BR112015000449B1 - Anticorpos da família anti-dr5, anticorpos da família anti-dr5 multivalentes ou biespecíficos e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS DA FAMÍLIA ANTI-DR5, ANTICORPOS DA FAMÍLIA ANTI-DR5 MULTIVALENTES OU BIESPECÍFICOS E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS. Anticorpos membros da família anti-DR5 e anticorpos biespecíficos que compreendem um ou mais anticorpos membros da família anti-DR5 são revelados. Esses anticorpos podem ser usados para desencadear morte celular em células DR5 positivas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se aos campos da imunologia, oncologia e, mais especificamente, a moléculas de anticorpo biespecíficas ou multivalentes que podem ser usadas para vantagem no tratamento de vários cânceres, doenças autoimunes, doenças infecciosas que expressam o antígeno DR5. A presente invenção é relacionada a polipeptídeos inovadores que se ligam especificamente ao receptor de DR5 também chamado de receptor 2 de TRAIL. A invenção refere-se particularmente a um polipeptídeo que tem dois domínios de ligação diferentes ou uma combinação de polipeptídeos que têm esses domínios de ligação diferente, que se ligam a diferentes epitopos do receptor de DR5, através do qual a apoptose é induzida. A invenção também se refere a composições farmacêuticas que contêm esses polipeptídeos e o tratamento de câncer, doenças autoimunes e infecções virais com o uso desses polipeptídeos e composições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A apoptose ou morte celular programada é um processo fisiológico essencial para o desenvolvimento normal e homeostase de organismos multicelulares. Os transtornos da apoptose contribuem para a patogênese de diversas doenças humanas incluindo o câncer, distúrbios neurodegenerativos e síndrome da imunodeficiência adquirida.

[0003] O ligante de indução de apoptose (TRAIL) relacionado ao fator de necrose tumoral, um membro da superfamília TNF das citocinas, é uma proteína de membrana do tipo 2 que é expressa na maioria dos tecidos normais e pode passar pela clivagem de protease, resultando em uma forma solúvel que pode se ligar a receptores de TRAIL, (Wiley SR. et al., Immunity. 1995; 3:673 a 682; Daniel PT et al., J Immunol. 1994; 152:5.624).

[0004] Os ligantes dessa família geralmente reconhecem e se ligam a um subconjunto limitado de receptores cognatos na superfície celular, levando a cascatas de transdução de sinal a jusante do receptor, permitindo a ativação de um grande painel de trajetória de sinalização incluindo NF-kB ou ativação de caspase. TRAIL induz a apoptose de determinadas células transformadas, incluindo um número de diferentes tipos de células de câncer assim como células viralmente infectadas, enquanto não induz a apoptose de vários tipos de células normais e é, assim, de interesse particular no desenvolvimento de terapias contra o câncer, (Walczak et al., Nature Medecine. 1999; 5/157 a 163, Ashkenazi A. et al., J Clin Invest. 1999; 104:155).

[0005] Há quatro receptores de superfície celular conhecidos para TRAIL. O Receptor 1 de TRAIL (TRAIL-R1, DR4) e o Receptor 2 de Trail (TRAIL-R2, DR5, Apo-2, TRICK2, Killer, TR6, Tango-63) têm um domínio de morte citoplasmático e podem ativar a apoptose em células tumorais por meio da ativação de caspase a jusante. Os outros dois receptores Receptor 3 de TRAIL (TRAIL-R3, DcR1, TR5, TRIDD, LIT) e Receptor 4 de TRAIL (TRAIL-R4, DcR2, TRUNDD) não tem um domínio de morte citoplasmático e não mediam a apoptose. Adicionalmente, a osteoprotegerina (OPG), um membro solúvel (secretado) da família de receptor de TNF das proteínas, também liga TRAIL.

[0006] Os domínios intracitoplásmicos de DR4 e DR5 incluem, cada um, um assim chamado domínio de morte. Após a ativação de seus receptores DR4 e DR5, a molécula adaptadora de domínio de morte associada a fas é recrutada para o receptor, levando a uma clivagem autoproteolítica e ativação da caspase-8 iniciadora. DR4 e DR5 foram relatados a transduzir um sinal apoptótico para células de câncer sensíveis a TRAIL, mediante a ligação de TRAIL. A caspase-8 ativa, por sua vez, aciona a ativação proteolítica de caspases a jusante incluindo a caspase-3. As caspases a jusante degradam, por fim, uma ampla faixa de proteínas celulares e a apoptose é finalizada.

[0007] A expressão de DR4 ou de DR5 é frequentemente detectada em cânceres humanos, incluindo câncer de cólon, gástrico, pancreático, de ovário, de mama e de pulmão de célula não pequena com baixa ou nenhuma expressão em tecidos normais.

[0008] No desenvolvimento ou progressão de muitas doenças, é frequentemente o caso em que as células não são deletadas. Em muitas doenças autoimunes e afecções inflamatórias, as células ativadas de sobrevivência atacam células ou tecidos normais. Ademais, a progressão da tumorogênese e a formação proliferativa de pannus da artrite reumatoide são caracterizadas pela proliferação não verificada das células. Assim, a apoptose insuficiente leva ao desenvolvimento da doença e os usados do Mab agonístico ou ligante de indução de apoptose para aprimorar a apoptose são considerados como uma estratégia terapêutica potencial para eliminar aquelas células indesejadas

[0009] TRAIL induz a apoptose em uma ampla faixa de células de tumor sólido e in hematopoiético, enquanto poupa a maioria das células normais. TRAIL tem atividade de indução de apoptose contra células de câncer in vitro e atividade antitumoral potente contra xenoenxertos de vários cânceres in vivo.

[0010] TRAIL e seus derivados, incluindo receptores de TRAIL de alvejamento de anticorpos agonísticos são compostos atraentes para a terapia contra câncer devido à sua capacidade de induzir a regressão tumoral sem efeitos colaterais significativos.

[0011] Há muitas ocorrências na literatura de patente de esforços para usar os polipeptídeos derivados do ligante de TRAIL como a terapia contra células cancerosas (documentos no US20090131317; US 6.469.144; US 6.740.739; US20070026000; US 6.444.640; US20050244857; US20050233958; US 7.736.637).

[0012] Os polipeptídeos de TRAIL foram primeiro estudados como ferramentas para induzir a trajetória apoptótica, mas têm a desvantagem de uma meia vida curta.

[0013] Atualmente, quantidade de atenção se concentrou no desenvolvimento de estratégias de imunoterapia inovadoras para o tratamento de câncer. Tal estratégia é a terapia contra câncer de base de anticorpo.

[0014] O determinante mais proeminente das propriedades de alvejamento acima é o tamanho da molécula baseada em anticorpo em relação ao grau de especificidade, retenção em tumores e seu espaçamento. Outro recurso importante das moléculas baseadas em anticorpo é a valência, conforme a retenção de tumor significativamente maior foi associada à ligação multivalente ao alvo, (Adams et al., Cancer Res. 1993; 51:6.363 a 6.371; Wolf et al., Cancer Res. 1993; 53:2.560 a 2.565).

[0015] Conforme mencionado anteriormente, os anticorpos agonísticos contra DR4 ou DR5 foram produzidos e representam uma nova geração de terapia contra câncer. Trabalhos foram conduzidos também no uso de anticorpos agonísticos direcionados com os receptores de TRAIL a fim de induzir a trajetória apoptótica de TRAIL.

[0016] Supõe-se que os anticorpos monoclonais agonísticos que se ligam especificamente a DR4 ou DR5 possam induzir diretamente a apoptose de células tumorais alvejadas, (Buchsbaum DJ et al., Future Oncol. 2006; 2:493; Rowinsky EK et al., J Clin Oncol. 2005; 23:9394).

[0017] Outras patentes referem-se ao uso de anticorpos agonísticos direcionados contra DR4 ou DR5 ou DR4 e DR5 ou ao uso combinado dos anticorpos contra DR5 e outro agente quimioterapêutico: documentos no US20040147725; US 20090022707; US20080248037; US20020155109; US 6.461.823; US 6.872.568; US 7.064.189; US 6.521.228; US 7.704.502.

[0018] O tratamento combinado com os anticorpos agonísticos contra diferentes receptores de TRAIL, por exemplo, DR4 e DR5, foi desenvolvimento também. Para preparação, anticorpos biespecíficos agonísticos que ligam DR4 ou DR5 (ou hibridomas que produzem tais MAbs agonísticos) podem ser empregados como materiais de partida em vários procedimentos (documento noWO 2002/0155109).

[0019] Os mesmos incluem lexatumumabe de MAb anti-DR5, (Plummer R. et al., Clin Cancer Res. 2007; 13:6.187), o apomabe de MAb anti-DR5, (Adams C. et al., Cell Death Differ. 2008; 15:751), o LBy135 de MAb anti-DR5, (Li J. et al., AACR Meeting Abstracts. 2007. Abstract 4874), o WD-1 de MAb anti-DR5, (Wang J. et al., Cell Mol Immunol. 2008; 5:55) e o AMG655 de MAb anti-DR5, (Wall J. et al., AACR Meeting Abstracts. 2008. Abstract 1326, Kaplan-Lefko P. et al., AACR Meeting Abstracts. 2008. Abstract 399). Uma revelação consistente de todos esses estudos é a variabilidade considerável na sensibilidade de várias linhagens celulares tumorais para a citotoxicidade mediada por anti-DR5.

[0020] Os anticorpos agonísticos anti-DR4 ou anti-DR5, incluindo mapatumumabe ou lexatumumabe, respectivamente, são também bem tolerados em pacientes (Herbst R.S. et al., J Clin Oncol. 2006; 24(18S)/3013; Hotte S.J. et al., Clin Cancer Res. 2008; 14/3.450 a 3.455; Wakelee H.A et al., Ann Oncol. 2010; 21/376 a 381; Fox N.L. et al., Expert Opin Biol Ther. 2010; 10/1 a 18).

[0021] Lexatumumabe (também conhecidos como ETR2-ST01) é um anticorpo monoclonal humano agonístico contra DR5 usado no tratamento de câncer. Os anticorpos HGS-ETR2 foram gerados por HGS através da colaboração com Tecnologia de Anticorpo de Cambridge.

[0022] Tigatuzumabe (CS-1008) é um anticorpo monoclonal de lgG1 humanizado composto das regiões CDR de mTRA-8. O anticorpo monoclonal anti-DR5 murino, TRA-8 (mTRA-8), foi selecionado a partir de uma série de anticorpos monoclonais anti-DR5 com base em sua especificidade, capacidade de acionar apoptose in vitro sem o uso de reagentes de reticulação e falta de toxicidade de hepatócitos humanos, (Buchsbaum DJ et al., Clin Cancer Res. 2003; 9:3731; lchikawa K. et ai, Nat Med. 2001; 7:954).

[0023] Tigatuzumabe media um padrão muito similar da citotoxicidade in vitro e eficácia antitumoral in vivo como mTRA-8. O mesmo mostrou ter citotoxicidade in vitro potente a uma variedade de linhagens celulares tumorais humanas e eficácia antitumoral in vivo em modelos de xenoenxerto murinos de cânceres humanos. Sua citotoxicidade in vitro e eficácia antitumoral in vivo podem ser substancialmente aprimoradas em combinação com uma variedade de agentes quimioterapêuticos e/ou radiação, (Buchsbaum DJ et al., Clin Cancer Res. 2003; 9:3.731; DeRosier LC et al., Clin Cancer Res. 2007; 13:5535s).

[0024] Os anticorpos anti-DR4 e anti-DR5 foram testados em associações, em conjunto ou com outros agentes quimioterapêuticos ou terapias. Um tratamento combinado de tumores colorretais com dois anticorpos agonísticos HGS-ETR1 (anti- DR4) e HGS-ETR2 (anti-DR5) e radioterapia levou a efeitos aprimorados in vitro e um atraso de crescimento dependente de dose in vivo (Marini P et al., Oncogene. 2006; 25 (37):5.145 a 5.154). Os anticorpos agonísticos completamente humanos a DR4 e DR5 demonstraram em células primárias e de linfoma cultivadas a indução da apoptose e aprimoramento da morte celular induzida por doxorubicina e bortezomibe (Georgakis GV et al., Oncogene. 2006; 25(37): 5145-54). Foi revelado que a expressão do DR5 e a suscetibilidade à apoptose induzida por TRAIL de células de câncer de mama é aprimorada pela radiação, sugerindo que, combinada com a radiação, a eficácia de TRAIL seria aumentada na terapia contra câncer (Chinnaiyan A.M et al., PNAS. 2000; 97/1754-1759).

[0025] A combinação do anticorpo e quimioterapia aprimora usualmente o grau de apoptose e pode inverter parcialmente a resistência em algumas linhagens celulares (Buchsbaum DJ et al., J Clin Cancer Res. 2003; 9:3.731; DeRosier LC et al., Clin Cancer Res. 2007; 13:5535s; Oliver PG et al., Clin Cancer Res. 2008; 14:2.180; Derosier LC et al., Mol Cancer Then 2007; 6:3.198; Long JW. et al., J Surg Res. 2007; 137:167).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0026] Os presentes inventores revelaram agora que, inesperadamente, é possível induzir a trajetória apoptótica DR5 com o uso de dois anticorpos direcionados contra pelo menos dois epitopos diferentes do receptor de DR5. A ligação a ambos os epitopos no mesmo receptor tem uma ação agonística no receptor e induz a apoptose de um modo eficaz. A combinação dos anticorpos DR5- 01 e DR5-05 conforme revelado no presente documento revelou uma ação agonística mais forte do que o próprio ligante.

[0027] Uma ação inesperada e sinérgica foi observada com o uso de dois anticorpos direcionados, cada um, contra um epitopo diferente no receptor de DR5, em relação a um anticorpo contra um único epitopo. Sem se ater à teoria, é postulado que a ligação aos dois epitopos de DR5 permite uma função de agonista sinérgica, levando a uma indução de apoptose inesperadamente elevada. Foi revelado que a ação inesperada e sinérgica pode ser benéfica para o tratamento terapêutico ou para a integração a um protocolo terapêutico. Foi assim revelado que a combinação dos anticorpos pode levar a um aumento sinérgico da inibição da proliferação de células de câncer particularmente no glioma. Foi também revelado que a combinação dos anticorpos e um fármaco quimioterapêutico pode levar a um aumento sinérgico da inibição da proliferação de células de câncer no caso de cânceres que são difíceis de tratar, tal como glioma, cânceres de pulmão e mama que resistem mais ou menos a fármacos quimioterapêuticos. Foi também revelado que a combinação dos anticorpos e fármaco pode permitir a obtenção de um efeito terapêutico, tal como a inibição da proliferação de células, que é estavelmente obtida ao longo de uma ampla faixa de dosagens de fármaco e/ou anticorpos.

[0028] É, assim, possível agora fornecer composições farmacêuticas que compreendem dois polipeptídeos ou anticorpos que atuam como agonistas ligando- se aos dois epitopos diferentes em DR5 ou anticorpos biespecíficos que atuam como agonistas ligando-se aos dois epitopos diferentes em DR5 e composições farmacêuticas que contêm os mesmos.

[0029] Um "agonista" ou um "polipeptídeo ou anticorpo agonístico" para um receptor natural receptor é um composto que se liga ao receptor para formar um complexo de receptor-agonista e que ativa o dito receptor, iniciando uma sinalização de trajetória e um processo biológico adicional. No contexto da presente invenção, uma função de agonista é obtida devido à interação simultânea ou sequencial entre os polipeptídeos ou anticorpos da invenção e dois epitopos diferentes do receptor de DR5, iniciando a trajetória de apoptose de DR5.

[0030] Um objetivo da invenção é, assim, uma composição que compreende dois polipeptídeos ou anticorpos ou fragmento dos mesmos, sendo que ambos têm a capacidade de se ligar a DR5, um primeiro polipeptídeo ou anticorpo que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5 e um segundo polipeptídeo ou anticorpo que compreende um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que se liga a um segundo epitopo do dito DR5. Cada um dentre o primeiro e o segundo sítios de ligação de antígeno se liga a um epitopo diferente na mesma molécula de DR5. Os dois polipeptídeos ou anticorpos ou fragmentos dos mesmos são para uma administração simultânea, separada ou sequencial a um mamífero, incluindo um humano.

[0031] A composição ou composição farmacêutica pode conter adicionalmente um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os polipeptídeos ou anticorpos são sinergicamente agonísticos em combinação, o que significa que os mesmos têm a capacidade mediante a ligação a ambos epitopos de uma molécula de DR5 de induzir a trajetória apoptótica de DR5.

[0032] Um objetivo da invenção é também um anticorpo biespecífico ou biparatópico ou fragmento do mesmo que tem a capacidade de se ligar a DR5, sendo que o dito anticorpo compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5 e um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que se liga a um segundo epitopo do dito DR5. Cada um dentre o dito primeiro e o dito segundo sítios de ligação de antígeno se liga a um epitopo diferente na mesma molécula de DR5. Os polipeptídeos ou anticorpos são sinergicamente agonísticos em combinação, o que significa que os mesmos têm a capacidade mediante a ligação de ambos a seus epitopos específicos de uma molécula de DR5 de induzir a trajetória apoptótica de DR5.

[0033] A invenção abrange a ligação de um anticorpo biespecífico dos dois epitopos diferentes da mesma molécula de DR5 ou dos dois anticorpos biespecíficos aos dois epitopos da mesma molécula de DR5, um anticorpo a um primeiro epitopo, o segundo ao segundo epitopo da mesma molécula de DR5.

[0034] O anticorpo biespecífico pode ser formulado em uma composição farmacêutica que contém adicionalmente um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0035] Sem se atar à teoria, considera-se que, em relação ao mecanismo de ação, a combinação de anticorpo ou anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção pode promover o agrupamento de DR5. Esses componentes podem promover o acúmulo de DR5 de concentração maior em comparação a um anticorpo monoespecífico.

[0036] A combinação de anticorpo ou anticorpos biespecíficos podem promover também uma alteração de conformação que induz uma incidência maior para ativar a sinalização de apoptose ou reverter a resistência da célula de câncer à apoptose. Esses componentes podem promover o acúmulo de DR5 de concentração maior em comparação a um anticorpo monoespecífico.

[0037] Um objetivo da invenção é abranger a ligação de pelos menos dois, três, quatro, cinco ou mais polipeptídeos de ligação monovalente ou anticorpos ou fragmento dos mesmos, sendo que ambos têm a capacidade de se ligar a DR5, um primeiro polipeptídeo ou anticorpo que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5 e um segundo polipeptídeo ou anticorpo que compreende um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que se liga a um segundo epitopo do dito DR5.

[0038] Outro objetivo da invenção é, assim, uma composição que compreende pelo menos um fármaco quimioterapêutico e dois polipeptídeos ou anticorpos ou fragmento dos mesmos, sendo que ambos têm a capacidade de se ligar a DR5, um primeiro polipeptídeo ou anticorpo que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5 e um segundo polipeptídeo ou anticorpo que compreende um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que se liga a um segundo epitopo do dito DR5. Cada um dentre o dito primeiro e o dito segundo sítio de ligação de antígenos se liga a um epitopo diferente na mesma molécula de DR5. O fármaco e os dois polipeptídeos ou anticorpos ou fragmentos dos mesmos são para uma administração simultânea, separata ou sequencial a um mamífero, incluindo um humano. Nesse objetivo, os dois polipeptídeos podem ser substituídos por um anticorpo biespecífico ou biparatópico ou fragmento do mesmo, conforme revelado no presente documento.

[0039] Os polipeptídeos, especialmente anticorpos, de acordo com a invenção podem ser adicionalmente definidos pelas CDRs das regiões VH e VL dos anticorpos murinos DR5-01 e DR5-05 ou por suas regiões VH e VL completas.

[0040] Um objetivo da invenção é uma composição que compreende pelo menos um ou dois polipeptídeos que ligam especificamente um receptor de DR5, em que o pelo menos um ou dois polipeptídeos compreendem dois domínios de ligação de imunoglobulina que compreendem:

[0041] - um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que

[0042] o a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência FAS, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 17; ou

[0043] o em que a cadeia VH contém a CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO:22, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 23, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 24; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 25, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 26, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 17, ou

[0044] o em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 32, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência

[0045] SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 24; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência FAS, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 17, e

[0046] - um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que

[0047] o a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência RTS, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 21, ou

[0048] o em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 27, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 28, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 29; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 30, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 31, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 21, ou

[0049] o em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 33, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 29; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência RTS, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 21, em que

[0050] - o pelo menos um polipeptídeo compreende ambos os domínios de ligação de imunoglobulina, ou

[0051] - os pelo menos dois polipeptídeos compreendem um primeiro polipeptídeo que compreende o primeiro domínio de ligação e um segundo polipeptídeo que compreende o segundo domínio de ligação para uma administração simultânea, separada ou sequencial a um mamífero, incluindo um homem e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição compreende adicionalmente um fármaco quimioterapêutico para uma administração simultânea, separada ou sequencial a um mamífero, incluindo um homem.

[0052] Outros objetivos da invenção são os polipeptídeos ou anticorpos individuais e suas várias combinações em concordância com a invenção, kits que compreendem pelo menos dois polipeptídeos ou anticorpos e kits que compreendem pelo menos um polipeptídeo ou anticorpo e pelo menos um fármaco, em que os anticorpos ou polipeptídeos e fármacos são separados ou não.

[0053] Os polipeptídeos ou anticorpos da invenção podem compreender um ou diversos, de preferência dois, sítios de ligação ou domínios ou paratopos. Um objetivo da presente invenção é um polipeptídeo que liga especificamente um receptor de DR5 que compreende um ou mais, de preferência um ou dois, domínios de ligação de imunoglobulina que compreendem:

[0054] - um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que:

[0055] a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência FAS, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 17 (CDRs do tipo DR5-01), ou

[0056] a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO:22, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 23, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 24; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 25, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 26, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 17, (CDRs do tipo DR5-01), ou

[0057] a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 32, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 24; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência FAS, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 17 (CDRs do tipo DR5-01), e/ou

[0058] - um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que:

[0059] a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência RTS, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 21 (CDRs do tipo DR5-05), ou

[0060] a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 27, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 28, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 29; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 30, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 31, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 21 (CDRs do tipo DR5-05), ou

[0061] a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 33, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 29; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 que compreende ou que consiste na sequência RTS, uma CDR3 que compreende ou que consiste na sequência SEQ ID NO: 21, (CDRs do tipo DR5-05). O domínio de ligação é melhor definido pelas cadeias VH e VL que compreendem as CDRs definidas com base no mesmo método, ou IMGT®, Kabat® ou sistema de numeração comum, consulte a tabela de CDR a seguir.

[0062] As cadeias VH e VL definem, em conjunto, um único sítio de ligação. Cada um desses domínios de ligação se liga especificamente a um epitopo diferente no receptor de DR5. Os polipeptídeos são sinergicamente agonísticos, o que significa que os mesmos têm a capacidade, mediante a ambos os epitopos de uma molécula de DR5, de induzir a trajetória apoptótica de DR5.

[0063] Por "domínio de ligação de imunoglobulina" ou "domínio de ligação" entende-se o paratopo de uma imunoglobulina feita de duas cadeias leve variável (VL) e pesada variável (VH). O paratopo pode se ligar especificamente ao epitopo alvo.

[0064] Em concordância com a invenção, as cadeias VL e VH têm uma estrutura convencional de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de uma imunoglobulina, com as regiões de arcabouço FR. A estrutura pode ser definida como a estrutura FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo da invenção compreende um ou mais, de preferência um ou dois, domínios de ligação de imunoglobulina que compreendem a região VH + VL de mDR5-01 e/ou a região VH + VL de mDR5-05. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem a região VH + VL de mDR5-01. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem a região VH + VL de mDR5-05. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação que compreendem a região VH + VL de mDR5-05, por um lado, e a região VH + VL de mDR5-01, por outro lado. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo da invenção compreende um ou mais, de preferência um ou dois, domínios de ligação de imunoglobulina que compreendem a região VH + VL de HzDR5-01 e/ou a região VH + VL de HzDR5-05. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem a região VH + VL de HzDR5-01. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem a região VH + VL de HzDR5-05. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação que compreendem a região VH + VL de HzDR5-05, por um lado, e a região VH + VL de HzDR5-01, por outro lado.

[0065] O polipeptídeo anti-DR5 compreende, assim, um ou dois domínios de ligação. Em uma modalidade, os domínios de ligação são específicos do mesmo epitopo no receptor de DR5. Esses domínios de ligação compreendem o mesmo conjunto de 3 CDRs na VH e VL conforme revelado e fornecido no mesmo e podem ser idênticos ou levemente diferente nas regiões de arcabouço, tão logo não afete a especificidade de ligar o epitopo alvo.

[0066] O polipeptídeo anti-DR5 pode ser, particularmente, um anticorpo, de preferência um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo adequado, tal como um fragmento de anticorpo adequado, tal como um Fv, um Fab, um F(ab')2, um fragmento variável de cadeia única (scFv).

[0067] A invenção também abrange o uso combinado de polipeptídeos ou anticorpos ou de polipeptídeos ou anticorpos biespecíficos ou fragmentos e similares, fazendo uso da atividade sinérgica vinculada à ligação dos dois epitopos revelados pela presente invenção. Esse uso pode ser adicionalmente combinado com a administração de um fármaco quimioterapêutico, conforme revelado no presente documento.

[0068] Outro objetivo da invenção abrange a ligação de pelos menos dois, três, quatro, cinco ou mais polipeptídeos de ligação monovalente ou anticorpos ou fragmento dos mesmos, sendo que ambos têm a capacidade de se ligar a DR5, um primeiro polipeptídeo ou anticorpo que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5 e um segundo polipeptídeo ou anticorpo que compreende um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que se liga a um segundo epitopo do dito DR5.

[0069] Assim, outro objetivo da invenção é uma composição que compreende dois polipeptídeos ou anticorpos ou fragmento do mesmo, sendo que ambos têm a capacidade de se ligar a DR5, um primeiro polipeptídeo ou anticorpo que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5, sendo que esse primeiro epitopo é aquele ao qual se liga especificamente um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 e sequência SEQ ID NO: 17, e um segundo polipeptídeo ou anticorpo que compreende um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que se liga a um segundo epitopo do dito DR5, sendo que esse epitopo é aquele ao qual se liga especificamente um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21, para uma administração simultânea, separada ou sequencial a um mamífero, incluindo um homem. Como uma alternativa, pode-se substituir, no presente documento acima, a definição das CDRs por aquelas de acordo com o Sistema de numeração Comum ou Kabat® como pelas Tabelas 1 e 2.

[0070] Outro objetivo da invenção é um anticorpo biespecífico ou fragmento do mesmo, que tem capacidade de se ligar a DR5, sendo que o dito anticorpo compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5, sendo que esse primeiro epitopo é aquele ao qual se liga especificamente um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 e sequência SEQ ID NO: 17, e um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que se liga a um segundo epitopo do dito DR5, sendo que esse epitopo é aquele ao qual se liga especificamente um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21. Como uma alternativa, pode-se substituir acima a definição das CDRs por aquelas de acordo com o Sistema de numeração Comum ou Kabat® como pelas Tabelas 1 e 2.

[0071] Outro objetivo da invenção é o método de tratamento que compreende a administração de uma quantidade eficaz ou suficiente de pelo menos dois polipeptídeos ou anticorpos conforme revelado no presente documento ou de pelo menos um polipeptídeo ou anticorpo bispecífico ou biparatópico conforme revelado no presente documento ou de pelo menos dois polipeptídeos ou anticorpos e pelo menos um fármaco, conforme revelado no presente documento ou de pelo menos um polipeptídeo ou anticorpo bispecífico ou biparatópico e pelo menos um fármaco, conforme revelado no presente documento. Por tratamento entende-se, particularmente, o tratamento de vários cânceres, doenças autoimunes, doenças infecciosas que expressam o antígeno DR5.

DEFINIÇÕES

[0072] Os termos "apoptose" e "atividade apoptótica" são usados em um sentido amplo e se referem à forma ordenada ou controlada da morte celular em mamíferos que é tipicamente acompanhada por uma ou mais alterações de célula características, incluindo a condensação de citoplasma, perda de microvilosidades da membrana plasmática, segmentação do núcleo, degradação do DNA cromossômico ou perda da função mitocondrial. Essa atividade pode ser determinada e medida, por exemplo, por ensaios de viabilidade celular, análise FACS ou eletroforese de DNA e, mais especificamente, pela ligação de anexina V, fragmentação do DNA, encolhimento de célula, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação de célula e/ou formação das vesículas da membrana (chamadas de corpos apoptóticos).

[0073] Conforme usado no presente documento, o termo "sinergia" ou "sinergismo" ou "sinergicamente" refere-se à interação de dois ou mais agentes de modo que seu efeito combinado seja maior do que a soma dos efeitos individuais.

[0074] Os termos "agonista"' e "agonístico" quando usados no presente documento referem-se a ou descrevem uma molécula que pode, direta ou indiretamente, induzir substancialmente a promoção ou o aprimoramento da ativação ou atividade biológica de DR5. Opcionalmente, um "anticorpo de DR5 agonista" é um anticorpo que tem atividade pelo menos comparável ao ligante para DR5, conhecido como ligante Apo-2 (TRAIL) ou pode ativar o receptor de DR5 o que resulta em uma ativação de mais uma trajetória de sinalização intracelular que pode incluir a ativação de caspase 3, caspase 8, caspase 10 ou FADD.

[0075] Os termos "agonista"' e "agonístico" quando usados no presente documento referem-se a ou descrevem uma molécula que pode, direta ou indiretamente, contrarreagir, reduzir ou inibir substancialmente atividade biológica de DR5 da ativação de DR5. Opcionalmente, um antagonista é uma molécula que neutraliza a atividade biológica resultante da ativação de DR5 ou formação de um complexo entre DR5 e seu ligante, tal como o ligante Apo-2.

[0076] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente os anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo contanto que os mesmos exibam a atividade biológica desejada.

[0077] "Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas" são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas (L) e cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto que o número de ligações de dissulfeto varia dentre as cadeias pesadas de diferentes isótipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH).

[0078] Conforme usado no presente documento, um "anticorpo" refere-se a uma proteína que consiste em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos dos genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, assim como inúmeros genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas ou como kappa ou como lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

[0079] Em relação aos anticorpos da invenção, o termo "imunologicamente específico" ou "liga-se especificamente" refere-se a anticorpos que se ligam a um ou mais epitopos de uma proteína de interesse (por exemplo, DR5/TRAIL R2), mas que não reconhecem substancialmente e ligam outras moléculas em uma amostra que contém uma população misturada de moléculas biológicas antigênicas.

[0080] O "epitopo DR5-01" e o "epitopo DR5-05" são as regiões no domínio extracelular de DR5 ao qual o DR5-01 e os anticorpos de DR5-05 se ligam respectivamente.

[0081] O termo "anticorpo biespecífico" conforme usado no presente documento refere-se a um anticorpo que compreende dois sítios de ligação de antígeno, um primeiro sítio de ligação que tem afinidade para um primeiro antígeno ou epitopo e um segundo sítio de ligação que tem afinidade para um segundo antígeno ou epitopo distinto do primeiro.

[0082] "Anticorpos biespecíficos" ou "anticorpos biparatópicos" são anticorpos únicos e bivalentes que têm dois sítios de ligação de antígeno específicos diferentes. De acordo com esta invenção, esses anticorpos têm dois sítios de ligação diferentes, cada um direcionado contra um epitopo específico e diferente na molécula de DR5. Essa definição também abrange os fragmentos de um anticorpo biespecífico ou biparatópico que compreendem ambos os sítios de ligação e em que cada um desses sítios de ligação tem a capacidade de ligação ao epitopo correspondente em DR5. Tal fragmento pode ser, por exemplo, um fragmento de anticorpo F(ab')2.

[0083] O termo "anticorpo biespecífico e bivalente" conforme usado no presente documento refere-se a um anticorpo conforme descrito acima no qual cada um dos dois pares de cadeia pesada e cadeia leve (HC/LC) está se ligando especificamente a um epitopo diferente, isto é, as primeiras cadeias pesada e leve estão se ligando especificamente, em conjunto, a um primeiro epitopo e as segundas cadeias pesada e leve estão se ligando especificamente, em conjunto, a um segundo epitopo; tais anticorpos biespecíficos e bivalentes podem se ligar especificamente a dois epitopos diferentes, ao mesmo tempo ou não.

[0084] De acordo com a invenção, a razão de um anticorpo biespecífico e bivalente desejado em comparação aos produtos secundários indesejados pode ser melhorada pela substituição de determinados domínios em somente um par de cadeia pesada e cadeia leve (HC/LC). Embora o primeiro dos dois pares de HC/LC se origine de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro epitopo e é deixado essencialmente inalterado, o segundo dos dois pares de HC/LC se origina de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo epitopo e é alterado pela substituição a seguir: • Cadeia leve: substituição do domínio de cadeia leve variável VL pelo domínio de cadeia pesada variável VH do dito anticorpo que se liga especificamente a um segundo epitopo e o domínio de cadeia leve constante CL pelo domínio de cadeia pesada constante CH do dito anticorpo que se liga especificamente a um segundo epitopo, e • Cadeia pesada: substituição do domínio de cadeia pesada variável VH pelo domínio de cadeia leve variável VL do dito anticorpo que se liga especificamente a um segundo epitopo e o domínio de cadeia pesada constante CH pelo domínio de cadeia leve constante CL do dito anticorpo que se liga especificamente a um segundo epitopo.

[0085] As proteínas modificadas tais como anticorpos bi ou multivalentes que podem ligar dois ou mais antígenos ou epitopos são conhecidas na técnica. Tais proteínas de ligação multivalente podem ser geradas com o uso de fusão celular, conjugação química ou técnicas de DNA recombinantes.

[0086] Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos que são muito similares a anticorpos naturais foram produzidos com o uso da tecnologia de quadromas, (Milstein C. et al., Nature. 1983; 305:537 a 540) com base na fusão somática de duas linhagens celulares de hibridoma diferentes que expressam anticorpos monoclonais murinos com as especificidades desejadas do anticorpo biespecífico. Por causa do emparelhamento aleatório das duas cadeias pesada e leve de anticorpo diferentes dentro da linhagem celular de hibridoma híbrido resultante (ou quadroma), até dez espécies de anticorpos diferentes são geradas das quais somente uma é a desejada, o anticorpo biespecífico funcional. Devido à presença de subprodutos emparelhados de modo errôneo e rendimentos de produção significativamente reduzidos, produtos de purificação sofisticados são exigidos, (Morrison S.L., Nature Biotech. 2007; 25:1.233 a 1.234). Em geral, o mesmo problema de subprodutos emparelhados de modo errôneo permanece se técnicas de expressão recombinante forem usadas.

[0087] Uma abordagem para contornar o problema de subprodutos emparelhados de modo errôneo, que é conhecida como "saliências-em-orifícios", tem como objetivo forçar o emparelhamento de duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes introduzindo-se mutações nos domínios CH3 para modificar a interface de contato. Em uma cadeia, aminoácidos volumosos são substituídos por aminoácidos com cadeias laterais curtas para criar um "orifício". Inversamente, aminoácidos com cadeias laterais grandes são introduzidos no outro domínio CH3, para criar uma "saliência". Coexpressando-se essas duas cadeias pesadas (e duas cadeias leves idênticas, que têm que ser apropriadas para ambas as cadeias pesadas), rendimentos altos de formação de heterodímero ("saliência-orifício") versus a formação de homodímero ("orifício-orifício" ou "saliência-saliência") podem ser observados, {Ridgway, JB et ai., Protein Eng. 1996; 9:617 a 621; e WO 96/02701 1).

[0088] "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência a região variável ou de ligação de antígeno do anticorpo intacto. Um "fragmento de anticorpo" adequado é um fragmento do anticorpo que tem a capacidade de se ligar ao epitopo DR5 e iniciar a trajetória de apoptose.

[0089] Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares, (Zapata et ai., Protein Eng. 1995; 8(10):1.057 a 1.062); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multivalentes formados de fragmentos de anticorpo.

[0090] Um anticorpo "intacto" é um que compreende uma região variável de ligação de antígeno assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. A digestão de papaína dos anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados de fragmentos "Fab", sendo que cada um compreende um único sítio de ligação de antígeno e uma região CL e uma CH1 e um fragmento Fc residual. O tratamento de pepsina rende um fragmento "F(ab')2" que tem dois sítios de ligação de antígeno e ainda tem a capacidade de reticulação de antígeno.

[0091] "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação de antígeno e reconhecimento de antígeno completo. Essa região consiste em um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação não covalente estreita. É nessa configuração que as três regiões hipervariáveis (CDRs) de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis ou CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo.

[0092] O fragmento "Fab" também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada e tem apenas um sítio de ligação ao antígeno.

[0093] Fragmentos "Fab" diferente de fragmentos Fab pela adição de alguns poucos resíduos no carbóxi-terminal do domínio de CH1 de cadeia pesada incluindo- se uma ou mais cisteínas da região de região de dobradiça de anticorpo.

[0094] Fragmentos de anticorpo de F(ab')2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos de Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre os mesmos. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhecidos (Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996, US 4 342 566).

[0095] Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeos. Preferencialmente, o scFv compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que habilita o scFv a formar a estrutura desejada para ligação de antígeno.

[0096] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de modo intercambiável no presente documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente assim como a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoácido que ocorre naturalmente correspondente. O termo também inclui variantes na ligação de peptídeo tradicional que une os aminoácidos que compõem o polipeptídeo. "Peptídeos", "polipeptídeos" e "proteínas" preferenciais são cadeias VH aminoácidos dos quais carbonos são ligados através de ligações de peptídeo.

[0097] O aminoácido terminal em uma extremidade da cadeia (amino-terminal), portanto, tem um grupo amino livre, enquanto o aminoácido terminal na outra extremidade da cadeia (carbóxi-terminal) tem um grupo carboxila livre. Conforme usado no presente documento, o termo "amino-terminal" (abreviado como N- terminal) se refere ao grupo α-amino livre em um aminoácido no amino-terminal de um peptídeo ou para o grupo α-amino (grupo amino quando participa de uma ligação de peptídeo) de um aminoácido em qualquer outra localização dentro do peptídeo. Similarmente, o termo "carbóxi-terminal" se refere ao grupo carboxila livre no carbóxi-terminal de um peptídeo ou o grupo carboxila de um aminoácido em qualquer outra localização dentro do peptídeo. Peptídeos também incluem essencialmente qualquer poliaminoácido incluindo-se, mas sem limitação a miméticos de peptídeo tal como aminoácidos unidos por éter em oposição a uma ligação de amina.

[0098] O termo "variável" se refere ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência dentre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente por todos os domínios variáveis de anticorpos. É concentrado em três segmentos chamados regiões de determinação de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis ambas nos domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas arcabouços (FR). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro regiões de FR, que adotam amplamente uma configuração de folha-β, conectadas por três CDRs, que formam laços de conexão e, em alguns casos que formam parte da estrutura de folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade pelas regiões de FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (Kabat et al., NIH Publ. 1991; N° 91-3242, Vol. 1, 647 a 669). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tal como participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo.

[0099] Os anticorpos monoclonais no presente documento especificamente incluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico a ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente n° U.S. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6.851 a 6.855 (1984)).

[00100] Outras formas preferenciais de "anticorpos quiméricos" incorporados pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi modificada ou mudada daquela do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação a ligação de C1 q e/ou ligação de receptor de receptor Fc (FcR).

[00101] Tais anticorpos quiméricos também são denominados "anticorpos de classe alternada". Anticorpos quiméricos são o produto de genes de imunoglobulina expressados que compreendem segmentos de DNA que codificam regiões variáveis de imunoglobulina e segmentos de DNA que codificam regiões constantes de imunoglobulina. Métodos para produzir anticorpos quiméricos envolvem técnicas de DNA recombinante e transfecção de gene convencionais são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Morrison, S. L et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984; 81:6851 a 6855; Patente n° U.S. 5.202.238 e Patente n° U.S. 5.204.244. O documento n° WO 2006/093794 se refere a composições de ligação de proteína heterodimérica. O documento n° WO 99/37791 descreve derivativos de anticorpo de múltiplos propósitos. Morrison et al., the J. Immunolog. 1998; 160:2.802 a 2.808 se refere à influência de troca de domínio de região variável nas propriedades funcionais de IgG.

[00102] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murina) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias VH imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato ou coelho que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da região de arcabouço (FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes.

[00103] Em uma modalidade preferencial, uma CDR de murina é enxertada na região de arcabouço de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Consultar, por exemplo, Riechmann, L. et al., Nature. 1988; 332: 323 a 327; e Neuberger, MS et al., Nature. 1985; 314: 268 a 270. CDRs particularmente preferenciais correspondem àqueles que representam sequências que reconhecem os antígenos observados acima para anticorpos quiméricos. Outras formas preferenciais de "anticorpos humanizados" incorporados pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi adicionalmente modificada ou mudada daquela do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação a ligação de C1 q e/ou ligação de receptor de receptor Fc (FcR).

[00104] Adicionalmente, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo de recipiente nem na CDR ou sequências de arcabouço importadas. Essas modificações são feitas para refinar e maximizar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente o total de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões de FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também irá compreender otimamente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consultar Jones et al., Nature. 1986; 321:522 a 525; Reichmann et al., Nature. 1988; 332:323 a 329; e Presta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 1992; 2:593 a 596.

[00105] Funções efetoras imunitárias que mostraram contribuir para citotoxicidade mediada por anticorpo incluem citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[00106] A citotoxicidade pode também ser mediada por meio de efeitos antiproliferativos. O mecanismo de modulação de anticorpo de proliferação de célula tumoral é mal compreendido. Entretanto, avanços no entendimento das interações de anticorpos com receptores Fcg (FcgR) em células efetoras imunitárias permitiram a engenharia de anticorpos com função efetora significativamente aprimorada.

[00107] O mecanismo de ação de MAbs é complexo e parece variar para MAbs diferentes. Existem múltiplos mecanismos pelos quais MAbs causam morte de célula alvo. Esses incluem apoptose, CDC, ADCC e inibição de transdução de sinal.

[00108] Funções efetoras tais como CDC e ADCC são funções efetoras que podem ser importantes para a eficácia clínica de MAbs. Todas essas funções efetoras são mediadas pela região de anticorpo Fc e deixam autores tentarem modificações de aminoácido com mais ou menos sucesso. Glicosilação, especialmente fucosilação da região Fc têm uma influência dramática na eficácia de um anticorpo. Isso deixa os autores modificarem as condições de produção dos anticorpos nas células CHO a fim de mudar o perfil de glicosilação em uma tentativa aqui novamente de aprimorar algumas funções efetoras, com mais ou menos sucesso novamente.

[00109] Uma pesquisa anterior mostrou que um polimorfismo do gene FcgRllla codifica tanto para uma fenilalanina (F) quanto uma valina (V) no aminoácido 158. A expressão da isoforma de valina se correlaciona com afinidade aumentada e ligação a MAbs (Rowland AJ, et al.1993. Cancer Immunol Immunother. 37(3): 195 a 202; Sapra P, Allen TM. 2002. Cancer Res 62: 7190-4; M0lh0j M, et al. 2007. Mol Immunol. 44(8): 1.935 a 1.943). Alguns estudos clínicos sustentaram essa revelação com resposta clínica maior a rituximab em pacientes com linfoma não-Hodgkin que demonstram o polimorfismo V/V (Bargou R, et al. 2008. Science. 321:974-7; Bruenke J, 2005. Br J Haematol. 130(2): 218 a 228; Cartron G, Blood. 1 de fevereiro de 2002; 99(3): 754 a 758; Hekman A, et al. 1991. Cancer Immunol Immunother 32:364 a 372).

[00110] O documento n° WO1999051642 descreve uma região Fc de IgC humano variante que compreende uma substituição de aminoácido nas posições 270 ou 329, ou em duas ou mais das posições 270, 322, 329 e 331. Essas modificações procuram aumentar as funções efetoras de CDC e ADCC.

[00111] "Tratamento" ou "terapia" se referem a ambos o tratamento terapêutico e/ou medidas profiláticas ou preventivas.

[00112] "Mamífero" para propósitos de tratamento ou terapia se refere a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo-se humanos, animais domésticos e de fazenda e animais de zoológico, de esportes, ou de estimação, tais como cachorros, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferencialmente, o mamífero é humano.

[00113] Os termos "câncer" e "canceroso" se referem a ou descrevem as condições fisiológicas em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento de célula não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer gastrointestinal, câncer renal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer de cervical, câncer do ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de colo, câncer de colorretal, carcinoma endometrial, carcinoma de glândula salivaria, câncer de rim, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, carcinoma hepático e diversos tipos de câncer de cabeça e pescoço.

[00114] O termo "ácido nucleico" ou "oligonucleotídeo" ou equivalentes gramaticais no presente documento se referem a pelo menos dois nucleotídeos covalentes ligados um ao outro. Um ácido nucleico da presente invenção é preferencialmente de filamento único ou filamento duplo e geralmente irá conter ligações de fosfodiéster.

[00115] "Variantes" da sequência de aminoácidos (ou mutantes) do anticorpo são preparados introduzindo-se mudanças de nucleotídeo apropriadas no DNA do anticorpo, ou por síntese de nucleotídeo. Tais modificações podem ser desempenhadas, entretanto, apenas em uma faixa bastante limitada, por exemplo, conforme descrito acima. Por exemplo, as modificações não alteram as característica de anticorpo mencionadas acima tal como o isótipo de IgG e ligação de antígeno, mas podem aprimorar o rendimento da produção de recombinante, estabilidade de proteína ou facilitar a purificação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00116] As sequências de CDR podem ser definidas de acordo com IMGT®, Kabat® ou o sistema de numeração Comum que retém a sequência comum entre IMGT® e Kabat®.

[00117] As CDRs para os anticorpos da família anti-DR5 mDR5-01 um anticorpo quimérico com VH e VL de murina e Fc humana e HzDR5-01 (um anticorpo humanizado com CDRs de murina e FR humano com ou sem mutação de volta e Fc otimizada ou não) da invenção compreende as seguintes CDRs: Tabela 1

[00118] As CDRs para os anticorpos da família anti-DR5 mDR5-05 e HzDR5-05 da invenção compreende as seguintes CDRs: Tabela 2

[00119] Por definição, essas CDRs incluem CDRs variantes, por eliminação, substituição ou adição de um ou mais aminoácido(s), tal variante mantém a especificidade da CDR original. O sistema de numeração comum fornece para uma definição de CDR que tem as sequências mais curtas de aminoácido ou a definição mínima de CDR.

[00120] mDR5-01, mDR5-05, HzDR5-01 e HzDR5-05 têm as sequências de aminoácidos VH e VL e sequências de ácido nucleico sequências são retratadas nas seguintes tabelas: Tabela 3

Tabela 4

[00121] DR5-01 e DR5-05 têm as sequências de aminoácidos CH e CL e sequências de ácido nucleico são retratadas nas seguintes tabelas: Tabela 5

[00122] Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 da sequência FAS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 17. Esse polipeptídeo se liga especificamente a um primeiro epítopo no receptor DR5. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende dois tais domínios de ligação.

[00123] Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 22, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 23, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 24; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 25, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 26, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 17. Esse polipeptídeo se liga especificamente a um primeiro epítopo no receptor DR5. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende dois tais domínios de ligação.

[00124] Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 32, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 24; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 da sequência FAS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 17. Esse polipeptídeo se liga especificamente a um primeiro epítopo no receptor DR5. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende dois tais domínios de ligação.

[00125] Em outra modalidade, o polipeptídeo compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 da sequência RTS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 21. Esse polipeptídeo se liga especificamente a um segundo e diferente epítopo no receptor DR5. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende dois tais domínios de ligação.

[00126] Em outra modalidade, o polipeptídeo compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 27, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 28, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 29; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 30, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 31, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 21. Esse polipeptídeo se liga especificamente a um segundo e diferente epítopo no receptor DR5. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende dois tais domínios de ligação.

[00127] Em outra modalidade, o polipeptídeo compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 33, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 29; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 da sequência RTS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 21. Esse polipeptídeo se liga especificamente a um segundo e diferente epítopo no receptor DR5. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende dois tais domínios de ligação.

[00128] Em outra modalidade, o peptídeo anti-DR5 compreende dois domínios de ligação e esses dois domínios de ligação são, cada um, específicos de um epítopo diferente no receptor DR5. Esses domínios de ligação compreendem um conjunto específico de 3 CDRs no VH e VL conforme revelado e fornecido nos mesmos e podem ser idênticos ou levemente diferentes nas regiões de arcabouço.

[00129] Esse polipeptídeo anti-DR5 pode ser em particular um F(ab')2, Fab, Fv, um fragmento de variável de cadeia única (scFv), um anticorpo, preferencialmente um anticorpo monoclonal, fragmento, nanocorpo, scFv multimérico.

[00130] Nessa modalidade, o polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, é biespecífico ou biparatópico e compreende:

[00131] - um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência FAS, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 17, e

[00132] - um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência RTS, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 21.

[00133] Em uma modalidade, o polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, é biespecífico ou biparatópico e compreende:

[00134] - um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 22, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 23, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 24; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 25, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 26, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 17, e

[00135] - um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 27, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 28, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 29; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 30, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 31, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 21.

[00136] Em uma modalidade, o polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, é biespecífico ou biparatópico e compreende:

[00137] - um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 32, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 24; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência FAS, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 17, e

[00138] - um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 33, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 29; e a cadeia VL contém uma CDR1 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 que compreende ou consiste na sequência RTS, uma CDR3 que compreende ou consiste na sequência SEQ ID NO: 21.

[00139] Esse polipeptídeo anti-DR5 biespecífico ou biparatópico ou anticorpo compreende os dois domínios diferentes da invenção e pode se ligar especificamente tanto a um dos dois quanto aos dois epítopos diferentes ao mesmo tempo.

[00140] Em algumas modalidades, os polipeptídeos anti-DR5 preferencialmente anticorpo da invenção compreende:

[00141] - um ou mais de pares de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4 (VL e VH de DR5-01) e SEQ ID NO: 6 e 8 (VH e VL de DR5-05),

[00142] - o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4, (VL e VH de DR5-01) - o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 8, (VL e VH de DR5- 05) ou

[00143] - ambos pares da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4 (VL e VH de DR5-01) e SEQ ID NO: 6 e 8 (VL e VH de DR5-05);

[00144] - um ou mais de pares de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37 (VH e VL de HzDR5-01) de SEQ ID NO: 39 e 41 (VH e VL de HzDR5-05),

[00145] - o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37, (VH e VL de HzDR5-01)

[00146] - o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 41, (VH e VL de HzDR5-05) ou

[00147] - ambos pares da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37 (VH e VL de HzDR5- 01) e SEQ ID NO: 39 e 41 (VL e VH de HzDR5-05).

[00148] Em algumas modalidades, o polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo da invenção, compreende:

[00149] - duas de cada sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 10, 2 e 12 (por exemplo, o anticorpo DR5-01 inteiro ou intacto)

[00150] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 10, 2 e 12 (Fv de cadeia única com base em DR5-01);

[00151] - duas de cada sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, 10, 6 e 12 (por exemplo, o anticorpo DR5-05 inteiro ou intacto)

[00152] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 8, 10, 6 e 12 (Fv de cadeia única com base em DR5-05);

[00153] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 8, 2, 6, 10 e 12 (anticorpo biespecífico), especificamente o anticorpo biespecífico compreende SEQ ID NO: 4, 8, 2, 6 (um de cada) e 10, 12 (dois de cada);

[00154] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 12 (cadeia leve);

[00155] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 12 (cadeia leve);

[00156] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 4 e 10 (cadeia pesada);

[00157] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 8 e 10 (cadeia pesada).

[00158] - duas de cada sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35, 10, 37 e 12 (por exemplo, o anticorpo HzDR5-01 inteiro ou intacto)

[00159] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35, 10, 37 e 12 (Fv de cadeia única com base em HzDR5-01);

[00160] - duas de cada sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 39, 10, 41 e 12 (por exemplo, o anticorpo HzDR5-05 inteiro ou intacto)

[00161] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39, 10, 41 e 12 (Fv de cadeia única com base em HzDR5-05);

[00162] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35, 39, 37, 41, 10 e 12 (anticorpo biespecífico), especificamente o anticorpo biespecífico compreende SEQ ID NO: 35, 39, 37, 41 (um de cada) e 10, 12 (dois de cada);

[00163] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 37 e 12 (cadeia leve);

[00164] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 41 e 12 (cadeia leve);

[00165] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 10 (cadeia pesada);

[00166] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 10 (cadeia pesada).

[00167] Os polipeptídeos anti-DR5, preferencialmente anticorpos, da invenção podem ser inteiramente murina, supondo-se que compreendem sequências de aminoácidos que combinam com a sequência de aminoácidos do maternal ou anticorpo de murina original. Os polipeptídeos da invenção também podem ser quiméricos ou humanizados, supondo-se que podem compreender sequências de aminoácidos derivadas de humano. Especificamente, o polipeptídeo pode compreender regiões de arcabouço e/ou regiões constantes de um anticorpo derivado de humano.

[00168] Outro objetivo da invenção é a composição ou composição farmacêutica que compreende um, dois ou mais polipeptídeos de acordo com a invenção, conforme revelado acima e fornecido no presente documento e um portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Modalidades dessas composições são definidas usando-se as definições de CDRs de acordo com IMGT®. Entretanto, a invenção incorpora e se refere também às composições equivalentes ou alternativas em que a numeração de IMGT® é substituída ou pela numeração de Kabat® ou o Sistema de numeração comum, com o uso das sequências indicadas acima. Portanto, nas modalidades seguintes de uma composição, outras modalidades são parte da invenção em que uma substitui as CDRs definidas com numeração de IMGT®, pela numeração de Kabat®, de acordo com a tabela acima. Também, nas modalidades seguintes de uma composição, outras modalidades são parte da invenção em que uma substitui a CDRs definida com numeração de IMGT®, pelo Sistema de numeração comum, de acordo com a tabela acima.

[00169] Em uma primeira modalidade, a composição compreende um polipeptídeo, preferencialmente anticorpo, que tem um ou dois domínio(s) de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 da sequência FAS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 17. Em uma segunda modalidade, a composição compreende um polipeptídeo, preferencialmente anticorpo, que tem um ou mais domínio(s) de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 da sequência RTS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 21. Em uma terceira modalidade, a composição compreende esses dois polipeptídeos ou anticorpos na mistura. Como uma alternativa, uma pode substituir acima a definição das CDRs por aqueles de acordo com Kabat® ou Sistema de numeração Comum conforme as Tabelas 1 e 2.

[00170] Em outra modalidade, a composição compreende um polipeptídeo biespecífico anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 da sequência FAS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 1 e um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, a CDR3 da sequência SEQ I D NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 da sequência RTS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 21. Como uma alternativa, uma pode substituir acima a definição das CDRs por aqueles de acordo com Kabat® ou Sistema de numeração Comum conforme as Tabelas 1 e 2.

[00171] Em uma modalidade, a composição compreende um polipeptídeo anti- DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende a par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4, um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 8 e um portador, diluentes ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade, a composição compreende um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende a par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37, um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 41 e um portador, diluentes ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

[00172] A presente invenção também se refere essas composições que compreendem pelo menos dois polipeptídeos, preferencialmente anticorpos, para uma administração simultânea, separada ou sequencial a um mamífero, incluindo-se o homem.

[00173] Um objetivo particular é uma composição que compreende um anticorpo anti-DR5 biespecífico que compreende um par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4 e um par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 8, ou que compreende um par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37 e um par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 41 e um portador farmaceuticamente aceitável.

[00174] Um objetivo da invenção é especialmente uma composição que compreende pelo menos um ou dois polipeptídeos que ligam especificamente um receptor DR5, em que o pelo menos um ou dois polipeptídeos compreendem dois domínios de ligação de imunoglobulina que compreendem:

[00175] - um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 da sequência FAS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 17, e

[00176] - um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 da sequência RTS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 21, em que

[00177] - o pelo menos um polipeptídeo compreende ambos os domínios de ligação de imunoglobulina, ou os pelo menos dois polipeptídeos compreendem um primeiro polipeptídeo que compreende o primeiro domínio de ligação e um segundo polipeptídeo que compreende o segundo domínio de ligação para uma administração simultânea, separada ou sequencial a um mamífero, incluindo-se o homem.

[00178] - e um portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Como uma alternativa, uma pode substituir acima a definição das CDRs por aqueles de acordo com Kabat® ou Sistema de numeração Comum conforme as Tabelas 1 e 2.

[00179] Em algumas modalidades, a composição da invenção compreende um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende:

[00180] - duas de cada sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 10, 2 e 12 (por exemplo, o anticorpo DR5-01 inteiro ou intacto)

[00181] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 10, 2 e 12 (Fv de cadeia única com base em DR5-01);

[00182] - duas de cada sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, 10, 6 e 12 (por exemplo, o anticorpo DR5-05 inteiro ou intacto)

[00183] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 8, 10, 6 e 12 (Fv de cadeia única com base em DR5-05);

[00184] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 8, 2, 6, 10 e 12 (anticorpo biespecífico), especificamente o anticorpo biespecífico compreende SEQ ID NO: 4, 8, 2, 6 (um de cada) e 10, 12 (dois de cada);

[00185] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 12 (cadeia leve);

[00186] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 12 (cadeia leve);

[00187] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 4 e 10 (cadeia pesada);

[00188] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 8 e 10 (cadeia pesada);

[00189] - duas de cada sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35, 10, 37 e 12 (por exemplo, o anticorpo HzDR5-01 inteiro ou intacto)

[00190] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35, 10, 37 e 12 (Fv de cadeia única com base em HzDR5-01);

[00191] - duas de cada sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 39, 10, 41 e 12 (por exemplo, o anticorpo HzDR5-05 inteiro ou intacto)

[00192] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39, 10, 41 e 12 (Fv de cadeia única com base em HzDR5-05);

[00193] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35, 39, 37, 41, 10 e 12 (anticorpo biespecífico), especificamente o anticorpo biespecífico compreende SEQ ID NO: 35, 39, 37, 41 (um de cada) e 10, 12 (dois de cada);

[00194] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 37 e 12 (cadeia leve);

[00195] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 41 e 12 (cadeia leve);

[00196] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 10 (cadeia pesada);

[00197] - sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 10 (cadeia pesada).

[00198] Essas composições podem compreender pelo menos um polipeptídeo ou anticorpo adicional direcionado contra outro alvo e/ou pelo menos um fármaco quimioterapêutico (tal como molécula pequena), para uma administração simultânea, separada ou sequencial com polipeptídeo(s) ou anticorpo(s) da invenção, a um mamífero, incluindo-se o homem. Como princípio ativo adicional, se pode citar doxorubicina, gemcitabina, camptotecina, paclitaxel. A composição pode compreender dois polipeptídeos, ou anticorpos ou fragmentos dos mesmos, sendo que ambos têm a capacidade de se ligar a DR5, modificado para compreender uma região de Fc de IgG otimizado humano variante, preferencialmente região de Fc de IgG1, em que essa região variante compreende uma substituição de aminoácido para modular PDCC, ADCC e/ou CDC. Em particular, dois polipeptídeos, ou anticorpos ou fragmentos dos mesmos, têm a capacidade de se ligar a DR5 e de se conjugar a componentes citotóxicos celulares (ADC).

[00199] As composições ou composições farmacêuticas de acordo coma invenção são destinadas para uso como um medicamento, especialmente para induzir apoptose de uma célula tumoral. As composições ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção são destinadas para uso como um medicamente, especialmente para tratar câncer, preferencialmente um câncer sólido.

[00200] As sequências de ácidos nucleicos isoladas reveladas e fornecidas no presente documento também são um objetivo da invenção.

[00201] Desse modo, a invenção também se refere a uma sequência de nucleotídeos isolada que compreende as seguintes sequências de nucleotídeos SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7 ou combinações de sequências de nucleotídeos ligadas umas às outras; SEQ ID NO: 9 e 7, ou 9 e 3, SEQ ID NO: 11 e 1, ou 11 e 5. A invenção também se refere a uma sequência de nucleotídeos isolada que compreende as seguintes sequências de nucleotídeos SEQ ID NO: 34, 36, 38, ou 40 ou combinações de sequências de nucleotídeos ligadas umas às outras; SEQ ID NO: 9 e 34, ou 9 e 38, SEQ ID NO: 11 e 36, ou 11 e 40.

[00202] A presente invenção também se refere a um método de prevenção e/ou tratamento de uma doença em que a indução de apoptose de algumas células é benéfica ao mamífero, em particular ao humano, em termos de prevenção ou tratamento (terapêutico ou profilático). Essas doenças são, em particular, câncer, especialmente um daqueles listados nas definições acima, doenças autoimunes, condições inflamatórias, infecções virais e doenças virais. Esse método compreende a administração a um mamífero, incluindo-se humano, de uma quantidade eficaz de uma composição conforme revelado e fornecido no presente documento. O método compreende a administração dos dois polipeptídeos, preferencialmente anticorpos, direcionados contra os dois epítopos diferentes de acordo com a invenção, ou do polipeptídeo biespecífico, preferencialmente anticorpo, direcionado contra os dois epítopos diferentes de acordo com a invenção. Modalidades dessas composições são definidas usando-se as definições de CDRs de acordo com IMGT®. Entretanto, a invenção incorpora e se refere também aos métodos equivalentes ou alternativas em que a numeração de IMGT® é substituída ou pela numeração de Kabat® ou o Sistema de numeração comum, com o uso das sequências indicadas acima. Portanto, nas modalidades seguintes de um método, outras modalidades são parte da invenção em que uma substitui as CDRs definidas com numeração de IMGT®, pela numeração de Kabat®, de acordo com a tabela acima. Também, nas modalidades seguintes de um método, outras modalidades são parte da invenção em que uma substitui a CDRs definida com numeração de IMGT®, pelo Sistema de numeração comum, de acordo com a tabela acima.

[00203] Em uma primeira modalidade, o método compreende a administração de uma composição que compreende um polipeptídeo, preferencialmente anticorpo, que tem um ou dois domínio(s) de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 da sequência FAS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 17. Em uma segunda modalidade, o método compreende a administração de uma composição que compreende um polipeptídeo, preferencialmente anticorpo, que tem um ou dois domínio(s) de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 da sequência RTS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 21. Em uma terceira modalidade, o método compreende a administração de uma composição que compreende esses dois polipeptídeos ou anticorpos em mistura, ou duas composições, sendo que uma contém o primeiro polipeptídeo ou anticorpo mencionado e a segunda compreende o segundo polipeptídeo ou anticorpo mencionado. Como uma alternativa, uma pode substituir acima a definição das CDRs por aqueles de acordo com Kabat® ou Sistema de numeração Comum conforme as Tabelas 1 e 2.

[00204] Em outra modalidade, o método compreende a administração de uma composição que compreende um polipeptídeo biespecífico, preferencialmente anticorpo, que compreende um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 da sequência FAS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 17 e um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 da sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 da sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 da sequência RTS, uma CDR3 da sequência SEQ ID NO: 21. Como uma alternativa, uma pode substituir acima a definição das CDRs por aqueles de acordo com Kabat® ou Sistema de numeração Comum conforme as Tabelas 1 e 2.

[00205] Em uma modalidade, o método fornece a administração de uma composição que compreende um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4 e um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 8 e um portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, o método fornece a administração de duas composições, uma que compreende um polipeptídeo anti- DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4 e outra que compreende um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 8. Em uma modalidade, o método fornece a administração de uma composição que compreende um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37 e um polipeptídeo anti-DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 41 e um portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, o método fornece a administração de duas composições, uma que compreende um polipeptídeo anti- DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37 e outra que compreende um polipeptídeo anti- DR5, preferencialmente anticorpo, que compreende o par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 41.

[00206] Em outra modalidade, o método fornece a administração de uma composição que compreende um anticorpo anti-DR5 biespecífico que compreende um par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4 e um par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 8 e um portador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, o método fornece a administração de uma composição que compreende um anticorpo anti-DR5 biespecífico que compreende um par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37 e um par de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 41 e um portador farmaceuticamente aceitável.

[00207] Em outra modalidade, o método fornece a administração de uma composição que compreende os anticorpos DR5-01 e DR5-05 conforme revelados e fornecidos no presente documento, ou anticorpos similares produzidos através de engenharia genética conforme descrito no presente documento, com base nas sequências de nucleotídeo SEQ ID NO: 9, 3, 11 e 1, ou SEQ ID NO: 9, 34, 11 e 36 para DR5-01, e SEQ ID NO: 9, 7, 11 e 5, ou SEQ ID NO: 9, 38, 11 e 40 para DR5-05; pode ser feito uso de uma composição que compreende esses anticorpos definidos por suas sequências de aminoácidos e que compreendem SEQ ID NO: 4, 10, 2 e 12 para DR5-01 e SEQ ID NO: 8, 10, 6 e 12 para DR5-05, ou SEQ ID NO: 35, 10, 37 e 12 para HzDR5-01 e SEQ ID NO: 39, 10, 41 e 12 para HzDR5-05.

[00208] As composições farmacêuticas, usos e métodos de tratamento são desse modo destinados para a prevenção e/ou tratamento de câncer. Uma lista de cânceres que podem se beneficiar da invenção é dada acima nas Definições.

[00209] As composições farmacêuticas, usos e métodos de tratamento também são desse modo destinados para a prevenção e/ou tratamento de doenças autoimunes e condições inflamatórias. As seguintes doenças são em particular de interesse.

[00210] As composições farmacêuticas, usos e métodos de tratamento também são desse modo destinados para a prevenção e/ou tratamento de infecção viral ou doenças virais. Infecções virais e doenças incluem, mas não são limitadas a, infecções com citomegalovírus, influenza, vírus da doença de Newcastle, vírus da estomatite vesicular, vírus da herpes simplex, hepatite, adenovírus-2, vírus da diarreia viral bovina, vírus de imunodeficiência humana (HIV) e vírus Epstein-Barr.

[00211] Em uma modalidade particular, os polipeptídeos, anticorpos ou anticorpos biespecíficos dessa invenção podem também ser usados para identificar especificamente células cancerígenas, tumores sólidos e similares e mais geralmente, para localizar/entregar qualquer efetor conjugado ou diferentemente acoplado (por exemplo, radioisótopo, identificação, citotoxina, fármaco, lipossoma, anticorpo, ácido nucleico, dendrímero, etc) a células cancerígenas incluindo-se, mas sem limitação a, células cancerígenas isoladas, células metastáticas, células de tumor sólido e similares.

[00212] Portanto, outro objetivo da invenção é um complexo de um polipeptídeo de acordo com a invenção e uma molécula, que é uma molécula efetora, a qual a função pode se beneficiar da localização do receptor DR5 pelo polipeptídeo. Tal molécula efetora pode ser um radioisótopo, uma identificação, uma citotoxina, um fármaco, um lipossoma, um anticorpo, um ácido nucleico, um dendrímero. A invenção também tem interesse em uma composição farmacêutica que contém esse complexo e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00213] A invenção também tem interesse no uso de tal composição e um método também, para prevenir ou tratar um câncer, tal como um daqueles citados acima nas Definições.

[00214] Um polipeptídeo ou os polipeptídeos dessa invenção podem ser usados para identificar outros polipeptídeos ou anticorpos que ligam a um dos epítopos contra o qual o DR5-01 e o DR5-05 são direcionados. Desse modo, em certas modalidades, um polipeptídeo ou anticorpo dessa invenção, direcionados um contra o outro, podem ser usados ou apreados com outro anticorpo com especificidade de ligação para o outro epítopo DR5.

[00215] Um polipeptídeo ou os polipeptídeos desta invenção podem ser usados para identificar outros polipeptídeos ou anticorpos que se ligam a outro epítopo em DR5 que, mediante ligação de polipeptídeos ou anticorpos nesses vários epítopos em DR5, induzem a apoptose. O DR5-01 e/ou o DR5-05 são direcionados. Assim, em determinadas modalidades, um polipeptídeo ou anticorpo desta invenção, direcionado contra um epítopo (DR5-01 ou DR5-05), ou polipeptídeos ou anticorpos desta invenção, direcionados contra ambos os epítopos (DR5-01 e DR5-05) podem ser usados com outro anticorpo com especificidade de ligação para outro epítopo em DR5.

[00216] Um ou mais polipeptídeos, anticorpos, anticorpos biespecíficos e/ou anticorpos biespecíficos funcionalizados e/ou porções químicas quiméricas desta invenção, ou composições farmacêuticas que contêm os mesmos, podem ser administrados por meio de injeção, ou seja, por via intravenosa, por via intramuscular, por via intracutânea, por via subcutânea, por via intraduodenal ou por via intraperitoneal. Também em determinadas modalidades, os compostos podem ser administrados por meio de inalação, por exemplo, por via intranasal. Outros sistemas de entrega farmacêutica também podem ser empregados, por exemplo, lipossomos.

[00217] O alvejamento de DR5 com os polipeptídeos ou anticorpos da presente invenção em combinação com tratamentos quimioterápicos existentes será mais eficaz no extermínio de células tumorais do que a quimioterapia por si só. Uma ampla variedade de fármacos foi empregada na quimioterapia de câncer. Os exemplos incluem, mas não são limitados a cisplatina, taxol, etopósido, mitoxantrona, actinomicina D, camptotecina, metotrexato, gemcitabina, mitomicina, dacarbazina, 5-fluorouracila, doxorrubicina e daunomicina.

[00218] Em uma abordagem, a combinação de anticorpo ou anticorpo MAb anti- DR5 biespecífico é adicionada a um procedimento de quimioterapia padrão, em tratamento de um paciente de câncer. Para essas combinações nas quais o anticorpo e o(s) agente(s) anticâncer adicional(is) exercem um efeito sinérgico contra células cancerígenas, a dosagem do(s) agente(s) adicional(is) pode ser reduzida, comparada à dosagem padrão do segundo agente quando administrado por si só. O anticorpo pode ser coadministrado com uma quantidade de um fármaco anticâncer que é eficaz no aumento da sensibilidade das células cancerígenas para a combinação de anticorpo ou anticorpo biespecífico.

[00219] Em um método da invenção, o alvejamento de DR5 com a combinação de anticorpo ou anticorpo biespecífico, é administrado ao paciente antes da administração de um segundo agente anticâncer. Um método alternativo compreende administrar o segundo agente anticâncer antes de administrar a combinação de anticorpo ou o anticorpo biespecífico e segundo agente em uma programação alternativa. Em outra modalidade, a combinação de anticorpo ou anticorpo biespecífico e o segundo agente são administrados simultaneamente.

[00220] O método da invenção pode fornecer a inclusão em um esquema terapêutico que envolve o uso de pelo menos um outro método de tratamento, como irradiação, quimioterapia com molécula pequena ou anticorpo. O método da invenção pode incluir diretamente a administração de uma quantidade suficiente de pelo menos um polipeptídeo adicional ou anticorpo direcionado contra outro alvo e/ou pelo menos um fármaco quimioterápico (como molécula pequena), para uma administração sequencial, simultânea ou separada com polipeptídeo(s) ou anticorpo(s) da invenção, para um mamífero, que inclui homem. Como um princípio ativo adicional, um pode citar doxorrubicina, gemcitabina, camptotecina, paclitaxel ou outros fármacos mencionados acima. Em uma modalidade, câncer de pulmão e câncer de mama são tratados com uso de tal combinação. Essa combinação, mais geralmente, é útil para cânceres (em particular cânceres agressivos) que não respondem bem ao tratamento com o fármaco por si só ou os/o anticorpos/anticorpo da invenção por si só, e para os quais a combinação deixa um efeito sinérgico.

[00221] Em um método da invenção, o alvejamento de DR5 com combinação de anticorpo ou anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo multivalente, pode ser empregado no tratamento de infecções virais e pode ser associado às condições que chegam a partir das infecções virais. As infecções virais, incluem, mas não são limitadas a, infecções com citomegalovírus, influenza, Newcastle, vírus da doença, vírus da estomatite vesicular, vírus de herpes simples, hepatite, adenovírus-2, vírus de diarreia viral bovina, vírus de imunodeficiência humana (HIV) e vírus Epstein-Barr.

[00222] As células de mamífero são os hospedeiros preferenciais para a produção de glicoproteínas terapêuticas, devido a sua capacidade para glicosilar proteínas sob a forma mais compatível para aplicações em seres humanos. A bactéria muito raramente glicosila as proteínas, e outro tipo similar de hospedeiros comuns, como leveduras, fungos filamentosos, células de planta e inseto rendem padrões de glicosilação associados com uma rápida depuração da corrente sanguínea.

[00223] Dentre as células de mamífero, as células de ovário de hamster chinês (CHO) são as mais comumente usadas. Além de fornecer padrões de glicosilação adequados, essas células permitem a geração consistente de linhagens celulares clonais altamente produtivas e geneticamente estáveis. As mesmas podem ser cultivadas em altas densidades em biorreatores simples com uso de meios sem soro e permitem o desenvolvimento de bioprocessos reproduzíveis e seguros. Outras células de animal comumente usadas incluem células de rim de hamster bebê (BHK), NSO- e células de mieloma de camundongo SP2/0.

[00224] Em uma modalidade, os polipeptídeos e anticorpos, de acordo com a invenção, são produzidos ou exprimidos a partir de células de mamífero, preferencialmente células de mamífero de tipo selvagem, preferencialmente de células originárias de roedores, especialmente células de CHO.

[00225] As modificações e alterações podem ser feitas na estrutura de um polipeptídeo da presente invenção e podem ainda obter uma molécula que tem características similares. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma sequência sem perda apreciável de atividade. Devido ao fato de que é a natureza e a capacidade interativa de um polipeptídeo que define que a atividade funcional biológica do polipeptídeo, certas substituições de sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de polipeptídeo (ou, certamente, sua sequência de codificação de DNA subjacente) e, no entanto, obtém um polipeptídeo com propriedades similares.

[00226] Ao fazer tais alterações, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácido hidropático para conferir a função biológica interativa em um polipeptídeo é, em geral, entendida na técnica. É conhecido que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm um índice ou escore hidropático similar e ainda resultam em um polipeptídeo com atividade biológica similar. Cada aminoácido tem sido atribuído a um índice hidropático na base de suas características de alteração e de hidrofobicidade.

[00227] Acredita-se que o caráter hidropático relativo do aminoácido determina a estrutura secundária do polipeptídeo resultante, que, por sua vez, define a interação do polipeptídeo com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, anticorpos, antígenos e similares. É conhecido na técnica que um aminoácido pode ser substituído por outro aminoácido que tem um índice hidropático similar e ainda obtém um polipeptídeo equivalente funcional e biologicamente. Em tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de +2, é preferencial, aqueles que estão dentro de +1 são particularmente preferenciais, e aqueles dentro de +0,5 são até mais particularmente preferenciais.

[00228] A substituição de aminoácidos similares também pode ser feita na base de hidrofilicidade, particularmente em que o peptídeo ou polipeptídeo equivalente funcional e biologicamente criado através da mesma se destina ao uso em modalidades imunológicas. A Patente no U.S. 4.554.101, incorporado ao presente documento a título de referência ou a uma pessoa verdade na técnica: pode se referir a, estados que de maior hidrofilicidade média local de um polipeptídeo, conforme governado pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, que se correlacionam com sua imunogenicidade e antigenicidade, isto é, com uma propriedade biológica do polipeptídeo.

[00229] Conforme detalhado na Patente no U.S. 4.554.101, os valores de hidrofilicidade seguintes foram atribuídos aos resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 +1); glutamato (+3,0 +1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 +1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Entende-se que um aminoácido pode ser substituído por outro que tem um valor de hidrofilicidade similar e ainda obtém um equivalente biologicamente, e em particular, um equivalente imunologicamente, polipeptídeo. Em tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de +2 é preferencial, aqueles que estão dentro de +1 são particularmente preferenciais, e aqueles dentro de +0,5 são até mais particularmente preferenciais.

[00230] Conforme descrito acima, consequentemente, as substituições de aminoácido são geralmente baseadas na similaridade relativa de substituintes de cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares. Tabela 5

[00231] A substituição de aminoácido pode ser escolhida ou selecionada diferentemente. Possíveis substituições foram documentadas em WO99/51642, WO2007024249 e WO2007106707.

[00232] Mediante a definição, as CDRs da invenção incluem variantes de CDRs, por deleção, substituição ou adição de um ou mais aminoácido(s), cuja(s) variante(s) mantém a especificidade duma CDR original. O sistema de numeração comum fornece uma definição de CDR que tem as sequências de aminoácido mais curtas ou a definição de CDR mínima.

[00233] O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo de todos seres humanos, um anticorpo biespecífico, um conjugado de fármaco de anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Um "anticorpo humanizado" ou "anticorpo humanizado quimérico" deveria significar um anticorpo derivado de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo de murino, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo parental, mas que é menos imunogênico em humanos.

[00234] Os métodos para produzir os polipeptídeos e anticorpos são conhecidos a partir da pessoa versada na técnica. As células de mamífero, preferencialmente células originárias de roedores como células de CHO, preferencialmente células tipo selvagem são transfectadas com um ou diversos vetores de expressão. Preferencialmente, as células são cotransfectadas com um vetor de expressão para cadeia leve e com um vetor de expressão para cadeia pesada.

[00235] A transfecção celular também é conhecida pela pessoa versada na técnica. Conforme a transfecção pode ser realizada, um pode mencionar sem procedimentos de transfecção de padrão de limitação, conhecidos a partir do homem versado na técnica, como precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada de DEAE-Dextran, eletroporação, magnetofection, nucleofecção (AMAXA Gmbh, GE), transfecção mediada por lipossomo (com uso de tecnologia de dreamfect®, lipofectin® ou lipofectamine® por exemplo) ou microinjeção.

[00236] Os vetores de expressão são conhecidos. Como vetores que podem ser usados, pode-se mencionar sem limitação: pcDNA3.3, pOptiVEC, pFUSE, pMCMVHE, pMONO, pSPORTI, pcDV1, pcDNA3, pcDNAI, pRc/CMV, pSEC. Um pode usar um vetor de expressão único ou diversos vetores de expressão que expressam diferentes partes do polipeptídeo ou anticorpo.

[00237] Um vetor de expressão para o CH1, região de dobradiça, CH2 e CH3 compreende SEQ ID NO: 9 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10.

[00238] Um vetor de expressão contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável VH da invenção. Em uma modalidade, o vetor compreende SEQ ID NO: 3 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, o mesmo compreende SEQ ID NO: 7 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o vetor compreende SEQ ID NO: 34 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35. Em outra modalidade, o mesmo compreende SEQ ID NO: 38 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 39.

[00239] Um conjunto de vetores de expressão que codifica uma cadeia pesada, compreende um vetor de expressão que compreende SEQ ID NO: 9 (ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10), e tanto o SEQ ID NO: 3 (ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4) quanto SEQ ID NO: 7 (ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8). Um conjunto de vetores de expressão que codifica uma cadeia pesada, compreende um vetor de expressão que compreende SEQ ID NO: 9 (ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10), e tanto SEQ ID NO: 34 (ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35) quanto SEQ ID NO: 38 (ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 39).

[00240] Um vetor de expressão único para a cadeia pesada contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica VH, CH1, região de dobradiça, CH2, CH3. Em uma modalidade, o vetor compreende SEQ ID NO: 3 e 9 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4 e 10. Em outra modalidade, o mesmo compreende SEQ ID NO: 7 e 9 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 e 10. Em uma modalidade, o vetor compreende SEQ ID NO: 34 e 9 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 10. Em outra modalidade, o mesmo compreende SEQ ID NO: 38 e 9 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 10.

[00241] Um vetor de expressão para a cadeia leve constante compreende SEQ ID NO: 11 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12.

[00242] Um vetor de expressão contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável VL da invenção. Em uma modalidade, o vetor compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o mesmo compreende SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o vetor compreende SEQ ID NO: 36 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 37. Em outra modalidade, o mesmo compreende SEQ ID NO: 40 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 41.

[00243] Um vetor de expressão contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma cadeia leve da invenção. Em uma modalidade, o vetor compreende SEQ ID NO: 1 e 11 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 12. Em outra modalidade, it compreende SEQ ID NO: 5 e 11 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 12. Em uma modalidade, o vetor compreende SEQ ID NO: 36 e 11 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 37 e 12. Em outra modalidade, it compreende SEQ ID NO: 40 e 11 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 41 e 12.

[00244] Um conjunto de vetores de expressão para produzir um anticorpo completo compreende diversos vetores, por exemplo, dois ou três.

[00245] Um vetor de expressão único também pode ser usado, que compreende tanto SEQ ID NO: 3, 9, 1 e 11 (ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 10, 2 e 12), quanto SEQ ID NO: 7, 9, 5 e 11 (ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, 10, 6 e 12). Um vetor de expressão único também pode ser usado, que compreende tanto SEQ ID NO: 34, 9, 36 e 11 (ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35, 10, 37 e 12), quanto SEQ ID NO: 38, 9, 40 e 11 (ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 39, 10, 41 e 12).

[00246] O vetor de expressão compreende uma sequência de ácidos nucleicos ou sequências de ácidos nucleicos que codifica(m) para a região variável que é desejada. Várias modalidades das regiões variáveis que podem ser expressas pelo vetor são apresentadas abaixo. As modalidades desses vetores são definidas pelo uso de definições de CDRs de acordo com IMGT®. No entanto, a invenção abrange e se refere também aos vetores alternativos ou equivalentes em que a numeração IMGT® é recolocada tanto pela numeração Kabat® quanto pelo sistema de numeração comum, com uso de sequências indicadas acima. No entanto, nas modalidades a seguir de um vetor, outras modalidades são parte da invenção na qual uma substitui as CDRs definidas com a numeração IMGT®, pela numeração Kabat®, de acordo com a tabela acima. Também, nas modalidades a seguir de um vetor, outras modalidades são parte da invenção na qual uma substitui as CDRs definidas com a numeração IMGT®, pelo sistema de numeração comum, de acordo com a tabela acima.

[00247] Um vetor de expressão codifica para uma VH que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15.

[00248] Um vetor de expressão codifica para uma VL que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 17.

[00249] Um conjunto de vetores de expressão compreende um vetor de expressão que codifica para uma VH que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15, e um vetor de expressão que codifica para uma VL que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 17.

[00250] Um vetor de expressão compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma VH que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15, e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma VL que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 17.

[00251] Um vetor de expressão codifica para uma VH que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19.

[00252] Um vetor de expressão codifica para uma VL que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21.

[00253] Um conjunto de vetores de expressão compreende um vetor de expressão que codifica para uma VH que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19, e um vetor de expressão que codifica para uma VL que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21.

[00254] Um vetor de expressão compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma VH que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19, e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma VL que compreende uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21.

[00255] A invenção, assim, compreende o uso de um vetor único ou um conjunto de vetores para produzir os polipeptídeos ou anticorpos da invenção. Esses vetores também são objetos da invenção, por si sós ou como um conjunto de vetores.

[00256] Outro objetivo da invenção é uma célula hospedeira que contém um vetor ou um conjunto de vetores da invenção. A célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero, preferencialmente uma célula originária de roedores, mais preferencialmente célula de CHO. Ainda mais preferencialmente, a célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero de tipo selvagem, preferencialmente uma célula originária de roedores de tipo selvagem, mais preferencialmente uma célula de CHO de tipo selvagem.

[00257] A pessoa versada na técnica detém completamente os métodos para gerar os anticorpos de acordo com a invenção usando tal vetor ou vetores e células como células de CHO.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00258] A presente invenção será descrita em detalhes adicionais a título de exemplos em relação às Figuras. Deve-se verificar que, nos diagramas de blocos, os blocos aparecem da esquerda para a direita na mesma ordem indicada na legenda nos diagramas em que a legenda é colocada em uma caixa.

[00259] A Figura 1 mostra a análise FACS de painel de anticorpo anti-DR5 em linhagens celulares de glioma humano (H4, HS683, A172, T98G, U87MG).

[00260] A Figura 2 mostra a análise FACS de expressão anti-DR5 em algumas linhagens celulares cancerígenas como adenocarcinoma do rim humano (A704, ACHN, Caki1), carcinoma do cólon humano (SW948, HCT 116), carcinoma da bexiga urinária humana (5637) e adenocarcinoma da mama humana (MCF7).

[00261] A Figura 3 é um gráfico que mostra os resultados de uma ligação de avaliação de ensaio de ELISA de MAbs (1 μg/ml) para Fas (50 ng/ml), FasL (100 ng/ml), TRAIL (100 ng/ml) e para DR4, DR5, DcR1 ou DcR2 (50 ng/ml), (média +/- SD, n=2).

[00262] A Figura 4 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de ligação MAb anti-DR5 biotinada (1 μg/ml, análise FACS) na presença de outro anticorpo anti-DR5 não conjugado (5 g/ml) com uso de células T98G (1.106 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00263] A Figura 5 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de ligação TRAIL (100 ng/ml, análise FACS) na presença de anticorpo (MAb anti-TRAIL, MAb anti-DR5 MAb) testado em diferentes concentrações com uso de células H4 (5.105 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00264] A Figura 6 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação de célula (bioensaio bioluminescente de ATP, 72 horas) de anticorpo anti-DR5 por si só ou combinado, testado em 1 μg/ml conforme comparado ao TRAIL (10 ng/ml) com uso de células H4 (5.104 células/ml), (significa +/-SD, n=2).

[00265] A Figura 7 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação de célula (bioensaio BrDU, 72 horas) de combinação de anticorpo agonístico de anti-DR5 seletivo (mDR5-01 + mDR5-05) contra combinação de anticorpo neutro (mDR5-05 + mDR5-04) testada em diferentes concentrações com uso de células H4 (5.104 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00266] A Figura 8 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) de apoptose (coloração de iodeto de propídio, 72 horas) de combinação de anticorpo agonístico de anti-DR5 seletivo (mDR5-01 + mDR5-05) contra combinação de anticorpo neutro (mDR5-05 + mDR5-04) testada em 1 μg/ml e também comparada ao TRAIL (10 ng/ml) com uso de células H4 (1.105 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00267] A Figura 9 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) de caspase-3 clivada (análise FACS, 48 horas) de combinação de anticorpo agonístico de anti-DR5 seletivo (mDR5-01 + mDR5-05) contra combinação de anticorpo neutro (mDR5-05 + mDR5-04) e também comparada ao TRAIL com uso de células H4 (1.105 células/ml), (experimento representativo, n=2).

[00268] A Figura 10 é um western blot que mostra o PARP clivado induzido ou não com a presença da combinação de anticorpo agonístico de anti-DR5 seletivo (mDR5-01 + mDR5-05) contra combinação de anticorpo neutro (mDR5-05 + mDR5- 04) com uso de células H4 (2.105 células/ml, 5 horas).

[00269] A Figura 11 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação de célula (bioensaio bioluminescente de ATP, 72 horas) com a combinação de anticorpo agonístico de anti-DR5 seletivo (10 μg/ml mDR5-05 + 0,1 μg/ml mDR5-01), na presença ou não de anti-DR5 MAb (mDR5-01, mDR5-02, mDR5-04 ou mDR5-05, 1 g/ml) com uso de células H4 (5.104 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00270] A Figura 12 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação de célula (bioensaio bioluminescente de ATP, 72 horas) de combinação de anticorpo agonístico de anticorpo anti-DR5 seletivo (10 μg/ml mDR5- 05 + 0,1 μg/ml mDR5-01) e, então, diluída em % comparada ao TRAIL (20 ng/ml) e, então, diluída em % com uso de células H4, HS683, A172, T98G ou U87MG glioma (5.104 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00271] A Figura 13 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação (bioensaio bioluminescente de ATP, 72 horas) de anticorpo quimérico (chDR5-01 ou chDR5-05 MAb) testada por si só em 5 μg/ml, então, diluída em % contra combinação de anticorpo (5 μg/ml chDR5-05 + 0,05 μg/ml chDR5-01), então, diluída em % com uso de células H4 de glioma (5.104 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00272] A Figura 14 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação de célula (bioensaio bioluminescente de ATP, 72 horas) de anticorpo anti-DR5 por si só ou combinado, testado em 10 μg/ml (razão de 1/10) conforme comparado ao TRAIL (50 ng/ml) com uso de células de glioma humano ex- vivo (5.104 células/ml), (média +/- SD, n=3 a partir de três células de GBM ex-vivo independentes).

[00273] A Figura 15 a 18 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação de célula (bioensaio bioluminescente de ATP, 72 horas) na presença de anticorpo anti-DR5 de camundongo combinado, testado em 10 μg/ml, diluído em 1/10, na presença de fármaco por si só (1 μg/ml diluído em 1/10) ou em associação com o anticorpo anti-DR5 de camundongo combinado e fármaco com uso de células de glioma HS683, A172, 42MGBA ou T98G, (5.104células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00274] A Figura 19 a 22 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação de célula (bioensaio bioluminescente de ATP, 72 horas) na presença de anticorpo anti-DR5 de camundongo combinado, testado em 10 μg/ml, diluído em 1/10, na presença de fármaco por si só (1 μg/ml diluído em 1/10) ou em associação com o anticorpo anti-DR5 de camundongo combinado e fármaco com uso de linhagens celulares de mama humana (MCF7, MDAMB231) ou linhagens celulares de adenocarcinoma de pulmão humano (NCIH1703, A549), (5.104 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00275] A Figura 23 é um diagrama de barras que mostra o percentual (%) da inibição de proliferação de célula (bioensaio bioluminescente de ATP, 72 horas) de anticorpo anti-DR5 de camundongo por si só ou combinado conforme comparado ao anticorpo anti-DR5 humanizado por si só ou combinado testado em 1 μg/ml (razão 1/1 em combinado), então, diluído em 1/2 com uso de células de glioma H4 (5.104 células/ml), (média +/- SD, n=2).

[00276] A Figura 24 é uma curva de sobrevivência de camundongos sem pelo ortotópico enxertados com glioma humano SC2 tratado com ou sem anticorpo anti- DR5 de camundongo combinado. O tratamento de MAb foi administrado por meio da injeção intraperitoneal (IP) em 5 mg/kg por camundongo até a eutanásia de camundongos, devido a perda de peso e foi aplicado durante um máximo de 36 dias. Os tempos de sobrevivência obtidos com o grupo de controle fora comparados aos tempos de sobrevivência obtidos com os grupos tratados (mDR5-01 +mDR5-05 contra mDR5-04+mDR5-05) com uso do método Kaplan Meier e teste estatístico Wilcoxon (software JMP).

[00277] A Figura 25 mostra a sequência de ácidos nucleicos e de aminoácidos para VH HzDR5-01 com descrição das FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 definidas de acordo com a IMGT ®.

[00278] A Figura 26 mostra a sequência de ácidos nucleicos e de aminoácidos para VL HzDR5-01 com descrição das FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 definidas de acordo com a IMGT ®. .

[00279] A Figura 27 mostra a sequência de ácidos nucleicos e de aminoácidos para VH HzDR5-05 com descrição das FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 definidas de acordo com a IMGT ®.

[00280] A Figura 28 mostra a sequência de ácidos nucleicos e de aminoácidos para VL HzDR5-05 com descrição das FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 definidas de acordo com a IMGT ®.

EXEMPLOS

[00281] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE MAb anti-DR5 MURINO

[00282] Esse exemplo ilustra a preparação de linhagens de células de hibridoma que secretam os anticorpos anti-DR5.

[00283] Anticorpos. Os anticorpos anti-DR5, anticorpos monoclonais de murino específicos para DR5 foram produzidos com uso de técnicas de hibridoma padrões (Zola et al., Aust J. Exp Biol Med Sci. 1981; 59:303-6). Brevemente, os camundongos receberam injeções i.p. de DR5 recombinante (10 μg), (R&D Systems, Lille, França) as semanas 0,2 e 4. A isso se sucedeu uma injeção i.v. de DR5 recombinante (10 μg) e os esplenócitos foram fundidos com a linhagem de mieloma de camundongo X63-Ag8.653. Os sobrenadantes de hibridoma foram examinados para a ligação DR5 por ELISA e por meio da citomeria de fluxo em linhagens de células DR5 positivas. Um painel MAb murino anti-DR5, respectivamente, mDR5-01, mDR5-02, mDR5-04 e mDR5-05 foi obtido.

EXEMPLO 2: CULTURA DE CÉLULAS

[00284] Várias linhagens celulares derivadas de tumor estão entre as células-alvo que podem entrar em contato com TRAIL, MAb anti-DR5 por si só, combinação MAb, em procedimentos de ensaio.

[00285] Linhagens de célula. As células H4 de neuroglioma humano estabelecidas, HS683 ou A172 (disponível a partir de ATCC) e as células A549 de adenocarcinoma de pulmão humano estabelecidas cresceram no Meio de Eagle modificado por Dulbecco (Sigma, St Quentin Fallavier, França) suplementadas com 10% de soro fetal bovino neutralizado pelo calor (FBS) (Sigma, St Quentin Fallavier, França), 4 nM L-glutamina (Sigma, St Quentin Fallavier, França) e 100 U/ml, 100 μg/ml penicilina-estreptomicina (Sigma, St Quentin Fallavier, França). As células U87MG ou T98G de astrocitoma de gliobastoma humano estabelecidas, as células A704 de adenocarcinoma de rim humano, as células de ACHN de adenocarcinoma de rim humano e as células MCF7 de adenocarcinoma de mama humana (disponível a partir de ATCC) cresceram no meio essencial de Eagle mínimo (Sigma, St Quentin Fallavier, França) suplementadas com 10% soro fetal bovino neutralizado pelo calor (FBS) (Sigma, St Quentin Fallavier, França), 4 nM L-glutamina (Sigma, St Quentin Fallavier, França) e 100 U/ml, 100 μg/ml penicilina-estreptomicina (Sigma, St Quentin Fallavier, França). As células SW948 de adenocarcinoma de cólon humano estabelecidas e as células MDAMB231 de adenocarcinoma de mama humana (disponível a partir de ATCC) cresceram em L15 de Leibovitz (Sigma, St Quentin Fallavier, França) suplementadas com 10% soro fetal bovino neutralizado pelo calor (FBS) (Sigma, St Quentin Fallavier, França), 4 nM L-glutamina (Sigma, St Quentin Fallavier, França) e 100 U/ml, 100 μg/ml penicilina-estreptomicina (Sigma, St Quentin Fallavier, França). As células Caki-1 de carcinoma de rim humano estabelecidas e as células HCT-116 de carcinoma colorretal humano (disponível a partir de ATCC) cresceram no meio modificado desenvolvido por McCoy 5A (Sigma, St Quentin Fallavier, França) suplementadas com 10% soro fetal bovino neutralizado pelo calor (FBS) (Sigma, St Quentin Fallavier, França), 4 nM L-glutamina (Sigma, St Quentin Fallavier, França) e 100 U/ml, 100 μg/ml penicilina-estreptomicina (Sigma, St Quentin Fallavier, França). As células 5637 de carcinoma de bexiga humana estabelecidas e as células NCIH1703 de adenocarcinoma de pulmão humano estabelecidas (disponível a partir de ATCC) cresceram no meio RPMI-1640 (Sigma, St Quentin Fallavier, França) suplementadas com 10% soro fetal bovino neutralizado pelo calor (FBS) (Sigma, St Quentin Fallavier, França), 4 nM L-glutamina (Sigma, St Quentin Fallavier, França) e 100 U/ml, 100 μg/ml penicilina-estreptomicina (Sigma, St Quentin Fallavier, França). As células 42MGBA de glioma humano estabelecidas (disponível a partir de DSMZ) cresceram em 80% de mistura de meio essencial de Eagle mínimo e médio RPMI-1640 em 1:1 (Sigma, St Quentin Fallavier, França) suplementadas com 20% soro fetal bovino neutralizado pelo calor (FBS) (Sigma, St Quentin Fallavier, França), 4 nM L-glutamina (Sigma, St Quentin Fallavier, França) e 100 U/ml, 100 μg/ml penicilina-estreptomicina (Sigma, St Quentin Fallavier, França).

EXEMPLO 3: ensaios de ligação de Anticorpo (FCM, ELISA)

[00286] Esse exemplo descreve os métodos para determinar o anti-DR5 de especificidade MAb por ELISA com antígenos revestidos, para investigar a expressão celular DR5 na superfície celular e para determinar os epítopos seguintes de concorrência MAb analisados pela citometria de fluxo.

[00287] Os experimentos de citometria de fluxo para expressão celular DR5. Brevemente, 2.105 células por 96 cavidades são incubadas com uma diluição de MAb anti/DR5 não conjugado em 10 μg/ml, então, diluído em 1/10. Os anticorpos não vinculados foram lavados com PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, França) suplementadas por 1% de albumina de soro bovino (Sigma, St Quentin Fallavier, França). Subsequentemente, as células são centrifugadas (5 minutos a 400 g) e o anticorpo vinculado é detectado com Isotiocianato de Fluoresceína (FITC), anticamundongo policlonal (Fab')2 caprino conjugado (MP Biomedical, lllkirch, França), a 4 °C por 30 minutos. O reagente de detecção é lavado e as células são centrifugadas (5 minutos em 400 g) e ressuspensas em 300 μl PBS. O anticorpo de detecção vinculado é quantificado em um FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, França), (canal FL1, 2.000 eventos por aquisição). Durante o experimento, os controles de isótipos respectivos são incluídos para excluir quaisquer eventos de ligação não específicos.

[00288] Os resultados de experimentos são mostrados na Figura 1 (em 10 μg/ml), a Figura 2 e Tabela 6 (em 5 μg/ml) mostram como, por exemplo, célula de coloração com concentração MAb ou em 5 μg/ml. Várias linhagens celulares cancerígenas expressam diferentes subconjuntos de receptores TRAIL. Os modelos de expressão variados de linhagem celular para linhas celulares. No presente estudo DR5 foi expresso em todas as linhas celulares testadas. Se a MAb testou anti-DR5 (mDR5- 01, mDR5-02, mDR5-04 ou mDR5-05), o modelo celular similar foi observado.

[00289] A Tabela 6 mostra a análise FACS de expressão DR5 com uso de 5 μg/ml de anticorpo anti-DR5 em outras linhas celulares de tumor sólido (1.106 células/ml), isto é, celulares de adenocarcinoma de mama humana (MCF7, MDAMB231) e em linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão humano (NCIH1703, A549). Tabela 6

[00290] As análises de especificidade MAb usando-se antígenos revestidos de ELISA. As propriedades de ligação específicas de anticorpos foram avaliadas em um ELISA com antígenos de Fas revestidos (50 ng/ml) (R&D Systems, Lille, França), FasL (100 ng/ml) (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, França), TRAIL (100 ng/ml) (R&D Systems, Lille, França), DR4 (50 ng/ml) (R&D Systems, Lille, França), DR5 (50 ng/ml) (R&D Systems, Lille, França), DcR1 (50 ng/ml) (R&D Systems, Lille, França) ou DcR2 (50 ng/ml) (R&D Systems, Lille, França). O painel anti-DR5 MAb foi testado em 1 μg/ml e foi revelado usando-se um peroxidase de rábano silvestre (HRP) anticamundongo caprino policlonal IgG1 conjugado (AbD Serotec, Colmar, França).

[00291] Os resultados de experimentos são mostrados na Figura 3. Os anticorpos mDR5-01, mDR5-02, mDR5-04 e mDR5-05 (1 g/ml) reagiram somente com antígenos revestidos DR5 (50 ng/ml). Não foi observado reatividade com outros antígenos apoptóticos relacionados (FAS, FASL, TRAIL, DR4, DcR1, DcR2), (média +/- SD em 2 experimentos independentes).

[00292] Os experimentos de citometria de fluxo para a ligação de competição MAb. Brevemente, 2.105 células T98G por 96 cavidades são incubadas com uma diluição de anticorpo anti-DR5 de murino biotinilado (então, 10 μg/ml diluído a 1/10) como uma referência e com ou sem anticorpo não conjugado a 5 μg/ml e incubado e 4 °C por 30 min. Apenas os dados obtidos com 1 μg/ml de anticorpo biotinilado são mostrados. O anticorpo não vinculado é lavado com PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, França) suplementado por 1% de albumina de soro bovino (Sigma, St Quentin Fallavier, França). Subsequentemente, as células são centrifugadas (5 minutos em 400 g) e o anticorpo vinculado é detectado com Estreptavidina conjugada com Ficoeritrina (Interchim, Montlugon, França) a 4 °C por 30 min. O reagente de detecção é lavado e as células são centrifugadas (5 minutos em 400 g) e são ressuspensas em 300 μl de PBS. O anticorpo de detecção vinculado [e quantificado em um FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, França), (canal FL2, 2.000 eventos por aquisição). Durante o experimento, os controles de isótipos respectivos são incluídos para excluir quaisquer eventos de ligação não específicos.

[00293] Os resultados de experimentos são mostrados na Figura 4. Por exemplo, os anticorpos mDR5-02 e mDR5-05 não conjugados (5 g/ml) não estão em concorrência com o anticorpo mDR5-01 de biotinada (1 μg/ml). Em contraste, os mDR5-01 e mDR5-04 não conjugados estão em concorrência com o anticorpo mDR5-01 de biotinada. Portanto, os DR5-01 e DR5-04 epítopos são comuns ou adjacentes, se os DR5-02 e DR5-05 epítopos forem dois epítopos separados. Ademais, o DR5-01 epítopo também é distinto do DR5-05 epítopo, (média +/- SD em dois experimentos independentes).

EXEMPLO 3: Atividade MAB BIOLÓGICA In vitro

[00294] Esse exemplo ilustra métodos de avaliação de impacto MAb anti-DR5 na ligação celular TRAI L em sua habilidade de desencadear efeito citotóxico celular em células cancerígenas. Esses componentes podem ser experimentados para atividade antitumoral, com uso de qualquer um dentre o número de ensaios adequados, que inclui, mas não se limitam aos ensaios para a habilidade de retardar o crescimento de tumores ou de matar as células cancerígenas in vitro. Várias linhagens celulares derivadas de tumores estão entre as células-alvo que podem entrar em contato com a combinação MAb, em tais procedimentos de ensaio.

[00295] Para identificar ou selecionar a combinação de anticorpo anti-DR5 que induz a apoptose, a perda de integridade de membrana conforme indicado, por exemplo, por PI, é avaliada em relação ao controle (células não tratadas) e comparada ao TRAIL recombinante (Figura 8). A capacidade de retardar o crescimento é avaliada por meio da quantificação de ATP ou de BrDU (Figura 6, Figura 7). A resposta apoptótica é avaliada pela quantificação de caspase-3 clivada (Figura 9) ou Poli-(ADP-Ribose)-Polimerase clivada (PARP), (Figura 10).

[00296] Reagentes Bioquímicos. Os reagentes bioquímicos usados para os estudos de apoptose foram: iodeto de propídio (PI), (Sigma, St Quentin Fallavier, França), anticorpo de Caspase-3 (Ozyme, Saint Quentin Yvelines, França), proliferação celular ELISA-BrdU (Roche Diagnostics, Meylan, França), concentração celular GLo-ATP (Promega, Charbonnieres-les-bains, França) e a Poli-(ADP- Ribose)-Polimerase antipoliclonal (PARP) (Roche Diagnostics, Meylan, França).

[00297] Os experimentos de citometria de fluxo de MAb impactam na ligação TRAIL. As linhas celulares H4 foram semeadas em uma densidade de 1.105 por 96 cavidades. As células foram incubadas por 30 minutos a 4 °C com ou sem MAb antiTRAIL ou anti-DR5 (mDR5-01, mDR5-02, mDR5-3 mDR5-4) testadas a 1 μg/ml, então, diluídas a 1/10. Os anticorpos não vinculados foram lavados com PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, França) suplementados por 1% de albumina de soro bovino (Sigma, St Quentin Fallavier, França). Subsequentemente, as células são incubadas com TRAIL recombinante (100 ng/ml), (R&D Systems, Lille, França) por 30 minutos a 4 °C. Os anticorpos não vinculados foram lavados com PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, França) suplementados por 1% de albumina de soro bovino (Sigma, St Quentin Fallavier, França). A TRAIL recombinante de ligação é detectada com anti TRAIL MAb B-S23 conjugado com biotinilado (iDD biotech, Dardilly, França). Após as lavagens, a estreptavidina conjugada com ficoeritrina (Interchim, Montlugon, França) foi adicionada a 4 °C por 30 min. O reagente de detecção é lavado e as células são centrifugadas (5 minutos a 400 g) e são ressuspensas em 300 μl PBS. O anticorpo de detecção vinculado é quantificado em uma FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, França), (canal FL2, 2.000 eventos por aquisição). Durante o experimento, os controles de isótipos respectivos são incluídos para excluir quaisquer eventos de ligação não específicos.

[00298] H4 humano que expressa a DR5 na superfície celular foi usado para determinar a atividade antagonista ou agonista de quatro anticorpos anti-DR5 denominados mDR5-01, mDR5-02, mDR5-04 e mDR5-05. Os resultados dos experimentos são mostrados na Figura 5. A TRAIL de ligação recombinante na superfície celular foi inibida com a TRAIL MAb antiantagonista B-T24 (iDD biotech, Dardilly, França). Dentre os painéis de anti-DR5 MAb testados, as MAbs mDR5-01, mDR5-04 e mDR-5-05 inibiram a TRAIL de ligação recombinante, sem qualquer impacto de mDR5-02 MAb.

[00299] Análise de viabilidade celular após determinação de nível de ATP. O ensaio de viabilidade celular luminescente de CellTiter-Glo® (Promega, Charbonnieres les Bains, França) foi usado para determinar o número de células viáveis na cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas. A detecção é baseada na utilização da reação da luciferase para medir a quantidade de ATP das células viáveis. Dentro de minutos após a perda de integridade de membrana, as células perdem a capacidade de sintetizar o ATP, e as ATPases endógenas destroem qualquer ATP restante; então, os níveis de ATP despencam. As culturas de células (5.104 células/ml) são incubadas por 72 horas por si sós ou com a anti-DR5 MAb por si só (1 μg/ml) ou com duas MAb combinadas a 1 μg/ml para cada MAb (Figura 6). A concentração de TRAIL de ligação foi usada a 10 ng/ml. O reagente CellTiter-Glo® foi adicionado diretamente às células na cultura em uma razão de 50 μl de reagente para 200 μl de meio de cultura. As placas de ensaio são incubadas a temperatura ambiente por 10 minutos e o sinal bioluminescente é registrado com uso de um fluorômetro padrão de múltiplas cavidades de Mithras LB940, (Berthold, Thoiry, França).

[00300] Os resultados dos experimentos para determinar a atividade agonista de quatro anticorpos anti-DR5 são mostrados na Figura 6. Nenhum dos anti-DR5 MAb testados por si sós tiveram capacidade para induzir a citotoxicidade celular nas células H4. Em contraste, apenas a combinação de mDR5-01 e mDR5-05 de anti- DR5 MAb desencadeou a apoptose nas células H4. A capacidade dessa combinação anti-DR5 MAb restrita (1/10) não estava relacionada ao nível de coloração MAb (Figura 1). Curiosamente, as mDR5-01 e mDR5-05 de MAb reconheceram dois epítopos diferentes (Figura 4). No entanto, a combinação MAb de mDR5-05 com outra mDR5 MAb como mDR5-02 que também reconhece o epítopo distinto não conseguiu desencadear a apoptose de H4 (Figura 6).

[00301] Análise de viabilidade de célula seguindo a determinação de incorporação BrDU. As células alvo H4 (5,104 células/ml) foram cultivadas com a combinação de MAb mDR5-05 e mDR5-01 ou com a combinação de MAb mDR5-05 e mDR5-04 a diferentes taxas de concentração de MAb. O crescimento da célula é determinado com o uso da proliferação celular ELISA-BrdU (Roche Diagnostics, Meylan, França), de acordo com as instruções do fabricante. Esse método é baseado na incorporação da pirimidina análoga ao BrdU, ao invés de timidina, no DNA das células em proliferação. Após incorporado no DNA, BrdU é detectado com um MAb anti-BrdU. Ao final da revelação, um sinal bioluminescente é registrado com o uso de um fluorômetro multicavidade padrão Mithras LB940, (Berthold, Thoiry, França).

[00302] Os resultados dos experimentos são mostrados na Figura 7. A combinação específica de MAb mDR5-01 e mDR5-05 induziu de modo sinérgico a apoptose na linhagem celular H4 como prova por quantificação BrDU, (média +/- SD em 2 experimentos independentes). Não foi observado um impacto significativo com a combinação de MAb mDR5-05 e mDR5-04.

[00303] Absorção de iodeto de propídio por citometria de fluxo para medir a apoptose induzida do MAb. As linhagens celulares H4 foram semeadas a uma densidade de 2,104 por 96 cavidades. As células foram incubadas por um período de 3 dias com ou sem MAb anti-DR5. Cada MAb anti-DR5 foi testado sozinho ou seguindo a combinação de MAb a 1 μg/ml (Figura 8). A concentração de ligante TRAIL foi usada a 10 ng/ml. As células, então, foram centrifugadas à 2.000 rpm por 5 min a 4°C, pélete ressuspenso em etanol 70% (Sigma, St Quentin Fallavier, França) para permeabilização. Após uma nova centrifugação as células foram incubadas com 100 μl de PI (100 g/ml) e 100 μl de Rnase (100 μg/ml), (Sigma, St Quentin Fallavier, França) por cavidade por 15 minutos. As células são centrifugadas (5 minutos a 2.000 rpm) e ressuspensas em 300 μl PBS. O anticorpo de detecção ligado é quantificado em um FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, França), (canaleta FL2, 3.000 eventos por captura).

[00304] Os resultados dos experimentos são mostrados na Figura 8. Enquanto a PCD não foi obtida somente com o MAb testado, a combinação específica de MAb mDR5-01 e mDR5-05 induziu de modo sinérgico a apoptose na linhagem celular H4 como prova por absorção do PI, (média +/- SD em 2 experimentos independentes). Não foi exigida reticulação do MAb. Não foi obtida a PCD com a combinação de MAb mDR5-05 e mDR5-04.

[00305] Quantificação de caspase-3 clivada por citometria de fluxo para medir a apoptose induzida do MAb. As linhagens celulares H4 foram semeadas a uma densidade de 2,104 por 96 cavidades. As células foram incubadas por 48 horas com ou sem MAb anti-DR5. Cada MAb anti-DR5 foi testado sozinho ou na presença da combinação de MAb a 1 μg /ml para mDR5-05 com 0,01 μg/ml para mDR5-01 ou mDR5-04 (Figura 9). A concentração de ligante TRAIL foi usada a 10 ng/ml. As células, então, foram centrifugadas a 2.000 rpm por 5 min a 4°C, pélete ressuspenso em metanol 90% (Sigma, St Quentin Fallavier, França) para permeabilização. As células foram, então, centrifugadas a 2.000 rpm por 5 minutos a 4°C e incubadas a 4°C por 30 minutos com o conjugado alexa flúor 488 anticorpos MAb anti-ativos caspase-3 (Ozyme, Saint Quentin Yvelines, França). As células são centrifugadas (5 minutos a 2.000 rpm) e ressuspensas em 300 μl PBS. O anticorpo de detecção ligado é quantificado em um FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, França), (canaleta FL2, 3000 eventos por captura).

[00306] Quando a apoptose é ativada, as caspases clivam múltiplos substratos de proteína, o que leva a perda de estrutura celular e função e, principalmente, resulta em morte celular. Em particular, as caspases -8, -9 e -3 foram envolvidas na apoptose: a caspase-9 na rota mitocondrial, caspase-8 na rota Fas/CD95 e caspase- 3 mais a jusante, ativada por rotas múltiplas. A combinação específica de MAb mDR5-01 e mDR5-05 induziu de modo sinérgico a apoptose na linhagem celular H4 como prova por quantificação da caspase 3 clivada (Figura 9), (média +/- SD em 2 experimentos independentes). Como comparado ao TRAIL (também denominado Apo2L), apenas a combinação de MAb mDR5-01 e mDR5-05 desencadearam a apoptose celular comparada à combinação de MAb mDR5-04 e mDR5-05.

[00307] Western blot PARP. As linhagens celulares H4 foram semeadas a uma densidade de 1,106 por frasco T25 cm2. As células foram incubadas por 5 horas com ou sem MAb anti-DR5. Os extratos celulares foram ressuspensos em Tris - HCI 50 mM, KCI 150 mM a pH7 e submetidos a sonicação e incubados por 15 minutos a 65°C. As amostras (10 μg) foram sujeitas à redução SDS-PAGE e transferidas à membrana PVDF com o uso de métodos-padrão. Após bloqueio em leite 5%, as manchas foram incubadas no anti-Poli-(ADP-Ribose)-Polimerase (PARP) (Roche Diagnostics, Meylan, França) a 1/2000. Após a lavagem, as membranas foram incubadas em anticorpo conjugado peroxidase de raiz forte PAb de ovelha anti-IgG de coelho a 1/10.000, (AbD Serotec, Colmar, França). As manchas foram desenvolvidas com Western blot ECL Advance com o uso de substrato quimioluminescente com base em luminol intensificado para a detecção de peroxidase de raiz forte (GE Healthcare, St Cyr au Mont d’Or, França).

[00308] Muitos substratos de alvo específico para caspase foram identificados, incluindo enzima reparadora de DNA, poli (ADP-ribose) polimerase (PARP). A detecção Western blot para clivagem de PARP foi usada extensivamente como um indicador de apoptose. A PARP é clivada entre Asp213 e Gly 214 na sequência humana, produzindo dois fragmentos de pesos moleculares aparentes de 24 e 89 kDa. A partir das células H4 tratadas com a combinação de MAb mDR5-01 e mDR5- 05, os fragmentos da PARP clivada foram detectados, ao passo que nenhum efeito similar foi observado a partir de células não-tratadas ou tratadas com a combinação MAb mDR5-05 e mDR5-04, (Figura 10).

[00309] Como mostrado na Figura 1 1, a apoptose bloqueada MAb mDR5-02 (1 g/ml) desencadeada com a combinação de MAb mDR5-01 e mDR5-05 testada a uma razão de 1/100 (10 μg/ml + 0.1 μg/ml). Não foi observado um impacto significativo com o outro MAbs anti-DR5 (mDR5-01, mDR5-04 ou mDR5-05). A viabilidade celular foi avaliada com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas.

[00310] A suscetibilidade de cinco das linhagens celulares de glioma, H4, HS683, A172, T98G e U87MG para TRAIL ou combinação de MAb anti-DR5 (mDR5-01 + mDR5-05 versus mDR5-05 + mDR5-04) testada a uma razão de 1/100 (10 μg/ml + 0.1 g/ml) foi avaliada com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Figura 12). Enquanto quatro linhagens celulares (HS683, A172, T98G e U87MG) são resistentes ou de sensibilidade muito baixa à apoptose induzida por TRAIL, o uso da combinação do MAb anti-DR5 mDR5-01 e mDR5-05 ultrapassa o mecanismo regulatório.

[00311] A suscetibilidade das células de glioma ex vivo de pacientes para a combinação de MAb anti-DR5 de camundongo (mDR5-01 + mDR5-05) testada a 10 μg/ml (razão 1/10) foi avaliada com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Figura 14).

[00312] A suscetibilidade de quatro linhagens celulares de glioma, (HS683, A172, 42MGBA, T98G) para a combinação de MAb anti-DR5 de camundongo (mDR5-01 + mDR5-05) testada a 10 μg/ml então diluída a 1/10 (razão 1/1) foi avaliada sozinha ou em associação com Camptotecina (Figura 15 a 18). Essas linhagens celulares exibiram diferentes níveis de apoptose induzida com combinação de MAb anti-DR5 de camundongo ou na presença de Camptotecina. O uso da combinação de MAb anti-DR5 em associação com Camptotecina ultrapassou esse mecanismo regulatório e intensificou o nível de apoptose.

[00313] A suscetibilidade de outras linhagens celulares de tumor sólido que expressam DR5 tais como em linhagens celulares de adenocarcinoma de mama humana (MCF7, MDAMB231) e em linhagens celulares de adenocarcinoma do pulmão humano (NCIH1703, A549) para a combinação de MAb anti-DR5 de camundongo (mDR5-01 + mDR5-05) testada a 10 g/ml então diluída a 1/10 (razão 1/1) foi avaliada sozinha ou em associação com Paclitaxel, Gemcitabina ou Doxorobucina (Figura 19 a 22). Essas linhagens celulares exibiram diferentes níveis de apoptose induzida com combinação de MAb anti-DR5 de camundongo ou na presença dos diferentes fármacos testados. O uso da combinação de MAb anti-DR5 em associação com esses fármacos ultrapassou esse mecanismo regulatório e intensificou o nível de apoptose.

EXEMPLO 4: Preparação dos anticorpos monoclonais quiméricos dirigidos contra DR5

[00314] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais está prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas oligonucleotídicas que têm a capacidade de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferencial de tal DNA.

[00315] A conversão do MAb de murino em um MAb: cDNA quimérico nativo que corresponde à região variável do hibridoma foi obtida com o uso de duas abordagens, a primeira abordagem consiste na utilização em PCR do conjunto de primer relacionado à degradação do aminoácido N-terminal gerado desde a sequenciamento do N-terminal e a segunda abordagem consiste na utilização em PCR do conjunto de primer degradado gerado pela base de dados do primer IMGT® e primers específicos anteriormente descritos (Essono et al., J Immunol Methods. 2003; 203: 279:25 a 66, Wang et al., Mol Immunol. 1991; 28:1387 a 97). A sequência da região variável do N-terminal foi determinada pela degradação Edman. A extração do RNA total foi executada com o uso do kit Tri Reagent, de acordo com o protocolo descrito pelo fornecedor Sigma. Os fragmentos de VL e VH amplificados foram clonados no vetor de clonagem TOPO-TA (Invitrogen) para análises de sequências pelo método de Sanger (Sanger et al., Nature. 1977; 265:687 a 95). Então, as variações de anticorpo construídas foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor de expressão.

[00316] As posições são numeradas de acordo com o IMGT® e com o índice Kabat® (sequências de segmentos e sequências de aminoácidos de região de V idêntico em anticorpos de diferentes especificidades). Contribuições relativas aos genes VH e VL, mini genes e regiões determinantes de complementaridade para a ligação de sítios de combinação de anticorpo foram analisadas (Kabat et al, NIH Publ. 1991; nos 91 a 3242, Vol. 1, 647 a 669).

[00317] Como mostrado na Figura 13, a combinação de MAb quimérica chDR5-01 e chDR5-05 desencadeou a apoptose celular H4 testada a uma razão de 1/100 (5 μg/ml + 0,05 μg/ml). Nenhum impacto significativo de MAb foi observado com o MAb quimérico testado sozinho. A viabilidade celular foi avaliada com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas.

[00318] A sequência de ácido nucléico ou sequência de aminoácidos com relação aos MAbs quiméricos DR5-01 e DR5-05 são mostradas na Listagem de Sequências:

[00319] - sequência de nucleotídeo da cadeia leve de murino variável de anticorpo DR5-01 anti-DR5 (SEQ ID N0:1) e sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID N0:2).

[00320] - sequência de nucleotídeo da cadeia pesada de murino variável de anticorpo DR5-01 anti-DR5 (SEQ ID N0:3) e sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID N0:4).

[00321] - sequência de nucleotídeo da cadeia leve de murino variável de anticorpo DR5-05 anti-DR5 (SEQ ID N0:5) e sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID N0:6).

[00322] - sequência de nucleotídeo da cadeia pesada de murino variável de anticorpo DR5-05 anti-DR5 (SEQ ID N0:7) e sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID N0:8).

[00323] - sequência de nucleotídeo da cadeia pesada de humano constante de anticorpo DR5-01 ou DR5-5 anti-DR5 (SEQ ID N0:9) e sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID N0:10).

[00324] - sequência de nucleotídeo da cadeia leve de humano constante de anticorpo DR5-01 ou DR5-5 anti-DR5 (SEQ ID N0:1) e sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID N0:12).

EXEMPLO 5: Produção de MAb e purificação de proteína A

[00325] As células mamárias são as hospedeiras preferenciais para a produção de glicoproteínas terapêuticas, em função de sua capacidade para glicosilação de forma mais compatível para aplicações humanas (Jenkins et al., Nat Biotech. 1996; 14:975 a 81). As células mamárias hospedeiras que poderiam ser usadas incluem Hela humana, 283, H9 e células Jurkat, células NIH3T3 e C127 de camundongo, células Cos 1, Cos 7 e CV1 de Macacos do Velho Mundo, células QC1 -3 de codorna, células L de camundongo e células do ovário do hamster-chinês. As bactérias raramente fazem a glicosilação de proteínas e, como outro tipo de hospedeiro comum, como leveduras, fungos de filamento, células de insetos e plantas, produzem padrões de glicosilação associados à depuração rápida da corrente sanguínea.

[00326] As células do ovário do hamster-chinês (CHO) permitem a geração consistente de linhas celulares clonais altamente produtivas e geneticamente estáveis. Essas podem ser cultivadas a elevadas densidades em biorreatores simples com o uso de um meio isento de soro e permitem o desenvolvimento de bioprocessos reproduzíveis e seguros. Outras células animais comumente utilizadas incluem células do rim de filhote de hamster (BHK), células de mieloma NSO- e SP2/0 de camundongo. A produção a partir de animais transgênicos também foi testada (Jenkins et ai, Nat Biotech. 1996; 14:975 a 81).

[00327] Um típico vetor de expressão de mamífero contém um elemento promotor (promotores precoces e tardios de SV40, as longas repetições terminais (LTRs) de retroviroses, por exemplo, RSV, HTLV1, HIV1 e promotor precoce do citomegalovírus (mCMV, hCMV), que medeia a iniciação da transcrição do mRNA, a sequência da codificação da proteína e os sinais necessários para a terminação da transcrição e poliadenilação da transcrição (BGH poliA, Herpes timidina quinase gene da Herpes simplex virus poliA (TKpa), SV40 poliA tardio e 3' UTR_Beta_Globin_poliA). Elementos adicionais incluem intensificadores (Eμ, hlE1), sequências Kozak, peptídeo de sinal e sequências de intervenção defendidas pelos sítios do doador e aceitante para emenda de RNA. Vetores de expressão adequados para uso no exercício na prática da presente invenção incluem, por exemplo, vetores tais como pcDNA3.1, pcDNA3.3, pOptiVEC, pRSV, pEμMuMv, pMCMVHE-UTR-BG, pHCMVHE-UTR-BG, pMCMV-UTR-BG, pHCMV-UTR-BG, pMCMVHE-SV40, pHCMVHE-SV40, pMCMV-SV40, pHCMV-SV40, pMCMVHE-TK, pHCMVHE-TK, pMCMV-TK, pHCMV-TK, pMCMVHE-BGH, pHCMVHE-BGH, pMCMV-BGH, pHCMV-UTR-BGH).

[00328] As células vazias CHO Easy C (adquiridas pela coleção CCT) foram co- transfeccionadas com o vetor de expressão de MAb para cadeias leves e pesadas seguindo o procedimento de transfecção temporário ou estável estabelecido em nosso laboratório. A secreção das cadeias H e L foi permitida pela respectiva sequência líder de IgH humano. As regiões de codificação de cadeias leve e pesada do MAb anti-DR5 foram introduzidas no vetor de expressão MAb no sítio de clonagem múltipla. Os transformantes são analisados para orientação correta e estrutura de leitura, o vetor de expressão pode ser transfectado em uma linhagem celular CHO.

[00329] Cromatografia da proteína A partir do fluido ascítico murino. O fluido ascítico murino é ajustado ao pH 8,3 com o tampão de equilíbrio 0,1 M Tris e 1 ,5 M sulfato de amônio e, então, carregado dentro da coluna rProtein A Sepharose Fast Flow (rProteína A Fluxo Rápido Sepharose) (GE Healthcare, Saint

[00330] Cyr au Mont d’Or, França). As proteínas não-ligadas são escorridas e removidas por diversas lavagens com o tampão de equilíbrio. O MAb anti-DR5 é eluído para fora da coluna Protein A (Proteína A) com o uso do tampão de eluição 0.1 M de citrato de sódio ao pH 3,5. O eluente da coluna é monitorado pelo A280. O pico do MAb anti-DR5 é agrupado.

[00331] Cromatografia da proteína A a partir do fluido da cultura celular CHO colhido. O fluido da cultura celular colhido produzido a partir das células CHO é carregado na coluna Hi Trap rProtein A (GE Healthcare, Saint Cyr au Mont d’Or, França) que é equilibrada com a solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2. As proteínas não-ligadas são escorridas e removidas por diversas lavagens com o tampão de PBS seguido. O MAb anti-DR5 é eluído para fora da coluna Protein A (Proteína A) com o uso uma etapa de elução de 0,1 M de ácido cítrico ao pH 3,0. O eluente da coluna é monitorado pelo A280. O pico do MAb anti-DR5 é agrupado.

[00332] EXEMPLO 6: Preparação dos anticorpos monoclonais humanizados dirigidos contra DR5

[00333] As regiões de anticorpo CDR e FR foram determinadas de acordo com diversas abordagens numeradas tais como IMGT (I mMunoGeneTics Information System® http://imgt.cines.fr), Kabat ou Sistema de Numeração Comum. Entretanto, o IMGT determinou que CDRs para um dado anticorpo não são necessariamente idênticos aos CDRs definidos pelos outros sistemas de numeração. Os CDRs de domínio variável e regiões de estruturas foram identificados pelo inventor graças aos sistemas de numeração IMGT.

[00334] Conversão do MAb quimérico para MAb humanizado: A cadeia H e L do anticorpo DR5 humanizado foi gerada com o uso de enxertia de CDR pelo método PCR. A fim de gerar um anticorpo humanizado no qual os CDRs de um anticorpo monoclonal de camundongo são enxertados em um anticorpo humano, há, preferencialmente, uma elevada homologia entre a região variável de um anticorpo monoclonal de camundongo e a região variável de um anticorpo humano. Portanto, as regiões V da cadeia H e cadeia L de um anticorpo monoclonal DR5 anti-humano de camundongo são comparadas à região V de todos os anticorpos humanos conhecidos com o uso do software IMGT/DomainGapAlign. Quando um anticorpo de camundongo é humanizado por uma tecnologia convencional, a sequência de aminoácidos de alguns FRs da região V de um anticorpo de camundongo que suporta o CDR pode ser enxertada no FR de uma região V humana, como desejado.

[00335] Para ambas as regiões V das cadeias humanizadas H e L, é possível selecionar as regiões V das cadeias H e L e a região J, IGKV3-D-15*01, IGHV1 - 3*01, IGKJ2*01 e IGHJ4*01 respectivamente, obtendo uma homologia elevada com a região V da cadeia H e L e a região J do anticorpo mDR5 e IGKV1-16*01, IGHV1- 3*01, IGKJ4*01 e IGHJ4*01, obtendo uma elevada homologia com a região V da cadeia H e L e a região J do anticorpo mDR5-05.

[00336] Depois, a sequência da região variável humanizada do HzDR5-01 e HzDR5-05 é determinada. As regiões variáveis da H e L do HzDR5 -01 e Hz-DR5 - 05 foram amplificadas por PCR e clonadas em um vetor de expressão p3U que contém a região constante lgG1 humano.

[00337] No caso de anticorpos humanos CDR enxertados, a atividade de ligação é reduzida por enxertia da sequência de aminoácidos do CDR somente no anticorpo de camundongo. Para evitar essa redução, dentre os diferentes resíduos de aminoácido em FR entre um anticorpo humano e um anticorpo de camundongo, os resíduos de aminoácido considerados a ter influência na atividade de ligação são enxertados juntamente com outra sequência de aminoácidos do CDR. Consequentemente, uma tentativa foi realizada nesse exemplo, para identificar os resíduos de aminoácidos em FR considerados a ter influência na atividade de ligação.

[00338] A suscetibilidade da linhagem celular de glioma H4 para a combinação de MAb anti-DR5 de camundongo ou humanizada (mDR5-01 + mDR5-05) testada a 1 μg/ml então diluída a 1/2 (razão 1/1) foi avaliada com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Figura 23). A combinação de MAb (hzDR5-01 e hzDR5-05) humanizado desencadeou a apoptose celular a um nível mais elevado em comparação à combinação de MAb de camundongo (mDR5- 01 e mDR5-05).

EXEMPLO 7: Atividade biológica MAb in vivo

[00339] Um modelo de camundongo xenoenxerto de glioma humano ortotópico foi obtido por injeção intracerebral em um camundongo de laboratório de 100.000 células isoladas vindas do modelo de camundongo xenoenxerto de glioma humano ortotópico Sc2. O tratamento de MAb foi administrado por injeção intraperitoneal (IP) a 5 mg/kg por camundongo até a eutanásia dos camundongos devido à perda de peso e foi aplicada durante um máximo de 36 dias. Os tempos de sobrevivência obtidos com o grupo e controle foram comparados aos tempos de sobrevivência obtidos com os grupos tratados (mDR5-01 +mDR5-05 versus mDR5-04+mDR5-05) com o uso do método Kaplan Meier e teste de estatística Wilcoxon (JMP software), (Figura 24). Esse estudo demonstrou a atividade antitumoral da combinação de MAb anti-DR5 (mDR5-01 + mDR5-05) em glioma intracerebral.

Claims (16)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um ou dois anticorpos que ligam especificamente um receptor DR5, sendo que o pelo menos um ou dois anticorpos compreendem dois domínios de ligação de imunoglobulina que compreendem: - um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL sendo que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 17; e - um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL sendo que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21; sendo que: - o pelo menos um polipeptídeo compreende ambos os primeiro e segundo domínios de ligação de imunoglobulina; ou - os pelo menos dois polipeptídeos compreendem um primeiro polipeptídeo que compreende o primeiro domínio de ligação e um segundo polipeptídeo que compreende o segundo domínio de ligação para uma administração simultânea à um mamífero, incluindo o homem; e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, sendo que o dito anticorpo compreende: - o par das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4; - o par das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e 8; ou - ambos os pares da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e 4 e SEQ ID NO: 6 e 8; ou - o par das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37; - o par das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 39 e 41; ou - ambos os pares da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 35 e 37 e SEQ ID NO: 39 e 41.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, em que o dito anticorpo compreende o par de sequências de aminoácido SEQ ID NO: 2 e 4, e um outro anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, em que o dito anticorpo compreende o par de sequências de aminoácido SEQ ID NO: 6 e 8.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, em que o dito anticorpo compreende o par de sequências de aminoácido SEQ ID NO: 35 e 37, e um outro anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, em que o dito anticorpo compreende o par de sequências de aminoácido SEQ ID NO: 39 e 41.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, em que o dito anticorpo compreende ambos os pares de sequências de aminoácido SEQ ID NO: 2 e 4 e SEQ ID NO: 6 e 8.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, em que o dito anticorpo compreende ambos os pares de sequências de aminoácido SEQ ID NO: 35 e 37 e SEQ ID NO: 39 e 41.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento para induzir apoptose de uma célula tumoral e/ou para tratar câncer, preferivelmente um câncer sólido.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é para uso como em combinação com outrp medicamento anticâncer.

10. Anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, caracterizado pelo fato de que compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 17.

11. Anticorpo que liga especificamente um receptor DR5, caracterizado pelo fato de que compreende um ou dois domínios de ligação que compreendem um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21.

12. Polipeptídeo biparatópico, biespecífico ou multivalente que liga especificamente um receptor DR5 caracterizado pelo fato de que compreende: - um primeiro domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL sendo que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14 CDR1, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 17; e - um segundo domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL sendo que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21.

13. Sequência de nucleotídeo isolada caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 34, 36, 38 ou 40.

14. Vetor de expressão ou uma célula hospedeira caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos, conforme definido na reivindicação 13.

15. Composição caracterizada pelo fato de que compreende dois anticorpos, ambos com a capacidade de ligar-se ao DR5, um primeiro anticorpo que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5, sendo esse primeiro epitopo aquele que se liga especificamente a um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 17, e um segundo anticorpo que compreende um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que liga a um segundo epitopo do dito DR5, sendo esse epitopo aquele que se liga especificamente a um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21, para uma administração simultânea, à um mamífero, incluindo o homem.

16. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de ter a capacidade de ligar-se aos dois polipeptídeos, ou anticorpos ou fragmentos dos mesmos, ambos com a capacidade de ligar-se ao DR5, o dito anticorpo que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro epitopo do dito DR5, sendo esse primeiro epitopo aquele que se liga especificamente a um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 15; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de sequência FAS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 17, e um segundo sítio de ligação de antígeno diferente que liga a um segundo epitopo do dito DR5, sendo esse epitopo aquele que se liga especificamente a um domínio de ligação que compreende um par de cadeias VH e VL em que a cadeia VH contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 18, uma CDR2 de sequência SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 19; e a cadeia VL contém uma CDR1 de sequência SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de sequência RTS, uma CDR3 de sequência SEQ ID NO: 21.

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