BR112015003702B1 - Composição adequada para reduzir a capacidade reprodutiva de ratos machos e fêmeas, e, uso de uma composição - Google Patents

Composição adequada para reduzir a capacidade reprodutiva de ratos machos e fêmeas, e, uso de uma composição Download PDF

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Abstract

composição adequada para esgotar os folículos ovarianos em mamíferos fêmeas, usos de uma composição e de um epóxido de diterpenóide e um diepóxido orgânico, e, método para preparar uma composição. são fornecidos composições e métodos para reduzir a capacidade reprodutiva de mamíferos. as composições e os métodos envolvem o uso e a administração de (a) um epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo e que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas e (b) um diepóxido orgânico que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas.

Description

INFORMAÇÃO DE PEDIDO CONTÍNUA
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Condicional U.S. Série N° 61/692,624, depositado em 23 de agosto de 2012 e incorporado aqui por referência.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da Invenção
[002] A presente invenção refere-se à composições e métodos para reduzir a capacidade reprodutiva de mamíferos. As composições e os métodos envolvem o uso e a administração de (a) um epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo e que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas em combinação com (b) um diepóxido orgânico que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas. Descrição dos Fundamentos
[003] As composições que reduzem a capacidade dos mamíferos, particularmente aqueles que induzem a esgotamento de folículo ovariano, podem ser desejáveis para uma variedade de razões. Tais composições podem ser usadas para induzir a infertilidade em pragas, tais como roedores, para controlar a população das pragas e produzir modelos animais para estudo. Por exemplo, os animais, tais como ratos, com esgotamento de folículo induzida podem ser usados para criar modelos animais que podem ser usados para estudar menopausa em e seus efeitos em outros animais, tais como seres humanos.
[004] As pragas de roedores são uma causa principal de dano às lavouras agrícolas e estoques de alimentos mundiais. Os roedores alimentam- se e contaminam os fornecimentos de alimentos, carregam doenças, danificam a infraestrutura e podem desorganizar a vida selvagem nativa e os ecossistemas. Por décadas, os rodenticidas foram usados para tentar controlar populações de roedores, ainda, até hoje, as populações de roedores mostram- se difíceis de controlar e o dano por roedores é difundido. Uma razão que as populações de roedores são difíceis de controlar é que os roedores tendem a ter períodos de gestação relativamente curtos (por exemplo, na ordem de algumas semanas), e, desta maneira, a não ser que a população total seja eliminada, a população pode restaurar por si só uma vez que a o rodenticida é exaurido ou esgotado. Além disso, os venenos podem não alvejar especificamente as pragas e podem afetar outros animais, incluindo seres humanos. Desta maneira, o uso de pesticidas pode ser moderado por outras preocupações ambientais.
[005] A taxa de reprodução do rato é vinculada à quantidade de alimentos e a qualidade das fontes de alimento. Desta maneira, enquanto o envenenamento reduz a população, isto também reduz a competição por alimento, desta maneira a reprodução dos sobreviventes pode tornar-se descontrolada.
[006] Uma alternativa promissora ao uso de rodenticidas que envolve o uso de formulações que aceleram o esgotamento de folículo ovariano para controlar as de pragas de roedores por intermédio do controle de fertilidade. O diepóxido de epóxido de 4-vinilcicloexeno (VCD) foi eficaz para causar o esgotamento do folículo primordial não regenerador em ratos Sprague Dawley (Rattus norvegicus) por intermédio da gavagem. Entretanto, para ser eficaz para o controle populacional, é desejável alvejar múltiplos, por exemplo, todos os folículos ovarianos para o esgotamento, a fim de ter impacto imediato na fertilidade e produção de filhote. Consequentemente, as composições melhoradas que induzem o esgotamento de folículo ovariano em estágios e métodos múltiplos de usar uma composição são desejados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] É um objetivo da presente invenção fornecer uma composição que pode ser usada para reduzir a capacidade reprodutiva de mamíferos. Em particular, as composições da presente invenção induzem o esgotamento de folículo ovariano quando administradas a mamíferos fêmeas bem como mamíferos machos. E um outro objetivo da presente invenção fornecer métodos de reduzir a população de mamíferos com as composições da presente invenção.
[008] Os objetivos da presente invenção podem ser acompanhados com uma composição adequada para esgotar os folículos ovarianos em mamíferos fêmeas, que compreende: (a) um epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo e que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas e (b) um diepóxido orgânico que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas.
[009] Em uma forma de realização preferida da invenção, o epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo (a) é representado pela fórmula:
Figure img0001
em que X1 é H, R1, OH ou OR1, X2 é H, R1, OH, OR1, =0 ou Y, X3 é H ou OH, X4 é H, OH ou OR1, R1 é um grupo alquila Cl-4, Y é (CR2R3O)nP(O)(O-Z+)2, cada R2 é, independentemente, H, alquila C|-6, aril-alquila Ci-6- , cicloalquila C3-6 ou arila, cada R3 é, independentemente, H, alquila C1-6, aril-alquila Ci-6- , cicloalquila C3-6 ou arila, ou R2 e R3, junto com o átomo de carbono ao qual estes são ligados formam um grupo cicloalquila C3.7, em que qualquer grupo alquila ou cicloalquila em R2 ou R3 podem ser opcionalmente substituídos com um a cinco substituintes selecionados do grupo que consiste de halo, alcóxi Ci-6 e NRaRb, em que qualquer grupo arila em R2 ou R3 podem ser opcionalmente substituídos com um a cinco substituintes selecionados do grupo que consiste de alquila C1-6, alcóxi C1-6, NRaRb, nitro e ciano, n é 1, 2 ou 3, cada Z é H, Ra e Rb são, cada um, independentemente, H, alquila Ci-6, cicloalquila C3-6 ou arila, ou Ra e Rb, junto com o átomo de nitrogênio ao qual estes são ligados, forma um grupo pirrolidino, piperidino, piperanino, azetidino, morfolino ou tiomorfolino, ou um sal do mesmo.
[0010] Em uma forma de realização preferida da invenção, X1 é H, CH3, OH OU OCH3.
[0011] Em outra forma de realização preferida da invenção, X2 é H, CH3, OH, 0CH3 OU =0.
[0012] Em outra forma de realização preferida, X2 é Y.
[0013] Em outra forma de realização preferida da invenção, X3 é H.
[0014] Em outra forma de realização preferida da invenção, X4 é H, OH ou OCH3.
[0015] Em uma forma de realização preferida da invenção, (a) é triptolídeo, triptolídeo, 16-hidroxitriptolídeo, triptonídeo ou minelídeo.
[0016] Em uma forma de realização particularmente preferida, (a) é triptolídeo.
[0017] Em uma forma de realização preferida da invenção, o diepóxido orgânico contém de 8 a 14 átomos de carbono.
[0018] Em uma forma de realização preferida da invenção, o diepóxido orgânico contém de dois a quatro anéis.
[0019] Em uma forma de realização preferida da invenção, o diepóxido orgânico compreende pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste de diepóxido de 4-vinilcicloexeno (VCD), glicerol diglicidil éter, carboxilato de 3,4-epóxi-cicloexil-metil-3,4-epoxicicloexila, 1,4-cicloexanodimetanol diglicidil éter, diglicidil éter de etileno glicol, resorcinol glicidil éter e 1,4-butanodiol diglicidil éter.
[0020] Em uma forma de realização preferida da invenção, o diepóxido orgânico compreende diepóxido de 4-vinilcicloexeno.
[0021] Em uma forma de realização preferida da invenção, (a) é triptolídeo e (b) é diepóxido de 4-vinilcicloexeno.
[0022] A presente invenção também inclui um método de induzir esgotamento de folículo ovariano em um mamífero fêmea, que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição descrita acima ao mamífero fêmea.
[0023] Em uma forma de realização preferida da invenção, o mamífero é um ser humano ou um mamífero não humano.
[0024] A presente invenção também inclui um método de reduzir a capacidade reprodutiva de um mamífero, que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição descrita acima ao mamífero.
[0025] Em uma forma de realização preferida da invenção, o mamífero é uma fêmea.
[0026] Em uma forma de realização preferida da invenção, o mamífero é um macho.
[0027] Em uma forma de realização preferida da invenção, o mamífero é esterilizado pela administração da composição.
[0028] A presente invenção também inclui um método de controlar o tamanho da população de uma população de mamíferos não humanos, que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição descrita acima para a população de mamíferos não humanos.
[0029] A presente invenção também inclui um método de induzir esgotamento de folículo ovariano em um mamífero fêmea, que compreende administrar ao mamífero fêmea uma quantidade eficaz de (a) um epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo e que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas e (b) um diepóxido orgânico que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas.
[0030] Em uma forma de realização da invenção, (a) e (b) são administrados como composições separadas.
[0031 ] A presente invenção também fornece um método de reduzir a capacidade reprodutiva de um mamífero, que compreende administrar ao mamífero uma quantidade eficaz de (a) um epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo e que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas e (b) um diepóxido orgânico que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas.
[0032] A presente invenção também fornece um método de controlar o tamanho da população de uma população de mamíferos não humanos, que compreende administrar para a população de mamíferos não humanos uma quantidade eficaz de (a) um epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo e que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas e (b) um diepóxido orgânico que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas.
[0033] A presente invenção também fornece um método de preparação de uma composição descrita acima, que compreende combinar (a) e(b).
[0034] Uma avaliação mais completa da invenção e muitas das vantagens presentes neste serão prontamente obtidas quando as mesmas tomam-se melhor entendidas por referência às seguintes figuras em conjunção com a descrição detalhada abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0035] As formas de realização exemplares da presente invenção serão descritas em conexão com as Figuras dos desenhos anexas.
[0036] As Figuras 1 e 2 ilustram os ovários de controle cultivados.
[0037] A Figura 3 ilustra um sistema de cultura in vitro. A. Coleção de ovário a partir do filhote de rato de 4 dias pós-natal. B. preparar o tecido em excesso do ovário sob um microscópio de dissecação. C. Ovário isolado é colocado na membrana em flutuação no meio.
[0038] A Figura 4 ilustra um ovário cultivado tratado com 30 μm de VCD.
[0039] A Figura 5 ilustra um ovário cultivado tratado com 30 μm de VCD e 5 nm de triptolídeo.
[0040] A Figura 6 ilustra um ovário cultivado tratado com 30 µm de VCD e 1 O nm de triptolídeo.
[0041] A Figura 7 ilustra o consumo de ração/isca dos ratos do estudo.
[0042] A Figura 8 ilustra aumento do peso corporal dos ratos do estudo.
[0043] A Figura 9 ilustra contagens de folículos dos ratos alimentados com isca contendo VCD e triptolídeo.
[0044] A Figura 10 ilustra imagens ovarianas dos ovários dos ratos alimentados com isca contendo VCD e triptolídeo.
[0045] A Figura 11 ilustra pesos dos ovários dos ratos do estudo.
[0046] A Figura 12: Ilustra os resultados dos ratos fêmeas prematuros consumindo isca com VCD constante (0,099 de concentração) combinado com o aumento das concentrações de triptolídeo.
[0047] A Figura 13: Ilustra os resultados dos ratos fêmeas prematuros consumindo ração ilimitada e água durante o período de tratamento total.
[0048] A Figura 14: Ilustra que o efeito nos filhotes nascidos por ninhada foi dependente da dose de triptolídeo. O eixo-x indica o triptolídeo total consumido mg/kg de peso corporal.
[0049] A Figura 15: Ilustra os resultados dos ratos fêmeas prematuros consumindo a isca controle, sem ingredientes ativos e as fêmeas tratadas comendo isca com VCD a 0,099% e dosagem alta de triptolídeo por 15 dias.
[0050] A Figura 16: Ilustra os resultados de um bioensaio in vitro do esgotamento de folículo.
[0051] Será estimado que as figuras não sejam necessariamente desenhadas em escala. Por exemplo, as dimensões de alguns dos elementos nas Figuras podem ser exageradas com relação a outros elementos para ajudar a melhorar o entendimento das formas de realização ilustradas da presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0052] A presente invenção fornece uma composição adequada para esgotar os folículos ovarianos em mamíferos fêmeas, que compreende: (a) um epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo e que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas quando incorporado na composição, isto é, usado em combinação com o epóxido (b) e (b) um diepóxido orgânico que causa esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas.
[0053] Triptolídeo é um epóxido diterpenóide bem conhecido e muitos derivados e análogos deste composto também são bem conhecidos e podem ser usados na presente invenção.
[0054] Como uma referência, o esqueleto de triptolídeo pode ser representado pela seguinte estrutura:
Figure img0002
[0055] É claro, os compostos da presente invenção têm uma variedade dos substituintes diferentes na cadeia principal. Os exemplos de tais compostos são descritos abaixo.
[0056] Em uma forma de realização preferida da invenção, o epóxido de diterpenóide que compreende uma cadeia principal de triptolídeo (a) é representado pela fórmula (I):
Figure img0003
X' é H, R’,OH ou OR1, X2 é H, R1, OH, OR1, =0 ou Y, X3 é H ou OH, X4 é H, OH ou OR1, R1 é um grupo alquila Cl-4, Y é (CR2R3O)nP(O)(O Z+)2, cada R2 é, independentemente, H, alquila Ci-6, aril-alquila Ci-6- , cicloalquila C3-6 ou arila, cada R3 é, independentemente, H, alquila Ci-6, aril-alquila Ci-6- , cicloalquila C3-6 ou arila, ou R2 e R3, junto com o átomo de carbono ao qual estes sào ligados formam um grupo cicloalquila C3-7, em que qualquer grupo alquila ou cicloalquila em R2 ou R3 podem ser opcionalmente substituídos com um a cinco substituintes selecionados do grupo que consiste de halo, alcóxi Ci-6 e NRaRb, em que qualquer grupo arila em R2 ou R3 podem ser opcionalmente substituídos com um a cinco substituintes selecionados do grupo que consiste de alquila Ci-6, alcóxi Ci-6, NRaRb, nitro e ciano, n é 1, 2 ou 3, cada Z é H, Ra e Rb são, cada um, independentemente, H, alquila Ci-6, cicloalquila C3-6 ou arila, ou Ra e Rb, junto com o átomo de nitrogênio ao qual estes são ligados, forma um grupo pirrolidino, piperidino, piperanino, azetidino, morfolino ou tiomorfolino, ou um sal do mesmo.
[0057] Em uma forma de realização preferida da invenção, X1 é H, CH3, OH OU OCH3.
[0058] Em outra forma de realização preferida da invenção, X2 é H, CH3, OH, OCH3 OU =O.
[0059] Em outra forma de realização preferida, X2 é Y. Em uma forma de realização particularmente preferida da invenção, quando X2 é Y, então X1, X3 e X4 são H.
[0060] Em outra forma de realização preferida da invenção, X3 é H.
[0061] Em outra forma de realização preferida da invenção, X4 é H, OH ou OCH3.
[0062] Em uma forma de realização preferida da invenção, (a) é triptolídeo, triptolídeo, 16-hidroxitriptolídeo, triptonídeo ou minelídeo, incluindo sais destes.
[0063] Em uma forma de realização particularmente preferida, (a) é triptolídeo.
[0064] As descrições detalhadas e métodos de fabricação do composto (a) são fornecidas em uma variedade de referências, tais como U.S. 6.294.546, 7.626.044, 6.548.537, 6.004.999, 8.268.882 e WO 2010/129918, cada um de que é incorporado neste por referência. As misturas dos compostos diferentes dentro do escopo de (a) são incluídas na presente invenção.
[0065] O componente (b) da composição inventiva é um diepóxido orgânico que é capaz de causar o esgotamento de folículo ovariano em mamíferos fêmeas. Em uma forma de realização preferida da invenção, o diepóxido orgânico contém de 8 a 14 átomos de carbono. Em outra forma de realização preferida da invenção, o diepóxido orgânico contém de dois a quatro anéis, inclusive dos dois anéis de epóxido.
[0066] Em uma forma de realização preferida da invenção, o diepóxido orgânico compreende pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste de diepóxido de 4-vinilcicloexeno (VCD), glicerol diglicidil éter, carboxilato de 3,4-epóxi-cicloexil-metil-3,4-epoxicicloexila, 1,4-cicloexanodimetanol diglicidil éter, diglicidil éter de etileno glicol, resorcinol glicidil éter e 1,4-butanodiol diglicidil éter. As misturas dos diepóxidos estão dentro do escopo da invenção.
[0067] Outros diepóxidos orgânicos que podem ser usados na presente invenção incluem 1,2,3,4-diepoxibutano, 1,2,4,5-diepoxipentano, 1,2,5,6-diepoxipentano, 1,2,6,7-diepoxipentano, 1,2,7,8-diepoxioctano, 1,2,3,4-diepoxicicloexano, 1,2,5,6-diepoxiciclooctano, ácido 9,10,12,13- diepoxiesteárico, 3,4-epóxi-6-metil-cicloexilmetil-3,4-epóxi-6-metil- cicloexanocarboxilato, resorcinoldiglicidil éter, hexaepoxiesqueleno, bis-(2,3- epóxi-2-metilpropil)éter, bis-(3,4-epoxibutil)éter, etileno glicol bis-(2,3- epóxi-2-metilpropil)éter, 2,3-epóxi-2-etilexil-9,10-epoxiestearato, 2-etil-1,3- hexanodiol bis-(9,l0-epoxiestearato), 2,3-bis(glicidiloxi)-l,4-dioxano, adipato de bis-(3,4-epoxicicloexilmetil), adipato de bis-(3,4-epóxi- metilcicloexilmetil), 3,4-epóxi-6-metilcicloexilmetil 3-4-epóxi-6- metilcicloexanocarboxilato, dióxido de limoneno e éter bis-(2,3- epoxiciclopentil). Tais compostos são descritos em, por exemplo, Weil, Industrial Hygiene Journal, July-August 1963, pp. 305-325 and Van Duuren, Annals New York Academy of Sciences, 1969, pp. 633-651, ambos incorporados neste por referência.
[0068] Em uma forma de realização preferida da invenção, o diepóxido orgânico compreende diepóxido de 4-vinilcicloexeno. Em uma forma de realização preferida muito particularmente da invenção, (a) é triptolídeo e (b) é diepóxido de 4-vinilcicloexeno.
[0069] A reatividade química dos epóxidos pode ser determinada em um ensaio de alquilação usando 4-(p-nitrobenzil) piridina (NBP) com base no método relatado em “Detection of epoxides with 4-(p-nitrobenzyl) piridine.” Agarwal et. al. 1979, Bull. Environm. Contam. Toxicol. 23, 825-829, incorporado neste por referência.
[0070] A atividade biológica dos epóxidos pode ser avaliada em um bioensaio in vitro usando-se ovários de filhote de rato com base no método relatado em “Characterization of a rat in vitro ovarian culture system to study the ovarian toxicant diepoxide de 4-vinilcicloexene.” Devine et. al. 2002, Toxicol. Appl. Pharmacol. 184, 107-115, incorporado neste por referência. A atividade biológica pode ser determinada pelas contagens de seções ovarianas de folículos após cultura de uma semana de duração com concentrações micro molares de epóxido. Em geral, os epóxidos biologicamente ativos também podem ser quimicamente ativos também mas não vice versa.
[0071] A presente invenção também inclui um método de induzir esgotamento de folículo ovariano em um mamífero fêmea, que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição descrita acima ao mamífero fêmea.
[0072] Em uma forma de realização preferida da invenção, o mamífero é um ser humano ou um mamífero não humano. Os exemplos de mamíferos não humanos incluem roedores (por exemplo, ratos, camundongos, esquilos, cães das pradarias, mamíferos roedores, marmotas, hamsters, ratão- do-banhado, castores, ratos silvestres), ratos almiscarados, gatos, cães, porcos, cavalos, gado, coiotes, raposas, ovelhas, renas, cabras, arminhos, gambás, gambás, coelhos, lebres, cangurus, cangurus, texugos, camelos, elefantes, burros, guaxinins, ursos, marmotas, toupeiras, morcegos e javalis, por exemplo.
[0073] Os mamíferos listados acima podem ser usados de qualquer forma de realização da invenção descrita acima.
[0074] A presente invenção também inclui um método de reduzir a capacidade reprodutiva de um mamífero, que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição descrita acima ao mamífero.
[0075] Em uma forma de realização preferida da invenção, o mamífero é uma fêmea. Em outra forma de realização da invenção, o mamífero é um macho. E observado que a descrição ao triptolídeo oral é conhecida comprometer a fertilidade do rato macho até a esterilidade completa. Deste modo, tanto machos quanto fêmeas podem ser tratados de acordo com a presente invenção. Em uma forma de realização preferida da invenção, o mamífero é esterilizado pelo tratamento na presente invenção, isto é, o animal tem perdido sua capacidade reprodutiva.
[0076] A presente invenção também inclui um método de controlar o tamanho da população de uma população de mamíferos não humanos, que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição descrita acima para a população de mamíferos não humanos. Neste aspecto da invenção, diversos animais, isto é, uma população, são alvejados para o tratamento em uma faixa de área, por exemplo, em um parque ou reserva de vida selvagem, agricultura, operações de alimentação animal concentrada, negócios comerciais, residencial, terras federais. Esta forma de realização da invenção é particularmente útil no controle da população de roedor (por exemplo, rato) em um sistema de trânsito público urbano. Por exemplo, um sistema de metrô urbano. O sistema de metrô da cidade de Nova York, por exemplo, é bem conhecido por ter uma ampla população de roedores. Nesta forma de realização da invenção, a composição inventiva é fornecida pelos roedores para ingerir por toda parte do sistema. Um tal tratamento é esperado para reduzir o tamanho da população animal e possivelmente eliminar a população.
[0077] A presente invenção também inclui todos dos métodos descritos acima no qual (a) e (b) são administrados separadamente se desejado, isto é, (a) e (b) não são incorporados em uma composição simples. Além disso, enquanto (a) e (b) serão preferivelmente administrados ao mesmo tempo, também estão dentro do escopo da presente invenção com relação a esta forma de realização que (a) e (b) podem ser administrados em tempos diferentes, com o entendimento que tanto (a) quanto (b) estarão presentes juntos para fornecer o efeito sinergístico fornecido pela presente invenção. Preferivelmente, (a) e (b) são administrados dentro de 24, 12, 6, 3, 2 ou 1 hora, ou menos, de cada outro.
[0078] De acordo com várias formas de realização, a composição da presente invenção é configurada para causar esterilidade nos mamíferos para induzir o esgotamento ovariano dos folículos. De acordo com vários aspectos destas formas de realização, todos os estágios dos folículos são alvejados. Para causar a perda permanente da função ovariana, o grupo primordial finito dos folículos é alvejado. Para causar a redução rápida na produção de progénies, os folículos de desenvolvimento são alvejados.
[0079] O componente (b) da presente invenção (por exemplo, VCD) é usado para alvejar os folículos primordiais/primários e componente (a) (por exemplo, triptolídeo) é usado para alvejar os folículos de desenvolvimento. A combinação é usada para suprimir permanentemente a reprodução nos mamíferos deste modo tratado pela presente invenção. Adicionalmente, o triptolídeo é conhecido para reduzir a fertilidade nos mamíferos machos e deste modo a composição reduz a fertilidade tanto nos mamíferos machos quanto fêmeas. A composição também pode ser usada para acelerar a insuficiência ovariana em mamíferos, tal como mulher peri-menopausa.
[0080] Uma dosagem de um agente ativo pode variar de acordo com o propósito do tratamento e tipo de animal. Entretanto, de acordo com as formas de realização exemplares da descrição, a composição inclui cerca 1 mM a cerca de 750 mM, ou de cerca de 1 mM a cerca de 500 mM, ou de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM de (b) e cerca de 1 nM a cerca de 10 mM, ou de cerca de 5 nM a cerca de 1 mM, ou de cerca de 5 nM a cerca de 20 nM de (a). Estas faixas incluem todos os valores específicos e subfaixas entre estas, tal como 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 5 mM, 25 nM, 50 mM e 250 mM. De maneira surpreendente e inesperada, as composições da presente invenção foram observadas esgotar todos os estágios dos folículos ovarianos. O esgotamento é considerado resultar da combinação sinergística de (b) e (a), que é pensado permitir o uso de concentrações mais baixas de cada um dos agentes, comparada às composições que não incluem a combinação e que resultam nas porcentagens de esgotamento maiores dos folículos.
[0081] Para as aplicações de cultura in vitro, a razão molar de (a) a (b) pode variar de 1/5 a 1/75,000, incluindo todos os valores específicos e subfaixas entre estas, tal como 1/10, 1/25, 1/50, 1/100, 1/250, 1/500, 1/1.000, 1/2.500, 1/5.000, 1/10.000, 1/25.000 e 1/50.000. Para a aplicação in vivo (por exemplo, uma isca), a razão molar correspondente é geraimente 1/5 a 1/500, inclusiva de todos os valores específicos e subfaixas entre estas, tal como 1/10, 1/25, 1/50, 1/100 e 1/250.
[0082] Para as aplicações de cultura in vitro, a razão em peso de (a) a (b) geralmente varia de 1/2 a 1/50,000, incluindo todos os valores específicos e subfaixas entre estas, tal como 1/10, 1/25, 1/50, 1/100, 1/250, 1/500, 1/1.000, 1/2.500, 1/5.000, 1/10.000 e 1/25.000. Para a aplicação in vivo (por exemplo, uma isca), a razão em peso correspondente é geralmente 1/5 a 1/500, inclusiva de todos os valores específicos e subfaixas entre estas, tal como 1/10, 1/25, 1/50, 1/100 e 1/250.
[0083] Embora as composições incluindo VCD sejam estudadas para induzir o esgotamento do folículo, foi observado que VCD apenas—como o único ingrediente ativo não causa insuficiência ovariana prematura em concentrações baixas, ou durações de descrição curtas < 15 dias. A insuficiência ovariana prematura acontece quando não ocorrem mais ovulações a despeito de óvulos/folículos estarem presentes em um ovário. Para as composições e métodos para funcionar como um meio de controle da população, a insuficiência ovariana, desejavelmente, ocorre de maneira rápida, por exemplo, dentro de 10 dias de tratamento para os roedores.
[0084] De acordo com várias formas de realização, um método de induzir esgotamento de folículo ovariano inclui as etapas de fornecer uma composição que compreende VCD e triptolídeo, em que a composição induz o esgotamento dos estágios múltiplos dos folículos ovarianos. Por exemplo, a composição pode causar esgotamento dos folículos primordiais, secundários e terciários e do corpora lutea. De acordo com os aspectos adicionais, a combinação pode causar um aumento no esgotamento do folículo primordial e destruição mais completa dos folículos primordiais, comparados às composições incluindo apenas VCD.
[0085] A composição e método descritos neste podem ser usados para esterilizar vários mamíferos (por exemplo, roedores, porcos, coiotes, cães, gatos, cavalos e outros animais descritos acima), controlar a população de tais animais e outros pela alimentação da composição às populações de mamíferos. Como notado acima, a composição reduz a fertilidade nos mamíferos machos, de modo a administrar a composição tanto para machos quanto fêmeas da população é considerada ainda reduzir a população, comparada às composições que apenas afetam a fertilidade de machos e fêmeas.
[0086] De acordo com as formas de realizações adicionais, um mamífero fêmea não humano tendo esgotamento de folículo ovariano induzido pela administração da composição que compreende VCD e triptolídeo, em que a composição induz o esgotamento dos estágios múltiplos dos folículos ovarianos, é fornecida. O animal pode ser usado, por exemplo, para estudar os tratamentos de menopausa e pós-menopausa e pode ser usado como um modelo animal para os animais, tal como humanos.
[0087] Os mamíferos podem ser alimentados de acordo com uma variedade de técnicas, tal como gavagem e uso de isca. Quando gavagem é usada, a concentração de (b) (por exemplo, VCD) tipicamente varia de cerca de 50 a cerca de 200 mg/kg/dia de alimentação e a quantidade de (a) (por exemplo, triptolídeo) varia de cerca de 25 μg/kg de peso corporal a cerca de 100 μg/kg de peso corporal da composição. Estas faixas incluem todos os valores específicos e subfaixas entre estas, incluindo 35, 60, 75, 90, 125, 150 e 175 μg/kg de peso corporal.
[0088] Quando a isca é usada, de acordo com formas de realização exemplares, a isca é formulada, tal que: os ingredientes ativos consumidos não causam efeitos colaterais adversos, o consumo de iscas acontece na presença de outras fontes de alimento, a isca é ambientalmente neutra, isto é, os ingredientes ativos não persistem no ambiente e nenhum acúmulo de tecido ocorre, no qual pode levar à descrição secundária dos animais não alvos, os ingredientes ativos não devem colocar os seres humanos em risco e a produção da isca deve ser escalável pela produção. A isca pode ser sólida, semissólida ou líquida.
[0089] As composições de acordo com a presente invenção podem incluir os ingredientes descritos nestes bem como os materiais inertes adicionais e/ou alternativos, preservantes e outros constituintes tipicamente observados nas composições similares. No caso onde os materiais inertes exemplares e/ou preservantes são listados, estes ingredientes são meramente exemplares e é entendido que outros ingredientes similares podem ser substituídos pelos materiais listados nos exemplos abaixo. EXEMPLOS
[0090] Descrevendo, em geral, esta invenção, um entendimento adicional pode ser obtido por referência a certos exemplos específicos que são fornecidos aqui para os propósitos de ilustração apenas e não são pretendidos serem limitantes a não ser que especificado de outra maneira. In Vitro Exemplo comparativo 1
[0091] As Figuras 1 e 2 ilustram imagens de ovários de filhote de rato com 4 dias de idade. Os ovários de controle ilustram folículos secundários primordiais/primários e em desenvolvimento. Exemplo comparativo 2
[0092] A Figura 3 ilustra um sistema de cultura in vitro para avaliar a eficácia de composições de esgotamento de folículo (desenvolvido por Patrick J. Devine). Como apresentados em vários exemplos neste, os ovários são cultivados com VCD com ou sem triptolídeo em meios isentos de soro para 8 dias, nenhuma gonadotropina presente, nenhuma mudança de meios e ingredientes ativos adicionados logo no início da cultura. Os ovários são coletados e processados para histologia para realizar a contagem de folículo.
[0093] A Figura 4 ilustra um ovário tratado com 30 μm VCD. Como ilustrado, o ovário apresentou uma redução de 38% em folículos primordiais. Os outros estágios de folículos não foram significantemente afetados pelo tratamento. Exemplo 3
[0094] A Figura 5 ilustra um ovário cultivado tratado com 30 μm de VCD e 5 nm de triptolídeo usando-se o sistema e o método do Exemplo comparativo 2. O ovário não tem folículos saudáveis aparentes e apresenta atresia e picnose extensivas. Como ilustrado, a aplicação in vitro da composição ao ovário causou 100% de esgotamento de todos os estágios de folículos. Exemplo 4
[0095] A Figura 6 ilustra um ovário cultivado tratado com 30 μm de VCD e 10 nm de triptolídeo. Como ilustrado, a aplicação in vitro da composição ao ovário causou 100% de esgotamento de todos os estágios de folículos. In Vivo Exemplo 5
[0096] Os estudos in vivo foram realizados usando-se um ensaio de alimentação de 15 dias de ratos Sprague-Dawley fêmeas jovens. A concentração de VCD foi mantida constante a 75 mM a concentração de triptolídeo foi variada como observado abaixo. O projeto do experimento foi como segue: Controle sem ingredientes ativos (n = 6) VCD + triptolídeo 25 μg/kg de peso corporal (n = 7) VCD + triptolídeo 50 μg/kg de peso corporal (n = 7) VCD + triptolídeo 100 μg/kg de peso corporal (n = 7)
[0097] O experimento foi projetado para estimar: palatabilidade e quantidade de isca consumida, a saúde dos ratos (peso corporal registrado diariamente) e os ovários coletados para a análise folicular. Os ratos tiveram acesso a ração padrão junto com o controle ou isca de tratamento por 15 dias consecutivos. A Figura 7 ilustra o consumo diário/ peso corporal médios para cada grupo e a Figura 8 ilustra as tendências de peso corporal para cada grupo.
[0098] A Figura 9 ilustra as contagens de folículo primordiais, contagens de folículo secundárias, contagens de folículos antrais e contagens de corpus lutea para cada um dos grupos. Em comparação com os grupos de controle, o grupo tratado com triptolídeo 50 μg/kg de peso corporal apresentou 50% de esgotamento nas contagens de folículo primordiais, 64% de esgotamento em contagens de folículo secundárias, 80% de esgotamento em contagens de folículo antral e 100% de esgotamento em contagens de corpora lutea. A Figura 10 ilustra imagens de ovários de cada grupo e Figura 11 ilustra os pesos dos ovários para cada grupo. Eficácia in vivo
[0099] Uma composição de isca contendo dois ingredientes ativos, diepóxido de 4-vinilcicloexeno em 0,099% em peso e triptolídeo em 0,0012% foi fornecido a ratos fêmeas Sprague Dawley imaturos por 15 noites sucessivas na presença de água ilimitada e ração de rato de laboratório e estes consumiram > 10% do seu peso corporal/noite. O dia seguinte após o final da dosagem, os ratos fêmeas foram criados por 21 dias com reprodutores machos adultos mostrados não tratados. Os ratos de controle que consumiram uma emulsão sem ingredientes ativos deram a luz a ninhadas médias de 12,2 filhotes de ratos após uma média de 39,7 dias de início da dosagem. Os ratos que consumiram a composição de isca inventiva tiveram um tamanho de ninhada médio de 4,3 filhotes após uma média de 55,9 dias do início da dosagem. Entretanto, 2 dos 8 ratos que beberam a composição inventiva nunca deram a luz a ninhada e outros 2 ratos deram a luz a uma ninhada de 1 filhote.
[00100] Adicionalmente, no grupo alimentado, a isca inventiva, o rato que consumiu a menor quantidade de todos os 8 ratos, 8 mg/kg de peso corporal versus 16 mg/kg de peso corporal com relação aos outros 7 ratos, deram a luz a uma ninhada de 15 filhotes indicando claramente uma relação de resposta de dose inversa entre a composição consumida e o número de fílhotes/ninhada. Estes resultados são consistentes com os dados apresentados acima que foram contagens de folículo reduzidas após o consumo da isca inventivas. Em que os dados apresentados aqui foram um efeito mais pronunciado de isca no desenvolvimento de folículos crescentes e corpora lutea sugerindo que houveram poucas ovulações. Portanto, o consumo da composição da presente invenção por ratos fêmeas reduziu as ovulações ovarianas ao ponto que houveram 65% menos filhotes produzidos e as ovulações atrasadas estenderam significantemente o tempo para o parto. A combinação destes dois efeitos em ratos que tiveram vidas curtas, menor do que 1 ano em estado selvagem, exerce um efeito pronunciado no número total em filhotes de rato nascidos por rato fêmea e, ultimamente o tamanho de população total. Exemplo 6: Aplicação In Vivo de uma Composição de Isca
[00101] As composições de isca com uma concentração constante de VCD e concentrações de triptolídeo crescentes foram preparadas.
[00102] Ratos fêmea imaturos consumiram isca com VCD constante (0,099% de concentração) combinado com concentrações de triptolídeo crescentes, baixa 3,99 μg/ml, média 7,96 μg/ml e alta 11,92 μg/ml por 15 dias. A Figura 12A é a quantidade de triptolídeo consumida por dia de grupos de dose baixa, média e alta média ± SEM. A Figura 12B é a quantidade de VCD consumida por dia de grupos de dose de triptolídeo baixa, média e alta média ± SEM.
[00103] Ratos fêmeas imaturos tiveram água e ração ilimitadas durante todo o período de tratamento. O dia 0 representa a primeira noite tendo isca com os ingredientes ativos triptolídeo e VCD apresentadas período de tempo sem luz. Na manhã seguinte, a quantidade de isca consumida foi medida e os ratos foram estimados quanto à saúde geral e pesados. Estes resultados são mostrados na Figura 13. Os dados apresentados na Figura 13 mostram que durante o período de tempo que os ratos foram alimentados com a isca estes continuaram a desenvolver em taxas similares. Além disso, a condição geral dos ratos foi boa e estes comeram a isca em uma quantidade constante durante todos os 15 dias, em torno de 8% a 10% do seu peso corporal.
[00104] Os ratos fêmeas imaturos comeram a isca com a concentração alta de triptolídeo e VCD em 0,099% por 15 dias. No dia após a última isca, os ratos fêmeas cruzadas com ratos reprodutores machos testados não tratados. O número de filhotes por ninhada foi contado no dia 4 pós-natal. Estes resultados são mostrados em Figura 14. Os dados apresentados na Figura 14 mostram que os efeitos nos filhotes nascidos por ninhada foram dependente da dose de triptolídeo. Houve uma correlação inversa entre a quantidade de dose de triptolídeo e o número de filhotes nascidos por ninhada.
[00105] Os ratos fêmeas imaturos comeram a isca de controle, sem ingredientes ativos e as fêmeas tratadas comeram a isca com VCD em 0,099% e dose alta de triptolídeo por 15 dias. No dia após o fim do uso de iscas, os ratos fêmeas tratados foram cruzados com ratos reprodutores machos testados. Os dias para o parto foram contados a partir do dia 0 do cruzamento até o parto. Os dados são apresentados na Figura 15, onde os símbolos são médias para cada grupo ± SEM. Exemplo 7: Ensaio In Vitro
[00106] Bioensaio in vitro de esgotamento de folículo, ovários cultivados por 8 dias com produtos químicos diferentes
[00107] Controle - sem produtos químicos, Triptolídeo - 5 nM (Trip), Diepóxidos, RDE, CHDE, Quetol, ERL 4221, BDE, GDE, cada um em 30 μM + Trip 5 nM
[00108] Os ovários foram preparados a partir da análise histológica para a determinação de esgotamento de folículo
[00109] O produto químico comparado (reatividade em ensaio de epóxido) com a atividade biológica (esgotamento de folículo)
Figure img0004
Classificação, 1 - reatividade química/atividade biológica menor, 6 - reatividade química/atividade biológica maior Conclusões: 1. Em um experimento prévio nenhum destes diepóxidos testados em 30 μM causou esgotamento de folículo significante. 2. Neste experimento, o Triptolídeo (Trip) em 5 nM não causou o esgotamento de folículo significante. 3. Apenas quando Triptolídeo e GDE, BDE, CHDE, Quetol e ERL 4221 quando combinados houve esgotamento de folículo significante. A combinação de Triptolídeo + RDE não causou o esgotamento de folículo significante. 4. ERL 4221 é a melhor ilustração da relação entre a atividade química e biológica. ERL 4221 foi menos quimicamente reativo enquanto está sendo mais biologicamente ativo quando combinado com Trip. 5. A combinação de Trip e estes diepóxidos GDE, BDE, CHDE, Quetol, ERL 4221 causou o esgotamento de folículo significante aparentemente por intermédio das interações sinergísticas.
[00110] A presente invenção foi descrita acima com referência a várias formas de realização exemplares e exemplos. Deve ser estimado que as formas de realização particulares mostradas e descritas aqui são ilustrativas das formas de realização principal da invenção e é o melhor modo e não são pretendidas limitar o escopo da invenção como apresentado na reivindicação. Será reconhecido que mudanças e modificações podem ser feitas nas formas de realização descritas aqui sem divergir do escopo da presente invenção. Estas e outras mudanças ou modificações são pretendidas estarem incluídas dentro do escopo da presente invenção, como expressado nas seguintes reivindicações e os seus equivalentes legais.
[00111] Obviamente, modificações e variações numerosas da presente invenção são possíveis na luz das explicações acima. Portanto, deve ser entendido que dentro do escopo das reivindicações anexas, a invenção pode ser praticada de outra maneira que não as especificamente descritas neste.

Claims (9)

1. Composição adequada para reduzir a capacidade reprodutiva de ratos machos e fêmeas, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) triptolídeo ou um sal do mesmo, e (b) um diepóxido orgânico escolhido do grupo que consiste de diepóxido de 4-vinilcicloexeno (VCD), glicerol diglicidil éter (GDE), 1,4- butanediol diglicidil éter (BDE), 1,4-cicloexanodimetanol diglicidil éter (CHDE), carboxilato de 3,4-epóxi-cicloexil-metil-3,4-epoxicicloexila (ERL 4221), e diglicidil éter de etileno glicol (Quetol).
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o diepóxido orgânico (b) é diepóxido de 4-vinilcicloexeno (VCD).
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o epóxido de diterpenóide (a) é triptolídeo e o diepóxido orgânico (b) é diepóxido de 4-vinilcicloexeno (VCD).
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a concentração de epóxido de diterpenóide (a) na composição é cerca de 1 nM a cerca de 10 nM e a concentração do diepóxido orgânico (b) na composição é cerca de 1 mM a cerca de 750 mM.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão molar de epóxido de diterpenóide (a) para o diepóxido orgânico (b) é de 1/5 a 1/75,000.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão molar de epóxido de diterpenóide (a) para o diepóxido orgânico (b) é de 1/2 a 1/50,000.
7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão molar de epóxido de diterpenóide (a) para o diepóxido orgânico (b) é de 1/5 a 1/500.
8. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para manufatura de um medicamento para reduzir a capacidade reprodutiva de uma população de ratos compreendendo ratos machos e fêmeas, compreendendo alimentar a população de ratos com uma quantidade eficaz da composição, em que a composição é consumida pelos ratos machos e fêmeas, e a composição reduz a capacidade reprodutiva dos ratos machos e fêmeas.
9. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para manufatura de um medicamento para reduzir a capacidade reprodutiva de um rato macho, em que a composição é administrada em uma quantidade eficaz a um rato macho.
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