ES2624776T3 - Producción modificada de glicoproteínas en plantas - Google Patents

Abstract

Un método para sintetizar una proteína de interés con una reducción de fucosilación y xilosilación que comprende, introducir en una planta, una porción de una planta, o una célula vegetal, una secuencia nucleotídica que comprende del 80 % al 100 % de identidad con una secuencia nucleotídica definida por la SEQ ID NO: 17 y que codifica una proteína híbrida que comprende una cola citoplásmatica, un dominio transmembrana, una región tallo (dominio CTS) de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1) fusionada a un dominio catalítico de beta-1,4galactosiltransferasa (GalT), la primera secuencia nucleotídica unida operativamente con una primera región reguladora que está activa en la planta, y una segunda secuencia nucleotídica para codificar la proteína de interés, la secuencia nucleotídica unida operativamente con una segunda región reguladora que está activa en la planta, y co-expresar de forma transitoria la primera y segunda secuencias nucleotídicas para sintetizar la proteína de interés que comprende menos del 10 % de fucosilación y xilosilación en comparación con la misma proteína de interés producida en una planta de tipo silvestre.

Description

Producción modificada de glicoproteínas en plantas.

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a métodos para modificar la producción de g licoproteínas en plantas La presente invención también proporciona plantas con producción modificada de glicoproteínas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

Las inmun09lobulinas (lgGs) son proteínas heteromultiméricas complejas con afinidad característica para homólogos antigénicos específicos de varias naturalezas. En I a ac tualidad, el ai slamiento de rutina de líneas celulares que producen IgG, y el advenimiento de tecnologías para evolución dirigida a IgG y la ingeniería molecular han tenido un profundo impacto en su evolución como bioterapéuticos y en el mercado general de las ciencias biológicas. La IgG monoclonal terapéutica ( anticuerpos m onoclonales, mAb) dom inan e I mercado ac tual de nu evos fármacos antiinflamatorios y anticancerosos y cientos de nuevos candidatos están actualmente bajo investigación y desarrollo cl ínico para apl icaciones m ejoradas y novedosas. E I mercado anu al de manda gamas de mAb de varios gramos (diagnóstico), algunos kilogramos (antitoxina) hasta uno a varios cientos de k ilogramos (defensa bioquímica, anticanceroso, antiinfeccioso, antiinflamatorio)

Aunque el cultivo de células C HO es aún su hu ésped de pr oducción preferido a es cala comercial, se admite generalmente para que los mAb alcancen su impacto completo en el mercado de las ciencias biológicas, se han desarrollado s istemas de producción al temativos, ya que I as instalaciones requeridas para e stos cultivos no s e modulan fácilmente en escala, su coste de construcción y mantenimiento son extremadamente elevados y aumentan constantemente, y su validación bajo G MP aún requiere un promedio de tres años tras la construccioo. Incluso en las etapas tempranas de desarrollo, la selección de líneas celulares de CHO con rendimientos y productividad aceptables sigue siendo un proceso costoso y largo. Los nuevos sistemas de producción que podrían disminuir los costes ascendentes (rendimientos más elevados, tecnologías e infraestructuras más sencillas), tienen un tiempo de espera más corto, son más flexibles en capacidad, al mismo tiempo que reúnen las características actuales de reproducibilidad, calidad y seguridad de los sistemas de cultivo celular actuales, probablemente tienen un impacto significativo en el desarrollo de mAb y vacunas para el mercado de las ciencias biológicas, en cada una de las fases de desarrollo

Las plantas son huéspedes adecuados para la producción de mAb y varias otras proteínas que tienen apl icaciones actuales en I as ciencias biológicas (véase K o y K oprowski 20 05; M a y col., 2005; Y usibov Y col., 2 006 para revisiones recientes). Los MAb se han producido en lineas vegetales transgénicas estables a rendimientos de hasta 200 mgfkg de peso fresco (FW), y mediante una expresión transitoria en índices de hasta 20 mgfkg de FW (Kathuria, 2002). Giritch y col. (2006) indican niveles de expresión de 200--300 mg/kg de pesode hoja para una IgG, con un máximo citado de 500 mgfkg a través del uso de un sistema de expresión transitoria basado en múltiples virus.

El documento WO 03f078637 desvela métodos para optimizar el procesamiento de glicanos en los organismos (y, en particular, las plantas), de manera que pueda obtenerse una glicoproteína que tenga glicanos biantenarios de tipo completo y, por lo tanto, que contenga residuos de galactosa en ambos brazos y que estén desprovistos de (o reducidos en) xilosa y fucosa

El documento WO 2004/065540 desvela moléculas de ácido nucleico, incluyendo construcciones de fusión, qu e tienen actividad catalítica y el uso de I as m ismas en el di seña de gl icosilación de células huésped par a generar polipéplidos con propiedades terapéuticas mejoradas, incluyendo anticuerpos con un aumento de la unión al receptor Fc y un aumento de la función efectora.

El do cumento WO O 1/29242 desvela m élodos par a pr aducir un po lipéptido het erólO9o modificado postraduccionalmente e n un sistema hué sped vegetal al terando 1 as capacidades de m odificación pos traduccional naturales de ese sistema de huésped vegetal. En otro aspecto de este método, la alteración de las modificaciones postraduccionales naturales se hace transformando el sistema huésped vegetal con una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una enzima de mooificación postraduccional

El proceso de N-glicosilación d e plantas y mamíferos difiere. Las últimas etapas d e N -glicosilación en células d e mamíferos añaden ¡l1 ,4galactosa, a1,6fucosa (beta-1 ,4galactosa, alfa-1,6fucosa) y residuos de ácido siálico terminal a los glicanos complejos_ Sin embargo, se añaden en las plantas residuos de 131,3galactosa, (d ,3-fucosa (beta1 ,3galactosa, al fa-1 ,3fucosa), 0.1 ,4fucosa y [31 ,2xilosa (alfa-1 ,4fucosa y beta-1,2xilosa). alfa-1 ,3fucosa y 131,2xilosa que s on c Oflstituyentes de glico-epítopos de algunos alérgenos d e pi antas, es tos residuos se c Oflsideran potencialmente inmunógenos y es indeseada su aparición en proteínas terapéuticas, incluyendo anticuerpos

La adi ción de una secuencia de K DEL a I ex tremo e d e un p éptido s e ut iliza típicamente par a asegurar I a recuperación del péptido a partir del Golgi de nuevo al ER. Este enfoque se ha ut ilizado para producir un anticuerpo no fucosilado y no xilosilado utilizando agroinfiltraciÓfl de hojas de tabaco (Sriraman y col., 2004)_ Sin embargo, el péptido de KoEL añadido es potencialmente inmunógeno, y este enfoque ha limitado la aplicabilidad a la prcx:lucción de proteínas terapéuticas

El control de I a adi ción de 0.1 ,3fucosa ( alfa-1 ,3fucosa) y 131 ,2xilosa ( beta-1 ,2xilosa) s e ha logrado también modificando I a expresión de f ucosiltransferasa y xilosiltransferasa. Se han producido m utantes en u n musgo que carecen de la capacidad de añadir 0:1 ,3fucosa y 131 ,2xilosa en glicanos complejos de musgo (Plyscomitrella patens; Koprivova y col., 2004) y Arabidopsis thaliana (Strasser y col., 2004). La inhibición parcial de la ex presiÓfl d e fucosiltransferasa y xilosiltransferasa en plantas se ha logrado también por la expresión ARN interferentes (ARNi) dirigidos a genes 0:1 ,3fucosiltransferasa y [31 ,2xilosiltransferasa en Lemna minar (Cox y col., 2006). Sin embargo, la inhibición completa de estas actividades enzimáticas tiene efectos nocivos en varias especias de plantas, ya que interfieren con eventos de desarrollo claves, tal como formación de polen y producción de semillas_ La degradación especifica inducida por ARNi del ARNm puede no ser estable con el paso del tiempo, y puede no ser aplicable a un espectro grande de plataformas basadas en plantas utilizadas para la producción de productos terapéuticos, ya que se ha indicado que son sensibles a factores ambientales

El documento 03f078637 desvela el uso de galactosiltransferasa humana para catalizar la adición de [31,4 galactosa terminal (GaIT) en gl icanos vegetales. La ex presión d e G alT y el direccionamiento de s u actividad al cis Golgi mediante el uso de una fusión con el dominio transmembrana de una xilosillransferasa dieron como resultado la adición de galactosa terminal y una di sminución en residuos específicos de plantas que tienen N-glicanos (véase también Bakker y col., 2006). El cultivo de estas plantas con plantas que contienen una IgG recombinante dio como resultado un descenso significativo, aunque variable, de los glicanos que contenian fucosa y xilosa.

La unión de un residuo de N-acetilglucosamina unida a beta-1 ,4 (GlnNAc) a manosa unida a beta para producir una GlcNac dividida s e cataliza por N -acetilglucosaminiltransferasa 111 (GnT-III; E C 2_ 4_1_144)_S e h a des crito la introducción de es ta enz ima en pi antas ( Rouwendal y col., 2007), Y I as pi antas q ue ex presaban pr oteínas comprendidas por GnT-IU con N-glicanos complejos se dividieron y se portaron dos residuos GlnAc.

RESUMEN DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a métodos para modificar la producción de g licoproteínas en plantas. La presente invención también proporciona plantas con producción de glicoprotelnas modificada.

Es un ob jeto de la invención proporcionar un método mejorado para modificar la producción de glicoproteínas en plantas

Se proporciona en el presente documento un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica (Al que comprende los nucleótidos 1-1077 de la SEO ID NO: 17 (GNT1-GaIT; figura 5d), o que comprende una secuencia nucleotídica que muestra de aproximadamente el 80 % al 100 % de identidad con los nucJeótidos 1 ~1077 de la SEO ID NO: 17, como se determina usando los siguientes parámetros: Programa: blasln: Base de datos: nr; Esperado 10; filtro: complejidad baja: Alineamiento: en pares: Tamaño de palabra: 11, en el que la secuencia nucleotídica codifica una proteina que modifica la glicosilación de una proteína de interés.

También se desvela un ácido nuc leico que t iene una secuencia nucleotídica ( B) q ue comprende un a pr imera secuencia de ácido nucJeico que comprende los nucleótidos 5-1198 de la SEO ID NO: 14 (GaIT), o que comprende una secuencia que muestra de aproximadamente el 80 % al 100 % de i dentidad COfl los nucleótidos 5-1198 de 1 a SEO ION O: 14, como s e determina us ando I os siguientes parámetros: Programa: bl astn: Base d e datos: nr; Esperado 10; filtro: complejidad baja: Alineamiento: en pares: Tamaño de palabra: 11 , en el que la primera secuencia de ácido n ucleico codifica una proteína qu e modifica 1 a 9 licosilaci6n de una proteína dei nterés, y 1 a primera secuencia de ácido nucleico está unida operativa mente con una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor 35S, o un promotor de plastocianina

Se desvela un ácido n ucleico que tiene una secuencia nucleotídica que comprende los nucleótidos 1 -1641 de la SEO ID NO: 26 (GNT1-GnT-II1), o que comprende una secuencia nucleotídica que muestra de aproximadamente el 80 % al 100 % de identidad con los nu cleótidos 1 -1641 del a S Ea ION O. 26, como se det ermina usando los siguientes parámetros: Programa: blastn; Base de datos; nr; Esperado 10; filtro: baja complejidad; Alineamiento: en pares; Tamaño de palabra· 11, en el que la secuencia nucleotídica codifica una proteína que modifica la glicosilación de una proteina de interés

También se desvela un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica que comprende una primera secuencia de ácido n ucleico q ue comprende los n ucleótidos 1 -1460 de I a S Ea ION o: 16 (GnT-111), o que comprende un a secuencia que es de aproximadamente el 80 % al 100 % similar cOrl los nucleótidos 1-1460 de la SEO 10 NO: 16, como se determina usando los siguientes parámetros: Programa: blastn; Base de datos: nr; Esperado 10; filtro: baja complejidad; Alineamiento: en pares; Tamaño de palabra: 11, en el que la primera secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que modifica la glicosilación de una proteína de interés, la primera secuencia de ácido nucleico unida op erativamente con u na s egunda secuencia d e ácido nu cleico qu e comprende un pr omotor 35S , o un promotor de plastocianina.

Se proporciona también una planta, una célula vegetal, o una semi lla que comprende la secuencia nucleotídica de

(A) como se ha descrito anteriormente

La presente invención también pertenece a una proteína híbrida GNT1-GaIT, que comprende un dominio CTS de Nacetilglucosaminil transferasa fusionado a un dominio catalítico de beta-1,4galactosiltransferasa, y que comprende la secuencia SEO ID NO: 18. La secuencia aminoacídica de la SEO 10 NO: 18 puede codificarse por la secuencia nucleotídica SEO 10 NO: 17. Se proporciona también una planta, una célula vegetal, o una semilla que comprende la proteína híbrida como se acaba de describir. Se proporciona también una planta, una célula vegetal, o una semilla que comprende el ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica SEO ID NO: 17

Se desvela una proteína híbrida GNT1-GnT-III, que comprende un dominio CTS de N-acetilglucosaminil transferasa fusionado a un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa tll, y que comprende la secuencia aminoacídica SEO ID NO: 20. La secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 21 puede codificarse por la secuencia nucleotídica SEO ID NO: 26. Se proporciona también una planta, una célula vegeta o un a semilla que comprende la proteína híbrida como s e acaba de d escribir. S e proporciona también una planta, un a célula vegetal, o una semilla qu e comprende el ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica SEO ID NO: 26.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método (1) para s intetizar un a proteína de interés q ue comprende expresar dentro de una planta o una porción de una planta, una secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nucleotídica que codifica una proteína híbrida, GNT1-GaIT, que comprende un dominio CTS de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1) fusionado a u n dominio catalitico de beta-1 ,4galactosiltransferasa (GaIT), la primera secuencia nu cleotídica un ida o perativamente con una pr imera región reguladora que está actíva en I a planta, y una s egunda secuencia nuc leotídica para codificar I a pr oteína de interés, I a segunda secuencia nucleotídica unida operativamente con una segunda región reguladora que está activa en la planta, y expresar la primera y segunda secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteína de interés que comprende glicanos con Nglicosilación modificada.

La pr imera secuencia n ucleotídica y I a segunda secuencia nu cleotídica como se h a d escrito anteriormente, s e expresan de forma transitoria en I a pi anta. A demás, la pr imera región reguladora puede s er un pr imer pr omotor específico de tejidos, y la segunda región reguladora es un segundo promotor específico de tejidos. Cada uno del primer y segundo promotores especificos de tejidos puede ser un promotor de plastocicanina.

La presente invención también proporciona un método (2) para sintetizar una proteína de interés. El método es como se ha descrito anteriormente (método 1), en el que la proteína de interés puede ser un anticuerpo. Si la proteína de interés es un anticuerpo, entonces la segunda secuencia nucleotídica que codifica la proteína de interés comprende una secuencia nucleotídica 2A, unida operativamente con una región reguladora 2A que está activa en la planta, y una secuencia nucleotídica 2B, unida operativamente con una región reguladora 2B que está actíva en la planta, y el producto codificado para cada una de 2A y 2B se combinan para producir el anticuerpo. La región reguladora 2A puede ser un promotor de plastocicanina, y la región reguladora 2B puede ser un promotor de plastocicanina.

La presente invención también proporciona un método (1) o (2), como se ha descrito anteriormente, en e l que una tercera secuencia nucleotídica se expresa dentro de la planta, la tercera secuencia nucleotídica que codifica un supresor de silenciamiento se une operativamente con una tercera región reguladora que está activa en la planta. La tercera secuencia nucleotídica qu e codifica un supresor de s ilenciamiento puede ser, por ej emplo, HcPro, TEV p1 fHC-Pro, BYV-p21 , TBSV p19, TCV-GP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11 , PVS-p11 , BScV-p16, GlV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10. El tercer promotor específico de tejidos puede ser un promotor de plastocicanina

Se desvela un sistema de expresión vegetal para conducir la expresión de una proteína de interés en una planta, en el que la proteína de interés comprende un patrón de gl icosilación modificado. Por ejemplo, la proteína de interés puede comprender N -glicanos f ucosilados, x ilosilados, o am bos, f ucosilados y x ilosilados reducidos. Como alternativa, la proteína de interés puede comprender un patrón de gl icosilación modificado, en el que I a proteína carece de r esiduos f ucosilados, x ilosilados o tanto f ucosilados como x ilosilados, y m uestra un au mento de galactosilación. Además, puede añadirse una galactosa terminal que dé como resultado una reducción o eliminación de I a f ucosilación y I a x ilosi1ación de la proteina de interés en comparación con I a misma pr oteína dei nterés producida en una planta de tipo silvestre

Se des vela un método (3) para s intetizar una proteína de interés con un perfil de N-glicosilación modificado qu e comprende, co--expresar dentro de una pi anta, u na porción de una pi anta, o un a célula vegetal, un a secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nucleot ídica que codifica una proteína híbrida, GNT1-GnT-III, que comprende un dominio CTS de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1 ) fusionado a un dominio catalítico de Nacetilglucosaminiltransferasa 111 (GnT-III), la primera secuencia nucleotídica unida operativa mente coo una primera región reguladora que está activa en I a planta, y una segunda secuencia nucleotídica para codificar la proteína de interés, la segunda secuencia nucleolídica unida operativamente con una segunda región reguladora que está activa en la planta, y co-expresar la primera y segunda secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteína de interés que comprende glicanos con el perfil de N-glicosilación modificado.

La primera secuencia nucleotídica y la segunda secuencia nucleotídica como se ha descrito anteriormente (método 3), pueden expresarse de forma transitoria en la planta, o pueden expresarse de forma estable. Además, la primera región reguladora puede ser un primer promotor específico de tejido, y la segunda región reguladora es un segundo promotor específico de tejido. Cada uno de los primeros y segundos promotores específicos de tejido puede ser un promotor de plastocicanina

También se desvela un método (4) para sintetizar una proteína de interés coo un perfil de N-glicosilación modificado que comprende, co--expresar dentro de una planta, una porción de una planta, o una célula vegetal, una secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nucleotídica que codifica una proteína híbrida, GNT1-GaIT, que comprende un dominio CTS de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1) fusionado a un dominio catalítico de beta-1,4galactosiltransferasa (GaIT), l a pr imera secuencia nu cleotídica un ida op erativamente con una pr imera r egián reguladora qu e e stá a ctiva en I a pi anta, u na segunda secuencia nu cleotídica que codifica bet a-1,4galactosiltransferasa, la s egunda secuencia nucleolídica unida ope rativamente con un a segunda región reguladora que está activa en la planta, y una tercera secuencia nucleotídica para codificar la proteína de interés, la tercera secuencia nucleotídica unida operativamente con una tercera región reguladora que está activa en la planta, y co--expresar la primera, segunda y tercera secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteína de interés qu e comprende glicanos con el perfil de N-glicosilación modificado

La primera secuencia nucleotídica y la s egunda secuencia nucleotídica como se ha d escrito anteriormente ( 4), pueden expresarse de forma transitoria en la planta, o pueden expresarse de forma estable. Además, la primera región reguladora puede ser un primer promotor específico de tejido, y la segunda región reguladora es un segundo promotor e specífico de tejido. Cada uno del primer y segundo pr omotores específicos de tejido puede s er u n promotor de plastocicanina.

Se des vela un método (5) para s intetizar una proteína de interés con un perfil de N-glicosilación modificado qu e comprende, co-expresar dent ro de una pi anta, u na porción de una pi anta, o un a célula vegetal, un a secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nucleotídica que codifica una proteína híbrida, GNT1-GnT-III, que comprende un dominio CTS de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1) fusionado a un dominio catalítico de Nacetilglucosaminiltransferasa 111 (GnT-III), la primera secuencia nucleotídica unida operativa mente con una pr imera región reguladora que está activa en la planta, una segunda secuencia nucleotídica que codifica Nacetilglucosaminiltransferasa 111, la segunda secuencia nucleotídica unida operativamente con u na segunda región reguladora que está activa en la planta, y una tercera secuencia nucleotidica para codificar la proteina de interés, la tercera secuencia nucleotídica unida operativamente con una tercera regián reguladora que está activa en la planta, y co--expresar la primera, segunda y tercera secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteína de interés qu e comprende glicanos con el perfil de N-glicosilación modificado.

La primera secuencia nucleotidica, la segunda secuencia nucleotidica y la tercera secuencia nucleotidica como se ha descrito en el metodo (5) anterionnente, pueden ex presarse de f onna transitoria en la planta, o pu eden expresarse de forma estable. Además, la primera, segunda y tercera regiones reguladoras pueden ser promotores especificos de tejidos Por ejemplo, cada uno de I os promotores especificos de tejidos puede ser un pr omotorde plastocicanina

De acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, una proteina de interés puede producirse, por lo tanto, con un alto rendimiento y que carece de glicanos que son conocidos por estar implicados en reacciones de hipersensibilidad, o de otro modo, estar implicados en reacciones alergenicas. Esto se logra por la ca-expresión de enzimas glico-diseñadas junto con la proteína de interés, y esto da como resultado la producciórJ de una proteína inmunógena que podría producirse dentro de la planta de tipo silvestre.

Como se describe en el presente documento, pue de utilizarse u n s istema de ex presión s implificado para I a producción d e una proteína de i nteres utilizando un sistema de expresión t ransitoria, sin embargo, los metodos pueden tambien ser utilizados con sistemas de t ransformación estable Por lo tanto, la presente invención no se limita a sistemas de expresión transitoria.

Usando la ca-expresión transitoria, el sistema descrito en el presente documento evita los extensos tiempos de producción, y el proceso de selección de líneas transgénicas mutantes elite o glico-diseñadas y su uso posterior como lineas parentales ( por ej emplo, como se de scribe por B akker, 200 5). También s e ev itan los pr oblemas simultáneos a menudo encontrados con plantas mutantes o glico-diseñadas, en cuando a productividad, producción de polen, producción de semillas (Bakker y col. 2005) y viabilidad (Boisson y col., 2005). Como se describe en el presente documento, la co--expresión de una proteína de interes con una galactosiltransferasa humana quimérica modificante no tuvo efecto en la cinética de producción o los rendimientos

El sistema de expresión transitoria descrito en el presente documento produce niveles de expresión que alcanzan 1,5 g de anticuerpo de alta calidad por kilogramo de peso fresco de hoja, excediendo el nivel de acumulación indicado para cualquier anticuerpo en pi antas con otros sistemas de ex presión, incluyendo sistemas basados en múltiples virus y plantas transgenicas

El enfoque descrito en el presente documento, por ejemplo, que implica la expresión de GalT o GAIT-GNT1 , puede usarse también con plantas transfonnadas de forma estable. Aunque se muestran muchas ventajas que se han descrito anterionnente, esta invención no se limita a los sistemas de expresión transitoria.

Este resumen de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Estas y otras características de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a las figuras adjuntas, en las que·

La figura lA muestra un casete basado en plastocianina ensamblado para la expresión de Cs-l. R610 comprende un a secuencia nucleotidica q ue codifica C 5·1 L C y CS -1 HC -KOEL; R612 e omprende u na secuencia nucleotídica que codifica C5-1 LC y C5-1 HC. eS-l Le: secuencia codificante de cadena ligera de Cs-l ; C5-1 HC: secuencia codificante de cadena pesada de C 5-1 . La f igura lB muestra la secuencia nucleotídica par a el pr omotor de pi astocianina y 5' U TR ( SEO I D N O: 23) , el s ¡tia de i nicio de I a transcripción s e m uestra en negrita, y el codón de inicio de I a traducción está subrayado. La figura le muestra la secuencia nucleotídica para la plastocianina 3' UTRC y el terminador (SEO ID NO: 24), el codón de terminación está subrayado.

La figura 2 muestra la acumulación del anticuerpo CS-l en hojas de Nicoriana benthamiana infi ltradas con R610 y R612 (casetes de expresión basados en plastocianina) con o s in la co-expresiórJ del supresor de silenciamiento H cPro. Lo s valores pr esentados corresponden al ni vel de ac umulación pr omedio y la desviación estándar obtenida a partir de las 6 mediciones en 3 plantas üeringa) o 6 mediciones en lotes de infiltración ind ividuales de aproximadamente 12 plantas (250 g)

La figura 3 muestra el anál isis d e t ransferencia de proteínas de acumu lación de C5-1 e n e xlractos de plantas infiltradas con jeringa y al vacio. La figura 3A muestra la inmunotinción con una IgG de cabra antiralón conjugada con peroxidasa (H+L), en extractos de plantas infiltradas con R612 (para secreción, filas 2)

o e 0f1 R61 O(para r elenci6n de E R, filas 2). el: S e cargaron 100 ng de I gG1 murina comercial ( Sigma M9269). como un control para la movilidad eleclroforética; C2: 12 Jl9 de proteínas totales extraídas de biomasa infiltrada con control (vector vacío). G~: 100 ng de IgG1 murina comercial (Sigma M9269) añadidos en 12 119 de proteína total extraída de biomasa infiltrada con control (vector vacio). La figura 38 muestra la inmunolinción d e a ctividad e on una IgG1 hu mana conjugada d e per oxidasa, e n ex tractos de plantas infiltradas con R612 (para secreción, filas 1) o con R610 (para retención de ER, filas 2). e1: 2 l-\9 de CS-1 de control purificado a partir de hibridoma (Khoudi y col., 1997); C2: 75 I1g de proteínas totales extraídas de biomasa infiltrada con control (vector vacío).

La figura 4 muestra un análisis de anticuerpos purificados a partir de plantas infiltradas ya sea con R612 (para secreción, filas 1) o R610 (para retención de ER, filas 2). La figura 4A muestra un análisis SOS-PAGE de ex tractos en bruto y ant icuerpos purificados realizado en condiciones no reductoras. La f igura 48 muestra un análisis SOS-PAGE de anticuerpos purificados realizado en condiciones reductoras. La figura 4C muestra 1 a i nmunotinción de ac tividad de ant icuerpos pur ificados realizada con u na 1 gG1 hum ana conjugada con peroxidasa. La figura 40 muestra una comparación de contaminantes en 61 otes de C5-1 purificada a par tir de diferentes lotes de infiltración. C 2, 5l-\g de 1 gG1 murina comercial (Sigma M9269), cargada como un cootrol para movilidad electroforética.

La figura 5A muestra un a representación de ejemplos de casetes ensamblados par a versiones nativas (R622) e híbridas (R621) de expresión de galactosiltransferasa. GNT1-CTS: dominio CTS de Nacetilglucosaminiltransferasa J; GaIT-Cat: dominio catalítico de [31 ,4galactosiltransferasa humana; GalT (de R622): 131,4galactosiltransferasa humana. La figura 5B muestra la secuencia nucleotídica (SEO ID NO: 14) para GalT (UDP-Gal:betaGlcNac polipéptido beta 1,4-galactosiltransferasa 1, bela 1,4-galactosiltransferasa 1), el sitio de i nicio A TG es tá s ubrayado; e 1 dom inio t ransmembrana e stá subrayado y en cursiva; 1 a secuencia en negrita corresponde al dominio catalítico de beta1 ,4GalT humana; el epítopo FLAG esta en cursiva, La figura se muestra la secuencia aminoacídica (SEa ID NO: 15) para GalT (UDP-Gal:betaGlcNac polipéptido bet a 1 ,4-galactosiltransferasa 1, beta-1 ,4-galactosiltransferasa 1 ). E 1 dominio t ransmembrana está subrayado y en cursiva; 1 a s ecuencia en negrita corresponde al dominio catalítico de be ta1,4GalT humana; el epitopo FLAG está en cursiva. La figura 50 muestra la secuencia nucleotídica (SEO ID NO: 17) de GNT1GaIT, el sitio de inicio ATG está subrayado; el dominio Iransmembrana (CTS) está subrayado y en cursiva; la secuencia en negrita corresponde al dominio catalítico de beta1 ,4GaIT humana; el epítopo FLAG está en cursiva. La figura SE muestra la secuencia aminoacidica (SEO ID NO: 18) de GNT1GalT, el dominio transmembrana (CTS) está subrayado y en cursiva; la secuencia en negrita corresponde al dominio catalítico de be ta1 ,4GaIT hum ana; el epítopo F LAG está en cursiva. La figura 5F muestra 1 a secuencia nucleotídica de un do minio e TS ( cola c itoplasmática, dominio t ransmembrana, región tallo) de N acetilglucosamina transferasa (GNT1, SEa ID NO: 21). La figura 5G muestra el aminoácido del CTS (SEa ID NO: 22). La figura 5H muestra la secuencia de ácido nucleico de Gntl-Gntlll (SEO ID NO: 26). La figura 51 muestra 1 a secuencia de ácido n ucleico de G ntl-Gntl U (SEa ION o: 20) La figura 5J muestra 1 a secuencia de ácido nucleico de G ntlll ( SEa ION O: 16). La figura 5K muestra 1 a s ecuencia de ácido nucleico de Gnt 111 (SEO ID NO: 19)

La figura 6 muestra un perfil de extractos obtenidos a partir de plantas que expresan C5-1 y están teñidos para una proteína, o s e someten a aná lisis Westem. El panel superior muestra un gel PAGE teñido con Coomasie. E 1 s egundo desde el pa nel s uperior muestra afinodetección u sando a glutinina de Erythrina cristagali (ECA) que se une específicamente a p1,4galactosa. El tercer panel desde el superior muestra un análisis de t ransferencia de Westem us ando anticuerpos anti-a1,3-fucosa. El pane 1 inferior m uestra un análisis de transferencia de Westem usando anticuerpos específicos de anti-131,2xilosa. R612: C5-1 expresado en solitario; R 612+R622-C5-1 co -expresado (co-infiltrado) con G alT; R612+R621· C 5-1 coexpressado con GNT1-GaIT

La figura 7 muestra espectrometria de masas MALDI-TOF para determinar la N-glicosilación del glicopéptido triptico EEoFNSTFR (SEO ID NO: 13) de C5-1 aislado a partir de plantas infiltradas con jeringa Nicotiana bent hamiana con un rango de construcciones. La N-glicositación de 1 gl icopéptido se determinó después de la separación en el análisis por HPLC preparativa. Se obtuvieron resultados similares después del a infiltración al vacío. La figura 7A muestra 1 a es pectrometría de m asas MALOI-TOF d el glicopéptido tríptico después de la expresión de R612 (C5-1; véase la figura 1). La figura 7B muestra una espectrometría de masas MALOI-TOF del glicopéptido tríptico después de la expresión de C5-1 (R612;

véase la figura 1) junto con GalT nativa (R622, véase la figura 5). la figura 7C muestra la espectrometrla de masas MALDI·TOF del glicopéptido trlptico después de la expresión de Cs., (R612, véase la figura 1): con GNT1GaIT (R621, véase la figura 5). la figura 7C-inserción corresponde al alargamiento miz 2650-2800 del espectro para mostrar la ausencia del ión J complejo principal detectado en la planta R612 (flecha). fJ\. GlcNAcManJ<3lcNAc,; B: MansGlcNAc: C: Ga1GlcNAcMan3GlcNAc: O: GlcNAc2ManNlcNAc,: E: Man/lGlcNAc2: F: GaIGlcNAcMan3(XyI)GlcNAC2: G: GlcNAcMansGlcNAc2: H: GlcNAc2Man3{Fuc)GlcNAc:z; 1: Man~lcNAc2: J: GlcNAC2Man3{Xyl)(Fuc)GlcNAc: K: GalGlcNAcMansGlcNAc: L: ManaGlcNAC2: M: Man&GlcNAc2.

DESCRIPCiÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a métodos para modificar la producción de glicoprotelnas en plantas. La presente invención también proporciona plantas con producción de glicoprotelnas modificada.

Se desvela un sistema de expresión de plantas para conducir la expresión de una protelna de interés en una planta. Con el sistema de expresión descrito, puede obtenerse una protelna de Interés que comprende un patrón de gllcosllación mOdificado, por ejemplo, con una reducción de N·gllcanos fucosilados, xilosilados o tanto fucosilados como xilosilados. Como aHernativa, puede obtenerse una protelna de interés que comprende un patrón de glicosilación modificado, en el que la protelna carece de fucosilación, xilosilación, o ambas, y comprende un aumento de la galactosilación. Además, como se describe en el presente documento, la modulación de modificaciones de postraduccionales, por ejemplo, la adición de la galactosa terminal, da como resultado una reducción de la fucosilación y xilosilación de la protelna expresada de interés, por ejemplo, la protelna de interés puede comprender menos del10 % de fucosilación y xilosilación (es decir, menos del 10 % de los residuos N-glicano están fucosilados y xilosilados), o menos del 5 % de fucosilac/ón y xilosilación (es decir menos del 5 % de los residuos N-gncano están fucosilados y xilosilados), menos del 1 % de fucos ilación y xilosilación (menos del 1 % de los residuos de N-gticano están fucosilados y xilositados), de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 2 % de los residuos de N-glicano están fucosilados y xilosilados, de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el ' ,5 % de los residuos de N-glicano están fucosilados y xilosilados, o de aproximadamente el 0,7 a aproximadamente el ' ,0 % de los residuos de N-gticano están fucosilados y xilosilados, en comparación con la misma protelna de interés producida en una planta de tipo silvestre. Por lo tanto, una protelna de Interés puede producirse con un alto rendimiento y carecer de glicanos que puedan provocar reacciones de hipersensibilidad, o de otra manera, estar implicada en reacciones alergénicas.

Un ejemplo no limitante de una protelna de interés a expresar incluye una protelna compleja, tal como un anticuerpo. La expresión de tal proterna compleja dentro de la planta agroinfiltrada, por ejemplo, Nicotiana benlhamiana, produjo niveles de proteinas que alcanzaban 1,5 glkg de PN (aproximadamente el 25 % de TSP). los niveles promedio de 558 y 757 mglkg/FW se lograron para las formas secretadas y retenidas por ER de la proterna de interés, respectivamente. En el ejemplo no ¡¡mitante proporcionado, este nivel de expresión se obtuvo para un anticuerpo, a un nivel de expresión tres ves más elevado que para un anticuerpo producidO utilizando un sistema de expreSión transitorio de muHiples virus (Giritch y col. 2006).

El impacto de la diferencia entre la planta y la N-glicosilación de mamlfero tlpica ha sido un problema principal que rodea el concepto del uso de plantas para la producci6n de productos terapéuticos. la aparición de glicanos especlficos de plantas puede contribuir a acortar la semivlda de una proterna hecha con plantas en el torrente sangufneo, o que los mismos glicanos provoquen reacciones de hipersensibilidad en pacientes.

La presencia de un núcleo de a.1,3fucosa y ~1 ,2xilosa en gllcoprotelnas hechas en plantas se percibe como un desafio regulador por la industria, ya que también se encuentran en algunos alérgenos vegetales. Además, se documenta ahora que la eliminación de fucosa central , incluso a.1 ,6fucosa que puede encontrarse en las IgG de células CHO, aumentara la actividad de ADCC. Una caracterlstica del sistema descrito en el presente documento es la capacidad para lograr la modulación de modificaciones postraduccionales, por ejemplo, la adición simultanea de galactosa terminal y la reducci6n o inhibición de la fucosilaci6n y la xilosilación (en comparación con la misma protelna producida en una planta de tipo silvestre). Como alternativa, el grado de fucosilaci6n puede reducirse mientras se aumenta la cantidad de galactosilación, de nuevo en comparación con la misma protelna producida en

una planta de tipo silvestre.

la modulación en la cantidad de fucosilaclón, xilosilaci6n o galactosilación puede determinarse utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, utilizando anticuerpos anti-alfa-1,3fucosa, para delectar la presencia o ausencia de inmunoseflales especificas de fucosa (fucosilaci6n) y anUcuerpos anti-beta1,2-xilosa para detectar xilosilación, o la presencia o ausencia de inmunoset'lales especificas de xilosa, por ejemplo, como se muestra en la figura 6. Como alternativa, la espectrometrla de masas MALOI-TOF puede utilizarse para determinar el perfil de N-glicosilación de una proteina o una porción de la protelna, como se muestra en la figura 7. Puede también utilizarse otro método para determinar el perfil de N-glicanos de una proterna o porción de la protelna conocida por un experto en la técnica.

Como se describe en más detalle a continuación, se usó un sistema de agroinfiltración basado en Yacio y se encontró adecuado para la producción de una protelna de interés. por ejemplo, un anticuerpo en cuando a cantidad. calidad y reproducibilidad. El paso a una tecnologla de Infiltración ampliable permite la producción de gramos de este anticuerpo por dla dentro de una pequefla unidad piloto, la cual permite el uso de tal sistema de expresión transitoria para la prOducción de materiales para ensayos cHnicos dentro de plazos extremadamente cortos y para el suministro de un producto permitido con un tamaflo de mercado en kilogramos por al\o. Se obtuvieron anticuerpos de alta calidad a partir de hojas infiltradas después de una única etapa cromatografica de afinidad. Sin embargo, se entenderá que los métodos descritos en el presente documento pueden también aplicarse a plantas que se transforman de forma estable.

El silenciamien10 génico postranscripción (PTGS) puede estar involucrado en la limitación de la expresión de transgenes en plantas, y puede utilizarse la coexpresión de un supresor de silenciamiento, por ejemplo, pero sin limitación, del VIrUS Y de patata (HcPro) para contrarrestar la degradación especifica de los ARNm transgénicos (Brigneti y col., 1998) . Los supresores alternativos de silenciamiento son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse como se describe en el presente documento (Chiba y col. , 2006, Virology 346: 7-14), por ejemplo, pero sin limitación, TEV -p1/HC-Pro (virus del grabado deltabaco-p1IHC-Pro), BYV -p21 , p19 del virus de enanismo arbustivo del tomate (TBSV p19), protelna de la cápside del virus de rizadura del tomate (TCV-CP), 2b del virus del mosaico del pepino; CMV-2b), p25 del virus X de la patata (PVX-p25), p11 del virus M de la patata (PVM-p11 ), p11 del virus S de la patata (PVS-p11 J, p16 del virus de quemadura del arándano, (BScV-p16), p23 del virus de la tristeza de los cltricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado con el enrollamiento de hoja de la vid, (GLRaV-2 p24), pl0 del virus A de la vid, (GVA-p10), p14 del virus B de la vid (GVB-p14), p10 del virus latente de Heracleum (HlV-pl0) o p16 del virus latente común del ajo (GClV-p16). Por lo tanto, un supresor de silenclamlento, por ejemplo, HcPro, TEV p1/HC-Pro, BYV-p21 , TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-P11. PVS-p l1, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HlV-p10, GClV-p16 o GVA-p10, puede coexpresarse junto con GaIT, GNT1-GaIT, GnT-III, GNT1GnT-III, o una combinación de las mismas, para asegurar además altos niveles de producción de protelna dentro de una planta.

La tlnción de Coomassie de productos purificados producidos utilizando expresión transitoria muestra la presencia de varios contaminantes de baja abundancia. Estos fragmentos parecen ser el producto relacionado, y todos los contaminantes por encima de 70 kDa contenlan al menos un Fab como se muestra por la transferencia de actividad (figura 3B). la identidad y cantidad de los contaminantes relacionados con el producto presentes en extractos de plantas son similares a los observados en sistemas de producción de células de mamrferos. Por lo tanto, una serie de purificación tlpicamente utilizada para la purificación de anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, intercambio aniónico, afinidad e intercambio catiónico) produce fácilmente la pureza requerida por las agencias reguladoras para una protelna para uso terapéutiCO.

la presente invención proporciona un método para la slntesis de una protelna de interés dentro de plantas que se caracterizan con un patrón de glicosilación modificado. El método Implica co-expresar la protelna de interés Junto con una secuencia nucleotfdica que codifica beta-1,49alactosiltransterasa (GaIT; SEO ID NO: 14), por ejemplo, pero sin limitación, GalT de mamlfero, o GalT humano, sin embargo, puede utilizarse la GaIT de otras fuentes. El dominio cataUtico de GalT (por ejemplo, nucleólidos 370-1194 de la SEO ID NO: 14, secuencia en negrita en la figura Sb, o nucleótidos 238-1062 de la SEa ID NO: 17, secuencia en negrita en la figura 5d) se fusiona a un dominio CTS (es decir, la cola citoplásmica, el dominio de transmembrana, región tallo) de N-acetilglucosaminiltransferasa (GNT1; por ejemplo, que comprende los nucleótidos 34-87 de la SEO 10 NO: 17; figura 5d) y que codifica la secuencia aminoacidica que comprende los aminoácidos 12-29 de la SEa ID NO: 18 (figura Se), para producir una enzima hlbrida GNT1-GaIT, y la enzima hlbrida puede co-expresarse con la protelna de interés. Se desvela la co-expresión

de la protelna de interés junto con una secuencia nucleoUdica que codifica N-acetilglucosaminlltransferasa 111 (GnT111; SEa ID NO: 16; figura 5j), por ejemplo, pero sin limitación, GnT-1II de mamlfero o GnT-1II humana, puede utilizarse también GnT-1I1 de otras fuentes. Adicionalmente, una enzima hlbrida GNT1-Gnt-JII (SEO ID NO: 26; figura 5d), que comprende el CTS de GNT1 fusionado a GnT-1I1 puede también utilizarse y se describe a continuación.

los métodos alternativos para anclar la secuencia nucleotldica que codifica GalT mGalT, o hGalT o GalT a partir de otras fuentes, incluyen fusionar la GalT a HOEL, KDEl (ambas secuencias de retención de retlculo endoplásmico),

el CTS de una proteína implicada en la biosíntesis de N-glicoproteína, por ejemplo, pero sin limitación, CTS de glucosidasa 1 , e TS de 9 lucosidasa 1 1, e TS de m anosidasa 1 , e TS de m anosidasa 1 1, e TS de beta,l ,2xililSiltransferasa, CTS de alfa, 1 ,2fucosiltransferasa. El dominio catalítico de GalT puede también fusionarse a H DEL, K DEL (ambas secuencias de retención de retículo e ndoplásmico), el C TS d e gl ucosidasa 1 , C TS de glucosidasa 11, C TS de m anosidasa 1, e TS de m anosidasa 11, C TS de bet a, 1, 2xililsiltransferasa, C TS de al fa, 1,2fucosiltransferasa

El uso de una enzima híbrida comprende GNT1-GaIT o la secuencia GNT1-GnT-III, sitúa el dominio catalítico de GaIT, o G nT·IIJ, en el aparato cis-Golgi don de tienen 1 ugar et apas tempranas e n la maduración de N -glicanos complejos. S in desear quedar 1 igando por 1 a t eoria, la actividad de G alT s ecuestrante en una fase temprana de maduración de glicanos puede dar como resultado la adición de ¡}1 ,4galactosa en glicanos de maduración y da como resultado la inhibición eficiente de la fucosilación y la xilosilación de la proteína que, de otro modo, podría tener lugar dentro de la planta. De forma similar, la actividad de GnT-UI secuestrante en una fase temprana de maduración de glicanos puede dar como resultado la adición de residuos de GlcNAc en manosa unida a beta para producir una GlnAc de bi-antena, y da como resultado la inhibición eficiente de la fucosilaci6n y la xilosilación de la proteína que, de otro modo, podría tener lugar dentro de la planta. Por ejemplo, la proteína de interés puede co-expresarse con una enzima híbrida que comprende un dominio CTS fusionado a un dominio catalítico de GaIT, por ejemplo, GNT1 -GalT (R621; figuras 5a, 5<1 ). o un dominio catalítico de GnT-III, por ejemplo, GNT1 ·GnT-1I1 (SEO ID NO: 26). Si se desea una proteína de interés que comprenda niveles reducidos de fucosilación, mientras comprende aún proteínas xilosiladas y galctosiladas, entonces la GalT no modificada (nativa) puede co-expresarse con la proteína de interés Si se desea una proteína de interés que comprenda glicosilación modificada que comprenda residuos de GlnAc biantena, entonces la GnT·1I1 no modificada (nativa), puede co-expresarse con la proteína de interés. Como apreciará un experto en 1 a técnica, una secuencia de ácido nucleico optimizada e n plantas puede usarse para producir una enzima de GalT o GnT-11I no modificada o nativa.

Por lo tanto, se proporciona una secuencia nucleotídica que comprende los nucleótidos 1-1062 de la SEO ID NO: 17 (GNT1-GaIT), o que comprende una secuencia nucleotídica que muestra de aproximadamente el 80 % al 100 % de identidad con los nucleótidos 1-102 de la SEO ID NO: 17, en la que la secuencia nucleotídica codifica una proteína que modifica la glicosilación de una proteína de interés. La secuencia puede estar optimizada para plantas. Se desvela tambiérJ una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende los nucleótidos 1-1224 de la SEO ID NO: 14 (GaIT), o que comprende una secuencia que muestra de aproximadamente el 80 % al 100 % de identidad con los nucleótidos 1-1224 de 1 a SEO ID NO: 14, en 1 a que 1 a secuencia de ác idos nucleicos codifica una proteína que modifica la glicosilaciórJ de una proteína de interés. La secuencia puede estar optimizada para plantas. La identidad de secuencias se determina utilizando los siguientes parámetros: Programa: blastn: Base de datos: nr; Esperado 10; "filtro: complejidad baja; Alineamiento: en pares; tamaño de palabra: 11

También se desvela una secuencia aminoacidica como se expone en la SEO ID NO· 18 (GNT1 -GaIT; figura Se), o la SEO ID NO: 15 (GaIT; figura 5c).

Se desvela un ácido n ucleico que tiene u na secuencia nucleotídica que comprende los nucleótidos 1 -1641 de 1 a SEO ID NO: 26 (GNT1-GnT-IIl), o que comprende una secuencia nucleotídica que muestra de aproximadamente el 80 % al 100 % de identidad con los nucleótidos 1-1641 del a SEO ION O: 26, en el que 1 a secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína que modifica la glicosilaciórJ de una proteína de interés. La secuencia puede estar optimizada para pi antas. S e proporciona también una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende los nucleótidos 232-1641 de 1 a S Ea 1 D NO: 26 (GnT -111; o los nucleótidos 1-1460 de la SEO ID NO: 16), o que comprende una secuencia que muestra de aproximadamente el 80 % al 100 % de identidad con los nucleótidos 232-1641 de la SEO ID NO: 26 (o los nucleótidos 1-1460 de la SEO ID NO: 16), en los que la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína que modifica la glicosilación de una proteína de interés. La secuencia puede estar optimizada para plantas. La identidad de secuencia se determina usando los siguientes parámetros: Programa: bl astn; Base d e datos: nr; Esperado 10; filtro: baja complejidad; A lineamiento: en par es; tamaño de palabra: 11 , en la que la secuencia nucleotídica codifica una proteína que modifica la glicosilación de una proteína de interés.

Se desvela también una secuencia aminoacídica como se expone en la SEO ID NO: 20 (GNT1 -GnT+IIJ, figura 5i) o la SEO ID NO: 19 (GnT-III, figura 5k)

Por "glicosilación modificada" de una proteína de interés significa que el perfil de N-glicano de la proteína de interés que comprende glicosilación modificada (por ejemplo, como se describe en el presente documento), es diferente del perfil de N-glicano de la proteína de interés producida en una planta de tipo silvestre La modificación de glicosilaci6n puede incluir un aumento o una disminución en uno o más de un glicano de la proteína de interés, o la bisección de GlnAc. Por ej emplo, la pr oteina de interés puede m ostrar una r educción de x ilosilación, un a r educción de fucosilación, o tanto una reducción de xilosilación como de fucosilación. Como altemativa, el perfil de N-glicano de la proteína de interés pue de modificarse de una manera tal que 1 a cantidad de ga lactosilación s e a umente, y opcionalmente, la cantidad de xilosilación, fucosilación, o ambas, se reduzcan. Adicionalmente, puede producirse la GlnAc divida en dos y esto puede dar como resultado la reducción de la cantidad de fucosilación y xilosilación de la proteína

Por "reducción de la xilosilación" o "reducción de la fucosilación" de una proteína de interés, significa que la cantidad de x ilosilaciÓfl, fucosilaciÓfl, o tanto x ilosiladón como fucosilación de N -glicanos detectables e n 1 a pr oteína d e interés, es menor del 10 % que la cantidad de xilosilación, fucosilación o ambas, que es detectable en la proteína de interés cuando se produce dentro de una planta de tipo silvestre, y donde la proteína de interés se aísla, y donde se determina la xilosilación o la fucosilación, utilizando el mismo método. Por ejemplo, la proteína de interés puede comprender menos del 5 % de residuos de N-glicano que están fucosilados, xilosilados, o ambos, menos del 1 % de los residuos de N-glicano detectables en la proteína de interés pueden estar fucosilados, xilosilados, o a mbos, de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 2 % de los residuos de N-glicano que son detectables en la proteína de interés pueden estar fucosilados y xilosilados, de aproximadamente e l 0,5 a aproximadamente el l ,5 % de los residuos de N-glicano están fucosilados y xiloxilados, o de aproximadamente el 0,7 a aproximadamente el 1,0 % de los residuos de N -glicano están f ucosilados y x ilosilados, en comparación con la misma proteína dei nterés producida en una planta de tipo silvestre.

Como se muestra en las figuras 6 y 7, al utilizar los métodos descritos en el presente documento, puede producirse una proteína de interés que muestra un perfil de glicosilación modificado. Por ejemplo, una proteína de interés con residuos de mucosa o x ilosa inmunolágicamente indetectables se ha producido cuando la proteina de interés se coexpresa con G NT1-GaIT. E 1 análisis M ALDI-TOF de un e pítopo d e una pr oteína dei nterés de muestra que un a proteína de interés con un patrón de glicosilación modificado puede obtenerse cuando la proteína de interés se coexpresa con GalT o GNT-GaIT (véanse las figuras 7A-C, inserción C). Por ejemplo, la figura 7A, muestra el perfil de glicosilaci6n de un epítopo de una proteína de interés expresada dentro de una planta de tipo silvestre. La proteína de interés comprende varios residuos x ilosilados y f ucosilados (picos H y J, respectivamente, figura 7 A). Estos residuos se reducen o están ausentes cuando la proteína de interés se co-expresa con GalT (figura 7B). Además, se observan nuevos residuos xilosilados (pico F), así como un aumento de los residuos galactosilados en la proteína de interés, al co-expresarse con GalT (véase los picos C, F, K, figura 7B). La ca-expresión de la proteína de interés con GNT1-GaIT da como resultado el perfil de N-glicanos que está caracterizado por que tiene menos del 1 % de residuos xilosilados y fucosilados (véase la figura 7C-inserción), y un au mento de residuos galactosilados (pico K; figura 7C)

Por lo tanto, se desvela un método (Método A) para sintetizar una proteína de interés con N-glicosilación modificada que comprende, proporcionar una pi anta que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nucleotídica que codifica beta-l ,4galactosiltransferasa humana (GaIT), la primera secuencia nucleotídica unida operativa mente con una región reguladora que está activa en la planta, y una segunda secuencia nuaeotídica para codificar 1 a pr oteína de interés, 1 a s egunda secuencia nu cleotídica un ida op erativamente con un a región reguladora qu e está ac tiva en 1 a planta, qu eh ace crecer la planta, y expresar 1 a primera y s egunda secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteína de interés que comprende N-glicosilación modificada. La co-expresión de la primera secuencia que codifica GalT junto con la segunda secuencia que codifica la proteína de interés, da como resultado la adición de beta-l ,4galactosa en glicanos de maduración de la proteína de interés, reduciendo de esta manera la fucosilación, la xilosilación, o ambas, de los glicanos de la proteína de interés. Además, con este método, el grado de galactosilación de la proteína de interés puede aumentarse en comparación con la cantidad de galactosilación de la proteína de interés producida en una planta de tipo silvestre que no expresa GalT

Se desvela un método (Método B) para sintetizar una proteína de interés con N-glicosilación modificada que implica expresar dentro de una planta o una porción de una planta, en una manera transitoria, una secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nudeotidica que codifica beta-1,4galactosillransferasa humana (GaIT; SEO ID NO: 14; figura 5b), la primera secuencia nucleotidica unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, y una segunda secuencia nucleotídica para codificar la proteína de interés, la segunda secuencia nucleotídica unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, y expresar la primera y segunda secuencias n ucleotídicas p ara sintetizar un a proteína de interés q ue comprende glicanos con N glicosilación modificada. La co-expresión de la primera secuencia que codifica GalT junto con la segunda secuencia que codifica la proteína de interés, da como resultado la adición de beta-l ,4-galactosa en glicanos de maduración de la proteína dei nterés, reduciendo de esta manera la fucosilación, la xilosilación, o a mbas, de los 9 licanos del a proteína de interés. A demás, e 1 gr ado de ga lac!osilación del a pr oteína de interés puede a umentarse en comparaciÓfl con la cantidad de galactosilación de la proteína de interés producida en una planta de tipo silvestre que no expresa GalT. La etapa de expresión puede implicar co-expresar de forma transitoria la primera y segunda secuencia nudeotídica, o co-expresar de forma estable la primera y segunda secuencia nucleotídica

La presente invención proporciona un método (Método e) para sintetizar una proteína de interés con N-glicosilación modificada que comprende, proporcionar una planta que comprende una primera secuencia nudeotídica híbrida que codifica una primera proteína híbrida que comprende un dominio CTS de N -acetilglucosaminil transferasa (GNT1) fusionado al dominio catalítico de GalT (beta-1,4galactosiltransferasa humana; GNT1 -GaIT; SEQ ID NO: 17; figura Sd), la primera secuencia nucleotídica hlbrida unida operativa mente con una región reguladora que está activa en la planta, y u na segunda secuencia nucleotídica par a codificar la proteína de interés, 1 a segunda secuencia nucleotídica unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, que hace crecer la planta, y expresar 1 a pr imera y s egunda secuencias n udeotídicas hí bridas, p ara s intetizar un a proteína de interés qu e comprende N-glicosilación modificada. La co--expresión de la primera secuencia híbrida que codifica GNT1-GaIT junto con 1 a segunda secuencia que codifica 1 a pr ote ína de interés da como resultado 1 a adición de beta-1,4 galactosa en g licanos de maduración del a pr oteína dei nterés, reduciendo de e sta manera 1 a f ucosilación y 1 a xilosilación de 1 os glicanos de la proteína de interés. Por ejemplo, el grado de fucosilación, xilosilación, o am bas, puede reducirse de apr oximadamente e 10, 5 a apr oximadamente e I 5 %, o d e ap roximadamente el °,5 a aproximadamente el 2 % de la cantidad en comparación con la proteína de interés producida en una planta de tipo silvestre que no expresa GNT1-GaIT.

Se desvela un método altemativo adicional (Método O) para sintetizar una proteína de interés con N-glicosilación modificada que implica expresar dentro de una planta, o una porción de una planta, de una manera transitoria, una secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nucleotídica híbrida que codifica GNT1-GaIT, la primera secuencia nucleotídica híbrida unida operativa mente con una región reguladora que está activa en la planta, y una segunda secuencia nu cleotídica par a codificar 1 a proteína de interés, 1 a s egunda secuencia nu cleotídica un ida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, y expresar la primera y segunda secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteína de interés que comprende N-glicosilación modificada. La co-expresión de la primera secuencia híbrida que codifica GNT1 -GaIT junto con la segunda secuencia que codifica la proteína de interés, da como resultado la adición de beta-1,4 galactosa en glicanos de maduración de la proteína de interés, reduciendo de esta manera la fucosilación y la xilosilaciÓfl de los glicanos de la proteína de interés. Por ejemplo, el grado de flucosilación, xilosilación, o am bas, puede reducirse de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 5 %, o de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 2 %, de la cantidad en comparación con la proteína de interés producida en una planta de tipo silvestre que no expresa GNT1-GalT. La etapa de expresión puede implicar la co-expresión transitoria de la primera y segunda secuencia nucleotídica, o la co--expresión estable de la primera y segunda secuencia nucleotídica.

Se desvela un método alternativo adicional (Método E) para sintetizar una proteína de interés con N-glicosilación modificada que comprende, proporcionar una pi anta qu e comprende un a secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nucleotídica qu e codifica bet a-1 ,4galactosiltransferasa humana ( GaIT), 1 a pr imera secuencia nucleotídica unida operativa mente con una región reguladora que está actíva en la planta, una segunda secuencia nucleotídica para codificar la proteína de interés, la segunda secuencia nucleotídica unida operativamente con una región reguladora que está activa en 1 a planta, y una tercera secuencia nucleotídica que codifica un supresor del silenciamiento génico, por ejemplo HcPro, la tercera secuencia nucleotídica unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, hacer crecer la planta, y expresar la primera, segunda y tercera secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteína de interés que comprende glicanos con N-glicosilación modificada. La coexpresión de la primera secuencia que codifica GalT junto con la segunda secuencia que codifica la proteína de interés, da como resultado la adición de beta-1,4 galactosa en glicanos de maduración de la proteína de interés, reduciendo de esta manera la fucosilación y la xilosilación de los glicanos de la proteína de interés, en comparación con la proteína de interés producida us ando un a p lanta de tipo silvestre qu e n o ex presa G alT. E 1 grado de galactosilación de la proteína de interés puede aumentarse en comparación con la cantidad de galactosilación de la proteina de interés producida en una planta de tipo silvestre que n o ex presa G alT. La ex presión de 1 a tercera secuencia que codifica u n supresor de s ilenciamiento, asegura altos rendimientos de la gal actosiltransferasa y la proteína de interés.

También se desvela un método para sintetizar una proteína de interés (Método F) con N-glicosilación modificada que implica expresar de ntro de u na planta, o u na porción de una planta, de un a m anera transitoria, u na secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nucleotídica que codifica bet a-1 ,4galactosiltransferasa humana (GaIT), 1 a primera secuencia nucleotídica un ida operativamente con una región reguladora que está activa en 1 a planta, una segunda secuencia nucleotidica para codificar la proteina de interés, la segunda secuencia nucleotidica unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, y una tercera secuencia nucleotídica que codifica un supresor del silenciamiento génico, por ejemplo HcPro, la tercera secuencia nucleotídica unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, y expresar la primera, segunda y tercera secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteína de interés que comprende Niflicosilación modificada. La coexpresión de la primera secuencia que codifica GalT junto con la segunda secuencia que codifica la proteina de interés, da como resultado la adición de beta-1,4 galactosa en glicanos de maduración de la proteína de interés, reduciendo de esta manera la fucosilación y la xilosilación de los glicanos de la proteína de interés. El grado de galactosilación de la proteina de interés puede aumentarse en comparación con la cantidad de galactosilación de la proteína de interés pr oducida en una planta de t ipo silvestre que n o expresa GaIT. La expresión de I a tercera secuencia que codifica u n supresor de s ilenciamiento, asegura altos rendimientos de la gal actosiltransferasa y la proteína de interés. La et apa de ex presión pue de implicar I a co-expresión transitoria de I a pr imera y segunda secuencia nudeotidica, o la co-expresión estable de la primera y segunda secuencia nucleotidica

Por lo tanto, se desvela un método (Método G) para sintetizar una proteína de interés con N-glicosilación modificada que comprende, pr oporcionar una pi anta que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una primera secuencia nu cleotídica que codifica N-acetilglucosaminliltransferasa (GnT-III), I a p rimera secuencia nu cleotídica unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, y una segunda secuencia nudeotidica para codificar I a pr oteína de interés, I a s egunda secuencia nu cleotídica un ida op erativamente con un a región reguladora qu e es tá ac tiva en I a pi anta, ha cer crecer I a pi anta, y expresar I a pr imera y s egunda secuencias nucleotídicas para sintetizar una proteina de interés que comprende N-glicosilación modificada. La co-expresión de la primera secuencia q ue codifica GnT-11I junto con la segunda secuencia que codifica I a proteína de interés, da como resultado la adición de residuos de N-acetilglucosamina unida a beta-1,4 (GlnAc) a manosa unida a beta (GlnAc de bi sección) en gl icanos de m aduración de I a pr oteína dei nterés, reduciendo de e sta manera I a fucosilación, la xilosilación, o ambas, de los glicanos de la proteina de interés, en comparación con la proteina de interés producida en una planta de tipo silvestre que no expresa GnT-111. La secuencia que codifica GnT-1I1 (primera secuencia nUcleotídica), la proteína de interés (segunda secuencia nUcleotídica), o tanto la primera como la segunda secuencia nUcleotídica, pueden expresarse de forma transitoria. Si las secuencias se expresan de forma transitoria, también puede usarse una tercera secuencia nucleotídica que codifica un supresor de silenciamiento génico, por ejemplo HcPro, unida operativamente con una región reguladora activa en la planta, y la primera, segunda y tercera secuencias n ucleotídicas se ex presan par a s intetizar u na pr oteína de interés qu e comprende g licosilación mod ificada.

También se desvela un método altemativo (Método H) para sintetizar una proteína de interés con N-glicosilación modificada que comprende, proporcionar una planta que comprende una primera secuencia nudeotidica híbrida que codifica una primera pr oteína hí brida qu e codifica u n do minio e TS de N -acetilglucosaminil t ransferasa (GNT1) fusionado al dominio catalítico de GnT-1II (N-acetilglucosaminliltransferasa; GNT1-GnT-11I SEO ID NO: 20), la primera secuencia nucleotídica hibrida unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, y una segunda secuencia nucleotídica para codificar la proteína de interés, la segunda secuencia nucleotídica unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta, hacer crecer la planta, y expresar la primera y segunda secuencias nucleolídicas híbridas para sintetizar una proteína de interés que comprende N-glicosilación modificada. La c o-expresión de I a pr imera secuencia hí brida q ue codifica G NT1-GnT-111 junto c on la segunda secuencia que codifica la proteína de interés da como resultado la adición de residuos de N-acetilglucosamina unida a beta-1,4 (GlnAc) a manosa unida a beta (GlnAc de bisección) en glicanos de maduración de la proteina de interés, reduciendo de esta manera la fucosilación y la xilosilaciÓfl de los glicanos de la proteína de interés. Por ejemplo, el grado de flucosilacián, xilosilacián, o am bas, puede reducirse de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 5 %, o de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 2 %, de la cantidad en comparación con la proteina de interés producida en una planta de tipo silvestre que no ex presa GNT1 -GnT-IIL La s ecuencia que codifica GNT1GnT-1II (primera secuencia nUcleotídica), la proteína de interés (segunda secuencia nUcleotídica), o tanto la primera como la segunda secuencia nUcleotídica, pueden expresarse de forma transitoria. Si las secuencias se expresan de forma transitoria, también puede usarse una tercera secuencia nucleotídica que codifica un supresor de sílenciamíento génico, por ejemplo HcPro, unída operativa mente con una región reguladora actíva en la planta, y la primera, segunda y tercera secuencias nucleotidicas se expresan para sintetizar la proteína de interés que comprende gl icosilación mod ificada.

Pueden hacerse modificaciones ad icionales a I a secuencia nucleolídica qu e codifica la proteína de i nlerés para asegurar un alto rendimiento. Por ejemplo, la segunda secuencia que codifica la proteina de interés puede también fusionarse a una secuencia que codifica una secuencia activa para retener la proteína dentro del retículo endoplásmico (ER), por ejemplo, pero sin limitación, una secuencia de KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu), u otras secuencias de retención de ER conocidas, por ejemplo, HDEL o KKSS

Además, cuando una proteína de interés compleja se produce, la segunda secuencia nUcleotídica, utilizada en cualquiera de los Métodos A-H como se ha descrito anteriormente, puede codificar más de un péptido o dominio de la proteína compleja. Por ejemplo, en el caso donde la proteína de interés es un anticuerpo, la segunda secuencia nucleotídica puede comprender dos segundas secuencias nucleotídicas 2A y 28, codificando cada una, una porción del anticuerpo, por ejemplo, el nucleótido 2A puede codificar una cadena ligera y una secuencia 28 codifica una cadena pesada del anticuerpo. Los ejemplos no limitanles de tales construcciones se proporcionan en la figura 1, donde la construcción de cada una de R 216 Y R610 comprende dos segundas secuencias nucleotídicas 2A, que codifican C5-1 LC (la cadena ligera de C5-1) unida operativamente a una región reguladora activa en una planta, por ejemplo, pero sin limitación, el promotor de plastocianina, y 28 que codifica la cadena pesada de C5-1 (C5-1 HC) unida operativamente a una región reguladora activa en una planta, por ejemplo, pero sin limitación, el promotor de plastocianina q ue comprende I os n udeótidos 556 -999 de l a figura 1bo l a S EQ ION O: 23; doc umento U S 7.125.978). Como se muestra en la figura 1, Y con referencia a R610, una secuencia de KDEL puede fusionarse a la región C-terminal de uno d e los péptidos 2A o 28 , por ejemplo, que no se considerará limitante, la secuencia de KDEL puede fusionarse a la cadena pesada del anticuerpo para asegurar que el anticuerpo se retenga con el ER

Cada proteína codificada por la segunda secuencia nudeotídica puede ser glicosilada

La pr oleína dei nterés así producida por cualquiera de I os M étodos A -H o pue de s er recuperada de I a planta. Además, la proteína de interés puede purificarse parcialmente o purificarse utilizando técnicas estándares como se conocerá por un experto en la técn ica.

En los casos donde las secuencias nucleotídicas se co-expresan dentro de la planta, cada una de las secuencias nucleotídicas de seadas puede s er introducida en I a planta ut ilizando técnicas de t ransformaciÓfl es tándares, técnicas de transformación transitoria, dos o más de dos plantas, expresando cada una, una o más de las secuencias nucleotídicas deseadas que pueden cruzarse para obtener una planta que ca-expresa la combinación requerida de secuencias nUcleotídicas , o puede combinarse una combinación de las técnicas anteriores. Por ejemplo, la expresión transitoria puede rea lizarse usando una planta transformada de forma estable expresando una secuencia que codifica GaIT, GNT1 -GaIT, GalT y GNT1-GaIT, GnT-III, GNT1 -GnT-III, GNT1 -Gnt-1II y Gnt-III, o una combinación de las mismas.

Por lo tanto, se desvela un método (Método 1) para producir una planta que puede utilizarse como una plataforma para la producción de una proteína de interés con N-glicosilación modificada. Este método comprende, proporcionar una planta que expresa una o más de una primera secuencia nucleotídica que codifica GaIT, GNT1-GalT, o tanto GalT como GNT1-GaIT, y que expresa la una o más secuencias nucleotídicas. Con el fin de producir la proteína de interés, una segunda secuencia nucleotidica que codifica la proteina de interés se introduce dentro de la planta de plataforma uti lizando técnicas estándares que implican la transformación estándar o la transformación transitoria, y la segunda secuencia nucleotídica se expresa de manera que la proteína de interés producida comprenda glicanos con N-glicosilación modificada, o la planta que expresa la primera secuencia nucleotídica se cruza con una segunda planta que ex presa I a s egunda secuencia nu cleotídica, y de es ta manera I a proteína de interés pr aducida comprenda gl icanos con N -glicosilación modificada. La pr oteína de interés puede extraerse de I a pi anta, y s i s e desea, la proteína de interés puede aislarse y purificarse utilizando métodos estándares.

Por lo tanto, se desvela un método (Método J) para producir una planta que puede utilizarse como una plataforma para la producción de una proteína de interés con N-glicosilación modificada. Este método comprende proporcionar una planta que expresa una o más de una primera secuencia nucleotídica que codifica GnT-III, GNT1-GnT -111 o tanto GnT-1II como GNT1-GNT-III, y que expresa una o más secuencias nucleotídicas. Con el fin de producir la proteína de interés, una segunda secuencia nucleotídica que codifica la proteína de interés se introduce en la planta de plataforma utilizando técnicas estándares que implican la transformación estable o la transformación transitoria, y la segunda secuencia nucleotídica se expresa de manera que la proteína de interés producida comprenda glicanos con N-glicosilaci6n modificada, o la planta que expresa la primera secuencia nucleotidica se cruza con una segunda planta que expresa la segunda secuencia nudeotídica y de esta manera la proteina de interés producida comprende glicanos con N-glicosilación modificada. La proteína de interés puede extraerse de la planta, y si se desea, la proteína de interés puede aislarse y purificarse utilizando métodos estándares.

Por lo tanto, se desvela un método (Método K) para producir una p lanta que puede utilizarse como una plataforma para la producción de una proteína de interés con N-glicosilación modificada. Este método comprende proporcionar una planta que expresa una o m ás de una primera secuencia nucleotídica que codifica GaIT, GNT1 -GaIT, GalT y GNT1-GaIT, GnT-III, GNT1-GnT.III, GnT-1I1 y GNT1-GNT-11I o una combinación de las mismas, y que expresa una o más secuencias nucleotídicas. Con el fin de producir la proteína de interes, una segunda secuencia nucleotidica que codifica la proteína de interes se introduce en la planta de la plataforma utilizando tecnicas estándares que implican la transformación estable, o la transformación transitoria, y la segunda secuencia nucleotídica se expresa de manera que la proteína de interes producida comprenda glicanos con N-glicosilación modificada, o la planta que expresa la primera secuencia nucleotídica se cruza con una segunda planta que expresa la segunda secuencia nucleotídica y de esta manera la proteína de interes producida comprende glicanos con N-glicosilación modificada. La proteína de interes pu ede extraerse d e la planta, y si se desea, I a proteína de interes puede aislarse y purificarse utilizando metodos estándares

Las secuencias nucleotídicas que codifican GaIT, GNT1-GaIT, GnT-III, GNT1-GnT-III, la proteína de interes, o una combinación de I as mismas, pueden ser un c odón optimizado para aumentar el nivel de expresión dentro de la planta. Por optimización de codón se refiere a I a selección de nuc leótidos de A DN apropiados para la síntesis de bloques de construcción de oligonucleótidos, y su ensamblaje enzimático posterior, de un gen o fragmento estructural del mismo con el fin de adoptar el uso del codón dentro de las plantas.

Con el fin de optimizar la expresión de la secuencia extraña dentro de una planta, la secuencia nUcleotídica, que puede s er una s ecuencia silvestre o s ¡ntetica, puede utilizarse o al terarse según s e requiera de manera que la proteína correspondiente, por ej emplo, G alT, G NT1-GaIT, G nT-III, G NT1-GnT-tII, I a proteína de interés, o u na combinación de las mismas, se produzca a un nivel más elevado que se producirá al codificarse por la secuencia nucleotídica no modificada. Por ej emplo, s in que s e considere I imitante, la s ecuencia puede ser una secuencia sintetica, optimizada para uso del codón dentro de una planta, que comprende al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la secuencia de tipo silvestre, como se determina utilizando tecnicas de comparación de secuencia, por ejemplo, pero sin limitación, BLAST (disponible a traves de GenBank; usando parámetros predeterminados). Se contempla tambien que los fragmentos o porciones de la secuencia que codifica la proteína de interes, o derivados de la misma, que muestran propiedades biológicas útiles, por ejemplo, pero sin limitación, propiedades antigenicas, pueden expresarse dentro de los tejidos vegetales

Con el fin de maximizar los niveles de expresión y la producción de proteínas transgenicas de G alT, GNT1 -GaIT, GnT-III, GNT1-GnT·III, y una proteína de interes, la secuencia de ácido nucleico puede ser examinada y la región de codificación modificada para optimizar la expresión del gen en plantas, utilizando un procedimiento similar al descrito por Sardana y col. (Plant Cell Reports 15: 677-681 ; 1996). Una tabla de uso del codón a partir de genes altamente expresados de plantas dicotiledóneas está disponible a partir de varias fuentes, incluyendo Murray y col. (Nuc Acids Res. 17: 477-498; 1989). Además, la optimización de secuencia puede tambien incluir la reducción de repeticiones de codón en tándem, la eliminación de sitios de empalme críptico, la reducción de secuencias repetidas (incluyendo repeticiones invertidas) y puede determinarse utilizando, por ejemplo, Leto 1.0 (Entelechon, Alemania).

Por lo tanto, se desvela un metodo (L) para sintetizar una proteína de interes con N-glicosilación modificada, como se describe e n u no cualquiera de los metodos anteriores ( Metodo A -K), en el que u na o m ás de una de las secuencias n ucleotídicas que codifican G alT, G NT1-GaIT, G nT-III, G NT1-GnT-III, I a proteína de i nteres o u na combinación de las mismas, se optimizan para la expresión en una planta

Además, la presente invención pertenece a una planta, una celula vegetal, o una semilla que comprende una secuencia nucleotídica que codifica GNT1-GaIT unida operativamente con una región reguladora que está activa en la planta. La pi anta, célula vegetal o s emilla puede además comprender una s egunda secuencia nucleotídica que codifica una o mas de una de una proteína de interés, la segunda secuencia nucleotídica unida operativamente a una o más de un a s egunda región reguladora a ctiva de ntro de I a planta. La pr imera secuencia nu cleotídica, la segunda secuencia nucleotídica, o tanto la primera secuencia nucleotídica como la segunda secuencia nucleotídica, pueden ser un codón optimizado para la expresión dentro de la planta, célula vegetal o semilla de planta.

Por" unida o perativamente" significa q ue I as s ecuencias par ticulares interactúan directa o indirectamente para realizar una funci6n pretendida, tal como la mediación o la modulación de la expresión genética. La interacción de secuencias unidas operativamente puede, por ejemplo, mediarse por proteínas que interactúan con las secuencias unidas operativamente. Una región reguladora de transcripción y una secuencia de interés se unen operablemente cuando las secuencias se conectan funcionalmente para permitir la transcripción de la secuencia de interés que se media o modula por la región reguladora de transcripción

Por la expresión "porción de una planta", se refiere a cualquier parte derivada de una planta, incluyendo la planta entera, el tejido obtenido de la planta, por ejemplo, pero sin limitación, las hojas, las hojas y el tallo, las raíces, la porción aérea, incluyendo las hojas, el tallo y opcionalmente la porción floral de la planta, las células o protoplastos obtenidos de la planta.

Por I a ex presión" materia vegetal", s e refiere a cualquier material der ivado de una planta. La m atena vegetal comprende una planta entera, tejido, células o cualquier fracción de los mismos. Además, la materia vegetal puede comprender componentes vegetales intracelulares, componentes vegetales ex tracelulares, ex tractos I iquidos o sólidos de plantas, o una combinación de los mismos. Además, la materia vegetal puede comprender plantas, células vegetales, tejido, un extracto líquido, o una combinación de los mismos, de hojas de las plantas, tallos, frutos, raíces o una combinación de los mismos. La m ateria vegetal pued e comprender una pi anta o porción de la misma la cual no se ha sometido a ninguna etapa de procesamiento. Sin embargo, se contempla también que la materia vegetal puede someterse a etapas de procesamiento mínimas como se define a continuación, o procesamiento m ás riguroso, incluyendo purificación de pr oteinas parcial o sustancial utilizando técnicas comúnmente conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, cromatografía, electroforesis y similares

Por I a ex presión " procesamiento mín imo", se refiere a m ateria vegetal , por e jemplo, u na pi anta o porción de l a misma que comprende una proteína de interés que se purifica parcialmente para producir un extracto vegetal, homogenado, fracción del homogenado vegetal o similares. La purificación parcial puede comprender, pero sin limitación, la interrupción de estructuras celulares vegetales, por lo que se crea una composición que comprende componentes vegetales s olubles y componentes vegetales insolubles los cuales pue den s epararse, por ej emplo, pero sin limitación, por centrifugación, filtración o una combinación de las mismas. En este sentido, las proteínas secretadas d entro del e spacio ex tracelular de la ho ja u ot ros tejidos podrían ob tenerse fácilmente utilizando extracción al vacío o por centrífuga, o I os tejidos podrían extraerse a pr esión por el paso a través de rodillos o molienda o s imilares para comprimir o liberar la proteína libre del espacio extracelular. El procesamiento mínimo podría también implicar la preparación de extractos en bruto de proteínas solubles, ya que estas preparaciones podrían tener una contaminación insignificante de productos vegetales s ecundarios. Además, el procesamiento mínimo puede implicar la extracción acuosa de proteína soluble a partir de hojas, seguida de la precipitación con cualquier sal adecuada. Otros métodos pueden incluir maceración y extracción de jugos a gran escala con el fin de permitir el uso directo del extracto.

La materia vegetal, en la forma de material o tejido vegetal puede administrarse por vía oral a un sujeto La materia vegetal puede administrarse como parte de un complemento dietético, junto con otros alimentos, o encapsularse. La materia o tejido vegetal puede también concentrarse para mejorar o aumentar la palatabilidad, o proporaonarse junto con otros materiales, ingredientes o excipientes farmacéuticos, según se requiera

Se contempla que una planta que comprende la proteina de interés puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, un animal o ser humano, en un a variedad de formas dependiendo del a necesidad y la situación. Por ejemplo, la proteína de interés obtenida a partir de la planta puede extraerse antes de su uso en ya sea una forma en bruto, parcialmente purificada o purificada. Si la proteína va a purificarse, entonces puede producirse en plantas comestibles o no comestibles. Además, si la proteína se administra por vía oral, el tejido vegetal puede cosecharse y suministrarse directamente al sujeto, o el tejido cosechado puede secarse antes de la alimentación, o puede dejarse que un animal se alimente de la planta sin tener lugar la cosecha. También se desvela el uso de los tejidos vegetales cosechados como un complemento alimenticio dentro del alimento para animales. Si el tejido vegetal se suministra a un animal con poco o ningún procesamiento adicional, se prefiere que el tejido vegetal que se administra sea comestible

Como se describe e n m ás detalle en los Ejemplos, G alT, G NT1-GaIT y la pr oteína de i nteres se introdujeron en plantas en una manera transitoria. El análisis inmunológico, utilizando anticuerpos apropiados, demostró que una proteína de PM, 150 kDa se presentó en las células transformadas (figuras 2, 3A Y 38). Además, GalT o GNT1 -GaIT fue detectable en extractos obtenidos a partir de plantas que expresan cualquier construcción, y la N-glicosilación alterada de una proteína de interes se observó cuando se expresó GNT1-GaIT en la planta (figura 6). Por lo tanto, GlaT expresado de forma recombinante, o GNT1-GaIT, está biológicamente activa in planta

Se introdujeron en plantas GaIT-FLAG o GNT1-GaIT-FLAG (es decir, GalT o GNT1-GaIT etiquetado en su extremo C con un epítopo FLAG par a permitir la inmunodetección del a proteina recombinante e n t ransformantes). Puede utilizarse un análisis de transferencia de Westem utilizando anticuerpos anti-FLAG, para demostrar que la proteína apropiada se encuentra presente en las células transformadas

Un "análogo" o "derivado" incluye cualquier sustitución, supresión o adición a la secuencia nucleotídica que codifica GalT (SEa ID NO: 14), el dominio catalítico de GalT (nucleótidos 368-1198 de SEa ID NO: 14; la secuencia de codificación en negrita en la figura 5b) , o G NT1 -GaIT (nucleótidos 248 -1077 de S Ea ION o : 17; secuencia d e codificación en negrita que a parece en I a figura 5d), s iempre y cuando la secuencia codifique una proteína que modifique, o que a I fusionarse a un C ST de G alT modifique el perfil de gl icosilación d e una pr oteína de interés cuando se expresa en una planta, por ejemplo, con reducción de la fucosilación, xilosilación, o ambas, de glicanos de la proteína de interés, o con el aumento de galactosilación de la proteína de interés en comparación con el perfil de glicosilación de la proteína de interés producida en una planta, en ausencia de GalT (SEO ID NO: 14) o GNT1 -GalT (SEO ID NO: 17) expresadas ectópicamente. Por ejemplo, la proteína codificada por la secuencia puede añadir una galactosa terminal durante la maduración de N-glicanos. Típicamente, los derivados y análogos de las secuencias de ácido n ucleico m uestran una identidad m ayor del 8 O % con una secuencia de ácido nu cleico, por ejemplo, de aproximadamente el 80-100 % de identidad de secuencia, o de aproximadamente el 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 % de identidad. La identidad de secuencia puede determinarse mediante el uso del algoritmo BLAST ( GenBank: nc bLnlm.nih.govfcgi-binfBLASTf), utilizando par ámetros pr edeterminados ( Programa: b lastn; Base de Datos: nr; Esperado 10: filtro: baja complejidad; Alineamiento: por pares; Longitud de las Palabras: 11). Los análogos o derivados d e los mismos, también incluyen las secuencias nucleotídicas que hi brida n en condiciones rigurosas de hibridación (véase Maniatis y col., en Molecular C loning (A Laboratory Manual), Cold Spring H arbor Laboratory, 1982, pág. 387-389, o Ausubel, y col. (ed.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en pág. 2.10.3) con cualquiera de las secuencias de GalT (SEO ID NO: 14), GNAT1-GaIT (SEO ID NO: 18) descritas en el presente documento, siempre y cuando la secuencia codifique una proteína que modifique el perfil de glicosilación de una proteína de interés, por ejemplo, reduciendo I a f ucosilación, xilosilación, o a mbas, de 9 licanos de I a pr oteína de interés, o aumentando la galactosilación del a pr oteína de interés en comparación con el per fil de gl icosilación de la pr oteína de interés producido en ausencia de GalT (SEO ID NO: 14) o GNT1-GaIT (SEO ID NO: 17). Por ejemplo, la proteína codificada por la secuencia puede añadir una galactosa terminal durante la maduración de N-glicanos. Un ejemplo de una de tales condiciones rigurosas de hibridación puede ser la hibridación con una sonda adecuada, por ejemplo, pero sin limitación, una sonda et iquetada con {gama_ 32p] dA TP durante 16-20 ha 65 °C en SOS al 7 %, EO TA 1 mM, Na2HP04 0,5M, pH 7,2. Seguido de un lavado a 65 OC en SOS al 5 %, EoTA 1 mM, Na2HP04 40 mM, pH 7,2 durante 30 min seguido de un lavado a 65 OC en SOS al 1 %, EOTA 1 mM, Na2HP04 40 mM, pH 7,2 durante 30 mino El lavado en este tampón puede repetirse para reducir el fondo

De manera similar, se desvela una modificación en la secuencia nucleotídica que codifica GnT-in (SEO ID NO: 16), el dom inio catalítico de G nT-III, o G NT1-GnT-tII (SEO ID NO: 20). siempre y cuando I a s ecuencia codifique un a proteína que modifique, o al fusionarse con un CST de GnT-1I1 modifique el pertil de glicosilación de una proteína de interés cuando se expresa en una planta, por ejemplo, con la bisección de G InAc y la reducción de la fucosilación, xilosilación, o a mbas, de gl icanos del a proteína de interés, en comparación con el pertil de gl icosilación del a proteína de interés producido en una planta, en ausencia de GnT-1II (SEO ID NO: 16) o GNT1-GnT-1I1 (SEO ID NO: 26) expresada ectópicamente. Típicamente, los derivados y análogos de las secuencias de ácido nucleico muestran una identidad mayor deJ80 % con una secuencia de ácido nUcleico, por ejemplo, aproximadamente del 80-100 % de identidad de I a secuencia, o aproximadamente del 80, 82, 84, 86, 88,90, 92,94, 96,98,100 % de identidad. La identidad de la secuencia puede determinarse mediante el uso del algoritmo BLAST (GenBank: ncbi.nlm.nih.govfcgibinfBLASTf), utilizando parámetros predeterminados (Programa: blastn; Base de Datos: nr; Esperado 10: filtro: baja complejidad; A lineamiento: por par es; Lon gitud de I as Palabras: 11) Los análogos o derivados de I os mismos, también incluyen las secuencias nucleotídicas que hibridan en condiciones rigurosas de hibridación (véase Maniatis y col., en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, pág. 387-389, o Ausubel, y col. (ed.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, lnc., Nueva York, en pág. 2.10.3) con cualquiera de las secuencias de GnT-111 (SEO ID NO: 16), GNATl-GnT111 (SEO ID NO: 26) descritas en el presente documento, siempre y cuando la secuencia codifique una proteína que modifique e I perfil de gl icosilación d e u na proteína de interés en comparación con el perfil de gl icosilación de la proteína de interés producido en ausencia de GnT-11t (SEO ID NO: 16) o GNT1 -GnT-1I1 (SEO ID NO: 26). Un ejemplo de una de tales condiciones rigurosas de hibridación puede ser la hibridación con una sonda adecuada, por ejemplo, pero sin limitación, una sonda etiquetada con [gama-32P]dATP durante 16-20 h a 65 OC en SOS al 7 %, EoTA 1 mM, Na2HP04 0,5M, pH 7,2. Seguido de un lavado a 65 °C en SOS al 5 %, EOTA 1 mM, Na2HP04 40 mM, pH 7,2 durante 30 min seguido de un lavado a 65 OC en SOS al 1 %, EOTA 1 mM, Na2HP04 40 mM, pH 7,2 durante 30 min El lavado en este tampón puede repetirse para reducir el fondo.

Por ~región reguladora", "elemento regulador" o ~promotor" se entiende una porción de ácido nucleico típicamente, aunque no siempre, aguas arriba de la región que codifica las proteínas de un gen, la cual puede estar compuesta por AON o ARN o tanto AoN comoARN. Cuando una región reguladora está activa, y en asociación operativa, o unida operativamente, con un gen de interés, esto puede dar como resultado la expresión de un gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad orgánica, o controlar el desarrollo o la activación genética temporal. Una "región reguladora~ incluye elementos promotores, elementos promotores centrales que exhiben una ac tividad pr omotora basal, elementos qu e s on i nducibles en respuesta a u n e stímulo ex terno, elementos q ue median I a a ctividad promotora t al como elementos reguladores ne gativos o mejoradores de la transcripción. La "región reguladora", como se utiliza en el presente documento, también incluye elementos que son activos después de la transcripción, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresión genética tales como mejoradores de I a traducción y de I a transcripción, represares de I a traducción y de la transcripción, secuencias de activación aguas ar riba, y determinantes de I a inestabilidad de I A RNm Varios d e e stas últimos elementos pueden ubicarse próximos a la región de codificación.

En el contexto de esta divulgación, la expresión "elemento regulador" o "región reguladora" tipicamente se refiere a una secuencia de AoN, normalmente, aunque no siempre, aguas arriba (S') a la secuencia de codificación de un gen estructural, el cual controla la expresión de la región de codificación proporcionando el reconocimiento para la ARN polimerasa y/u otros factores requeridos para que la transcripción inicie en un sitio particular. Sin embargo, debe entenderse que otras s ecuencias de nu cleótidos, ubi cadas dentro del os i ntrones, o 3' de I a secuencia pu eden también contribuir a la regulación de expresión de una región de codificación de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento para la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para asegurar el inicio en un s itio particular es un elemento promotor. La mayoría, aunq ue no todos los elementos promotores eucariotas contienen una caja TATA, una secuencia de ácido nucleico conservada que consta de pares de bases de nucleótidos de ad enosina y timidina usualmente situados aproximadamente 25 pares de bases aguas arriba de un sitio de inicio de la transcripción. Un elemento promotor comprende un elemento promotor basal, responsable por el inicio de la transcripción, así e omo otros elementos reguladores (como s e ha enumerado ant eriormente) que modifican la expresión génica.

Existen v arios tipos de r egiones r eguladoras, incluyendo aquellas que s e regulan por des arrollo, i nducibles o constitutivas. Una región reguladora que se regula por desarrollo, o controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se activa dentro de ciertos órganos o tejidos de un órgano en momentos específicos durante el desarrollo de ese órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que se regulan por desarrollo pueden activarse preferiblemente dentro de ciertos órganos o tejidos en etapas específicas del desarrollo, también pueden ser activas en una forma regulada por desarrollo, o a un nivel basal en otros órganos o tejidos dentro de la planta también Ejemplos de regiones reguladoras específicas de tejidos, por ejemplo, véase -especificas de una región reguladora, incluyen el promotor de napina, y al promotor de cruciferina (Rask y col., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595 599; Bilodeau y coJ., 1994, Plant Ce1l14: 125-130). Un ejemplo de un promotor específico de la hoja incluye el promotor de plastocianina (documento US 7.125.978; SEQ ID NO: 23; figura 1b)

Una región reguladora inducible es aquella que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una

o más secuencias o genes de AoN en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias o genes de ADN no serán transcritos. Típicamente, el factor de proteína que se une específicamente a una región reguladora inducible par a activar I a transcripción pu ede pr esentarse en una f arma ac tiva, qu e es des pués di recta o indirectamente convertida en la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor de proteína también puede estar ausente. E I inductor puede s er un ag ente qu ímico t al e amo una pr oteína, m etabolito, regulador d e crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frlo, salo elementos tóxicos

o indirectamente mediante la acción de un patógeno o agente infeccioso tal como un virus. Una célula vegetal que contiene una región reguladora inducible puede ser expuesta a u n inductor aplicando externamente el inductor a la célula o planta por ejemplo, por aspersión, riego, calentamiento o métodos similares. Los elementos reguladores inducibles pueden derivarse ya sea de genes de la planta o que no son de la planta (por ejemplo, Gatz, C. y Lenk, J.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Los ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen, pero sin limitación, promotor inducible de tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 48, 89-108), el promotor inducible por esteroides (Aoyama, T. y Chua, N. H., 1997, Plant J. 2, 397-404) Y el promotor inducible por etanol (Salter, M. G., Y col., 1998, Plant Journal16, 127 -132; Caddick, M. X. y col., 1998, Nature Biotech, 16, 177 180), genes IB6 y CK11 inducibles por citoquinina (Brandstatter, 1. y Kieber, J. J., 1998, Plant Cell10, 1009 -1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982 -985) Y el elemento inducible por auxina, oR5 (Ulmasov, T., y col., 1997, Plant Cell 9, 1963 -1971). U na región reguladora constitutiva dirige la expresión de unge n a través de las diferentes partes de una planta y continuamente durante todo el desarrollo de la planta. Ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluyen promotores asociados con la transcripción 35S de CaMV (Odell y col., 1985, Nature,

313: 81 O-812), la actina 1 del arroz (Zhang y col., 1991, Plant Cell, 3: 1155 -1165), actina 2 (An y col., 1996, Plant J., 10: 107 -121) o tms 2 (documento US 5.428.147) y los genes de triosafosfato isomerasa 1 (Xu y col., 1994, Plant Physiol. 106: 459 -467), el gen de la ubiquitina 1 de maíz (Comejo y col., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637 -646), los genes 1 y 6 de ubiquitina de Arabidopsis (Holiorf y col., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637 -646), Y el gen del factor 4A de inicio de la traducción de tabaco (Mandel y col., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995 -1004). El término "constitutivo· como se usa en el presente documento, no necesariamente indica que un gen bajo control de la región reguladora constitutiva se exprese al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en un am plio rango de tipos celulares aun cuando a menudo se observa una variaciÓfl en abundancia.

La una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invencioo puede expresarse en cualqu ier huésped vegetal adecuado que se transforma por la secuencia de nucleótidos, o construcciones, o vectores de la presente invención. Los ejemplos de huéspedes adecuados incluyen, pero sin limitación, cultivos agrícolas incluyendo alfalfa, colza, Brassica spp., maíz, Nicotiana spp, alfalfa, patata, ginseng, guisante, avena, arroz, soja, trigo, cebada, girasol yalgodÓfl

La una o más construcciones genéticas quiméricas de la presente invención pueden comprender además una región 3' no traducida. Una región 3' no traducida se refiere a aquella porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento del ARN m o expresión genética. La señal de poliadenilaciÓfl se caracteriza usualmente efectuando la adición de rastros de ácido poliadenilico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de po liadenilación se reconocen comúnmente por la pr esencia de ho mologla con I a forma canónica 5' A ATAAA-3', aunque no s on infrecuentes I as variaciones. Una o m ás de las construcciones gené ticas qui méricas de la pr esente invención pueden también incluir potenciadores adicionales, ya sea potenciadores de traducción o de transcripción, según se requiera. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden incluir el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. El codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación para asegurar la traducción de la secuencia completa

Los ejemplos no limitantes de regiones 3' adecuadas son las regiones 3' no traducidas, transcritas que contienen una señal de poliadenilación de genes del plásmido que inducen tumor (Ti) de Agrobacterium, ta l como los genes de plantas y de nopa lina sintasa (gen Nos) tal como los genes de proteína de almacenamiento de soja y la subunidad pequeña del gen de ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO).

Para facilitar la identificación de las células de plantas transformadas, las construcciones de esta invención pueden manipularse además para incluir marcadores seleccionables de plantas. Marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a compuestos quimicos tal como un a ntibiótico, por ejemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina, o herbicidas, tal como fosfinotricina, glifosato, clorosulfurón y similares. De forma similar, se pueden utilizar enzimas que proporcionen la producción de un compuesto identificable por medio de cambio de color tal como GUS (beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP

También se consideran parte de esta invención las plantas transgénicas, células vegetales o semillas que contienen la construcción genética quimérica de la presente invención. Los métodos para regenerar plantas completas a partir de células vegetales se conocen también en la técnica. En general, se cultivan células vegetales transformadas en un medio apropiado, que puede contener agentes selectivos tal como antibióticos, donde se usan marcadores seleccionables para facilitar la identificación de células vegetales transformadas. Una vez se forman los callos, se puede estimular la formación de brotes empleando las hormonas apropiadas de plantas de a cuerdo con métodos conocidos y s e transfieren los brotes a I m edio de enraizamiento para regeneración del as plantas. La s pi antas pueden utilizarse entonces para establecer generaciones repetitivas, ya sea a partir de semillas o utilizando técnicas de propagación vegetativas. También pueden generarse plantas transgénicas sin utilizar cultivos de tejidos.

Los elementos reguladores descritos en la presente invención pueden también combinarse con la región de codificación de i nterés par a e xpresión de ntro de un rango de or ganismos hué spedes que s on s ensibles a transformación, o ex presión transitoria. Tales or ganismos incluyen, pero s in limitación, p lantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, por ejemplo, pero sin limitación, maíz, plantas de cereales, trigo, cebada, avena, Nicotiana spp, Brassica spp, soja, judías, guisantes, alfalfa, patata, tomate, ginseng y Arabidopsis.

Los métodos para la transformación estable y la regeneraciÓfl de estos organismos se encuentran establecidos en la técnica y se conocen entre los expertos en la técnica. El método para obtener plantas transformadas y regeneradas no es crucial para la presente invenciÓfl

Elt érmino " transformación" s e refiere a I a transferencia i nterespecífica de i nformación genética ( secuencia nucleotídica) que s e m anifiesta de f arma genotípica, fenotípica, o am baso L a transferencia i nterespecífica del a información genética proveniente de una construcción quimérica a un huésped puede heredarse y la transferencia de informaciÓfl genética puede considerarse estable, o I a transferencia puede ser transitoria y la transferencia de información genética no puede heredarse.

Se desvela un vector adecuado que comprende una construcción quimérica adecuada para utilizarse con sistemas de expresión estables o transitorios. La información genética también puede proporcionarse dentro de una o más construcciones. Por ejemplo, una secuencia nucleotidica que codifica una proteína de interés puede introducirse en una construcción, y una segunda secuencia nucleotídica que codifica una proteína que modifica la glicosilación de la proteína de interés puede introducirse utilizando una construcción separada. Estas secuencias nucleotídicas pueden co-expresarse po steriormente den tro d e una planta. S in embargo, también puede utilizarse una estructura qu e comprende una secuencia nucleotídica que codifica tanto la proteína de interés como la proteína que modifica el perol de glicosilación de I a proteína de interés. En este caso, la secuencia nucleotídica comprenderá una pr imera secuencia que comprende una pr imera secuencia d e ác ido nu cleico que codifica I a pr oteína de interés operativamente unida a un pr omotor o región reguladora, y una s egunda secuencia que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés, la segunda secuencia operativa mente unida a un promotor o región reguladora

Por ~coexpresado" se entiende que dos o más de dos secuencias de nucleótidos se expresan aproximadamente al mismo tiempo dentro de la planta, y dentro del mismo tejido de la planta. Sin embargo, las secuencias de nucleótidos no ne cesitan ex presarse exactamente al mismo tiempo. M ás bien, las d os o m ás secuencias de nucleótidos se expresan en una forma tal que los productos codificados tengan una oportunidad de interactuar. Por ejemplo, la proteína que modifica la glicosilación de la proteína de interés puede expresarse ya sea antes o durante el periodo cuando la proteína de interés se expresa de tal manera que la modificación de la glicosilación de la proteína de interés tenga lugar. Las dos o más de dos secuencias de nucleótidos pueden coexpresarse utilizando un sistema de expresión transitorio, donde las dos o más secuencias se introducen dentro de la planta aproximadamente al m ismo tiempo bajo condiciones tales que s e expresen ambas secuencias. Como altemativa, una planta de plataforma que comprende un a del as secuencias de nu cleótidos, por ejemplo, I a s ecuencia que codifica la proteína que modifica el perol de gl icosilación de la proteína de interés, puede transformarse, ya sea transitoriamente o en un a forma estable, con una secuencia adicional que codifica la proteína de interés. En este caso, la secuencia que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés puede expresarse dentro de un tejido deseado, durante una etapa deseada de desarrollo, o su expresión puede inducirse utilizando un promotor inducible, y la secuencia adicional que codifica la proteína de interés puede expresarse bajo condiciones similares y en el mismo tejido, para asegurar que se coexpresan las secuencias de nucleótidos

Las construcciones pu eden introducirse en Ias células vegetales utilizando plásmidos Ti, pi ásmidos R i, vectores virales de I a planta, transformación directa de A DN, microinyección, electroporación, etc. Para la revisión de tales técnicas véase por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, Nueva York. V 111, págs 421 -463 (1988); G eierson y C orey, P lant Molecular B iology, 28 edi ción, ( 1988); Y Miki Y I ver, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. En Plant Metabolism, 28 edición, DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell ( eds), A ddison Wesly, La ngmans Lt d, Lon dres, pags . 561 -579 ( 1997). O tros métodos incluyen la incorporación directa de A DN, el uso de I iposomas, el ectroporación, p or e jemplo, utilizando pr otoplastos, microinyección, microproyectiles o bigotes e infiltración al vacío. Véase por ejemplo, Bilang, y col. (Gene 100: 247250 ( 1991), Scheid y col. (Mol. Gen. G enet. 228: 104 -112, 1991 ), Guerche y col. (Plant Science 52: 111 -116, 1987), Neuhause y col. (Theor. Appl Genet. 75: 30 -36,1987), Klein y col., Nature 327: 70 -73 (1987); Howell Y col (Science 208: 1265, 1980), Horsch y col. (Science 227: 1229 -1231, 1985), DeBlock y col., Plant Physiology 91. 694 701 , 1 989), M ethods f or P lant Molecular B iology ( Weissbach y Weissbach, e ds. A cademic P ress Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski eds., Academic Press Inc., 1989), Liu y Lomonossoff (J. Virol Meth, 105: 343 -340, 2002), las Pat. de Estados Unidos n.o 4.945.050; 5.036.006; Y 5.100.792, las Solicitudes de Patente de Estados Unidos n.o de Serie 08/438.666, presentada el10 de mayo de 1995, y 07/951 .715, presentada el 25 de septiembre de 1992.

Como se describe a continuación, se usan métodos de expresión transitoria para expresar las construcciones de la presente invención ( véase Liu y Lom onossoff, 2 002, J ournal of V irological M ethods, 105: 343 -348). Como alternativa, puede utilizarse u n método de expresión transitoria con base en vacío, como se describe por Kapila y col. 1997. Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, pero sin limitación, un método de Agroinoculación o Agroinfiltración, sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos transitorios como se observó anteriormente Ya sea con la Agroinoculación o con la Agroinfiltración, una mezcla de Agrobacterias que incluye el acido nucleico deseado ingresa a lose spacios intercelulares de un t ejido, por ejemplo, las hojas, la porción a érea de I a pi anta (incluyendo tallo, hojas y flores), otra porción de la planta (tallo, raíz, flor) o la planta completa. Después de cruzar la epidermis, las Agrobacterla infectan y transfieren copias de ADN-t dentro de I as células. El ADN-t se transcribe en forma episomal y se traduce el ARNm, conduciendo a la producción de la proteína de interés en células infectadas, sin embargo, el paso del ADN-t dentro del núcleo es transitorio.

Por "gen de interesO, "secuencia nucleotidica de interesO, o "región codificante de interesO, se refiere a que cualquier gen, secuencia nucleotídica, o región de codificación que se va a expresar dentro de un organismo huésped, por ejemplo, una planta. Estas expresiones se utilizan de forma intercambiable. Tal secuencia nucleotídica de interés 5 puede incluir, pero sin limitación, un gen o región de codificación cuyo producto es una proteína de interes_Ejemplos de una pr oteína de interés incluyen, por e jemplo, pero sin I imitación, un a enz ima industrial, un complemento proteínico, un nutraceutico, un producto de valor añadido, o un fragmento de los mismos para su uso en forraje, alimento, o en ambos, una proteína farmacéuticamente activa, por ejemplo, pero sin limitación, factores de crecimiento, reguladores de crecimiento, anticuerpos, antígenos, y fragmentos de los mismos, o sus derivados útiles 10 para inmunización o vacunación o similares. Proteínas de interes adicionales pueden incluir, pero sin limitación, interleucinas, por ejemplo, una o más de una de IL-1 a IL-24, IL-26 Y IL-27, citocinas, eritropoyetina (EPO), insulina, G-CSF. G M-GSF, h PG-GSF, M -CSF o combinaciones del as mismas, interferones, por ej emplo, i nterferón-alfa, interterón-beta, interferón-gama, factores de coagulación sanguínea, por ejemplo, Factor VIII, Factor IX, o tPA hGH, receptores, agonistas de receptores, anticuerpos, neuropolipéptidos, insulina, vacunas, factores de crecimiento, por

15 ejemplo, p ero s in limitación, f actor del crecimiento epi dérmico, f actor del crecimiento quer atinocítico, f actor de crecimiento de transformación, reguladores de crecimiento, antígenos, autoantigenos, fragmentos de los mismos, o combinaciones de los mismos.

Si la secuencia nucleotídica de interes codifica un producto que es directa o indirectamente tóxico para la planta,

20 entonces, usando el metodo de la presente invención, tal toxicidad puede reducirse por toda la planta expresando de forma selectiva el gen de interés dentro de un tejido deseado o en una etapa deseada del desarrollo de la planta Además, el periodo limitado de expresión resultante de la expresión transitoria puede reducir el efecto al producir un producto tóxico en la planta.

25 La región de codificación de interés o la secuencia nucleotídica de interés puede expresarse en cualquier planta huesped ad ecuada, ya sea transformada o que comprenda I as secuencias nuc leotídicas, o m oleculas de ác idos nucleicos, o construcciones geneticas, o vectores de la presente invención. Los ejemplos de huéspedes adecuados incluyen, pero sin limitación, Arabidopsis, cultivos agrícolas que i nduyen, por ejemplo, colza, Brassica spp .• maíz, Nicotiana spp., alfalfa, patata, ginseng, guisante, avena, arroz, soja, trigo, cebada, girasol y algodón.

30 Como se describe en más deta lle en los siguientes ejemplos, la síntesis de una proteína de interés, por ejemplo, pero sin limitación, un anticuerpo, C5-1 , con una N-glicosilación modificada, se produjo en una planta co-expresando

GalT o GNT1-GaIT

Secuencia Xmal Plas .c Sacl -ATG-pPlas.r Sacl -PlasTeLc EcoRI-PlasTer.r Plasto-443c Plas+LC C51 .r LC-C51 .c LC-C51XhoSac.f Plas+HC-C51 .r HG-C51 .c He C51XhoSac.r HC-C51 KDEL Sacl ., Glucopéplido tríptico GalT I nucleótido aminoácido GalT I GnT-1I1 nucleótido

Ejemplos

Lista de secuencias·

SEQIDNO·

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Secuencia GNT1 GalT secuencia nucleotídica am inoácido GNT1-GaIT am inoácido GnT-1I1 am inoácido GNT1-GnT-lII Dominio GTS de GNT1 nucleótido) Dominio CTS de GNT1 (am inoácido) Promotor de lastocianina 5'UTR Plastocian ina 3' UTR y terminador FgalTS e GNT1-GnT-1I1 nucleótido F alT RgalTFlagStu FGNT RGBTS e

SEO ID NO·

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Ejemplo 1· Ensamblaje de los casetes de expresión R61 O R612 (figura 1 a) R621 y R622 (figura 5a) Todas I as manipulaciones se realizaron u sando protocolos de b iologia molecular ge neral de S ambrook y R ussel

(2001).

R610, R612 (figura 1a)

Los cebadores de oligonucleótidos usados se presentan a continuación·

Xmal-pPlas.c: SEO ID NO: 1 5' AGTTCCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTC-3' SEO ID NO: 1 Sacl-ATG-pPlas.r: SEO ION o: 2 5 '-AA T AGAGCTCCA TTTTCTCTCAAGATGA TTAA TIAA TIAA TT AGTC3' SEO ID NO :2 Sacl-PlasTer.c: SEO ID NO:3 5'-AATAGAGCTCGTTAAAATGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGG-3' SEO ID NO:3 EcoRI-PlasTer.r: SEO ID NO:4 5'TT ACGAA TTCTCCTTCCT AA TIGGTGTACT ATCA TTT ATCAAAGGGGA-3' SEO ID NO:4 Plasto-443c: SEO ID NO:5 5'-GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC-3' SEO ID NO:5 Plas+LC-C51.r: SEO ID NO:6 5'-ATCTGAGGTGTGAAAACCATTTTCTCTCAAGATG-3' SEO ID NO:6 LC-C51.c: SEO ID NO:7 5'-ATGGTTTTCACACCTCAGATACTTGG-3' SEO ID NO:7 LC-C51XhoSac.r: SEO ID NO:8 5'-ATATGAGCTCCTCGAGCTAACACTCATTCCTGTIGAAGC-3' SEO ID NO:8 Plas+HC-C51.r: SEO ID NO:9 S'-CAAGGTCCACACCCAAGCCATTTTCTCTCAAGATG-3' SEO ID NO:9 HC-C 51.c: SEO ID NO: 10 5'-ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC-3' SEO ID NO: 10 HC-C51XhoSac.r: SEO ID NO: 11 5'-ATAAGAGCTCCTCGAGTCATTTACCAGGAGAGTGGG-3' SEO ID NO: 11 HC -C51KDEL(Sacl).r: SEO ID NO: 12 5'-ATAAGAGCTCTCAAAGTTCATCCTTTTTACCAGGAGAGTGGG3' SEO ID NO: 12

La primera etapa de clonaciórJ consistió en ensamblar un plásmido receptor que contenía elementos reguladores aguas arriba yaguas abajo del gen de pi astocianina de alfalfa. El promotor de pi astocianina (Patente de Estados Unidos 7. 125.978) Y 1 as secuencias 5'UTR s e am plificaron a par tir de A ON genó mico de al faifa ut ilizando 1 os cebadores de oligonucléotidos Xmal-pPlas.c (SEO ID NO: 1) y Sacl-ATG-pPlas.r (SEO ID NO: 2). El producto resultante de la amplificación se digirió con Xmal y Sacl y se ligó con pCAMBIA2300, previamente digerido con las mismas enzimas, para crear pCAMBIA-PromoPlasto. De manera similar, las secuencias de 3'UTR y el terminador, del gen de pi astocianina (figura 1 c; nu cleátidos 1 -399 del a S EO ION O: 24) se am plificaroo a partir de A ON genómico de alfalfa utilizando los siguientes cebadores: Sacl-PlasTer.c (SEO ID NO: 3) y EcoRI PlasTer.r, (SEO ID NO: 4) y el producto se digirió con Sacl y EcoRI antes de insertarse en los mismos sitios de pCAMB1A-PromoPlasto para crear pCAMBIAPlasto.

Los plásmidos R 610 Y R 612 se prepararon para contener secuencias de cadena ligera C5-1 y de cadena pesada C5-1 bajo el promotor de plastocianina de alfalfa como construcciones en tándem; R 610 se diseñó para permitir la retención en el ER de la IgG ensamblada y comprendió la secuencia de KOEL fusionada al extremo de la cadena pesada de C5-1, y R 612 se diseñó para permitir la secreción.

El en samblaje d e casetes de ex presión d e C 5-1 s e realizó ut ilizando un m étodo de ligación mediado por P CR descrito por Oarveau y col. (1995). Para ensamblar las secuencias de codificación de cadena ligera aguas abajo del promotor de pi astocianina, u na primera etapa consistió e n am plificar los pr imeros 44 3 pares de bases (pb) de 1 promotor de plastocianina de alfalfa (nucleótidos 556-999 de la figura 1 b o SEO ID NO: 23) descritos por O'Aoust y col. (Patente de Estados Unidos 7.125.978) aguas abajo del ATG inicial mediante PCR usando pCAMBIAPlasto como plantilla y los siguientes cebadores:

Plasto-443c (SEO ION O: 5) y PI as+LC-C51 .r (SEO ION O: 6 , e 1 solapamiento está subrayado, anteriormente) .

De forma paralela, la secuencia de codificación de cadena ligera se amplificó por PCR a partir del plásmido pGA643kappa (Khoudi y col., 1999) con los siguientes cebadores:

LC-C51 .C (SEO ID NO: 7) y LC-C51XhoSac.r. (SEO ID NO: 8; el solapamiento está subrayado).

Los dos productos de amplificación obtenidos se mezclaron y utilizaron como plantilla en una tercera reacciórJ por PCR utilizando los cebadores Plasto-443c (SEO ID NO: 5) y LC-C51XhoSac.r (SEO ID NO: 8). El solapamiento entre los cebadores Plas+LC-C51 .r (SEO ID NO: 6) y LC-C51 .C (SEO ID NO: 7) utilizados en las primeras reacciones condujo al ensamblaje del os productos de la am plificación durante la tercera reacción. E 1 producto ensamblado resultante de la tercera reacción por PCR se digirió con Oralll y Sacl y se ligó con pCAMBIAPlasto digerido con Oralll y Sacl para generar el plásmido R540.

la secuencia codificante de cadena pe sada s e fusionó con el elemento regulador ag uas arriba de p lastocianina mediante la amplificación de los 443 pb aguas arriba del ATG inicial de plastocianina, los nucleótidos 556 -999 de la figura 1 b; SEO ID NO: 23, mediante PCR utilizando pCAMBIAPlasto como plantilla con los siguientes cebadores

Plasto-443c (SEO ID NO: 5) y Plas+HC CS1 .r (SEO ID NO: 9; el solapamiento subrayado anterior)

El producto de estas reacciones se mezcló y ensambló en una tercera reacción por PCR uti lizando los cebadores Plasto-443c (SEO ID NO: 5) y HC-C51XhoSac.r (SEO ID NO: 11). El fragmento resultante se digirió con Oralll y Sacl y se ligó en pCAMBIAPlasto entre los sitios de Oralll y SacL El plásmido resultante se denomillÓ R541

Se añadió una etiqueta KOEl en el extremo C de la secuencia codificante de cadena pesada mediante amplificación por PC R con los cebadores Plasto-443c (SEO ID NO: 8 ) Y HC-C51KDEL (Sacl).r (SEO ID NO: 12) utilizando el plásmido R541 como una plantilla. El fragmento resultante se digirió con Oralll y Sacl se clonó en los mismos sitios de pCAMBIAPlasto, creando el plásmido R550.

El ensamblaje de los casetes de expresión de cadena ligera y pesada en el mismo plásmido binario se realizó como se indica a continuación: R541 y R550 se digirieron con EcoRl, se redujeron, se digirieron con Hindlll y se ligaron en los sitios Hindlll y Smal de R540 para crear R610 (con KDEl) y R612 (sin KOEl; véase la figura 1).

R621 Y R622 (figura Sa) -los cebadores oligonucleotídicos usados se presentan a continuación

FgalT SEO ID NO: 27 S'-GACTCTAGAGCGGGAAGATGAGGCnCGGGAGCCGCTC-3' SEO ID NO: 27

RgalTFlagStu SEO ID NO: 28

5'-AAGGCCfACG CfACTI'GTCAT CGTCATCTIT GTAGTCGCAC

GGTGTCCCG AAGTCCAC -J' SEQ ID NO: 28

FGNT SEO ID NO: 29 S'-ATCGAAATCGCACGATGAGAGGGAACAAGTITIGC-3' SEO ID NO: 29

RGNTSpe SEO ID NO: 30 5'-CGGGATCCACTAGTCTGACGCnCATTIGTICnC-3' SEO ID NO: 30

FgalTSpe SEO ID NO: 25 5'-GGACTAGTGCACTGTCGCTGCCCGCCTGC-3' SEO ID NO: 25

los plásmidos para la expresión de GalT y GNT1GaIT se ensamblaron a partir de pBlTI121 (pagny y coi., 2003). El gen de ¡}(l ,4)--galactosiltransferasa (hGaIT) (galactosa UOP: ¡}-N-acetillglucosaminida: ¡3.(l ,4)--galactosiltransferasa; EC 2.4.122) se aisló de pU C19-hGaIT (Watzele y coL, 1991) con digestión de EcoRL Después del tratamiento de Klenow, el fragmento de hG alT de 1, 2 kb s e clonó e n p BlTI221 en 1 os s itios S mal, dando como resultado e 1 plásmido pBL TI221 hGalT. O espués, una et iqueta indicadora s e fusionó con el extremo C -terminal de la región codificante mediante PCR utilizando los cebadores FGalT (SEO ID NO: 27) y RGalTFlagStu (SEO ID NO: 28) para amplificación. Posteriormente, R622 se produjo clonando este fragmento Xbal-Stul en el vector binario pBL T1121. Los primeros 77 a. a. de N-acetilglucosaminiltransferasa 1 (GNT1) que corresponden al dominio transmembrana se amplificaron por PCR utilizando el AoNc de N. labacum que cod ifica N-GNT1 como plantilla (Strasser y coL , 1999) y FGNT (SEO ID NO: 29) y RGNTSpe (SEO ID NO: 30) como cebadores. El producto de amplificación se clonó en primer lugar en el vector pGEM-T, yel plásmido resultante se asimiló con Apal y BamHI, y se ligó en pB LT1221, produciendo u n pi ásmido denominado pB L TI221-GNTI. E 1 dom inio catalítico de hG alT s e obt uvo mediante amplificación por PCR en pBLTI221hGalT usando los cebadores FGalTSpe (SEO ID NO: 25) y RgalTFlagStu (SEO ID NO: 28), creando los sitios Spel y Stul en el extremo 5' y 3', respectivamente. Después, el fragmento SpellStul hGalT se clonó en pB LT1221-GNT1 ut ilizando 1 os m ismos sitios ( Spel y S tul), creando pBL TI221-GNTIGalT. Finalmente, pBL TI221 -GNT1GaIT se asimiló con Xbal y Stul aislando la secuencia codificante de GNT1GalT (figura 5d; SEO ID NO: 17), y R621 se produjo clonando este fragmento en el vector binario pBLTI121

Todos los clones se secuenciaron para confirmar la integridad de las construcciones. Los plásmidos se usaron para transformar Agrobacterlum tumefaciens (AGL 1; ATCC, Manassas, VA 20108, Estados Unidos) por electroporación (Hofgen y Willmitzer, 1988) usando un aparato Gene Pulser 11 (Biorad, Hercules, CA, Estados Unidos) como para la transformación de E. coli (W.S. Dower, Electroporation of bacteria, En "Genetic Engineering", Volumen 12, Plenum Press, N ueva Y 0111, 199 O, J .K. S etlow eds .). La integridad de t odas las c epas de A. t umefaciens se co nfirmó mediante un mapeo de restricción.

Se preparó una construcción HcPro como se describe en Hamilton y col (2002)

Ejemplo 2: Preparación de biomasa vegetal inoculación agroinfiltracián y cosecha

Se cultivaron plantas de Nicotiana benthamiana a partir de semillas en superficies llenas con un sustrato de musgo esfagnáceo comercial. Se dejó que las plantas crecieran en el invemadero bajo un fotoperiodo de 16/8 y un régimen de temperatura de 25°C dur ante e I dí af20 oC dur ante I a noc he. T res s emanas d espues d el s embrado, se seleccionaron pi ántulas individuales, s e t ransplantaron e n m acetas y s e dej ó que crecieran en el i nvernadero durante tres semanas adicionales en las mismas condiciones ambientales

Las cepas de Agrobacteria R612, R610, R621, R622 o 35SHcPro crecieron en un medio YEB complementado con ácido 2 -[N-morfolino]etanosulfónico 10 mM (MES), ac etosiringona 20 JlM, 5 Ol-Igfml de c anamicina y 25 l-Igfml de carbenicilina a pH 5,6 hasta que alcanzaron una 00000 entre 0,6 y 1,6. Las suspensiones se Agrobacterium se centrifugaron antes de utilizarse y se suspendieron de nuevo en un medio de infiltración (MgCI2 10 mM y MES 10 mM a pH 5,6).

La infiltración con jeringa se realizó como se describe por Liu y Lomonossoff (2002, Journal of Virological Melhods,

105: 343-348))

Para la infiltración al vacio, las suspensiones de A tumefaciens se centrifugaron, se suspendieron de nuevo en el medio de infiltración y s e almacenaron durante I a noche a 4 oC. E I dí a del a infiltración, los lo tes d e cultivo s e diluyeron en 2,5 volúmenes de cultivo y se dejó que se calentaran antes de utilizarse. Se pusieron al revés plantas completas de Nicotiana b enthamiana en I a suspensión bacteriana en un dep ósito de ac ero inoxidable cerrado herméticamente, con un vacío de 20-40 Torr durante 2 mino Tras la infiltración con jeringa o al vacío, las plantas se devolvieron al invernadero durante un periodo de incubación de 4-5 días hasta su cultivo

Muestreo de Hojas y Extracción Total de Proteínas

Después de la incubación, se cosechó la parte aerea de las plantas, se congeló a -80 OC, se trituró y se separó en sub-muestras de 1,5 o 7,5 g. Las proteínas solubles totales se extrajeron al homogeneizar (Polytron) cada submuestra de material congelado-triturado de planta en 3 volúmenes de Tris 50 mM frio a pH 7.4, NaCI 0,15 M, Triton X-lOO ala, 1 %, fluoruro de fenilmetansulfonilo 1 mM y qui mostatina 10 JlM. Despues de I a homogenización, las suspensiones se centrifugaron a 20 000 9 durante 20 m in a 4 oC y es tos ex tractos e n br uto depurados (sobrenadante) se conservaron para su análisis. El contenido de proteína total de los extractos en bruto depurados se determinó mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad, H ercules, CA) utilizando al búmina s ériea bov ina como estándar de referencia.

Ejemplo 3: Análisis de proteínas inmunolransferencia y ELlSA

C5-1 es una I gG m urina a nti-humana, p or lo tanto, I a detección y cuantificación puede realizarse a t raves d e s u afinidad característica con IgG (marcas de actividad) o mediante su inmunorreactividad con IgG anti-ratón.

Las proteínas de extractos totales en bruto o anticuerpos purificados se separaron mediante SDS-PAGE y se tiñeron con Azul de Coomassie R-250 o G-250 o se electrotransfirieron a membranas de difluoruro de polivinileno (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para inmunodetección. Antes de la inmunotransferencia, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5 % y Tween-20 al 0,1 % en una solución salina tamponada con Tris (TBS-T) durante 16-18ha4OC

La inmunotransferencia se realizó mediante incubación con los siguientes anticuerpos: un anticuerpo IgG (H+L) antiratón de cabra conjugado con peraxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grave, P A, Cal. n. ° 115-035-146) (0,04 ,¡g/ml en I eche desnatada al 2 % en T BS-T), un ant icuerpo I gG hu mano conjugado con peroxidasa (GamuneX® Bayer Corp., Elkhart, IN) (0,2 ,¡g/ml en leche desnatada al2 % en TBS-T) o un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra policlonal (específico de cadena pesada) (8igma-Aldrich, 8t-Louis, MO) (0,25 l-Igfml en leche desnatada al 2 % en T BS-T). Un ant icuerpo I gG ant i-cabra de a sno conjugado c on per oxidasa (Jackson I mmunoResearch) (0,04 Jlg/ml en leche desnatada al 2 % en T98-T) se utilizó como anticuerpo secundario para membranas tratadas

con el a nticuerpo es pecífico de cadena pesada. S e detectaron I os complejos inmunorreactivos mediante quimioluminescencia utilizando luminol como el sustrato (Rache Diagnostics Corporation). La conjugación de la enzima de peroxidasa de rábano picante del anticuerpo IgG humano se realizó usando el equipo de conjugación de peroxidasa activada EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, IL)

Ensayo cuantitativo de ELlSA

Placas con múltiples pocillos ( Immulon 2H B, T hermoLab System, Franklin, M A) s e cubrieron con 2,5 pg/ml d e anticuerpos anti-ratón de cabra específicos para cadena pesada de IgG1 (Sigma M8770) en tampón de carbonato 50 mM (pH 9,0) a 4 OC durante 16-18 h. Las placas multipocillo se bloquearon después a través de 1 h de incubación en caseína al 1 % en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Pierce Biotechnology, Rockford, 11) a 37 oC Una curva estándar se generó con diluciones de un control de IgG1 de ratón purificado (Sigma M9269). Al realizar los inmunoensayos, todas las diluciones (control y las muestras) se realizaroo en un extracto vegetal obtenido de un tejido vegetal infiltrado e incubado con inoculo de control, de manera que se eliminase cualquier efecto de matriz Las placas se incubaron con muestras de proteínas y diluciones con curvas estándar durante 1 ha 37 oC. Después de tres lavados con Tween-20 al 0,1 % en PBS (PBS-T), las placas se incubaron con un anticuerpo IgG (H+L) antiratón de cabra conjugado con peroxidasa (0,04 pgfml en una soluciÓfl de bloqueo) (Jackson ImmunoResearch 115035-146) durante 1 ha 37 OC. Los lavados con PBS-T se repitieron y las placas se incubaron con un sustrato de peroxidasa de 3,3', S, 5'-Tetrametilbencidina (TMB) S ure B lue (KPL, G aithersburg, M O). La reacción s e det uva añadiendo HCI 1 N Y la absorbancia se leyó a 450 nm. Cada muestra se analizó por triplicado y las concentraciones se interpolaron en la porción lineal de la curva estándar.

Ejemplo 4: Purificación de IgG

La purificación de C5-1 a partir del material de las hojas implicó recoger hojas congeladas de N. benthamiana (100150 g), añadir fosfato sódico 20 mM, NaCI150 mM y meta-bisulfito sódico 2 mM con un pH de 5,8-6,0, y mezclar con ayuda de u n m ezclador comercial dur anle 2 -3 m in a t emperalura a mbienle. S e r eliraron I as fibras insolubles mediante una filtración basta de Miracloth™ (Calbiochem, San Diego, CA) y se añadió ftuoruro de fenilmetansulfonilo 10 mM (PMSF) al filtrado. El extracto se ajustó a un pH 4,8 ± 0,1 con HCI 1 M y se depuró mediante centrifugación a

18.000 g durante 15 m in a 2 -8 oC. El s obrenadante depurado se aj ustó a un pH de 8, O ± 0,1 con TRIS 2 M, se

depuró de nuevo mediante centrifugación a 18000 g durante 15 min a 2-8 oC, y se filtró en membranas secuenciales de 0,8 y 0,2 pm (Pall Corporation, Canadá). El material filtrado se concentró mediante filtración de flujo tangencial utilizando una membrana de ultrafiltraci6n de corte con peso molecular de 100 kDa de 0,2 pies2 de área eficaz (GE Healthcare B iosciences, Canadá) par a r educir el v olumen del material dep urado de 5 a 10 veces. Después, la muestra concentrada se aplicó a una columna de 5 mm x 5 cm (volumen de columna de 1 mi) de proteína recombinante G-Sepharose Fast Flow (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, Cal. n.o P4691). La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de TRIS-HCI 20 mM, NaCI 150 mM con un pH de 7,5. El anticuerpo se eluyó con glicina 100 mM con pH de 2,9-3,0, e inmediatamente se llevó a un pH neutro mediante recolección en tubos con volúmenes calculados de TRIS-HCI 1 M a pH 7,5. Las fracciones agrupadas de anticuerpos eluidos se centrifugaron a 21000 9 durante 15 min a 2-8 oC y se almacenaron a -80 oC hasta su análisis. Después de la pu rificación, la columna de afinidad se limpió y se almacenó de acuerdo con las indicaciones del fabricante. El m ismo medio cromatográfico pudo volverse a utilizar para varias purificaciones sin una modificación significativa del rendimiento de la purificación (hasta 10 ciclos probados)

Ejemplo 5: Análisis de N-Glicosilación

Las muestras que comprendían C5-1 (50 pg) se realizaron en S DSfPAGE al15 %. Las cadenas pesadas y ligeras se revelaron coo azul de Coomassie y la banda de proteínas correspondiente a la cadena pesada se extrajo y se cortó en pequeños f ragmenlos. Los f ragmenlos se l avaron 3 veces con 600 I.il de u na s olución de N H4HC03 0,1 MfCH3CN (1f1) durante 15 minutos cada vez y se secaroo.

La reducción de puentes de disulfuro se produjo mediante la incubación de los fragmentos de gel en 600 I.il de una solución de OTI O, 1 M en NH4HC03 0,1 M, a 56 oC durante 45 minutos. La alquilación se realizó añadiendo 600 ,11 de una solución de yodoacetamida 55 mM en N H4HC03 0,1 M, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los sobrenadantes se desecharon y los fragmentos de poliacrilamida se lavaron una vez más en NH4HC03 0,1 MlCH3CN (1/1)

Después, I as proteínas s e digirieron con 7,5 pg de t ripsina (Promega) en 600 pi d e N H4HC03 0,05 M, a 37 OC durante 16 h. Se añadieron doscientos ~I de CH3CN y se recogió el sobrenadante. Después, los fragmentos de gel se lavaron con 200 J.l1 de N H4HC03 0,1 M, después con 200 J.l1 de C H3CN de nuevo y, finalmente, con 200 J.l1 de ácido fórmico al 5 %. Todos los sobrenadantes se agruparon y se liofilizaron.

La separación peptidica mediante HPLC se realizó en una columna de fase inversa C 18 (4,5 x 250 mm) con un gradiente lineal de CH3CN en TFA al 0,1%. Las fracciones se recogieron, se liofilizaron y se ana lizaron por MALDITOF-MS en un instrumento Voyager DE-Pro MALDI-TOF (Applied Biosystems, Estados Unidos) equipado con un láser de nitrógeno de 337 nm. Se realizaron los espectros de masas en el modo de extracción retardada del renector usando ácido alfa-cian04-hidroxicinámico (Sigma-Aldrich) como matriz

Ejemplo 6: Cuantificación de expresión transitoria de IgG en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana

Para probar si los casetes de expresión a base de plastocianina fuertes podían provocar una alta acumulación de una IgG completamente ensamblada, las secuencias codificantes de I a cadena ligera y pesada de C5-1, una JgG anti-humana murina (Khoudi y col. 1997) se ensamblaron en construcciones en tándem aguas abajo del promotor de plastocianina y secuencias sin traducir 5', y se flanquearon con las secuencias no traducidas 3' de plastocianina y de terminación de transcripción en el mismo segmento de ADN-T de un plásmido binario pCambia como se representa en la figura 1.

Tanto en el casete de expresión R612 como R610 (véase el Ejemplo 1), las secuencias de codificación de cadena pesada y ligera contenían el péptido de señal nativo de C5-1 (Khoudi y col. 1999), pero en R610, la secuencia de codificación de un pé ptido K DEL s e aña dió e n el ex tremo C -terminal de I a cadena pes ada par a restringir e I movimiento de la IgG ensamblada al aparato de Golgi

Tras las etapas de donación y la transferencia de plásmidos en Agrobacterium tumefaciens (AGL 1), cada hoja de las tres plantas de Nicotiana benthamiana se infiltraron con jeringa con cepas de Agrobacterium transformadas con los plásmidos R612 o R610 , y se incubaron en cond iciones de invernadero durante 6 días antes de su análisis, como se describe en el Ejemplo 2. Después del periodo de incubación, las hojas de cada planta (aproximadamente 20 g de biomasa) se congelaron, se trituraron, y el polvo congelado se mezcló para producir una muestra homogénea de la cual se tomaron 2 s ub-muestras de 1,5 gramos para s u ex tracción ( de cada pi anta; v éase el Ejemplo 3) El contenido en C5-1 se cuantificó en extractos totales de proteínas de cada muestra mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELlSA) utilizando una cadena pesada de I gG1 anti-ratón de c abra poi iclonal para la captura y una IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (H+L) para la detección (véase el Ejemplo 3)

Como se muestra en la figura 2, la agroinfiltraciÓfl de R612 condujo a la acumulación de 106 mg del anticuerpo por kg d e peso fresco, m ientras que la forma retenida e n E R del ant icuerpo ( R61 O) al canzó 211 mglkg F W en las mismas condiciones

Debido a que el silencia miento genético postranscripcional (PTGS) ha demostrado limitar la expresión de transgenes en plantas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana y que la co-expresión de un supresor de silenciamiento del virus de la patata Y (HcPro) contrarrestó la degradación específica de ARNm de los transgenes (Brigneti y col. , 1998), la co-infiltración de una construcción H cPro ( Hamilton y col., 2002) s e pr obó par a determinar su ef iciencia con la expresión en aumento de C5-1 . La co-expresión de R612 y R610 con HcPro aumentó los niveles de acumulación de anticuerpos 5,3 Y 3,6 veces, respectivamente, en comparación c on los ob servados en aus encia de H cPro. En presencia de HcPro, la expresión de C5-1 controlada con plastocianina alcanzó valores promedio de 558 mglkg de FVI/ con R 612, Y 757 mglkg de F W con R 61 O(figura 2). Los niveles máximos d e ex presión de C 5-1 ex cedieron 1,5glkg de FVI/ (25 % de las proteínas solubles totales) en algunos extractos de hojas infiltradas con R612 y R610

Para evaluar la escalabilidad de un sistema de expresión de agroinfiltración, la acumulación de C5-1 se cuantificó seguida de un procedimiento de infiltración al vacio adaptado de Kapila y col. (1997). En esta serie de experimentos, la parte aérea de las plantas completas se infiltraron al vacio con R612 + HcPro o R610 + HcPro y se devolvieron al invernadero durante 6 días antes de la cosecha. En un esfuerzo para proporcionar datos que sean representativos de un s istema de producción a gran escala, se congelaron lotes de aproximadamente 250 g de hojas/peciolos de varias plantas, se molieron en una muestra homogénea, y se recogieron 3 sub-muestras de 7,5 gramos de material por I ate para s u análisis. Como se m uestra a través de I a cuantificación por E USA, los niveles de acumulación promedio de C5-1 alcanzaron 238 y 328 mglkg de FVI/ para las infiltraciones de R612 y R610 respectivamente (figura 2).

Ejemplo 7: Caracterización del anticuemo producido

Se us aran análisis d e transferencia d e pr oteínas ( véase el E jemplo 3) para revelar el ni vel de e nsamblaje y fragmentación de la IgG C5-1 en plantas que prcx:lucen las formas secretadas de (R612) y de retención en ER (R610) de la proteína, después de tanto experimentos de infiltración de jeringa como al vacío. Una transferencia de Western sondeada con IgG H+L anti-ratón d e cabra conjugada con peroxidasa s e ut i1izó en primer lugar para destacar la presencia de un máximo de fragmentos de anticuerpos, independientemente de su origen en la molécula de C5-1. Como se muestra en la figura 3A, todos los extractos de proteínas contenían fragmentos de tamaño molecular similar y en abundancia relativa similar, sin importar la estrategia de direccionamiento subcelular o el

método de infiltración utilizado. En cada caso, se reveló una banda mayor (:<:85 %) correspondiente al anticuerpo completo a aproximadamente 150 kDa, con dos bandas menores a aproximadamente 135 kDa y aproximadamente 100 kDa, mostrando que el anticuerpo se acumuló principalmente en su forma completamente ensamblada (H211) De manera interesante, los fragmentos de movilidad electroforética similar también estaban presentes en la IGg1 de control purificada a par tir de una linea celular tumoral murina (MOPC-21; Sigma #M9269), lo que sugeria que las fragmentaciones producidas en las líneas celulares de plantas y ani males eran similares y, qui zá resultantes de actividades pr oteolíticas comunes. También se obtuvieron resultados similares c on un an ticuerpo ant i-ratón especifico de cadena pesada para la detección

Para ensayar la identidad de los fragmentos de anticuerpos presentes en los extractos, se utilizó una transferencia de actividad, en la que las proteínas transferidas se prueban con una IgG1 humana conjugada con peroxidasa, el antigeno de C5-1 La identidad de un anticuerpo completamente ensamblado con una banda de aproximadamente 150 kDa puede observarse en la figura 38. Además, el patrón de fragmentación observado en las transferencias de Western, con ex cepción d e un ban da de 100 kDa (véase la figura 3A) e s v isible en I a transferencia de actividad (figura 38). Sin desear quedar ligado por la teoría, este resultado sugiere que el fragmento de 100 kDa no contiene las regiones Fab del anticuerpo de C5-1 , y puede consistir, al menos en parte, en dímeros de cadena pesada, un intermedio del ensamblaje de anticuerpos

Ejemplo 8: Purificación de anticuerpos y caracterización del producto purificado

El anticuerpo se pu rificó a partir de la biomasa, utilizando una única etapa cromatográfica de afinidad de Proteina G yel producto obtenido se analizó mediante SDS-PAGE (véase el Ejemplo 4). El gel teñido con azul de Coomassie que se presenta en la figura 4a muestra una banda principal a 150 kDa en la fracción del eluato de la Proteína G Esta banda representa más del 85 % del producto purificado en la forma secretada y retenida en ER, y el contenido en los contaminantes es idéntico para ambas formas (figura 4A, filas 4 y 5). Un análisis de transferencia Westem, probado con una IgG anti-ratón poi iclonal, ha m ostrado el origen mu rino de I gG del contaminante principal en las fracciones purificadas de C 5-1 (datos no mostrados). En condiciones de r educción, se detectaron dos productos principales a aproximadamente 26 kDa y aproximadamente 55 kDa, lo que corresponde al peso molecular de las cadenas ligera y pes ada, respectivamente (figura 48 , f ila 2). La cadena pe sada del a nticuerpo retenido en E R mostró una movilidad electroforética más elevada que la cadena pesada del anticuerpo apoplásico (figura 48, fila 3), lo que se interpreta como los resultados combinados de aminoácidos KDEL adicionales presentes en el extremo Cterminal y las diferencias en la N-glicosilación debido a la retención en ER. La figura 4C muestra que los anticuerpos purificados (150 kDa) unidos con IgG1 humana, como ocurrió con los fragmentos contaminantes de 75, 90, 100, Y 120 kDa, destacando la presencia de al menos un segmento Fab en estos fragmentos. La presencia de Fab en el fragmento de 100 kDa contrastó con el resultado obtenido del análisis de extractos en bruto, donde la banda de 100 kDa no se unió con la IgG humana. Existen hipótesis de que la cantidad de fragmentos que contienen Fab y que migran a 100 kDa en el extracto en bruto fue demasiado baja para la detección con esta transferencia de actividad o que el fragmento que migra a 100 kDa consistía en dos moléculas diferentes, una de dímeros de cadena pesada (sin Fab) y la otra con regiones de unión a antígeno.

La capacidad de reproducción de este sistema para la prcx:lucción de anticuerpos se evaluó con una comparación paralela de los productos purificados de 2 loles de infiltración diferentes y 3 lotes de purificación distintos de cada lote. El análisis de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de los lotes de purificación mostró la presencia de bandas idénticas en todos los lotes, yen abundancia relativa altamente similar (figura 40).

Ejemplo 9: Modificación de N-qlicosilación de ant icuerpos m ediante la co-expresión de una 9a laclosillransferasa humana

Para investigar si la co-expresión transitoria puede usarse para controlar la glicosilación de pr oteínas emergenles durante I a ex presión transitoria, s e pr epararon casetes de ex presión de p lastocianina q ue comprendían ¡}1,4galactosiltransferasa human nativa (GaIT). R622 comprendía GalT (figura 5B), y R621 comprendía el dominio catalítico de GalT fusionado con el dominio CTS de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1 ; GNT1GaIT (figura 5A). El dom inio C TS de N -acetilglucosaminil t ransferasa (GNT1) s e seleccionó como an claje d e m embrana par a el dominio catalítico de GalT humano, ya que GNT1 actúa en una etapa temprana de la síntesis N-glicanos complejos en el E R Y el aparato d e c is-Golgi (Saint-Jore-Dupas y col., 2006). S in de sear quedar ligando por la t eoria, el secuestro de la actividad de GaIT en una etapa temprana de la maduración de la proteina puede dar como resultado la adiciÓfl de 131 ,4galactosa en gl icanos de maduración y la inhibición eficiente de la fucosilación y x ilosilación del núcleo. Estas construcciones se co-infiltraron en plantas con C5-1

Las plantas de Nicotiana benthamiana se infiltraron con R612 (véase el Ejemplo 2) (forma secretada de C5-1), R612

+ R621 (GNT1GaIT) o R612 + R622 (GaIT) en presencia de HcPro. La figura 6 muestra un análisis inmunológico de C5-1 purificado a partir de estas muestras de biomasa.

La galactosilación del anticuerpo se estimó mediante afinodetección con la aglutinina de Erythrina cristagali (ECA) que se une específicamente a f31,4galactosa. Como se esperaba, no se detectó galactosa cuando C5-1 se expresó en solitario (R612; figura 6) La gal actosilación se o bservó en C 5-1 pur ificado a par tir de ca-infiltraciones c on R512+R622 (GaIT) pero no a partir de co-infiltraciones con R612+R621 (GNT1GaIT, Figura 6). La transferencia de Western realizada utilizando anticuerpos anti-131 ,3fucosa revelaron la fucosilación del N---9licano en el control C5-1 expresado sin galactosiltransferasa. La fucosilaciÓfl del N-glicano no se detectó en el anticuerpo co-expresado con GNT1GaIT, sin importar el método de agroinfiltración, mientras que la co--expresión con el GalT nativa no condujo a una reducción detectable en la fucosilación del anticuerpo (figura 6). Se obtuvieron resultados similares con los anticuerpos específicos anti-131 ,2xilosa, que mostraron la ausencia total de inmunoseñales especificas de xilosa en C5-1 co-expresado con GNT1 GalT y su presencia cuando C5-1 se co-expresó con GalT (figura 6).

Los ge les teñidos con C oomasie p ara es timaciones v isuales di rectas de I gG completamente ens amblada, y las transferencias de Westem y de actividad se realizaron en los mismos extractos. En base a estos datos, el sistema de expresión de anticuerpos que se describe alcanza rendimientos de 1,5 glkg de peso fresco con mas del 85 % del producto que consiste en IgG tetramérica de tamaño completo de aproximadamente 150 kDa en extractos en bruto

La ad ición d e un péptido K DEL en e I extremo C -terminal de la cadena pesada se ha utilizado previamente para aumentar la acumulación de anticuerpos (2-10X) mediando en la recuperación del anticuerpo del Golgi de vuelta al ER (Schillberg y col., 2003). Con el sistema de expresión que se describe en el presente documento, la adición de un péptido K DEL a I a cadena pesada de C5-1 du pliCÓ el rendimiento de C 5-1 cuando el s upresor de HcPro de silencia miento no estaba en uso. La diferencia entre el rendimiento de C5-1 en presencia o ausencia de KDEL se redujo de forma significativa cuando se usó HcPro para reducir el silenciamiento. La retención en ER no afecto a la calidad del producto, debido a que los fragmentos observados en los extractos en bruto de plantas que producen las formas de retención en ER y secretadas del anticuerpo tenían un tamaño idéntico y abundancia relativa.

C5-1 se separó en un aná lisis por HPLC preparativa y el perfil de N-glicallO del glicopéptido tríptico EEQFNSTFR (SEO 10 NO: 13) de C5-1 se analizó mediante espectrometría de masas de MALDI-TOF. Como se muestra en la figura 7A, cuando C5-1 se expresó en solitario, su población de N-glicano estuvo principalmente representada por formas complejas, incluyendo iones que consistian en oligosacáridos fucosilados y xilosilados, como se observa para la expresión estable (Bardar y col., 2003). La presencia de glicallOs específicos de ER no maduros, tales como Man-8 y Man-9, pueden es tar relacionados con una fracción de pr oteínas "en camino", como s e h a indicado previamente para anticuerpos derivados de plantas producidos por expresión transitoria (Sriraman, y col., 2004)

La c o--expresión de I anticuerpo C 5-1 con G alT na tiva dio como resu Itado una m odificación significativa de I a estructura de N-glicano, aunque los iones correspondientes a los N-glicallOs de tipo de manosa elevada siguieron siendo abundantes. E I complejo fucosilado principal y el N-glicano x ilosilado (J) de saparecieron y s e de tectaron nuevos 01 igosacáridos parcialmente galactosilados, algunos de I os cuales contenían maduraciones específicas de plantas y extensiones de galactosa, tales como GaIGlcNAcMam(XyI)GlcNAC:2 (figura 7B)_ Esto demostró que la coexpresión de C5-1 con (31 ,4galactosiltransferasa humana dio como resultado un glico-diseño eficiente del anticuerpo derivado de la planta

La ca-expresión de C5-1 con GNT1GaIT produjo una preparación de C5-1 purificada, en la que la población de Nglicano er a s ignificativamente di stinta de la d e G a1T/C5-1 Como s e m ueslra en la f igura 7C ,los hibridos galactosilados y no galactosilados (GaIGlcNAcMansGlcNAC:2 (K), y GalGlcNAcMansGlcNAc2 (G), estaban presentes junto con N-glicanos de oligomanosa. Sin desear quedar ligado por la teoria, según las hipótesis de Bakker y col (2006), GlcNAcMansGlcNAc2 (G) y M ansGlcNAc2 (B) pueden s er fragmentos der ivados de I a degr adación del GalGlcNAcMansGlcNAc2 híbrido mediante glicosidasas endógenas, en lugar de intermediarios de la formación de Nglicanos maduros. El efecto del anclaje de membrana de GNT1 fue notable; el C5-1 purificado a partir de plantas en las que la enzima sintética GNT1GalT se co-expresó de forma transitoria con C5-1 no contenía residuos (::;99 %) de glicanos que albergasen 0:1 ,3fucosa o 131,2xilosa específicas de plantas, lo que de muestra que I a modificación completa de la fucosilación y xilosilación se logró durante la co-expresión transitoria

La presente invención se ha descrito con respecto a una o más realizaciones. Sin embargo, será evidente para los expertos en I a técnica que pueden hacerse v arias variaciones y modificaciones sin apartarse del a lcanee de la invención, según se define en las reivindicaciones

Referencias:

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Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para sintetizar una proteína de interés con una reducción de fucosilación y xilosilación que comprende, introducir en una planta, una porción de una planta, o una célula vegetal, una secuencia nucleotidica que comprende del 80 % al 100 % de identidad con una secuencia nudeotídica definida por la SEO ID NO: 17 y que codifica una proteína hibrida que comprende una cola citoplásmatica, un dominio transmembrana, una región tallo (dominio C TS) de N -acetilglucosaminil t ransferasa ( GNT1) fusionada a un do minio catalítico d e be ta1,4galactosiltransferasa ( GaIT), l a pr imera secuencia nu cleotídica un ida op erativamente con una pr imera región reguladora que está activa en la planta, y una segunda secuencia nucleotidica para codificar la proteína de interés, la secuencia nucleotídica unida operativamente con una segunda región reguladora que está activa en la planta, y co-expresar de forma transitoria la primera y segunda secuencias nucleotídicas para sintetizar la proteína de interés que comprende m enos del 10 % de f ucosilación y x ilosilación en comparación con I a m isma proteína de interés producida en una planta de tipo silvestre

2. 2.

   El m étodode l ar eivindicación 1, en el qu e I a pr imera región reguladora e s un p romotorde plastocianina, o un promotOf 35S, y la segunda región reguladora es un promotor de plastocianina, o un promotor 35S.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, en el que una tercera secuencia nucleotídica se expresa dentro de la planta , la tercera secuencia nucleotídica que cod ifica un supresor de silencia miento, la tercera secuencia nucleotídica unida operativamente con una tercera región reguladora que está activa en la planta

4. 4.

   El método de la reivindicación 3, donde la proteína de interés se sintetiza en una cantidad de hasta 1,5 g por kilogramo de peso fresco de planta

5. 5.

   El método de la reivind icación 3, en el que la tercera región reguladora es un promotor de plastocianina, o un promotor 35S

   6 El método de la reivindicación 2, en el que una tercera secuencia nucleolídica se expresa en la planta, la tercera secuencia nucleotídica que codifica un supresor del silenciamiento, la tercera secuencia nucleolídica unida operativamente con una tercera región reguladora que está activa en la planta.

   7 El método de la reivind icación 6, en el que la tercera región reguladora es un promotor de plastocianina, o un promotor 35S.

6. 8.

   El método de la reivindicación 1, en el que la proteína de interés es un anticuerpo, un antígeno o una vacuna.

7. 9.

   El método de la reivindicación 8, en el que la segunda secuencia nucleotídica que codifica la proteína de interés comprende una secuencia nucleotídica 2A, unida operativa mente con una región reguladora 2A que está activa en la planta, y una secuencia nucleotídica 2B, unida operativamente con una región reguladora 2B que está activa en la planta, y el producto codificado por cada una de 2A y 28 se combinan para producir un anticuerpo.

   10 El método de la reivindicación 9, en el que la región reguladora 2A es un promotor de plastocianina, y la región reguladora 28 es un promotor de plastocianina
8. 11 . Un ácido nucleico que comprende los nucteótidos 1 a 1062 de la SEO ID NO: 17 (GNT1-GaIT), en el que la secuencia nucleotídica codifica una proteína que modifica la glicosilación de una proteína de interés.

9. 12.

   Una proteína híbrida GNT1-GaIT, que comprende un dominio CTS de N-acetilglucosaminil transferasa fusionado a un dominio catalítico de bet a-1 ,4galactosiltransferasa, comprendiendo I a proteína híbrida los aminoácidos 1 a 354 de la secuencia SEO ID NO: 18.

10. 13.

    Una planta, célula vegetal, o una semilla que comprende la secuencia nucleotídica de la reivindicación

11. 11 .

    14 Una planta, célula vegetal, o una semilla que comprende la proteína híbrida de la reivindicación 12
12. 15. El método de la reivindicadón 3, en el que la proteína de interés es un anticuerpo y se sintetiza en una cantidad de hasta 1,5 g por kilogramo de peso fresco de hoja
13. 16. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína de interés sintetizada carece de fucosilación, xilosi1ación, o ambas