CN104603622B - 用于提高辅助受精中的着床成功率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于确定子宫容受性特征的方法，以提高辅助受精中的着床成功率。

Description

用于提高辅助受精中的着床成功率的方法
技术领域
本发明涉及一种用于确定女性受试者在子宫着床窗期间的子宫容受性特征的方法，从而确定用于所述受试者的个性化治疗以提高着床成功率。
背景技术
辅助受精，如体外受精(IVF)在三十年来已经被成功用于有不孕问题的人类受试者。尽管进行了广泛的研究，但它仍是一种困难且昂贵的程序。实际上，所采集的卵母细胞中不到5％以及所移植的胚胎中仅有20％-25％得以诞生。胚胎能力以及相应的子宫容受性的优化是提高辅助生殖技术(ART)成功率的绝对要求。着床的成功牵涉到容受性子宫内膜与功能性胚泡之间的同步串扰。这种现象只能够在着床窗期间发生，所述着床窗是跨越月经周期(女性)的第19天与第23天之间的自限性子宫内膜容受期。在正常的月经周期中，这是经由卵巢雌激素和孕酮的局部作用来实现的，其诱导子宫内膜中的一系列细胞事件和分子事件，进而产生适当的子宫内膜容受性。
用于确定子宫内膜容受性的方法已在本领域中公开：例如，US7,175,990公开了一种基于测定由子宫上皮细胞产生的L-选择素水平的方法，其中L-选择素水平与对照水平相比升高则表示着床的成功概率提高。EP2348318中公开的另一种用于确定子宫内膜容受性的方法是基于测定子宫内膜液中前列腺素E2或F2α的水平。其它新兴的方法，如子宫内膜容受性阵列(ERA系统)研究了在着床窗期间特异性表达的238种基因(PCT/ES2009/000386)。这些方法只可用于确定子宫内膜对胚胎着床的容受性。
然而，在确定出子宫内膜不适当的容受性的情况下，这些方法对于恢复子宫内膜容受性不起帮助作用。
本申请的发明人已观测到子宫内膜不适当的容受性可以由以下两种不同的状态来解释：欠激活状态或过度激活状态。对子宫内膜状态进行确定，由此允许解释它的非容受性，从而产生适合的并且个性化的治疗以恢复容受性状态。
因此，感兴趣的是提供一种允许确定女性受试者的子宫内膜状态的方法，这一信息可用于对她的治疗进行优化以恢复子宫内膜容受性。
发明内容
本发明的一个目的在于一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容受性特征的方法，所述方法包括：
在子宫内膜样品上通过测量以下各项来确定子宫内膜的状态：
a)子宫NK(uNK)细胞的活性状态的生物标志物，以及
b)子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物，
将所述值与参考值进行比较，
从而确定子宫内膜的状态，所述子宫内膜的状态表明适当的或不适当的子宫容受性。
在一个实施方案中，通过测量IL-18、IL-6以及IL-12表达中的至少一种来确定uNK细胞的活性状态。
在另一个实施方案中，通过测量IL-18和Tweak表达并且计算IL-18/Tweak比率来确定uNK细胞的活性状态。
在另一个实施方案中，通过对CD56+uNK细胞的数目进行定量或通过测量CD56表达来确定uNK细胞的募集。
在另一个实施方案中，通过测量IL-15表达来确定uNK细胞的成熟状态。
在另一个实施方案中，通过测量IL-15和Fn14表达并且计算IL-15/Fn14比率来确定uNK细胞的成熟状态。
在另一个实施方案中，所述参考值是从有生育能力的女性受试者获得的。
本发明的另一个目的在于一种子宫容受性特征，所述子宫容受性特征是基于对以下各项特异的生物标志物进行定量：a)uNK细胞的活性状态；以及b)uNK细胞的募集和成熟状态。
在一个实施方案中，所述子宫容受性特征是基于以下各项的表达：a)IL-18、IL-6以及IL-12中的至少一种；以及b)CD56和IL-15。
在另一个实施方案中，所述子宫容受性特征是通过如本文以上所述的方法获得的。
本发明的另一个目的在于一种用于提高女性受试者的辅助生殖技术(ART)程序的成功率的方法，所述方法包括：
如本文以上所述确定所述受试者在子宫着床窗期间的子宫容受性特征，以及
根据所观测到的所述子宫容受性特征，确定针对所述受试者的个性化建议。
本发明的另一个目的在于一种用于针对辅助生殖技术(ART)程序对女性受试者进行评估的方法，所述方法包括：
‐从所述女性受试者获得信息项以提供针对所述女性受试者的特征，其中每一项信息均与预先选择的受试者变量有关，其中所述变量中的一种是如本文以上所述的子宫容受性特征，
‐使用基于所述预先选择的受试者变量的算法将针对所述女性受试者的所述特征与已知表示对辅助生殖技术程序有响应性的已知特征模式的文库进行比较，
‐其中所述比较针对ART程序提供对所述女性受试者的评估。
在一个实施方案中，所述预先选择的受试者变量包括组织学分期(histologicaldatation)(确定容受窗)；子宫内膜特征(如子宫内膜厚度、子宫内膜容积、子宫内膜血管形成、子宫动脉多普勒)；年龄；不孕的病因；不孕的数据，如先前病史以及移植胚胎的数目和质量的汇总；对卵巢储备的激素评估(AMH、FSH、窦状卵泡计数)；ART的类型(IVF、ICSI、IMSI、授精)。
本发明的另一个目的在于一种用于在针对辅助生殖技术程序对女性受试者进行评估中分析数据的系统，所述系统包括：
-计算环境，
-输入装置，所述输入装置与计算环境连接以从用户接收数据，其中所接收的数据包含来自女性受试者的信息项以提供针对所述女性受试者的特征，其中每一项信息均与预先选择的受试者变量有关，其中所述变量中的一种是如本文以上所定义的子宫容受性特征，
-输出装置，所述输出装置与所述计算环境连接以向所述用户提供信息，以及
-计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质上已存储有至少一种算法以将针对所述女性受试者的所述特征与已知表示对辅助生殖技术程序有响应性的已知特征模式的文库进行比较，其中所述系统提供结果，所述结果可以用于生成在针对辅助生殖技术程序对女性受试者进行评估中提供数据分析的报告。
在一个实施方案中，所述预先选择的受试者变量包括组织学分期(确定容受窗)；子宫内膜特征(如子宫内膜厚度、子宫内膜容积、子宫内膜血管形成、子宫动脉多普勒)；年龄；不孕的病因；不孕的数据，如先前病史以及移植胚胎的数目和质量的汇总；卵巢储备的激素评估(AMH、FSH、窦状卵泡计数)；ART的类型(IVF、ICSI、IMSI、授精)。
本发明的另一个目的在于一种用于实施如本文以上所定义的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
‐用于测量IL-18、IL-6、IL-12中的至少一种的表达以及IL-15和CD56的表达的试剂，
‐任选的用于测量Tweak和Fn-14的表达的试剂，
‐任选的用于测量GCSF-R的表达的试剂，
‐任选的用于测量参考基因的表达的试剂，以及
‐用于实施如本文以上所定义的方法的说明书。
定义
在本发明中，以下术语具有以下含义：
-术语“辅助生殖”指的是用于提高人类或动物的生育力的临床技术和实验室技术，包括但不限于体外受精(IVF)、冷冻胚胎移植(FET)、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内形态选择精子注射(IMSI)、配子输卵管内移植(GIFT)、子宫内授精(IUI)以及合子输卵管内移植(ZIFT)。
-术语“着床失败”指的是通过辅助生殖或经由人工授精产生的几个胚胎未能在接受者受试者的子宫中着床或正常着床。胚胎着床失败病例的实例包括但不限于8胚胎移植后着床失败、4胚胎移植后着床失败、在J5时2胚胎移植后着床失败、或外源性卵母细胞捐赠后移植2个胚胎后着床失败。在一个实施方案中，定义着床失败的被移植而后续着床失败的胚胎的最小量是在第2天或第3天具有最佳形态的至少四个胚胎、在第2天或第3天具有中等形态的六个胚胎或在第5天的2个胚胎。
-术语“卵巢功能不全”指的是年龄小于40岁的女性中卵巢功能丧失。患有这种病症的受试者还表现出对胚胎的生理性排斥反应。这些病症包括但不限于：卵巢早衰、高促性腺素性功能减退症、性腺发育不全、过早绝经、或早停经。
-术语“子宫着床窗”指的是在排卵后约4至5天时开始并且持续约4天的非常短的一段时间。这种被定义为着床窗的窗限定了月经周期中子宫对胚胎具有容受性的时间段。在中期黄体期的期间，为成功妊娠所需的子宫重塑事件在着床之前起始于子宫内膜的蜕膜化，所述子宫内膜的蜕膜化甚至在人体内不存在受精了的孕体的情况下也会发生。
-术语“受试者”指的是哺乳动物，优选地雌性哺乳动物，更优选地女性人类。在一个实施方案中，所述受试者指的是经历着床失败的女性。在另一个实施方案中，所述受试者指的是患有卵巢功能不全的女性。
-如本文所用的术语“参考值”广泛地涵盖可被用作基准以相对于测量变量进行比较的任何合适的值。优选地，所述参考值是从有生育能力的女性受试者获得的。
-术语“表达”可互换地指基因的表达，所述表达包括所述基因的转录物、mRNA、这些RNA转录物的多肽翻译产物，无论是否对这种产物进行转录后修饰；或基因产物的表达，所述基因产物包括编码的多肽或蛋白质。基因产物的表达可例如通过使用一种或多种与多肽结合的抗体进行免疫测定法来测定。或者，基因的表达可通过例如以RT-PCR、qPCR测量mRNA水平来测定。
-术语“归一化的水平”指的是相对于参考基因表达水平的基因表达水平。
具体实施方式
如实施例中所示，当仅利用以下各项中一项的测定时，所检查的女性中有超过40％被分类为呈现出正常的子宫内膜状态或适当的子宫容受性特征：(1)子宫NK细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态；(2)子宫NK细胞的成熟状态；或(3)子宫NK细胞的募集状态。
当实施本发明的方法时，本申请的发明人已发现在如通过仅利用子宫NK细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态的测定所确定的、被分类为呈现出正常的子宫内膜的42％的受试者当中，有几乎25％实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
此外，在如通过仅利用子宫NK细胞的成熟状态的测定所确定的、被分类为呈现出正常的子宫内膜的43％的受试者当中，有几乎75％实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
此外，在如通过仅利用子宫NK细胞的募集状态的测定所确定的、被分类为呈现出正常的子宫内膜的47％的受试者当中，有80％实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
因此需要一种允许更准确地确定子宫内膜状态的方法，从而允许原本会被认为“正常”的女性得益于个性化的并且优化的治疗以恢复子宫内膜容受性并且因此提高她们获得发展性妊娠(evolutive pregnancy)或活产的机会。
本发明旨在通过确定子宫内膜的状态来确定子宫/子宫内膜的容受性以对治疗进行优化以恢复子宫容受性。
本发明的一个目的在于一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容受性特征的方法，所述方法包括：
在子宫内膜样品上通过测量以下各项来确定子宫内膜的状态：
a)子宫自然杀伤(uNK)细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态的生物标志物，以及
b)子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物，
将所述值与参考值进行比较，
从而确定子宫内膜的状态，所述子宫内膜的状态表明适当的或不适当的子宫容受性。
将受试者的子宫内膜状态区分成以下三种特定的状态：(1)欠激活状态、(2)正常状态、以及(3)过度激活状态，允许将受试者分成两个类别：适当的子宫容受性(正常的子宫内膜状态)和不适当的子宫容受性，后者被分成两个亚类：不存在容受性(欠激活的子宫内膜状态)和异常的容受性(过度激活的子宫内膜状态)。
将受试者区分成这三个类别，由此允许对她们的治疗进行监测以恢复适当的子宫内膜容受性，从而提高成功率并且对ART程序进行优化。
因此，本发明的一个目的在于一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容受性特征的方法，所述方法包括：
在子宫内膜样品上通过测量以下各项来确定子宫内膜状态：
a)子宫自然杀伤(uNK)细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态的生物标志物，
b)子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物，以及
c)将所述值与参考值进行比较，
从而将受试者的子宫内膜状态区分成以下三种特定的状态：(1)欠激活状态、(2)正常状态、以及(3)过度激活状态，这允许将受试者分成两个类别：适当的子宫容受性(正常的子宫内膜状态)和不适当的子宫容受性，后者被分成两个亚类：不存在容受性(欠激活的子宫内膜状态)和异常的容受性(过度激活的子宫内膜状态)。
在一个实施方案中，所述子宫内膜样品是子宫内膜活检。
如本文所用的uNK细胞的活性状态指的是在周围的子宫内膜细胞上的外部uNK细胞的活性状态。
如本文所用的细胞因子子宫内膜环境的活性状态指的是在周围的子宫内膜细胞上的免疫细胞的活性状态。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞的活性状态或细胞因子子宫内膜环境的活性状态是通过测量以下生物标志物中的至少一种的表达水平来确定的：IL-18、IL-6以及IL-12。
在一个实施方案中，IL-18、IL-6或IL-12的表达水平可以通过估算蛋白质的量或对应于编码IL-18、IL-6或IL-12的基因的核酸的量(例如像RNA的量)来测量。在一个实施方案中，可以相对于参考基因产物的水平将所述水平归一化，所述参考基因产物例如像RPL-13A、β-2微球蛋白或tata盒蛋白TBP。在另一个实施方案中，可以相对于参考基因的至少两种产物的几何平均水平将所述水平归一化。在另一个实施方案中，所述参考基因不是肌动蛋白和GAPDH。
如本文所用的术语“IL-6”指的是白细胞介素6；术语“IL-12”指的是白细胞介素12并且术语IL-18指的是白细胞介素18。
用于测量样品中IL-6、IL-12或IL-18的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于生物测定法，例如像ELISA、Luminex法(例如像使用来自伯乐公司(Biorad)的检测试剂盒(Bioplex pro人类细胞因子)进行的Luminex法)、RT-PCR、RT-qPCR、PCR、qPCR、实时PCR、实时qPCR、DNA芯片等；以及免疫测定法，例如像FloCytomix技术(Biosource公司)或BD流式微球芯片(Cytometric Beads Array，BD生物科技公司(BDBioscience))。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞的活性状态或细胞因子子宫内膜环境的活性状态是通过测量生物标志物IL-18和Tweak的表达水平并且计算IL-18/Tweak比率来确定的。
如本文所用的术语“Tweak”指的是由TNFSF12基因编码的蛋白质。
用于测量样品中Tweak的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于生物测定法，例如像ELISA、RT-PCR、RT-qPCR、PCR、qPCR、实时PCR、实时qPCR、DNA芯片等；以及免疫测定法，例如像FloCytomix技术(Biosource公司)或BD流式微球芯片(BD生物科技公司)。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞的募集是通过对uNK细胞的数目进行定量来确定的。
uNK细胞的数目可以通过测定CD56+子宫细胞的数目来定量。可以通过冷冻切片或石蜡固定的切片的免疫组织化学法，利用抗CD56抗体鉴定NK细胞染色，来对所述数目进行测定。在一个实施方案中，在40倍视野中对CD56+细胞进行计数。在另一个实施方案中，在四个40倍视野中对CD56+细胞进行计数，然后计算平均数。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞的募集是通过测量CD56的表达水平来确定的。
在本发明的一个实施方案中，测量CD56的表达水平是任选的。
用于测量样品中CD56的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于生物测定法，例如像ELISA、RT-PCR、RT-qPCR、PCR、qPCR、实时PCR、实时qPCR、DNA芯片等；以及免疫测定法，例如像FloCytomix技术(Biosource公司)或BD流式微球芯片(BD生物科技公司)。
如本文所用的术语“CD56+细胞”指的是表达CD56的细胞，所述CD56也被称为NCAM(神经细胞粘附分子)。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞的成熟状态是通过测量以下生物标志物的表达水平来确定的：IL-15。
在一个实施方案中，IL-15的表达水平可以通过估算蛋白质的量或对应于编码IL-15的基因的核酸的量(例如像RNA的量)来测量。在一个实施方案中，可以相对于参考基因产物的水平将所述水平归一化，所述参考基因产物例如像RPL-13A、β-2微球蛋白或tata盒蛋白TBP。在另一个实施方案中，可以相对于参考基因的至少两种产物的几何平均水平将所述水平归一化。在另一个实施方案中，所述参考基因不是肌动蛋白和GAPDH。
如本文所用的术语“IL-15”指的是白细胞介素15。
用于测量样品中IL-15的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于生物测定法，例如像ELISA、Luminex法(例如像使用来自伯乐公司的检测试剂盒(Bioplex pro人类细胞因子)进行的Luminex法)、RT-PCR、RT-qPCR、PCR、qPCR、实时PCR、实时qPCR、DNA芯片等；以及免疫测定法，例如像FloCytomix技术(Biosource公司)或BD流式微球芯片(BD生物科技公司)。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞的成熟状态是通过测量以下生物标志物的表达水平：IL-15和Fn-14，并且计算IL-15/Fn14比率来确定的。
如本文所用的术语“Fn14”指的是诱导型成纤维细胞生长因子-14，它是Tweak的受体。
用于测量样品中Fn-14的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于生物测定法，例如像ELISA、Luminex法、RT-PCR、RT-qPCR、PCR、qPCR、实时PCR、实时qPCR、DNA芯片等；以及免疫测定法，例如像FloCytomix技术(Biosource公司)或BD流式微球芯片(BD生物科技公司)。
在一个实施方案中，参考值可以与来源于群体研究的数字或值有关，所述群体研究包括而不限于所述具有相似的年龄范围的此类受试者、属于相同或相似的民族的受试者、或处于胚胎着床失败的受试者、或正经受卵巢功能不全的受试者。
本发明的一个目的在于一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容受性特征的方法，所述方法包括：
在子宫内膜样品上通过以下步骤来确定子宫内膜的状态：
a)测量：子宫自然杀伤(uNK)细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态的生物标志物、以及子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物，
b)基于IL-18/Tweak比率的测定，通过将所述值与参考值进行比较来将子宫内膜的状态分类，
c)如果在步骤b)中将子宫内膜的状态分类为正常状态，那么基于IL-15/Fn14比率的测定值以及任选的CD56的测定，通过将所述值与参考值进行比较来将子宫内膜的状态分类，
从而确定子宫内膜的状态，所述子宫内膜的状态表明适当的或不适当的子宫容受性。
如实施例中所示，如果首先考虑将IL15/Fn14比率用于对子宫内膜的状态进行分类，那么在14％的病例中的诊断是不适当的。
在本发明的一个实施方案中，参考值可以源自于在来源于基本上健康的一个或多个受试者的至少一种对照样品中对以下生物标志物的水平的测量：IL-18、IL-6、IL-12、IL-15、G-CSF受体；或对IL-18/Tweak比率或IL-15/Fn-14比率的计算；或对uNK细胞数目的测定。如本文所用的“基本上健康的受试者”指的是尚未经历过着床失败的受试者、或被认为是有生育能力的受试者的受试者、或具有正常的子宫内膜状态的受试者。
在本发明的另一个实施方案中，参考值可以源自于在来源于具有欠激活或过度激活的子宫内膜状态的一个或多个受试者的至少一种对照样品中对以下生物标志物的水平的测量：IL-18、IL-6、IL-12、IL-15、G-CSF受体；或对IL-18/Tweak比率或IL-15/Fn-14比率的计算；或对uNK细胞数目的测定。
在本发明的一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)基于对uNK细胞或对细胞因子子宫内膜环境的活性状态值的测定对子宫内膜的状态进行分类，
b)如果在a)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对uNK细胞募集的测定对子宫内膜的状态进行分类，
c)如果在b)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于针对uNK细胞的募集和uNK细胞的成熟状态所获得的值的组合对子宫内膜的状态进行分类。
本发明的一个目的在于一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容受性特征的方法，所述方法包括：
在子宫内膜样品上通过以下步骤来确定子宫内膜的状态：
a)测量子宫自然杀伤(uNK)细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态的生物标志物，
b)通过将所述值与参考值进行比较来将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，
c)如果在b)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么测量子宫NK细胞的募集和/或成熟状态的生物标志物，
d)基于uNK细胞募集和/或成熟的测定，通过将所述值与参考值进行比较来对子宫内膜的状态进行分类。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)基于对IL-18/Tweak比率值的测定对子宫内膜的状态进行分类，
b)如果在a)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对CD56+uNK细胞的数目或对CD56表达水平的测定对子宫内膜的状态进行分类，
c)如果在b)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于针对CD56+uNK细胞的数目或针对CD56表达水平所获得的值和IL-15/Fn-14比率值的组合对子宫内膜的状态进行分类。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)测量作为子宫自然杀伤(uNK)细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态的生物标志物的IL-18/Tweak比率值，
b)通过将所述值与参考值进行比较来将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，
c)如果在b)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么测量作为子宫NK细胞的募集和/或成熟状态的生物标志物的IL-15/Fn-14比率值，
d)通过将所述值与参考值进行比较来将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)基于对uNK细胞的成熟状态值的测定将子宫内膜的状态分类，
b)如果在a)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对uNK细胞募集的测定对子宫内膜的状态进行分类，
c)如果在b)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对uNK细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态值的测定对子宫内膜的状态进行分类。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)基于对IL-15/Fn-14比率值的测定对子宫内膜的状态进行分类，
b)如果在a)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对CD56+uNK细胞的数目或对CD56表达水平的测定对子宫内膜的状态进行分类，
c)如果在b)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对IL-18/Tweak比率值的测定对子宫内膜的状态进行分类。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)基于对uNK细胞的成熟状态值的测定将子宫内膜的状态分类，
b)如果在a)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对uNK细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态值的测定对子宫内膜的状态进行分类，
c)如果在b)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对uNK细胞募集的测定对子宫内膜的状态进行分类。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)基于对IL-15/Fn-14比率值的测定对子宫内膜的状态进行分类，
b)如果在a)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对IL-18/Tweak比率值的测定对子宫内膜的状态进行分类，
c)如果在b)中不能将子宫内膜的状态分类为欠激活或过度激活状态，那么基于对CD56+uNK细胞的数目或对CD56表达水平的测定对子宫内膜的状态进行分类。
在本发明的另一个实施方案中，还可以测定子宫内膜中G-CSF受体的表达水平。
如本文所用的术语“G-CSF受体”指的是粒细胞-集落刺激因子受体。
用于测量样品中G-CSF受体的水平的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于生物测定法，例如像ELISA、Luminex法、RT-PCR、RT-qPCR、PCR、qPCR、实时PCR、实时qPCR、DNA芯片等；以及免疫测定法，例如像FloCytomix技术(Biosource公司)或BD流式微球芯片(BD生物科技公司)。
对G-CSF受体水平的测定使得将受试者分成以下两个组：对肾上腺皮质激素有响应的和对肾上腺皮质激素无响应的。
在本发明的一个实施方案中，如本文以上所述的方法可以进一步包括以下步骤，在该步骤中，基于G-CSF受体的表达将受试者在对肾上腺皮质激素有响应与对肾上腺皮质激素无响应之间进行分类。优选地，当呈现出过度激活的子宫内膜时，将受试者分到这两个组中的一组中。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)低于0.5倍的uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态参考值(优选地IL-18/Tweak比率参考值)则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)低于0.45倍、0.4倍、0.35倍、0.3倍、0.25倍、0.2倍、0.15倍、0.1倍的uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态参考值(优选地IL-18/Tweak比率参考值)则表明欠激活的子宫内膜状态。
在所述实施方案中，所述参考值是从基本上健康的受试者获得的。
在本发明的一个实施方案中，uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)高于1.8倍的uNK活性状态的参考值(优选地IL-18/Tweak比率的参考值)则表明过度激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)高于2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、75倍、100倍的uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态参考值(优选地IL-18/Tweak比率的参考值)则表明过度激活的子宫内膜状态。
在所述实施方案中，所述参考值是从基本上健康的受试者获得的。
在本发明的一个实施方案中，uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)为0.5倍至1.8倍的uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态参考值(优选地IL-18/Tweak比率的参考值)，并且CD56+uNK细胞的数目少于每个视野10个则表明欠激活的子宫内膜状态。
在所述实施方案中，所述参考值是从基本上健康的受试者获得的。
在本发明的一个实施方案中，uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)为0.5倍至1.8倍的uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态参考值(优选地IL-18/Tweak比率的参考值)，并且CD56+uNK细胞的数目为每个视野10个至70个，并且uNK细胞成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)低于0.3倍的uNK细胞成熟状态的参考值(优选地IL-15/Fn-14比率的参考值)则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)低于0.25倍、0.2倍、0.15倍、0.1倍的uNK细胞成熟状态的参考值(优选地IL-15/Fn-14比率的参考值)则表明欠激活的子宫内膜状态。
在所述实施方案中，所述参考值是从基本上健康的受试者获得的。
在本发明的一个实施方案中，uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)为0.5倍至1.8倍的uNK活性状态的参考值(优选地IL-18/Tweak比率的参考值)，并且CD56+uNK细胞的数目为每个视野10个至70个的范围，并且uNK细胞成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)高于2倍的uNK细胞成熟状态的参考值(优选地IL-15/Fn-14比率的参考值)则表明因uNK细胞过度激活的过度激活状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)高于2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、75倍、100倍的uNK细胞成熟状态的参考值(优选地IL-15/Fn-14比率的参考值)则表明过度激活的子宫内膜状态。
在所述实施方案中，所述参考值是从基本上健康的受试者获得的。
在本发明的一个实施方案中，uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)为0.5倍至1.8倍的uNK或细胞因子子宫内膜的活性状态参考值(优选地IL-18/Tweak比率的参考值)，并且CD56+uNK细胞的数目多于每个视野70个，并且uNK细胞成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)高于2倍的uNK细胞成熟状态的参考值(优选地IL-15/Fn-14比率的参考值)则表明因uNK细胞过度激活所致的过度激活状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)高于2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、75倍、100倍的uNK细胞成熟状态的参考值(优选地IL-15/Fn-14比率的参考值)则表明过度激活的子宫内膜状态。
在所述实施方案中，所述参考值是从基本上健康的受试者获得的。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)低于0.03则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)低于0.025、0.02、0.015、0.01、0.005则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)高于0.11则表明过度激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞或细胞因子子宫内膜的活性状态值(优选地IL-18/Tweak比率值)高于0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞的募集值(优选地CD56+uNK细胞的数目)少于每个视野10个则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞的募集值(优选地CD56+uNK细胞)的数目少于每个视野9个、8个、7个、6个、5个、3个、2个、1个则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞的募集值(优选地CD56+uNK细胞的数目)为每个视野10个至70个，并且uNK细胞的成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)低于0.3则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞的募集值(优选地CD56+uNK细胞的数目)为每个视野10个至70个，并且uNK细胞的成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)低于0.25、0.2、0.15、0.1、0.05则表明欠激活的子宫内膜状态。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞的募集值(优选地CD56+uNK细胞的数目)为每个视野10个至70个，并且uNK细胞的成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)高于2则表明过度激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞的募集值(优选地CD56+uNK细胞的数目)为每个视野10个至70个，并且uNK细胞的成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)高于2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、20则表明过度激活的子宫内膜状态。
在本发明的一个实施方案中，uNK细胞的募集值(优选地CD56+uNK细胞的数目)多于每个视野70个并且uNK细胞的成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)高于2则表明过度激活的子宫内膜状态。
在本发明的另一个实施方案中，uNK细胞的募集值(优选地CD56+uNK细胞的数目)多于每个视野70个并且uNK细胞的成熟状态值(优选地IL-15/Fn-14比率值)高于2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、20则表明过度激活的子宫内膜状态。
在一个实施方案中，G-CSF受体值高于0.7则表明受试者对肾上腺皮质激素无响应。
在另一个实施方案中，G-CSF受体值低于或等于0.7则表明受试者对肾上腺皮质激素有响应。
在另一个实施方案中，G-CSF受体值并不表明受试者对肾上腺皮质激素的响应性。
本发明的另一个目的在于一种子宫容受性特征，其中所述特征是基于在子宫着床窗期间所获得的子宫内膜样品中a)子宫NK(uNK)细胞或细胞因子子宫内膜环境的活性状态，以及b)子宫NK细胞的募集和成熟状态。
在一个实施方案中，所述子宫容受性特征是基于IL-18、IL-6或IL-12中的至少一种的表达水平，优选地IL-18的表达水平，以及IL-15和CD56的表达水平。
在另一个实施方案中，所述子宫容受性特征是基于IL-18、IL-6或IL-12中的至少一种的表达水平，优选地IL-18的表达水平，以及IL-15的表达水平和CD56+uNK细胞的数目。
在另一个实施方案中，所述子宫容受性特征是基于IL-18/Tweak和IL-15/Fn14的比率值以及CD56的表达水平。
在另一个实施方案中，所述子宫容受性特征是基于IL-18/Tweak和IL-15/Fn14的比率值以及CD56+uNK细胞的数目。
在一个实施方案中，所述子宫容受性特征是基于对子宫内膜状态的相续确定，所述相续确定首先基于IL-18/Tweak的比率值，然后基于IL-15/Fn14的比率值。
在一个实施方案中，所述子宫容受性特征是根据本文以上所述的方法而获得的。
在一个实施方案中，基于对子宫内膜状态的确定(正常状态、欠激活状态或过度激活状态)将所述子宫容受性特征在适当的子宫容受性或不适当的子宫容受性(不存在容受性或异常的容受性)之间进行分类。
本发明的另一个目的在于一种用于提高女性受试者的辅助生殖技术(ART)程序的成功率的方法，所述方法包括：
-如本文以上所述确定子宫容受性特征，以及
-根据所观测到的子宫容受性特征，确定针对所述受试者的个性化建议。
本发明的另一个目的在于一种用于提高女性受试者的辅助生殖技术(ART)程序的成功率的方法，所述方法包括：
-如本文以上所述确定所述受试者在子宫着床窗期间的子宫内膜状态，以及
-根据所观测到的子宫内膜状态，确定针对所述受试者的个性化建议。
在本发明的一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是欠激活状态或子宫容受性特征因不存在容受性而是不适当的，可以建议在IVF周期之前在黄体期内通过经由子宫内膜活检造成局部损伤来对子宫内膜进行机械刺激。不希望受理论所束缚，所述局部损伤可以诱导免疫细胞和促炎性细胞因子，以通过更好的粘附作用为未来的着床准备好土壤。
在本发明的另一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是欠激活状态或子宫容受性特征由于不存在容受性而是不适当的，可以建议降低激素刺激的水平以减少子宫内膜细胞对高浓度的雌二醇的暴露。这意味着例如在IVF的情况下降低FSH单位数以触发排卵(在触发排卵当天在血液中所测量的雌二醇水平应当低于1500pg/ml)或在监测的自然周期(而不是照例经由雌激素和孕酮的替代周期)中置换解冻后的冷冻胚胎。不希望受理论所束缚，在自然周期中最低限度的刺激或置换将会削弱已经存在的局部欠激活状态的加剧。出于同样的原因，在胚胎置换后在黄体期期间将不以补充方式引入雌激素。
在本发明的另一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是欠激活状态或子宫容受性特征由于不存在容受性而是不适当的，可以建议在着床窗期间通过施用人绒毛膜促性腺激素(HCG)来刺激免疫耐受性、血管生成以及uNK细胞的增殖。举例来说，可以在采卵后的4天、6天以及8天时(IVF)或在排卵高峰(ovulation surge)后的6-8-10天时(在自然周期中置换冷冻胚胎)注射1500IU的HCG。不希望受理论所束缚，HCG将极大地影响免疫耐受性，母胎界面处的血管生成，并经由甘露糖受体结合牵涉到uNK细胞的动员。具体地说，HCG将通过子宫内膜上皮细胞诱导VEGF产生，增强内皮细胞增殖和平滑肌细胞的迁移，从而使得血管成熟。
在本发明的另一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是欠激活状态或子宫容受性特征由于不存在容受性而是不适当的，建议在胚胎移植后进行性交。不希望受理论所束缚，精浆可以在通过对调节性T细胞的募集和激活进行调节而准备土壤以履行它着床的使命中起作用。
在本发明的一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是过度激活状态或子宫容受性特征由于异常的容受性而是不适当的，建议在胚胎着床前的周期期间无局部损伤。
在本发明的另一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是过度激活状态或子宫容受性特征由于异常的容受性而是不适当的，建议高水平的卵巢刺激以允许子宫内膜细胞对雌二醇的高水平暴露。
举例来说，在IVF的情况下，将使用正常剂量的FSH来触发超数排卵，旨在采集9至12个卵母细胞(FSH的初始剂量将是225IU至400IU)。在置换冷冻胚胎的情况下，将利用经由雌激素和孕酮的替代。为了提高雌激素的局部浓度，建议经阴道施用途径(雌二醇2mg，1丸，每天三次，经阴道)。最终，在黄体期中，在胚胎移植后，可以维持雌二醇的处方(雌二醇2mg，1丸，每天三次，口服或经阴道)。
在本发明的另一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是过度激活状态或子宫容受性特征由于异常的容受性而是不适当的，建议在采卵后给予高剂量的孕酮(例如400mg，每天三次，经阴道)。
在本发明的另一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是过度激活状态或子宫容受性特征由于异常的容受性而是不适当的，将建议从刺激开始时给予旨在控制促炎性局部环境的药物。所述药物的选择将取决于如本文以上所述基于G-CSF受体的表达水平的对肾上腺皮质激素有响应性的确定。
举例来说，如果受试者对肾上腺皮质激素有响应，那么可以从IVF周期的周期第一天开始施用皮质类固醇直到妊娠检查为止(所要施用的皮质类固醇的实例是泼尼松，20mg，从第1天到妊娠检查当天)。如果受试者对肾上腺皮质激素无响应，那么可以施用低剂量的乙酰水杨酸与低分子量肝素(如依诺肝素(Lovenox)，0.4，采卵当天至妊娠检查当天)的组合。在受试者对肾上腺皮质激素无响应时，治疗的另一个实例是使用脂肪乳剂(intralipid)。脂肪乳剂已经被主要研究用来控制来自血液的外周NK细胞的细胞毒性，但初步结果表明其控制子宫NK细胞的细胞毒性并且对调节性T细胞进行免疫调节。在一个实施方案中，在胚胎移植之前的7-14天将100ml的脂肪乳剂以20％溶解于500cc的生理盐水中。优选地，500mL的输注时间不得短于2小时。该治疗可以在阳性妊娠检查的情况下重复，然后每月施用一次直到第12周为止。
在本发明的另一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是过度激活状态或子宫容受性特征由于异常的容受性而是不适当的，将向受试者施用治疗有效量的抗氧化剂。可以向受试者施用的抗氧化剂的实例是TOCO，500mg，每天2丸，从第1天开始直到妊娠检查当天为止。
在本发明的另一个实施方案中，其中如本文以上所述所确定的子宫内膜状态是过度激活状态或子宫容受性特征由于异常的容受性而是不适当的，建议在胚胎移植后不性交。
本发明还旨在提供用于有助于对临床不孕症进行评估的方法和基于计算机的系统。所述方法和系统可以被实施以有助于针对体外受精治疗或辅助生殖技术程序对受试者进行评估。确切地说，所述方法和系统可以被实施以有助于对受试者的子宫容受性进行评估并且随后针对所述受试者的体外受精提供个性化的治疗。
在一个实施方案中，所述方法包括从女性受试者获得信息项以提供针对所述女性受试者的特征，其中每一项信息均与预先选择的受试者变量有关；使用基于预先选择的受试者变量的算法将针对所述女性受试者的所述特征与已知表示对体外受精程序有响应性的已知特征模式的文库进行比较，其中所述比较针对体外受精程序提供对所述女性受试者的评估，特别是对所述女性受试者的子宫容受性的评估，以针对所述受试者的体外受精提供个性化的治疗。在一个实施方案中，所述变量中的一种是如本文以上所定义的子宫容受性特征。在另一个实施方案中，所述变量中的一种是如本文以上所定义的子宫内膜状态。
在一个实施方案中，所述信息项可以由女性受试者基于书面问卷或电子问卷来提供或可以由卫生保健的从业者(如医生、护士、技术人员等)来询问、抄录或以其它方式记录。
与预先选择的受试者变量有关的示例性信息项包括但不限于：组织学分期(以确定受试者处在容受窗期)；受试者的特征，如年龄、先前不孕症病史、临床诊断；子宫内膜的特征，如子宫内膜的厚度、子宫内膜的容积、子宫内膜的血管形成、子宫动脉多普勒；不孕的病因、临床治疗信息，如药物的类型、刺激的天数、卵母细胞数等；常规的胚胎形态学数据，如所移植的胚胎的数目和质量、发育阶段、等级等；卵巢储备的评价，如3天促卵泡激素(FSH)水平、3天抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)水平、第3天的窦状卵泡计数；体质指数、多囊卵巢病、伴有精子形态分析(spermocytogram)的精液分析(spermogram)、不明原因的女性不孕症、自然流产的次数、年份、女性不孕症的其它原因、先前妊娠的次数、先前足月分娩的次数、子宫内膜异位症、输卵管疾病、输卵管结扎、男性不育症、子宫肌瘤、输卵管积液、以及男性不育症的病因。
在另一个实施方案中，所述方法包括获得与至少如本文以上所述确定子宫内膜状态所需的变量或更多变量有关的信息项。因而，在其它实施方案中，所述方法包括获得与所述变量以及至少一个额外变量，包括2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个变量等有关的信息项。
优选地，除了子宫内膜的状态和/或子宫容受性特征之外，所述方法还包括获得下组的信息项：组织学分期(确定容受窗)；子宫内膜特征(例如像子宫内膜的厚度、子宫内膜的容积、子宫内膜的血管形成、子宫动脉多普勒)；受试者的年龄；不孕症的病因；不孕症的数据，如先前病史以及所移植的胚胎的数目和质量的汇总；对卵巢储备的激素评价(AMH、FSH、窦状卵泡计数)；ART的类型(IVF、ICSI、IMSI、授精)。
在另一个实施方案中，所述方法包括相关于其它预先选择的受试者变量，将加权的相对重要性分配给每一种预先选择的受试者变量。
在一些实施方案中，所述比较包括应用决策规则。在一些实施方案中，数据分析算法包括使用分类树。在其它实施方案中，数据分析算法是非参数的，如使用威氏符号秩次检验(Wilcoxon Signed Rank Test)。在某些实施方案中，数据分析算法检测特征值分布的差异。在一些实施方案中，数据分析算法包括使用多重累计回归树。在一些实施方案中，数据分析算法是逻辑回归。
一种分析这一数据的方法在于使用分类树算法，所述分类树算法在大型数据集中搜索模式和关系。“分类树”是一种递归分割以使用被设计成将受试者准确地归为一种类别的一系列问题针对体外受精程序对女性受试者进行评估。每一个问题均会询问受试者的条件是否满足给定的预测因子，其中使用每一个答案将用户沿分类树向下引导直到可以确定所述受试者所属的类别为止。如本文所用的“预测因子”是例如像uNK或细胞因子子宫内膜环境的活性状态或uNK成熟和募集状态等特征的值的范围。
如上文所述，通过从女性受试者获得信息项并且使用基于所述预先选择的受试者变量的算法将所述信息项与已知表示对体外受精程序有响应性的已知特征模式的文库进行比较来针对体外受精程序对女性受试者进行评估，包括确定她的子宫容受性。在一些实施方案中，对受试者的评估以报告的形式提供。因此，在一些实施方案中，所述方法进一步包括制备或生成报告的步骤，所述报告包括关于受试者的体外受精程序的成功可能性的一项或多项信息以及如本文以上所述的对个性化治疗的一种或多种建议。举例来说，主题方法可以进一步包括生成或输出报告的步骤，所述报告提供受试者评估的结果，该报告可以电子介质(例如计算机监视器上的电子显示)的形式，或以有形介质(例如印在纸或其它有形介质上的报告)的形式提供。
该报告还可以包括关于检查机构的一项或多项信息，所述信息与进行样品采集和/或数据生成的医院、诊所或实验室有关。这一信息可以包括与例如以下各项有关的一个或多个详情：检查机构的名称和地址、进行测定和/或录入输入数据的实验室技术人员的身份、进行和/或分析测定的日期和时间、样品和/或所得数据存储的位置、用于测定的试剂(例如试剂盒等)的批号等。所述报告还可以包括与服务提供方、受试者数据以及样品数据有关的一项或多项信息。
该报告的解读性报告部分包括在如本文所述对数据进行处理后生成的信息。该解读性报告可以包括针对体外受精程序对女性受试者的评估。该解读性报告可以包括例如基于如上文所述所获得的数据对子宫容受性的解读以及任选的针对体外受精的个性化治疗的一种或多种建议。
本文所述的方法和系统可以多种方式实施。在特别关注的一个实施方案中，所述方法包括使用通信基础结构，例如互联网。本发明的若干个实施方案论述于下文中。还应当了解的是，本发明可以各种形式的硬件、软件、固件、处理器或其组合来实施。本文所述的方法和系统可以硬件和软件的组合实施。所述软件可以作为在程序存储装置上有形地体现的应用程序被实施，或软件的不同部分可以(例如作为小程序)在用户的计算环境中以及在审核人员的计算环境上被实施，其中所述审核人员可以位于相关的远程站点(例如位于服务提供方的机构)。
计算装置的各种元件(如输入装置)可以经由有线连接或无线连接与所述系统的其它元件相关联，所述无线连接包括例如无线LAN连接、蓝牙连接协议、ZigBee连接协议、射频连接协议或蜂窝电话连接协议，包括码分多址(CDMA)或经由全球移动通信系统(GSM)。
用于执行本文所述的算法的应用程序可以上载到包括任何合适的构造的机器上并且通过所述机器执行。一般来说，所述机器包括具有硬件的计算机平台，所述硬件如一个或多个中央处理单元(CPU)、随机存取存储器(RAM)、以及一个或多个输入/输出(I/O)接口。所述计算机平台还包括操作系统和微指令代码。本文所述的各种方法和功能可以是经由操作系统执行的微指令代码的一部分或应用程序的一部分(或其组合)。此外，各种其它外围装置可以连接到所述计算机平台，如另外的数据存储装置和打印装置。
输入数据和输出数据的一部分或全部还可以电子方式传送；某些输出数据(例如报告)可以电子方式或以电话方式传送(例如通过传真，例如使用诸如传真回复系统(faxback)之类的装置)。示例性输出接收装置可以包括显示元件、打印机、传真装置等。传输和/或显示的电子形式可以包括电子邮件、交互式电视等。在特别关注的一个实施方案中，输入数据的全部或一部分和/或输出数据的全部或一部分(例如通常至少是最终报告)被保持在Web服务器上用于以典型的浏览器访问，优选地机密访问。所述数据可以根据需要被卫生保健的专业人员访问或发送给卫生保健的专业人员。包括最终报告的全部或一部分在内的输入数据和输出数据可以被用于构成受试者的医疗记录，所述医疗记录可以存在于医疗保健机构的机密数据库中。
用于本文所述的方法中的系统一般包括至少一个计算机处理器(例如当在单一站点整体执行所述方法时)或至少两个联网计算机处理器(例如当数据将由用户输入并且被传输到远程站点的第二计算机处理器以进行分析时，其中第一计算机处理器和第二计算机处理器通过网络，例如经由内部网或互联网连接)。所述系统还可以包括用于输入的一个或多个用户组件；以及用于审核数据、生成报告以及人工干预的一个或多个审核人员组件。所述系统的其他组件可包括一个或多个服务器组件；以及用于存储数据的一个或多个数据库。计算机处理器可以是通常存在于个人台式计算机(例如IBM、Dell、Macintosh)、便携式计算机、主机、小型计算机、或其它计算装置中的处理器，所述其它计算装置如智能手机装置(Smartphone device)，包括例如Apple(R)iPhone(R)装置。
联网客户端/服务器架构可以根据需要加以选择，并且可以是例如经典的两层或三层客户端服务器模型。关系数据库管理系统(RDMS)作为应用服务器组件的一部分或作为单独的组件(RDB机)提供通向数据库的接口。
在一个实施方案中，提供作为以数据库为中心的客户端/服务器架构的架构，其中客户端应用程序一般从应用服务器请求服务，所述应用服务器向数据库(或数据库服务器)发出请求以根据需要用各种报告要素，特别是解读性报告要素，尤其是解读文本和警示构成报告。一个或多个服务器(例如作为应用服务器机器的一部分或作为单独的RDB/关系数据库机)对客户端的请求响应。
本发明还涵盖一种计算机可读存储介质(例如CD-ROM、存储键、闪存存储器卡、磁盘等)，所述计算机可读存储介质上存储有当在计算环境中执行时使得算法得以实现以进行如本文所述的针对体外受精程序对受试者进行评估的全部或一部分分析方法的程序。在计算机可读介质含有用于执行本文所述方法的完整程序的情况下，所述程序包括用于采集、分析以及生成输出的程序指令，并且一般包括用于如本文所述与用户进行交互、处理该数据连同分析信息以及为该用户生成独特的打印或电子介质的计算机可读代码装置。
在存储介质提供使得本文所述的方法的一部分(例如所述方法的用户侧方面(例如数据输入、报告接收功能等))得以实施的程序的情况下，所述程序使得用户的数据输入向处于远程站点处的计算环境传输(例如经由互联网、经由内部网等)。在远程站点处对数据进行处理或完成对数据的处理以生成报告。在审核所述报告并且完成任何所需的人工干预以提供完整报告后，然后将所述完整报告以电子文档或打印文档(例如传真或邮寄的纸件报告)形式传输回用户。含有根据本发明的程序的存储介质可以经过包装而带有说明书(例如有关程序的安装、使用等)，所述说明书被记录在可以获得这些说明书的合适的基质上或网址上。计算机可读存储介质还可以与一种或多种用于测定受试者的信息数据的试剂，例如用于如本文以上所述确定子宫内膜状态的物质组合提供。
用于本发明的方法中的物质适用于制备根据公知的程序所产生的试剂盒。本发明因此提供试剂盒，所述试剂盒包含可用于测定本文所公开的基因的表达以及可用于例如评估受试者的子宫内膜状态的试剂。
举例来说，试剂盒可以包括一种或多种与如本文以上所述的基因产物特异性杂交的核酸探针，所述基因产物如CD56、IL-18、IL-6、IL-12、Tweak、IL-15、G-CSF受体以及Fn14。
在一些情况下，除与如本文以上所述的核酸产物特异性杂交的探针之外，试剂盒还将包括一种或多种与参考基因产物特异性杂交的探针，所述参考基因产物如RPL-13A、β-2微球蛋白以及tata盒蛋白TBP。这些探针可以用于测定目标基因的归一化的表达水平。
所述试剂盒可以任选地包含一种或多种试剂，所述试剂带有与它们在本发明的方法中的使用有关的标识说明或标签或说明书。所述试剂盒可以包含容器(包括适用于自动实施所述方法的微量滴定板)，每一个容器容纳在本发明的方法中所利用的各种试剂中的一种或多种(通常呈浓缩的形式)，所述试剂包括例如预制的微阵列、缓冲液、适当的三磷酸核苷酸(例如dATP、dCTP、dGTP以及dTTP；或rATP、rCTP、rGTP以及UTP)、逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、以及本发明的一种或多种探针和引物(例如与启动子连接的适当长度的聚(T)或随机引物，所述启动子与RNA聚合酶具有反应性)。
在主题试剂盒中还可以包括数学算法的使用说明书，所述数学算法用于针对体外受精治疗周期对女性受试者进行评估。在这些实施方案中，所述试剂盒将进一步包括书面介质或电子介质、或如上文所述访问远程数据库的指令，以提供和/或接收信息，所述信息一般包括受试者的信息数据，以便执行如上文所述的方法。
附图说明
图1：用于评价子宫容受性的专家系统。
图2：(A)在两个不同的周期中IL-15mRNA表达的相关性(n＝37名受试者)；(B)在两个不同的周期中IL-18mRNA表达的相关性(n＝37名受试者)；(C)在两个周期中TWEAK mRNA表达的相关性(n＝15名受试者)。
图3：GCSF受体表达与对肾上腺皮质激素响应的相关性。
图4：IL-15/Fn-14在肾上腺皮质激素前和在肾上腺皮质激素下的演变。(A)示出了在14个着床失败病例中的IL-15/Fn-14的mRNA表达，所述病例被诊断同时具有基础的IL-18/TWEAK过表达以及IL-15/Fn-14过表达。(B)示出了针对10名患者的IL-15/Fn-14的mRNA表达，所述患者具有IL-18/TWEAK过表达和IL-15/Fn-14低表达。
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例
材料与方法
在非孕周期的黄体期中期对有先前不明原因的并且反复的着床失败病史的受试者进行评估。
在以下任一时间进行子宫内膜取样：
-如果所述受试者具有规则的周期，那么在所监测的自然周期期间在排卵高峰(LH)后的7到9天时，
-如果周期不规则或所述受试者闭经，那么在用以移植解冻胚胎的雌激素/孕酮替代治疗下进行。然后从第1天到第21天，每天口服施用2mg的微粉化的雌二醇(普罗瓦米(Provames)；法国巴黎的Cassenne公司(Cassenne,Paris,France))，并且从第14天到第21天，每天经阴道施用200mg微粉化的孕酮(安琪坦(Utrogestan)；法国巴黎的Besins-Iscovesco制药公司(Besins-Iscovesco Pharmaceuticals,Paris,France))。
使用标准的Cornier吸移管(法国巴黎的CCD实验室公司(CCD Laboratories,Paris,France))进行活检。将一部分样品包埋于石蜡中，用于根据公布的标准的组织学分期，以及用于免疫染色和CD56+细胞的计数(Ventana公司，760-2625)。进行分期和CD56+免疫染色以确认黄体期中期并且确定所观测到的uNK/视野的平均数目。将另一个样品立即转移到RNA稳定化溶液(RNA Later，法国库尔塔伯的快而精公司(QIAGEN,Courtabeuf,France))中并且立即储存在-80℃直到后续使用为止。数天后(在确认黄体期后)进行RNA提取。
免疫组织化学
在切片机上切割切片(5μm厚)，将所述切片放置到超冻(Superfrost)载玻片(法国内穆尔的CML公司(CML,Nemours,France))上。在实验当天，将载玻片在组织相容性柠檬酸液(histolemon)中脱蜡并且使用醇重新水化。通过将载玻片在特定的溶液(过氧化物酶阻断溶液，法国特拉普的丹科公司(Dako,Trappes,France)；以及抗生物素蛋白/生物素阻断载体试剂盒，法国巴黎的Abcys公司(Abcys,Paris,France))中孵育来抑制内源性过氧化物酶和生物素的活性。通过在含1％兔血清(或山羊血清，用于CD56染色)和5％人类正常血清(封闭血清)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中孵育20分钟来实现蛋白质封闭。在CD56染色的情况下，将切片与单克隆小鼠抗人抗体(法国马赛的Immunotech公司(Immunotech,Marseille,France))一起在室温下孵育1小时。抗CD56抗体的浓度是1μg/mL。将抗体在封闭血清中稀释。在每个步骤之间，使用PBS将载玻片冲洗三次。使用二抗(兔抗山羊抗体或山羊抗小鼠抗体，来自试剂盒Vector ABC，法国巴黎的Abcys公司)进行免疫染色，持续20分钟，之后与和过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白链菌素一起孵育30分钟，然后使用补充有液体DAB和过氧化氢底物溶液(法国特拉普的丹科公司)的底物缓冲液。然后将切片与迈尔氏苏木精(Mayer's haematoxylin)(法国蒙吕松的Interchim公司(Interchim,France))一起孵育5分钟。最终，将载玻片在补充有1％氨水的蒸馏水中冲洗并且使用Ultramount(法国特拉普的丹科公司)封埋。
对于每个样品，在四个40倍视野中对CD56+细胞进行计数，然后计算平均值。
总RNA提取和逆转录
使用Ultra Turrax T15(IKA-WERKE公司)将每个子宫内膜活检的碎片在RNeasy试剂盒(法国库尔塔伯的快而精公司)的裂解缓冲液中直接破坏。使用RNeasy试剂盒，根据制造商的说明书来提取总RNA。在提取过程期间进行另外的脱氧核糖核酸酶消化(无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶套组(RNase-free DNase set)，法国库尔塔伯的快而精公司)。使用Experion系统(Experion RNA StdSens试剂盒，加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA))确定RNA的完整性和丰度并且将RNA储存在-80℃直到最终使用为止。
使用随机引物和Superscript III(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))，根据制造商的说明书将总RNA(1μg)逆转录成cDNA。系统地进行无逆转录酶的对照以检测基因组DNA污染。将cDNA储存在-20℃直到进一步使用为止。
实时PCR
设计已被公布为对以下各项具有特异性的引物：TWEAK(Tweak-STGCACCTAAAGGCCGGAAAACACG(SEQ ID NO:1)和Tweak-AS CAGCGCAGGGCCAGCACCATCC(SEQ IDNO:2))；IL-18(IL-18-S ATAAAGATGGCTGCTGAACC(SEQ ID NO:3)和IL-18-ASTCAAATAGAGGCCGATTTCC(SEQ ID NO:4))；β-2微球蛋白(β2M)(β2M-STGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT(SEQ ID NO:5)和β2M-AS TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT(SEQ IDNO:6))；核糖体蛋白L13A(RPL13A)(RPL13A-S CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA(SEQ ID NO:7)和RPL13-AS TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA(SEQ ID NO:8))。使用通用探针文库测定设计中心(Universal Probe Library Assay Design Center；www.roche-applied-science.com)设计Fn14特异性引物(Fn14-S TTTCTGGCTTTTTGGTCTGG(SEQ ID NO:9)和Fn14-ASGGCACATTGTCACTGGATCA(SEQ ID NO:10))、IL-15(IL-15-S CTAGAGCCAACTGGGTGAATG(SEQID NO:11)和IL-15AS CATCTCCGGACTCAAGTGAAA(SEQ ID NO:12))、以及G-CSF受体(G-CSFR-S GTCCAAGATCACAAAGCTGGT(SEQ ID NO:13)和G-CSFR-AS CCGCACTCCTCCAGACTTC(SEQ IDNO:14))。使用BLAST程序针对基因库(GenBank)序列搜索Fn14、IL-15以及G-CSFR序列以确保引物的特异性。
使用LightCycler 480设备(法国梅朗的罗氏公司(Roche,Meylan,France))进行实时PCR。使用以下最终浓度建立反应：0.5μM的正义引物和反义引物、1×480SYBR绿预混液(SYBR Green Master mix)以及4μl的1/20稀释的cDNA。循环条件如下：变性(95℃，持续5分钟)；重复40次的扩增和定量(95℃，持续10秒；60℃，持续10秒；以及72℃，持续15秒)；熔解曲线程序(65℃-95℃，以2.2℃/秒的升降温速率)；以及冷却到4℃的步骤。所述测定包括无模板对照、校准物以及测试cDNA中的每一种。所有均按一式两份进行。
使用每种特异性扩增子的连续稀释液估算扩增效率。使用LightCycler 480相对定量软件，利用以两种所选择的内参的几何平均值进行的归一化策略来分析数据。
这项研究中所用的两种内参(β2M、RPL13A)是通过geNorm程序来选择的(数据未示)。每次特异性扩增效率均>1.8。
结果1
在欧洲和美国，九分之一的夫妻受着床障碍和妊娠荒废的影响并且大多数的妊娠丢失在着床之前或期间出现。因此，了解胎儿组分与母体组分之间在它们对抗之前、期间以及之后的串扰仍存在重大的挑战。
人类着床可以被描述成三步过程，该过程开始于有能力的胚泡定位并粘附到子宫内膜上皮，并且在整个妊娠前三个月期间通过进行广泛的侵入而在容受性子宫内膜中持续。复杂而非常高度相互协调的人类着床过程产生血绒毛膜胎盘的必要构造。
为成功妊娠所需的子宫重塑事件在着床之前起始于子宫内膜的蜕膜化，所述子宫内膜的蜕膜化甚至在人体内不存在受精了的孕体的情况下也会发生。这些子宫内膜的改变限定了着床窗并且持续5天，即排卵后的第4天至第9天，并且构成了容受性子宫内膜。人类蜕膜化的特征在于主要由母体子宫自然杀伤细胞构成的独特的淋巴细胞群的流入。通过子宫自然杀伤(uNK)细胞，经由细胞因子和促进血管重塑的促血管生成因子的协调并且受调节的释放来引导滋养层的侵入。
蜕膜化是人类妊娠的关键过程，功能在于提供母体免疫耐受性、对胎儿的保护以及调节胎盘形成。局部环境和它的免疫平衡将是至关重要的。
从免疫的观点来看，着床窗的特征在于免疫细胞类别的转变。虽然在增生期时，大部分的免疫细胞属于适应性局部免疫以保护生殖道防御感染，但在黄体期中期时，大部分的免疫细胞属于先天免疫。这种转变看来是允许对“半同种异体”胎儿局部耐受性的现象的基本转变。
因此，在着床时，主要的免疫作用物是子宫自然杀伤细胞(65％-70％)、抗原呈递细胞如巨噬细胞(10％-20％)、调节性T细胞(<20％)以及树突状细胞(<2％)。子宫NK细胞不仅在表型方面不同于它们的外周对应物，而且在表观功能方面也不同。子宫NK细胞通常是CD56亮/CD16-，而外周NK是CD56暗/CD16+。CD16直接牵涉到触发靶细胞的裂解。如果与来源于血液的CD56(亮)细胞相比较，那么调节NK相关活性的激活受体和抑制受体的清单是不同的。在uNK上不存在CD16的表达使得这些细胞的细胞毒性降低，从而转变功能以产生细胞因子。然而，子宫NK细胞在由局部环境所触发的情况下潜在地具有细胞毒性并且能够清除受病毒感染的细胞或经由过量的促炎性细胞因子激活的滋养层细胞或胚胎。
IL-15敲除的小鼠是有生育能力的，但它们在着床时表现出蜕膜完整性受损、螺旋动脉未发生改变以及缺乏uNK。IL-15直接牵涉到NK细胞的排卵后子宫募集。据报道IL-15对于uNK细胞的2型细胞因子的产生来说是必要的。不同于其对血液NK细胞的作用，白细胞介素-15在不过量存在并且参与uNK细胞成熟的情况下并不会使uNK细胞转化成强效的细胞溶解性细胞。这对于存在于母胎界面处的细胞来说是极其重要的，其中细胞溶解活性将会破坏滋养层。在人类中，IL-15的mRNA子宫内膜表达与子宫NK细胞的局部募集和局部血管生成具有相关性。此外，已报道在有在IVF-ET后不明原因的着床失败病史的受试者的黄体中期子宫内膜中存在IL-15表达的缺乏或过量。因此合理地假定，在人类子宫中，IL-15可以在促进uNK细胞存活和扩增以及驱使它们分化成非细胞毒性表型方面起作用。然而，如果表达得过多，那么IL-15可以触发局部细胞毒性。
与IL-15的子宫内膜表达相关，单独的IL-18是Th-2促进性细胞因子，经由血管生成素-2的作用对螺旋动脉的关键性的去稳定化起积极作用。它的主要作用是使血管的母体侧进行重塑。然而，白细胞介素-18是一种二价细胞因子，能够在白细胞介素-12存在下作为促炎性Th-1细胞因子反应。由IL-12共刺激，IL-18增强IFN-γ和TNF的局部产生并且以细胞毒性杀伤细胞形式激活子宫NK细胞。IL-18代表了子宫内膜内细胞因子的平衡，如果缺乏的话，那么不能有效地使所要被侵入的螺旋动脉作好准备并且着床失败。在过量的情况下，IL-18表现为Th-1细胞因子并且将触发周围的免疫细胞而诱导有害的细胞毒性活性。
对IL-15和IL-18的局部功能的了解需要考虑到诸如TWEAK之类的免疫调节因子的局部表达，TWEAK能够调节细胞因子的效应。TWEAK(肿瘤坏死因子样弱细胞凋亡诱导因子(Tumor necrosis factor like WEAK inducer of apoptosis))触发多种细胞反应，所述细胞反应的范围从增殖到细胞死亡，包括控制血管生成在内。TWEAK还已被描述为在免疫力中发挥“阴阳(Yin and Yang)”功能的TNF(肿瘤坏死因子)的配偶体。TWEAK的mRNA和蛋白质的表达在整个月经周期中未显示出变化。然而，它的基础表达水平影响IL-18相关的uNK募集和局部细胞毒性。TWEAK通过调节一种uNK细胞的细胞毒性受体NKp46的表达而对由IL-18过表达所诱导的uNK细胞的细胞毒性起作用，从而对它们针对胚胎的活性起作用。TWEAK表现为一种避免由IL-18过表达所诱导的子宫内膜uNK细胞毒性的调节因子。IL-18和TWEAK作为两种独立的蛋白质，可能起协同作用以维持与uNK细胞相关的血管生成/细胞毒性平衡。
通过确定子宫内膜的状态来对子宫容受性进行评估因此对于针对辅助生殖技术程序对女性受试者进行评估来说可能是有意义的。
对225名受试者进行分析得到以下观测结果：
基于通过使用IL-15/Tweak比率确定uNK细胞的活性状态来评估子宫内膜状态的方法将约42％的所检查的女性鉴定为具有正常的子宫内膜状态。然而，在所述的42％当中，有几乎25％实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
类似地，基于通过使用IL-15/Fn14比率确定uNK细胞的成熟状态来评估子宫内膜状态的方法将约43％的所检查的女性鉴定为具有正常的子宫内膜状态。然而，在所述的43％当中，有几乎75％实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
此外，基于通过对CD56+细胞的数目进行计数以确定uNK细胞的募集状态来评估子宫内膜状态的方法将约47％的所检查的女性鉴定为具有正常的子宫内膜状态。然而，在所述的47％当中，有80％实际上未呈现出正常的子宫内膜状态。
然后研发一种专家系统以更准确地评估女性的子宫内膜状态(图1)。
然后可以根据所述受试者的子宫内膜状态来提出个性化的建议。
这些程序已被施用于255名受试者，所述受试者有在IVF/ICSI后不明原因的着床失败或通过标准的遗传学、血栓形成倾向或自身免疫探查无法解释的习惯性流产的先前病史。
对于着床失败的受试者，IVF/ICSI先前尝试的平均范围是三次不成功的尝试(范围：1-8)，平均7个移植胚胎(范围：3-25)而未后续妊娠。平均年龄是36岁。
a-根据如本文以上所述的方法对子宫容受性特征进行诊断
48.5％(124/255)呈现出过度激活的子宫内膜(对胚胎有排斥反应)。
35.5％(91/255)呈现出欠激活的子宫内膜(胚胎无法粘附)。
15.5％(40/255)呈现出正常的子宫内膜。
b-通过使子宫准备过程个性化来优化IVF/ICSI尝试
在有先前着床失败的这一群体中，在下一次IVF/ICSI尝试时预期的继续妊娠率是15％至20％的胚胎移植。实际上，在法国，四次尝试(采卵)被纳入社会保险的范围。
我们在确定75名受试者的子宫容受性特征并且对于她们的体外受精治疗进行优化和个性化之后能够前瞻性评估她们的结果。
所记录的结果是：
-在闭经5周时的妊娠率(孕囊的可视化)。
-在闭经12周时评估的妊娠率(存在有至少一个具有心搏的孕囊的继续妊娠)。
在随后的第一次胚胎移植(新鲜或冻融)后进行子宫评估。主管医师采用建议以优化子宫的容受性。
对于所述群组的75名受试者：
38％(28/75)呈现出过度激活的子宫内膜(有排斥胚胎的倾向)。
42.6％(32/75)呈现出欠激活的子宫内膜(有胚胎粘附的问题)。
20％(15/75)呈现出正常的子宫内膜。
建议呈现出过度激活的子宫内膜的受试者进行如下IVF尝试：
-在之前的周期无主动子宫干预，
-肾上腺皮质激素，
-在黄体期施用高剂量的孕酮。
呈现出欠激活的子宫内膜的受试者接受以下治疗：在IVF尝试前的周期的黄体期中期进行子宫内膜活检、最低程度的卵巢刺激以及在胚胎移植后在黄体期中增添绒毛膜促性腺激素。
在随后的第一次胚胎移植时对治疗进行个性化之后的继续妊娠率是：
-在过度激活的子宫内膜的情况下：
在闭经5周时的妊娠率是46％(13/28)。
在闭经12周时的继续妊娠率是39％(11/28)。
-在欠激活的子宫内膜的情况下：
在闭经5周时的妊娠率是53％(17/32)。
在闭经12周时的继续妊娠率是43.7％(14/32)。
-在正常的子宫内膜的情况下：
在闭经5周时的妊娠率是26％(4/15)。
在闭经12周时的继续妊娠率是20％(3/15)。
这些结果表明确定子宫容受性以优化它的状态恢复了有先前不明原因的着床失败的受试者的最佳着床潜能。实际上，约40％的继续妊娠率被认为是良好的妊娠率并且在年轻的受试者中在她们第一次或第二次IVF/ICSI尝试时预期如此。
在本发明的临床背景下(第三次尝试，既往有不明原因的并且反复的着床失败)，预期的妊娠率是20％，这一妊娠率是在具有正常的子宫内膜的组中观察到的妊娠率，且可能与其它与卵母细胞或精子有关的问题有关。
此外，呈现出欠激活或过度激活的子宫内膜的受试者的预期流产率超过25％。
遵循如上文所述的方法，这个高风险组中的流产率降低至10％(5/50)，这表明局部失调得到控制。
结果2
在两个周期内子宫容受性特征的相关性。
我们首先分别在39名受试者和37名受试者当中对IL-15、IL-18的mRNA表达进行定量和归一化，并且在15名受试者当中对TWEAK的mRNA表达进行定量和归一化。
在两个周期内IL-15、IL-18以及TWEAK的mRNA表达的归一化的定量具有高度并且显著的相关性。
IL-15的秩相关性是0.59，p＝0.0001(图2A)。
IL-18的秩相关性是0.55，p＝0.0004(图2B)。
TWEAK的秩相关性是0.72，p＝0.0023(图2C)。
为了验证在两个周期内涉及IL-18的血管生成通路以及它对螺旋动脉的去稳定化的作用是相同的，我们还在十名受试者当中对IL-18/TWEAK比率以及归一化的血管生成素-2的表达进行定量。
在两个周期内IL-18/TWEAK(r＝0.77，p＝0.01)以及血管生成素-2的mRNA表达(r＝0.93，p＝0.0001)和Tie-2的表达具有高度相关性。
基于这些结果，我们可以假定对一个周期进行研究代表了在每个周期均会出现的障碍。障碍与周期本身无关，而是与受试者的免疫局部特征有关。
结果3
在过度激活的背景下，可能牵涉到许多分子和免疫通路并且最终的结果是过度免疫激活。
直接的后果是有效控制过度免疫激活的治疗将不得不控制所牵涉到的将有效的特定通路。
在这种过度激活的背景下，药物候选者是：
-肾上腺皮质激素(针对它们的抗炎作用)，
-低剂量的肝素(针对控制补体作用和抗血栓形成作用)，
-低剂量的阿斯匹林(针对抗前列腺素作用、抗血栓形成作用)，
-脂肪乳剂(控制Th-1/Th-2平衡)。
由于在这种背景下第一线的治疗是肾上腺皮质激素，因此我们在27名患者当中在两个周期期间在肾上腺皮质激素之前和之后对免疫分子的子宫内膜特征进行评估。
对治疗的反应是通过在肾上腺皮质激素下比率IL-18/Tweak、IL-15/Fn-14达到正常来确定，或者在肾上腺皮质激素下没有可获得的研究发现的情况下通过演变型妊娠来确定。
我们在具有子宫内膜过度免疫激活的患者中观测到15/27(55％)的对肾上腺皮质激素的有效响应。
对肾上腺皮质激素有响应的所有患者均具有低于阈值0.7的G-CSF受体表达，而无响应的所有患者均具有超过0.7的G-CSF受体表达(p>0.0001)(图3)。
结果4
为了对有在IVF-ET后反复并且不明原因的着床失败(RIF)病史的患者的着床潜能根据她们的免疫子宫内膜特征进行优化，对299名RIF患者进行前瞻性观察性队列研究。进行孕前免疫子宫体检，之后在不良或过度的子宫内膜激活的情况下提出个性化策略的建议。结果是在评估后在第一次新鲜的或解冻的胚胎移植之后出现的妊娠率。
在非孕周期的黄体期中使用Pipelle de(取样器)进行子宫内膜活检。在每个样品上，在组织学分期之后，我们通过实时PCR对以下各项进行定量：子宫自然杀伤细胞(uNK)的动员(对CD56+进行免疫染色)、IL-15(反映uNK的成熟状态)、IL-18(反映Th-1/Th-2细胞因子环境)以及TWEAK/Fn-14(反映TNF相关的局部免疫调节)的子宫内膜mRNA表达。
限定导致反复着床失败的机制的最终诊断是逐步的推导，所述推导首先考虑细胞因子免疫环境(IL-18/TWEAK)而在第二步考虑uNK细胞的动员和成熟。
-IL-18/TWEAK的mRNA表达低并且存在或不存在IL-15/Fn-14的低mRNA表达和/或低uNK细胞动员则限定了激活的不良免疫状态以及粘附作用不足导致的假定RIF机制。
-IL-18/TWEAK的mRNA表达正常并且存在IL-15/Fn-14的低mRNA表达和/或低uNK细胞动员则限定了激活的不良免疫状态以及粘附作用不足导致的假定RIF机制。
-IL-18/TWEAK的高表达单独限定了过度激活的免疫状态。
-IL-18/TWEAK的表达正常并且存在IL-15/Fn-14的高mRNA表达和/或高uNK细胞动员则限定了激活的过度免疫状态以及胚胎排斥导致的假定RIF机制。
在不良激活的情况下，将建议在尝试前的周期造成局部损伤、施加最低程度的卵巢刺激、在黄体期补充人绒毛膜促性腺激素以及进行性交。在过度激活的相反情况下，建议在之前的周期无局部损伤、从IVF周期的第-1天开始施用泼尼松龙(Prednisolone)20mg和维生素E、在黄体期施用高剂量的孕酮(1200mg，经阴道)和雌激素以及不进行性交。
将队列的平均年龄(37岁)连同先前尝试的平均范围(平均次数为3次尝试)、先前所移植的胚胎的平均数(多于6个胚胎)一起考虑在内，在不改变策略的情况下，在下一次尝试时预期的继续妊娠率预期将是约20％。
表1：关于第一次的299个结果的初步结果
结论：在先前经历反复着床失败的299名患者中，孕前免疫评估(本发明的方法)在77％的患者中证实了免疫子宫失调。在观测到子宫内膜免疫失调的组中，根据她们的免疫子宫内膜特征对子宫容受性进行优化(通过特定的治疗)显著地提高了后续的妊娠率(参见表1)。预期的继续妊娠率是约20％。我们然后观测到，在患者被分类为具有不良或过度的局部子宫内膜激活，然后相应地被治疗时，所观测到的继续妊娠率与预期的继续妊娠率之间有超过100％的相对增加。
结果5
为了确定在所评估的参数当中的顺序对于限定着床失败的机制来说是否是必要的，选择了如下患者，所述患者在根据其子宫内膜细胞因子特征个性化其IVF尝试之后，成功妊娠。所应用的决策的顺序是首先考虑细胞因子免疫环境IL-18/TWEAK，然后是uNK细胞的募集和成熟：IL-15/Fn-14和CD56细胞计数。
我们然后选择了在作为第一线治疗的肾上腺皮质激素下评估的具有高IL-18/TWEAK表达(过度激活状态)、并且具有高或低的基础IL-15/Fn-14表达的患者。我们的目的在于分析在治疗下IL-15/Fn-14的后续变化。
虽然在基础IL-15/Fn-14表达高或正常(>3)时，观测到显著的降低(图4A)。但在具有低的基础IL-15/Fn-14表达的10个样品中(图4B)，在5个病例中观测到IL-15/Fn-14比率的正常化，在两个病例中观测到矛盾的响应，结果导致过度表达。这可能是肾上腺皮质激素对IL-15本身的转录的作用所造成的。实际上，在IL-15的序列中存在皮质释放元件。因此，在细胞毒性环境中IL-15的mRNA低表达的这些病例中，通过肾上腺皮质激素对CRE进行刺激会破坏局部调节。IL-18/TWEAK表达应当被首先考虑以使后继治疗个性化。因此，如果IL-18/TWEAK是正常的，那么应当在第二步中考虑IL-15/Fn-14表达。
此外，对成功妊娠的109个病例进行回顾性分析，在第一步中确定IL-15/Fn-14的mRNA表达以及CD56动员，之后是IL-18/TWEAK。在109个病例中的12个病例中，IL-15/Fn-14的mRNA表达低(对应于未成熟的uNK状态)，而IL-18/TWEAK高，这表明在子宫内膜环境中Th-1细胞因子过量。如果曾经首先考虑IL-15/Fn-14，那么将会作出相反的诊断和个性化。
在109个病例中的4个病例中，IL-15/Fn-14的mRNA表达高(表明过度激活的uNK状态)，而IL-18/TWEAK低，这表明相反情况：子宫内膜环境中Th-2细胞因子缺乏。如果已首先考虑IL-15/Fn-14，那么我们将会推导出相反的诊断。
总之，我们将会在14％的病例中推断出错误的子宫内膜状态和错误的治疗。应当在考虑uNK细胞的募集和成熟之前考虑反映整个子宫内膜的细胞因子免疫环境和所有免疫细胞(包括调节性T细胞和树突状细胞)的细胞因子环境的IL-18/TWEAK(参见图1)。

Claims (10)

1.用于测量子宫NK细胞的活性状态的至少一种生物标志物的试剂和用于测量子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物的试剂在制备一种用于实施以下方法的试剂盒中的用途：一种用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容受性特征的方法，所述方法包括：
在子宫内膜样品上通过测量以下各项来确定子宫内膜的状态：
在第一步中，测量子宫NK细胞的活性状态的至少一种生物标志物，其中所述子宫NK细胞的活性状态是通过测量IL-18、IL-6以及IL-12的表达中的至少一种，从所述测量获得值，并且将所述值与参考值进行比较来确定的；以及
在第二步中，测量子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物，其中所述子宫NK细胞的募集是通过定量CD56+子宫NK细胞的数目和/或通过测量CD56表达，从所述测量和/或定量获得值，并且将所述值与参考值进行比较来确定的，并且其中所述子宫NK细胞的成熟状态是通过测量IL-15的表达，从所述测量和/或定量获得值，并且将所述值与参考值进行比较来确定的；
从而确定子宫内膜的状态，所述子宫内膜的状态表明适当的或不适当的子宫容受性。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述子宫NK细胞的活性状态是通过测量IL-18和Tweak的表达并且计算IL-18/Tweak比率来确定的。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的用途，其中所述子宫NK细胞的成熟状态是通过测量IL-15和Fn14的表达并且计算IL-15/Fn14比率来确定的。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述参考值是从有生育能力的女性受试者获得的。
5.用于测量子宫NK细胞的活性状态的至少一种生物标志物的试剂和用于测量子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物的试剂在制备一种用于实施以下方法的试剂盒中的用途：一种用于提高女性受试者的辅助生殖技术程序的成功率的方法，所述方法包括：
-根据权利要求1至4中任一项所定义的方法来确定所述受试者在子宫着床窗期间的子宫容受性特征，以及
-根据所观测到的所述子宫容受性特征，确定针对所述受试者的个性化建议。
6.用于测量子宫NK细胞的活性状态的至少一种生物标志物的试剂和用于测量子宫NK细胞的募集和成熟状态的生物标志物的试剂在制备一种用于实施以下方法的试剂盒中的用途：一种用于针对辅助生殖技术程序对女性受试者进行评估的方法，所述方法包括：
-从所述女性受试者获得信息项以提供针对所述女性受试者的特征，其中每一项信息均与预先选择的受试者变量有关，其中所述变量中的一种是如权利要求1至4中任一项所定义的子宫容受性特征，
-使用基于所述预先选择的受试者变量的算法将针对所述女性受试者的所述特征与已知表示对辅助生殖技术程序有响应性的已知特征模式的文库进行比较，
-其中所述比较针对辅助生殖技术程序提供对所述女性受试者的评估。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述预先选择的受试者变量包括组织学分期、子宫内膜特征、年龄、不孕的病因、不孕的数据、对卵巢储备的激素评估和辅助生殖技术的类型。
8.一种用于在针对辅助生殖技术程序对女性受试者进行评估中分析数据的系统，所述系统包括：
-计算环境，
-输入装置，所述输入装置与计算环境连接以从用户接收数据，其中所接收的所述数据包含来自女性受试者的信息项以提供针对所述女性受试者的特征，其中每一项信息均与预先选择的受试者变量有关，其中所述变量中的一种是如权利要求1至4中任一项所定义的子宫容受性特征，
-输出装置，所述输出装置与所述计算环境连接以向所述用户提供信息，以及
-计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质上已存储有至少一种算法以将针对所述女性受试者的所述特征与已知表示对辅助生殖技术程序有响应性的已知特征模式的文库进行比较，其中所述系统提供结果，所述结果可以用于生成在针对辅助生殖技术程序对女性受试者进行评估中提供数据分析的报告。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述预先选择的受试者变量包括组织学分期、子宫内膜特征、年龄、不孕的病因、不孕的数据、对卵巢储备的激素评估和辅助生殖技术的类型。
10.一种用于实施根据权利要求1至4任一项中所定义的用于在女性受试者中确定在子宫着床窗期间子宫容受性特征的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
-用于测量IL-18、IL-6、IL-12中的至少一种的表达以及IL-15和CD56的表达的试剂，
-任选的用于测量Tweak和Fn-14的表达的试剂，
-用于测量GCSF-R的表达的试剂，
-任选的用于测量参考基因的表达的试剂，所述参考基因用于测定IL-18、IL-6、IL-12、IL-15、CD56、Tweak、Fn-14和/或GCSF-R的归一化的表达水平，以及
-用于实施所述的方法的说明书。
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