional fornece um método de aprimorar a produção de uma proteína recombinante em uma planta compreendendo: (i) introduzir um vetor de expressão compreendendo (a) um promotor selecionado a partir (i) do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) ou (ii) do promotor do gene da pequena subunidade da ribulose bifosfato carboxilase (rbc) de Chrysanthemum morifolium', (b) uma região não traduzida 5’ (UTR) selecionada a partir do (i) 35S 5' UTR do CaMV ou (ii) da 5' UTR do gene da pequena subunidade da rbc subunidade pequena do gene de C. morifolium-, (c) uma 3' UTR e sequência terminadora selecionadas a partir (i) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium, (ii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da osmotina (osm) de Oryza sativa, (iii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium ou (iv) de uma versão truncada, por 162 bp conforme definido por um local de reconhecimento de BspE\, da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium-, e (d) uma sequência do ácido nucléico codificando uma proteína recombinante em uma planta ou uma célula vegetal; e (ii) o cultivo da planta ou a célula vegetal para obter uma planta que expresse a proteína recombinante.

[0012] Em uma modalidade, a proteína recombinante é co-expressa com o supressor P19 de silenciamento de genes da proteína do tomato bushy stunt virus (TBSV).

[0013] Outras características e vantagens da invenção atual serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve-se compreender, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, ao indicar as modalidades preferidas da invenção atual, estão apresentados por a ilustração somente, desde que as várias mudanças e modificações dentro do princípio e do escopo da invenção atual se tornarão aparentes àquelas pessoas versadas na técnica desta descrição detalhada.

Breve Descrição das Figuras

[0014] A Figura 1: Diagrama dos cassetes de expressão usada no Exemplo 1. Os cassetes de expressão mostrados aqui estavam situados na região do T-DNA de vetores binários. Vetor 102mAb foi o único vetor carregando as cadeias leves (LC) de trastuzumabe e pesados (HC) sobre o mesmo T-DNA. Quando expressar o Trastuzumabe com vetores 103mAb- 106mAb, o HC e LC foram co-expressos para produzir moléculas de IgG totalmente montadas.

[0015] A Figura 2: Análise Western blot de Trastuzumabe expressa transitoriamente com vetores de expressão diferente da planta em N. benthamiana. Expressão dos vetores 103-106mAb foi analisada durante 6 dias. As plantas foram tratadas pela infiltração de vácuo. Cada faixa representa uma amostra agrupada, criada através da mistura de três amostras de folha. Os vetores foram também expressos sozinhos (A), ou em conjunto com P19 (B). Todos os conjuntos de vetor carregavam os mesmos códigos para o HC e LC de Trastuzumabe juntamente com diferentes UTRs. Observaram-se diferentes expressões dinâmicas quando vetores foram expressos isoladamente ou em conjunto com P19, conforme determinado por ELISA (C).

[0016] A Figura 3: Análise Western blot de Trastuzumabe expresso transitoriamente com (A) 102mAb e com vetores de expressão (baseado no vírus) (B) TMV/PVX no N. benthamiana. As plantas foram tratadas por infiltração local. As amostras agrupadas foram geradas pela combinação de três manchas infiltradas. Duas amostras agrupadas (colhidas 5 DPI) são mostradas para cada tratamento. Semelhante ao 106mAb, co-expressão da P19 não afetou o nível de Trastuzumabe expresso com qualquer vetor.

[0017] A Figura 4: A análise Western blot mostrando o efeito dependente da dose da P19 relativo ao reforço da expressão de anticorpo recombinante no N. benthamiana. Os vetores 103mAb foram co-expressos com P19 em três diferentes concentrações de Agrobacterium, OD600= 0.2, 0,02 e 0,002. As plantas foram tratadas por infiltração local. As amostras agrupadas foram geradas pela combinação de três manchas infiltradas. Cada faixa representa uma amostra agrupada. O efeito estimulando o P19 foi mais proeminente quando aplicado na concentração mais elevada, independentemente da concentração de 103mAb. P19 não teve nenhum efeito de aumento na expressão de anticorpo quando aplicado no OD600= 0,002.

[0018] A Figura 5: Resposta diferencial de N. tabacum e N. benthamiana para P19. Análise Western blot, mostrando a expressão transiente de trastuzumabe sozinha ou em conjunto com P19 no N. benthamiana e cinco diferenças de cultivares N. tabacum (A) e cruzamento de N. tabacum (B). As plantas foram tratadas por infiltração local. Amostras foram agrupadas pela combinação de três manchas infiltradas. Cada faixa representa uma amostra agrupada. A co-expressão de 103mAb com P19 resultou em uma redução significativa na expressão de anticorpo em todos os cultivares de tabaco exceto no LCR. A diminuição na expressão de anticorpo indica um estado intensificado de silenciamento de RNAi. Cruzamento entre N. tabacum 1-64 e LCR, e N. benthamiana e N. tabacum e 1-64 (NBT) mostrou uma queda semelhante na expressão de anticorpo quando a P19 foi co-expressa com 103mAb (B). Todas as espécies de Nicotiana que apresentaram uma queda na expressão de anticorpo na presença da P19 também apresentaram descoloração no local devido à infecção, que conduzem à necrose cerca do dia 3 dias após a infecção (C). Imagens aqui mostram as manchas infiltradas em 5 dias após infecção. XAN, N. tabacum cv. Xanthi; PH, N. tabacum cv. Petite Havana H4; LCR, N. tabacum cv. Little Crittenden; BEN, N. benthamiana', NBT, N. benthamian x N. tabacum cv. I-64.

[0019] A Figura 6: Perfis de glicano N de 103mAb expresso no N. benthamiana WT (A) e em ΔXTFT sem (B) e (C) com P19 (C). Análises de glicano N foram realizadas por espectrometria de massa de ionização de cromatografia líquida de eletropulverização (LC-ESI-MS) de glicopeptídeos trípticos, como descrito anteriormente (Stadlmann et al., 2008; Strasser et al., 2008). Nota, que resultados incompletos de digestão tríptica na geração de dois glicopeptídeos que diferem por 482 Da. Glicopeptídeo 1 é indicado com asteriscos (*). Consulte http://www.proglycan.com para abreviações de glicano N.

[0020] A Figura 7: A co-infiltração transitória do vetor de expressão P19 realça extremamente da expressão de dois anticorpos mais terapêuticos na Nicotiana benthamiana. Sequências de codificação para anti-HIV mAb 4E10 e bevacizumabe foram infiltrados no local, com e sem P19, em tecido de folha de N.benthamiana e colhidas após 7 dias. Cada cepa de Agrobacterium foi aplicada em uma extremidade OD600 de 0,2. Colheitas do tecido para cada tratamento incluíam 3 ou 4 pontos, que foram agrupados e proteínas solúveis totais (TSP) foram extraídas, conforme descrito em Garabagi et al. (2012a,b). Um gel de SDS-PAGE com 10% de não reduçãofoi executado que incluiu 10μ g TSP para cada amostra da planta. Proteínas separadas eletroforeticamente foram posteriormente eletrotransferidas à membrana PVDF e analisadas com sondas de anticorpo anti-y e anti-K combinado de conjugadas para fosfatase alcalina (também descrita em Garabagi et al., 2012a). Os resultados indicam que essa co-expressão da P19 aumenta muito a expressão de ambos os anticorpos independentemente do vetor de expressão de anticorpo. O esquema de carregamento do gel é tabulado acima da imagem de immunoblot, e o tamanho de cada banda do marcador de peso molecular na faixa 1 é dado à esquerda em kDa. A quantificação de imunoglobulinas do soro humano padrão na pista 10 é 500 ng. mAb = anticorpo monoclonal; HC = vetor de cadeia pesada; LC = vetor de cadeia leve. Observe que o vetor p105T contém um 3' UTR truncado comparado com o vetor p105 original, com 162 menos pares de bases (bps) devido a uma exclusão de BspEI-BspEI.

[0021] A Figura 8: Expressão transitória da butirilcolinesterase humana (BChE) no N. benthamiana é bastante reforçada pela co-expressão da P19. Dois vetores de expressão BChE diferentes foram construídos em p105T: (1) com a sequência de sinal de quitinase básica (abc) de Arabidopsis e um sintético BChE da sequência otimizada para expressão em plantas de código referida como E2, ou seja, abc-BChE2; e (2) com a nativo humano BChE da sequência de sinal (hSS) e outro sintético BChE da sequência otimizada para expressão em plantas de código referido como E3, ou seja, hSS-BChE3. Estas foram introduzidas em todas as plantas de N. benthamiana pela infiltração do vácuo (Garabagi et al, 2012a,b), com ou sem o vetor de expressão P19 descrito neste pedido. As amostras foram colhidas em 5, 7 e 9 dias após a infiltração (DPI) e da atividade BChE foi medida por meio de ensaio Ellman (Ellman et al., 1961). Todas as barras de histograma apresentam valores de BChE no mg do tecido de folha BChE/kg, convertendo as medições da atividade para massa de enzima usar o fator de conversão da atividade específica de 718,3 unidades da atividade por mg de BChE determinado em Weber et al. (2010) . Observe que leituras do fundamento (como determinado com extratos das plantas não tratadas) tem sido subtraídas para a apresentação desses dados. As barras de histograma indicam a média da atividade BChE medida em 2 amostras de 2 plantas (total de 4 repetições de cada uma) com barras de erro padrão associadas.

[0022] A Figura 9: Diagrama de um dos cassetes de expressão usados na Figura 7 e na Figura 8. O cassete da expressão 105 mAb da Figura 1 é mostrado na parte superior da figura. Inserção de uma sequência de codificação para uma proteína recombinante para ser expressa em plantas é executada usando a endonuclease de restrição BspEI para ligadura da extremidade 3' do que a sequência de código, resultando em uma exclusão de 162 bp da extremidade 5' do Rbc 3' UTR e terminador. O resultante 105T (T=truncado) do cassete de expressão é mostrado na parte inferior da figura.

Descrição detalhada da divulgação

[0023] Como descrito anteriormente, os inventores presentes projetaram e testaram um conjunto de vetores de expressão da planta que são apropriados para reforçar a expressão da proteína recombinante nas plantas. A combinação única de promotor, 5' UTR e 3' UTR/terminador nestes níveis elevados de unidades de vetores da expressão heteróloga de proteínas em plantas, incluindo Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum.

I. Vetores de expressão

[0024] Em uma modalidade, o pedido fornece um vetor de expressão que compreende: (a) um promotor selecionado a partir (i) do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) ou (ii) do promotor do gene da pequena subunidade da ribulose bifosfato carboxilase {rbc) de Chrysanthemum morifolium; (b) uma região não traduzida 5’ (UTR) selecionada a partir (i) da 5' UTR 35S do CaMV ou (ii) da 5' UTR do gene da pequena subunidade da rbc subunidade pequena do gene de C. morifoliurrr, e (c) uma 3' UTR e sequência terminadora selecionadas a partir (i) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da nopalina sintase {nos) de Agrobacterium, (ii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da osmotina {osm) de Oryza sativa, (iii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium ou (iv) de uma versão truncada, por 162 bp conforme definido por um local de reconhecimento de BspEI, da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium.

[0025] Como usado aqui, o termo "expressão vetorial" significa que uma molécula de ácido nucleico, como um plasmídeo, compreendendo elementos reguladores e um sítio para a introdução de DNA transgênico, que é usado para introduzir o referido DNA transgênico que está numa célula hospedeira. O DNA transgênico pode codificar uma proteína heteróloga, que pode ser expresso em e isolada de células vegetais.

[0026] Os elementos reguladores incluem promotores, 5' e 3' não regiões não traduzidas (UTRs) e sequências terminadoras ou truncamentos respectivos. Os elementos normativos da presente invenção podem ser selecionados do promotor 35S e 5' UTR do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV; adesão Genbank: AF140604), o promotor e 5' UTR ribulose bisfosfato carboxilase {rbc) gene de pequena subunidade de Chrysanthemum morifolium (adesão Genbank: AY163904.1), o promotor de choque térmico (Hsp81.1) de Arabidopsis thaliana, a 3' UTR e sequências terminadoras do gene de nopalina síntese {nos) do Agrobacterium (adesão Genbank: V00087.1), a 3' UTR e sequências terminadoras do gene de osmotina {osm) do Oryza sativa (adesão Genbank: L76377.1) e os 3' UTR e sequências de terminações do gene rbc de C. morifolium. Em uma modalidade, o promotor de Hsp81.1 de Arabidopsis é colocado diretamente acima de um dos outros promotores.

[0027] Em uma modalidade, o vetor de expressão compreende o promotor 35S do CaMV, operacionalmente ligado ao 35S 5' UTR de CaMV e a sequência terminadora 3' UTR do gene nos de Agrobacterium. Esse vetor de expressão também pode ser referido como p103.

[0028] Em outra modalidade, o vetor de expressão compreende o promotor 35S do CaMV, operacionalmente ligado ao 35S 5' UTR de CaMV e a sequência terminadora 3' UTR dos osm do gene de Oryza sativa. Esse vetor de expressão também pode ser referido como p104.

[0029] Em outra modalidade, o vetor de expressão compreende o promotor 35S do CaMV, operacionalmente ligado ao 35S 5' UTR de CaMV e a sequência terminadora 3' UTR do gene da subunidade pequena rbc de C. morifolium. Esse vetor de expressão também pode ser referido como p105.

[0030] Em outra modalidade, o vetor de expressão compreende o promotor 35S do CaMV, operacionalmente ligado a 35S 5' UTR de CaMV e uma versão truncada, por 162 bp conforme definido por um BspE\ reconhecimento local, da sequência terminadora e 3' UTR do gene de pequena subunidade rbc de C. morifolium. Esse vetor de expressão também pode ser referido como p105T.

[0031] Em outra modalidade, o vetor de expressão compreende o promotor do gene da subunidade pequena rbc de C. morifolium, operacionalmente ligadas para o 5' UTR do gene da subunidade pequena rbc de C. morifolium e a sequência terminadora 3' UTR do gene da subunidade pequena rbc de C. morifolium. Esse vetor de expressão também pode ser referido como p106.

[0032] Como usado aqui, o termo "molécula de ácido nucleico" designa uma sequência de nucleosídeo ou nucleotídeo monômeros consistindo de bases de ocorrência natural, ligações de açúcares e intersugar (estrutura). O termo também inclui sequências modificadas ou substituídas, compreendendo a ocorrência de monômeros ou partes não naturais deles. As sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser sequências de ácido desoxirribonucleico (DNA) ou sequências de ácido ribonucleico (RNA) e podem incluir a ocorrência natural de bases incluindo adenina, guanina, citosina, timidina e uracil. As sequências podem conter bases modificadas. Exemplos de tais bases modificadas incluem aza e deaza adenina, guanina, citosina, timidina e uracila; e xantina e hipoxantina.

[0033] Em uma modalidade, o pedido fornece um vetor de expressão que compreende: (d) um promotor selecionado a partir (i) do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) ou (ii) do promotor do gene da pequena subunidade da ribulose bifosfato carboxilase {rbc) de Chrysanthemum morifoliunr, (e) uma região não traduzida 5’ (UTR) selecionada a partir do (i) 35S 5' UTR do CaMV ou (ii) da 5' UTR do gene da pequena subunidade da rbc subunidade pequena do gene de C. morifoliunr, (f) uma 3' UTR e sequência terminadora selecionadas a partir (i) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da nopalina sintase {nos) de Agrobacterium, (ii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da osmotina {osm) de Oryza sativa, (iii) da 31 UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium ou (iv) de uma versão truncada, por 162 bp conforme definido por um local de reconhecimento de BspE\, da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium e (g) uma sequência do ácido nucleico codificando uma proteína recombinante.

[0034] Como usado neste documento, o termo "proteína recombinante" significa qualquer polipeptídeo que pode ser expresso em uma célula vegetal, no qual disse polipeptídeo é codificado pelo DNA transgênico introduzido na célula da planta através do uso de um vetor de expressão. Em uma modalidade preferencial, o vetor de expressão é p103. Em outra modalidade preferencial, o vetor de expressão é p105 ou p105T.

[0035] Em uma modalidade, a proteína recombinante é um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em uma modalidade específica, o anticorpo é trastuzumabe ou uma forma modificada, composta por 2 cadeias pesadas (HC) e 2 cadeias leves (LC). Trastuzumabe (Herceptin® Genentech Inc., San Francisco, CA) é um anticorpoK imunoglobulina G1K de murino humanizado que é usado no tratamento do câncer de mama metastático.

[0036] Em outra modalidade específica, o anticorpo é bevacizumabe ou uma forma modificada, composta por 2 cadeias pesadas (HC) e 2 cadeias leves (LC). Bevacizumabe (nome comercial Avastin, Genentech/Roche) é um inibidor de angiogênese, uma droga que retarda o crescimento de novos vasos sanguíneos. É licenciado para tratar de vários cânceres, incluindo colorretal, pulmão, mama, glioblastoma, rim e ovário.

[0037] Em outra modalidade específica, a proteína recombinante é uma enzima como uma enzima terapêutica. Em uma modalidade específica, a enzima terapêutica é butirilcolinesterase. Butirilcolinesterase (também conhecido como pseudocolinesterase, colinesterase do plasma, BCHE ou BuChE) é uma enzima colinesterase inespecífica que hidrolisa muitos ésteres de colina diferente. Nos humanos, é encontrado principalmente no fígado e é codificado pelo gene BCHE . Está sendo desenvolvido como um antídoto para o envenenamento por gás dos nervos.

[0038] As moléculas do ácido nucleico codificam o HC e LC de um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou a sequência de codificação de uma enzima terapêutica pode ser incorporada separadamente em cada expressão de vetor ou incorporados juntos em um vetor de expressão única, compreendendo vários cassetes de expressão.

[0039] Como usado aqui, o termo "cassete de expressão" significa um conjunto único, operacionalmente vinculado de elementos reguladores que inclui um promotor, uma 5' UTR, um sítio de inserção de DNA transgênico, um 3' UTR e uma sequência do terminador.

[0040] Como usado neste documento, o termo "fragmento de anticorpo" inclui, sem limitação, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicorpos, diacorpos e respectivos e fragmentos de anticorpos biespecíficos.

[0041] Em uma modalidade, um sinal de peptídeo que direciona que o polipeptídeo à via secretora das células vegetais pode ser colocado na terminal amino das proteínas recombinantes, incluindo anticorpos HCs e/ou LCs. Em uma modalidade específica, o Arabidopsis thaliana do peptídeo de sinal de quitinase básica (SP), ou seja, MAKTNLFLFLIFSLLLSLSSA (SEQ ID NO:2), é colocado no terminal amino(N-) de ambos HC e LC (Samac et al., 1990).

[0042] Em outra modalidade, o peptídeo de sinal nativo butirilcolinesterase humano (SP), ou seja MHSKVTIICIRFLFWFLLLCMLIGKSHT SEQ ID NO:3, são colocada no terminal amino (N-) de uma enzima terapêutica como butirilcolinesterase (GenBank: AAA99296.1).

[0043] Outros sinais de peptídeos podem ser extraídos de GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/] ou outros tais bancos de dados, e suas sequências adicionadas para o terminal N do HC ou LC, sequências de nucleotídeos para estes sendo otimizado para planta preferida dos códons conforme descrito acima e então sintetizados. A funcionalidade de uma sequência de SP pode ser prevista usando freeware online, tais como o programa SignalP [http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/],

[0044] Em uma modalidade específica, o ácido nucleico constrói proteínas recombinantes de codificação, incluindo anticorpos HCs e/ou LCs e proteínas terapêuticas, tais como as enzimas são otimizadas para uso do códon da planta. Em particular, a sequência do ácido nucleico de codificação da cadeia pesada e a cadeia leve podem ser modificadas para incorporar códons da planta preferida. Em uma modalidade específica, sequências de codificação para o HC e LC, incluindo o SP em ambos os casos, foram otimizados para expressão em espécies de Nicotiana. O primeiro objetivo deste procedimento foi tornar as sequências de codificação mais semelhantes das espécies de Nicotiana. Otimizações dos códons foram executadas utilizando freeware online, ou seja, o programa Protein Back Translation (Entelchon) e de sequência de codificação preferências de Nicotiana. Assim, foram incorporados os códons com as mais altas frequências para cada aminoácido em espécies de Nicotiana (Nakamura, 2005). Além disso, potenciais intervenientes da sequência do aceptor do sítio splice e motivos do doador foram identificados (Shapiro et al., 1987; CNR National Research Council) e posteriormente removido por substituição com nucleotídeos que resultou em codificação dos códons dos mesmos aminoácidos. Sequências de repetição invertidas foram analisadas usando o pacote de software de estrutura secundária Genebee RNA (Brodsky et al.; GeneBee Molecular Biology Server); nucleotídeos foram alterados para reduzir a energia livre (quilocalorias por mol) do potencial de estrutura secundária, mantendo a sequência do polipeptídeo. Do mesmo modo, elementos repetidos foram analisados (CNR National Research Council) e substituídos quando presentes. Sítios potenciais de metilação (ou seja, CXG e CpG; Gardiner-Garden et al.) foram substituídos, sempre que possível e sempre sem alterar a sequência dos aminoácidos codificados. Um sítio de início de tradução Kozak (Kozak, 1984) otimizado foi projetado. Sítios de poliadenilação de planta (ou seja, AATAAA, AATGAA, AAATGGAAA e AATGGAAATG; Li et al.; Rothnie) e elementos de instabilidade do ATTTA RNA (Ohme-Takagi et al.) foram igualmente evitadas.

[0045] Os genes marcadores selecionáveis também podem ser vinculados ao T-DNA, tais como o gene de resistência à canamicina (também conhecido como gene de neomicina fonfatase II, ou nptll), gene de resistência à Basta, gene de resistência de à higromicina ou outros.

II. P19 supressor de silenciamento

[0046] Em uma modalidade a proteína recombinante, como um anticorpo ou enzima terapêutica, é co-expressa com a proteína P19 do Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV; Adesão do GenBank: M21958). Em uma modalidade preferencial, a proteína P19 do TBSV expressa de uma molécula de ácido nucleico, que foi modificada para aperfeiçoar os níveis de expressão em plantas de tabaco. Em uma modalidade específica, a molécula de ácido nucleico de codificação da P19 modificada tern a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1.

[0047] Em uma modalidade, o ácido nucleico de codificação P19 é incorporado em um dos vetores de expressão da presente invenção. Em uma modalidade preferencial, o vetor de expressão é p103, p105 ou p105T.

[0048] A proteína P19 pode ser expressa de um vetor de expressão, compreendendo um cassete de expressão único ou de um vetor de expressão que contém um ou mais cassetes adicionais, no qual um ou mais cassetes adicionais compreendem codificação de DNA transgênico de uma ou mais proteínas recombinantes.

III. Método de transformação de plantas

[0049] Os inventores têm demonstrado que eles podem alcançar altos níveis de expressão de proteínas recombinantes usando os vetores descritos neste documento.

[0050] Consequentemente, o presente recurso adicional fornece um método de aprimorar a produção de uma proteína recombinante em uma planta compreendendo: (i) introduzir um vetor de expressão compreendendo (a) um promotor selecionado a partir (i) do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) ou (ii) do promotor do gene da pequena subunidade da ribulose bifosfato carboxilase (rbc) de Chrysanthemum morifolium-, (b) uma região não traduzida 5’ (UTR) selecionada a partir do (i) 35S 5' UTR do CaMV ou (ii) da 5' UTR do gene da pequena subunidade da rbc subunidade pequena do gene de C. morifolium-, (c) uma 3' UTR e sequência terminadora selecionadas a partir (i) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium, (ii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da osmotina (osm) de Oryza sativa, (iii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium, ou (iv) uma versão truncada, por 162 bp conforme definido por um local de reconhecimento de BspE\, da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium-, e (d) uma sequência do ácido nucléico codificando uma proteína recombinante em uma planta ou uma célula vegetal; e (ii) o cultivo da planta ou a célula vegetal para obter uma planta que expresse a proteína recombinante.

[0051] Em uma modalidade, a proteína recombinante é a proteína heteróloga apenas expressa na planta ou célula vegetal. Em uma modalidade preferencial, a proteína recombinante é co-expressa com a proteína P19 do TBSV. Os vetores de expressão e proteína P19 para expressá-los são descritos acima.

[0052] Em uma modalidade, a proteína recombinante é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve. Em uma modalidade específica, o anticorpo é Trastuzumabe. Em outra modalidade específica, o anticorpo é bevacizumabe.

[0053] Em outra modalidade específica, a proteína recombinante é uma enzima como butirilcolinesterase.

[0054] Em uma modalidade, a molécula de codificação do ácido nucleico da região variável da cadeia pesada e a molécula de codificação do ácido nucleico da região variável da cadeia leve podem ser introduzidas na célula vegetal nos vetores de expressão separados. Em outra modalidade, a molécula de codificação do ácido nucleico da região variável da cadeia pesada e a molécula de codificação do ácido nucleico da região variável da cadeia leve podem ser introduzidas na célula vegetal sobre o mesmo vetor de expressão. Em tal modalidade, cadeia pesada e a cadeia leve seriam expressas separadamente em então combinariam na célula vegetal, a fim de preparar o anticorpo desejado ou fragmento de anticorpo.

[0055] “A frase “introduzir” um vetor de expressão em uma planta ou uma célula vegetal” inclui ambas a integração estável da molécula do ácido nucleico recombinante no genoma de uma célula vegetal para preparar uma planta transgênica, bem como a integração transitória do ácido nucleico recombinante em uma planta ou parte dela.

[0056] Os vetores de expressão podem ser introduzidos na célula vegetal utilizando técnicas conhecidas da técnica, incluindo, sem limitação, eletroporação, um método de entrega de partícula acelerada, um método de fusão celular, ou por qualquer outro método para entregar os vetores de expressão para uma célula vegetal, incluindo a entrega mediada por Agrobacterium , ou outra entrega bacteriana como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti e Mesorhizobium loti (Chung et al, 2006).

[0057] A célula vegetal pode ser qualquer célula vegetal, incluindo, sem limitação, as plantas do tabaco, as plantas de tomate, plantas do milho, plantas de alfafa, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Nicotiana tabacum do cultivo cv. Little Crittenden, plantas de arroz, Lemnas grandes ou Lemnas menores (duckweeds), plantas de cártamo ou quaisquer outras plantas que são agriculturalmente propagadas e passíveis de modificação genética para a expressão de proteínas recombinantes ou estrangeiras.

[0058] Em uma modalidade, a proteína recombinante é expressa transitoriamente, com ou sem P19, em N. benthamiana. Em outra modalidade, a molécula de codificação do ácido nucleico da proteína recombinante é integrada no genoma de uma planta de N. tabacum, que pode ser usada posteriormente para expressão transgênica. Em uma modalidade preferencial, a planta de N. tabacum é do cultivo cv. Little Crittenden (LCR) e a proteína recombinante são co-expressas com P19. Conforme descrito no exemplo 1, LCR foi o único cultivo identificado que não induz resposta hipersensível (HR), na presença da P19. Este cultivo de tabaco, portanto, pode ser utilizado eficazmente em conjunto com sistemas de expressão transgênica com base na P19.

[0059] Em uma modalidade, a proteína recombinante e a P19 são co- expressas em uma planta de tabaco de glicomodificado baseado em RNAi. Em uma modalidade preferencial, a planta é uma planta de N. benthamiana. Em uma modalidade mais preferida a planta de N. benthamiana exibe os genes de silenciamento induzido por RNAi dos endógenos fucosiltransferase (FT) e xilosiltransferase (XT) genes. Conforme mostrado no Exemplo 1, P19 pode com segurança ser usado com glicomodificado com base no RNAi N. benthamiana hospedeiros da expressão para a produção de proteínas recombinantes, tais como anticorpos sem alterar o perfil glicano da proteína recombinante.

[0060] Como usado aqui, a frase "planta do tabaco glicomodificada com base no RNAi" significa uma planta de tabaco que expressa polipeptídeos com perfis de glicano alterado, no qual o resultado de perfis alterados do uso da tecnologia de silenciamento de genes de RNA (RNAi) interferente. Resíduos de açúcar vegetal específico no núcleo de glicano N, designadamente de núcleo α1,3-fucose e β1,2-xilose, são imunogênicas em mamíferos (Bardor et al., 2003; Jin et al., 2008). Devido à existência de múltiplos endógenos de genes FT XT e na maioria das plantas, padrões de glicosilação modificados de preferência são criados com o uso da tecnologia de RNAi (Cox et al., 2006; Sourrouille et al., 2008;Strasser et al., 2008).

[0061] A frase "crescimento de uma planta ou célula vegetal para obter uma planta que expressa uma proteína recombinante" inclui tanto crescimento de células de plantas transgênicas em uma planta madura, bem como crescimento ou cultivo de uma planta madura que tem recebido as moléculas de codificação do ácido nucleico da proteína recombinante. Um dos versados na técnica prontamente pode determinar as condições de crescimento adequado em cada caso.

[0062] Em uma modalidade específica, vetores de expressão contendo as moléculas de ácidos nucleicos recombinantes da cepa A. tumefaciens são introduzidos por procedimentos de eletroporação. As plantas de N. benthamiana podem ser vácuo infiltrado de acordo com o protocolo descrito por Marillonnet et al. (2005) e Giritch et al. (2006) with several modifications. Brevemente, todas as culturas podem ser crescidas à 28° e 220 rpm para uma densidade final ótica em 600 nm (OD600) de 1.8. Volumes iguais são combinados e peletizados por centrifugação a 8.000 rpm durante 4 minutos, ressuspensos e diluídos por 103 no tampão de infiltração do ácido (10 mM 1-(/\/.- Morfolinos)etanosulfônico (MES) pH 5.5, 10 mM de MgSO4). Alternativamente, cada uma das 5 culturas Agrobacterium podem ser crescidas para valores OD inferiores, e a lei de Beer poderia ser aplicada para determinar os volumes de cada cultura necessária para fazer uma suspensão do coquetel bacteriano, segundo a qual as concentrações de todas as cepas bacterianas foram equivalentes. Alternativamente, menores ou maiores concentrações dos vetores de expressão poderiam ser usadas para aperfeiçoar a expressão da proteína recombinante. Alternativamente, poderiam ser usadas diluições superiores ou inferiores com tampão de infiltração.

[0063] As partes aéreas de seis semanas de idade das plantas /V. benthamiana estão submersas em uma câmara contendo a ressuspensão Agrobacterium tumefaciensde solução, após o qual um vácuo (0,5 a 0,9 bar) é aplicado por 90 segundos, seguidos por uma liberação lenta do vácuo, depois que as plantas foram devolvidas para a estufa por 8 dias antes de serem colhidas. Alternativamente, períodos mais longos ou mais curtos, sob vácuo, e/ou vácuo lançamento, poderia ambos/ou/e serem usados. Alternativamente, poderiam ser usados em períodos mais longos ou mais curtos do crescimento na estufa. Alternativamente, poderia ser usado um padrão de horticultura aprimorada do crescimento, maximizada para a produção de proteína recombinante (ver Colgan et al., 2010).

[0064] Alternadamente, em vez da introdução transitória da expressão vetores contendo a codificação de HC e LC das sequências de um anticorpo, ou a sequência de codificação da butirilcolinesterase, plantas transgênicas estáveis poderiam ser produzidas usando um vetor no qual a molécula de codificação do ácido nucleico da região variável da cadeia pesada e a molécula de codificação do ácido nucleico da região variável da cadeia leve podem ser introduzidas juntas no mesmo construto. Em uma modalidade, a molécula de codificação do ácido nucleico da região variável da cadeia pesada pode ser ligada à molécula de codificação do ácido nucleico da região variável da cadeia leve de um ligador para preparar um fragmento de região variável de cadeia única (scFv).

[0065] Em outra modalidade, a molécula de codificação do ácido nucleico da cadeia pesada e a molécula de codificação do ácido nucleico da cadeia leve podem ser introduzidas na célula vegetal nos construtos do ácido nucleico do vetor de expressão separados. Em tal modalidade, cadeia pesada e a cadeia leve seriam expressas do loci transgênicos separados e então combinam na célula vegetal, a fim de preparar o anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[0066] Vetor(s) de expressão que contém genes HC e LC do anticorpo será introduzido em Agrobacterium tumefaciens At542 ou outras apropriadas isoladas Agrobacterium ou outras espécies bacterianas adequadas capazes de introduzir DNA às plantas para transformação como Rhizobium sp., Sinorhizobium meliloti, Mesorhizobium loti e outras espécies (Broothaerts et al. 2005; Chung et al., 2006), por eletroporação ou outros procedimentos de transformação bacteriana. Os clones Agrobacterium contendo vetores de expressão iriam ser propagados em placas de Luria- Bertani (LB) contendo rifampicina (30 mg/l) e canamicina (50 mg/l) ou outros meios selecionáveis, dependendo da natureza dos genes dos marcadores selecionáveis no vetor. Transformação de Agrobacterium mediada de disco de folha (Horsch et al. 1985; Gelvin, 2003), ou protocolos semelhantes envolvendo tabaco ferido (/V. tabacum, variedade 81V9 ou tecido de outras variedades de tabacos como aquelas listadas em Conley et al., 2009) ou N. benthamiana ou outras espécies de plantas como a das Solanáceas, milho, cártamo, Lemna spp., etc. poderia estar infectado com a cultura Agrobacterium (OD600 = 0,6) e plaqueada no Murashige e Skoog mais meias vitaminas (MS; Sigma), suplementada com ágar (5,8%; Sigma) e contendo canamicina (100 mg/l) ou cefotaxima 500 (mg/L) ou outros meios selecionáveis, dependendo da natureza dos genes de marcadores selecionáveis no vetor de expressão, para a seleção das células vegetais transformadas. Produção de brotos iria ser induzida com naftaleno acético (NAA; 0,1 mg/l; Sigma) e adenina benzílico (BA; 1 mg/l; Sigma) no meio. Para indução de raízes, os brotos recém-formados foram transferidos para caixas Magenta (Sigma-Aldrich, Oakville, ON) no meio de MS (como acima) que estava faltando NAA e BA. Depois se formam raízes, as plantas poderiam ser transplantadas para o solo em podem ser geradas em cultura de estufa. Para a transformação da planta, o maior número possível ou pelo menos 25 das plantas transgênicas primárias seriam produzidas. ELISA e immunoblots quantitativos seriam realizados em todas as plantas para caracterizar os níveis totais e anticorpos ativos produzidos pelas plantas, respectivamente (Almquist et al., 2004; 2006; McLean etal., 2007; Olea- Popelka et al., 2005; Makvandi-Nejad et al., 2005).

[0067] Após a seleção das plantas transgênicas primárias expressando anticorpo, ou simultâneas com seleção das plantas expressando anticorpo, a derivação de linhas homozigotas estáveis das plantas transgênicas seria realizada. Plantas transgênicas primárias seriam crescidas até à maturidade, permitida para autopolinizar, e produzir sementes. Homozigotia seria verificada pela observação de resistência de 100% de mudas em placas de canamicina (50 mg/L), ou outra droga selecionável como indicado acima. Uma linha homozigota com inserções de T-DNA únicas, que são mostradas por análise molecular para produzir a maioria das quantidades dos anticorpos, seriam escolhidas para reprodução da homozigotia e produção de sementes, garantindo fontes subsequentes de sementes para produção homogênea de anticorpo pela cultura transgênica ou geneticamente modificada estável (Olea-Popelka et al., 2005; McLean et al., 2007; Yu et al., 2008).

[0068] Alternativamente, o vetor de expressão com genes tanto HC e LC, ou 2 vetores de expressão (aquele com um gene HC e outro com um gene LC), poderiam ser usados para transitoriamente infectar uma planta, ou tecidos de planta, como descrito acima, e tecidos colhidos como descrito acima para purificação subsequente do anticorpo.

[0069] O anticorpo ou fragmento do anticorpo ou a enzima pode ser purificada ou isolada das plantas usando técnicas conhecidas na técnica, incluindo a homogeneização, clarificação do homogeneizado e purificação de afinidade. Homogeneização é qualquer processo que esmaga ou rompe- se a fábrica de tecidos e células e produz líquidos homogêneos de tecidos vegetais, tais como usando um liquidificador ou espremedor, ou moedor ou pulverizador como almofariz e pilão, etc. Esclarecimento envolve ou/e/ou centrifugação, filtração, etc. Purificação da afinidade usa a Proteína A ou Proteína G ou Proteína L ou anticorpos que se ligam a anticorpos; purificação da afinidade por enzimas usa ligantes que se ligam a eles, como procainamida ou huprina.

[0070] Os exemplos a seguir não limitantes são ilustrativos da presente invenção:

EXEMPLO 1 Procedimentos Experimentais Vetores de Expressão da Planta

[0071] Quatro cassetes de expressão, ou seja, 103-106, foram sintetizados e clonados na região de plCH14011 de T-DNA criando plasmídeos p103-p106 para a produção de proteínas recombinantes nas espécies de Nicotiana. As estruturas de cassetes de expressão são descritas na Figura 1. Cassetes de expressão 103-105 contêm o promotor 35S e 5' UTR do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV; Adesão do GenBank: AF140604), enquanto 106 contêm o promotor e 51 UTR ribulose bisfosfato carboxilase {rbc) gene de subunidade pequena Chrysanthemum morifolium (Adesão do GenBank: AY163904.1). Cassete 103 contém as 3' UTR e sequências terminadoras do gene de nopalina sintase {nos) de Agrobacterium (Adesão do GenBank: V00087.1), cassete 104 contém o 3' UTR e sequências terminadoras do gene de osmotina {osm) do Oryza sativa (Adesão do GenBank: L76377.1), e cassetes 105 e 106 carregam o 3' UTR e sequências terminadoras do gene de rbc do C. morifolium (Adesão do GenBank: AY163904.1). As estruturas de outro cassete de expressão são retratadas na Figura 9. Este cassete de expressão foi derivado de p105 pela inserção de uma sequência de codificação para uma proteína recombinante ser expressa em plantas usando a endonuclease de restrição BspE\ para ligadura da extremidade 3' do que a sequência de código, resultando em uma exclusão de 162 bp da extremidade 5' do Rbc 3' UTR e terminador. O plasmídeo resultante é conhecido como p105T.

[0072] A proteína P19 de Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV; Adesão do GenBank: M21958) foi clonado no cassete 103. As cadeias pesadas e leves de trastuzumabe (Grohs et al, 2010) foram clonadas separadamente em cassetes de expressão 103-106. As cadeias pesadas e leves foram ambas fundidas para a sequência do sinal do gene de quitinase básica do Arabidopsis thaliana (Adesão de Genbank: AY054628) para secreção para o apoplasto. Todas as sequências das proteínas foram otimizadas do códon para expressão emN. benthamiana. A molécula de codificação do ácido nucleico otimizada do códon P19 tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1. As cadeias pesadas e leves de trastuzumabe também foram clonadas em um único vetor binário, designado como 102mAb, em que a cadeia pesada foi impulsionada pelo promotor deactin2de Arabidopsis thaliana (Adesão Genbank: NM_112764) com A. thaliana actin2 UTRs e região do terminador, e a cadeia leve conduz pela octopina quimérica e promotor de mannopine sintase (Adesão Genbank: EU181146.1) com UTRs e região do terminador do gene deA thaliana ubiquitin 10 (ubq10) (Adesão Genbank: L05361).

Cultura e Transformação Bacteriana

[0073] As células do Competente Agrobacterium tumefaciens A136 foram transformadas com os cassetes de expressão acima mencionados por um método padrão de choque térmico. Culturas bacterianas foram crescidas durante a noite a 28°C em meio YEP (10 g Bacto peptona, 10 g de extrato de levedura, e 5 g de cloreto de sódio por litro, pH 7,0) suplementado com antibióticos. A menos que indicado o contrário, culturas durante as noites densas (até OD600= 2.5) para cada vetor foram ajustados para um OD600 de 0.2 no tampão de infiltração por Agro (AIB) contendo 10 mM de ácido 2-(4-morfolino)-etanesulfónico (MES), 10 mM MgSO4, pH 5,5 e misturados juntos para criar um coquetel de infiltração Agrobacterium (AIC) para o tratamento de plantas.

Expressão Transiente do Ensaio e Preparação da Amostra

[0074] As plantas foram cultivadas em estufa e alimentadas com fertilizante de nitrato elevado (N:P:K = 20:08:20) diariamente a 1 g/l (Produtos Vegetais, Brampton, Ontario, Canada), ajustado ao pH 6.0 com 20% H3PO4. Para trastuzumabe transitoriamente expressar, um AIC contendo duas cepas de Agrobacterium, cada uma abrigando uma das cadeias de anticorpo, foram utilizadas para se infiltrarem nas folhas de plantas. Todas as plantas foram tratadas na fase de 4 a 6 semanas, ou por infiltração no local ou na planta inteira. Logo após o tratamento, as plantas foram colocadas em estufa por um determinado período de colheita, dependendo do vetor de expressão antes do tempo. Durante este período, as plantas foram alimentadas apenas com água. Quando a colheita inteiramente se infiltrou nas plantas, folhas que surgiram recentemente foram descartadas e as folhas infiltradas foram separadas das hastes e armazenadas a -80 0 C até 0 processamento adicional. Para detectar as infiltrações, 100 mg de tecido de folha da área infiltrada foi pesado e armazenado a -80 0 C até 0 processamento adicional.

[0075] Aproximadamente 100 mg do tecido de folha foram misturados com 300 μl de tampão de extração, contendo tampão de fosfato salino (PBS: 8 g NaCI, 0.2 g KCI, 1.44 g Na2HPO4, e 0.24 g KH2PO4 por litro) e 10mM EDTA, pH 6.8 (tampão de PBSE). As amostras foram interrompidas em um tubo de microcentrífuga de 2 ml contendo dois rolamentos de esferas de aço inoxidável por 5 minutos, usando um TissueLyser (Qiagen) para preparar um extrato da proteína bruta, que foi aliquotado em pequenos volumes e armazenado a -20°C.

Western Blotting

[0076] A alíquota congelada foi descongelada e girada em uma centrífuga de bancada refrigerada em >13.000 rpm por 1 minuto para esclarecer o extrato bruto para quantificação da proteína. Um ensaio BCA (Pierce) ou um Bradford foi usado para determinar a concentração de proteína dos extratos brutos uma vez descongelados. 30 μg de proteínas solúveis totais (TSP) por amostra foi carregada em cada poço em um gel de poliacrilamida de SDS de 8%. As proteínas separadas foram destruídas em uma membrana de (PVDF) de fluoreto de polivinilideno e sondadas pela presença do anticorpo com uma mistura de fosfatase alcalina conjugada do anti-humano y θ anticorpos K (Sigma Aldrich, Cat# A3312 e A3813), diluído em 1:10,000 em PBS (pH 7.4), usando NBT/BCIP (Thermo Scientific, Cat# 34042) como substrato. Os borrões foram desenvolvidos por 2-5 minutos, dependendo da experiência.

ELISA

[0077] Ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) foi usado para dosar a quantidade dos anticorpos presentes no extrato de proteína bruta das plantas tratadas. Placas de ELISA foram revestidas a noite a 4°C, com um camundongo policlonal do anti-humano lgG1 (Sigma-Aldrich, Cat# I5885) captura o anticorpo em 0,6 μg/ml de PBS. Padrão Humano de lgG1 (Atenas de Pesquisa e Tecnologia, Cat# 16-16-090707) cravado em 5 pg do extrato de proteína bruta não tratada foi usado como um padrão. A curva padrão foi gerada usando lgG1 humana, o que permitiu para a detecção do anticorpo em um intervalo que abrange três ordens de magnitude (0,1-100 ng/poço). Extrato bruto de cada amostra tratada foi carregado em uma placa de ELISA como duas diluições em triplicado. Concentração de anticorpos finais foi calculada pela média da concentração de anticorpos médios para três diluições do extrato bruto. Um segundo anticorpo anti- humano conjugado com HRP de coelho (Abeam, Cat # ab6759) foi usado para detecção, usando TMB-ELISA (Thermo Scientific, Cat # 34022) como substrato. As placas foram autorizadas a desenvolverem durante 15 minutos antes que a reação fosse interrompida com 0,5 M H2SO4.

Purificação do Anticorpo

[0078] Anticorpos foram purificados essencialmente conforme descrito por Grohs et al. (2010).

Análises de glicosilação N

[0079] Realizaram-se análises de glicano N de mAbs purificadas por cromatografia líquida de eletropulverização da espectometria em massa por ionização (LC-ESI-MS) de glicopeptídeos de trípticos recentemente descritos (Stadlmann et al., 2008). Brevemente, as amostras purificadas foram submetidas à redução de SDS PAGE e a banda de 55 kD correspondente para que o HC fosse cortado do gel, alquilados S, digerido com tripsina, eluído do fragmento de gel com 50% acetonitril e separados em uma coluna Biobasic C18 (150 x 0.32 mm, Thermo Electron) com um gradiente de 1 %-80% de acetonitrila contendo 65 mM de formiato de amónio pH 3.0. Os íons positivos foram detectados com um espectrômetro de massa Q TOF Ultima Global (Águas, Milford, MA, EUA). Os espectros somados e deconvoluídos do intervalo de eluição de glicopeptídeos foram utilizados para a identificação de glicoformas. Esse método gera dois glicopeptídeos que diferem por 482 Da (glicopeptídeo 1, EEQYNSTYR; glicopeptídeo 2 TKPREEQYNSTYR).

Resultados As Regiões não traduzidas utilizadas na Expressão de Recombinação do Trastuzumabe siqnificativamente impacta a Acumulação de Anticorpo.

[0080] Trastuzumabe é um anticorpo terapêutico utilizado no tratamento de câncer de Mama HER2+ (Baselga et al., 1998; Lewis et al., 1993). Para produzir este anticorpo em hospedeiros de Nicotina, suas cadeias pesadas (HC) e leves (LC) foram clonadas para cassetes de expressão da planta e colocadas em um único vetor binário (102mAb) ou separadas dos vetores binários (103-106HC e 103LC-106), em cujo caso fossem co-expressas (referidos como conjuntos de vetores 103mAb- 106mAb) para produzir o anticorpo totalmente montado. Os cassetes de expressão diferentes foram projetados para carregar diferentes combinações de promotores, 5'UTRs e 3'UTR/terminadores (Figura 1). Trastuzumabe transitoriamente foi expresso em N. benthamiana usando conjunto de vetor 103mAb-106mAb para comparar os níveis de produção de anticorpos recombinantes. O curso de tempo da expressão 7 dias com infiltração de vácuo da planta inteira mostrou uma diferença significativa na expressão de anticorpo dinâmica e máxima entre os conjuntos de quatro vetores (Figura 2A). Os vetores 105mAb e 106mAb resultaram em maior acúmulo de anticorpo máximo em comparação com 103mAb e 104mAb. Expressão de anticorpo atingiu um pico de pós-infecção de 3-4 dias (d.p.i) para 103mAb e 104mAb e em 4-5 d.p.i. para 105mAb, considerando que 106mAb mostrou um constante aumento na expressão pós-infecção de até 7 dias. Níveis de anticorpos máximos foram alcançados com os conjuntos do vetor 105mAb e 106mAb, estimados por ELISA em =1% do TSP. O conteúdo das proteínas das folhas de tabaco foi estimado em cerca de 2% do peso fresco (Stevens et al., 2000), portanto, a expressão de anticorpo em 1% de TSP traduz-se em =200 mg de anticorpo por kg de peso fresco (FW). Observou-se uma acumulação do anticorpo em uma escala de 20 vezes quando comparados aos diferentes vetores. Portanto, diferentes elementos UTR fundiram aos códigos para as cadeias pesadas e leves de Trastuzumabe que afetam significativamente o acúmulo do anticorpo totalmente montado quando transitoriamente expresso. Além disso, a glicosilação N de perfis de mAbs foi determinada por LC-ESI-MS (cromatografia líquida de eletropulverização da espectometria em massa por ionização). Normalmente mAbs exibiu um padrão oligossacarídeo amplamente homogêneo GnGnXF3 com planta específica de xilose β1,2 e núcleo de resíduos de fucose α1,3 (veja a última seção de resultados).

O P19 não tem um Efeito de Estimulção Similar e a Expressão de Trastuzumabe dos Vetores de Expressão Diferente

[0081] O efeito de co-expressar o P19 com vetores 103mAb-106mAb foi analisado durante 7 dias em N. benthamiana (Figura 2B e 2C) para determinar se as diferentes combinações de UTR tiveram qualquer efeito sobre a capacidade da P19 para aumentar a expressão de anticorpos, como relatado anteriormente (Saxena et al.,2011; Vezina et al., 2009). Todas as culturas Agrobacterium utilizadas neste experimento foram ajustadas para uma OD600 de 0.2. Nem todos os conjuntos do vetor foram positivamente afetados pela P19 (Figura 2, Tabela 1). Para 103mAb e 104mAb, P19 resultou em um aumento de 15 vezes da concentração de Trastuzumabe, que apesar da expressão máxima foi quase 3 vezes maior com 103mAb comparado com 104mAb, sem e com P19. Para 105mAb, P19 só resultou em um aumento de =2 vezes na concentração de Trastuzumabe, de 1% para aproximadamente 2,1% de TSP. Acumulação de anticorpos com vetor definido 106mAb, que continha apenas derivados da planta UTRs, foi afetada por P19. Expressão de anticorpo atingiu um pico de 103mAb e 105mAb quando co-expressa com P19 em pouco mais de 2% do TSP. Também foi observado que P19 mudou o tempo de pico de expressão para os vetores 103mAb, 104mAb e 105mAb (Figura 2C). A capacidade da P19 para aumentar a expressão de Trastuzumabe com vetor 102mAb também foi testada. 102mAB é semelhante ao 106mAb, ou seja, ela contém apenas os derivados da planta UTRs (Figura 1). Semelhante ao 106mAb, o P19 não afetou o nível de expressão do anticorpo de 102mAb (Figura 3A). O P19 também foi encontrado para não ter nenhum efeito estimulado no Trastuzumabe expressa com vírus do mosaico do tabaco (TMV) e baseados no vírus de batata X (PVX) dos vetores desconstruídos (Grohs et al, 2010) (Figura 3B).

Aumentar o efeito da P19 na Expressão do Anticorpo Recombinante é Dependente da Concentração

[0082] Acredita-se que em ordem para P19 exercer sua função biológica para uma infecção TBSV bem sucedida, tem que acumular além de certa concentração limite das células da planta (Qiu et al., 2002; Scholthof et al., 1999). Quando expressas transitoriamente, a co-expressão da P19 com 103mAb em uma concentração Agrobacterium de OD600= 0.2 da produção de anticorpos significativamente impulsionada. Desde que o nível de expressão das proteínas recombinantes é, em grande parte, a menor para uma expressão transgênica vs transiente, a co-infiltração de 103mAb com P19 foi examinada nas concentrações inferiores da Agrobacterium para simular transgênicos com os níveis de acumulação P19 na N. benthamiana. Infiltração de vetores 103mAb sozinhos nos valores de OD6OO 0,2, 0,02 e 0,002 resultou em diferentes níveis de produção dos anticorpos, com uma correlação direta entre a concentração de grobacterium aplicada e nível de expressão do anticorpo (Figura 4). A capacidade da P19 para aumentar a expressão do anticorpo com 103mAb progressivamente diminuída quanda P19 foi aplicada em concentrações inferiores, co-expriminda P19 no OD6oo= 0.2 resultou em um aumento significativo na expressão de anticorpo independentemente da concentração de 103mAb (Figura 4). Assim, a menos que P19 possa ser expressa em níveis muito elevados, sua utilidade na produção transgênica de proteínas recombinantes pode ser limitada devido ao seu modo de concentração dependente de ação.

Variedades do Tabaco Respondem de Forma Diferente para P19

[0083] Para utilizar P19 para produção de proteínas transgênicas recombinantes em plantas, é imperativa que P19 não prejudicará o crescimento das plantas e mais importante, a expressão do gene. Como discutido, quando expressas transitoriamente em níveis elevados em N. benthamiana, o P19 efetivamente, aumenta os níveis de proteína recombinante. No entanto, devido a ter uma biomassa muito maior, N. tabacum é muitas vezes selecionados em N. benthamiana para a produção de transgênica. A desvantagem do uso de N. tabacum é o desenvolvimento de necroses no local da infecção por 7 dias após a introdução da P19 recombinante para células da folha via Agroinfiltração (Angel et al., 2011). A reação que é desencadeada por P19 N. tabacum, também conhecido como a resposta de hipersensibilidade, tem sido bem documentada mas apenas testada em dois cultivares de tabaco (Angel et al., 2011; Jonatan et al, 2011; Siddiqui et al., 2008). Para identificar um tabaco que poderia ser usado com P19 em um sistema de expressão transgênica, cinco cultivares foram selecionados para o desenvolvimento da resposta hipersensível. Trastuzumabe transitoriamente foi expresso com 103mAb, sozinho ou em conjunto com P19 por infiltração local de plantas de 5 semanas de idade. Quatro ou cinco cultivares de tabaco, ou seja I-64, TI-95, Xanthi e Petite Havana H4, mostraram uma diminuição acentuada em expressão do anticorpo no dia 6 quando co-expressa com P19, em comparação com a expressão do anticorpo sem P19 (figura 5A). Por outro lado, a co-expressão da P19 com 103mAb em N. tabacum cv. Little Crittenden (LCR) resultou em um aumento significativo na expressão de trastuzumabe (Figura 5B). Além disso, as cultivares de tabaco que mostraram uma diminuição na expressão de anticorpo na presença da P19 também mostrou uma descoloração marcada das áreas tratadas após 3 dias, enquanto as áreas infiltradas de N. benthamiana e N. tabacum cv. LCR foram afetadas até a pós-infecção de 10 dias (mostrada na Figura 5 em 5 d.p.i). Estes resultados indicam que N. tabacum cv. Little Crittenden pode ser usado como um hospedeiro para a produção transgênica das proteínas recombinantes usanda P19.

[0084] Os cruzamentos recíprocos foram feitos entre tabaco cultivares I-64 e LCR para olhar para a maneira em que a indução da resposta hipersensível por P19 é herdada em N. tabacum. A indução da resposta em um cruzamento estéril entre N. benthamiana e N. tabacum, chamado NBT, também foi testada. Mudas de cinco semanas de idade foram infiltradas com 103mAb, com ou sem P19. O nível de Trastuzumabe foi reduzido em todos os cruzamentos em 5 d.p.i. quando 103mAb foi co-expressa com P19 (Figura 5B). Esta redução na expressão de anticorpo correlacionada com descoloração das folhas tratadas, seguida de necrose (Figura 5C). Estes resultados indicam que o gene R putativo responsável por desencadear o HR é nuclear, e o LCR é recessivo homozigoto para aquele gene.

O P19 não afeta o silenciamento a atividade de fucosiltransferase e xilosiltransferase qlicomodificada com base em RNAi Nicotiana benthamiana

[0085] Silenciamento com base em RNAi é um método comumente usado para modificar o padrão de glicosilação N no sentido humano como estruturas em plantas (Cox et al., 2006; Sourrouille et al., 2008; Strasser et al., 2008). Esta estratégia também foi aplicada para eliminar os resíduos específicos de glicano N das plantas (ou seja, xilose e núcleo a1,3 fucoce) em Nicotiana benthamiana (ΔXTFT) pelo regulamento negativo das enzimas respectivas de fucosiltranferase e xilosiltransferase (Cox et al., 2006; Sourrouille et al., 2008; Strasser et al., 2008). Os possíveis efeitos adversos da P19 em tais plantas ainda não haviam sido determinados. Assim, os mutantes ΔXTFT foram infiltrados no com os vetores de mAb103 com ou sem P19. Trastuzumabe foi purificado 5 dias pós-infiltração e analisados por LC-ESI-MS para determinar o padrão de glicosilação N (Figura 6B, C). Curiosamente, ambas as versões 103mAb carregava um idêntico perfil de glicosilação N, sem a planta de oligossacarídeos específicos. Isto sugere que P19 não afeta o caminho de silenciamento do RNAi responsável para silenciá-lo o FT e XT em ΔXTFT enquanto ele interfere com a via do silenciamento de genes que reduzem a expressão do transgene. Estes resultados indicam que P19 podem ser usados para aumentar os níveis de proteína recombinantes expressados em um hospedeiro de expressão baseada em RNAi sem alterar o perfil de glicano da proteína.

A co-infiltração transitória do vetor de expressão P19 realça extremamente da expressão de dois anticorpos mais terapêuticos na Nicotiana benthamiana.

[0086] Para demonstrar que melhoras da expressão P19 de outros anticorpos, sequências de codificação para as cadeias leves e pesadas de anti-HIV mAb 4E10 e bevacizumabe foram sintetizadas para expressão em plantas (como acima). 4E10 mAb anti-HIV foi primeiramente descrita em Buchacher et al. (1994) com sua sequência de cadeia leve, sendo disponível no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) como Gl:122920218 de entrada e sua cadeia pesada como um Fd/VH na entrada de Gl: 61680025. Este anticorpo pode ser usado como uma vacina anti-HIV ou como um reagente de diagnóstico. As sequências de cadeia leve e pesada de bevacizumabe estão disponíveis de Drugbank (http://www.druqbank.ca/) como entrada DB00112. Bevacizumabe é usada com a quimioterapia padrão para câncer de cólon metastático; ele também foi aprovado para uso em certos tipos de câncer de pulmão, câncer renal e glioblastoma multiforme do cérebro. Sequência de codificação da cadeia pesada para mAb 4E10 e ambas as cadeia leve e pesada, sequências de codificação para bevacizumabe foram clonados a jusante do sinal de peptídeo de Arabidopsis quitinase básicas (como acima) e inserido nos vetores 103 e 105. A sequência de codificação de cadeia leve por mAb 4E10 também foi clonado a jusante do sinal de peptídeo de Arabidopsis de quitinase básica e inserido no vetor 105 e em uma versão do vetor 105 no qual um par de deleções de base 162 da extremidade 5' da sequência terminadora do gene C. morifolium rbc foi causada por clivagem de um sítio de físpEI; este último vetor é conhecido como p105T (i.e., 105-truncado). Todos os oito vetores foram introduzidos na cepa Agrobacterium tumefaciens At542 (como acima), em seguida, infiltrados no local, com e sem P19 (como acima), em N.benthamiana tecidos de folha nas combinações indicadas na Figura 7 e colhidos após 7 dias. Cada cepa Agrobacterium foi aplicada em uma extremidade OD600 de 0,2. Colheitas do tecido para cada tratamento incluíam 3 ou 4 pontos, que foram agrupados e proteínas solúveis totais (TSP) foram extraídas, conforme descrito em Garabagi et al. (2012a,b). Um gel de SDS-PAGE de não redução de 10% foi executado que incluiu 10 mg TSP para cada amostra da planta. Proteínas separadas eletroforeticamente foram posteriormente eletrotransferidas à membrana PVDF e analisadas com sondas de anticorpo anti-y e anti-K combinados de conjugados para fosfatase alcalina (também descrita em Garabagi et al., 2012a). Os resultados indicam que essa co-expressão da P19 aumentam muito a expressão de ambos os anticorpos independentemente do vetor de expressão de anticorpo. Na Figura 7, o esquema de carregamento do gel é tabulado acima da imagem de immunoblot, e o tamanho de cada banda do marcador de peso molecular na faixa 1 é dado à esquerda em kDa; a quantificação de imunoglobulinas do soro humano padrão na faixa 10 é 500 ng; mAb = anticorpo monoclonal; HC = vetor de cadeia pesada; LC = vetor de cadeia leve.

A expressão transiente de uma enzima terapêutica, butirilcolinesterase humana (BChE) é bastante reforçada pela co- expressão da P19.

[0087] Butirilcolinesterase é uma enzima de colinesterase não específica que hidrolisa muitos ésteres de colina diferente. Nos humanos, é encontrado principalmente no fígado e é codificado pelo gene BCHE. Está sendo desenvolvido como um antídoto para o envenenamento por gás dos nervos. Dois vetores de expressão BChE diferentes foram construídos em p105T (descrito acima): (1) com a sequência de sinal de quitinase básica (abc) de Arabidopsis e um sintético BChE da sequência otimizada para expressão em plantas de código referida como E2, ou seja, abc-BChE2; e (2) com a nativo humano BChE da sequência de sinal (hSS) e outro sintético BChE da sequência otimizada para expressão em plantas de código referido como E3, ou seja, hSS-BChE3. Estas foram introduzidas em todas as plantas de N. benthamiana pela infiltração do vácuo (de acordo com Garabagi et al., 2012a, b), com ou sem o P19 (como acima). As amostras foram colhidas em 5, 7 e 9 dias após a infiltração (DPI) e da atividade BChE foi medida por meio de ensaio Ellman (Ellman et al., 1961). Resultados deste experimento são apresentados na Figura 8, onde as barras de histograma apresentam valores de BChE em mg de tecido da folha de BChE/kg, convertendo as medições de atividade para massa de enzima usando o fator de conversão da atividade específica de 718,3 unidades da atividade por mg de BChE determinado em Weber et al. (2010). Observe que leituras do fundamento (como determinado com extratos das plantas não tratadas) têm sido subtraídas para a apresentação desses dados. As barras de histograma na Figura 8 indicam a média da atividade BChE medida em 2 amostras de 2 plantas (total de 4 repetições de cada uma) com barras de erro padrão associadas. Estes dados indicam essa co-expressão da P19 aumenta muito a expressão de BChE.

Discussão

[0088] Neste exemplo, três questões importantes são abordadas no tocante à aplicação da P19 para melhorar a produção de proteínas recombinantes em plantas: capacidade da P19 para aumentar suficientemente a expressão de proteínas recombinantes; seus potenciais efeitos fisiológicos adversos no hospedeiro de expressão; e interferência com o estado de silenciamento dos genes em plantas glicomodificadas baseadas em RNAi. Os resultados aqui descritos indicam que todos os três requisitos estão preenchidos e que P19 pode ser utilizado eficazmente para expressão transiente de glicoproteínas recombinantes em hospedeiros de expressão baseado em RNAi.

[0089] Os relatórios de expressão de anticorpos maiores usando supressores de silenciamento do gene de data tem sido na expressão transiente de mAb 2G12 com P19 em 400 mg/kg FW (Saxena et al., 2011) e mAb C5-1 com HcPro em 757 mg/kg FW (Vezina et al., 2009). Ambos esses mAbs foram retidos no ER pela adição de marcadores auxiliares do terminal C. No contexto dos anticorpos terapêuticos biossimilares, no entanto, sinais de retenção ER são problemáticos, desde que eles adicionem aminoácidos extras para a sequência primária da proteína inovadora. Além disso, ER típico de oligomannisidic da glicosilação é para proteínas terapêuticas mais atípicas e, portanto, indesejáveis.

[0090] O P19 é mostrado aqui para realçar a expressão do modelo terapêutico de mAb trastuzumabe que é direcionado para o apoplasto usando vetores binários clássicos em cerca de 2,3% do TSP, ou mg/kg de -460 FW. Além disso, elementos genéticos regulamentares utilizados em construções de recombinação determinam se ou não o P19 pode aumentar a expressão. Isto foi demonstrado por co-expressão da P19 juntamente com as cadeias pesadas e leves de trastuzumabe clonados em vetores de diferentes expressões contendo diferentes 5' e 3' UTRs. Os resultados aqui descritos indicam que as transcrições pelo menos uma UTR derivados de vírus, como por exemplo 103mAb, 104mAb e 105mAb, foram impulsionados por P19. Isto sugere que as transcrições destes cassetes de expressão estão sujeitos ao silenciamento RNAi, embora em graus diferentes e portanto são impulsionados na presença de um supressor de um silenciamento de genes. Em contraste, as transcrições que continham apenas a planta derivada de UTRs, tais como 106mAb e 102mAb, eram não afetados pelo P19, sugerindo que eles não estavam sujeitos a qualquer silenciamento de RNAi significativo durante o período de observação. Esses achados podem ter implicações diretas na concepção de vetores de expressão.

[0091] O P19 aqui também é mostrado para aumentar a expressão de outra mAb terapêutica, nomeadamente bevacizumabe, usando dois dos vetores descritos neste pedido. O P19 aqui também é mostrado para aumentar a expressão de outro mAb terapêutico, ou seja, anti-HIV mAb 4E10, usando três dos vetores descritos neste pedido. Estes três exemplos ilustram o potencial para o P19 realçar a expressão de mais nenhum anticorpo usando o sistema de vetor apresentado neste pedido.

[0092] O P19 aqui também é mostrado para aumentar a expressão de uma enzima terapêutica potencial, nomeadamente butirilcolinesterase, usando um dos vetores descritos neste pedido com ambas as sequências do sinal de quinase básica de Arabidopsis ou com a sequência do sinal de butirilcolinesterase humana nativa e usando qualquer uma das duas sequências de codificação sintéticas, otimizadas para expressão da planta do polipeptídeo butirilcolinesterase idênticas da mesma. Este exemplo ilustra o potencial da P19 para aprimorar a expressão de outras proteínas terapêuticas do que anticorpos, tais como enzimas.

[0093] É evidente que os vetores descritos neste pedido podem produzir proteínas terapêuticas diferentes, e que a expressão de proteínas destes vetores na planta pode ser reforçada pela co-expressão do gene P19.

[0094] Também é aparente de vários relatórios sobre a expressão transgênica constitutiva da P19 que o aparecimento dos efeitos adversos ocorre somente quando a proteína é usada em títulos elevados, especialmente desde que a expressão constitutiva de alto nível da P19 é conhecida por ser letal em Arabidopsis (Dunoyer et al., 2004). Essa funcionalidade dependente da dose da P19 é apoiada pelo fato do tabaco transgênico cv. Xanthi é tolerante ao P19 em níveis baixos (Siddiqui et al., 2008), enquanto a proteína gera necrose no tabaco cvs. As folhas de Samsun e NC95 quando transitoriamente expressas em títulos elevados (Angel et al., 2011). Sistemas de expressão induzíveis que são capazes de produzir níveis elevados de proteína recombinante têm sido empregados para contornar a letalidade causada por produzir altos títulos da P19 nos sistemas de transgênicos. No entanto, efeitos desfavoráveis tais como malformadas folhas e flores aparecem quando o P19 é expresso com tais sistemas em níveis elevados, tais como os sistemas de transativação pOp/LhG4 descrito por Stav et al. (2009). Desde que transgenes geralmente de maior expressão nos transitórios como oposição as configurações transgênicas (Garabagi et al. 2012, in press), a quantidade da proteína P19 produzida pela infiltração transitória nas concentrações de OD60O= 0,02 e menos foi mostrado para não aumentar significativamente os níveis de trastuzumabe. Por outro lado, altas concentrações da P19 (OD600= 0,2) causaram um aumento de 15 vezes nos níveis de anticorpos (Figura 4). Estes resultados apoiam a ideia da funcionalidade dependente da dose da P19 no contexto de aumentar a expressão de proteínas recombinantes. No entanto, o título no qual P19 exerce seu efeito estimulando provoca uma resposta hipersensível na maioria dos cultivares de tabaco (Figura 5A).

[0095] Os recentes relatórios sobre a indução da resposta hipersensível no N. tabacum cvs. Samsun e NC95 descrevem uma resposta fisiológica que envolve a indução do sítio de silenciamento de RNAi (Jovel et al, 2011) seguido por necrose (Angel et al., 2011). Esta resposta é provavelmente desencadeada pelo produto de um gene putativo de R (Angel et al., 2011). Tal como descrito no presente exemplo, um cultivar do tabaco, Little Crittenden, foi identificado que não desencadeou uma resposta de hipersensibilidade quando exposto a elevados títulos da P19 (Figura 5A e 5C). Todos os outros cultivares de tabaco testado mostrou uma diminuição marcada na produção de anticorpos na presença da P19 em comparação com a expressão de unicamente os vetores de anticorpos, indicando a indução de um mecanismo de silenciamento de RNAi que substitui a supressão do gene silenciador por P19. Estes resultados estão em conformidade com os últimos relatórios sobre a indução da resposta de hipersensibilidade em N. tabacum, que inclui uma indução do sítio do silenciamento de RNAi (Angel et al, 2011;. Jovel et al, 2011). Os resultados descritos neste documento também indicam um modo dominante de herança para este traço, também de acordo com as características descritas anteriormente dos genes R (Moffett, 2009) e que cultivar o LCR tem uma mutação recessiva neste gene. Assim, este genótipo tabaco e outros semelhantes que têm mutações de genes R podem prestar-se a expressão transgênica de proteínas recombinantes, utilizando O P19 quando utilizado com um sistema capaz de gerar títulos elevados de proteína. LCR pode ser usado como um modelo para determinar o número de genes envolvidos na resposta de hipersensibilidade ao P19.

[0096] Apesar da capacidade das plantas para realizar complexa glicosilação, um possível afunilamento para seu uso como uma plataforma de expressão versátil para anticorpos terapêuticos é a presença de resíduos de plantas específicas do glicano N, ou seja, xilose e núcleo a1,3- fucose. Esses oligossacarídeos não mamíferos podem alterar a atividade biológica de uma proteína dada ou mesmo podem induzir efeitos colaterais adversos indesejados mediante ao pedido terapêutico. Como esperado, durante os experimentos descritos neste documento, planta típica de glicosilação N foi detectada no Trastuzumabe. Para contornar este problema de tecnologia RNAi foi utilizado para gerar uma linha de plantas que não tem os resíduos de glicano N indesejado das plantas específicas (Strasser et al., 2008). Os anticorpos monoclonais produzidos neste mutante (ΔXTFT) realizam glicanos N semelhantes aos humanos complexos sem glicosilação específica da planta. Além disso, os mAbs com um perfil glico projetado também mostrarou um aumento das funções efetoras em comparação com os seus homólogos derivados das células dos mamíferos (Forthal et al, 2010; Zeitlin et al, 2011). Assim, tais plantas mutantes de glicosilação podem servir como plataformas de expressão valiosas para a produção de mAbs terapêuticos. No entanto, se o uso da P19 perturbasse o silenciamento do XT e FT nos mutantes ΔXTFT não foi investigado ainda. Com base nos relatórios anteriores sobre os alvos celulares da P19, incluindo um caso documentado da interferência com a via de silenciamento siRNA numa linha de planta transgênica (Ahn et al., 2011), o P19 era esperado para interferir com o gene silenciador induzido por RNAi do XT e FT na N. benthamiana glicomodificada. Surpreendentemente, os mAbs expressos em ΔXTFT com e sem P19 foram a ambos os casos totalmente desprovidos dos resíduos de xilose e de fucose. Os perfis de glicano virtualmente idênticos dos dois anticorpos indicam que o silenciamento do FT e XT é afetado por P19 (Figura 6). Assim, parece que o P19 pode ser utilizado eficazmente em combinação com hospedeiros glicomodificados baseados em RNAi para a produção de glicoproteínas terapêuticas em ambos os sistemas de expressão transiente e estável.

[0097] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência ao que presentemente são considerados os exemplos preferidos, deve ser entendido que o invento não está limitado aos exemplos revelados. Pelo contrário, a invenção destina-se a abranger a várias modificações e arranjos equivalentes incluídos dentro do sentido e âmbito das reivindicações anexas.

[0098] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para a mesma extensão como se cada pedido de publicação, patente ou patente individual foi especificamente e individualmente indicado para ser incorporada por referência na sua totalidade. Tabela 1 - Nível de trastuzumabe Máxima produzida com diferentes vetores de expressão.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ ID NO: 1 sequência de nucleotídeos P19 dos códons otimizados para a expressão em Nicotiana. ATGGAAAGGGCTATTCAGGGAAATGATGCTAGAGAGCAGGCTAA TTCTGAAAGATGGGATGGTGGATCTGGTGGAACTACTTCTCCATTCAA GCTTCCAGATGAGTCTCCATCTTGGACTGAGTGGAGGCTTCATAACGA TGAGACTAACTCCAATCAGGATAACCCACTCGGATTCAAAGAATCTTGG GGATTCGGAAAGGTTGTGTTCAAGCGTTACCTTAGGTATGATAGGACT GAGGCTTCACTTCATAGGGTTCTCGGATCTTGGACTGGTGATTCTGTTA ACTACGCTGCTTCTCGTTTTTTTGGATTCGATCAGATCGGATGCACTTA CTCTATTAGGTTCAGGGGAGTGTCTATTACTGTTTCTGGTGGATCTAGG ACTCTTCAACACCTTTGCGAGATGGCTATTAGGTCTAAGCAAGAGCTTC TTCAGCTTGCTCCAATTGAGGTTGAGTCTAACGTTTCAAGAGGATGTCC AGAAGGTACTGAGACTTTCGAGAAAGAATCCGAGTGA FULL CITATIONS FOR REFERENCES REFERRED I Ü IN I HE SPECIFICATION Ahn JW, Lee JS, Davarpanah SJ, Jeon JH, Park Yl, Liu JR and Jeong WJ (2011) Host-dependent suppression of RNA silencing mediated by the viral suppressor p19 in potato. Planta. Almquist K. C., Niu Y., McLean M. D., Mena F. L., Yau K. Y., Brown K., Brandie J. E. and Hall J. C. (2004) Immunomodulation confers herbicide resistance in plants. Plant Biotechnol J 2, 189-97. Angel CA, Hsieh YC and Schoelz JE (2011) Comparative analysis of the capacity of tombusvirus P22 and P19 proteins to function as avirulence determinants in Nicotiana species. Mol Plant Microbe Interact 24:91-99. Bardor M, Faveeuw C, Fitchette AC, Gilbert D. Galas L. Trottein F, Faye L and Lerouge P (2003) Immunoreactivity in mammals of two typical plant glyco-epitopes, core alpha(1,3)-fucose and core xylose. Glycobiology 13:427-434. Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim YM and Mendelsohn J (1998) Recombinant humanized anti-HER2 antibody (Herceptin) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 58:28252831. Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431:356-363. Brodersen P and Voinnet O (2006) The diversity of RNA silencing pathways in plants. Trends Genet 22:268-280. Brodsky, L. I.; Ivanov, V. V.; Kalaidzidis, Y. L.; Leontovich, A. M.; Nikolaev, V. K.; Feranchuk, S. I.; Drachev, V. A. GeneBee-NET: internet-based server for analyzing biopolymers structures. Biochemestry 1995, 60, 923-928. Broothaerts W, Mitchell H J, Weir B, Kaines S, Smith L M A, Yang W, Mayer J E, Roa-Rodriguez C, Jefferson R A (2005) Gene transfer to plants by diverse species of bacteria, Nature 433:629-633. Buchacher, A., R. Predl, K. Strutzenberger, W. Steinfellner, A. Trkola, M. Purtscher, G. Gruber, C. Tauer, F. Steindl, A. Jungbauer, and H. Katinger. 1994. Generation of human monoclonal antibodies against HIV-1 proteins; electrofusion and Epstein-Barr virus transformation for peripheral blood lymphocyte immortalization. AIDS Research and Human Retroviruses 10:359-69. Burgyan J, Lakatos L, Szittya G and Silhavy D (2004) Molecular mechanism of RNA silencing suppression mediated by p19 protein of tombusviruses. Embo Journal 23:876-884. Carthew RW and Sontheimer EJ (2009) Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs Cell 136:642-655. Chung S. M., Vaidya M. and Tzfira T. (2006) Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria. Trends Plant Sci11. 1-4. Colgan R., Atkinson C. J., Paul M.. Hassan S., Drake P. M., Sexton A. L. Santa-Cruz S., James D.. Hamp K., Gutteridge C. and Ma J. K. Optimisation of contained Nicotiana tabacum cultivation for the production of recombinant protein pharmaceuticals. Transgenic Res 19, 241-56. Cox KM. Sterling JD. Regan JT. Gasdaska JR, Frantz KK, Peele CG, Black A. Passmore D. Moldovan-Loomis C. Srinivasan M. Cuison S. Cardarelli PM and Dickey LF (2006) Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nature biotechnology 24:1591-1597. Dunoyer P, Lecellier CH, Parizotto EA. Himber C and Voinnet O (2004) Probing the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA silencing. Plant Cell 16:1235-1250. Ellman, G.L., Courtney. K.D., Andres. V.. Jr., Featherstone, R.M., A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7: 88-95, 1961. Forthal DN, Gach JS, Landucci G. Jez J, Strasser R, Kunert R and Steinkellner H (2010) Fc-glycosylalion influences Fcgamma receptor binding and cell-mediated anti-HIV activity of monoclonal antibody 2G12. Journal of immunology 185:6876-6882. Gardiner-Garden. M.; Frommer, M. CpG islands in vertebrate genomes. J. Mol. Biol. 1987, 196. 261-282. Garabagi, F„ E. Gilbert. A. Loos, M.D. McLean, and J.C. Hall. 2012a. Utility of the P19 suppressor of gene-silencing protein for production of therapeutic antibodies in Nicotiana expression hosts. Plant Biotechnol J 10:1118-28. Garabagi, F., M.D. McLean, and J.C. Hall. 2012b. Transient and stable expression of antibodies in Nicotiana species. Methods Mol Biol 907:389-408. Gelvin S R (2003) Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev 67, 16-37. Giritch A., Marillonnet S., Engler C., van Eldik G., Botterman J., Klimyuk V. and Gleba Y. (2006) Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc Natl Acad Sci U SA 1 03, 14701-6. Gomord V, Fitchette AC, Menu-Bouaouiche L, Saint-Jore-Dupas C, Plasson C, Michaud D and Faye L (2010) Plant-specific glycosylation patterns in the context of therapeutic protein production. Plant Biotechnol J 8:564-587. Grohs BM, Niu Y, Veldhuis LJ, Trabelsi S, Garabagi F, Hassell JA, McLean MD and Hall JC (2010) Plant-produced trastuzumab inhibits the growth of HER2 positive cancer cells. J Agric Food Chem 58:10056-10063. Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.G. and Fraley R.T. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229-1231. Hsieh YC, Omarov RT and Scholthof HB (2009) Diverse and newly recognized effects associated with short interfering RNA binding site modifications on the Tomato bushy stunt virus p19 silencing suppressor. J Virol 83:2188-2200. Jin C, Altmann F, Strasser R, Mach L, Schahs M, Kunert R, Rademacher T, Glossl J and Steinkellner H (2008) A plant-derived human monoclonal antibody induces an anti-carbohydrate immune response in rabbits. Glycobiology 18:235-241. Jovel J, Walker M and Sanfacon H (2011) Salicylic acid-dependent restriction of Tomato ringspot virus spread in tobacco is accompanied by a hypersensitive response, local RNA silencing, and moderate systemic resistance. Mol Plant Microbe Interact 24:706-718. Kozak M. (1984) Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs. Nucleic Acids Ros 12. 857- 72. Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C and Shepard HM (1993) Differential responses of human tumor cell lines to antipl 85HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 37.255-263. Li, Q.; Hunt, A. A near-stream element in a plant polyadenylation signal consist of more than six nucleotides. Plant Mol. Biol. 1995, 28, 927-934. Moffett P (2009) Mechanisms of recognition in dominant R gene mediated resistance. Adv Virus Res 75:1-33. Makvandi-Nejad S., McLean M. D., Hirama T., Almquist K. C., Mackenzie C. R. and Hall J. C. (2005) Transgenic tobacco plants expressing a dimeric single-chain variable fragment (scfv) antibody against Salmonella enterica serotype Paratyphi B. Transgenic Res 14, 785-92. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. (2005). Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat. Biotechnol 23, 718-723. McLean, M. D., Almquist, K C., Niu, Y., Kimmel, R., Lai, Z., Schreiber, J. R., and Hall, J. C. (2007). A Human Anti-Pseudomonas aeruginosa Serotype O6ad Immunoglobulin G1 Expressed in Transgenic Tobacco Is Capable of Recruiting Immune System Effector Function In Vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 51. 3322-3328. Nakamura, Y. Codon usage database. Available on-line at www.kazusa.or.jp/codon; 2005. Ohme-Takagi. M.; Taylor, C.; Newman, T.; Green, P. The effect of sequences with high AU content on mRNA stability intobacco. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90. 11811-11815. Olea-Popelka, F„ McLean. M. D., Horsman, J.. Almquist, K., Brandie, J. E.. and Hall, J. C. (2005). Increasing expression of an anti-picloram single-chain vanable fragment (ScFv) antibody and resistance to pidoram in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum). J. Agπc. Food Chem 53, 6683- 6690. Park JW, Faure-Rabasse S, Robinson MA, Desvoyes B and Scholthof HB (2004) The multifunctional plant viral suppressor of gene silencing P19 interacts with itself and an RNA binding host protein. Virology 323.49-58. Qiu W, Park JW and Scholthof HB (2002) Tombusvirus P19-mediated suppression of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence pathogenicity. Mol Plant Microbe Interact 15:269-280. Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoados MW, Bartel B and Bartel DP (2002) MicroRNAs in plants. Genes Dev 16:1616-1626. Rothnie, H. M. Plant mRNA 3 i-end formation. Plant Mol. Biol. 1996. 32, 43-61. Samac. D. A.. Hironaka, C. M.. Yallaly, P. E.. and Shah, D. M. (1990). Isolation and Characterization of the Genes Encoding Basic and Acidic Chitinase in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 93, 907-914. Saxena P. Hsieh YC. Alvarado VY, Sainsbury F. Saunders K, Lomonossoff GP and Scholthof HB (2011) Improved foreign gene expression in plants using a virus-encoded suppressor of RNA silencing modified to be developmentally harmless. Plant Biotechnol J 9:703-712. Schiestl M, Stangler T, Torella C. Cepeljnik T, Toll H and Grau R (2011) Acceptable changes in quality attributes of glycosylated biopharmaceuticals. Nature Biotechnology 29:310-312. Scholthof HB (2006) The Tombusvirus-encoded P19: from irrelevance to elegance. Nat Rev Microbiol 4:405-411. Scholthof HB. Desvoyes B. Kuecker J and Whitehead E (1999) Biological activity of two tombusvirus proteins translated from nested genes is influenced by dosage control via context-dependent leaky scanning. Mol Plant Microbe In 12:670-679. Scholthof KBG, Scholthof HB and Jackson AO (1995) The Effect of Defective Interfering Rnas on the Accumulation of Tomato Bushy Stunt Virus Proteins and Implications for Disease Attenuation. Virology 211:324-328. Shapiro, M. B.; Senapathy, P. RNA splice junctions of different classes of eukaryotes: sequence statistics and functional implications in gene expression. Nucleic Acids Res. 1987, 5. 7155-7174. Siddiqui SA, Sarmiento C, Truve E. Lehto H and Lehto K (2008) Phenotypes and functional effects caused by various viral RNA silencing suppressors In transgenic Nicotiana benthamiana and N. tabacum. Mol Plant Microbe Interact 21:178-187. Sourrouille C, Marquet-Blouin E, D’Aoust MA. Kiefer-Meyer MC. Seveno M, Pagny-Salehabadi S, Bardor M, Durambur G. Lerouge P, Vezina L and Gomord V (2008) Down-regulated expression of plant-specific glycoepitopes in alfalfa. Plant Biotechnol J 6:702-721. Stadlmann J, Pabst M, Kolarich D, Kunert R and Altmann F (2008) Analysis of immunoglobulin glycosylation by LC-ESI-MS of glycopeptides and oligosaccharides. Proteomics 8:2858-2871. Stevens LH, Stoopen GM, Elbers IJ. Molthoff JW. Bakker HA. Lommen A, Bosch D and Jordi W (2000) Effect of climate conditions and plant developmental stage on the stability of antibodies expressed in transgenic tobacco Plant Physiol 124:173-182. Strasser R, Stadlmann J, Schahs M, Stiegler G, Quendler H, Mach L. Glossl J, Weterings K, Pabst M and Steinkellner H (2008) Generation of glycoengineered Nicotiana benthamiana for the production of monoclonal antibodies with a homogeneous human-like N-glycan structure. Plant Biotechnol J 6:392-402. Vezina LP, Faye L, Lerouge P, D'Aoust MA, Marquet-Blouin E, Burel C, Lavoie PO, Bardor M and Gomord V (2009) Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnol J 7:442-455. Voinnet O, Pinto YM and Baulcombe DC (1999) Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proc Natl Acad Sci U S A 96:14147-14152. Voinnet O, Rivas S, Mestre P and Baulcombe D (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J 33:949-956. Weber, A., H. Butterweck, U. Mais-Paul, W. Teschner, L. Lei, E.M. Muchitsch, D. Kolarich, F. Altmann, H.J. Ehrlich, and H.P. Schwarz. 2010. Biochemical, molecular and preclinical characterization of a double- virus-reduced human butyrylcholinesterase preparation designed for clinical use. Vox Sang 100:285-97. Yu D., McLean M. D., Hall J. C. and Ghosh R. (2008) Purification of a human immunoglobulin G1 monoclonal antibody from transgenic tobacco using membrane chromatographic processes. J Chromatogr A 1187, 128-37. Zeitlin L, Pettitt J, Scully C, Bohorova N, Kim D, Pauly M, Hiatt A, Ngo L, Steinkellner H, Whaley KJ and Olinger GG (2011) Enhanced potency of a fucose-free monoclonal antibody being developed as an Ebola virus immunoprotectant. Proc Natl Acad Sci U S A 108:20690-20694. Zheng N, Xia R, Yang C, Yin B, Li Y, Duan C, Liang L, Guo H and Xie Q (2009) Boosted expression of the SARS-CoV nucleocapsid protein in tobacco and its immunogenicity in mice. Vaccine 27:5001-5007.

Claims

1. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV); (b) a 5' UTR 35S do CaMV; (c) uma 3' UTR e sequência terminadora selecionadas a partir (i) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium, (ii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da osmotina (osm) de Oryza sativa, (iii) da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium ou (iv) de uma versão truncada, por 162 bp conforme definido por um sítio de reconhecimento de BspEI, da 3' UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium; (d) uma molécula de ácido nucleico codificando a proteína P19 do Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV), em que a molécula de ácido nucleico codificando a proteína P19 tem a sequência mostrada na SEQ ID NO:1, e (e) uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína recombinante, em que a proteína recombinante é um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou uma enzima terapêutica.

2. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende: o promotor 35S do CaMV, ligado operacionalmente à 5’ UTR 35S do CaMV e à 3’ UTR e sequência terminadora do gene da nos de Agrobacterium; o promotor 35S do CaMV, ligado operacionalmente à 5’ UTR 35S do CaMV e à 3’ UTR e sequência terminadora do gene da osm de Oryza sativa; o promotor 35S do CaMV, ligado operacionalmente à 5’ UTR 35S do CaMV e à 3’ UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium; ou o promotor 35S do CaMV, ligado operacionalmente à 5’ UTR 35S do CaMV e uma versão truncada, por 162 bp conforme definido por um sítio de reconhecimento de BspEI, da 3’ UTR e sequência terminadora do gene da pequena subunidade da rbc de C. morifolium.

3. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é trastuzumabe ou bevacizumabe.

4. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a enzima terapêutica é butirilcolinesterase.

5. Vetor de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o promotor de choque térmico da Arabidopsis (Hsp81.1).

6. Método para melhorar a produção de uma proteína recombinante em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a introdução de um vetor de expressão definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em uma planta ou uma célula vegetal; e (b) o cultivo da planta ou da célula vegetal para obter uma planta que expresse a proteína recombinante.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é trastuzumabe ou bevacizumabe.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é butirilcolinesterase.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de tabaco.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta de tabaco é N. benthamiana ou N. tabacum.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que N. tabacum é cv. Little Crittenden.