JP6411340B2 - 生殖補助における着床の成功を増大させる方法 - Google Patents

Description

本発明は、メスの対象の子宮の着床ウィンドウ（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）の間の子宮の受容性プロファイルを判定することにより、上記対象に個別化された処置を決定して着床の成功を増大させる方法に関する。

体外受精（ＩＶＦ）などの生殖補助は、３０年の間不妊性の問題があるヒトに使用され成功を収めている。大規模な研究が行われているにも関わらず、この生殖補助は未だ困難かつ高価な手法である。実際に、収集した卵母細胞の５％未満および移植した胚のうちの２０〜２５％のみが出生につながる。胚のコンピテンスおよび対応する子宮の受容性の最適化は、生殖補助医療（ＡＲＴ）において成果を改善するための絶対条件である。着床の成功には、受容性のある子宮内膜と機能的な胚盤胞との間で同時に発生するクロストークが関わっている。この現象は、月経周期（女性）の１９日目〜２３日目の間にわたる子宮内膜の受容性の自己限定された期間である着床ウィンドウの間にのみ起こり得る。通常の月経周期では、この現象は、卵巣のエストロゲンおよびプロゲステロンの局所的な作用を介して達成され、これにより、適切な子宮内膜の受容性を引き起こす子宮内膜中の一連の細胞および分子現象が誘導される。

子宮内膜の受容性を判定する方法は、すでに当業者に開示されている。たとえば、米国特許第７，１７５，９９０号は、子宮上皮細胞により産生されるＬ−セレクチンレベルの判定に基づく方法であって、対照レベルと比較したＬ−セレクチンレベルの増大が着床の成功率の増大を示す方法を開示する。欧州特許第２３４８３１８号に開示される子宮内膜の受容性を判定する別の方法は、子宮内膜液中のプロスタグランジンＥ２またはＦ２αのレベルの判定に基づく。子宮内膜受容能アレイ（ＥＲＡシステム）のような他の新しい手法により、着床ウィンドウの間に特異的に発現する２３８の遺伝子が探索されている（ＰＣＴ／ＥＳ２００９／０００３８６号）。これらの方法は、胚着床に対する子宮内膜の受容性の判定にのみ有益である。

しかしながら、子宮内膜の不適切な受容性の判定の場合、これらの方法は、子宮内膜の受容性の修復には有益ではない。

本発明者らは、子宮内膜の不適切な受容性が、２つの異なる状態（未活性状態（ｕｎｄｅｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）または過剰活性状態（ｏｖｅｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ））により説明できるという知見を得た。子宮内膜の状態を判定することで子宮の非受容性を説明でき、これにより受容性の状態を修復するための適合かつ個別化された処置をもたらすことができる。

結果として、本発明は、メスの対象の子宮内膜の状態の判定を可能にする方法であって、この情報が子宮内膜の受容性を修復するための対象の処置を最適化するために有益である方法を提供することを目的とする。

本発明の１つの目的は、メスの対象における、子宮の着床ウィンドウの間の子宮の受容性プロファイルを判定する方法であって、
（ａ）子宮のＮＫ（ｕＮＫ）細胞の活性状態のバイオマーカーと、
（ｂ）子宮のＮＫ細胞の動員状態および成熟状態のバイオマーカーと
を測定することにより、子宮内膜試料の子宮内膜の状態を判定することと、
上記値を参照値と比較することと、
これにより、適切または不適切な子宮の受容性を示す子宮内膜の状態を判定することと
を含む、方法である。

１つの実施形態では、ｕＮＫ細胞の活性状態は、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２の発現のうちの少なくとも１つを測定することにより判定される。

別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の活性状態は、ＩＬ−１８およびＴｗｅａｋの発現を測定し、かつＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率を計算することにより判定される。

別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の動員は、ＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数を定量化、またはＣＤ５６の発現を測定することにより判定される。

別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の成熟状態は、ＩＬ−１５の発現を測定することにより判定される。

別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の成熟状態は、ＩＬ−１５およびＦｎ１４の発現を測定し、かつＩＬ−１５／Ｆｎ１４比率を計算することにより判定される。

別の実施形態では、参照値は繁殖性のあるメスの対象から得られる。

本発明の別の目的は、ａ）ｕＮＫ細胞の活性状態、ならびにｂ）ｕＮＫ細胞の動員状態および成熟状態に特異的なバイオマーカーの定量化に基づく、子宮の受容性プロファイルである。

１つの実施形態では、子宮の受容性プロファイルは、ａ）ＩＬ−１８、ＩＬ−６およびＩＬ−１２のうちの少なくとも１つ、ならびにｂ）ＣＤ５６およびＩＬ−１５の発現に基づく。

別の実施形態では、子宮の受容性プロファイルを、本明細書で上述した方法により得た。

本発明の別の目的は、メスの対象での生殖補助医療（ＡＲＴ）処置の成功率を上げる方法であって、
本明細書で上述した着床ウィンドウの間の上記対象の子宮の受容性プロファイルを判定することと、
観察した子宮の受容性プロファイルに応じて上記対象に対する個別化された推奨を判定することと
を含む、方法である。

本発明の別の目的は、生殖補助医療（ＡＲＴ）処置についてメスの対象を評価する方法であって、
上記メスの対象から情報の項目を入手して上記メスの対象のプロファイルを提供することであって、情報の各項目が予め選択した対象の変数に関連し、上記変数のうちの１つが本明細書に上述した子宮の受容性プロファイルであることと、
上記メスの対象のプロファイルを、上記予め選択した対象の変数に基づくアルゴリズムを使用して、生殖補助医療処置に対する応答性を示すと知られている既知のプロファイルパターンのライブラリと比較することとを含み、
上記比較が、上記メスの対象のＡＲＴ処置に対する評価を提供する、
方法である。

１つの実施形態では、上記予め選択した対象の変数は、組織学的な日付付与（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄａｔａｔｉｏｎ）（受容性ウィンドウの判定）；子宮内膜の特性（子宮内膜の厚さ、子宮内膜の容積、子宮内膜の血管新生、子宮動脈ドップラーなど）；年齢；不妊の原因；以前の病歴および移植した胚の数および質などをまとめた不妊症のデータ；
卵巣予備能のホルモン評価（ＡＭＨ、ＦＳＨ、胞状卵胞数計測）；ＡＲＴの種類（ＩＶＦ、ＩＣＳＩ、ＩＭＳＩ、受精）を含む。

本発明の別の目的は、生殖補助医療処置についてメスの対象を評価する際のデータ分析用のシステムであって、
コンピュータ環境と、
コンピュータ環境と接続しており、ユーザからデータを受信するための入力デバイスであって、上記受信したデータがメスの対象のプロファイルを提供するための上記メスの対象からの情報の項目を含み、情報の各項目が予め選択した対象の変数に関連し、上記変数のうちの１つが本明細書中上記で定義した子宮の受容性プロファイルである、入力デバイスと、
コンピュータ環境と接続しており、ユーザに情報を提供するための出力デバイスと、
メスの対象のプロファイルを生殖補助医療処置に対して応答性を示すと知られている既知のプロファイルパターンのライブラリと比較するために提供される少なくとも１つのアルゴリズムを格納するコンピュータ可読格納媒体であって、システムが、生殖補助医療処置についてメスの対象を評価する際のデータ分析を提供するレポートの作成に使用できる結果を提供する、コンピュータ可読格納媒体と
を含む、システムである。

１つの実施形態では、上記予め選択した変数は、組織学的な日付付与(受容性ウィンドウの判定）；子宮内膜の特性（子宮内膜の厚さ、子宮内膜の容積、子宮内膜の血管新生、子宮動脈ドップラーなど）；年齢；不妊の原因；以前の病歴および移植した胚の数および質などをまとめた不妊症のデータ；卵巣予備能のホルモン評価（ＡＭＨ、ＦＳＨ、胞状卵胞数計測）；ＡＲＴの種類（ＩＶＦ、ＩＣＳＩ、ＩＭＳＩ、受精）を含む。

本発明の別の目的は、本明細書で上記に定義した方法を実施するキットであって、
ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＩＬ−１２のうちの少なくとも１つの発現ならびにＩＬ−１５およびＣＤ５６の発現を測定する試薬と、
任意に、ＴｗｅａｋおよびＦｎ−１４の発現を測定する試薬と、
任意に、ＧＣＳＦ−Ｒの発現を測定する試薬と、
任意に、参照遺伝子の発現を測定する試薬と、
本明細書で上記に定義した方法を実施するための説明書と
を含む、キットである。

定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。

「生殖補助」との用語は、ヒトまたは動物の妊孕性を高めるために使用される臨床的かつ実験的技術を指し、限定するものではないが、体外受精（ＩＶＦ）、凍結胚移植（ＦＥＴ）、卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、形態的特徴により選別された精子を用いる卵細胞質内精子注入（ＩＭＳＩ）、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）、子宮内受精（ＩＵＩ）、および接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）が挙げられる。

「着床不全」との用語は、レシピエントの対象の子宮における、生殖補助により、または人口受精を介して産生した少数の胚の着床不全または正常な着床の失敗を指す。胚の着床不全の例として、限定するものではないが、８つの胚移植後の着床不全、４つの胚移植後の着床不全、Ｊ５での２つの胚移植後の着床不全、または外来性卵母細胞の提供後の２つの胚の移植後の着床不全が挙げられる。１つの実施形態では、着床不全を定義するための後に着床不全となる移植胚の最小数は、最適な形態をもつ２日目もしくは３日目での少なくとも４つの胚、中程度の形態をもつ２日目もしくは３日目での６つの胚または５日目での２つの胚である。

「卵巣不全」との用語は、４０歳より若いメスの卵巣の機能喪失を指す。この障害により影響を受ける対象ではまた、胚が生理学的に拒絶される。これらの障害は、限定するものではないが、早期卵巣機能不全、高ゴナドトロピン性性腺機能低下症、性器発育不全、または早発閉経（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｍｅｎｏｐａｕｓｅ、ｅａｒｌｙ ｍｅｎｏｐａｕｓｅ）を含む。

「子宮の着床ウィンドウ」との用語は、排卵から約４〜５日後に始まり約４日間持続する非常に短い期間を指す。着床ウィンドウと定義されるこのウィンドウは、月経周期中において胚に対して子宮の受容性がある期間を定義する。黄体中期（ｍｉｌｄ ｌｕｔｅａｌ ｐｈａｓｅ）の間、妊娠の成功に必要な子宮リモデリングの現象は、子宮内膜の脱落膜化を伴う着床の前に始まり、これはヒトにおいては、受精した受胎産物がない場合でも起こる。

「対象」との用語は、哺乳類、好ましくはメスの哺乳類、より好ましくはメスのヒトを指す。１つの実施形態では、対象は着床不全の経験のあるメスを指す。別の実施形態では、対象は卵巣不全により影響を受けているメスを指す。

本明細書で使用される「参照値」との用語は、測定された変数に関する比較の基として使用され得る任意の適切な値を広く包有する。好ましくは、参照値は、繁殖性のあるメスの対象から得られる。

「発現」との用語は、遺伝子の転写物、ｍＲＮＡを含む遺伝子の発現、その産物が転写後に修飾されるかされないかに関わらないこのようなＲＮＡ転写物のポリペプチド翻訳産物の発現、またはコードされたポリペプチドもしくはタンパク質を含む遺伝子産物の発現を互換的に指す。遺伝子産物の発現は、たとえば、ポリペプチドと結合する１つ以上の抗体を使用するイムノアッセイにより判定されてもよい。あるいは、遺伝子の発現は、たとえばＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを測定することにより判定されてもよい。

「正規化したレベル」との用語は、参照遺伝子の発現レベルと比較した遺伝子の発現レベルを指す。

実施例に示すように、（１）子宮のＮＫ細胞もしくはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態、（２）子宮のＮＫ細胞の成熟状態、（３）子宮のＮＫ細胞の動員状態、のうちの１つの判定のみを使用した際、試験した女性の４０％超が、正常な子宮内膜状態または適切な子宮の受容性プロファイルを呈すると分類される。

本発明の方法を実施する際、本発明者らは、子宮のＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態の判定のみを使用して判定した場合、正常な子宮内膜を呈すると分類した対象の４２％のうち、約２５％は正常な子宮内膜状態を実際には呈していないことを発見した。

さらに、子宮のＮＫ細胞の成熟状態の判定のみを使用することにより判定した正常な子宮内膜を呈すると分類した対象の４３％のうち、約７５％は正常な子宮内膜状態を実際には呈していない。

さらに、子宮のＮＫ細胞の動員状態の判定のみを使用して判定した正常な子宮内膜を呈すると分類した対象の４７％のうち、８０％は正常な子宮内膜状態を実際には呈していない。

したがって、子宮内膜の状態をより正確に判定でき、それにより、「正常」と分類された女性が、子宮の受容性を修復するために個別化かつ最適化した処置から利益を得て、それにより妊娠の進行または生児出生を得る機会が増大する方法が必要とされる。

本発明は、子宮の受容性を修復する処置を最適化するために、子宮内膜の状態を判定することにより子宮／子宮内膜の受容性を判定することを目的とする。

本発明の１つの目的は、子宮の着床ウィンドウの間、メスの対象の子宮の受容性プロファイルを判定する方法であって、
ａ）子宮のナチュラルキラー（ｕＮＫ）細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態のバイオマーカー、ならびに
ｂ）子宮のＮＫ細胞の動員状態および成熟状態のバイオマーカー
を測定することにより子宮内膜試料の子宮内膜状態を判定することと、
これにより、適切または不適切な子宮の受容性を示す子宮内膜の状態を判定することと
を含む、方法である。

３つの特定の状態：（１）未活性状態、（２）正常状態、および（３）過剰活性状態、にある対象の子宮内膜状態を区別することにより、対象を２つのカテゴリ：適切な子宮受容性（正常な子宮内膜状態）および不適切な子宮受容性、に分類できる。後者はさらに２つのサブカテゴリ：受容性なし（未活性化子宮内膜状態）および異常な受容性（過剰活性子宮内膜状態、に分類される。

対象をこれら３つのカテゴリに区別することにより、適切な子宮内膜受容性を回復するための処置をモニタリングすることが可能となり、これにより、成功率が増大し、かつＡＲＴ処置が最適化できる。

したがって、本発明の目的は、子宮の着床ウィンドウの間の、メスの対象の子宮の受容性プロファイルを判定する方法であって、
ａ）子宮のナチュラルキラー（ｕＮＫ）細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態のバイオマーカー、
ｂ）子宮ＮＫ細胞の動員状態および成熟状態のバイオマーカー、ならびに
ｃ）上記値を参照値と比較すること
を測定することにより子宮内膜試料の子宮内膜状態を判定することと、
それにより、対象の子宮内膜状態を３つの特定の状態：（１）未活性状態、（２）正常状態、および（３）過剰活性状態、に区別し、それにより対象を２つのカテゴリ：適切な子宮の受容性（正常な子宮内膜状態）および不適切な子宮受容性、に分類でき、後者は２つのサブカテゴリ：受容性なし（未活性子宮内膜状態）および異常な受容性（過剰活性子宮内膜状態）に分類されることと
を含む、方法である。

１つの実施形態では、上記子宮内膜試料は子宮内膜生検由来である。

本明細書で使用されるように、ｕＮＫ細胞活性状態は、周辺の子宮内膜細胞の外部ｕＮＫ細胞の活性状態を指す。

本明細書で使用されるように、サイトカイン子宮内膜環境の活性状態は、周辺の子宮内膜細胞の免疫細胞活性を指す。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫ細胞の活性状態またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態は、以下のバイオマーカーＩＬ−１８、ＩＬ−６およびＩＬ−１２のうちの少なくとも１つの発現レベルを測定することにより判定される。

１つの実施形態では、ＩＬ−１８、ＩＬ−６またはＩＬ−１２の発現レベルは、ＩＬ−１８、ＩＬ−６またはＩＬ−１２をコードする遺伝子に対応するタンパク質、または核酸の量（たとえば、ＲＮＡの量など）を評価することにより測定されてもよい。１つの実施形態では、上記レベルは、たとえば、ＲＰＬ−１３Ａ、β−２ミクログロブリン、またはＴＡＴＡボックスタンパク質ＴＢＰなどの参照遺伝子の産物レベルに対して正規化されてもよい。別の実施形態では、上記レベルは、参照遺伝子のうち少なくとも２つの産物の幾何学的平均レベルに対して正規化されてもよい。別の実施形態では、上記参照遺伝子は、アクチンおよびＧＡＰＤＨではない。

本明細書で使用されるように、用語「ＩＬ−６」はインターロイキン６を指し、用語「ＩＬ−１２」はインターロイキン１２を指し、用語ＩＬ−１８はインターロイキン１８を指す。

試料中のＩＬ−６、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８の発現レベルを測定する方法は当業者に良く知られており、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡ、ルミネックス法（たとえばバイオラッド製の検出キット（Ｂｉｏｐｌｅｘ ｐｒｏ ヒトサイトカイン）を使用したルミネックス法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ；およびＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ＦｌｏＣｙｔｏｍｉｘ）法（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）またはＢＤ サイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ バイオサイエンス）などのイムノアッセイが挙げられる。

本発明の別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の活性状態またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態は、バイオマーカーＩＬ−１８およびＴｗｅａｋの発現レベルを測定し、かつＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率を計算することにより判定される。

本明細書に使用されるように、用語「Ｔｗｅａｋ」は、ＴＮＦＳＦ１２遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。試料のＴｗｅａｋの発現レベルを測定する方法は当業者に良く知られており、限定するものではないが、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ；およびＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ＦｌｏＣｙｔｏｍｉｘ）法（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、またはＢＤ サイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ バイオサイエンス）などのイムノアッセイが挙げられる。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫ細胞の動員は、ｕＮＫ細胞数の定量化により判定される。

ｕＮＫ細胞数は、ＣＤ５６＋子宮細胞数を決定することにより定量化できる。上記数の決定は、凍結またはパラフィン固定した部分の抗‐ＣＤ５６抗体による免疫組織化学的検査を使用して実施し、ＮＫ細胞染色を同定することにより実行してもよい。１つの実施形態では、４０倍の視野でＣＤ＋５６細胞を計測する。別の実施形態では、４つの４０倍視野でＣＤ５６＋細胞を計測し、その後平均数を計算する。

本発明の別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の動員はＣＤ５６の発現レベルを測定することにより判定される。

本発明の１つの実施形態では、ＣＤ５６の発現レベルを測定することは任意である。

試料中のＣＤ５６の発現レベルを測定する方法は、当業者に良く知られており、限定するものではないが、たとえばＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ；およびＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ＦｌｏＣｙｔｏｍｉｘ）法（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、またはＢＤ サイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ バイオサイエンス）などのイムノアッセイが挙げられる。

本明細書で使用されるように、用語「ＣＤ＋５６細胞」はＣＤ５６を発現する細胞を指し、ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）とも呼ばれる。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫ細胞の成熟状態は、バイオマーカーＩＬ−１５の発現レベルを測定することにより判定される。

１つの実施形態では、ＩＬ−１５の発現レベルは、ＩＬ−１５をコードする遺伝子に対応するタンパク質または核酸の量（たとえば、ＲＮＡの量）を評価することにより測定してもよい。１つの実施形態では、上記レベルは、ＲＰＬ−１３Ａ、β‐２ミクログロブリンまたはＴＡＴＡボックス（ｔａｔｂｏｘ）タンパク質ＴＢＰなどの参照遺伝子の産物のレベルに対して正規化される。別の実施形態では、上記レベルは、参照遺伝子のうち少なくとも２つの産物の幾何学的平均レベルに対して正規化される。別の実施形態では、上記参照遺伝子はアクチンおよびＧＡＤＰＨではない。

本明細書で使用されるように、用語「ＩＬ−１５」はインターロイキン１５を指す。

試料中のＩＬ−１５の発現レベルを測定する方法は当業者に良く知られており、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡ、ルミネックス法（たとえばバイオラッド製の検出キット（Ｂｉｏｐｌｅｘ ｐｒｏ ヒトサイトカイン）を使用したルミネックス法）、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ；およびＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ＦｌｏＣｙｔｏｍｉｘ）法（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）またはＢＤ サイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ バイオサイエンス）などのイムノアッセイが挙げられる。

本発明の別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の成熟状態は、バイオマーカーＩＬ−１５およびＦｎ−１４の発現レベルを測定し、かつＩＬ１５／Ｆｎ１４比率を計算することにより判定される。

本明細書で使用されるように、用語「Ｆｎ１４」は、Ｔｗｅａｋの受容体である、線維芽細胞増殖因子誘導性‐１４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ １４）を指す。

試料中のＦｎ−１４の発現レベルを測定する方法は当業者に良く知られており、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡ、ルミネックス法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ；およびＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ＦｌｏＣｙｔｏｍｉｘ）法（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）またはＢＤ サイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ バイオサイエンス）などのイムノアッセイが挙げられる。

１つの実施形態では、参照値は、限定するものではないが、同様の年齢範囲内の対象、同一もしくは同様の民族グループの対象、または胚着床不全である対象、または卵巣機能不全症である対象を含む、集団試験に由来する数または値と関連できる。

本発明の１つの目的は、子宮の着床ウィンドウの間、メスの対象の子宮の受容性プロファイルを判定する方法であって、
ａ）子宮のナチュラルキラー（ｕＮＫ）細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態のバイオマーカー、ならびに子宮のＮＫ細胞の動員状態および成熟状態のバイオマーカーを測定することと、
ｂ）上記値を参照値と比較することにより、ＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の決定に基づき子宮内膜の状態を分類することと、
ｃ）子宮内膜の状態がステップｂ）で正常と分類された場合、上記値を参照値と比較することにより、ＩＬ−１５／Ｆｎ１４比率の決定、および任意にＣＤ５６の判定に基づき、子宮内膜の状態を分類することと
により、子宮内膜の試料の子宮内膜状態を判定することと、
それにより、適切または不適切な子宮受容性を示す子宮内膜状態を判定することと
を含む方法である。

実施例に示されるように、ＩＬ１５／Ｆｎ１４比率が子宮内膜の状態の分類の最初に考慮されるならば、診断のうち１４％が不適切である。

本発明の１つの実施形態では、参照値は、以下のバイオマーカーＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ受容体のレベルの測定、またはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率もしくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の計算、または実質的に健常な１つ以上の対象由来の少なくとも１つの対照試料中のｕＮＫ細胞数の決定から得てもよい。本明細書に使用されるように、「実質的に健常な対象」は、着床不全を経験していない対象、または生殖可能な対象と考えられる対象、または正常な子宮内膜状態を有する対象を指す。

本発明の別の実施形態では、参照値は、以下のバイオマーカーＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ受容体のレベルの測定、またはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率もしくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の計算、または未活性もしくは過剰活性子宮内膜状態を有する１つ以上の対象由来の少なくとも１つの対照試料中のｕＮＫ細胞数の決定から得ることができる。

本発明の１つの実施形態では、本発明の方法は、以下の
ａ）ｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態の値の決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｂ）ａ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ｕＮＫ細胞の動員の判定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｃ）ｂ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ｕＮＫ細胞の動員状態およびｕＮＫ細胞の成熟状態について得られる値の組み合わせに基づく子宮内膜状態の分類ステップと
を含む。

本発明の１つの目的は、子宮の着床ウィンドウの間、メスの対象の子宮の受容性プロファイルを判定する方法であって、
ａ）子宮のナチュラルキラー（ｕＮＫ）細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態のバイオマーカーを測定することと、
ｂ）上記値を参照値と比較することにより、未活性または過剰活性に子宮内膜状態を分類することと、
ｃ）ｂ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合、子宮のＮＫ細胞の動員状態および／または成熟状態のバイオマーカーを測定することと、
ｄ）上記値を参照値と比較することにより、ｕＮＫ細胞の動員および／または成熟の判定に基づき子宮内膜状態を分類することと
により子宮内膜試料における子宮内膜状態を判定すること
を含む方法である。

本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、以下の
ａ）ＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値の決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｂ）ａ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数またはＣＤ５６の発現レベルの決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｃ）ｂ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数またはＣＤ５６の発現レベルについて得られる値とＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値との組み合わせに基づく子宮内膜状態の分類ステップと
を含む。

本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、以下の
ａ）子宮のナチュラルキラー（ｕＮＫ）細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態のバイオマーカーとしてＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値を測定するステップと、
ｂ）上記値を参照値と比較することにより、子宮内膜状態を未活性または過剰活性に分類するステップと、
ｃ）ｂ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性に分類できない場合、子宮のＮＫ細胞の動員状態および／または成熟状態のバイオマーカーとしてＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値を測定するステップと、
ｄ）上記値を参照値と比較することにより、子宮内膜状態を未活性または過剰活性に分類するステップと
を含む。

本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、以下の
ａ）ｕＮＫ細胞の成熟状態の値の決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｂ）ａ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性に分類できない場合の、ｕＮＫ細胞の動員の判定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｃ）ｂ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性に分類できない場合の、ｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態の値の決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと
を含む。

本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、以下の
ａ）ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値の決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｂ）ａ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数またはＣＤ５６の発現レベルの決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｃ）ｂ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値の決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと
を含む。

本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、以下の
ａ）ｕＮＫ細胞の成熟状態の値の判定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｂ）ａ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜環境活性状態の値の決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｃ）ｂ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ｕＮＫ細胞の動員の判定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと
を含む。

本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、以下の
ａ）ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値の決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｂ）ａ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値の判定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと、
ｃ）ｂ）で子宮内膜状態が未活性または過剰活性と分類できない場合の、ＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数またはＣＤ５６発現レベルの決定に基づく子宮内膜状態の分類ステップと
を含む。

本発明の別の実施形態では、子宮内膜中のＧ−ＣＳＦ受容体の発現レベルもまた決定されてもよい。

本明細書で使用されるように、用語「Ｇ−ＣＳＦ受容体」は顆粒球コロニー刺激因子受容体を指す。

試料中のＧ−ＣＳＦ受容体のレベルを測定する方法は当業者に良く知られており、限定するものではないが、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ルミネックス法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ；およびＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ＦｌｏＣｙｔｏｍｉｘ）法（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）またはＢＤ サイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ バイオサイエンス）などのイムノアッセイが挙げられる。

Ｇ−ＣＳＦ受容体のレベルの決定により２つのグループ：コルチコイド応答性およびコルチコイド非応答性に対象を分類する。

本発明の１つの実施形態では、本明細書に上述した方法はさらにステップを含み、Ｇ−ＣＳＦ受容体の発現に基づき対象がコルチコイド応答性およびコルチコイド非応答性との間で分類される。好ましくは、対象は、過剰活性化した子宮内膜を呈する場合にこれらの２つのグループのうちの１つに分類される。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜活性状態の参照値の、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の参照値の半分よりも少ないｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値は、未活性子宮内膜状態を示す。

本発明の別の実施形態では、ｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜活性状態の参照値の、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の参照値の０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１倍よりも少ないｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値は、未活性子宮内膜状態を示す。

上記の実施形態では、参照値は実質的に健常な対象から得られる。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫ活性状態の参照値の、好ましくは、Ｌ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の参照値の１．８倍超のｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値は、過剰活性子宮内膜状態を示す。

本発明の別の実施形態では、ｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜活性状態の参照値の、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の参照値の２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００倍超のｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値は、過剰活性子宮内膜状態を示す。

上記の実施形態では、参照値は実質的に健常な対象から得られる。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫまたはサイトカインの子宮内膜活性状態の参照値の、好ましくはＩＬ‐１８／Ｔｗｅａｋ比率の参照値の０．５倍〜１．８倍を含むｕＮＫまたはサイトカインの子宮内膜活性状態、好ましくはＩＬ‐１８／Ｔｗｅａｋ比率の値、ならびに視野当たり１０より少ないＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数は、未活性子宮内膜状態を示す。

上記の実施形態では、参照値は実質的に健常な対象から得られる。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜活性状態の参照値の、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の参照値の０．５倍と１．８倍との間を含むｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値、ならびに視野あたり１０〜７０を含むＣＤ＋５６ｕＮＫ細胞の数、ならびにｕＮＫ細胞の成熟状態の参照値の、好ましくはＩＬ‐１５／Ｆｎ−１４比率の参照値の０．３倍よりも少ないｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ‐１５／Ｆｎ−１４比率の値は、未活性子宮内膜状態を示す。

本発明の別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の成熟状態の参照値の、好ましくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の参照値の０．２５、０．２、０．１５、０．１倍より少ないｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値は、未活性子宮内膜状態を示す。

上記の実施形態では、参照値は実質的に健常な対象から得られる。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫ活性状態の参照値の、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の参照値の０．５倍と１．８倍との間を含むｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値、ならびに視野あたり１０〜７０を含むＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数、ならびにｕＮＫ細胞の成熟状態の参照値の、好ましくはＩＬ‐１５／Ｆｎ‐１４比率の参照値の２倍超のｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ‐１５／Ｆｎ−１４比率の値は、ｕＮＫ細胞の超‐活性による過剰活性状態を示す。

本発明の別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の成熟状態の参照値の、好ましくはＩＬ‐１５／Ｆｎ‐１４比率の参照値の２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００倍超のｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ‐１５／Ｆｎ−１４比率の値は、過剰活性子宮内膜状態を示す。

上記の実施形態では、参照値は実質的に健常な対象から得られる。

本発明の１つの実施形態では、ｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜活性状態の参照値、好ましくはＩＬ‐１８／Ｔｗｅａｋ比率の参照値の０．５倍と１．８倍との間を含む、ｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ‐１８／Ｔｗｅａｋ比率の値、ならびに視野あたり７０超のＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数、ならびにｕＮＫ細胞の成熟状態の参照値、好ましくはＩＬ‐１５／Ｆｎ−１４比率の参照値の２倍超のｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ‐１５／Ｆｎ−１４比率の値は、ｕＮＫ細胞の超‐活性による過剰活性状態を示す。

本発明の別の実施形態では、ｕＮＫ細胞の成熟状態の参照値、好ましくは、ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の参照値の、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００倍超のｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ−１５／ＦＮ−１４比率の値は、過剰活性子宮内膜状態を示す。

上記の実施形態では、参照値は実質的に健常な対象から得られる。

本発明の１つの実施形態では、０．０３より少ないｕＮＫ細胞またはサイトカインの子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値は、未活性子宮内膜の状態を示す。

本発明の別の実施形態では、０．０２５、０．０２、０．０１５、０．０１、０．００５より少ないｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜の活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値は、未活性子宮内膜の状態を示す。

本発明の１つの実施形態では、０．１１超のｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜の活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値は、過剰活性子宮内膜状態を示す。

本発明の別の実施形態では、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５超のｕＮＫ細胞またはサイトカイン子宮内膜活性状態の値、好ましくはＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値は、未活性子宮内膜状態を示す。

本発明の１つの実施形態では、視野当たり１０より少ないｕＮＫ細胞の動員値、好ましくはＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数は、未活性子宮内膜状態を示す。

本発明の別の実施形態では、視野当たり、９、８、７、６、５、３、２、１より少ないｕＮＫ細胞の動員値、好ましくはＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数は、未活性状態を指す。

本発明の１つの実施形態では、視野あたり１０〜７０を含むｕＮＫ細胞の動員値、好ましくはＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数、および０．３より少ないｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率は、未活性子宮内膜状態を示す。

本発明の別の実施形態では、視野あたり１０〜７０を含むｕＮＫ細胞動員値、好ましくはＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数、および０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０５より少ないｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ１５／Ｆｎ−１４比率の値は、未活性子宮内膜状態を示す。

本発明の１つの実施形態では、視野あたり１０〜７０を含むｕＮＫ細胞の動員値、好ましくはＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数、および２を超えるｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値は、過剰活性子宮内膜状態を示す。

本発明の別の実施形態では、視野あたり１０〜７０を含むｕＮＫ細胞動員値、好ましくはＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数、および２、５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０を超えるｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値は、過剰活性子宮内膜状態を示す。

本発明の１つの実施形態では、視野あたり７０を超えるｕＮＫ細胞動員値、好ましくはＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数、および２を超えるｕＮＫ細胞の成熟状態の値、好ましくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値は、過剰活性子宮内膜状態を示す。

本発明の別の実施形態では、視野あたり７０を超えるｕＮＫ細胞動員値、好ましくはＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞の数、および２，５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０を超えるｕＮＫ細胞成熟状態の値、好ましくはＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の値は、過剰活性状態を示す。

１つの実施形態では、０．７を超えるＧ−ＣＳＦ受容体の値はコルチコイドに非応答性である対象を示す。

別の実施形態では、０．７以下のＧ−ＣＳＦ受容体の値はコルチコイドに応答性のある対象を示す。

別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦ受容体の値はコルチコイドに応答性のある対象を示さない。

本発明の別の目的は子宮受容性プロファイルであり、上記プロファイルは、子宮の着床ウィンドウの間に得られる子宮内膜試料中のａ）子宮ＮＫ（ｕＮＫ）細胞またはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態、ならびにｂ）子宮ＮＫ細胞の動員状態および成熟状態に基づく。

１つの実施形態では、上記子宮受容性プロファイルは、ＩＬ−１８、ＩＬ−６またはＩＬ−１２のうちの少なくとも１つの、好ましくはＩＬ−１８の発現レベル、ならびにＩＬ−１５およびＣＤ−５６の発現レベルに基づく。

別の実施形態では、上記子宮受容性プロファイルは、ＩＬ−１８、ＩＬ−６またはＩＬ−１２のうちの少なくとも１つの、好ましくはＩＬ−１８の発現レベル、ならびにＩＬ−１５の発現レベルおよびＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数に基づく。

別の実施形態では、上記子宮受容性のプロファイルは、ＩＬ−１８／ＴｗｅａｋおよびＩＬ−１５／Ｆｎ１４比率の値ならびにＣＤ５６の発現レベルに基づく。

別の実施形態では、上記子宮受容性プロファイルは、ＩＬ−１８／ＴｗｅａｋおよびＩＬ−１５／Ｆｎ１４比率の値ならびにＣＤ５６＋ｕＮＫ細胞数に基づく。

１つの実施形態では、上記子宮受容性のプロファイルは、第１にＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率の値、次にＩＬ−１５／Ｆｎ１４比率の値に基づく子宮内膜状態の連続した判定に基づく。

１つの実施形態では、上記子宮受容性のプロファイルは上述した方法にしたがって得られる。

１つの実施形態では、上記子宮受容性のプロファイルは、子宮内膜の状態（正常、未活性または過剰活性）の判定に基づき適切または不適切な（受容性がないまたは異常な受容性である）子宮受容性の間で分類される。

本発明の別の目的は、メスの対象の生殖補助医療（ＡＲＴ）処置の成功率を上げる方法であって、
本明細書で上述するように子宮受容性プロファイルを決定することと、
観察される子宮受容性プロファイルに応じて上記対象の個別化された推奨を決定することと
を含む方法である。

本発明の別の目的は、メスの対象の生殖補助医療（ＡＲＴ）処置の成功率を上げる方法であって、
本明細書で上述するように子宮の着床ウィンドウの間の上記対象の子宮内膜状態を判定することと、
観察した子宮内膜状態に応じて上記対象の個別化された推奨を決定することと
を含む方法である。

本明細書で上述するように判定した子宮内膜の状態が未活性状態である、または子宮受容性プロファイルが受容性の欠如のため不適切である本発明の１つの実施形態では、推奨は、子宮内膜生検を介して局所的に損傷を作製することにより、ＩＶＦ期の前の黄体期に子宮内膜を機械的に刺激することであってよい。理論に縛られるものではないが、上記局所的な損傷は免疫細胞および炎症促進性サイトカインを誘導して、より良好な接着を介して来るべき着床のための土壌を準備し得る。

本明細書で上述するように判定した子宮内膜状態が未活性状態である、または子宮受容性プロファイルが受容性の欠如のため不適切である本発明の別の実施形態では、推奨は、高濃度のエストラジオールへの子宮内膜細胞の曝露を減らすために、ホルモン刺激のレベルを下げることであってよい。これは、たとえば、ＩＶＦの場合ＦＳＨ数を減少させて排卵を引き起こすこと（排卵が起こる日の血液中で測定されるエストラジオールレベルは１５００ｐｇ／ｍｌ未満である）、またはモニタリングした自然周期（エストロゲンおよびプロゲステロンによる通常の代替周期としてではない）において凍結胚を融解後に移植することを意味する。理論に縛られるものではないが、自然周期における最小の刺激または移植は、すでに存在している局所的な未活性化の悪化を低減させる。エストロゲンは同じ理由により、胚移植に続く黄体期の間の補充に導入されない。

本明細書で上述した子宮内膜状態が未活性状態である、または子宮受容性プロファイルが受容性の欠如のため不適切である本発明の別の実施形態では、推奨は、着床ウィンドウの間のヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（ＨＣＧ）の投与を介してｕＮＫ細胞の免疫耐性、血管新生および増殖を刺激することであってもよい。たとえば、ＨＣＧの１５００ＩＵを、卵母細胞の回収（ＩＶＦ）から４、６および８日後、または排卵サージ（自然周期における凍結した胚の移植）から６〜８〜１０日後に注射してもよい。理論に縛られるものではないが、ＨＣＧは、母体‐胎児のインターフェースにおける免疫学的耐性、血管新生に深く影響し、マンノース受容体結合を介してｕＮＫ細胞の動員に関与している。特に、ＨＣＧは子宮内膜上皮によるＶＥＧＦ産生を誘導し、内皮細胞の増殖および平滑筋細胞の遊走を増大させることにより血管の成熟をもたらす。

本明細書に上述されるように判定した子宮内膜状態が未活性状態である、または子宮受容性プロファイルが受容性の欠如のため不適切である本発明の別の実施形態では、性交が胚移植の後に推奨される。理論に縛られるものではないが、精漿は制御性Ｔ細胞の動員および活性化を調節することにより着床の目的のための土壌の調製に関与し得る。

本明細書に上述されるように判定した子宮内膜状態が過剰活性状態である、または子宮受容性プロファイルが異常な受容性のため不適切である本発明の１つの実施形態では、いかなる局所的損傷も、胚着床に先立つ周期の間中は推奨されない。

本明細書に上述されるように判定した子宮内膜状態が過剰活性状態である、または子宮受容性プロファイルが異常な受容性のため不適切である本発明の別の実施形態では、高レベルの卵巣の刺激が、エストラジオールへの子宮内膜細胞の高レベルの曝露を可能にするために推奨される。

たとえば、ＩＶＦの場合、９〜１２の卵母細胞を収集する目的で通常の用量のＦＳＨを使用して過剰排卵を引き起こす（ＦＳＨの初期用量は、２２５〜４００ＩＵである）。凍結胚を移植する場合、代わりにエストロゲンおよびプロゲステロンが使用される。エストロゲンの局所濃度を高めるために、膣の投与経路が推奨される（エストラジオール２ｍｇ、膣を介して１錠剤を１日に３回）。最後に、胚移植の後の黄体期では、エストラジオールの処方が維持されてもよい（エストラジオール２ｍｇ、経口または膣を介して１錠剤を１日あたり３回）。

本明細書に上述されるように判定した子宮内膜状態が過剰活性状態である、または子宮受容性プロファイルが異常な受容性のため不適切である本発明の別の実施形態では、高用量のプロゲステロンが、卵母細胞の回収の後に推奨される（たとえば、膣を介して１日当たり４００ｍｇを３回）。

本明細書に上述されるように判定した子宮内膜状態が過剰活性状態である、または子宮の受容性プロファイルが異常な受容性のため不適切である本発明の別の実施形態では、炎症促進性の局所環境を制御する目的の薬剤が、刺激の始めから推奨される。薬剤の選択は、本明細書に上述したＧ−ＣＳＦ受容体の発現レベルに基づくコルチコイド応答性の判定に基づく。

たとえば、対象がコルチコイドに応答する場合、コルチコイドは、ＩＶＦ周期の第１日目から妊娠試験まで投与されてもよい（投与されるコルチコイドの例は、１日目〜妊娠試験の日のプレドニゾン２０ｍｇである）。対象がコルチコイドに非応答性である場合、低用量のアセチルサリチル酸（ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｙｃｉｌｉｃ ａｃｉｄ）と低重量のヘパリンの組み合わせ（たとえばＬｏｖｅｎｏｘ ０．４など、妊娠試験の卵母細胞回収日）を投与してもよい。対象がコルチコイドに対して非応答性である際の処置の別の例は、イントラリピッドの使用である。イントラリピッドは、血液由来の末梢性ＮＫ細胞の細胞毒性を制御するために主に探索されているが、先行する結果からは、子宮のＮＫ細胞の細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｘｉｔｙ）および制御性Ｔ細胞の免疫原性の制御が示唆されている。１つの実施形態では、２０％のイントラリピッド１００ｍｌを、胚移植の７〜１４日前に通常の生理食塩水５００ｃｃ（ｍｌ）中に溶解する。好ましくは、５００ｍｌのインフュージョンの時間は２時間以上でなければならない。この治療は陽性妊娠試験と共に繰り返され、その後、第１２週まで毎月投与されてもよい。

本明細書に上述するように判定した子宮内膜状態が過剰活性状態である、または子宮受容性プロファイルが異常な受容性のため不適切である本発明の別の実施形態では、抗酸化剤の治療上有効量が対象に投与される。対象に投与できる抗酸化剤の例はＴＯＣＯ５００ｍｇであり、第１日目から妊娠試験日まで、１日に２錠剤を投与することである。

本明細書で上述するように判定した子宮内膜状態が過剰活性状態である、または子宮受容性プロファイルが異常な受容性のため不適切である本発明の別の実施形態では、性交は胚移植の後は推奨されない。

本発明はまた、臨床的な不妊の評価を促進する方法およびコンピュータ系システムを提供することを目的とする。本方法およびシステムは、体外受精処置または生殖補助医療処置での対象の評価を促進するために実施できる。特に、本方法およびシステムは、対象の子宮受容性の評価を促進し、その後、上記対象の体外受精用の個別化処置を提供するために実施できる。

１つの実施形態では、本方法はメスの対象のプロファイルを提供するためにメスの対象から情報の項目を得ることであって、情報の各項目が予め選択した対象の変数に関連することと、メスの対象のプロファイルを予め選択した対象の変数に基づくアルゴリズムを使用して体外受精手処置に対する応答性を示すと知られている既知のプロファイルパターンのライブラリと比較することであって、比較することが体外受精処置に関するメスの対象の評価を提供し、特にメスの対象の子宮受容性の評価を提供して上記対象の体外受精用の個別化処置を提供することとを含む。１つの実施形態では、上記変数のうちの１つは本明細書の上記に定義されるような子宮受容性プロファイルである。別の実施形態では、上記変数のうちの１つは本明細書の上記に定義されるような子宮内膜状態である。

１つの実施形態では、情報の項目は文書もしくは電子的なアンケートに基づきメスの対象により提供されてもよく、または医者、看護師、技術者などのヘルスケアの実務者により要求、筆記、もしくは記録されてもよい。

予め選択した対象の変数に関連する例示的な情報の項目は、限定するものではないが、組織学的日付付与（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄａｔｉｎｇ）（対象が受容性ウィンドウにいることを判定するため）；年齢、以前の不妊症の病歴、臨床診断などの対象の特性；子宮内膜の厚さ、子宮内膜の容積、子宮内膜の血管新生、子宮動脈ドップラーなどの子宮内膜の特性；不妊の原因、薬物療法、刺激法を行った日数、卵母細胞の数などの臨床処置情報；移植した胚の数および質、発達段階、等級などの従来の胚形態学データ；３日間の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レベル、３日間の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）レベル、３日目の胞状卵胞（ａｎｔｒａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）の計数など卵巣予備能の評価；体型指数、多嚢胞性卵巣症疾患、ｓｐｅｒｍｏｃｙｔｏｇｒａｍを用いた精子解析（ｓｐｅｒｍｏｇｒａｍ）、原因不明なメスの不妊症、自然流産の数、年、メスの不妊症の他の原因、以前の妊娠回数、以前の正期産数、子宮内膜症、卵管疾患、卵管結索、オスの不妊、子宮筋腫、卵管水腫、ならびにオスの不妊の原因が挙げられる。

別の実施形態では、本方法は、少なくとも本明細書に上述するような子宮内膜状態を判定するために必要とされる変数に関連する情報の項目を取得することを含む。このように、他の実施形態では、本方法は、上記変数に関する情報の項目を得ることを含み、かつ少なくとも１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０つ以上などの項目を含む。

好ましくは、子宮内膜状態および／または子宮受容性プロファイルに加えて、方法は、以下のグループ：組織学的日付付与（受容性ウィンドウ判定）；子宮内膜の特性（たとえば、子宮内膜の厚さ、子宮内膜の容積、子宮内膜の血管新生、子宮動脈ドップラーなど）；対象の年齢；不妊の原因；以前の病歴の概要ならびに移植胚の数および質などの不妊症データ；卵巣予備能のホルモン的評価（ＡＭＨ、ＦＳＨ、胞状卵胞数計測）；ＡＲＴの種類（ＩＶＦ、ＩＣＳＩ、ＩＭＳＩ、授精）などの情報項目を得ることを含む。

別の実施形態では、本方法は、各予め選択した対象の変数に対し他の予め選択した対象の変数との関連で重み付けした相対的重要性を割り当てることを含む。

いくつかの実施形態では、比較することは、決定則を適用することを含む。いくつかの実施形態では、このデータ分析アルゴリズムは分類木の使用を含む。他の実施形態では、データ分析アルゴリズムは、ウィルコクソン符号順位検定を使用するなどノンパラメトリックである。特定の実施形態では、データ分析アルゴリズムは、特性となる値の分布における差異を検出する。いくつかの実施形態では、データ分析アルゴリズムは、追加的に複数の回帰木を使用することを含む。いくつかの実施形態では、データ分析アルゴリズムは、ロジスティック回帰分析である。

このデータを分析する１つの手法は、大きなデータセットにおけるパターンおよび関係を探索する分類木アルゴリズムを使用することである。「分類木」は、対象を分類のうちの１つに正確に配置するために設計された一連の質問を使用して、体外受精処置に関してメスの対象を評価するための再帰的な区画法である。各質問は、対象の状態が所定の予測因子に当てはまるかどうかを尋ねており、各答えを用いて、対象の属する分類が決定できるまで分類木をたどるようユーザを導く。本明細書に使用するように、「予測因子」は、たとえば、ｕＮＫまたはサイトカイン子宮内膜環境の活性状態またはｕＮＫ成熟状態および動員状態などの特性の値の範囲である。

上述されるように、対象の子宮受容性を判定することを含む、体外受精処置に関するメスの対象の評価は、メスの対象からの情報の項目を得ることと、メスの対象からの情報の項目を上記予め選択した対象の変数に基づくアルゴリズムを使用して体外受精処置に対する応答性を示すことが知られている既知のプロファイルパターンのライブラリと比較することとにより行われる。いくつかの実施形態では、対象の評価はレポートに提供される。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に上述されるような体外受精処置に対する対象の成功の可能性および個別化処置についての推奨に関する情報を含むレポートを、準備または作成するステップをさらに含む。たとえば、目的の方法は、対象の評価の結果を提供するレポートを作成または出力するステップであって、レポートが電子媒体の形態（たとえばコンピュータのモニタ上の電子ディスプレイ）、または有形的表現媒体の形態（たとえば紙に印刷されたレポートもしくは他の有形的表現媒体）で提供されるステップをさらに含むことができる。

レポートはまた、試験設備についての情報であって、サンプル収集および／またはデータ作成が行われる病院、診療所、または研究室に関連する情報を含んでもよい。この情報は、たとえば、試験施設の名称および位置、アッセイを行いかつ／または入力データを入れた研究技術者の同定、アッセイを行いかつ／または分析した日付および時間、試料および／または結果データを保存した場所、アッセイに使用した試薬（たとえばキットなど）のロット番号などに関連する１つ以上の詳細を含むことができる。上記レポートはまた、サービスプロバイダー、対象データおよび試料データに関連する情報を含んでもよい。

レポートの解釈的レポート部分は、本明細書に上述したようにデータの処理後に作成した情報を含む。解釈的レポートは、体外受精処置に関するメスの対象の評価を含むことができる。解釈的レポートは、たとえば、上述するように取得したデータに基づく子宮受容性の解釈および任意に、体外受精の個別化処置の推奨を含むことができる。

本明細書に記載する方法およびシステムは、多様な方法で実施できる。特定の目的の１つの実施形態では、本方法は、たとえばインターネットのようなコミュニケーションインフラストラクチャーの使用を含む。本発明のいくつかの実施形態を以下に論述する。また、本発明は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、プロセッサ、またはそれらの組み合わせなどの様々な形態で実施されてもよい。本明細書に記載した方法およびシステムは、ハードウェアおよびソフトウェアの組み合わせとして実施できる。ソフトウェアは、プログラム格納装置上に目に見える形式で実施されるアプリケーションプログラムとして、または、ユーザのコンピュータ環境において（たとえばアプレットとして）およびレビュアーのコンピュータ環境上で実施されるソフトウェアの異なる一部として実施でき、レビュアーは関連する離れた位置（たとえばサービスプロバイダの施設）に配置されてもよい。

入力装置などのコンピューティング装置の様々な要素は、たとえばワイヤレスＬＡＮ接続、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ(登録商標)接続プロトコル、ＺｉｇＢｅｅ接続プロトコル、無線周波数接続プロトコル、または符号分割多元接続（ＣＤＭＡ）もしくはモバイル接続用のグローバルシステム（ＧＳＭ（登録商標））を介する携帯電話接続プロトコルを含む、有線または無線接続を介したシステムの他の要素と関連してもよい。

本明細書に記載したアルゴリズムを実行するアプリケーションプログラムは、いずれかの適切なアーキテクチャを含む機械にアップロードされ、かつこの機械により実行されてもよい。一般的に、機械は、１つ以上の中央処理装置（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、および入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェースなどのハードウェアを有するコンピュータプラットフォームを含む。コンピュータプラットフォームはまた、オペレーティングシステムおよびマイクロインストラクションコードを含む。本明細書に記載した多様なプロセスおよび機能は、オペレーティングシステムを介して実行される、マイクロインストラクションコードの一部またはアプリケーションプログラムの一部（またはそれらの組み合わせ）のいずれかであってよい。さらに、多様な他の周辺装置は、追加的なデータ格納装置および印刷装置などのコンピュータプラットフォームと接続されてもよい。

入力および出力のデータの一部または全ては電子的に送ることもでき、特定の出力データ（たとえばレポート）は電子的または電話を使用して（たとえばファックスバックなどのデバイスを使用するファクシミリにより）送信できる。例示的な出力受信装置は、ディスプレイエレメント、プリンタ、ファクシミリ装置などを含むことができる。送信および／または表示の電子形態は、Ｅメール、インタラクティブテレビなどを含んでよい。特定の目的の実施形態では、入力データの全てもしくは一部および／または出力データの全てもしくは一部（たとえば、通常少なくとも最終的なレポート）は、アクセス用の、好ましくは機密アクセス用のウェブサーバ上に標準的なブラウザを備えて維持される。データは要望に応じてアクセスされまたは医療従事者へ送られる。最終レポートの全てまたは一部を含む入力データおよび出力データは、ヘルスケア施設の機密データベース内にある対象の医療記録に追加するのに使用される。

本明細書に記載した方法を使用したシステムは、少なくとも１つのコンピュータプロセッサ（たとえば、方法は単一の場所で全体が実行される）または少なくとも２つのネットワークコンピュータプロセッサ（たとえば、データはユーザにより入力されて分析のため第２のコンピュータプロセッサへとリモート部位に送信され、第１および第２のコンピュータプロセッサは、たとえば、イントラネットまたはインターネットを介したネットワークにより接続される）を一般的に含む。システムはまた、入力用のユーザコンポーネント、ならびにデータ、作成したレポート、および手動介入のレビュー用のレビュワーコンポーネントを含むことができる。システムの追加的なコンポーネントは、サーバコンポーネント、および格納データ用のデータベースを含むことができる。コンピュータプロセッサは、個人のデスクトップコンピュータ（たとえば、ＩＢＭ、Ｄｅｌｌ、マッキントッシュ）、ポータブルコンピュータ、メインフレーム、ミニコンピュータ、または、たとえば、アップル（登録商標）のｉＰｈｏｎｅ（登録商標）デバイスを含むスマートフォンデバイスなどの他のコンピューティングデバイス内に概して見いだされるプロセッサとすることができる。

ネットワーククライアント／サーバアーキテクチャは、望ましいように選択でき、かつ、たとえば、基本的な２段または３段のクライアントサーバモデルとすることができる。アプリケーションサーバコンポーネントの一部としてまたは別のコンポーネント（ＲＤＢマシン）としていずれかで、リレーショナルデータベース管理システム（ＲＤＭＳ）はデータベースにインターフェースを提供する。

１つの実施形態では、アーキテクチャはデータ中心クライアント／サーバアーキテクチャとして提供され、そこでクライアントアプリケーションは、必要に応じて多様なレポート要素、特に解釈的レポート要素、特に解釈テキストおよびアラートをレポートに追加するようデータベース（またはデータベースサーバ）に要求するアプリケーションサーバからのサービスを一般に要求する。サーバ（たとえば、アプリケーションサーバマシンの一部、または別々のＲＤＢ／関連データベースマシンのいずれかとして）は、クライアントの要求に応答する。

本発明はまた、コンピュータ環境で実行される際に、本明細書に記載されるような体外受精処置に関して対象を評価する分析方法の全てまたは一部を実行するためのアルゴリズムの実施を規定するプログラムを格納する、コンピュータ可読格納媒体（たとえばＣＤ−ＲＯＭ、メモリキー、フラッシュメモリカード、ディスケットなど）を考慮する。コンピュータ可読媒体が本明細書に記載した方法を実行する完全なプログラムを含む場合、プログラムは出力を収集、解析かつ作成するプログラム指示を含み、ならびに本明細書に記載されるようにユーザと相互作用し、分析情報と共にそのデータを処理し、かつそのユーザに対して固有の印刷媒体または電子媒体を作成するためのコンピュータ可読コードデバイスを一般に含む。

格納媒体が本明細書に記載される方法の一部の実施を規定するプログラムを提供する場合（たとえば、本方法のユーザ側の態様（たとえば、データ入力、レポート受信能力など））、プログラムは、離れた場所でのコンピュータ環境へのユーザにより入力されたデータの伝送を規定する（たとえばインターネット経由、イントラネット経由など）。データの処理または処理の完了は離れた場所で実行されてレポートを作成する。完全なレポートを提供するためのレポートのレビュー、および必要とされる手動の介入の完了後、完全なレポートはユーザへ電子文書または印刷文書（たとえば、ファックスまたは郵送での紙のレポート）として返信される。本発明に係るプログラムを含む格納媒体は、このような指示を入手し得る適切な基板またはウェブアドレス上に記録される指示（たとえば、プログラムインストール、使用のための指示）と一括できる。コンピュータ可読格納媒体はまた、たとえば、本明細書に上述するような子宮内膜状態を判定するための物質など、対象の情報データを輸送し判定する１つ以上の試薬と共に提供できる。

本発明の方法で使用するための物質は、良く知られている手順にしたがって作製されるキットの調製に適している。本発明はしたがって、本明細書に開示される遺伝子の発現をアッセイし、かつ、たとえば対象の子宮内膜状態を評価するために有用な試薬を含むキットを提供する。

たとえば、本キットは、ＣＤ５６、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｔｗｅａｋ、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ受容体およびＦｎ１４などの、本明細書に上述したような遺伝子産物に特異的にハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブを含むことができる。

いくつかの場合、本キットは、本明細書に上述した核酸産物に対して特異的にハイブリダイズするプローブに加えて、ＲＰＬ−１３Ａ、β‐２ミクログロブリンおよびＴＡＴＡボックスタンパク質ＴＢＰなどの参照遺伝子産物に対して特異的にハイブリダイズする１つ以上のプローブを含む。このようなプローブは、目的の遺伝子の正規化した発現レベルを決定する際に使用できる。

本キットは、本発明の方法におけるそれらの使用に関連する識別の記載またはラベルまたは説明書と共に試薬を任意に含んでもよい。本キットは複数のコンテナ（本方法を自動化して実施する際の使用に適したマイクロタイタープレートを含む）を含んでもよく、各コンテナは本発明の方法で使用される様々な試薬（概して濃縮された形態である）のうちの１つ以上を備え、たとえば、あらかじめ作製されたマイクロアレイ（ｐｒｅ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、バッファー、適切なヌクレオチド三リン酸塩（たとえばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに本発明の１つ以上のプローブおよびプライマー（たとえば、ＲＮＡポリメラーゼと反応するプロモーターに連結される適切な長さのポリ（Ｔ）またはランダムプライマー）を含む。

また、体外受精処置周期に関してメスの対象を評価するために使用される数学的アルゴリズムの使用のための説明書は、対象キットの中に含むことができる。このような実施形態では、本キットは、上述のような方法を実行するために、上述したようにリモートデータベースにアクセスして情報を提供かつ／または受信するための書面媒体または電子媒体、あるいは説明書をさらに含み、情報は対象の情報データを一般に含む。

子宮受容性の評価のためのエキスパートシステムである。 （Ａ）２つの別の周期にわたるＩＬ−１５ｍＲＮＡの相関（ｎ＝３７の対象）、（Ｂ）２つの別の周期にわたるＩＬ−１８ｍＲＮＡの相関（ｎ＝３７の対象）、（Ｃ）２つの周期にわたるＴＷＥＡＫｍＲＮＡ発現の相関（ｎ＝１５）の対象である。 ＧＣＳＦ受容体発現とコルチコイドに対する応答の相関を示す。 コルチコイドの前および最中のＩＬ−１５／Ｆｎ−１４の発展。（Ａ）は基本的にＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫの過剰発現およびＩＬ−１５／Ｆｎ−１４の過剰発現の両方を有すると診断された着床不全の１４の事例におけるＩＬ−１５／Ｆｎ−１４のｍＲＮＡ発現を示す。（Ｂ）は、ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫの過剰発現およびＩＬ−１５／Ｆｎ−１４の低発現を有する１０人の患者のＩＬ−１５／Ｆｎ−１４のｍＲＮＡ発現を示す。

本発明を以下の実施例によりさらに説明する。

実施例
材料および方法
以前に原因不明でかつ繰り返して着床が失敗した病歴を有する対象を、非受胎的な周期の黄体期中期で評価した。

子宮内膜の試料の収集を、
対象が一定の周期を有している場合、排卵サージ（ＬＨ）から７〜９日後のモニタリングされる自然周期の間に、
周期が変則的である、または対象が無月経（ａｍｅｎｏｒｈｅａ）である場合、解凍した胚の移植に適用されるエストロゲン／プロゲステロン置換処置下で
のいずれかで実施した。その後、微粒子化したエストラジオール（Ｐｒｏｖａｍｅｓ、Ｃａｓｓｅｎｎｅ（フランス パリ））２ｍｇを１日目〜２１日目に毎日経口で投与し、微粒子化したプロゲステロン（ウトロゲスタン；Ｂｅｓｉｎｓ−Ｉｓｃｏｖｅｓｃｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（フランス パリ））を、１４日目〜２１日目に毎日膣を介して投与した。

生検を、標準的なコルニエ(Ｃｏｒｎｉｅｒ)ピペット（ＣＣＤ研究所（フランス パリ））を用いて実施する。公開された基準にしたがった組織学的日付付与ならびにＣＤ５６＋細胞（Ｖｅｎｔａｎａ，７６０−２６２５）の免疫染色および列挙のために、試料の一部をパラフィンに埋め込んだ。日付付与およびＣＤ５６＋の免疫染色を実施して黄体中期を確認し、かつ観察したｕＮＫ／視野の平均数を決定する。別の試料をＲＮＡ安定化溶液（ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ、ＱＩＡＧＥＮ（フランス クールタブフ(Ｃｏｕｒｔａｂｅｕｆ）））中にすぐに移し、直ちに−８０℃で後に使用するまで保存する。ＲＮＡ抽出を、何日間か後（黄体期を確認した後）に実施する。

免疫組織化学
ミクロトーム上で切片を切断し（厚さ５μｍ）、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔガラススライド（ＣＭＬ、Ｎｅｍｏｕｒｓ（フランス））上に配置する。実験日に、スライドをｈｉｓｔｏｌｅｍｏｎ中で脱パラフィン化し、アルコールで再水和させる。内在性ペルオキシダーゼおよびビオチンの活性を、特定の溶液中でスライドをインキュベーションすることにより阻害する（ペルオキシダーゼブロッキング溶液、Ｄａｋｏ、（フランス トラップ）およびアビジン／ビオチンブロッキングベクターキット、Ａｂｃｙｓ（フランス パリ））。タンパク質のブロッキングを、１％のウサギ血清（またはＣＤ５６染色用のヤギ血清）および５％のヒトの正常血清（ブロッキング血清）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で２０分インキュベートすることにより行う。ＣＤ５６染色（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（フランス マルセイユ））の場合モノクローナルマウス抗ヒト抗体を用いて、切片を室温で１時間インキュベートする。抗ＣＤ５６抗体の濃度は１μｇ／ｍＬである。抗体はブロッキング血清中で希釈されている。各ステップ間でスライドをＰＢＳで３回すすぐ。免疫染色は、２次抗体（Ａｂｃｙｓ製のキット、ベクターＡＢＣ(フランス パリ)由来のウサギ抗ヤギ抗体またはヤギ抗マウス抗体）を２０分間用い、続いてペルオキシダーゼ共役型ストレプトアビジンと３０分間インキュベートし、その後、液体ＤＡＢを添加した基質緩衝液および過酸化水素基質溶液（Ｄａｋｏ（フランス トラップ））を用いて行う。切片をその後マイヤ−ヘマトキシリン（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（フランス モンリュソン））と５分間インキュベートする。最後に、スライドを、１％のアンモニア水を補完した蒸留水ですすぎ、Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ（Ｄａｋｏ（フランス トラップ））を用いてマウントする。
各検体につきＣＤ５６細胞を４つの４０倍に拡大した視野で計測し、それから平均値を計算する。

総ＲＮＡの抽出および逆転写
各子宮内膜生検の断片を、Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ１５（ＩＫＡ−ＷＥＲＫＥ）を用いて、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ（フランス クールタブフ））の溶解バッファー中で直接破壊する。製造者の説明にしたがいＲＮｅａｓｙキットを使用して総ＲＮＡを抽出する。追加的なＤＮａｓｅ消化を、抽出工程の間実施する（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｓｅｔ、ＱＩＡＧＥＮ、（フランス クールタブフ））。ＲＮＡの完全性および存在量を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎシステム（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ ＲＮＡ ＳｔｄＳｅｎｓ キット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、（カリフォルニア州ハーキュリーズ））を使用して決定し、ＲＮＡを、最終的に使用するまで−８０℃で保存する。

総ＲＮＡ（１μｇ）を、製造者の説明にしたがいランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（インビトロジェン（カリフォルニア州カールスバッド））を使用してｃＤＮＡに逆転写する。逆転写酵素を含まない対照を系統的に実施してゲノムＤＮＡの混入を検出する。ｃＤＮＡを、さらに使用するまで−２０℃で保存する。

リアルタイムＰＣＲ
ＴＷＥＡＫ（Ｔｗｅａｋ−Ｓ ＴＧＣＡＣＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＣＧ（配列番号：１）およびＴｗｅａｋ−ＡＳ ＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＣＣ（配列番号：２））、ＩＬ−１８（ＩＬ−１８−Ｓ ＡＴＡＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣ（配列番号：３）およびＩＬ−１８−ＡＳ ＴＣＡＡＡＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号：４））、β−２ミクログロブリン（β２Ｍ）（ｂ２Ｍ−Ｓ ＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＴＡＴＣＴ（配列番号：５）およびｂ２Ｍ−ＡＳ ＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＴ（配列番号：６））、リボソームタンパク質 Ｌ１３Ａ（ＲＰＬ１３Ａ）（ＲＰＬ１３Ａ−Ｓ ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡ（配列番号：７）およびＲＰＬ１３−ＡＳ ＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡ（配列番号：８））に特異的であるとすでに公開されているプライマー対を設計した。Ｆｎ１４に特異的なプライマー（Ｆｎ１４−Ｓ ＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＧＧ（配列番号：９）およびＦｎ１４−ＡＳ ＧＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡ（配列番号：１０））、ＩＬ−１５（ＩＬ−１５−Ｓ ＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧ（配列番号：１１）、およびＩＬ−１５ ＡＳ ＣＡＴＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴＧＡＡＡ（配列番号：１２））およびＧ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ−Ｓ ＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＴ（配列番号：１３）およびＧ−ＣＳＦＲ−ＡＳ ＣＣＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＣ（配列番号：１４））を、ユニバーサルプローブライブラリーアッセイ設計センター（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ）（ｗｗｗ．ｒｏｃｈｅ−ａｐｐｌｉｅｄ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を使用して設計した。Ｆｎ１４、ＩＬ−１５およびＧ−ＣＳＦＲ配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋ配列と照らし合わせて探索し、プライマーの特異性を確かめた。

リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０装置（ロシュ、（フランス メラン）を使用して実行した。反応は以下の最終濃度を使用して設定する：０．５μＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、１×４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックスおよび２０倍に希釈したｃＤＮＡ４μｌ。サイクル条件は以下の通りであった：変性（９５℃、５分間）、４０回繰り返される増幅および定量化（９５℃ １０秒間、６０℃ １０秒間、および７２℃ １５秒間）、融解曲線プログラム（２．２℃／秒の傾斜率で６５〜９５℃）ならびに４℃への冷却ステップ。アッセイは、非−鋳型の対照、標準物質および各試験ｃＤＮＡを含んだ。すべてを二連で実行した。

増幅効率を、各特異的増幅産物の段階希釈を使用して推定した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０相対定量ソフトウェアを使用し、選択した２つの内部対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）の幾何平均による正規化法を用いてデータを分析した。
この試験で使用した２つの内部対照（β２Ｍ、ＲＰＬ１３Ａ）はｇｅＮｏｒｍプログラムを使用して選択した（データ不図示）。それぞれの特異的増幅率は、１．８超であった。

結果１
欧州および米国では、９組のうち１組のカップルが着床障害による影響を受けており、流早産および妊娠損失の大部分は着床の前または間に起こる。したがって、胎児および母体の成分の間の、それらが直面する前、最中および後のクロストークの理解は、依然として主要な課題である。

ヒトの着床は、適格な胚盤胞の子宮内膜上皮への対位および接着で始まり、受容性のある子宮内膜における妊娠の第１三半期にわたる広範囲の浸潤により継続する３つのステップとして説明されてもよい。複雑で非常に高度に相互に統合された過程であるヒトの着床は、血液−漿膜胎盤の必須の構造をもたらす。

妊娠の成功に必要な子宮リモデリング現象は着床前に子宮内膜の脱落膜化で始まり、これはヒトにおいて受精による受胎がない場合にも起こる。これらの子宮内膜の修飾は着床ウィンドウを規定し、排卵後４〜９日目に５日続き、受容性のある子宮内膜を構成する。ヒトの脱落膜化は、母体の子宮ナチュラルキラー細胞を主として構成される独特なリンパ球の集団の流入により特徴付けられる。トロホブラスト浸潤は、血管のリモデリングを促進するサイトカインおよび血管新生因子の、統合されかつ調節された放出を介して、子宮のナチュラルキラー（ｕＮＫ）細胞により行われる。

脱落膜化はヒトの妊娠にとって不可欠な過程であり、母体の免疫耐性、胎児の保護を提供し、かつ胎盤形成を調節するよう機能している。局所的な環境およびその免疫平衡が重要である。

免疫の観点から、着床ウィンドウは、免疫細胞の種類の切り替えにより特徴づけられる。増殖期では、免疫細胞の大部分は、感染から生殖器系を守るために適応的な局所免疫に属しているのに対し、黄体中期では、免疫細胞の大部分は自然免疫に属している。このような切り替えは、局所的寛容の現象を「半アロジェニック（ｓｅｍｉａｌｌｏｇｅｎｉｃ）な」胎児で可能にするための基本的なものとして現れる。

従って着床の時点では、主な免疫因子は子宮ナチュラルキラー細胞（６５〜７０％）、マクロファージとしての抗原提示細胞（１０〜２０％）、制御性Ｔ細胞（＜２０％）および樹状細胞（＜２％）である。子宮ＮＫ細胞は、表現型だけでなく明白な機能に関してもそれらの末梢性対応物と異なる。子宮ＮＫ細胞は概してＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１６−であるが、末梢性ＮＫは、ＣＤ５６ｄｉｍ／ＣＤ１６＋である。ＣＤ１６は、標的細胞の溶解の引き金に直接関与している。ＮＫ関連活性を調節する受容体を活性化および阻害するレパートリーは、血液由来のＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞と比較した場合異なる。ｕＮＫ上にＣＤ１６発現がないことが、これらの細胞中での細胞毒性の低減をもたらし、機能をサイトカイン産生へと切り替える。しかしながら、子宮ＮＫ細胞は、局所的な環境に誘発された場合細胞毒性を有する可能性があり、かつ、ウイルスに感染した細胞または過度の炎症促進性サイトカインを介して活性化された栄養膜性細胞もしくは胚を除くことができる。

ＩＬ−１５ノックアウトマウスは繁殖性があるが、脱落膜の完全性が不十分であり、非修飾型らせん動脈を有し、かつ着床時にｕＮＫが存在しない。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の排卵後の子宮の動員に直接関与している。ＩＬ−１５は、ｕＮＫ細胞による２型サイトカインの産生に重要であることが報告されている。血液ＮＫ細胞に対するその作用とは異なり、インターロイキン１５は、過度に存在せずそれらの成熟に関わらない場合、ｕＮＫ細胞を潜在的な細胞溶解性細胞へと変換しない。このことは、細胞溶解活性がトロホブラストを破壊する、母体‐胎児間のインターフェースに存在する細胞にとって極めて重要である。ヒトでは、ＩＬ−１５のｍＲＮＡの子宮内膜発現は、子宮ＮＫ細胞の局所的な動員および局所的な血管新生と相関する。さらに、ＩＬ−１５発現の欠失または過度のＩＬ−１５発現が、ＩＶＦ−ＥＴ後の原因不明な着床不全の病歴を有する対象の子宮内膜の黄体中期で報告されている。したがって、ヒトの子宮内でＩＬ−１５がｕＮＫ細胞の生存および増殖の促進、かつ、それらの非細胞毒性表現型への分化の駆動に役割を果たしていると推測することは合理的である。しかしながら、多く発現しすぎる場合、ＩＬ−１５は局所的な細胞毒性の引き金となり得る。

ＩＬ−１５の子宮内膜発現に関連して、ＩＬ−１８単独は、Ｔｈ−２を促進するサイトカインであり、アンジオポエチン−２の作用を介したらせん動脈の重大な不安定化に陽性に作用する。この主要な役割は、母体側の脈管構造のリモデリングである。しかしながら、インターロイキン−１８は、インターロイキン−１２存在時に炎症促進性Ｔｈ―１サイトカインとして反応できる二価サイトカインである。ＩＬ−１２と同時に刺激されると、ＩＬ−１８は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦの局所的産生を増大させ、かつ細胞毒性キラー細胞中の子宮ＮＫ細胞を活性化する。浸潤されるらせん動脈の調製の欠如が効果的でなく着床が失敗する場合、ＩＬ−１８は子宮内膜内のサイトカインの平衡の代表である。過度にある場合、ＩＬ−１８はＴｈ−１サイトカインとして作用し、周辺免疫細胞の細胞毒性有害活性を誘導する引き金となる。

ＩＬ−１５およびＩＬ−１８の局所的機能を理解するには、サイトカインの作用を調節できるＴＷＥＡＫなどの免疫調節因子の局所的発現を考慮に入れる必要がある。ＴＷＥＡＫ（アポトーシスのＷＥＡＫ誘導因子のような腫瘍壊死因子）は、血管新生の制御を含む、増殖から細胞死までの範囲の複数の細胞応答の引き金となる。ＴＷＥＡＫは、免疫において「陰陽の」機能を果たす、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）に対するパートナーとしても記載されてきた。ＴＷＥＡＫのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、月経周期中に多様性を示さない。しかしながら、その発現の基礎レベルは、ＩＬ−１８関連のｕＮＫの動員および局所的な細胞毒性に影響する。ＴＷＥＡＫは、ＩＬ−１８の過剰発現により誘導される、ｕＮＫ細胞の細胞毒性に作用し、ｕＮＫ細胞の細胞毒性受容体発現のうちの１つを修飾すること、ＮＫｐ４６よってそれらの胚に対する活性、により作用する。ＴＷＥＡＫは、ＩＬ−１８の過剰発現により誘導される子宮内膜のｕＮＫ細胞毒性を回避するための調節因子と思われる。２つの独立したタンパク質としてＩＬ−１８およびＴＷＥＡＫは、ｕＮＫ細胞に関連する血管新生／細胞毒性の均衡を維持するため相乗的に作用し得る。

子宮内膜状態を判定することにより子宮受容性を評価することはしたがって、生殖補助医療処置に関してメスの対象を評価することを目的とし得る。

２２５人の対象の分析は、以下の知見をもたらした。

ＩＬ−１５／Ｔｗｅａｋ比率を使用してｕＮＫ細胞の活性状態を判定することによる子宮内膜状態の評価に基づく方法は、試験した女性の約４２％を正常な子宮内膜状態を有すると同定する。しかしながら、上記４２％のうち、およそ２５％は実際に正常な子宮内膜状態を呈していなかった。

同様に、ＩＬ−１５／Ｆｎ１４比率を使用してｕＮＫ細胞の成熟状態を判定することによる子宮内膜状態の評価に基づく方法は、試験した女性の約４３％を、正常な子宮内膜状態を有すると同定する。しかしながら、上記４３％のうち、およそ７５％は実際に正常な子宮内膜状態を呈していなかった。

さらに、ＣＤ５６＋細胞数を計測してｕＮＫ細胞の動員状態を判定することによる子宮内膜状態の評価に基づく方法は、試験した女性の約４７％を正常な子宮内膜状態を有すると同定する。しかしながら、上記４７％のうち、８０％は実際に正常な子宮内膜状態を呈していなかった。

エキスパートシステムをその後開発して、より正確に女性の子宮内膜状態を評価した（図１）。

それから、個別化した推奨を、対象の子宮内膜状態に応じて示唆できる。

このような手順を、ＩＶＦ／ＩＣＳＩ後の原因不明な着床不全、または標準的な遺伝子的傾向、血栓形成傾向もしくは自己免疫探索では説明できない反復流産の病歴を有する２５５人の対象に適用した。

着床不全の対象では、以前に試みたＩＶＦ／ＩＣＳＩの平均範囲は、３回の不成功な試み（１〜８の範囲）であり、平均７つの移植胚を用い（３〜２５の範囲）その後の妊娠はなかった。平均年齢は３６歳であった。

ａ．本明細書に上述した方法にしたがった子宮受容性プロファイルの診断
４８．５％（１２４／２５５）は、過剰活性子宮内膜（胚の拒絶）を呈した。
３５．５％（９１／２５５）は、未活性子宮内膜（胚の接着なし）を呈した。
１５．５％（４０／２５５）は、正常な子宮内膜を呈した。

ｂ．子宮調製の個別化によるＩＶＦ／ＩＣＳＩの試みの最適化
以前に着床不全を経験したことのあるこのような集団では、次回のＩＶＦ／ＩＣＳＩの試みで予測される継続的な(ｏｎｇｏｉｎｇ)妊娠の比率は、胚移植の１５〜２０％である。実際、フランスでは４度の試み（卵母細胞の回収）は社会保険の適用を受けている。

我々は、７５人の対象の子宮受容性プロファイルならびに彼らの体外受精の処置の最適化および個別化を判定した後の対象の結果を将来に向けて評価できた。

記録した結果は、
無月経５週での妊娠率（胎嚢の可視化）
無月経１２週目で調査した妊娠率（心臓の活性を伴う少なくとも１つの胎嚢が存在する継続的な妊娠）
であった。
第１の後続の胚移植（新鮮なまたは凍結／融解した胚）を行い、その後子宮を評価した。担当医は、子宮受容性を最適化するために推奨を適用した。

７５人の対象の上記コホートについて：
３８％（２８／７５）は、過剰活性子宮内膜（胚を拒絶する傾向）を呈した。
４２．６％（３２／７５）は、未活性子宮内膜（胚接着に問題）を呈した。
２０％（１５／７５）は、正常な子宮内膜を呈した。

過剰活性子宮内膜を呈する対象は、
周期前の能動的な子宮の介入をせず、その後
コルチコイド、
黄体期に高用量のプロゲステロン
といったＩＶＦを試みるように推奨された。

未活性子宮内膜を呈する対象は、ＩＶＦの試みに先立ち、周期のうち黄体中期に実施される子宮内膜生検、最小限の卵巣の刺激および胚移植後の黄体期の絨毛性性腺刺激ホルモンの添加で処置される。

第１の後続の胚移植での処置の個別化の後の継続的妊娠率は、
過剰活性子宮内膜の場合、
無月経の５週目の妊娠率は４６％（１３／２８）であり、
無月経１２週の継続的妊娠率は３９％（１１／２８）であった。
未活性子宮内膜の場合、
無月経５週目の妊娠率は５３％（１７／３２）であり、
無月経１２週の継続的妊娠率は４３．７％（１４／３２）であった。
正常な子宮内膜の場合、
無月経５週目の妊娠率は、２６％（４／１５）であり、
無月経１２週の継続的妊娠率は、２０％（３／１５）であった。

これらの結果から、対象の状態を最適化するために子宮受容性を判定することが、以前の原因不明な着床不全を伴う対象における着床の最適な可能性を元の状態に戻すと示唆される。実際に、４０％前後の継続的妊娠率は良好な妊娠率と考えられ、第２のＩＶＦ／ＩＣＳＩの試みの第１期における若い対象において予測されるものである。

現在の臨床の状況（第３の試み、原因不明かつ繰り返し起こる着床不全の過去）では、予測される妊娠率は２０％であり、この値は正常な子宮内膜を有し、かつ、卵母細胞または精子のいずれかに関連する他の問題におそらく関連するグループで観察される。

さらに、流産の予測率は、未活性または過剰活性の子宮内膜を呈する対象では、２５％超であった。

上述の方法を参照すると、比率はこのリスクの高いグループにおいて１０％（５／５０）まで減少したが、これは局所的な調節不能の制御を示唆している。

結果２
２つの周期にわたる子宮受容性プロファイルの相関
まず、３９人の対象および３７人の対象において、それぞれＩＬ−１５、ＩＬ−１８のｍＲＮＡ発現を、ならびに１５人の対象においてＴＷＥＡＫのｍＲＮＡ発現を定量化し、正規化した。
ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＴＷＥＡＫのｍＲＮＡ発現の正規化した定量化は、２つの周期にわたり高くかつ顕著に相関した。
ＩＬ−１５の順位相関は、０．５９であった（ｐ＝０．０００１、図２Ａ）。
ＩＬ−１８の順位相関は、０．５５であった（ｐ＝０．０００４、図２Ｂ）。
ＴＷＥＡＫの順位相関は、０．７２であった（ｐ＝０．００２３、図２Ｃ）。

ＩＬ−１８が関与する血管新生経路およびそのらせん動脈の不安定化に対する作用が２つの周期にわたり同一であることを検証するために、１０人の対象において、ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫ比率およびアンジオポエチン−２の正規化発現も定量化した。

ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫは２つの周期にわたり高く相関し（ｒ＝０．７７、ｐ＝０．０１）、またアンジオポエチン−２（ａｎｇｉｏｐｉｅｔｉｎ−２）のｍＲＮＡ発現（ｒ＝０．９３、ｐ＝０．０００１）およびＴｉｅ−２発現とも相関した。

これらの結果に基づき、周期を探索することは、各周期で起こる障害を代表すると仮定できる。障害は周期自体とは関連しないが、対象の局所的な免疫プロファイルに関連する。

結果３
過剰活性の場合、多くの分子および免疫経路が関連している可能性があり、最終的に過剰免疫活性が引き起こされる。

直接の結果は、過剰免疫活性を制御するために有効な処置が、関与する特定の経路を有効となるよう制御しなければならなくなることである。

過剰活性に関連して、候補となる薬剤は、
コルチコイド（それらの抗炎症作用のため）、
低用量のヘパリン（補体および抗血栓作用の制御のため）、
低用量のアスピリン（抗プロスタグランジン、抗血栓作用のため）
イントラリピッド（Ｔｈ−１／Ｔｈ−２平衡の制御）
である。

第１選択の処置は、この場合コルチコイドであり、２つの周期の間中２７人の患者において、コルチコイド（投与）の前後の子宮内膜の免疫分子プロファイルを評価した。

処置に対する応答は、コルチコイド下でのＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ、ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４の正規化した比率により定義されるか、または、探索がコルチコイド下で利用可能ではない場合の進化的妊娠（ｅｖｏｌｕｔｉｖｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）により定義される。

子宮内膜が過剰活性である患者において、コルチコイドに対する有効な応答性が１５５／２７（５５％）であることを観察した。

コルチコイドに応答する全ての患者は、０．７の閾値未満のＧ−ＣＳＦ受容体発現を有するが、応答を示さない全ての患者は、０．７超のＧ−ＣＳＦ受容体発現を有した（ｐ＞０．０００１）（図３）。

結果４
対象の免疫子宮内膜プロファイルにしたがって、ＩＶＦ−ＥＴ（ＲＩＦ）後に繰り返し起きる原因不明の着床不全の病歴を有する患者の、着床の可能性を最適化するために、２９９人のＲＩＦ患者の前向き観察型コホート試験を実施した。受胎前の子宮の免疫調査を実施し、その後不十分または過剰な子宮内膜活性の場合に個別化戦略を推奨する。結果は、評価後の第１の新鮮なまたは融解した胚の移植後に起こる妊娠率である。

子宮内膜の生検は、Ｐｉｐｅｌｌｅ ｄｅ Ｃｏｒｎｉｅｒ（登録商標）を用いて非受胎周期（ｎｏｎ−ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ ｃｙｃｌｅ）の黄体期で実施される。各試料について、組織学的日付付与の後、子宮ナチュラルキラー細胞（ｕＮＫ）の動員（免疫染色ＣＤ５６^＋）、ＩＬ−１５（ｕＮＫの成熟状態を反映）、ＩＬ−１８（Ｔｈ−１／Ｔｈ−２サイトカイン環境を反映）およびＴＷＥＡＫ／Ｆｎ−１４（ＴＮＦに関連する局所的な免疫調節に影響する）の子宮内膜でのｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲにより定量化した。

繰り返し起こる着床不全を発生させる機構を規定する最終的な診断は段階的な推論で行い、第１のステップでサイトカイン免疫環境（ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫ）を、第２のステップでｕＮＫ細胞の動員および成熟を考慮した。

ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４ｍＲＮＡの低発現の有無に関わらないＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫｍＲＮＡの低発現および／またはｕＮＫ細胞の低い動員は、不十分な免疫活性状態および不十分な接着によるＲＩＦの推定機構を定義する。
ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４のｍＲＮＡの低発現を伴うＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫの正常なｍＲＮＡ発現および／またはｕＮＫ細胞の低い動員は、不十分な免疫活性状態および不十分な接着によるＲＩＦの推定機構を定義する。
ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫの高発現単独は、過剰活性免疫状態を定義する。
ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４ｍＲＮＡの高発現を伴うＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫの正常な発現および／またはｕＮＫ細胞の高い動員は、過剰な免疫活性状態および胚の拒絶によるＲＩＦの推定機構を定義する。

不十分な活性化の場合、推奨されるのは、試みに先立つ周期の局所的な損傷を実施し、最小限の卵巣刺激を適用し、黄体期にヒト絨毛性ゴナドトロピンを補充しかつ性交することである。過剰活性とは反対の場合、推奨されるのは、周期前に局所的な損傷を行わず、ＩＶＦ周期の１日目からのプレドニゾロン２０ｍｇおよびビタミンＥ、黄体期における高用量のプロゲステロン（膣経由１２００ｍｇ）とエストロゲンおよび性交は行わないことである。

コホートの平均年齢（３７歳）を以前の試みの平均的な範囲（平均３度の試み）、以前移植した胚の平均数（６超の胚）と共に考慮すると、次回の試みで戦略を変化させることなく予測される継続的妊娠率は２０％前後と予測される。

結論：以前に繰り返し起こる着床不全を経験した２９９人の患者に関して、受胎前の免疫評価（本発明の方法）は、患者の７７％において、子宮の免疫の調節不全を記録した。子宮内膜の免疫の調節不全が観察されたグループにおいて、子宮内膜免疫プロファイルに従った子宮受容性の最適化（特定の処置による）は、その後の妊娠率を顕著に高めた（表１参照）。予測される継続的妊娠率は約２０％であった。その後、患者が子宮内膜の不十分なまたは過剰な局所的活性をもつと分類されその後それに応じて処置された際に、観察される継続的妊娠率と予測される継続的妊娠率との間で１００％を超える相対的増加を見出した。

結果５
評価したパラメータの順序が、着床不全の機構を定義するために必要かどうかを判定するために、子宮内膜のサイトカインプロファイルにしたがったＩＶＦの試みの個別化の後に妊娠に成功した患者を選択した。適用した決定順序は、第１にサイトカイン免疫環境ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫを考慮し、その後、ｕＮＫ細胞の動員および成熟、すなわちＩＬ−１５／Ｆｎ−１４およびＣＤ５６細胞の計数を考慮した。

その後、高いまたは低いＩＬ−１５／Ｆｎ−１４の基礎発現により第１選択の処置としてのコルチコイド下で評価した、ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫ高発現（過剰発現状態）の患者を選択した。目的は処置下でのＩＬ−１５／Ｆｎ−１４のその後の変動を解析することであった。

ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４の基礎発現が高いまたは正常（＞３）である場合に顕著な減少が観察された（図４Ａ）。低いＩＬ−１５／Ｆｎ−１４の基礎発現を伴う１０の試料（図４Ｂ）では、ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４比率の正規化が５つの事例で観察され、逆説的な応答が２つの事例において観察され結果として超過剰発現を伴った。このことは、ＩＬ−１５自体の転写に対するコルチコイドの作用の結果である可能性がある。実際、コルチコイド放出要素がＩＬ−１５の配列中に存在する。したがって、細胞毒性環境におけるＩＬ−１５ｍＲＮＡの低発現のこれらの場合では、コルチコイドによるＣＲＥの刺激は、局所的な調節を破壊する。Ｌ−１８／ＴＷＥＡＫ発現が最初に考慮されて、その後の処置を個別化するべきである。したがって、ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４発現は、ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫが正常な場合に第２のステップで考慮されるべきである。

さらに、成功した１０９の妊娠の事例を遡及的に分析し、ＣＤ５６の動員を伴うＩＬ−１５／Ｆｎ−１４のｍＲＮＡ発現を第１のステップにおいて判定し、その後ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫを判定した。１０９のうち１２の事例では、ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫが高い一方でＩＬ−１５／Ｆｎ−１４のｍＲＮＡ発現は低く（未成熟のｕＮＫ状態に対応する）、これは子宮内膜環境における過度のＴｈ−１サイトカインを示唆している。ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４が最初に考慮された場合、反対の診断および個別化をもたらしたであろう。

１０９のうち４つの事例では、ＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫが低い一方でＩＬ−１５／Ｆｎ−１４のｍＲＮＡ発現は高く（超活性ｕＮＫ状態を示唆する）、上記と反対の状態を示唆し、すなわち子宮内膜環境におけるＴｈ−２サイトカインの欠失を示唆する。ＩＬ−１５／Ｆｎ−１４が最初に考慮された場合、反対の診断が導かれたであろう。

まとめると、事例のうち１４％で誤った子宮内膜状態および誤った処置が推測された。子宮内膜全体のサイトカイン免疫環境および全ての免疫細胞（調節性Ｔ細胞および樹状細胞を含む）のサイトカイン環境を反映しているＩＬ−１８／ＴＷＥＡＫは、ｕＮＫ細胞の動員および成熟前に考慮するべきである（図１参照）。

Claims (13)

1. 子宮の着床ウィンドウの間のメスの対象の子宮受容性プロファイルを判定するための方法であって、
   （ａ）第１のステップにおいて、ＩＬ−１８、ＩＬ−６およびＩＬ−１２のうちの少なくとも１つを含む子宮ＮＫ（ｕＮＫ）細胞の活性状態のバイオマーカーの発現に対応する少なくとも１つの値を測定して参照値と比較し、（ｂ）第２のステップにおいて、少なくともＣＤ５６を含む動員状態のバイオマーカーの発現、および／または前記動員状態のバイオマーカーを発現するｕＮＫ細胞の数、に対応する少なくとも１つの値と少なくともＩＬ−１５を含むｕＮＫ細胞の成熟状態のバイオマーカーの発現に対応する少なくとも１つの値とを測定して参照値と比較することによって、子宮内膜状態を子宮内膜試料において判定することと、
   それにより適切または不適切な子宮受容性プロファイルを判定することと、
   を含む方法。
2. ｕＮＫ細胞の活性状態が、ＩＬ−１８およびＴｗｅａｋの発現を測定することとＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率を計算することとによって判定される、請求項１に記載の方法。
3. ｕＮＫ細胞の成熟状態が、ＩＬ−１５およびＦｎ１４の発現を測定することとＩＬ−１５／Ｆｎ１４比率を計算することとによって判定される、請求項１または２に記載の方法。
4. （ａ）第１のステップにおいて、子宮ＮＫ（ｕＮＫ）細胞の活性状態のバイオマーカーの発現に対応する少なくとも１つの値を測定して参照値と比較し、（ｂ）第２のステップにおいて、少なくともＣＤ５６を含む動員状態のバイオマーカーの発現、および／または前記動員状態のバイオマーカーを発現するｕＮＫ細胞の数、に対応する少なくとも１つの値とｕＮＫ細胞の成熟状態のバイオマーカーの発現に対応する少なくとも１つの値とを測定して参照値と比較することによって、子宮内膜状態を子宮内膜試料において判定することと、
   それにより適切または不適切な子宮受容性プロファイルを判定することと、
   を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
   ｕＮＫ細胞の活性状態が、ＩＬ−１８およびＴｗｅａｋの発現を測定することとＩＬ−１８／Ｔｗｅａｋ比率を計算することとによって判定され、
   ｕＮＫ細胞の成熟状態が、ＩＬ−１５およびＦｎ１４の発現を測定することとＩＬ−１５／Ｆｎ１４比率を計算することとによって判定される、
   方法。
5. 前記参照値が、繁殖性のあるメスの対象から得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. （ａ）第１のステップにおける、子宮ＮＫ（ｕＮＫ）細胞の活性状態に特異的なバイオマーカーの定量化、ならびに（ｂ）第２のステップにおける、ｕＮＫ細胞の動員状態および成熟状態に特異的なバイオマーカーの定量化、
   に基づく子宮受容性プロファイルであって、
   前記ｕＮＫ細胞の活性状態に特異的なバイオマーカーは、ＩＬ−１８、ＩＬ−６およびＩＬ−１２のうちの少なくとも１つを含み、
   前記動員状態に特異的なバイオマーカーは、少なくともＣＤ５６を含み、
   前記成熟状態に特異的なバイオマーカーは、少なくともＩＬ−１５を含む、
   子宮受容性プロファイル。
7. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により得られる子宮受容性プロファイル。
8. メスの対象において生殖補助医療（ＡＲＴ）処置の成功率を上げるための方法であって、
   請求項１〜５のいずれか１項に従って子宮の着床ウィンドウの間の前記対象の子宮受容性プロファイルを判定することと、
   観察された子宮受容性プロファイルに基づき前記対象に対する個別化された推奨を判定することと、
   を含む方法。
9. 生殖補助医療（ＡＲＴ）処置についてメスの対象を評価するための方法であって、
   前記メスの対象から情報の項目を得て前記メスの対象についてのプロファイルを提供することであって、情報の各項目が予め選択した対象の変数に関連し、前記変数のうちの１つが請求項６または７で定義される子宮受容性プロファイルであることと、
   前記メスの対象についての前記プロファイルを、前記予め選択した対象の変数に基づくアルゴリズムを使用して、生殖補助医療処置に対する応答性を示すと知られている既知のプロファイルパターンのライブラリと比較することと、
   を含み、
   前記比較することが、ＡＲＴ処置についての前記メスの対象の評価を提供する、
   方法。
10. 前記予め選択した対象の変数が、組織学的日付付与（受容性ウィンドウの判定）；子宮内膜の特性（子宮内膜の厚さ、子宮内膜の体積、子宮内膜の血管新生、子宮動脈ドップラー）；年齢；不妊の原因；不妊症のデータ（以前の病歴ならびに移植した胚の数および質の概要）；卵巣予備能のホルモン的評価（ＡＭＨ、ＦＳＨ、胞状卵胞数計測）；ＡＲＴの種類（ＩＶＦ、ＩＣＳＩ、ＩＭＳＩ、受精）を含む、請求項９に記載の方法。
11. 生殖補助医療処置についてメスの対象を評価する際のデータ分析のためのシステムであって、
    コンピュータ環境、
    コンピュータ環境と接続された、ユーザからデータを受信するための入力デバイスであって、受信されるデータがメスの対象についてのプロファイルを提供するために前記メスの対象からの情報の項目を含み、情報の各項目が予め選択した対象の変数に関連し、前記変数のうちの１つが請求項６または７で定義される子宮受容性プロファイルである、入力デバイス、
    前記コンピュータ環境と接続された、前記ユーザに情報を提供するための出力デバイス、および
    前記メスの対象についてのプロファイルを、生殖補助医療処置に対する応答性を示すと知られている既知のプロファイルパターンのライブラリと比較するために提供される少なくとも１つのアルゴリズムを格納するコンピュータ可読格納媒体であって、生殖補助医療処置についてメスの対象を評価する際のデータ分析を提供するレポートの作成のために使用できる結果を前記システムが提供する、コンピュータ可読格納媒体、
    を含むシステム。
12. 前記予め選択した対象の変数が、組織学的日付付与（受容性ウィンドウの判定）；子宮内膜の特性（子宮内膜の厚さ、子宮内膜の体積、子宮内膜の血管新生、子宮動脈ドップラー）；年齢；不妊の原因；不妊症のデータ（以前の病歴ならびに移植した胚の数および質の概要）；卵巣予備能のホルモン評価（ＡＭＨ、ＦＳＨ、胞状卵胞数計測）；ＡＲＴの種類（ＩＶＦ、ＩＣＳＩ、ＩＭＳＩ、受精）を含む、請求項１１に記載のシステム。
13. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＩＬ−１２のうちの少なくとも１つの発現ならびにＩＬ−１５およびＣＤ−５６の発現を測定するための試薬、
    任意に、ＴｗｅａｋおよびＦｎ−１４の発現を測定するための試薬、
    任意に、ＧＣＳＦ−Ｒの発現を測定するための試薬、
    任意に、参照遺伝子の発現を測定するための試薬、および
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実行するための説明書、
    を含むキット。

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