PL216099B1 - Transgeniczne komórki roslinne produkujace bialko antygenowe HBcAg oraz ich zastosowanie do wytwarzania szczepionki - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy transgenicznych komórek roślinnych produkujących białko antygenowe HBcAg i otrzymywania szczepionki zawierającej rdzeniowy antygen HBV-HBcAg, skierowanej przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (wzw B), aplikowanej doustnie w formie utrwalonego materiału roślinnego oraz aplikowanej parenteralnie lub donosowo w formie oczyszczonego preparatu ekstrahowanego z materiału roślinnego.

Otrzymanie rekombinowanej szczepionki przeciwko hepatitis B. tj. wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (wzw B) na początku lat '80 XX wieku było znaczącym sukcesem medycyny i wakcynologii, gdyż umożliwiło masowe szczepienia przeciwko wzw B. Pomimo wysokiej skuteczności szczepionki, sięgającej 90-95%, globalna liczba osób przewlekle chorych w następstwie zakażenia HBV (ang. Hepatitis B Virus) corocznie wzrasta i obecnie wynosi ponad 400 min. Ocenia się, że blisko 100 mln spośród tych chorych może umrzeć z powodu chorób i innych powikłań, np. marskości lub raka pierwotnego wątroby. Jednocześnie populacja chronicznych nosicieli wzw B stanowi wielki rezerwuar dla nowych infekcji. Z danych epidemiologicznych wynika, że blisko 1/3 światowej populacji przebyła zakażenie wirusem żółtaczki typu B. O ile w krajach wysoko rozwiniętych zapadalność na wzw B jest raczej niska - mniej niż 0.5%, to w krajach rozwijających się i w Chinach wskaźnik zachorowań wynosi od 5 do 50% (Hollinger 1996. Young 2001). Zapadalność na wzw B była i pozostaje poważnym problemem epidemiologicznym także w krajach rozwiniętych, gdzie do 20% populacji wykazuje markery zainfekowania HBV. W Polsce spośród chorób wątroby o etiologii wirusowej, ponad 50% wywoływanych jest przez HBV (Walewska-Zielecka 1996).

Liczba osób przewlekle chorych i nosicieli HBV wzrasta pomimo wprowadzenia rekombinowanych szczepionek (np. Engerix-B^®. Euvax B^®) opartych na małej podjednostce S antygenu powierzchniowego (HBsAg, Hepatitis B surface Antigen), w skrócie tzw. małym antygenie powierzchniowym wirusa, tj. S-HBsAg, produkowanym w komórkach rekombinowanych drożdży (rHBsAg). Szczepionki te, jakkolwiek umożliwiły masowe szczepienia, nie zapewniają jednak wystarczającej ochrony. Stwierdzono bowiem, że u pewnej liczby szczepionych osób dochodzi do zakażenia i replikacji wirusa w następstwie pojawienia się zmutowanych szczepów HBV. Szczepy te charakteryzują się zmienioną sekwencją aminokwasów w obrębie epitopu „a'' antygenu S-HBs, neutralizującego dla wszystkich opisanych dotychczas podtypów wirusa. Przypuszcza się, że w wyniku presji selekcyjnej jaką stwarzają przeciwciała powstałe w wyniku szczepienia, pojawiają się zmutowane warianty epitopu „a”, na które organizm szczepionego nie wytwarza neutralizujących przeciwciał. Wobec braku wystarczającej ochrony immunologicznej dochodzi do rozwoju przewlekłego schorzenia, pomimo wcześniejszej odpowiedzi na poziomie >10 mlU/ml przeciwciał anty-HBs, w większości krajów uznawanym za wystarczający dla zapewnienia ochrony immunologicznej przed zakażeniem wirusem (Cooreman 2001, Huang 2004).

Ponadto, część pacjentów po aplikacji parenteralnej szczepionki zawierającej mały antygen powierzchniowy S-HBsAg nie wykształca odpowiedzi immunologicznej lub jest ona niewystarczająca. Szczególnie ludzie starsi, palący, otyli, mężczyźni, osoby zakażone wirusami obniżającymi immunokompetencję (np. HlV), bądź cierpiące na niedobory immunologiczne o innym podłożu oraz pacjenci z niewydolnością nerek zdecydowanie gorzej reagują na klasyczną szczepionkę. W skrajnych przypadkach efektywność szczepienia w tych grupach sięga zaledwie kilku procent pomimo wielokrotnego szczepienia zwiększonymi dawkami preparatu (Singh 2003). W konsekwencji osoby te pozostają podatne na rozwój choroby. W związku z powyższym, od pewnego czasu prowadzone są badania nad opracowaniem nowej szczepionki, tzw. trzeciej generacji, przeciwko wzw B, zawierającej S-HBsAg i jeden lub dwa pozostałe antygeny powierzchniowe HBV, tj. średni (ang. medium) M-HBsAg oraz duży (ang. large) L - HBsAg (Madaliński 2002, Yamada 2001, Young 2001). Wymienione antygeny są _® wysoce immunogenne, co powoduje, że szczepionki III generacji (np. Hepacare^®, Bio-Hep-B™), wywołują powstawanie znacznie większego spektrum przeciwciał anty-wirusowych w porównaniu ze szczepionkami zawierającymi wyłącznie S-HBsAg. Badania kliniczne prowadzone zarówno z udziałem osób dorosłych jak i dzieci oraz noworodków potwierdzają silne właściwości immunostymulujące preparatów zawierających pełen zestaw antygenów powierzchniowych HBV. Miano przeciwciał anty-HBV po dwukrotnej immunizacji takim preparatem było do trzech razy większe w porównaniu z wynikami osiągniętymi po trzykrotnym zaaplikowaniu klasycznej szczepionki, zawierającej tylko antygen S-HBs. Co ważniejsze, preparat ten wywoływał odpowiedź immunologiczną u zdecydowanie większego odsetka pacjentów gorzej odpowiadających na szczepionki przeciw hepatitis B: starszych, mężczyzn,

PL 216 099 B1 palaczy oraz osób z nadwagą (Young 2001). W innych doświadczeniach wykazano, że osoby, które pierwotnie nie odpowiedziały na szczepionkę zawierającą tylko mały antygen powierzchniowy, wykształciły odpowiednie przeciwciała po podaniu preparatu, w którym obecne były również antygeny średni M-HBs i duży L-HBs. Po pojedynczej dawce prawie 70% (Zuckerman 1997), natomiast po dwukrotnym zaaplikowaniu specyfiku blisko 80% pacjentów uległo serokonwersji (Yap 1996). Większą skuteczność szczepionki zawierającej wszystkie antygeny otoczki potwierdzają również badania, w których użycie kilkukrotnie mniejszej dawki takiego preparatu (2,5 μg) od standardowej dawki szczepionki opartej na antygenie S-HBs, wywoływało powstanie odpowiednich przeciwciał u 100% szczepionych dzieci (Madaliński 2002).

Oprócz prac nad otrzymaniem udoskonalonej szczepionki profilaktycznej przeciwko wzw B, podejmowane są działania zmierzające do opracowania specyfików służących terapii chronicznej postaci choroby, na którą zapada do 10% dorosłych, do 40% dzieci i aż 90% noworodków. Obecnie stosowana terapia interferonem przynosi umiarkowanie pozytywne efekty u około 30-50% pacjentów (Juszczyk 2000, Martin-Vivaldi 2000), a znaczny odsetek osób odczuwa silne skutki uboczne (Deres 2003). Wobec tych problemów, zainteresowanie wzbudza podejście oparte na próbach modulacji odpowiedzi immunologicznej za pomocą preparatów zawierających wszystkie antygeny powierzchniowe otoczki HBV i/lub antygen rdzeniowy, tj. HBcAg (Hepatitis B core Antygen). Dotychczasowe próby immunoterapii przewlekłego wzw B realizowane za pomocą preparatu antygenów powierzchniowych S-, Μi L-HBsAg dały obiecujące wyniki, ponieważ uzyskano stukrotnie podwyższoną immunogenność w stosunku do szczepionki standardowej (Yuen 2001) lub stwierdzono indukcję humoralnej odpowiedzi immunologicznej względem antygenu HBs oraz pewną odpowiedź cytotoksyczną u 50% chronicznych nosicieli HBV (Couillin 1999, Pol 1998). Oprócz białek otoczki, ważną rolę w przyszłej szczepionce terapeutycznej przypisuje się antygenowi rdzeniowemu HBcAg, z którego zbudowany jest kapsyd wirusa hepatitis B. Antygen HBc jest silnym immunogenem zarówno zależnym od limfocytów T, jak też T-niezależnym i z tego powodu jest doskonałym kandydatem do konstruowania szczepionek terapeutycznych indukując zarówno silną odpowiedź cytotoksyczną, jak również humoralną odpowiedź przeciwciał anty-HBc (Heathcote 1999, Bocher 2001).

Wzrastająca liczba nosicieli HBV, konieczność masowych szczepień, jak również niewystarczająca efektywność dotychczasowych preparatów powodują, że opracowanie tanich szczepionek profilaktycznych o podwyższonej skuteczności oraz szczepionek terapeutycznych przeciwko wzw B jest powszechnie oczekiwane.

Opierając się na dotychczasowych danych można założyć, że immunogenność preparatu zawierającego wszystkie antygeny otoczki, tj. S-. M- i L-HBsAg i/lub antygen rdzeniowy HBcAg, będzie bardzo podobna do wywoływanej przez kompletne wiriony HBV, tzw. cząstki Dane'a. Preparat taki będący „szczepionkowym analogiem pełnego wirusa indukowałby silną odpowiedź immunologiczną poprzez elicytację przeciwciał przeciwko wszystkim antygenom wirusa. Szczepienie tego rodzaju preparatem stwarzałoby sytuację zbliżoną do immunizacji natywnym wirusem, jednakże bezpieczną, ponieważ preparat ten jako pozbawiony materiału genetycznego i stąd nieinfekcyjny, nie wywoływałby objawów chorobowych. Wytworzenie panelu roślin transgenicznych produkujących komplet antygenów HBV pochodzących z różnych szczepów wirusa, pozwoli na opracowanie alternatywnej szczepionki pochodzenia roślinnego, zarówno profilaktycznej i terapeutycznej przeciwko wielu szczepom (podtypom, serotypom) HBV.

Głównym założeniem otrzymania szczepionki profilaktycznej o podwyższonej efektywności i terapeutycznej przeciwko wzw B aplikowanej doustnie, parenteralnie lub donosowo jest ekspresja i wydajna produkcja wysoce immunogennych podjednostek antygenu powierzchniowego S-HBs, M-HBs i L-HBs oraz antygenu rdzeniowego HBc różnych szczepów HBV w transgenicznej roślinie jadalnej w przypadku szczepionki doustnej lub cechującej się szybkim wzrostem, dużą biomasą i łatwością ekstrakcji w przypadku szczepionki parenteralnej lub donosowej. Prace nad tym zagadnieniem prowadzono przez szereg lat w kilku grupach badawczych (patrz cytowana literatura) na całym świecie. Dotychczas otrzymywane rośliny transgeniczne lub kultury tkanek/komórek syntetyzowały antygeny powierzchniowe HBV oraz charakteryzowały się w każdym przypadku opornością na antybiotyki, głównie kanamycynę. Jednocześnie poziom ekspresji białek HBsAg był niewysoki i dla S-HBsAg oscylował w granicach 1-3 μg/gram świeżej masy (ang. g of fresh weight, g FW), a sporadycznie wynosił maksymalnie 16 μg/g FW, dla M-HBsAg 0,01-1 μg/g FW, a dla L-HBsAg w^: 0,01 μg/g FW. Ponadto, w badaniach nad immunizacją doustną zwierząt, ewentualnie ochotników, wykorzystywano wyłącznie świeży nieprzetworzony, tj. surowy materiał roślinny.

PL 216 099 B1

Założeniem wynalazku jest uzyskanie alternatywnej doustnej oraz parenteralnej lub donosowej profilaktycznej oraz terapeutycznej szczepionki III generacji przeciwko wzw B, opracowanej z wykorzystaniem roślin transgenicznych.

W szczególności, pierwszym celem wynalazku jest wydajna ekspresja antygenu rdzeniowego HBcAg, należącego do różnych podtypów HBV, w jadalnych roślinach transgenicznych. np. w sałacie, umożliwiająca opracowanie szczepionki aplikowanej doustnie, np. w formie zawiesiny, syropu, granulatu, tabletki bądź kapsułki. Szczepionka doustna w tej postaci byłaby istotnie łatwiejsza do zastosowania na szeroką skalę, zarówno jako szczepionka pierwotna, jak i jako szczepionka przypominająca dla osób uprzednio szczepionych, u których miano przeciwciał anty-HBs obniżyło się, względnie przeciwciała anty-HBs nie są już wykrywalne.

W szczególności, drugim celem wynalazku jest wydajna ekspresja antygenu rdzeniowego HBcAg, należącego do różnych podtypów HBV, w tytoniu jako gatunku cechującym się szybkim wzrostem i dużą biomasą, pozwalająca na efektywną ekstrakcję i oczyszczenie antygenów jako podstawowych składników szczepionki aplikowanej parenteralnie w formie zastrzyku lub donosowo w formie aerozolu lub kropel. Zastosowanie roślin transgenicznych do produkcji komponentów szczepionki byłoby w założeniu istotnie tańsze od stosowanych obecnie przemysłowych metod produkcji mikrobiologicznej.

Nieoczekiwanie, opisane powyżej cele zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku. Kolejne przedmioty wynalazku zostały zdefiniowane w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

Przedmiotem wynalazku jest transgeniczna komórka roślinna zdolna do ekspresji antygenu rdzeniowego HBcAg wirusa HBV szczepu ayw4 lub adw4 na poziomie > 50 ąg/g św. m., przy czym zawiera ona cząsteczkę T-DNA składającą się z sekwencji granicznych T-DNA oraz umieszczonych pomiędzy nimi dwóch kaset ekspresyjnych:

- pierwszej kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej białko HBcAg wirusa HBV szczepu ayw4 lub adw4 oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji promotora 35S RNA CaMV z pojedynczym enhancerem i terminatora transkrypcji syntazy nopalinowej (NOSt), korzystnie zawierającą co najmniej jedną spośród sekwencji: SEQ ID No. 12 i SEQ ID No. 13, oraz

- drugiej kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej gen oporności na herbicydy fosfinotricynowe, korzystnie genu bar, oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t, korzystnie zawierającą SEQ ID No. 16.

Korzystnie, komórką według wynalazku jest komórka sałaty albo tytoniu.

Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonej komórki roślinnej do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

W korzystnej realizacji, stosowane komórki roślinne mają postać biomasy roślinnej, zwłaszcza liofilizowanego materiału roślinnego, korzystnie sałaty.

Korzystnie, wytwarzana szczepionka ma postać wybraną spośród: zawiesiny, syropu, g ranul atu, tabletek, kapsułek.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórki roślinnej określonej powyżej do wytwarzania aplikowanej parenteralnie lub donosowo szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

W korzystnej realizacji, stosowane komórki roślinne, korzystnie tytoniu, wytwarzają białka antygenu rdzeniowego HBcAg wirusa HBV, które mogą być ekstrahowane i oczyszczone.

Korzystnie, wytwarzana szczepionka ma postać wybraną spośród zastrzyku podawanego na drodze iniekcji parenteralnej lub podawanych donosowo aerozolu lub kropel.

Szczegółowy opis wynalazku

W wynalazku została ujawniona transgeniczna komórka roślinna i zregenerowane oraz potomne rośliny kolejnych pokoleń sałaty i tytoniu, jak również ich klony wegetatywne, posiadające oporność na fosfinotricynę i pochodne herbicydy i zdolne do ekspresji białka HBcAg wirusa HBV szczepu ayw4 lub udw4 na poziomie > 50 ąg/g św. m. (FW), przy czym komórki zawierają pochodzącą z wektora ekspresyjnego cząsteczkę T-DNA złożoną z sekwencji granicznych i umieszczonych między nimi dwóch kaset ekspresyjnych:

- Pierwszej, składające się z sekwencji kodującej antygen rdzeniowy (HBcAg) wirusa HBV szczepu ayw4 lub adw4 oraz kontrolujących ich ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie promotora 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) oraz terminatora syntazy nopalinowej (NOSt). Korzystnie posiadają one sekwencje przedstawione jako SEQ ID No. 12 i SEQ ID No. 13.

PL 216 099 B1

- Drugiej, składającej się z sekwencji kodującej gen oporności na fosfinotricynę, korzystnie gen bar oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t, przedstawionej jako SEQ ID No. 16.

Pochodzący z sałaty materiał roślinny może być zastosowany jako szczepionka doustna przeciwko HBV i w konsekwencji przeciwko wzw B. Materiał roślinny według wynalazku po odwodnieniu na drodze liofilizacji w warunkach głębokiego zamrożenia, zachowuje w temperaturze pokojowej natywną strukturę białka antygenowego HBcAg i immunogenność przez okres co najmniej 12 miesięcy i może być zastosowany do otrzymania szczepionki doustnej przeciwko wzw B w formie zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek.

Pochodzący z tytoniu materiał roślinny może być zastosowany jako surowiec do ekstrakcji i oczyszczenia antygenu HBcAg jako komponentu szczepionki przeciwko HBV i w konsekwencji przeciwko wzw B. zarówno parenteralnej w formie zastrzyku domięśniowego lub dootrzewnowego lub podskórnego, bądź szczepionki donosowej w formie aerozolu lub kropel.

W wynalazku ujawniono również zastosowanie komórki roślinnej sałaty według wynalazku do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

Liofilizowany materiał roślinny zawierający antygen S-HBsAg podany per os w formie zawiesiny zwierzętom doświadczalnym wywoływał odpowiedź immunologiczną błon śluzowych charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał klasy IgA anty-HBs oraz odpowiedź ogólnoustrojową charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał IgA i IgG anty-SHBs. W szczególności, liofilizowany materiał roślinny według wynalazku podany per os jednokrotnie uprzednio immunizowanym per os zwierzętom doświadczalnym wywołuje wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej błon śluzowych charakteryzującej się wytwarzaniem przeciwciał klasy IgA anty-HBs oraz wzmocnienie odpowiedzi ogólnoustrojowej charakteryzującej się wytwarzaniem przeciwciał IgA i IgG anty-HBs. Z wysokim prawdopodobieństwem można założyć, że podobny efekt immunizacyjny zachodzić będzie dla materiału roślinnego zawierającego HBcAg ayw4/adw4.

Korzystnie, wytwarzana szczepionka doustna ma postać wybraną spośród: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek i kapsułek. Korzystnie, granulat, tabletki oraz kapsułki uformowane ze sproszkowanego liofilizatu transgenicznej sałaty według wynalazku zachowują w temperaturze pokojowej natywną strukturę białka antygenowego HBcAg i immunogenność przez okres co najmniej 12 miesięcy.

W wynalazku ujawniono także zastosowanie komórki roślinnej tytoniu według wynalazku do wytwarzania parenteralnej lub donosowej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

Na podstawie obecnego stanu wiedzy, z wysokim prawdopodobieństwem można założyć, że antygen HBcAg poddany ekstrakcji i oczyszczaniu, korzystnie z materiału roślinnego wg wynalazku, podany na drodze iniekcji parenteralnej (domięśniowej, dootrzewnowej, podskórnej) będzie wywoływać ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał anty-HBc, głównie z klasy IgG oraz pozostałych klas, jak również antygen ten podany na drodze donosowej w postaci aerozolu lub kropel przez błonę śluzową jamy nosowej będzie wywoływać odpowiedź immunologiczną błon śluzowych charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał klasy IgA antyHBc oraz odpowiedź ogólnoustrojową charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał anty-HBc, głównie klasy IgG oraz pozostałych klas.

W stosunku do znanych ze stanu techniki wyników wynalazek reprezentuje istotne nowości i zasadniczo innowacyjne podejście do otrzymania doustnej, parenteralnej lub donosowej szczepionki III generacji przeciwko wzw B, obejmujące następujące elementy:

- transgeniczne rośliny sałaty wytwarzające HBcAg na poziomie przekraczającym 50 ąg HBcAg/g FW i dochodzącym do 200 ąg/g FW oraz nie zawierające markerowych genów oporności na antybiotyki lecz oporne na herbicydy fosfinotricynowe, np. Basta, przez co nie stwarzają zagrożenia potencjalnego poszerzenia antybiotykooporności mikroflory ustroju człowieka

- otrzymanie z sałaty transgenicznej wytwarzającej HBcAg po raz pierwszy prototypu szczepionki doustnej w skondensowanej formie liofilizatu, wyjściowego półproduktu dla postaci doustnej szczepionki jak: zawiesina liofilizatu, syrop, granulat, tabletki lub kapsułki

- transgeniczne rośliny tytoniu wytwarzające HBcAg na poziomie przekraczającym 50 ąg HBcAg/g FW i dochodzącym do 500 ąg/g FW, co stanowi podstawę do wydajnego uzyskiwania na skalę przemysłową antygenu HBcAg na drodze ekstrakcji i oczyszczania dla potrzeb szczepionki parenteralnej lub donosowej, a jednocześnie oporne na herbicydy fosfinotricynowe. np. Basta, co umożliwia ich uprawę w warunkach polowych.

PL 216 099 B1

Jedną z korzystnych realizacji wynalazku są wektory pKHBCBAR i pKHBCadwBAR [Fig. 1] do otrzymywania roślin opornych na herbicydy fosfionotricynowe. np. Basta i jednocześnie eksprymujących heterologiczne białko HBcAg w sposób konstytutywny, głównie w liściach.

Ważną cechą wektorów jest T-DNA zawierające dwie kasety ekspresyjne, determinujące ekspresję immunogennego białka antygenu rdzeniowego HBc (podtypu ayw4/adw4) wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) oraz acetylotransferazy fosfinotricyny, warunkującej oporność na fosfinotricynę, która jest składnikiem niektórych herbicydów o nieselektywnym działaniu, np. Basta. W skład pierwszej kasety wchodzi sekwencja kodująca antygenowe białko HBcAg pod kontrolą sekwencji regulatorowych: promotora 35S RNA CaMV z pojedynczym enhancerem i terminatora transkrypcji syntazy nopalinowej (NOSt). W skład drugiej kasety wchodzi sekwencja kodująca genu bar pod kontrolą promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t. Kolejną istotną cechą skonstruowanego T-DNA jest występowanie wymienionych sekwencji kodujących lub regulatorowych wyłącznie w jednej kopii i w określonej orientacji względem siebie [Fig. 1]. Brak powtórzeń motywów sekwencyjnych powoduje wyeliminowanie rekombinacji w obrębie wprowadzonego T-DNA oraz zrównoważoną transkrypcję poszczególnych transgenów. Cechy konstrukcyjne T-DNA przyczyniają się zatem do ograniczenia zjawiska wyciszania genów, a tym samym do większej stabilności T-DNA w obrębie genomu roślin transgenicznych, co jest szczególnie istotne w odniesieniu do sałaty, której genom jest stosunkowo zmienny i ulegający rearanżacjom (McCabe 1999). W konsekwencji cechy konstrukcyjne F-DNA przyczyniają się do stabilnej ekspresji transgenów HBc oraz bar w komórkach roślinnych.

W wynalazku przedstawiono transformowane komórki sałaty i tytoniu oraz zregenerowane z nich rośliny, a także rośliny kolejnych pokoleń generatywnych i/lub wegetatywnych charakteryzujące się jednoczesną ekspresją białka antygenu rdzeniowego - HBcAg wirusa HBV ayw4/adw4 oraz opornością na herbicydy fosfinotricynowe. Oporność roślin na herbicydy umożliwia wykorzystanie takiego produktu jako materiału wyjściowego do otrzymania szczepionki doustnej bądź uprawę roślin w warunkach polowych zgodnie z obowiązującymi wymogami i zaleceniami.

Transformowanie sałaty i tytoniu za pomocą wektorów opisanych w wynalazku [Fig. 1] zapewnia otrzymanie linii roślin transgenicznych [Fig. 2], których znamienną cechą jest oporność na herbicydy fosfinotricynowe. np. Basta oraz ekspresja białka HBcAg na poziomie > 50 ąg/g FW do 500 ąg/g FW [Fig. 3-4]. Cechy te utrzymują się zarówno w pierwotnych regenerantach (pokolenie T0) oraz w pierwszym (T1) i w kolejnych pokoleniach generatywnych, jak i w klonach wegetatywnych. Linie transgenicznych roślin analizowano techniką PCR w celu wstępnego potwierdzenia obecności sekwencji transgenu w DNA genomowym, jak również w celu określenia/potwierdzenia mendlowskiego mechanizmu 3:1 dziedziczenia transgenu roślin transgenicznych [Fg. 2A]. Następnie, genomowy DNA roślin z poszczególnych linii poddano hybrydyzacji z sondą komplementarną do sekwencji transgenu HBc według techniki Southern blot [Fig. 2B] w celu określenia liczby miejsc integracji T-DNA zawierającego transgeny. Rośliny pokolenia T0 i T1 badano również pod kątem ekspresji antygenu rdzeniowego HBc za pomocą jakościowego i ilościowego kanapkowego testu immunoenzymatycznego, czyli sandwich ELISA z użyciem specyficznych przeciwciał firmy Biodesign [Fig. 3], a także przy użyciu techniki Western-blot [Fig. 4]. Wytwarzane w roślinach białko antygenowe HBcAg charakteryzuje się natywną strukturą, zdolnością do glikozylacji oraz zachowuje zdolność do składania się w wysoce immunogenne cząstki kapsydopodobne (ang. Capsid-Like Particles, CLPs), bądź mniejsze agregaty, o czym świadczą wyniki ELISA, ukierunkowanego na wykrywanie białka HBcAg ustrukturalizowanego w cząstki CLPs/agregaty. Z kolei, wśród obserwowanych w Western-blot prążków odpowiadających różnym formom białka HBcAg, znajdują się również formy glikozylowane oraz dimery, które są pierwszym etapem w procesie składania się cząstek CLPs. Cząstki takie obserwowano również za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM1200EXII firmy Jeol bezpośrednio w komórkach mezofilu liści tytoniu [Fig. 5]. przygotowanych za pomocą standardowych technik seryjnych skrawków i kontrastowania z niewielkimi modyfikacjami (Kocjan 1996).

W wynalazku przedstawiono również zastosowanie transgenicznej sałaty, opornej na fosfinotricynę i wytwarzającej białko antygenowe HBcAg jako komponentu do otrzymania profilaktycznej i terapeutycznej doustnej szczepionki III generacji przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B. tj. zawierającej pełen zestaw białek strukturalnych HBV. Sałata (Lactuca sativa L.) jest gatunkiem, który w odróżnieniu od wykorzystywanych dotychczas gatunków roślin charakteryzuje się właściwościami istotnymi dla otrzymywania szczepionki podawanej na drodze doustnej. Liście sałaty, odmiennie niż zdecydowana większość roślin uprawnych, nadają się do bezpośredniego spożycia bez potrzeby uzdatniania, przede wszystkim obróbki termicznej. Nie zawierają też żadnych substancji antyżywiePL 216 099 B1 niowych lub wywołujących alergię, których obecność mogłaby stanowić czynnik limitujący spożycie. Znamienną cechą transgenicznej sałaty wytwarzającej HBcAg i jednocześnie opornej na herbicyd jest przydatność i dogodność jej wykorzystania jako materiału wyjściowego dla wytworzenia szczepionki przeciwko wzw B aplikowanej na drodze doustnej.

W wynalazku ujawniono także zliofilizowany materiał roślinny, jego zastosowanie do otrzymania szczepionki doustnej III generacji w formie pochodnych: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek i kapsułek zawierających m.in. białko szczepionkowe HBcAg, a także wymienione formy pochodne liofilizatu i sposób ich przygotowania z materiału roślinnego. Skuteczna szczepionka doustna III generacji przeciwko wzw B. w przeciwieństwie do stosowanych dotychczas rozwiązań [patrz cytowana literatura], posiada skondensowaną formę sproszkowanego liofilizatu aplikowaną w formie zawiesiny, syropu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek. Materiałem wyjściowym do otrzymania kondensatu są liście poszczególnych linii sałaty, zawierające białka antygenowe, w tym HBcAg, które są poddawane liofilizacji. Materiał pochodzący z poszczególnych linii jest mielony na proszek, a następnie może być komponowany do preparatu zawierającego określone ilości białek antygenowych, w tym HBcAg, rożnych podtypów HBV, odpowiednie dla wywołania pożądanej odpowiedzi immunologicznej. Preparat ten przy użyciu roztworu soli fizjologicznej lub podobnego buforu, np. PBS, bądź po dodaniu substancji pomocniczych może być przeprowadzany do formy zawiesiny lub syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek [Fig. 5A], Sproszkowany, Iiofilizowany materiał roślinny oraz forma zawiesinowa/syropowa lub granulatowa/tabletkowa/kapsułkowa szczepionki doustnej III generacji przeciwko wzw B [Fig. 5A], w przeciwieństwie do surowego materiału roślinnego, charakteryzują się znamiennymi cechami umożliwiającymi:

- utrwalenie materiału roślinnego z zachowaniem wysokiej zawartości szczepionkowego białka HBcAg różnych podtypów

- skoncentrowanie dawki czynnika szczepionkowego, tj. białka HBcAg różnych podtypów do poziomu wystarczającego do immunizacji na drodze doustnej

- podawanie stałej wystandaryzowanej dawki HBcAg dzięki a) kontroli poziomu białka antygenowego na poszczególnych etapach przygotowania półproduktu - liofilizatu zawierającego antygen, b) kontroli poziomu białka antygenowego na etapie sporządzania zawiesiny lub syropu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek oraz c) doborowi odpowiednich materiałów wyjściowych i komponentów wypełniających

- ustalenie odpowiednich proporcji HBcAg różnych podtypów dla uzyskania odpowiedniego poziomu zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej, bądź dla uzyskania odpowiedniego efektu terapeutycznego chronicznej postaci wzw B, wywoływanej przez najczęściej występujące szczepy HBV

- ustalenie skutecznego protokołu szczepienia poprzez kontrolowanie dawki i reżimu czasowego immunizacji

- łatwe przechowywanie sproszkowanego liofilizatu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek w temperaturze pokojowej z zachowaniem trwałości HBcAg przez okres co najmniej 12 miesięcy

- prosty sposób szczepienia na drodze doustnej poprzez wypicie lub połknięcie

W wynalazku przedstawiono zastosowanie transgenicznego tytoniu opornego na fosfinotricynę i wytwarzającego białko antygenowe HBcAg do otrzymania profilaktycznej i terapeutycznej parenteralnej lub donosowej szczepionki III generacji przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B. Tytoń (Nicotiana tabacum L.) jest gatunkiem rośliny, która charakteryzuje się właściwościami istotnymi dla wytwarzania białek. Produkcja białek heterologicznych w tytoniu opornym na herbicydy cechuje się wysoką opłacalnością, co wynika z niskich kosztów uprawy w warunkach zarówno szklarniowych, jak i polowych, szybkiego wzrostu, dużej biomasy oraz stałości i wydajności poziomu ekspresji białek heterologicznych. Antygenowe białka HBV, w tym HBcAg, tworzące cząstki CLPs lub agregaty w liściach tytoniu [Fig. 5B] mogą być ekstrahowane i oczyszczane z materiału roślinnego z użyciem standardowych metod fizycznych, np. wirowania i fizykochemicznych, np. chromatografii powinowactwa. Oczyszczony antygen HBcAg różnych podtypów może następnie być wykorzystany do przygotowania preparatu zawierającego określone proporcje poszczególnych antygenów dla uzyskania odpowiedniego poziomu odpowiedzi immunologicznej zabezpieczającej przed wzw B, bądź dla uzyskania odpowiedniego efektu terapeutycznego chronicznej postaci wzw B. Preparat białek szczepionkowych, po dodaniu adiuwantów, stabilizatorów i innych substancji może być użyty do szczepień wg stosowanych procedur na drodze iniekcji parenteralnej (domięśniowej, dootrzewnowej, podskórnej) bądź przez błony śluzowe w formie aerozolu lub kropel aplikowanych donosowo [Fig. 5B]. Znamienną cechą transgenicznego tytoniu wytwarzającego HBcAg i jednocześnie opornego na herbicydy jest przydatność

PL 216 099 B1 i dogodność jego wykorzystania jako materiału wyjściowego dla wytworzenia profilaktycznej i terapeutycznej szczepionki IIl generacji przeciwko wzw B zawierającej oczyszczone antygeny i aplikowanej na drodze parenteralnej lub donosowej.

Uzyskane zgodnie z wynalazkiem szczepionki III generacji mogą być wykorzystane do szczepienia przeciwko wzw B na drodze doustnej za pomocą zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek wytworzonych ze sproszkowanego liofilizatu pochodzącego z sałaty zawierającego antygen HBcAg, bądź na drodze parenteralnej za pomocą zastrzyków lub donosowej za pomocą aerozolu lub kropel zawierających ekstrahowany i oczyszczony z tkanek tytoniu antygen HBcAg. Uzyskane preparaty mogą być również wykorzystane w kombinowanej immunizacji doustno-parenteralnej lub doustno-donosowej lub donosowo-parenteralnej.

Antygen rdzeniowy HBcAg i pozostałe antygeny wirusa HBV są silnymi immunogenami, które wywołują odpowiedź immunologiczną u szeregu gatunków ssaków, w tym u myszy, szympansa oraz człowieka. Odpowiedź immunologiczna może być typu komórkowego obejmującego powstawanie specyficznych limfocytów cytotoksycznych lub typu humoralnego polegającego na powstawaniu specyficznych przeciwciał. Przyjmuje się, że u człowieka i szympansa zaindukowana na odpowiednim poziomie odpowiedź humoralna jest wystarczająca do ochrony przed zachorowaniem po ekspozycji na wirusa. W zależności od sposobu podania immunogenu, reakcja immunologiczna na antygeny HBV obejmuje powstawanie przeciwciał głównie klasy IgG oraz innych klas przy immunizacji parenteralnej (iniekcja domięśniowa, dootrzewnowa lub podskórna) oraz IgG i IgA przy immunizacji poprzez błony śluzowe przewodu pokarmowego, tj. metodą doustną (za pomocą zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek) oraz poprzez nabłonek dróg oddechowych, tj. metodą donosową (za pomocą aerozolu lub kropli), ewentualnie także na drodze waginalnej, rektalnej lub poprzez skórę.

Istotnym elementem sposobu szczepienia antygenem HBcAg produkowanym w roślinach zgodnie z wynalazkiem jest immunizacja poprzez błony śluzowe - jelita w przypadku szczepionki doustnej wytworzonej z sałaty lub śluzówkę nosa w przypadku szczepionki donosowej wytworzonej na bazie antygenu ekstrahowanego i oczyszczanego z tytoniu.

Według dostępnej wiedzy (Mowat i Viney 1997. Langridge 2000, Mowat 2003, Poonam 2007), białka antygenowe znajdujące się w kontakcie z błonami śluzowymi indukują lokalnie zasocjowane komórki układu immunologicznego, w tym GALT (Gut Associated Lyphoid Tissue) w jelicie, NALT (Nasal Associated Lymphoid Tissue) w śluzówce nosa i BALT (Bronchus Associated Lymhoid Tissue) dalszych dróg oddechowych oraz inne. W strukturze GALT, NALT lub BALT znajdują się wyspecjalizowane komórki (np. komórki M w kępkach Peyera w śluzówce jelita), które od strony środowiska zewnętrznego, tj. światła jelita lub jamy nosa i dalszych dróg oddechowych pobierają zdegradowane i kompletne białka antygenowe oraz wirusy, bakterie lub pierwotniaki. Antygeny lub drobnoustroje są następnie transportowane do komórek układu immunologicznego, w tym komórek prezentujących antygen (APC - Antigen Presenting Cells), tj. komórek dendrytycznych i makroIagow oraz limfocytów T i B, zarówno lokalnie w obrębie błon śluzowych, jak i do obwodowych organów Iimfatycznych w wyniku cyrkulacji ogólnoustrojowej. W wyniku prezentacji antygenów limfocytom Th obecnym w śluzówce jelita lub dróg oddechowych dochodzi do lokalnej humoralnej odpowiedzi immunologicznej poprzez aktywację limfocytów Th, wydzielania cytokin i następującej aktywacji limfocytów B objawiającej się wydzielaniem przez błony śluzowe antygenowo-specyficznych przeciwciał klasy IgA. W kolejnych etapach limfocyty Th przechodzą do krwi i po dotarciu do obwodowych organów układu immunologicznego wywołują na podobnej drodze aktywacji ogólnoustrojową odpowiedź humoralną w klasie przeciwciał IgG i pozostałych klas (IgM, IgA) oraz ewentualnie odpowiedź komórkową objawiającą się wykształceniem subpopulacji limfocytów cytotoksycznych Tc aktywowanych antygenem, a także pamięci immunologicznej.

Jak wykazano uprzednio, antygen S-HBsAg jest immunogenny dla myszy po uprzednim utrwaleniu materiału roślinnego sałaty zawierającego S-HBsAg na drodze liofilizacji i przeprowadzeniu bezpośrednio przed podaniem w formę zawiesiny. Odpowiedź immunologiczna na antygen S-HBsAg powstaje w wyniku pierwotnego doustnego podania antygenu (priming), a następnie w efekcie powtarzanych jednej lub więcej immunizacji, których rezultatem jest odpowiedź wtórna (boosting). Można z wysokim prawdopodobieństwem założyć, że podobną odpowiedź immunologiczną po podaniu doustnym będzie wywoływał preparat szczepionki zawierający antygen HBcAg i pozostałe antygeny HBV. Przesłanką takiego założenia jest pokrewieństwo strukturalne antygenów HBV, objawiające się zdolnością do tworzenia struktur wyższego rzędu, tj. cząstek VLPs/CLPs lub agregatów, w tym formowanych przez HBcAg. Podobieństwo mechanizmów śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej

PL 216 099 B1 w obrębie GALT i NALT/ BALT (Brandtzaeg 2007, Poonam 2007) pozwala z kolei przyjąć, że donosowo podany preparat szczepionkowy zawierający oczyszczone HBcAg i pozostałe antygeny HBV będzie indukować lokalną i ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną.

Wytworzony w roślinach według wynalazku i oczyszczony antygen HBcAg będzie mógł być również użyty jako składnik standardowo aplikowanych szczepionek, tj. na drodze iniekcji parenteralnej wg stosowanych procedur. Istotnym dla tej metody szczepień jest alternatywny sposób produkcji szczepionkowych antygenów w roślinach.

Produkcja antygenu HBcAg różnych podtypów w odrębnych liniach roślin transgenicznych według wynalazku pozwala na optymalne ustalenie i wystandaryzowanie proporcji poszczególnych immunogenów szczepionki dla potrzeb wysoce skutecznej profilaktycznej i terapeutycznej szczepionki III generacji przeciwko wzw B, zarówno doustnej, jak i donosowej lub parenteralnej. Możliwość użycia HBcAg i pozostałych antygenów, dwóch najczęściej (ayw4, adw4) lub innych spotykanych szczepów HBV pozwoli na ustalenie optymalnych parametrów efektywnej immunizacji. tj. liczby i wysokości dawek antygenu, okresów pomiędzy poszczególnymi immunizacjami. użycia adiuwantów itp. W kolejnym etapie wystandaryzowanie szczepionki odbywać się będzie poprzez odpowiedni dobór proporcji antygenu HBcAg i pozostałych, oczyszczonych w przypadku szczepionki donosowej lub parenteralnej lub w przypadku szczepionki doustnej obecnych w utrwalonych materiałach roślinnych, tj. sproszkowanych liofilizatach zawierających określone ilości antygenów.

Rodzaj szczepionki według wynalazku, tj. doustna w formie zawiesiny, syropu, granulatu, tabletki, kapsułki, bądź donosowa w formie aerozolu lub kropel, bądź parenteralna w formie zastrzyku umożliwia szerokie spektrum metod immunizacji w zależności od wieku immunizowanych zwierząt i ludzi, ogólnej kondycji oraz immunokompetencji, płci, wagi ciała i innych parametrów mających wpływ na odpowiedź immunologiczną. Zróżnicowanie typów szczepionki według wynalazku umożliwia ponadto stosowanie jednej metody lub kombinacji różnych metod immunizacji. tj. doustno-donosowa, doustno-parenteralna, donosowo-parenteralna itp. w celu uzyskania maksymalnego poziomu lub zakresu humoralnej odpowiedzi immunologicznej, tj. elicytacji przeciwciał klasy IgG bądź IgG i IgA, bądź też odpowiedzi komórkowej. Ponieważ zakłada się, że wertykalna transmisja HBV obejmować może błony śluzowe jako wrota zakażenia, kombinacja metod immunizacji łącząca drogę jelitowo-śluzówkową, oddechowo-śluzówkową i parenteralną za pomocą różnych form szczepionki profilaktycznej i terapeutycznej III generacji według wynalazku stanowić będzie potencjalnie bardziej szczelną ochronę immunologiczną w rodzinach osób zakażonych HBV lub u przewlekłych nosicieli HBV, gdzie może dochodzić do wertykalnej transmisji zakażenia.

Dla lepszego zilustrowania istoty wynalazku niniejszy opis wzbogacono o wykaz sekwencji i figury.

Sekwencja nr 12 (SEQ ID No. 12) prezentuje sekwencję nukleotydową kasety ekspresyjnej P35S-HBcayw4-NOSt znajdującą się w opisanym w przykładach wektorze binarnym pKHBCBAR, przeznaczonym do transformacji roślin.

Sekwencja nr 13 (SEQ ID No. 13) prezentuje sekwencję nukleotydową kasety ekspresyjnej P35S-HBcadw4-NOSt znajdującą się w opisanym w przykładach wektorze binarnym pKHBCadwBAR przeznaczonym do transformacji roślin.

Sekwencja nr 16 (SEQ ID No. 16) prezentuje sekwencję nukleotydową kasety ekspresyjnej PNOS-bar-g7t znajdującą się w opisanych w przykładach wektorach binarnych pKHBCBAR i pKHBCadwBAR.

Na figurze 1 przedstawiono schemat konstrukcji wektora pKHBCBAR i pKHBCadwBAR użytych do transformacji sałaty i tytoniu zawierających sekwencję kodującą HBc antygenu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) szczepu ayw4 lub adw4, pod kontrolą konstytutywnego promotora 35S RNA CaMV (P35S) i terminatora syntazy nopalinowej (NOSt) oraz sekwencję genu bar kodującą acetylotransferazę fosfinotricyny pod kontrolą promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora g7t. determinującą oporność roślin transgenicznych na herbicydy fosfinotricynowe.

Oznaczenia: HBc, HBcAg - sekwencja kodująca średni antygen powierzchniowy HBVayw4 lub adw4, P35S - promotor 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), NOSt

- terminator genu syntazy nopalinowej. BAR - sekwencja kodująca genu bar - acetylotransferazy fosfinotricyny, PNOS - promotor genu syntazy nopalinowej, g7t - terminator g7, RB, LB - prawa i lewa sekwencja graniczna T-DNA, NPT III - gen fosfotransferazy neomycynowej, GUS - sekwencja kodująca β-glukuronidazy, GUS-INT - sekwencja kodująca β-glukuronidazy z intronem; (ayw/adw) identyczna konstrukcja plazmidu z sekwencją kod, antygen HBV szczepu ayw4 i adw4, nazwa wektora binarnego bez indeksu - wektor zawiera sekwencję kod. antygen HBV szczepu ayw4, nazwa wektora binarnego z indeksem „adw”- wektor zawiera sekwencję kod. antygen HBV szczepu adw4.

PL 216 099 B1

Na figurze 2 przedstawiono wyniki analizy obecności transgenów zawierających sekwencje kodujące antygen HBcAg w DNA genomowym potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) oraz tytoniu za pomocą metody PCR z użyciem starterów specyficznych do danej sekwencji kodującej oraz za pomocą techniki Southern-blot z użyciem sond specyficznych wobec poszczególnych sekwencji kodujących.

A - elektroforegram produktów reakcji amplifikacji transgenu HBc w roślinach tytoniu linii Tt15

Oznaczenia ścieżek elektroforegramu: M - marker wielkości fragmentów DNA (200 pz DNA Ladder, MBI Fermentas), 2-70 - analizowane rośliny, N - kontrola negatywna - DNA rośliny nietransgenicznej, P - kontrola pozytywna - plazmid pKHBCBAR.

B - wynik analizy Southern-blot linii sałaty dla transgenu HBc

Oznaczenia ścieżek biotu: 16A/27 - 21/12 - analizowane rośliny, N - kontrola negatywna - DNA rośliny nietransgenicznej, P - kontrola pozytywna - plazmid pKHBCBAR traw. EcoR I oraz EcoR I i Kpn I

Na figurze 3 przedstawiono wykres analizy zawartości białka antygenowego HBcAg za pomocą immunoenzymatycznego testu ELISA w liściach potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) linii LT12-4J (A) i tytoniu linii Tt15 (B) zawierających sekwencję kodującą HBcAg pod kontrolą konstytutywnego promotora 35S. Zawartość białka wyrażono w ąg/g świeżej masy jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z 3 oznaczeń.

Objaśnienia: T0 - zawartość antygenu dla rośliny pokolenia T0 (rodzicielskiej), T1

- średnia arytmetyczna zawartości antygenu HBV dla roślin pokolenia T1 (potomnych)

Na fig. 4 przedstawiono wynik analizy form białka antygenowego HBcAg w liściach potomnych transformantów sałaty (A) i tytoniu (B) za pomocą techniki Western-blot z użyciem specyficznych króliczych poliklonalnych przeciwciał.

A - Analiza Western-blot białka HBcAg w ekstraktach z liści potomnych roślin sałaty (16A/2 - 21/6) z użyciem mysiego monoklonalnego przeciwciała Mab C86340M (Biodesign).

B - Analiza Western-blot białka HBcAg w ekstraktach z liści roślin tytoniu (15-31 - 15-124) z użyciem mysiego monoklonalnego przeciwciała Mab C86340M (Biodesign).

Oznaczenia ścieżek biotów: M - wzorzec masy białek (MBI Fermentas), N - roślina nietransgeniczna - kontrola negatywna, P - antygen HBc nr kat. R8A120 (Biodesign) - kontrola pozytywna

Formy białka HBc:

p18 - prawdopodobnie charakterystyczny częściowo zdegradowany monomer HBc o masie 18 kDa p20 - prawdopodobnie charakterystyczny częściowo zdegradowany monomer HBc o masie 20 kDa p22 - monomer HBc o masie 22 kDa p25 - monomer HBc o masie 25 kDa p26 - prawdopodobnie charakterystyczny częściowo glikozylowany monomer HBc o masie 26 kDa p36 - prawdopodobnie dimer monomeru HBc p18 o masie 36 kDa p40 - prawdopodobnie dimer monomeru HBc p20 o masie 40 kDa p44 - dimer monomeru HBc p22 o masie 44 kDa

Na figurze 5 zilustrowano zastosowanie roślin transgenicznych wytwarzających białko antygenowe HBcAg do otrzymywania pochodnych profilaktycznych i terapeutycznych szczepionek IIl generacji przeciwko wzw B.

A - zastosowanie transgenicznej sałaty do otrzymywania sproszkowanego liofilizatu jako półfabrykatu do produkcji doustnej szczepionki w postaci zawiesiny lub syropu oraz w upostaciowanej formie granulatu, tabletek lub kapsułek

B - zastosowanie cząstek subwiralnych (CLPs) wytwarzanych w komórkach mezofilu liści tytoniu, które po ekstrakcji i oczyszczeniu oraz dodaniu substancji pomocniczych mogą być użyte w postaci preparatu podawanego na drodze iniekcji parenteralnej lub w postaci preparatu donosowego aplikowanego w formie aerozolu lub kropel. W komórkach roślinnych cząstki subwiralne gromadzą się w pęcherzykach, zamykanych następnie w cysternach retikulum endoplazmatycznego - ER. Mikrografie wykonano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM1200 EXII firmy Jeol.

Poniższe przykłady realizacji wynalazku zostały umieszczone jedynie w celu lepszego wyjaśnienia poszczególnych aspektów wynalazku i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

P r z y k ł a d 1. Konstrukcja wektorów pKHBCBAR i pKHBCadwBAR do transformacji sałaty i tytoniu

Przygotowanie wektorów zawierających sekwencje kodujące białko antygenowe HBcAg podtypów HBV ayw4 i adw4 pod kontrolą promotora 35S obejmowało następujące etapy:

PL 216 099 B1

Za pomocą metody PCR na matrycy całkowitego DNA Agrobacterium tumefaciens nopalinowego szczepu C58 namnożono terminator syntazy nopalinowej (NOSt) (Croy 1993). Do sekwencji NOSt wprowadzono jednocześnie sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Pst I. Xho I od końca 5' oraz Hind III od końca 3'. Terminator wklonowano następnie do plazmidu pUC18 (MBI Fermentas, Yanisch-Perron 1985, Genebank L09136) otrzymując p18PNOSt, a następnie zsekwencjonowano.

Adaptowano wcześniej sklonowany promotor 35S CaMV (P35S) z wektora p35SGUS-INT (Vannaceyt 1990) w plazmidzie pBluescript KS (Stratagene, Alting-Mees i Short 1989, Genebank

X52327) usuwając miejsce restrykcyjne Pst I przy końcu 5' promotora poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym Pst I, degradację 3' wystających lepkich końców za pomocą T4 DNA polimerazy, a następnie religację - otrzymano ostatecznie plazmid pKSP35SGl.

Przeklonowano promotor 35S z plazmidu pKSP35SGI do p18PNOSt - otrzymując wektor pMG2A.

Za pomocą techniki PCR namnożono sekwencję kodującą HBc (poz. 1992-2454) na matrycy wcześniej otrzymanego plazmidu pHBV312, zawierającego kompletny genom polskiego izolatu wirusa HBV ayw4 (Płucienniczak 1994a). Podobnie namnożono sekwencję kodującą HBc szczepu adw4 (Płucienniczak 1994b) - HBcadw (poz. 1902-2460). Jednocześnie, za pomocą odpowiednich oligonukleotydów, dokonano substytucji niektórych nukleotydów usuwając w ten sposób zlokalizowane wewnątrz sekwencji motywy rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne EcoR I, BamH I oraz Pst I. zachowując natomiast oryginalny układ kodonów dla aminokwasów. Do sekwencji kodujących antygen poszczególnych podtypów wprowadzono jednocześnie miejsca restrykcyjne BamH I od końca 5' i Pst I od końca 3‘. Zmodyfikowane sekwencje wklonowano do pGEM-T (Promega, Marcus 1996) otrzymując pGTHBC i pGTHBCadw, a następnie zsekwencjonowano.

Do wektora pMG2A przeklonowano sekwencje kodujące antygen poszczególnych podtypów z pGTHBC i pGTHBCadw, otrzymując odpowiednio pMG2AHBC i pMG2AHBCadw.

Gotowe kasety ekspresyjne: P35S-HBcayw-NOSt i P35S-HBcadw-NOSt, przeniesiono do wektora pGPTV-BAR (Becker 1992) usuwając jednocześnie fragment GUS-NOSt, otrzymując wektory pKHBCBAR i pKHBCadwBAR do transformowania roślin.

Wektory do transformowania roślin przygotowano z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych, Taq DNA polimerazy i innych odczynników firmy MBI Fermentas. Schemat konstrukcji wektorów binarnych wg wynalazku przedstawiono szczegółowo na schemacie [Fig. 1].

Przygotowane wektory binarne wprowadzono do komórek Agrobacterium tumefaciens szczepów LBA4404 i EHA105. Obecność plazmidu w klonach Agrobacterium sprawdzono za pomocą techniki PCR z użyciem starterów specyficznych do sekwencji kodujących poszczególne podtypy białka HBcAg.

P r z y k ł a d 2. Oznaczanie antygenu HBcAg w transgenicznych roślinach sałaty i tytoniu metodą ELISA

Zawartość antygenu HBeAg w tkankach roślinnych oznaczano metodą ELISA za pomocą opracowanych testów z wykorzystaniem: I-rzędowego przeciwciała monoklonalnego (Mab) anty-HBc C31190M (Biodesign) oraz I-rzędowych przeciwciał poliklonalnych anty-HBc obecnych w surowicy króliczej, którą otrzymano od prof. B. Szewczyka (Uniwersytet Gdański) po trzykrotnej immunizacji królika rasy Nowozelandzki Duży antygenem HBc R8A120 (Biodesign). Opracowany test umożliwia oznaczenie w badanym materiale całkowitego poziomu białka HBcAg zarówno upostaciowanego w cząstki CLP bądź kilku-kilkudziesięciocząsteczkowe agregaty, jak i również pojedyncze podjednostki.

W celu oznaczenia HBcAg w roślinach transgenicznych przygotowywano ekstrakty przez roztarcie próbek liści w stopniowo dodawanym buforze w objętości równej pięćdziesięciokrotności masy próbki (1 mg = 50 ąl buforu). Do ekstrakcji zastosowano bufor o następującym składzie: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4. 10,3 mM Na2SO3, 2% PVP40000, 0,2% BSA, 1% Tween® 20, pH = 7,4. Roztarte próbki zwirowywano przez 5 min. przy 10000 obr./min. w temperaturze pokojowej. Z supernatantu pobierano 20 ąl ekstraktu do oznaczeń.

Testy ELISA wykonywano na płytkach Nunc-Immuno Plate F96 Maxisorb firmy NUNC™ z użyciem płuczki Model 1575 firmy Bio-Rad. Płytkę opłaszczano przez noc w temp. 4°C przeciwciałem monoklonalnym C31190M w buforze węglanowym w stężeniu 0,5 ąg/ml. Płytkę płukano 3 razy w buforze PBST, a następnie blokowano przez 60-90 minut w temp. 25°C za pomocą 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze PBS. Płytkę płukano jak wyżej i nanoszono próbki ekstraktów roślinnych, które następnie rozcieńczano w buforze PBS w stosunku 1/1 do uzyskania odpowiednio

PL 216 099 B1

50-, 100-, 200- i 400-krotnego rozcieńczenia. Płytkę inkubowano przez 45 min. w temp. pok. na wytrząsarce przy 400 obr./min. Po usunięciu reagentów i trzykrotnym płukaniu jw. nanoszono surowicę króliczą anty-HBc rozcieńczoną 5000x w PBS i inkubowano przez 45 min. w temp. pok. 400 obr./min. Po usunięciu reagentów i trzykrotnym płukaniu jw., na płytkę nanoszono biotynylowane przeciwciało monoklonalne anty-Fc królicze (Sigma) rozcieńczone 20000x w PBS i inkubowano przez 45 min. w temp. pok. 400 obr./min. Po usunięciu reagentów i trzykrotnym płukaniu jw., na płytkę nanoszono ekstrawidynę sprzężoną z alkaliczną fosfatazą (Sigma) rozcieńczoną 4000x w buforze PBS i inkubowano przez 45 min. w temp. pok. 400 obr./min. Po usunięciu reagentów i trzykrotnym płukaniu naniesiono substrat dla alkalicznej fosfatazy, tj. fosforan p-nitrofenylu (pNPP, Sigma). Większość reagentów nakładano w objętości 100 μl/dołek, za wyjątkiem etapu blokowania i płukania gdzie nanoszono objętość 400 μ!. Po upływie 1 h i zatrzymaniu reakcji odczytywano absorbancję przy długości 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek Model 680 firmy Bio-Rad. Absorbancję przeliczano na zawartość danego białka antygenowego według wzoru krzywej kalibracyjnej wykonywanej dla każdego oznaczenia z użyciem odpowiedniego standardu, tj. HBcAg R8A120 (Biodesign).

Zawartość białek antygenowych HBcAg oznaczano co najmniej trzykrotnie podczas rozwoju roślin w warunkach ex vitro. Średni poziom danego białka obliczano jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z oznaczeń cząstkowych [Fig. 3].

Odczynniki do analiz, pochodziły, poza wymienionymi przeciwciałami, z firm POCh i Sigma.

P r z y k ł a d 3. Wykrywanie antygenu HBcAg w transgenicznej sałacie i tytoniu techniką Western-blot

Białko antygenowe HBcAg wykrywano w roślinach transgenicznych techniką Western-blot z użyciem specyficznych przeciwciał. Białko HBcAg wykrywano za pomocą przeciwciała monoklonalnego Mab C86340M (Biodesign) oraz przeciwciał poliklonalnych obecnych w surowicy króliczej, którą otrzymano od prof. B. Szewczyka (Un iwersytet Gdański) po trzykrotnej immunizacji królika rasy Nowozelandzki Duży antygenem HBc R8A120 (Biodesign).

W celu wykonania analizy Western-blot przygotowywano ekstrakty roślinne przez roztarcie próbek liści sałaty w pięciokrotnej objętości (1 mg = 5 μ!) buforu PBS z 0,5% dodatkiem detergentu Tween® 20. Do roztartych tkanek dodawano denaturujący bufor do próbek (Laemmli 1970) z 50 mM dodatkiem DTT i inkubowano przez 15 min. w temp. 65°C. Próbki ekstraktów wraz z wzorcem białka HBcAg (R8A120. Biodesign) oraz markerem wielkości białek (MBI Fermentas) nanoszono na 12,5% denaturujący żel poliakrylamidowy i prowadzono elektroforezę w buforze Laemmli. Białka przenoszono z żelu na membranę nitrocelulozową metodą „mokrego elektrotransferu w aparacie firmy Bio-Rad. Po trzykrotnym przemyciu w buforze TBST (bufor TBS z 0,05% dodatkiem Tween® 20), membranę z przeniesionymi białkami blokowano za pomocą 3% roztworu BSA w buforze TBS. Po trzykrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano w roztworze przeciwciał w TBS: 1 μg/ml Mab lub 0,5 μg/ml Pab. Po trzykrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano w roztworze II-rzędowych przeciwciał znakowanych biotyną w buforze TBS: 10000x rozcieńczonych mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-Fc króliczego (Sigma) lub 10000x rozcieńczonych kozich poliklonalnych przeciwciał anty-króliczych typu „whole molecule” (Sigma) lub 10000x rozcieńczonych kozich poliklonalnych przeciwciał anty-mysich typu „whole molecule” (Sigma). Po trzykrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano w roztworze 4000x rozcieńczonej ekstrawidyny znakowanej peroksydazą chrzanową lub alkaliczną fosfatazą (Sigma). Po pięciokrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano z diaminobenzidyną (DAB, Sigma), tj. substratem dla peroksydazy lub 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforanem/błękitem nitro tetrazolium (BCIP/NBT, Sigma), tj. substratem dla alkalicznej fosfatazy. Wszystkie inkubacje z przeciwciałami oraz przemycia membrany prowadzono z wytrząsaniem ok. 100 obr./min..

Obserwowane w Western-blot [Fig. 4] prążki odpowiadają różnym formom białka HBcAg, tj. glikozylowanym i niemodyfikowanym monomerom.

Sole do buforów, BSA itp. pochodziły z firm POCh oraz Sigma.

P r z y k ł a d 4. Przygotowanie liofilizatów zawierających antygen szczepionkowy HBcAg na bazie liści transgenicznej sałaty

Rośliny wybranych linii transgenicznej sałaty, charakteryzujących się względnie wysoką zawartością HBcAg, tj. pow. 15 μ0/ g św. masy, były uprawiane w szklarni w warunkach naturalnego fotoperiodu i w temperaturze 20-22°C w dzień i 14-16°C w nocy. Liście z dobrze rozwiniętych główek zbierano, zamrażano w ciekłym azocie, częściowo rozdrabniając przy tym tkankę, a następnie przechowywano _® w temperaturze -80°C. Zamrożony materiał umieszczano w liofilizatorze BETA 1-16 firmy CHRIST^®

PL 216 099 B1 i prowadzono liofilizację przez 24-36 h w próżni 0,2 mbar przy temperaturze zamrożenia - 80°C i temperaturze półek 55°C, na których umieszczano materiał na metalowych tackach. Zliofilizowany materiał mielono na proszek i przechowywano w szczelnie zamkniętych pojemnikach w obecności desykatora w temperaturze pokojowej jako materiał wyjściowy do przygotowania poszczególnych form szczepionek doustnych [Fig. 5A]. Proces liofilizacji materiału roślinnego kontrolowano przez oznaczanie zawartości antygenu HBcAg wg procedury opisanej w przykładzie 2.

Literatura

1. Alting-Mees MA, Short JM (1989) pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res 17: 9494.

2. Becker D, Kemper E, Schell J, Masterson R (1992) New plant binary vectors with selectable markers locatcd proximal to the left T-DNA border. Plant Mol Biol 20: 1195-1197.

3. Bochcr WO, Dekel B, Schwerin W, Geissler M, Hoffmann S, Rohwer A, Arditti F, Cooper A, Bernhard H, Berrebi A, Rose-John S, Shaul Y, Galle PR, Lohr HF, Reisner Y (2001) Induction of strong hepatitis B virus (IIBV) specific T helper cell and cytotoxic T lymphocyte responses by therapeutic vaccination in the trimera mouse model of chronic HBV infection. Eur J Immunol 31: 2071-2079.

4. Brandtzaeg P (2007) Induction of secretory immunity and memory at mucosal surfaces. Vaccine 25: 5467-5484.

5. Couillin I, Pol S, Mancini M, Driss F, Brechot C, Tiollais P, and Michel ML (1999) Specific vaccine therapy in chronic hepatitis B: induction of T cell proliferative responses specific for envelope antigens. J Infect Dis 180: 15-26.

6. Cooreman MP, Leroux-Roels G, Paulij WP (2001) Vaccine- and hepatitis B immune globulininduced escape mutations of hepatitis B virus surface antigen. J Biomed Sci 8: 237-247.

7. Croy RRD (1993) Plant selectable genes, reporter genes and promoters. W: Plant Molecular Biology Labfax. Wyd. Hames BD, Rockwood D, Croy RRD. Academic Press. Oxford, str. 175-178.

8. Deres K, Schroder CH, Paessens A, Goldmann S, Hacker HJ, Weber O, Kramer T, Niewohner U, Pleiss U, Stoltefuss J, Graef E, Koletzki D, Masantschek RN, Reimann A, Jaeger R, Gross R, Beckermann B, Schlemmer KH, Haebich D, Rubsamen-Waigmann H (2003) Inhibition of hepatitis B virus replication by drug-induced depletion of nucleocapsids. Science 299: 893-896

9. Ehsani P, Khabiri A, Domansky NN (1997) Polypeptides of hepatitis B surface antigen produced in transgenic potato. Gene 190: 107-111.

10. Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements for suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res 50: 151-158.

11. Genebank, pUC18c cloning vector (beta-galactosidase mRNA on complementary strand). Accession No. L09136.

12. Genebank, pBluescript II KS (+) vector DNA, phagemid excised from lambda ZAPII, Accession No. X52327.

13. Heathcote J, McHutchison J, Lee S, Tong M, Benner K, Minuk G, Wright T, Fikes J, Livingston B, Sette A, Chestnut R (1999) A pilot study of the CY-1899 T-cell vaccine in subjects chronically infected with hepatitis B virus. Fhe CY1899 T Cell Vaccine Study Group, Hepatology 30: 531-536.

14. Hollinger BF (1996) Hepatitis B Virus. W: Fields Virology, 3rd Edition. Wyd. Fields BN, Knipe DM, Howley PM et al. Lippincott - Raven Publishers, str. 2739-2807.

15. Huang X, Lu D, Ji G, Sun Y, Ma L, Chen Ζ, Zhang L, Huang J, Yu L (2004) Hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced escape mutants of HBV S gene among children from Qidong area, China. Virus Res 99: 63-68.

16. Huang Z, Elkin G, Maloney BJ, Buehner N, Arntzen CJ, Thanavala Y, Mason HS (2005) Virus-like particles expression and assembly in plants: hepatitis B and Norwalk viruses. Vaccine 23: 1851-1858.

17. Imani J, Berting A, Nitsche S, Schaefer S, Gerlich WH, Neumann K-H (2002) The integration of a major hepatitis B virus gene into cell-cycle synchronized carrot cell suspension cultures and its expression in regenerated carrot plants. Plant Cell Tiss Org 71: 157-164.

18. Joung YH, Youm JW, Jeon JH, Lee BC, Ryu CJ, Hong HJ, Kim HC, Joung H, Kim HS (2004) Expression of the hepatitis B surface S and preS2 antigens in tubers of Solanum tuberosum, Plant Cell Rep 22: 925-930.

19. Juszczyk J. (2000) Clinical course and consequences of hepatitis B infection. Vaccine 18: 23-25.

PL 216 099 B1

20. Kapusta J, Modelska A, Figlerowicz M, Pniewski T, Letellier M, Lisowa O, Yusibov V, Koprowski H, Płucienniczak A, Legocki AB (1999) A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. FASEB J 13: 1796-1799.

21. Kapusta J, Modelska A, Figlerowicz M, Pniewski T, Lisowa O, Koprowski H, Płucienniczak A, Legocki AB (2000) Plant-based edible vaccine against HBV. Immunology Letters 73: 269.

22. Kapusta J, Modelska A, Pniewski T, Figlerowicz M, Jankowski K, Lisowa O, Płucienniczak A, Koprowski H, Legocki AB (2001) Oral immunization of human with transgenic lettuce expressing hepatitis B surface antigen. Adv Exp Med Biol 495: 299-303.

23. Kocjan G, Samardakiewicz S, Woźny A (1996) Regions of lead uptake in Lemna minor plants and localization of this metal within selected parts of the root. Biologia Plantarum 38: 107-117.

24. Kong Q, Richter L, Yang YF, Arntzen CJ, Mason HS, Thanavala Y (2001) Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA 98: 1153911544.

25. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227: 680-685.

26. Lam DM, Arntzen CJ (1996) Vaccines produced and administered through edible plants. US Patent 5 484 719.

27. Langridge WH (2000) Edible vaccines. Sci Am 283: 66-71.

28. Lou X-M, Yao Q-H, Zhang Z, Peng R-H Xiong A-S, Wang H-K (2007) Expression of the human Hepatitis B Virus large surface antigen gene in transgenic tomato plants. Clinical and Vaccine

Immunology 14: 464-469.

29. Lycett GW, Croy RR, Shirsat AM, Boulter D (1984) The complete nucleotide sequence of a legumin gene from pea (Pisum sativum L.) Nuc Acid Res 12: 4493-4506.

30. Madaliński K, Sylvan SP, Hellstrom U, Mikołajewicz J, Zembrzuska-Sadkowska E, Piontek E (2002) Antibody responses to preS components after immunization of children with low doses of BioHepB. Vaccine 20: 92-7.

31. Marcus L, Hartnett J, Storts DR (1996) The pGEM^®-T and pGEM^®-T Easy Vector Systems.

PromegaNotes Magazine 58: 36.

32. Martin-Vivaldi R, Nogueras F, Vignote ML, Salmeron J, Aguilar J, Romero M. Andrade R, De MM, Moreno JM, Perez J, Garcia G, Lopez H, Gomez F, Palacios A, Otero S, Suarez E, Poyatos A, Quintero D (2000). Multicenter retrospective study of response to interferon in chronic hepatitis B. Rev

Esp Enferm Dig 92: 561-572.

33. Mason HS, Lam DM-K, Arntzen CJ (1992) Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA 89: 11745-11749.

34. Mason HS, Thanavala Y, Arntzen CJ, Richter E (2003) Expression of immunogenic hepatitis B surface antigen in transgenic plants. US patent 6 551 820 B1

35. McCabe MS, Mohapatra UB, Debnath SC, Power JB, Davey MR (1999) Integration, expression and inheritance of two linked T-DNA marker genes in transgenic lettuce. Molecular Breeding 5:

329-344.

36. Mowat AM (2003) Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature

Rev 3: 331-341.

37. Mowat AM, Viney JL (1997) The anatomical basis of intestinal immunity. Immunol Rev 156: 145-166.

38. Płucienniczak A (1994a) Molecular cloning and sequencing of two complete genomes of Polish isolates of Human Hepatitis B Virus. Genebank, Accesion No. Z35716.

39. Płucienniczak A (1994b) Molecular cloning and sequencing of two complete genomes of Polish isolates of Human Hepatitis B Virus. Genebank, Accesion No. Z35717.

40. Pniewski T, Kapusta J, Płucienniczak A (2006) Agrobacterium-mediated transformation of yellow lupin to generate callus tissue producing HBV surface antigen in a long-term culture. J Appl Genet 47: 309-318.

41. Poonam P (2007) The biology of oral tolerance and issues related to oral vaccine design.

Current Pharmaceutical Design 13: 2001-2007.

42. Richter LJ, Thanavala Y, Arntzen CJ, Mason HS (2000) Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Nature Biotechnology 18: 1167-1171.

PL 216 099 B1

43. Rukavtsova EB, Zolova OE, Buryanova NYa, Borisova VN, Bykov VA, Buryanov YaI (2003)

Analysis of Transgenic Tobacco Plants Carrying the Gene for the Surface Antigen of the Hepatitis B

Virus. Russian Journal of Genetics 39: 41-45.

44. Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can Journal of Botany 50: 199-204.

45. Singh NP, Mandal SK, Thakur A, Kapoor D, Anuradha S, Prakash A, Kohli R, Agarwal SK (2003). Efficacy of GM-CSF as an adjuvant to hepatitis B vaccination in patients with chronic renal failure- -results of a prospective, randomized trial. Ren Fail 25: 255-266.

46. Shulga NYa, Rukavtsova EB, Krymsky MA, Borisova VN, Melnikov VA, Bykov VA, Buryanov

YaI (2004) Expression and Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Transgenic Potato

Plants. Biochemistry (Moscow) 69: 1158-1164.

47. Smith ML, Mason HS, Shuler ML (2002) Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg) Expression in Plant Cell Culture: Kinetics of Antigen Accumulation in Batch Culture and Its Intracellular Form. Biotechnology and Bioengineering 80: 812-822.

48. Sojikul P, Buchner N, Mason HS (2003) A plant signal peptide-hepatitis B surface antigen fusion protein with enhanced stability and immunogenicity expressed in plant cells. Proc Natl Acad Sci USA 100: 2209-2214.

49. Sunil Kumar GB, Ganapathi TR, Revathi CJ, Prasad KSN, Bapat VA (2003a) Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic banana plants and NT-1 cell line of tobacco. BARC News Lett

237: 85-96.

50. Sunil Kumar GB, Ganapathi TR, Revathi CJ, Prasad KSN, Bapat VA (2003b) Expression of hepatitis B surface antigen in tobacco cell suspension cultures. Prot Exp Purif 32: 10-17.

51. Sunil Kumar GB, Ganapathi TR, Revathi CJ, Srinivas L, Bapat VA (2005) Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic banana plants. Planta 222: 484-493

52. Sunil Kumar GB, Srinivas L, Ganapathi TR, Bapat VA (2006) Hepatitis B surface expression in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants using four different expression cassettes. Plant Cell

Tiss Org 84: 315-323.

53. Sunil Kumar GB, Ganapathi TR, Srinivas L, Revathi CJ, Bapat VA (2006) Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Sci 170: 918-925.

54. Thanavala Y, Yang Y-F, Lyons P, Mason HS, Arntzen CJ (1995) Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen. Proc Natl Acad Sci USA 92: 3358-3361.

55. Vannaceyt G, Schmidt R, O'Connor-Sanchez A, Willmitzer L, Rocha-Sosa M (1990) Construction of an intron-containing marker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium - mediated plant transformation. Mol Gen Genet 220: 245-250.

56. Walewska-Zielecka B, Świderska H, Płucienniczak G, Jończyk M, Nitkiewicz J, Płucienniczak A, Nowosławski A (1996) Etiology of chronic hepatitis as evaluated by liver biopsy and serum samples submitted to the Department of Immunopathology of the National Institute of Hygiene in 1993-1995. Przegląd Epidemiologiczny 50: 353-363.

57. Yamada T, Iwabuki H, Kanno Τ, Tanaka H, Tomoji K, Fukuda H Kondo A, Seno Μ, Tanizawa K, Kuroda S (2001) Physiochemical and immunological characterization of hepatitis B virus envelope particles exclusively consisting of the entire L, (pre-S1 + pre- S2+S) protein. Vaccine 19: 3154-3163.

58. Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33: 103-119.

59. Yap I, Chan SH (1996) A new pre-S containing recombinant hepatitis B vaccine and its effect on non-responders: a preliminary observation. Ann Acad Med Singapore. 25: 120-2.

60. Young MD. Rosenthal MH, Dickson B, Du W, Maddrey WC (2001) A multi-center controlled study of rapid hepatitis B vaccination using a novel triple antigen recombinant vaccine. Vaccine 19: 3437-3443.

61. Yuen MF, Lai CL (2001) Treatment of chronic hepatitis B. The Lancet Infectious Diseases 1:

232-241.

62. Zuckerman JN, Sabin C, Craig FM, Williams A, Zuckerman AJ (1997) Immune response to a new hepatitis B vaccine in healthcare workers who had not responded to standard vaccine: randomised double blind dose-response study. BMJ 314: 329-33.

PL 216 099 B1

Wykaz sekwencji <110> Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk et al.

<120> Transgeniczne komórki roślinne produkujące białko antygenowe HBcAg oraz ich zastosowanie do wytwarzania szczepionki.

<210> 12 <21ł> 2123 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Sekwencja kasety ekspresyjnej P35S-HBcayw-i-NOSt umieszczona w wektorze binarnym pKHECBAR <400> 12 gaattcccca gattagcctt ttcaatttca aggcttacgc agcaggtctc atcaagacga aataccttcc caagaaggtt aaagatgcag acacagagaa agatatattt ctcaagatca gcttgcttca caaaccaagg caagtaatag ctgaatcaaa ggccatggag tcaaagattc agactggcga acagttcata cagagtctct tcaacatggt ggagcacgac acacttgtct aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac tccattgccc agctatctgt cactttattg acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta cacgggggac tctagaggat ccatggacat ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt cgcctcagct ctctatcggg aagccttaga tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg tgttaatttg gaagatccag catctaggga gggcttaaag ttcaggcaac ttttgtggtt aacggtcata gagtatttgg tgtctttcgg accaccaaat gcccctatct tatcaacact caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc cagaagatct caa.tctcggg aatctcaatg gtcgaagcag atcgttcaaa catttggcaa ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg atttaatacg cgatagaaga caaaatatag gtgtcatcta tgttactaga tcgatcaaac gagaggctga ctaacaaaag gtatgcccaa aagtttctgc tcatgccgac aggcataaet gtcctgctgg tttgcgccaa gataaatcag gaaatgaact gctgactgcc ccccaagaaa atacaccatc gaaaacccac gtccgaacac ctcaagagca agtcctttct gtgctcgtcg catgtcttgc gttgatgaag ctt gaaagaatgc taacccacag atggttagag tctacccgag caataatctc caggaaatca tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga gaagtactat tccagtatgg acgattcaag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca tctccactga cgtaagggat gacgcacaat tataaggaag ttcatttcat ttggagagaa cgacccttat aaagaatttg gagctactgt ctttccttca gtacgagatc ttctagatac gtctcctgag cattgttcac ctcaccatac ggaactaatg actctagcta cctgggtggg cctagttgtt agttatgtca acactaatat tcacatttct tgtctcactt ttggaagaga agtgtggatt cgcactcctc cagcttatag tccggagact actgttgtta gacgacgagg tcgcagacga agatctcaat cgccgcgtcg ttaactgcag ctcgagtaaa gaaggagtgc taaagtttct caagattgaa tcctgttgcc ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac gtttttatga ttagagtccc gcaattatac cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg ttcggcactg tgtaatgacg atgagcaatc aaacaacctc tccaaactgt ttcgaattgg tagatattcg cgggctattc ccactaattc tgcatctcct tacaagttcc tctgtcttgt gcctcctcat ctcccagttg gcggcggctg ttgatacatg tgcctgagaa ataggcctac gaaattcctc tcctgtcaga cggtcgtgcg

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 144 0 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2123

PL 216 099 B1

<210>	13
<211>	212 9
<212>	DNA
<213> <220>	Artificial
<223>	Sekwencja kasety ekspresyjnej P35S-HBcadw4-NGSt w wektorze binarnym pKHBCadwBAR
<400>	13

gaattcccca gattagcctt ttcaatttca gaaagaatgc taacccacag atggttagag aggcttacgc agcaggtctc atcaagacga tctacccgag caataatctc caggaaatca aataccttcc caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga acacagagaa agatatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca caaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa ggccatggag tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga acagttcata cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagaa cacgggggac tctagaggat ccatggacat tgacccttat aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttcc gtcagagatc tcctagacac cgcctcagct ctgtatcgag aagccttaga gtctcctgag cattgctcac ctcaccatac tgcactcagg caagccattc tctgctgggg ggaattgatg actctagcta cctgggtggg taataatttg gaagatccag catccaggga tctagtagtc aattatgtta ataataacat gggtttaaag atcaggcaac tattgtggtt tcatatatct tgccttactt ttggaagaga gactgtactt gaatatttgg tctctttcgg agtgtggatt cgcactcctc cagcctatag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact actgttgtta gacgacggga ccgaggcagg tcccctagaa gaagaactcc ctcgcctcgc agacgcagat ctcaatcgcc gcgtcgcaga agatctcaat ctcgggaatc tcaatgttaa ctgcagctcg agtaaagaag gagtgcgtcg aagcagatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttctcaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaagacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcga tcaaacttcg gcactgtgta atgacgatga gcaatcgaga ggctgactaa caaaaggtat gcccaaaaac aacctctcca aactgtttcg aattggaagt ttctgctcat gccgacaggc ataacttaga tattcgcggg ctattcccac taattcgtcc tgctggtttg cgccaagata aatcagtgca tctccttaca agttcctctg tcttgtgaaa tgaactgctg actgcccccc aagaaagcct cctcatctcc cagttggcgg cggctgatac accatcgaaa acccacgtcc gaacacttga tacatgtgcc tgagaaatag gcctacctca agagcaagtc ctttctgtgc tcgtcggaaa ttcctctcct gtcagacggt cgtgcgcatg tcttgcgttg atgaagctt

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 102 0 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2129

PL 216 099 B1 <210> 16 <211> 1124 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Sekwencja kasety ekspresyjnej PN0S-bar-g7t umieszczonej w wektorach binarnych pKHBCBAR. i pKHBCadwBAK <400> 16 aagcttaaca ctgatagttt aaactgaagg aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc agctaagcac atacgtcaga aaccattatt cagctagcaa atatttcttg tcaaaaatgc atccaattag agtctcatat tcactctcaa gaacgacgcc cggccgacat ccgccgtgcc atcgtcaacc actacatcga gacaagcacg caggagtgga cggacgacct cgtccgtctg gtggacggcg aggtcgccgg catcgcctac gactggacgg ccgagtcgac cgtgtacgtc tccacgctct acacccacct gctgaagtcc gctgtcatcg ggctgcccaa cgacccgagc ccccgcggca tgctgcgggc ggccggcttc tggcagctgg acttcagcct gccggtaccg tgatgacccc tagaggatcc atcttgaaag aacaagtcag gtattatagt ccaagcaaaa agaaatattt caataactga ttatatcagc gcgatattat gtgtaataca taaattgatg cgggaaacga caatctgatc atgagcggag gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg cactcagccg cgggtttctg gagtttaatg gcgcgttcaa aagtcgccta aggtcactat tccactgacg ttccataaat tcccctcggt tccaaataat ctgcaagatc tatgagccca accgaggcgg acatgccggc ggtctgcacc gtcaacttcc gtaccgagcc gcaggaaccg cgggagcgct atccctggct cgtcgccgag gcgggcccct ggaaggcacg caacgcctac tccccccgcc accagcggac gggactgggc ctggaggcac agggcttcaa gagcgtggtc gtgcgcatgc acgaggcgct cggatatgcc aagcacggga actggcatga cgtgggtttc ccccgtccgg tcctgcccgt caccgagatc aaatatagtt taaatattta ttgataaaat acataaattt attgatgcaa gtttaaattc tggtacattg ccgtagatga aagactgagt atatagctag ctta

120

ISO

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1124

Claims (8)

1. Transgeniczna komórka roślinna zdolna do ekspresji antygenu rdzeniowego HBcAg wirusa

HBV szczepu ayw4 lub adw4 na poziomie > 50 ąg/g św. m., przy czym zawiera ona cząsteczkę T-DNA składającą się z sekwencji granicznych T-DNA oraz umieszczonych pomiędzy nimi dwóch kaset ekspresyjnych:

- pierwszej kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej białko HBcAg wirusa HBV szczepu ayw4 lub adw4 oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji promotora 35S RNA CaMV z pojedynczym enhancerem i terminatora transkrypcji syntazy nopalinowej (NOSt), korzystnie zawierającą co najmniej jedną spośród sekwencji: SEQ ID No. 12 i SEQ ID No. 13, oraz

- drugiej kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej gen oporności na herbicydy fosfinotricynowe, korzystnie genu bar, oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t. korzystnie zawierającą SEQ ID No. 16.

2. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że jest komórką sałaty albo tytoniu.

3. Zastosowanie komórki roślinnej określonej w zastrz. 1-2 do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że stosowane komórki roślinne mają postać biomasy roślinnej, zwłaszcza liofilizowanego materiału roślinnego, korzystn ie sałaty.

5. Zastosowanie według zastrz. 3. znamienne tym, że wytwarzana szczepionka ma postać wybraną spośród: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek, kapsułek.

6. Zastosowanie komórki roślinnej określonej w zastrz. 1-2 do wytwarzania aplikowanej parenteralnie lub donosowo szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

PL 216 099 B1

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że stosowane komórki roślinne, korzystnie tytoniu, wytwarzają białka antygenu rdzeniowego HBcAg wirusa HBV, które mogą być ekstrahowane i oczyszczone.

8. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że wytwarzana szczepionka ma postać wybraną spośród zastrzyku podawanego na drodze iniekcji parenteralnej lub podawanych donosowo aerozolu lub kropel.