BR112015001157B1 - Método in vitro para a determinação da receptividade uterina, método in vitro para aumentar a taxa de sucesso de um procedimento de tecnologia de reprodução assistida, método in vitro para avaliação de um indivíduo do sexo feminino e kit - Google Patents

Abstract

método para aumentar o sucesso da implantação em fertilização assistida. a presente invenção refere-se a um método para determinar um perfil de receptividade uterina, a fim de aumentar o sucesso da implantação na fertilização assistida.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um método para a determinação do perfil de receptividade uterina durante a janela de implantação uterina em um indivíduo do sexo feminino, determinando-se, assim, um tratamento personalizado para o dito indivíduo para aumentar o sucesso da implantação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A fertilização assistida, tal como fertilização in vitro (IVF), foi usada em seres humanos com problemas de infertilidade com sucesso por três décadas. Apesar da extensa pesquisa, ainda é um procedimento difícil e caro. Com efeito, menos de 5% dos oócitos coletados e apenas 20-25% dos embriões transferidos conduzem a um nascimento. A otimização de competência do embrião, bem como a receptividade uterina correspondente é uma exigência absoluta para melhorar o sucesso na tecnologia de reprodução assistida (ART). O sucesso da implantação envolve uma relação cruzada sincronizada entre um endométrio receptivo e um blastocisto funcional. Esse fenômeno só pode ocorrer durante a janela de implantação, um período autolimitado de receptividade endometrial ocorrendo entre os dias 19 e 23 do ciclo menstrual (mulheres). Em ciclos menstruais normais, isto é conseguido através dos efeitos locais de estrogênios e progesterona do ovário, os quais induzem uma série de eventos celulares e moleculares no endométrio levando a receptividade endometrial apropriada.

[0003] Os métodos para determinação da receptividade endometrial foram divulgados na técnica: por exemplo, US 7.175.990 divulgou um método com base na determinação do nível de L-selectina produzida pelas células epiteliais uterinas, em que um aumento no nível de L-selectina em comparação com um nível de controle indica um aumento da probabilidade de sucesso da implantação. Outro método para determinar a receptividade endometrial divulgado em EP 2348318 baseia-se na determinação do nível da prostaglandina E2 ou F2 alfa no fluido do endométrio. Outra abordagem emergente como a matriz Receptiva Endometrial (sistema ERA) explorou 238 genes especificamente expressos durante a janela de implantação (PCT/ES2009/000.386). Estes métodos são apenas úteis para determinar a receptividade endometrial à implantação do embrião.

[0004] No entanto, no caso da determinação da receptividade inadequada do endométrio, estes métodos são inúteis para a restauração de uma receptividade endometrial.

[0005] Os inventores fizeram a observação de que a receptividade inadequada do endométrio pode ser explicada por dois estados diferentes: um estado subativado, ou um estado superativado. A determinação de um estado endometrial permite, assim, explicar a sua não receptividade, levando assim a um tratamento adaptado e personalizado para restaurar um estado de receptividade.

[0006] Em consequência, é de interesse fornecer um método que permite a determinação de um estado endometrial de um indivíduo do sexo feminino, sendo esta informação útil para otimizar o seu tratamento para restaurar uma receptividade endometrial. SUMÁRIO

[0007] Um objetivo da invenção é um método para a determinação em um indivíduo do sexo feminino do perfil de receptividade uterina durante a janela de implantação uterina, que compreende:

[0008] determinar em uma amostra endometrial o estado endometrial através da medição de: a) biomarcadores do estado de atividade de células NK uterinas (uNK), e b) biomarcadores do estado de recrutamento e maturação das células NK uterinas,

[0009] comparar os ditos valores com os valores de referência,

[0010] determinar, assim, um estado endometrial que é indicativo de uma receptividade uterina apropriada ou inapropriada.

[0011] Em uma modalidade, o estado de atividade de células uNK é determinado através da medição de pelo menos um dentre a expressão de IL-18, IL-6, e IL-12.

[0012] Em uma outra modalidade, o estado de atividade de células uNK é determinado através da medição da expressão de IL-18 e Tweak e do cálculo de uma razão de IL-18/Tweak.

[0013] Em uma outra modalidade, o recrutamento de células uNK é determinado através da quantificação do número de células uNK CD56+ ou através da medição da expressão de CD56.

[0014] Em uma outra modalidade, o estado de maturação de células uNK é determinado através da medição da expressão de IL-15.

[0015] Em uma outra modalidade, o estado de maturação de células uNK é determinado através da medição da expressão de IL-15 e Fn14 e do cálculo de uma razão de IL-15/Fn14.

[0016] Em uma outra modalidade, os valores de referência são obtidos a partir de um indivíduo fértil do sexo feminino.

[0017] Outro objetivo da invenção é um perfil de receptividade uterina com base na quantificação de biomarcadores específicos de a) o estado de atividade de células uNK, e b) o estado de recrutamento e a maturação de células uNK.

[0018] Em uma modalidade, o perfil de receptividade uterina baseia-se na expressão de a) pelo menos um dentre IL-18, IL-6 e IL-12, e b) CD56 e IL-15.

[0019] Em uma outra modalidade, o perfil de receptividade uterina é obtido pelo processo tal como descrito aqui acima.

[0020] Outro objetivo da invenção é um método para aumentar a taxa de sucesso de um procedimento de tecnologia de reprodução assistida (ART), em um indivíduo do sexo feminino, que compreende:

[0021] determinar o perfil de receptividade uterina do dito indivíduo durante a janela de implantação uterina, como descrito aqui acima, e

[0022] determinar uma recomendação personalizada para o dito indivíduo, dependendo do perfil de receptividade uterina observado.

[0023] Outro objetivo da invenção é um método para avaliação de um indivíduo do sexo feminino para um procedimento de tecnologia de reprodução assistida (ART), que compreende:

[0024] obter itens de informação do indivíduo do sexo feminino para fornecer um perfil para o dito indivíduo do sexo feminino, em que cada item de informação está relacionado com as variáveis pré-selecionadas do indivíduo, em que uma das ditas variáveis é o perfil de receptividade uterina tal como descrito aqui acima,

[0025] comparar o dito perfil para o dito indivíduo do sexo feminino com uma biblioteca de padrões de perfil conhecidos que se sabe serem indicativos da responsividade a um procedimento de tecnologia de reprodução assistida usando um algoritmo com base nas ditas variáveis do indivíduo pré-selecionadas,

[0026] em que a dita comparação fornece uma avaliação do dito indivíduo do sexo feminino para um procedimento de ART.

[0027] Em uma modalidade, as ditas variáveis do indivíduo pré-selecionadas compreendem datação histológica (determinação da janela de receptividade); características do endométrio (como a espessura endometrial, o volume endometrial, vascularização endometrial, dopplers da artéria uterina); idade; etiologia da infertilidade; dados de infertilidade, tais como resumo da história anterior e número e qualidade dos embriões transferidos; avaliação hormonal da reserva ovariana (AMH, FSH, contagem de folículos antrais); tipo de ART (IVF, ICSI, IMSI, inseminação).

[0028] Um outro objetivo da invenção é um sistema para análise de dados na avaliação de um indivíduo do sexo feminino para um procedimento de tecnologia de reprodução assistida, que compreende:

[0029] um ambiente de computação,

[0030] um dispositivo de entrada, conectado a um ambiente de computação, para receber dados de um usuário, em que os dados recebidos compreendem itens de informação a partir de um indivíduo do sexo feminino para fornecer um perfil para o dito indivíduo do sexo feminino, em que cada item de informação está relacionado com as variáveis pré-selecionadas do indivíduo, em que uma das ditas variáveis é o perfil de receptividade uterina, tal como definido aqui acima,

[0031] um dispositivo de saída, conectado ao ambiente de computação, para fornecer informações para o usuário, e

[0032] um meio de armazenamento legível por computador tendo armazenado no mesmo pelo menos um algoritmo para fornecer comparação do perfil para o indivíduo do sexo feminino com uma biblioteca de padrões de perfil conhecidos que se sabe serem indicativos da responsividade a um procedimento de tecnologia de reprodução assistida, em que o sistema fornece resultados que podem ser utilizados para a geração de um relatório fornecendo uma análise de dados na avaliação de um indivíduo do sexo feminino para um procedimento de tecnologia de reprodução assistida.

[0033] Em uma modalidade, as ditas variáveis do indivíduo pré-selecionadas compreende datação histológica (determinação da janela de receptividade); características do endométrio (como a espessura endometrial, o volume endometrial, vascularização endometrial, dopplers da artéria uterina); idade; etiologia da infertilidade; dados de infertilidade, tais como resumo da história anterior e o número e qualidade dos embriões transferidos; avaliação hormonal da reserva ovariana (AMH, FSH, contagem de folículos antrais); tipo de ART (IVF, ICSI, IMSI, inseminação).

[0034] Outro objetivo da invenção é um kit para implementar o método, tal como definido aqui acima, que compreende:

[0035] reagentes para a medição da expressão de pelo menos uma dentre a expressão de IL-18, IL-6, IL-12, e IL-15 e CD56,

[0036] opcionalmente, reagentes para medir a expressão de Tweak e Fn-14,

[0037] opcionalmente, reagentes para medir a expressão de GCSF-R,

[0038] opcionalmente, reagentes para medir a expressão de genes de referência, e

[0039] Instruções para a realização do método, tal como definido aqui acima. DEFINIÇÕES

[0040] Na presente invenção, os seguintes termos têm os seguintes significados:

[0041] O termo "reprodução assistida" refere-se a técnicas clínicas e laboratoriais usadas para melhorar a fertilidade em humanos ou animais, incluindo, mas não se limitando a, fertilização in vitro (IVF), transferência de embriões congelados (FET), injeção intracitoplasmática de espermas (ICSI), injeção intracitoplasmática de esperma morfologicamente selecionado (IMSI), transferência intrafalopiana de gametas (GIFT), inseminação intrauterina (IUI) e transferência intrafalopiana de zigoto (ZIFT).

[0042] O termo "falha de implantação" refere-se à falha de alguns embriões produzidos por reprodução assistida ou através de inseminação artificial para implante ou para implante normalmente no útero de um indivíduo receptor. Exemplos de casos de falha de implantação do embrião, incluem, mas não se limitam a, falha de implantação após 8 transferências de embriões, falha de implantação após 4 transferências de embriões, falha de implantação após 2 transferências de embriões em J5, ou a falha de implantação após a transferência de 2 embriões após doação de oócito exógeno. Em uma modalidade, o mínimo de embriões transferidos com subsequentes a uma falha de implantação para definir uma falha de implantação é, pelo menos, quatro embriões no Dia-2 ou -3, com uma morfologia ótima, seis embriões no Dia-2 ou 3 com uma morfologia do meio ou 2 embriões no Dia-5.

[0043] O termo "insuficiência ovariana" refere-se à perda da função dos ovários em mulheres com menos de 40 anos. Os indivíduos afetados por este transtorno apresentam também rejeição fisiológica do embrião. Estes distúrbios incluem, mas não se limitam a: a falha prematura do ovário, hipogonadismo hipergonadotrópico, de disgenesia gonadal, menopausa prematura, ou menopausa precoce.

[0044] O termo "janela de implantação uterina" refere-se a um período muito curto que se inicia cerca de 4 a 5 dias após a ovulação e com duração de cerca de 4 dias. Esta janela definida como a janela de implantação define o período no ciclo menstrual da receptividade uterina para o embrião. Durante a fase lútea leve, eventos de remodelação do útero necessários para uma gravidez de sucesso começam antes da implantação com a decidualização do endométrio, que ocorre mesmo na ausência de um concepto fertilizado em humano.

[0045] O termo "indivíduo" refere-se a um mamífero, de preferência, um mamífero do sexo feminino, com mais preferência, um ser humano do sexo feminino. Em uma modalidade, indivíduo refere-se a uma fêmea que foi submetida a falhas de implantação. Em outra modalidade, indivíduo refere-se a uma fêmea que é afetada por insuficiência ovariana.

[0046] O termo "valor de referência", como usado no presente documento, abrange amplamente qualquer valor adequado que pode ser usado como uma base para comparação com respeito à variável medida. De preferência, o valor de referência é obtido a partir de um indivíduo do sexo feminino fértil.

[0047] O termo "expressão" refere-se de modo intercambiável à expressão de um gene, incluindo os transcritos do gene, mRNA, produtos de tradução de polipeptídeo de tais transcritos de RNA se tal produto é ou não modificado pós- transcricionalmente, ou a expressão do produto do gene, incluindo o polipeptídeo ou proteína codificada. A expressão de um produto do gene pode ser determinada, por exemplo, por meio de imunoensaio usando um ou mais anticorpos que se ligam com o polipeptídeo. Alternativamente, a expressão de um gene pode ser determinada por medição de níveis de mRNA, por exemplo, por RT-PCR, qPCR.

[0048] O termo "nível normalizado" refere-se a um nível de expressão de um gene em relação a um nível de expressão de um gene de referência.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0049] Como mostrado nos Exemplos, ao usar apenas a determinação de um de (1) o estado de atividade de células NK uterinas ou do ambiente endometrial da citocina, (2) o estado de maturação de células NK uterinas ou (3) o estado de recrutamento de células NK uterinas, mais do que 40% das mulheres testadas são classificadas como apresentando um estado endometrial normal ou um perfil de receptividade uterina apropriado.

[0050] Na implementação do método da invenção, os inventores descobriram que, entre os 42% dos indivíduos classificados como apresentando um endométrio normal, como determinado usando apenas a determinação do estado de atividade de células NK uterinas ou ambiente endometrial da citocina, quase 25% não apresentam de fato um estado endometrial normal.

[0051] Além disso, entre os 43% dos indivíduos classificados como apresentando um endométrio normal, como determinado usando apenas a determinação do estado de maturação de células NK uterinas, quase 75%, de fato, não apresentam um estado normal do endométrio.

[0052] Além disso, entre os 47% dos indivíduos classificados como apresentando um endométrio normal, conforme determinado usando apenas a determinação do estado de recrutamento de células NK uterinas, 80% não apresentam, de fato, um estado endometrial normal.

[0053] Existe, portanto, uma necessidade de um método que permite uma determinação mais precisa do estado endometrial, permitindo, assim, que as mulheres que teriam sido consideradas como "normais" ara se beneficiassem de um tratamento personalizado e otimizado para a restauração de uma receptividade uterina e assim aumentar a sua possibilidade de ter uma gravidez ou parto evolutivo.

[0054] A presente invenção tem como objetivo determinar a receptividade do endométrio/útero através da determinação do estado endometrial, de forma a otimizar um tratamento para restaurar uma receptividade uterina.

[0055] Um objetivo da invenção é um método para a determinação em um indivíduo do sexo feminino de um perfil de receptividade uterina durante a janela de implantação uterina, que compreende:

[0056] determinar em uma amostra endometrial o estado endometrial através da medição de: a) biomarcadores do estado de atividade de células assassinas naturais uterinas (uNK) ou ambiente endometrial de citocina, e b) biomarcadores do estado de recrutamento e maturação das células NK uterinas,

[0057] comparar os ditos valores com os valores de referência,

[0058] determinar, assim, um estado endometrial que é indicativo de uma receptividade uterina apropriada ou inapropriada.

[0059] A discriminação do estado endometrial de um indivíduo em três estados específicos: (1) estado subativado, (2) estado normal e (3) estado superativado, permite a classificação do indivíduo em duas categorias: receptividade uterina apropriada (estado endometrial normal) e receptividade uterina inapropriada, sendo esta última dividida em duas subcategorias: ausência de receptividade (estado endometrial subativado) e receptividade anormal (estado endometrial superativado).

[0060] A discriminação dos indivíduos nestas três categorias permite, assim, o acompanhamento do seu tratamento, a fim de restaurar uma receptividade endometrial apropriada, aumentando assim a taxa de sucesso e otimizando o processo de ART.

[0061] Portanto, um objetivo da presente invenção é um método para a determinação em um indivíduo do sexo feminino de um perfil de receptividade uterina durante a janela de implantação uterina, que compreende:

[0062] determinar em uma amostra endometrial o estado endometrial através da medição de: a) biomarcadores do estado de atividade de células assassinas naturais uterinas (uNK) ou ambiente endometrial de citocina, b) biomarcadores do estado de recrutamento e maturação de células NK uterinas, e c) comparar os ditos valores com os valores de referência,

[0063] discriminar, assim, o estado endometrial de um indivíduo em três estados particulares: (1) estado subativado, (2) estado normal e (3) estado superativado, que permite a classificação do indivíduo em duas categorias: receptividade uterina apropriada (estado endometrial normal) e receptividade uterina inapropriada, sendo esta última dividida em duas subcategorias: ausência de receptividade (estado endometrial subativado) e receptividade anormal (estado endometrial superativado).

[0064] Em uma modalidade, a dita amostra endometrial é uma biópsia endometrial.

[0065] Como usado no presente documento, o estado de atividade de células uNK refere-se ao estado de atividade de células uNK externas nas células endometriais circundantes.

[0066] Como usado no presente documento, o estado de atividade do ambiente endometrial de citocina refere-se ao estado de atividade de células imunes nas células endometriais circundantes.

[0067] Em uma modalidade da invenção, o estado de atividade de células uNK ou o estado de atividade endometrial de ambiente de citocina é determinado através da medição do nível de expressão de pelo menos um dos seguintes biomarcadores IL-18, IL-6 e IL-12.

[0068] Em uma modalidade, o nível de expressão de IL-18, IL-6 ou IL-12 pode ser medido através da avaliação da quantidade de proteína ou de ácido nucleico correspondente ao gene que codifica IL-18, IL-6 ou IL-12 (tais como, por exemplo, a quantidade de RNA). Em uma modalidade, o dito nível pode ser normalizado para o nível de um produto de genes de referência, tais como por exemplo RPL-13A, beta-2 microglobulina ou proteína tatabox TBP. Em uma outra modalidade, o dito nível pode ser normalizado para o nível médio geométrico de pelo menos dois produtos de genes de referência. Em uma outra modalidade, os ditos genes de referência não são actina e GAPDH.

[0069] Como usado no presente documento, o termo "IL-6" refere-se à interleucina 6; o termo "IL-12" refere-se à interleucina 12 e o termo IL-18 refere-se à interleucina 18.

[0070] Os métodos para medição do nível de expressão de IL-6, IL-12 ou IL-18 em uma amostra são bem conhecidos do versado na técnica, e incluem, mas não se limitam a, bioensaios, tais como, por exemplo, ELISA, método Luminex (tal como, por exemplo, o método Luminex usando o kit de detecção de Biorad (Citocinas Humanas Bioplex pro), RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, PCR em tempo real, qPCR em tempo real, Chip de DNA, e semelhantes; e imunoensaios, tais como, por exemplo, Tecnologia FloCytomix (Biosource) ou Matriz de Grânulos Citométricos BD (Bioscience BD).

[0071] Em uma outra modalidade da invenção, o estado de atividade de células uNK ou o estado de atividade endometrial de ambiente de citocina é determinado por medição do nível de expressão dos biomarcadores de IL-18 e Tweak e do cálculo de uma razão de IL-18/Tweak.

[0072] Como usado no presente documento, o termo " Tweak " refere-se a uma proteína codificada pelo gene TNFSF12.

[0073] Os métodos para medição do nível de expressão do Tweak em uma amostra são bem conhecidos do versado na técnica, e incluem, mas não se limitam a, bioensaios, tais como, por exemplo, ELISA, RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, PCR em tempo real, qPCR em tempo real, chip de DNA, e semelhantes; e imunoensaios, tais como, por exemplo, Tecnologia de FloCytomix (Biosource) ou Matriz de Grânulos Citométricos BD (BD Bioscience).

[0074] Em uma modalidade da invenção, o recrutamento de células uNK é determinado através da quantificação do número de células uNK.

[0075] O número de células uNK pode ser quantificado através da determinação do número de células CD56+ do útero. A determinação do dito número pode ser realizada quer usando imuno-histoquímica de seções fixas de parafina ou congeladas com anticorpos anti-CD56 para identificar a coloração de células NK. Em uma modalidade, as células CD56+ são contadas em um campo de 40X. Em uma outra modalidade, as células CD56+ são contadas em quatro campos de 40X e, em seguida, o número médio é calculado.

[0076] Em uma outra modalidade da invenção, o recrutamento de células uNK é determinado através da medição do nível de expressão de CD56.

[0077] Em uma modalidade da invenção, a medição do nível de expressão de CD56 é opcional.

[0078] Os métodos para medição do nível de expressão de CD56 em uma amostra são bem conhecidos do versado na técnica, e incluem, mas não se limitam a, bioensaios, tais como, por exemplo, ELISA, RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, PCR em tempo real, qPCR em tempo real, chip de DNA, e semelhantes; e imunoensaios, tais como, por exemplo, Tecnologia de FloCytomix (Biosource) ou Matriz de Grânulos Citométricos BD (BD Bioscience).

[0079] Como usado no presente documento, o termo "células CD56+" refere-se a células que expressam CD56, também chamadas NCAM (molécula de adesão celular neural).

[0080] Em uma modalidade da invenção, o estado de maturação de células uNK é determinado através da medição do nível de expressão do seguinte biomarcador: IL-15.

[0081] Em uma modalidade, o nível de expressão de IL-15 pode ser medido avaliando a quantidade de proteína ou de ácido nucleico correspondente ao gene que codifica a IL-15 (tais como, por exemplo, a quantidade de RNA). Em uma modalidade, o dito nível pode ser normalizado para o nível de um produto de genes de referência, tais como por exemplo RPL-13A, beta-2 microglobulina ou proteína tatabox TBP. Em uma outra modalidade, o dito nível pode ser normalizado para o nível médio geométrico de pelo menos dois produtos de genes de referência. Em uma outra modalidade, os ditos genes de referência não são actina e GAPDH.

[0082] Como usado no presente documento, o termo "IL-15" refere-se à interleucina 15.

[0083] Os métodos para medição do nível de expressão de IL-15 em uma amostra são bem conhecidos do versado na técnica, e incluem, mas não se limitam a, bioensaios, tais como, por exemplo, ELISA, método Luminex (tal como, por exemplo, método Luminex usando o kit de detecção de Biorad (Citocinas Humanas Bioplex pro), RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, PCR em tempo real, qPCR em tempo real, chip de DNA, e semelhantes; e imunoensaios, tais como, por exemplo, Tecnologia de FloCytomix (Biosource) ou Matriz de Grânulos Citométricos BD (BD Bioscience).

[0084] Em uma outra modalidade da invenção, o estado de maturação de células uNK é determinado através da medição do nível de expressão dos seguintes biomarcadores: IL-15 e Fn-14 e do cálculo de uma razão de IL-15/Fn14.

[0085] Como usado no presente documento, o termo "Fn14" refere-se ao fator de crescimento de fibroblastos induzível -14, que é um receptor para Tweak.

[0086] Os métodos para medição do nível de expressão de Fn-14 em uma amostra são bem conhecidos do versado na técnica, e incluem, mas não se limitam a, bioensaios, tais como, por exemplo, ELISA, método Luminex, RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, PCR em tempo real, qPCR em tempo real, chip de DNA, e semelhantes; e imunoensaios, tais como, por exemplo, Tecnologia de FloCytomix (Biosource) ou Matriz de Grânulos Citométricos BD (BD Bioscience).

[0087] Em uma modalidade, um valor de referência pode ser relativo a um número ou valor derivado de estudos populacionais, incluindo, sem limitação, tais indivíduos com faixa etária semelhante, os indivíduos do mesmo grupo étnico ou grupo étnico similar ou indivíduos que estão com falha de implantação embrionária ou indivíduos que sofrem de insuficiência do ovário.

[0088] Um objetivo da invenção é um método para a determinação em um indivíduo do sexo feminino de um perfil de receptividade uterina durante a janela de implantação uterina, que compreende: determinar em uma amostra endometrial o estado endometrial por: a) medir os biomarcadores do estado de atividade de células assassinas naturais uterinas (uNK) ou o ambiente endometrial de citocina, e os biomarcadores do estado de recrutamento e maturação das células NK uterinas, b) classificar o estado endometrial com base na determinação da razão de IL-18/Tweak através da comparação do dito valor com o valor de referência, c) se o estado endometrial é classificado como normal na etapa b), classificar o estado endometrial com base na determinação da razão de IL-15/Fn14 e, opcionalmente, determinar CD56, através da comparação dos ditos valores com os valores de referência, determinar, assim, um estado endometrial que é indicativo de uma receptividade uterina apropriada ou inapropriada.

[0089] Como mostrado nos Exemplos, se a razão de IL15/Fn14 é considerada primeiro para classificar o estado endometrial, o diagnóstico é inapropriado em 14% dos casos.

[0090] Em uma modalidade da invenção, um valor de referência pode ser derivado da medição do nível dos seguintes biomarcadores: IL-18, IL-6, IL-12, IL-15, receptor de G-CSF ou o cálculo da Razão de IL 18/Tweak ou Razão de IL-15/Fn-14 ou a determinação do número de células uNK em pelo menos uma amostra de controle derivada a partir de um ou mais indivíduos substancialmente saudáveis. Como usado no presente documento, um "indivíduo substancialmente saudável" refere-se a um indivíduo que não tenha experimentado uma falha de implantação ou um indivíduo que é considerado como um indivíduo fértil ou um indivíduo tendo um estado normal do endométrio.

[0091] Em uma outra modalidade da invenção, um valor de referência pode ser derivado da medição do nível dos seguintes biomarcadores: IL-18, IL-6, IL-12, IL-15, receptor de G-CSF ou do cálculo da razão de IL 18/Tweak ou razão de IL-15/Fn-14 ou da determinação do número de células uNK em pelo menos uma amostra de controle derivada de um ou mais indivíduos tendo um estado endometrial subativado ou superativado.

[0092] Em uma modalidade da invenção, o método da invenção compreende as seguintes etapas: a) classificação do estado endometrial com base na determinação do valor do estado de atividade de células uNK ou do ambiente endometrial de citocina, b) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em a), classificar o estado endometrial com base na determinação do recrutamento de células uNK, c) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em b), classificar o estado endometrial com base na combinação dos valores obtidos para o estado de recrutamento de células uNK e de maturação de células uNK.

[0093] Um objetivo da invenção é um método para a determinação em um indivíduo do sexo feminino de um perfil de receptividade uterina durante a janela de implantação uterina, que compreende:

[0094] determinar em uma amostra endometrial, o estado endometrial por: a) medição de biomarcadores do estado de atividade de células assassinas naturais uterinas (uNK) ou do ambiente endometrial de citocina, b) classificar o estado endometrial como subativado ou superativado comparando ditos valores com os valores de referência, c) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em b), medir os biomarcadores do estado de recrutamento e/ou maturação das células NK uterinas, d) classificar o estado endometrial com base na determinação do recrutamento e/ou maturação de células uNK comparando ditos valores com os valores de referência.

[0095] Em uma outra modalidade da invenção, o método da invenção compreende as seguintes etapas: a) classificação do estado endometrial com base na determinação da razão de IL-18/Tweak, b) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em a), classificar o estado endometrial com base na determinação do número de células uNK CD56+ ou no nível de expressão de CD56, c) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em b), classificar o estado endometrial com base na combinação dos valores obtidos para o número de células uNK CD56+ ou com o nível de expressão de CD56 e valor da razão de IL-15/Fn-14.

[0096] Em uma outra modalidade da invenção, o método da invenção compreende as seguintes etapas: a) medir o valor da razão de IL-18/Tweak como biomarcador do estado de atividade das células assassinas naturais do útero (uNK) ou o ambiente endometrial de citocina, b) classificar o estado endometrial como subativado ou superativado comparando o dito valor com um valor de referência, c) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em b), medir o valor da razão de IL-15/Fn-14 como biomarcador do estado de recrutamento e/ou maturação das células NK uterinas, d) classificar o estado endometrial como subativado ou superativado por comparação do dito valor com um valor de referência.

[0097] Em uma outra modalidade da invenção, o método da invenção compreende as seguintes etapas: a) classificar o estado endometrial com base na determinação de um valor do estado de maturação de células uNK, b) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em a), classificar o estado endometrial com base na determinação do recrutamento de células uNK, c) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em b), classificar o estado endometrial com base na determinação do valor do estado de atividade das células uNK ou do ambiente endometrial de citocina.

[0098] Em uma outra modalidade da invenção, o método da invenção compreende as seguintes etapas: a) classificar o estado endometrial com base na determinação do valor da razão de IL-15/Fn-14, b) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em a), classificar o estado endometrial com base na determinação do número de células uNK CD56+ ou no nível de expressão de CD56, c) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em b), classificar o estado endometrial com base na determinação da razão de IL-18/Tweak.

[0099] Em uma outra modalidade da invenção, o método da invenção compreende as seguintes etapas: a) classificar o estado endometrial com base na determinação de um valor do estado de maturação de células uNK, b) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em a), classificar o estado endometrial com base na determinação do valor do estado de atividade das células uNK ou do ambiente endometrial de citocina, c) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em b), classificar o estado endometrial com base na determinação do recrutamento de células uNK.

[00100] Em uma outra modalidade da invenção, o método da invenção compreende as seguintes etapas: a) classificar o estado endometrial com base na determinação do valor da razão de IL-15/Fn-14, b) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em a), classificar o estado endometrial com base na determinação do valor da razão de IL-18/Tweak, c) se o estado endometrial não pode ser classificado como subativado ou superativado em b), classificar o estado endometrial com base na determinação do número de células uNK CD56+ ou do nível de expressão de CD56.

[00101] Em uma outra modalidade da invenção, o nível de expressão de receptor de G-CSF no endométrio pode também ser determinado.

[00102] Como usado no presente documento, o termo "receptor de G-CSF" refere- se ao receptor do fator de estimulação de colônias de granulócitos.

[00103] Os métodos para medição do nível do receptor de G-CSF em uma amostra são bem conhecidos do versado na técnica, e incluem, mas não se limitam a, bioensaios, tais como, por exemplo, ELISA, métodos de Luminex, RT-PCR, RT- qPCR, PCR, qPCR, PCR em tempo real, qPCR em tempo real, chip de DNA, e semelhantes; e imunoensaios, tais como, por exemplo, Tecnologia de FloCytomix (Biosource) ou Matriz de Grânulos Citométricos BD (BD Bioscience).

[00104] A determinação do nível de receptores de G-CSF leva à classificação do indivíduo em dois grupos: responsivos a corticoide e não responsivos a corticoide.

[00105] Em uma modalidade da invenção, os métodos como aqui descritos acima podem compreender ainda uma etapa em que o indivíduo é classificado entre o responsivo a corticoide e não responsivo a corticoide com base na expressão do receptor de G-CSF. De preferência, o indivíduo é classificado em um desses dois grupos, ao apresentar um endométrio superativado.

[00106] Em uma modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocinas ou de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL- 18/Tweak, inferior a 0,5 vezes um valor de referência do estado de atividade endometrial de citocinas ou uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-18/Tweak, é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00107] Em outra modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocinas ou de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL- 18/Tweak, inferior a 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1 vez um valor de referência do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-18/Tweak, é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00108] Em ditas modalidades, os valores de referência são obtidos a partir de um indivíduo substancialmente saudável.

[00109] Em uma modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor da razão de IL-18/Tweak, superior a 1,8 vezes um valor de referência do estado de atividade de uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-18/Tweak, é indicativo de um estado endometrial superativado.

[00110] Em uma outra modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor da razão de IL-18/Tweak, superior a 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4.7, 4,8, 4,9, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 vezes um valor de referência do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-18/Tweak, é indicativo de um estado endometrial superativado.

[00111] Em modalidades, os valores de referência são obtidos a partir de um indivíduo substancialmente saudável.

[00112] Em uma modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor da razão de IL-18/Tweak, compreendido de 0,5 vezes a 1,8 vez um valor de referência do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-18/Tweak, e um número de células uNK CD56+ inferior a 10 por campo é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00113] Na dita modalidade, os valores de referência são obtidos a partir de um indivíduo substancialmente saudável.

[00114] Em uma modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor da razão de IL-18/Tweak, compreendido entre 0,5 vez e 1,8 vez um valor de referência do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-18/Tweak, e um número de células uNK CD56+ compreendido entre 10 e 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, inferior a 0,3 vez o valor de referência do estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL- 15/Fn-14, é indicativo de um estado endometrial subativado. Em uma outra modalidade da invenção, um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, inferior a 0,25, 0,2, 0,15, 0,1 vez um valor de referência do estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-15/Fn-14, é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00115] Nas ditas modalidades, os valores de referência são obtidos a partir de um indivíduo substancialmente saudável.

[00116] Em uma modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor da razão de IL-18/Tweak, compreendido entre 0,5 vez e 1,8 vez um valor de referência do estado de atividade de uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-18/Tweak, e um número de células uNK CD56+ compreendido entre 10 a 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL- 15/Fn-14, superior a 2 vezes um valor de referência do estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-15/Fn-14, é indicativo de um estado superativado pela hiper-ativação de células uNK.

[00117] Em uma outra modalidade da invenção, um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, superior a 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8.5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 vezes um valor de referência do estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-15/Fn-14 , é indicativo de um estado endometrial superativado.

[00118] Nas ditas modalidades, os valores de referência são obtidos a partir de um indivíduo substancialmente saudável.

[00119] Em uma modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor da razão de IL-18/Tweak, compreendido entre 0,5 vez e 1,8 vez um valor de referência do estado de atividade endometrial de citocina ou uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-18/Tweak, e um número de células uNK CD56+ superior a 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, superior a 2 vezes um valor de referência do estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-15/Fn-14, é indicativo de um estado superativado pela hiper-ativação de células uNK.

[00120] Em uma outra modalidade da invenção, um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, superior a 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8.5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 vezes um valor de referência do estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor de referência da razão de IL-15/Fn-14 , é indicativo de um estado endometrial superativado.

[00121] Nas ditas modalidades, os valores de referência são obtidos a partir de um indivíduo substancialmente saudável.

[00122] Em uma modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocinas ou de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL- 18/Tweak, inferior a 0,03 é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00123] Em uma outra modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocinas ou de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL- 18/Tweak, inferior a 0,025, 0,02, 0,015, 0,01, 0,005 é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00124] Em uma modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocinas ou de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL- 18/Tweak, superior a 0,11 é indicativo de um estado endometrial superativado.

[00125] Em uma outra modalidade da invenção, um valor do estado de atividade endometrial de citocinas ou de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL- 18/Tweak, superior a 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5 é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00126] Em uma modalidade da invenção, um valor de recrutamento de células uNK, de preferência, um número de células uNK CD56+, inferior a 10 por campo é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00127] Em uma outra modalidade da invenção, um valor de recrutamento de células uNK, de preferência, um número de células uNK CD56+, inferior a 9, 8, 7, 6, 5, 3, 2, 1 por campo é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00128] Em uma modalidade da invenção, um valor de recrutamento de células uNK, de preferência um número de células uNK CD56+, compreendido entre 10 e 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, inferior a 0,3 é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00129] Em uma outra modalidade da invenção, um valor de recrutamento de células uNK, de preferência, um número de células uNK CD56+, compreendido entre 10 e 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, inferior a 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 é indicativo de um estado endometrial subativado.

[00130] Em uma modalidade da invenção, um valor de recrutamento de células uNK, de preferência, um número de células uNK CD56+, compreendido entre 10 e 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, superior a 2 é indicativo de um estado superativado do endométrio.

[00131] Em uma outra modalidade da invenção, um valor de recrutamento de células uNK, de preferência, um número de células uNK CD56+, compreendido de 10 a 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, superior a 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 é indicativo de um estado endometrial superativado.

[00132] Em uma modalidade da invenção, um valor de recrutamento de células uNK, de preferência, um número de células uNK CD56+, superior a 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, superior a 2 é indicativo de um estado endometrial superativado.

[00133] Em uma outra modalidade da invenção, um valor de recrutamento de células uNK, de preferência, um número de células uNK CD56+, superior a 70 por campo e um valor de estado de maturação de células uNK, de preferência, um valor da razão de IL-15/Fn-14, superior a 2, 5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 é indicativo de um estado endometrial superativado.

[00134] Em uma modalidade, um valor receptor de G-CSF superior a 0,7 é indicativo de um indivíduo não responsivo a corticoides.

[00135] Em uma outra modalidade, um valor receptor de G-CSF inferior ou igual a 0,7 é indicativo de um indivíduo responsivo a corticoides.

[00136] Em uma outra modalidade, um valor receptor de G-CSF não é indicativo de um indivíduo responsivo a corticoides.

[00137] Um outro objetivo da invenção é um perfil de receptividade uterina, em que o dito perfil é baseado em a) o estado de atividade de células NK uterinas (uNK) ou ambiente endometrial de citocinas, e b) o estado de recrutamento e maturação de células NK uterinas, em uma amostra endometrial obtida durante a janela de implantação uterina.

[00138] Em uma modalidade, o dito perfil de receptividade uterina é baseado no nível de expressão de pelo menos um de IL-18, IL-6 ou IL-12, de preferência, IL-18, e o nível de expressão de IL-15 e CD56.

[00139] Em uma outra modalidade, o dito perfil de receptividade uterina é baseado no nível de expressão de pelo menos um de IL-18, IL-6 ou IL-12, de preferência, IL-18, e o nível de expressão de IL-15 e o número de células uNK CD56+.

[00140] Em uma outra modalidade, o dito perfil de receptividade uterina é baseado no valor da razão de IL-18/Tweak e IL-15/Fn14 e o nível de expressão de CD56.

[00141] Em uma outra modalidade, o dito perfil de receptividade uterina é baseado no valor da razão de IL-18/Tweak e IL-15/Fn14 e o número de células uNK CD56+.

[00142] Em uma modalidade, o dito perfil de receptividade uterina é baseado em uma determinação sequencial do estado endometrial com base no primeiro valor da razão de IL-18/Tweak e, em seguida, sobre o valor da razão de IL-15/Fn14.

[00143] Em uma modalidade, o dito perfil de receptividade uterina é obtido de acordo com o método descrito aqui acima.

[00144] Em uma modalidade, o dito perfil de receptividade uterina é classificado entre a receptividade uterina apropriada ou inapropriada (ou ausência de receptividade ou receptividade anormal) com base na determinação do estado endometrial (normal, subativado ou superativado).

[00145] Outro objetivo da invenção é um método para aumentar a taxa de sucesso de um procedimento de tecnologia de reprodução assistida (ART), em um indivíduo do sexo feminino, que compreende:

[00146] determinar um perfil de receptividade uterina tal como descrito aqui acima, e

[00147] determinar uma recomendação personalizada para o dito indivíduo, dependendo do perfil de receptividade uterina observado.

[00148] Outro objetivo da invenção é um método para aumentar a taxa de sucesso de um procedimento de tecnologia de reprodução assistida (ART), em um indivíduo do sexo feminino, que compreende:

[00149] determinar o estado endometrial do dito indivíduo durante a janela de implantação uterina, como descrito aqui acima, e

[00150] determinar uma recomendação personalizada para o dito indivíduo, dependendo do estado endometrial observado.

[00151] Em uma modalidade da invenção em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima, é um estado subativado, ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma ausência de receptividade, a recomendação pode ser para estimular mecanicamente na fase lútea anterior ao ciclo IVF do endométrio através da criação de uma lesão no local através de uma biópsia do endométrio. Sem querer se ater a uma teoria, dita lesão local pode induzir as células imunes e citocinas pró-inflamatórias para preparar o solo para a implantação futura através de uma aderência melhor

[00152] Em uma outra modalidade da invenção em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima é um estado subativado, ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma ausência de receptividade, a recomendação pode ser para diminuir o nível de estimulação hormonal para diminuir a exposição de células do endométrio a uma concentração elevada de estradiol. Isto significa, por exemplo, diminuir o número de unidades de FSH para desencadear a ovulação em caso de IVF (o nível de estradiol medido no sangue no dia do desencadeamento da ovulação deve ser menor do que 1500 pg/ml) ou substituir os embriões congelados após o descongelamento em ciclos naturais monitorados (e não, como de costume, o ciclo substituído por estrogênios e progesterona). Sem querer se ater a uma teoria, uma estimulação ou substituição mínima no ciclo natural irá prejudicar um agravamento da subativação local já está presente. Os estrogênios não serão introduzidos na suplementação durante a fase lútea após a substituição embrião pelas mesmas razões.

[00153] Em uma outra modalidade da invenção, em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima é um estado subativado, ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado, devido a uma ausência de receptividade, a recomendação pode ser para estimular a tolerância imune, a angiogênese e a proliferação de células uNK através da administração de hormônios da Gonadotrofina Coriônica Humana (HCG) durante a janela de implantação. Por exemplo, 1500 UI de HCG podem ser injetados 4, 6 e 8 dias após a recuperação de oócitos (IVF) ou 6-8-10 dias após o pico de ovulação (substituição de embriões congelados em ciclo natural). Sem querer se ater a uma teoria, HCG vai influenciar profundamente a tolerância imunológica, a angiogênese na interface materno-fetal e ser envolvida na mobilização de células uNK através de uma ligação ao receptor de manose. Particularmente, o HCG irá induzir a produção de VEGF pelo epitélio do endométrio, aumentar a proliferação das células endoteliais e a migração de células do músculo liso que conduzem à maturação dos vasos.

[00154] Em uma outra modalidade da invenção, em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima, é um estado subativado, ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma ausência de receptividade, as relações sexuais são recomendadas após a transferência do embrião. Sem querer se ater a uma teoria, o plasma seminal pode desempenhar um papel na preparação do solo para a sua missão de implantação através da regulação do recrutamento e ativação de células T reguladoras.

[00155] Em uma modalidade da invenção, em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima, é um estado superativado ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma receptividade alterada, nenhuma lesão local é recomendada durante o ciclo que precede uma implantação do embrião.

[00156] Em uma outra modalidade da invenção, em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima, é um estado superativado ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma receptividade anormal, o nível elevado de estimulação do ovário é recomendado, a fim de permitir um nível elevado de exposição de células do endométrio para estradiol.

[00157] Por exemplo, no caso de IVF, as doses normais de FSH serão usadas para desencadear a superovulação com o objetivo de coletar 9 a 12 oócitos (a dose inicial de FSH será entre 225 a 400 UI). No caso de substituição de embriões congelados, a substituição por estrogênios e progesterona será usada. Para acentuar a concentração local de estrogênios, a via de administração vaginal é recomendada (2 mg de estradiol, 1 comprimido três vezes ao dia por via vaginal). Finalmente, na fase lútea, após a transferência do embrião, a prescrição de estradiol pode ser mantida (2 mg de estradiol, 1 comprimido três vezes por dia por via oral ou vaginal).

[00158] Em uma outra modalidade da invenção, em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima, é um estado superativado ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma receptividade anormal, altas doses de progesterona são recomendadas após a recuperação de oócitos (por exemplo, 400 mg, três vezes por dia por via vaginal).

[00159] Em uma outra modalidade da invenção, em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima, é um estado superativado ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma receptividade anormal, fármacos destinados a controlar o ambiente pró-inflamatório local será recomendado desde o início da estimulação. A escolha do fármaco irá depender da determinação da responsividade a corticoides com base no nível de expressão do receptor de G-CSF tal como descrito aqui acima.

[00160] Por exemplo, se o indivíduo é responsivo aos corticoides, os corticosteroides podem ser administrados a partir do primeiro dia do ciclo de os ciclos de IVF até que o teste de gravidez (um exemplo de corticosteroide a ser administrado é de 20 mg de prednisona do dia 1 dia ao dia do teste de gravidez). Se o indivíduo é não responsivo a corticoides, uma combinação de baixa dose de ácido acetil salicílico com heparinas de baixo peso (como Lovenox 0,4 dia do dia de recuperação de oócito de teste de gravidez) pode ser administrada. Um outro exemplo de tratamento quando o indivíduo é não responsivo a corticoides é o uso de intralipídeos. Os intralipídeos foram principalmente explorados para controlar a citotoxicidade das células NK periféricas do sangue, mas os resultados preliminares sugerem um controle de citotoxicidade uterina de células NK e uma imunorregulação sobre as células T reguladoras. Em uma modalidade, 100 ml de Intralipídeo a 20% são dissolvidos em 500 cc de solução salina normal de 7-14 dias antes da transferência do embrião. De preferência, o tempo de infusão para 500 mL não deve ser inferior a 2 horas. A cura pode ser repetida com um teste de gravidez positivo então administrada a cada mês, até a 12a semana.

[00161] Em uma outra modalidade da invenção, em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima, é um estado superativado ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma receptividade anormal, uma quantidade terapeuticamente eficaz de agente antioxidante deve ser administrada ao indivíduo. Um exemplo de agente antioxidante que pode ser administrado ao indivíduo é TOCO de 500 mg, 2 comprimidos por dia do D1 até o D do teste de gravidez.

[00162] Em uma outra modalidade da invenção, em que o estado endometrial determinado como descrito aqui acima, é um estado superativado ou o perfil de receptividade uterina é inapropriado devido a uma receptividade anormal, não é recomendada relação sexual após a transferência do embrião.

[00163] A presente invenção também tem por objetivo fornecer métodos e sistemas à base de computador para facilitar a avaliação da infertilidade clínica. Os métodos e sistemas podem ser implementados para facilitar a avaliação de um indivíduo para um tratamento de fertilização in vitro ou procedimento de tecnologia de reprodução assistida. Especificamente, os métodos e os sistemas podem ser implementados para facilitar a avaliação da receptividade uterina de um indivíduo e subsequentemente fornecer um tratamento personalizado para a fertilização in vitro do dito indivíduo.

[00164] Em uma modalidade, o método inclui a obtenção de itens de informação de um indivíduo do sexo feminino para fornecer um perfil para o indivíduo do sexo feminino, em que cada item de informação refere-se a variáveis pré-selecionadas do indivíduo, comparando o perfil para o indivíduo do sexo feminino com uma biblioteca de padrões de perfil conhecidos que se sabe serem indicativos da responsividade a um processo de fertilização in vitro, usando um algoritmo baseado nas variáveis pré- selecionadas do indivíduo, em que a comparação fornece uma avaliação do indivíduo do sexo feminino para um procedimento de fertilização in vitro, em particular, uma avaliação da receptividade uterina do indivíduo do sexo feminino, em a fim de fornecer um tratamento personalizado para a fertilização in vitro do dito indivíduo. Em uma modalidade, uma das ditas variáveis é o perfil de receptividade uterina, tal como definido aqui acima. Em uma outra modalidade, uma das ditas variáveis é o estado endometrial tal como definido aqui acima.

[00165] Em uma modalidade, os elementos de informação podem ser fornecidos pelo indivíduo do sexo feminino com base em um questionário escrito ou eletrônico ou podem ser solicitados, transcritos, ou de outro modo conectados, por um profissional de saúde, como um médico, enfermeiro, técnico, ou semelhante.

[00166] Itens exemplares de informações relativas a variáveis pré-selecionadas do indivíduo incluem, mas não se limitam a: datação histológica (para determinar que o indivíduo está na janela de receptividade); características do indivíduo, tais como idade, história de infertilidade anterior, diagnóstico clínico; características do endométrio, como a espessura endometrial, o volume endometrial, vascularização endometrial, dopplers da artéria uterina; etiologia da infertilidade, informações sobre o tratamento clínico, tais como o tipo de medicamentos, o número de dias de estimulação, número de oócitos, etc.; dados morfológicos do embrião convencionais, como o número e qualidade dos embriões transferidos, estágio de desenvolvimento, grau, e semelhantes; avaliação da reserva ovariana, como 3 dias do nível de hormônio folículo estimulante (FSH), 3 dias do nível de hormônio anti-Mülleriano (AMH), contagem de folículo Antral no Dia-3; índice de massa corporal, doença do ovário policístico, espermograma com espermocitograma, infertilidade feminina inexplicável, número de abortos espontâneos, ano, outras causas de infertilidade feminina, número de gestações anteriores, número de partos anteriores, endometriose, doença tubária, laqueadura, infertilidade masculina, miomas uterinos, hidrosalpinx, e causas de infertilidade masculina.

[00167] Em uma outra modalidade, o método inclui a obtenção de itens de informação relativos a pelo menos as variáveis que são necessárias para determinar o estado endometrial tal como descrito aqui acima, ou mais. Como tal, em outras modalidades, o método inclui a obtenção de itens de informação relativos as ditas variáveis e, pelo menos, mais um, incluindo 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, e semelhantes.

[00168] De preferência, além do estado endometrial e/ou do perfil de receptividade uterina, o método inclui a obtenção de itens de informação do seguinte grupo: datação histológica (determinação da janela de receptividade); características do endométrio (como, por exemplo, espessura endometrial, o volume endometrial, vascularização endometrial, dopplers da artéria uterina); idade do indivíduo; etiologia da infertilidade; dados de infertilidade, tais como resumo da história anterior e número e qualidade dos embriões transferidos; avaliação hormonal da reserva ovariana (AMH, FSH, contagem de folículos antrais); tipo de ART (IVF, ICSI, IMSI, inseminação).

[00169] Em uma outra modalidade, o método inclui a atribuição de uma importância relativa ponderada para cada variável pré-selecionada do indivíduo em relação a outras variáveis pré-selecionadas do indivíduo.

[00170] Em algumas modalidades, a comparação inclui a aplicação de uma regra de decisão. Em algumas modalidades, o algoritmo de análise de dados compreende o uso de uma árvore de classificação. Em outras modalidades, o algoritmo de análise de dados é não paramétrico, como com o uso de um teste de Wilcoxon Signed Rank. Em certas modalidades, o algoritmo de análise de dados detecta as diferenças de uma distribuição de valores de característicos. Em algumas modalidades, o algoritmo de análise de dados inclui o uso de uma árvore de regressão de múltiplo aditivo. Em algumas modalidades, o algoritmo de análise de dados é uma regressão logística.

[00171] Uma abordagem para analisar esses dados é o uso de um algoritmo de árvore de classificação que procura por padrões e relações em grandes conjuntos de dados. A "árvore de classificação" é uma partição recursiva para avaliar um indivíduo do sexo feminino para um procedimento de fertilização in vitro, usando uma série de perguntas que são projetadas para colocar com precisão o indivíduo em uma das classes. Cada pergunta questiona se a condição de um indivíduo satisfaz um determinado indicador, com cada resposta sendo usada para orientar o usuário na árvore de classificação até uma classe a qual o indivíduo faz parte pode ser determinada. Como usado no presente documento, um "indicador" é a faixa de valores das características, tais como, por exemplo, o estado de atividade de ambiente endometrial de citocina ou uNK ou o estado de recrutamento e maturação de uNK.

[00172] Como discutido acima, a avaliação de um indivíduo do sexo feminino para um procedimento de fertilização in vitro, incluindo a determinação a sua receptividade uterina é feita através da obtenção e comparação dos itens de informação a partir do indivíduo do sexo feminino com uma biblioteca de padrões de perfil conhecidos que se sabe serem indicativos da responsividade a um em procedimento de fertilização in vitro usando um algoritmo com base nas ditas variáveis do indivíduo pré-selecionadas. Em algumas modalidades, a avaliação de um indivíduo é fornecida em um relatório. Assim, em algumas modalidades, o método inclui ainda uma etapa de preparação ou a geração de um relatório que inclui informação(ções) sobre a probabilidade de sucessos do indivíduo para um procedimento de fertilização in vitro e recomendação(ções) para um tratamento personalizado, tal como descrito aqui acima. Por exemplo, um método em questão pode ainda incluir uma etapa de gerar ou produzir um relatório que fornece os resultados da avaliação de um indivíduo, cujo relatório pode ser fornecido sob a forma de um meio eletrônico (por exemplo, um visor eletrônico em um monitor de computador), ou sob a forma de um meio tangível (por exemplo, um relatório impresso em papel ou outro meio tangível). O relatório também pode incluir informação(ções) sobre a instalação de testes, cuja informação é relevante para o hospital, clínica ou laboratório em que a coleta da amostra e/ou geração de dados foi conduzida. Esta informação pode incluir um ou mais detalhes em relação a, por exemplo, o nome e a localização da instalação de teste, a identidade do técnico de laboratório que realizou o ensaio e/ou que introduziu os dados de entrada, a data e a hora que o ensaio foi realizado e/ou analisado, o local em que a amostra e/ou os dados do resultado é armazenado, o número de lote dos reagentes (por exemplo, kit, etc.) utilizados no ensaio, e semelhantes. Dito relatório também pode incluir informação(ções) relativas ao prestador de serviços, dados do indivíduo e dados da amostra.

[00173] A porção interpretativa do relatório inclui informações geradas após o processamento dos dados como aqui descrito. O relatório interpretativo pode incluir uma avaliação de um indivíduo do sexo feminino para um procedimento de fertilização in vitro. O relatório interpretativo pode incluir, por exemplo, a interpretação da receptividade uterina com base nos dados obtidos, como descrito acima e, opcionalmente, recomendação(ções) para um tratamento personalizado para a fertilização in vitro.

[00174] Os métodos e sistemas aqui descritos podem ser implementados de várias maneiras. Em uma modalidade de interesse particular, os métodos envolvem o uso de uma infraestrutura de comunicação, por exemplo a internet. Várias modalidades da invenção são discutidas a seguir. Deve também ser compreendido que a presente invenção pode ser implementada em várias formas de hardware, software, firmware, processadores, ou uma combinação dos mesmos. Os métodos e sistemas aqui descritos podem ser implementados como uma combinação de hardware e software. O software pode ser implementado como um programa de aplicação tangivelmente incorporado em um dispositivo de armazenamento do programa, ou porções diferentes do software implementado no ambiente de computação do usuário (por exemplo, como um applet) e no ambiente de computação do revisor, em que o revisor pode ser localizado em um sítio remoto associado (por exemplo, em instalações de um prestador de serviços).

[00175] Os vários elementos do dispositivo de computação, tais como o dispositivo de entrada, podem estar associados a outros elementos do sistema por meio de uma conexão com fio ou de conexão sem fio, incluindo, por exemplo, uma conexão LAN sem fio, protocolo de conexão de Bluetooth, protocolo de conexão ZigBee, protocolo de conexão de radiofrequência, ou um protocolo de conexão de telefone celular, incluindo o acesso múltiplo por divisão de código (CDMA) ou através de um sistema global para comunicações móveis (GSM).

[00176] O programa de aplicação para executar os algoritmos descritos aqui pode ser carregado em, e executado por, uma máquina que compreende qualquer arquitetura adequada. Em geral, a máquina envolve uma plataforma de computador tendo hardware tais como uma ou mais unidades de processamento central (CPU), uma memória de acesso aleatório (RAM), e interface(s) de entrada/saída (I/O). A plataforma de computador também inclui um sistema operacional e código de microinstrução. As várias funções e processos aqui descritos podem ser tanto parte do código de microinstrução quanto parte do programa de aplicação (ou uma combinação dos mesmos) que é executada por meio do sistema operacional. Além disso, vários outros dispositivos periféricos podem ser conectados à plataforma de computador, tal como um dispositivo de armazenamento de dados adicional e um dispositivo de impressão.

[00177] Parte ou a totalidade dos dados de entrada e de saída também pode ser enviada eletronicamente; certos dados de saída (por exemplo, relatórios) podem ser enviados eletronicamente ou telefonicamente (por exemplo, por fax, por exemplo, com o uso de dispositivos como o fax de retorno). Exemplos de dispositivos de recebimento de saída que podem incluir um elemento de exibição, uma impressora, um dispositivo de fac-símile e semelhantes. As formas eletrônicas de transmissão e/ou exibição podem incluir e-mail, televisão interativa, e semelhantes. Em uma modalidade de particular interesse, a totalidade ou uma porção de dados de entrada e/ou a totalidade ou uma porção dos dados de saída (por exemplo, normalmente, pelo menos, o relatório final) são mantidas no servidor da web para o acesso, de preferência, acesso confidencial, com navegadores típicos. Os dados podem ser acessados ou enviados para os profissionais de saúde conforme desejado. Os dados de entrada e de saída, incluindo a totalidade ou uma porção do relatório final, podem ser usados para preencher a ficha médica do indivíduo, que pode existir em um banco de dados confidencial na instalação de cuidados de saúde.

[00178] Um sistema para uso nos métodos descritos aqui, geralmente, inclui pelo menos um processador de computador (por exemplo, onde o método é realizado na sua totalidade num único sítio) ou, pelo menos, dois processadores de computador em rede (por exemplo, onde os dados devem ser introduzidos por um usuário e transmitidos para um sítio remoto a um segundo processador de computador para análise, em que os primeiro e segundo processadores de computador são ligados por uma rede, por exemplo, através de uma intranet ou internet). O sistema também pode incluir um componente(s) de usuário para a entrada; e um componente(s) de revisor para revisão de dados, relatórios gerados e intervenção manual. Os componentes adicionais do sistema podem incluir um componente(s) de servidor; e um banco de dados para o armazenamento de dados. Os processadores de computador podem ser processadores que são normalmente encontrados em computadores de mesa pessoais (por exemplo, IBM, Dell, Macintosh), computadores portáteis, mainframes, minicomputadores, ou outros dispositivos de computação, tais como dispositivos de smartphones, incluindo, por exemplo, um dispositivo de iPhone(R)Apple(R).

[00179] A arquitetura de cliente/servidor de rede pode ser selecionada como desejado, e pode ser, por exemplo, um modelo de servidor cliente clássico de duas ou três camadas. Um sistema de gerenciamento de banco de dados relacional (RDMS), como parte de um componente de servidor de aplicativos ou como um componente separado (máquina de RDB) fornece a interface para o banco de dados.

[00180] Em uma modalidade, a arquitetura é fornecida como uma arquitetura cliente/servidor centrada no banco de dados, em que a aplicação do cliente geralmente solicita serviços do servidor do aplicativo que faz solicitações para a banco de dados (ou o servidor de banco de dados) para preencher o relatório com os vários elementos do relatório conforme necessário, especialmente os elementos do relatório interpretativas, especialmente o texto e alertas de interpretação. O(s) servidor(s) (por exemplo, como parte da máquina do servidor de aplicativos ou de uma máquina de banco de dados relacional/RDB separada) responde a solicitações do cliente.

[00181] A invenção também contempla um meio de armazenamento legível por computador (por exemplo, CD-ROM, chave de memória, cartão de memória flash, disquete, etc.) tendo armazenado no mesmo um programa que, quando executado em um ambiente de computação, fornece a aplicação de algoritmos para realizar a totalidade ou uma porção dos métodos de análise de avaliação de um indivíduo para um procedimento de fertilização in vitro, como aqui descrito. Quando o meio legível por computador contém um programa completo para realizar os métodos aqui descritos, o programa inclui instruções de programa para a coleta, análise e geração de saída, e geralmente inclui dispositivos de códigos legíveis por computador para interagir com um usuário, tal como aqui descrito, o processamento de dados em conjunto com informações analíticas e geração de meios impressos ou eletrônicos exclusivos para esse usuário.

[00182] Quando o meio de armazenamento fornece um programa que prevê a aplicação de uma porção de um dos métodos aqui descritos (por exemplo, o aspecto do lado do usuário dos métodos (por exemplo, a entrada de dados, a capacidade de recepção de relatórios, etc.)), o programa fornece a transmissão de dados introduzidos pelo usuário (por exemplo, através da internet, através de uma intranet, etc.) para um ambiente de computação de um sítio remoto. O processamento ou conclusão do processamento dos dados é realizado no sítio remoto para gerar um relatório. Após a revisão do relatório, e conclusão de qualquer intervenção manual necessária, para fornecer um relatório completo, o relatório completo é então transmitido de volta para o usuário como um documento eletrônico ou documento impresso (por exemplo, relatório enviado por papel ou fax). O meio de armazenamento que contém um programa de acordo com a invenção pode ser embalado com instruções (por exemplo, para a instalação do programa, uso, etc.) registrado sobre um substrato adequado ou um endereço da Internet, onde podem ser obtidos tais instruções. O meio de armazenamento legível por computador pode também ser fornecido em combinação com um ou mais reagentes para realizar a determinação dos dados de informação do indivíduo, por exemplo, material para determinação do estado endometrial tal como descrito aqui acima.

[00183] Os materiais para uso nos métodos da presente invenção são adequados para a preparação de kits produzidos de acordo com procedimentos bem conhecidos. A invenção fornece, assim, kits compreendendo reagentes úteis para testar a expressão dos genes aqui divulgados e para avaliar o estado endometrial do indivíduo, por exemplo.

[00184] Por exemplo, um kit pode incluir uma ou mais sondas de ácidos nucleicos que hibridizam especificamente com os produtos de genes, tal como descrito aqui acima, tais como CD56, IL-18, IL-6, IL-12, Tweak, IL-15, receptor G-CSF e Fn14,

[00185] Em alguns casos, um kit vai incluir, além de uma sonda que se hibridiza especificamente com os produtos de ácido nucleico como descrito aqui acima, uma ou mais sondas que se hibridizam especificamente com um produto do gene de referência, tais como RPL-13A, beta-2 microglobulina e proteína tatabox TBP. Tais sondas podem ser utilizadas para determinar níveis de expressão normalizados dos genes de interesse.

[00186] Os kits podem compreender, opcionalmente, o(s) reagente(s) com uma descrição de identificação ou etiqueta ou instruções sobre seu uso nos métodos da presente invenção. Os kits podem compreender recipientes (incluindo placas de microtitulação adequadas para uso em uma implementação automatizada do método), cada um com um ou mais dos vários reagentes (tipicamente na forma concentrada) utilizados nos métodos da invenção, incluindo, por exemplo, micromatrizes pré-fabricadas, tampões, trifosfatos de nucleotídeo apropriados (por exemplo, dATP, dCTP, dGTP e dTTP; ou rATP, rCTP, rGTP e UTP), transcriptase reversa, DNA polimerase, RNA polimerase, e uma ou mais sondas e os iniciadores da presente invenção (por exemplo, comprimento de poli (T) apropriado ou iniciadores aleatórios ligados a um promotor reativo com a RNA polimerase).

[00187] As instruções para o uso de algoritmos matemáticos usados para avaliar um indivíduo do sexo feminino para um ciclo de tratamento de fertilização in vitro, também podem ser incluídas em um kit em questão. Em tais modalidades, os kits incluem ainda um meio escrito ou eletrônico, ou instruções para acessar um banco de dados remoto, como descrito anteriormente, para fornecer e/ou receber informações, que incluem, geralmente, dados de informação do indivíduo, a fim de realizar os métodos conforme acima descrito. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00188] Figura 1: Sistema inteligente para avaliação da receptividade uterina.

[00189] Figura 2: (A) Correlação da expressão de mRNA de IL-15 sobre os dois ciclos distintos (n = 37 indivíduos), (B) Correlação da expressão de mRNA de IL-18 sobre os dois ciclos distintos (n = 37 indivíduos), (C) Correlação da expressão de mRNA de TWEAK ao longo de dois ciclos (n = 15 indivíduos).

[00190] Figura 3: A correlação da expressão do receptor do GCSF e resposta a corticoides.

[00191] Figura 4: Evolução de IL-15/Fn-14 antes e sob os corticoides. (A) mostra a expressão de mRNA de IL-15/Fn-14 em 14 casos de falha de implantação diagnosticados com basal tanto superexpressão de IL-18/TWEAK quanto superexpressão de IL-15/Fn-14. (B) mostra a expressão de mRNA de IL-15/Fn-14 em 10 pacientes, com uma superexpressão de IL-18/TWEAK e uma baixa expressão de IL-15/Fn-14.

[00192] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes. EXEMPLOS Material e métodos

[00193] Indivíduos com história de falhas de implantação repetidas e inexplicáveis anteriores foram avaliados na fase lútea intermediária de um ciclo de não concepção.

[00194] As amostragens do endométrio foram realizadas:

[00195] durante um ciclo natural monitorado de 7 a 9 dias após o pico de ovulação (LH), se o indivíduo tinha ciclos regulares,

[00196] em tratamento de reposição de estrogênio/progesterona aplicado para transferir embriões descongelados se os ciclos são irregulares ou o indivíduo está em amenorreia. 2 mg de estradiol micronizado (Provames, Cassenne, Paris, França) são então administrados diariamente a partir do dia 1 a 21, por via oral e progesterona micronizada (Utrogestan; Besins-Iscovesco Pharmaceuticals, Paris, França), 200 mg por dia, por via vaginal dos dias 14 a 21.

[00197] As biópsias são realizadas com uma pipeta Cornier padrão (CCD Laboratories, Paris, França). Uma porção da amostra é embebida em parafina para datação histológica de acordo com critérios publicados e para a enumeração e coloração imune de células CD56+ (Ventana, 760-2625). A datação e imunocoloração de CD56+ são realizadas para confirmar a fase lútea intermediária e determinar o número médio de uNK/campo observado. Outra amostra é imediatamente transferida para uma Solução de Estabilização de RNA (RNA Later, QIAGEN, Courtabeuf, França) e imediatamente armazenada a -80°C até uso posterior. A extração de RNA é realizada vários dias depois (após confirmação da fase lútea tardia). Imuno-histoquímica

[00198] As seções são cortadas em um micrótomo (5 μm de espessura), colocadas em lâminas de vidro Superfrost (CML, Nemours, França). No dia do experimento, as lâminas são desparafinizadas em histolemon e re-hidratadas com álcool. As atividades de peroxidases endógenas e de biotina são inibidas pela incubação das lâminas em uma solução específica (Solução de Bloqueio de Peroxidase, Dako, Trappes, França e kit de Vetor de Bloqueio de Avidina/Biotina, Abcys, Paris, França). A proteína de bloqueio é conseguida por uma incubação de 20 min em PBS (Tampão de Fosfato Salino) com 1% de soro de coelho (ou soro de cabra para a coloração de CD56) e 5% de soro humano normal (soro de bloqueio). As seções são incubadas 1 hora à temperatura ambiente com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-humano no caso de coloração de CD56 (Immunotech, Marselha, França). A concentração é de 1 μg/ml para os anticorpos anti-CD56. O anticorpo é diluído em soro de bloqueio. Entre cada uma das etapas as lâminas são lavadas três vezes com PBS. A imunocoloração é realizada usando um anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho ou de cabra anti-camundongo a partir Kit de Vetor ABC, Abcys, Paris, França) durante 20 min, seguido por incubação com um conjugado de estreptavidina-peroxidase durante 30 minutos e, em seguida, por uso de tampão de substrato suplementado com DAB líquido e solução de substrato de peróxido de hidrogênio (Dako, Trappes, França). As seções são então incubadas durante 5 minutos com hematoxilina de Mayer (Interchim, Montlucon, França). Finalmente, as lâminas são lavadas em água destilada, suplementada com 1% de água amoniacal e montadas com Ultramount (Dako, Trappes, França).

[00199] Para cada espécime, as células CD56+ são contadas em quatro campos de 40X e então a média é calculada. Extração de RNA total e transcrição reversa

[00200] Um fragmento de cada biópsia do endométrio é interrompido diretamente no tampão de lise de um kit RNeasy (QIAGEN, Courtabeuf, França) usando um Ultra Turrax T15 (IKA-WERKE). O RNA total é extraído usando o kit RNeasy de acordo com as instruções do fabricante. Uma digestão de DNase adicional é realizada durante o processo de extração (configuração de DNase livre de RNase, QIAGEN, Courtabeuf, França). A integridade e a abundância de RNA são determinadas usando o sistema de Experion (kit StdSens de RNA Experion, Bio-Rad, Hercules, CA) e o RNA é armazenado a -80°C até uso final.

[00201] O RNA total (1 μg) é transcrito reversamente no cDNA usando iniciadores aleatórios e Superescrito III (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Controles sem transcriptase reversa são sistematicamente realizados para detectar contaminação de DNA genômico. O cDNA é armazenado a -20°C até à sua utilização. PCR em Tempo Real

[00202] Os pares de iniciadores já publicados como específico para TWEAK (Tweak-S TGCACCTAAAGGCCGGAAAACACG (SEQ ID NO: 1) e Tweak- AS CAGCGCAGGGCCAGCACACCATCC (SEQ ID NO: 2)), IL-18 (IL-18-S ATAAAGATGGCTGCTGAACC (SEQ ID NO: 3) e IL-18-AS TCAAATAGAGGCCGATTTCC (SEQ ID NO: 4)), beta-2 microglobulina (β2M) (b2M- S TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT (SEQ ID NO: 5) e b2M-AS TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT (SEQ ID NO: 6)), proteína ribossomal L13A (RPL13A) (RPL13A-S CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA (SEQ ID NO: 7) e RPL13-AS TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA (SEQ ID NO: 8)) foram projetados. Iniciadores específicos de Fn14 (Fn14-S TTTCTGGCTTTTTGGTCTGG (SEQ ID NO: 9) e Fn14-AS GGCACATTGTCACTGGATCA (SEQ ID NO: 10)), IL-15 (IL-15-S CTAGAGCCAACTGGGTGAATG (SEQ ID NO: 11) e IL-15 AS CATCTCCGGACTCAAGTGAAA (SEQ ID NO: 12)) e receptor de G-CSF (G-CSFR-S GTCCAAGATCACAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 13) e G-CSFR- AsCCGCACTCCTCCAGACTTC (SEQ ID NO: 14)) foram projetados usando o Centro de Projeto de Ensaio de Biblioteca de Sonda Universal (www.roche-applied- science.com). As sequências Fn14, IL-15 e G-CSFR foram pesquisadas contra as sequências do GenBank com o programa BLAST para garantir a especificidade dos iniciadores.

[00203] PCR em tempo real é realizada usando um aparelho LightCycler 480 (Roche, Meylan, França). As reações são estabelecidas usando as seguintes concentrações finais: 0,5 μM de iniciadores sense e antisense, 1X 480 SYBR Green Master Mix e 4 μl de cDNA diluído de 1/20. As condições dos ciclos foram as seguintes: desnaturação (95°C durante 5 min), amplificação e quantificação (95°C durante 10s, 60°C durante 10s e 72°C durante 15s) repetido 40 vezes, um programa de curva de fusão (65- 95°C com uma taxa de rampa de 2,2°C/s) e uma fase de resfriamento a 4°C. O ensaio incluiu um controle não-modelo, um calibrador e cada um dos cDNA de teste. Todos foram realizados em duplicata.

[00204] A eficiência de amplificação foi estimada usando diluições em série de cada um dos amplicons específicos. Os dados foram analisados usando o software quantificação relativa LightCycler 480, usando a estratégia de normalização com a média geométrica de dois controles internos selecionados.

[00205] Os dois controles internos (β2M, RPL13A) usados neste estudo foram selecionados pelo programa geNorm (dados não mostrados). Cada eficiência de amplificação específica foi > 1,8. Resultados 1

[00206] Cada nove casais em dez na Europa e EUA é afetado por distúrbios de implantação e perda de gravidez e a maior parte das perdas de gravidez ocorre antes ou durante a implantação. Portanto, compreender a relação entre os componentes fetais e maternos antes, durante e depois de seus confrontos continua a ser um grande desafio.

[00207] A implantação humana pode ser descrita como um processo de três etapas começando com a aposição e aderência de um blastocisto competente ao epitélio do endométrio e continuando por uma invasão extensiva ao longo do primeiro trimestre de gravidez em um endométrio receptivo. O processo orquestrado altamente recíproco muito complexo de implantação humana leva à construção essencial de uma placenta haemocorial.

[00208] Eventos de remodelação uterina necessários para uma gravidez com sucesso começam antes da implantação com a decidualização do endométrio, que ocorre mesmo na ausência de um concepto fertilizado em humano. Estas modificações do endométrio definem a janela de implantação e dura 5 dias dos dias 4 a 9 após a ovulação e constituem o endométrio receptivo. A decidualização humana é caracterizada por um influxo de uma população de linfócitos distintiva composta principalmente por células assassinas naturais uterinas maternas. A invasão de trofoblasto é dirigida por células assassinas naturais uterinas (uNK) através de uma liberação orquestrada e regulamentada de citocinas e fatores pró- angiogênicos que promovem a remodelação vascular.

[00209] A decidualização é um processo vital para a gravidez humana, funcionando para fornecer tolerância imune materna, a proteção do feto e regular a placentação. O ambiente local e seu equilíbrio imune serão cruciais.

[00210] De um ponto de vista imunológico, a janela de implantação é caracterizada por uma troca de categorias de células imunes. Enquanto na fase proliferativa, a maioria das células imunes pertence à imunidade local adaptativa, a fim de defender o trato reprodutivo da infecção, na fase lútea intermediária, a maior parte das células imunes pertence à imunidade inata. Tal troca aparece como fundamental para permitir o fenômeno da tolerância local ao feto "semialogênico".

[00211] Assim, no momento da implantação, os principais atores imunes são as células assassinos naturais uterinas (65-70%), as células que apresentam antígenos como macrófagos (10-20%), as células T reguladoras (<2 0%) e as células dendríticas (< 2%). As células NK uterinas diferem da sua contraparte periférica, não só no fenótipo, mas também na função aparente. As células NK uterinas são tipicamente CD56bright/CD16-, enquanto as NKs periféricas são CD56dim/CD16+. CD16 está diretamente envolvido no desencadeamento da lise das células alvos. O repertório dos receptores de ativação e inibição que regulam a atividade relacionada a NK são diferentes se as células CD56bright comparadas se originam do sangue. A ausência de expressão de CD16 em uNKs resulta em citotoxicidade reduzida nestas células, trocando a função para produção de citocinas. No entanto, as células NK uterinas são potencialmente citotóxicas se desencadeadas por um ambiente local e capaz de eliminar as células infectadas com vírus ou células trofoblásticas ou embriões ativados por meio de um excesso de citocinas pró-inflamatórias.

[00212] Os camundongos de knockout com IL-15 são férteis, mas eles exibem integridade decidual prejudicada, artérias espiraladas não modificadas, e falta de uNK na implantação. A IL-15 está envolvida diretamente no recrutamento uterino pós-ovulatório de células NK. A IL-15 é referida como sendo essencial para a produção de citocinas do tipo 2 pelas células uNK. Ao contrário de seus efeitos sobre as células NK no sangue, a interleucina-15 não transforma as células uNK em células citolitícas potentes se não estiver presente em excesso e tiver participado de sua maturação. Isto é extremamente importante para uma célula que está presente na interface materno - fetal, onde a atividade citolítica destruiria o trofoblasto. No ser humano, a expressão endometrial do mRNA de IL-15 correlaciona-se com o recrutamento local de células NK uterinas e a angiogênese local. Além disso, quer a depleção ou um excesso de expressão de IL-15 tem sido relatado no endométrio lútea intermediário de indivíduos com história de falhas de implantação inexplicáveis depois de IVF-ET. É, portanto, razoável presumir que no útero humano, a IL-15 pode desempenhar um papel importante na promoção da sobrevivência e expansão de células uNK, bem como na condução de sua diferenciação para um fenótipo não- citotóxico. Contudo, se for muito expressa, a IL-15 pode desencadear uma citotoxicidade local.

[00213] Com relação à expressão endometrial de IL-15, a IL-18 sozinha é uma citocina promotora de Th-2, com efeitos positivos sobre a desestabilização crucial de artérias espiraladas através de uma ação da angiopoietina-2. O seu principal papel é a remodelação do lado materno da vasculatura. No entanto, a interleucina-18 é uma citocina bivalente capaz de reagir como uma citocina Th-1 pró-inflamatória na presença de interleucina-12. Coestimulada com a IL-12, a IL-18 acentua a produção local de IFN-gama e TNF e ativa as células NK uterinas em células assassinas citotóxicas. A IL-18 é representativa do equilíbrio de citocinas dentro do endométrio, se a falta de preparação de artérias espiraladas para serem invadidas não for eficaz e a implantação falhar. Em excesso, a IL-18 se comporta como uma citocina Th-1 e irá desencadear as células imunes circundantes para induzir uma atividade citotóxica danosa.

[00214] A compreensão da função local de IL-15 e IL-18 tem de ter em conta a expressão local de imunorreguladores, como TWEAK, que é capaz de modular os efeitos das citocinas. TWEAK (fator de necrose tumoral semelhante ao indutor WEAK de apoptose) desencadeia várias respostas celulares que variam da proliferação à morte celular, incluindo o controle da angiogênese. TWEAK também tem sido descrito como um parceiro para TNF (Fator de Necrose Tumoral) desempenhando uma função de «Yin e Yang» na imunidade. O mRNA de TWEAK e a expressão de proteína não apresentam variações ao longo do ciclo menstrual. No entanto o seu nível basal de expressão influencia o recrutamento de uNK relacionadas com IL-18 e a citotoxicidade local. TWEAK atua sobre a citotoxicidade de células uNK, induzida pela superexpressão de IL-18, por modificação de uma das células uNK de expressão do receptor citotóxico, NKp46, consequentemente, a sua atividade contra o embrião. TWEAK aparece como um modulador para evitar a citotoxicidade de uNK endometrial induzida por superexpressão de IL-18. IL-18 e TWEAK como duas proteínas independentes possivelmente atuam em sinergia para manter o equilíbrio angiogênico/citotóxico relacionado com as células uNK.

[00215] A avaliação da receptividade uterina, determinando o estado endometrial pode, assim, ser de interesse para a avaliação de um indivíduo do sexo feminino para um procedimento de tecnologia de reprodução assistida.

[00216] A análise em 225 indivíduos levou à seguinte observação:

[00217] Um método baseado na avaliação do estado endometrial através da determinação do estado de atividade de células uNK usando uma razão de IL- 15/Tweak identifica cerca de 42% das mulheres testadas como tendo um estado endometrial normal. No entanto, entre as ditas 42%, quase 25% não chegaram a apresentar um estado endometrial normal.

[00218] Do mesmo modo, um método baseado na avaliação do estado endometrial através da determinação do estado de maturação de células uNK usando uma razão de IL-15/Fn14 identifica cerca de 43% das mulheres testadas como tendo um estado normal do endométrio. No entanto, entre as ditas 43%, quase 75% não chegaram a apresentar um estado endometrial normal.

[00219] Além disso, um método baseado na avaliação do estado endometrial através da determinação do estado de recrutamento de células uNK contando o número de células CD56+ identifica cerca de 47% de mulheres testadas como tendo um estado normal do endométrio. No entanto, entre as ditas 47%, 80%, na verdade, não apresentam um estado normal do endométrio.

[00220] Um sistema inteligente foi então desenvolvido para avaliar com mais precisão o estado endometrial das mulheres (Figura 1).

[00221] Uma recomendação personalizada pode então ser sugerida, dependendo do estado endometrial do indivíduo.

[00222] Tais procedimentos foi aplicado a 255 indivíduos com história prévia de falhas de implantação inexplicáveis após IVF/ICSI ou abortos recorrentes inexplicados por padrão genético, trombofilia ou explorações autoimunes.

[00223] Para indivíduos com falha de implantação, a faixa média de tentativas de IVF/ICSI anterior foi de três tentativas sem sucesso (faixa: 1-8), com uma média de 7 embriões transferidos (faixa: 3-25), sem gravidez subsequente. A média de idade foi de 36 anos de idade. a - Diagnóstico de perfil de receptividade uterina de acordo com o método tal como descrito aqui acima.

[00224] 48,5% (124/255) apresentaram endométrio superativado (rejeição do embrião).

[00225] 35,5% (91/255) apresentaram um endométrio subativado (sem aderência do embrião).

[00226] 15,5% (40/255) apresentaram um endométrio normal. b- Otimização da tentativa de IVF/ICSI por uma personalização da preparação uterina.

[00227] Em tal população com falha de implantação anterior, a taxa de gravidez em curso esperada na próxima tentativa de IVF/ICSI é entre 15 a 20% de transferências de embriões. De fato, na França quatro tentativas (recuperação folicular) estão cobertas pelo seguro social.

[00228] Fomos capazes de avaliar prospectivamente o resultado de 75 indivíduos após a determinação do seu perfil de receptividade uterina e otimização e personalização de seu tratamento de fertilização in vitro.

[00229] O resultado registrado foi:

[00230] A taxa de gravidez em 5 semanas de amenorreia (visualização do saco gestacional).

[00231] A taxa de gravidez avaliada em 12 semanas de amenorreia (gravidez em curso com a presença de pelo menos um saco gestacional com atividade cardíaca).

[00232] A primeira transferência de embriões subsequente (frescos ou congelados e descongelados) é seguida pela avaliação uterina. Os médicos responsáveis aplicaram as recomendações para otimizar a receptividade uterina.

[00233] Para dito coorte de 75 indivíduos:

[00234] 38% (28/75) apresentaram endométrio superativado (tendência de rejeitar o embrião).

[00235] 42,6% (32/75) apresentaram um endométrio subativado (problema de aderência do embrião).

[00236] 20% (15/75) apresentaram endométrio normal.

[00237] Os indivíduos que apresentaram um endométrio superativado foram recomendados para ter uma tentativa de fertilização in vitro:

[00238] Sem intervenção uterina ativa do ciclo antes,

[00239] Corticoides,

[00240] Alta dose de progesterona na fase lútea.

[00241] Os indivíduos que apresentam um endométrio subativado foram tratados com uma biópsia endometrial realizada na fase lútea intermediária do ciclo que precede a tentativa de fertilização in vitro, a uma estimulação ovariana mínima e uma adjunção de hormônio da gonadotrofina coriônica na fase lútea após a transferência do embrião.

[00242] A taxa de gravidez em curso depois de personalização do tratamento na primeira transferência de embriões subsequente foi:

[00243] No caso de um endométrio superativado:

[00244] A taxa de gravidez em 5 semanas de amenorreia foi de 46% (13/28).

[00245] A taxa de gravidez em curso em 12 semanas de amenorreia foi de 39% (11/28).

[00246] No caso de endométrio subativado:

[00247] A taxa de gravidez em 5 semanas de amenorreia foi de 53% (17/32).

[00248] A taxa de gravidez em curso em 12 semanas de amenorreia foi de 43,7% (14/32).

[00249] No caso de um endométrio normal:

[00250] A taxa de gravidez em 5 semanas de amenorreia foi de 26% (4/15).

[00251] A taxa de gravidez em curso em 12 semanas de amenorreia foi de 20% (3/15).

[00252] Estes resultados sugerem que a determinação da receptividade uterina para otimizar seu estado restitui um potencial ótimo de implantação em indivíduos com falhas de implantação inexplicáveis anteriores. De fato, uma gravidez em curso de cerca de 40% é considerada como uma taxa de gravidez boa e é esperada em um indivíduo jovem na sua primeira das segundas tentativas de IVF/ICSI.

[00253] No presente contexto clínico (terceira tentativa, após a falha de implantação inexplicável e repetida), a taxa de gravidez esperada era de 20%, da observada no grupo com endométrio normal e, provavelmente, associada a outros problemas relacionados quer com o oócito ou com os espermatozoides.

[00254] Além disso, a taxa esperada de aborto era superior a 25% para o indivíduo apresentando um endométrio subativado ou superativado.

[00255] Seguindo o método tal como descrito acima, a taxa diminui para 10% (5/50) no grupo de alto risco, sugerindo um controle de desregulações locais. Resultados 2

[00256] Correlação do perfil de receptividade uterina ao longo de dois ciclos.

[00257] Primeiramente quantificou-se e normalizou-se a expressão de mRNA de IL-15, IL-18 entre 39 indivíduos e 37 indivíduos, respectivamente, e a expressão de mRNA de TWEAK entre 15 indivíduos.

[00258] As quantificações normalizadas da expressão de mRNA de IL-15, IL-18 e TWEAK foram altamente correlacionadas ao longo de dois ciclos.

[00259] A correlação de classificação de IL-15 foi de 0,59 p = 0,0001 (Figura 2A).

[00260] A correlação de classificação de IL-18 foi de 0,55 p = 0,0004 (Figura 2B).

[00261] A correlação de classificação para TWEAK foi de 0,72 p = 0,0023 (Figura 2C).

[00262] A fim de verificar que as vias angiogênicas que envolvem a IL-18 e o seu efeito sobre a desestabilização das artérias espiraladas foi o mesmo ao longo dos dois ciclos, também quantificou-se entre dez indivíduos a razão de IL-18/TWEAK, bem como a expressão normalizada de angiopoietina-2.

[00263] IL-18/TWEAK foi altamente correlacionada ao longo de dois ciclos (r = 0,77, p = 0,01), bem como a expressão de RNAm de angiopietina-2 (r = 0,93, p = 0,0001) e expressão de Tie-2.

[00264] Com base nestes resultados, pode-se postular que a exploração de um ciclo é representativa de distúrbios que ocorrem a cada ciclo. Distúrbios são relacionados não com o ciclo em si mas com o perfil local imune do indivíduo. Resultados 3

[00265] No contexto da superativação, muitas vias moleculares e imunes podem estar implicadas e o resultado no final é uma ativação superimune.

[00266] A consequência direta é que o tratamento eficaz para controlar a ativação superimune terá que controlar as vias específicas envolvidas para ser eficaz.

[00267] Neste contexto da superativação, os fármacos candidatos são os seguintes:

[00268] Corticoides (para os seus efeitos anti-inflamatórios),

[00269] Heparinas em dose baixa (para o controle do complemento e os efeitos anti-trombóticos),

[00270] Aspirina em baixa dose (para a prostaglandina anti-, efeito anti- trombótica),

[00271] Intralipídeos (controle do equilíbrio de Th-1/Th-2).

[00272] Como a primeira linha de tratamento é com corticoides neste contexto, foram avaliados o perfil endometrial molecular imune entre 27 pacientes durante dois ciclos antes e depois dos corticoides.

[00273] A resposta ao tratamento foi definida quer por uma normalização da razão de IL-18/Tweak, IL-15/Fn-14 sob corticoides ou definida por uma gravidez evolutiva se nenhuma exploração estava disponível sob corticoides.

[00274] Observou-se em pacientes com ativação superimune endometrial uma resposta eficaz aos corticoides em 15/27 (55%).

[00275] Todos os pacientes com resposta aos corticoides tiveram uma expressão de receptor de G-CSF abaixo do limite de 0,7, enquanto todos os pacientes sem resposta tiveram uma expressão do receptor de G-CSF acima de 0,7 (p > 0,0001) (Figura 3). Resultados 4

[00276] Para otimizar a potencialidade da implantação de pacientes com história de falhas de implantação repetida e inexplicável após IVF-ET (RIF) de acordo com o seu perfil endometrial imune, foi realizado um estudo de Coorte prospectivo, observacional, de 299 pacientes com RIF. A verificação uterina imune para pré- concepção é realizada seguindo-se as recomendações de estratégias personalizadas em caso de superativação ou pobre ativação endometrial. O resultado é a taxa de gravidez que ocorre após a primeira transferência de embriões recentes ou descongelados após a avaliação.

[00277] A biópsia endometrial é realizada na fase lútea do ciclo não -conceptivo com um Pipelle de Cornier®. Em cada amostra, após a datação histológica, foi feita a quantificação da mobilização das células assassinas naturais uterinas (uNK) (imunocoloração de CD56+), a expressão de mRNA endometrial de IL-15 (refletindo o estado de maturação de uNK), de IL-18 (refletindo o ambiente de citocinas Th- 1/Th-2) e de Tweak/Fn-14 (refletindo a imunorregulação local relacionada com TNF) por PCR em tempo real.

[00278] O diagnóstico final definindo o mecanismo que gera falhas de implantação repetidas foi uma dedução de passo a passo levando-se em conta, primeiramente, o ambiente imune de citocinas (IL-18/TWEAK) e em uma segunda etapa, a mobilização e maturidade das células uNK.

[00279] Uma baixa expressão de RNAm de IL-18/TWEAK com ou sem baixa expressão de mRNA de IL-15/Fn-14 e/ou uma baixa mobilização de células uNK define um estado imune de ativação deficiente e um mecanismo putativo de RIF por aderência insuficiente.

[00280] A expressão de mRNA normal de IL-18/TWEAK com baixa expressão de mRNA de IL-15/Fn-14 e/ou uma baixa mobilização de células uNK define um estado imune de ativação deficiente e um mecanismo putativo de RIF por aderência insuficiente.

[00281] A alta expressão de IL-18/TWEAK sozinho define um estado imune superativado.

[00282] Uma expressão normal de IL-18/TWEAK com alta expressão de mRNA de IL-15/Fn-14 e/ou alta mobilização de células uNK define um estado de ativação superimune e um mecanismo putativo de RIF por rejeição do embrião.

[00283] Em caso de ativação deficiente, as recomendações foram para executar uma lesão local no ciclo anterior a tentativa, aplicar uma estimulação ovariana mínima, completar a fase lútea com gonadotrofina coriônica humana e ter relações sexuais. No caso oposto da superativação, as recomendações foram nenhuma lesão local do ciclo anterior, 20 mg de Prednisolona e vitamina E do Dia -1 do ciclo de IVF, alta dose de progesterona (1200 mg, por via vaginal) com estrogênios na fase lútea e nenhuma relação sexual.

[00284] A idade média do coorte (37 anos) foi levada em conta com a faixa média de tentativa anterior (média de 3 tentativas), o número médio de embriões transferidos anteriormente (mais de 6 embriões) de modo que a taxa de gravidez em curso esperada, sem alterar a estratégia na tentativa seguinte, fosse esperada ser de cerca de 20%. Tabela 1 - Resultados preliminares sobre os primeiros 299 resultados

Conclusão: Em 299 pacientes que experimentaram falha de implantação repetida anteriormente, a avaliação imune de pré-concepção (método da invenção) documentou desregulações uterinas imunes em 77% dos pacientes. No grupo em que foi observada a desregulação imune do endométrio, a otimização da receptividade uterina de acordo com o seu perfil endometrial imune (através de tratamentos específicos) aumentou significativamente a taxa de gravidez subsequente (ver Tabela 1). A taxa de gravidez esperada em curso foi de cerca de 20%. Em seguida, observou-se um aumento relativo de mais de 100% entre a taxa de gravidez em curso observada e a esperada quando as pacientes foram classificadas como tendo uma ativação deficiente ou superativação local do endométrio e, em seguida, tratadas em conformidade. Resultados 5

[00285] Para determinar se uma ordem entre os parâmetros avaliados é necessária para definir o mecanismo de falha de implantação, foram selecionadas pacientes com gravidez bem sucedida após a personalização de sua tentativa de IVF de acordo com o seu perfil citocínico endometrial. A ordem de decisão aplicada foi primeiramente considerar o ambiente imune de citocina de IL-18/tweak, em seguida, o recrutamento e maturidade das células uNK: IL-15/Fn-14 e contam de células CD56.

[00286] Em seguida, as pacientes selecionadas com altos níveis de expressão de IL-18/TWEAK (estado superativado), que foram avaliadas sob corticoide como um tratamento de primeira linha com alta ou baixa expressão de IL-15/Fn-14 basal. Nosso objetivo foi analisar a variação subsequente no tratamento com IL-15/Fn-14.

[00287] Enquanto isso, um decréscimo significativo seja observado quando a expressão de IL-15/Fn-14 basal é alta ou normal (> 3) (Figura 4A). Mais de 10 amostras com baixa expressão de IL-15/Fn-14 basal (Figura 4B), uma normalização da razão de IL-15/Fn-14 é observada em 5 casos e a resposta paradoxal foi observada como consequência de uma hiper-expressão em dois casos. Isto pode ser consecutivo à ação dos corticoides na transcrição de IL-15 em si. De fato, um elemento de liberação de córtico está presente na sequência de IL-15. Assim, nestes casos de baixa expressão de mRNA de IL-15 em ambiente citotóxico, a estimulação de CRE por corticoides rompe a regulação local. A expressão de IL-18/TWEAK deve ser primeiramente considerada para personalizar o tratamento subsequente. Portanto, a expressão de IL-15/Fn-14 deve ser considerada na segunda etapa se IL- 18/TWEAK é normal.

[00288] Além disso, 109 casos de gravidez bem-sucedida foram analisados retrospectivamente, a expressão de mRNA de IL-15/Fn-14 com a mobilização de CD56 foi determinada em uma primeira etapa seguido de IL-18/TWEAK. Em 12 casos dos 109, a expressão de mRNA de IL-15/Fn-14 foi baixa (correspondente a um estado imaturo de uNK) enquanto a IL-18/TWEAK era alta sugerindo excesso de citocinas Th-1 no ambiente endometrial. Se IL-15/Fn-14 tivesse sido considerada primeiramente, isso teria levado ao diagnóstico e personalização opostos.

[00289] Em 4 casos dos 109, a expressão do mRNA de IL-15/Fn-14 foi alta (sugerindo um estado de uNK hiper-ativado), enquanto IL-18/TWEAK foi baixa, sugerindo o oposto: a depleção de citocinas Th-2 no ambiente endometrial. Se IL- 15/Fn-14 tivesse sido considerada primeiramente, o diagnóstico oposto seria deduzido.

[00290] No total, seria deduzido um estado endometrial errado e um tratamento errado em 14% dos casos. A IL-18/TWEAK refletindo o ambiente imune das citocinas do endométrio global e o ambiente das citocinas de todas as células imunes (incluindo células T dendríticas e reguladoras) deve ser considerada antes do recrutamento e maturidade das células uNK (ver Figura 1).

Claims (6)

1. Método in vitro para a determinação da receptividade uterina em um indivíduo do sexo feminino durante a janela de implantação no útero pela determinação do estado endometrial do dito indivíduo do sexo feminino, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: determinar, em uma amostra endometrial previamente obtida do dito indivíduo do sexo feminino, o estado endometrial por: a) em uma primeira etapa, medir o estado de atividade de células NK uterinas (uNK), em que o dito estado de atividade de células uNK é determinado através da medição de expressão de IL-18 e Tweak, cálculo de um valor de razão de IL-18/Tweak e comparação do dito valor com um valor de referência; e b) em uma segunda etapa, medir o recrutamento e estado de maturação de células uNK, em que o dito recrutamento de células uNK é determinado por quantificação do número de células uNK CD56+ ou através da medição da expressão de CD56 e comparação do(s) dito(s) valor(es) com valor(es) de referência, e em que o dito estado de maturação de células uNK é determinado através da medição da expressão de IL-15 e Fn14 e cálculo de um valor de razão de IL-15/Fn14 e comparação do dito valor com um valor de referência.

2. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os valores de referência foram obtidos a partir de um indivíduo do sexo feminino fértil.

3. Método in vitro para aumentar a taxa de sucesso de um procedimento de tecnologia de reprodução assistida (ART) em um indivíduo do sexo feminino, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: - determinar a receptividade uterina do dito indivíduo do sexo feminino durante a janela de implantação uterina determinando o estado endometrial de acordo com o método como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Método in vitro para avaliação de um indivíduo do sexo feminino para um procedimento de tecnologia de reprodução assistida (ART), caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: - obter os itens de informação do indivíduo do sexo feminino para fornecer um perfil para o dito indivíduo do sexo feminino, em que os itens de informação são selecionados do grupo consistindo em datação histológica, características do endométrio, idade, etiologia da infertilidade, dados de infertilidade, avaliação hormonal da reserva ovariana e tipo de ART, e em que um dos itens de informação é a receptividade uterina do dito indivíduo do sexo feminino durante a janela de implantação no útero determinando o estado endometrial de acordo com o método como definido na reivindicação 1 ou 2; e - comparar o dito perfil para o dito indivíduo do sexo feminino com a uma biblioteca de padrões de perfil conhecidos por serem indicativos da responsividade a um procedimento de ART com o uso de um algoritmo baseado nos ditos itens de informação.

5. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as características do endométrio são a espessura endometrial, o volume endometrial e/ou a vascularização endometrial.

6. Kit para implementar método como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito kit compreende: - reagentes para medir a expressão de IL-18, IL-15 e CD56, - reagentes para medir a expressão de Tweak e Fn-14, - reagentes para medir a expressão de GCSF-R, - reagentes, opcionalmente, para medir a expressão de genes de referência, e - instruções para realizar o método como definido na reivindicação 1 ou 2.

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