抗-DR5家族抗体,双特异性或多价抗-DR5家族抗体及其应用方法
技术领域
本发明涉及免疫学、肿瘤学的领域,并且更具体地,涉及单特异性、双特异性或多价的抗体分子,这些单特异性、双特异性或多价抗体分子可以有利地用于治疗表达DR5抗原的各种癌症、自身免疫疾病、传染病。本发明涉及与DR5受体(也被称为TRAIL受体2)特异性结合的新的多肽。本发明尤其涉及具有两个不同的结合结构域的多肽,或具有这些不同的结合结构域的多肽的组合,这些不同的结合结构域与DR5受体的不同表位结合,从而诱导凋亡。本发明还涉及含有这些多肽的药物组合物,以及使用这些多肽和组合物对癌症、自身免疫疾病和病毒感染的治疗。
背景技术
凋亡或程序性细胞死亡是多细胞有机体的正常发育和体内平衡所必需的生理过程。凋亡的紊乱促使严重的人类疾病发病,包括癌症、神经退行性疾病和获得性免疫缺陷综合征。
肿瘤坏死因子(TNF)-相关的凋亡诱导配体(TRAIL)(细胞因子TNF超家族的成员)是II型膜蛋白,该II型膜蛋白在大部分正常组织中表达,并且能够经蛋白酶剪切,产生能够与TRAIL受体结合的溶解形式(Wiley SR.等人,Immunity.1995;3:673-682;Daniel PT等人,J Immunol.1994;152:5624)。
该家族的配体通常识别并且结合细胞表面上的同源受体的有限子集,引起受体下游的信号传导级联,允许大批信号通路(包括NF-kB或半胱天冬酶(caspase)活化)的激活。TRAIL诱导特定的转化细胞的凋亡,包括许多不同类型的癌症细胞以及病毒感染的细胞,同时不诱导许多正常细胞类型的凋亡,因此在癌症治疗的发展中特别有意义(Walczak等人,Nature Medecine.1999;5/157-163,Ashkenazi A.等人,J Clin Invest.1999;104:155)。
存在四种已知的TRAIL细胞表面受体。TRAIL受体1(TRAIL-R1,DR4)和Trail受体2(TRAIL-R2、DR5、Apo-2、TRICK2、Killer、TR6、Tango-63)具有细胞质死亡结构域,并且能够经由下游的caspase活化引发肿瘤细胞中的凋亡。其它两种受体TRAIL受体3(TRAIL-R3、DcR1、TR5、TRIDD、LIT)和TRAIL受体4(TRAIL-R4、DcR2、TRUNDD)缺乏细胞质死亡结构域,并且不能介导凋亡。此外,骨保护素(OPG)(蛋白TNF受体家族的可溶(分泌)成员)也结合TRAIL。
DR4和DR5的胞质内结构域均包括所谓的死亡结构域。在它的受体DR4和DR5活化之后,fas-相关的死亡结构域衔接分子被招募至受体,引起自我蛋白酶解和起始因子caspase-8的活化。已经报道,一旦TRAIL结合,DR4和DR5就将凋亡信号转导至TRAIL敏感的癌症细胞。活化的caspase-8反过来引发下游caspase(包括caspase-3)的蛋白酶解活化。下游caspase最终使大范围的细胞蛋白降解,并且终止凋亡。
经常在人类癌症中,包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、乳癌和非小细胞肺癌中,检测到DR4或DR5的表达,而在正常组织中没有DR4或DR5的表达或者表达很低。
在很多疾病的发展或推进中,常常是细胞不被去除的情况。在很多自身免疫疾病和炎症性病症中,存活的被活化的细胞攻击正常的组织或细胞。进一步地,肿瘤发生的进行和风湿性关节炎的增生性淋巴结炎的形成的特征在于细胞的未受控制的增殖。因此,不充分的凋亡导致疾病的发展,并且使用凋亡诱导配体或激动性MAb以增强凋亡被认为是消除那些不想要的细胞的潜在的治疗策略。
TRAIL在大范围的造血和实体肿瘤细胞中诱导凋亡,同时不伤害大部分正常的细胞。TRAIL在体外具有针对癌症细胞的强凋亡诱导活性,并且在体内具有针对各种癌症的肿瘤异种移植物的潜在的抗肿瘤活性。
由于TRAIL及其衍生物(包括靶向TRAIL受体的激动性抗体)具有诱导肿瘤消退且没有显著副作用的能力,因此它们是癌症治疗的有吸引力的化合物。
在专利文献中存在很多实例,这些实例致力于使用来源于TRAIL配体的多肽作为针对癌细胞的疗法(US20090131317;US 6,469,144;US 6,740,739;US20070026000;US 6,444,640;US20050244857;US20050233958;US7,736,637)。
已经首次研究了TRAIL多肽作为伤害物以诱导TRAIL凋亡通路,但是具有半衰期短的缺点。
目前,大量注意力都集中在开发治疗癌症的新的免疫治疗策略。一种这样的策略是基于抗体的癌症疗法。
上述目标特性的最突出的决定因素是基于抗体的分子的大小相对于特异性的程度、肿瘤中的滞留和它们的清除。基于抗体的分子的另一重要特征是效价,因为显著较大的肿瘤滞留已经与靶标的多价结合相关(Adams等人,Cancer Res.1993;51:6363-6371;Wolf等人,Cancer Res.1993;53:2560-2565)。
如之前所述,已经生产出了针对DR4或DR5的激动性抗体,并且该针对DR4或DR5的激动性抗体代表了新一代的癌症疗法。还对指向TRAIL受体的激动性抗体的使用开展了工作,以诱导TRAIL凋亡通路。
猜想与DR4或DR5特异性结合的激动性单克隆抗体能够直接诱导靶定的肿瘤细胞的凋亡(Buchsbaum DJ等人,Future Oncol.2006;2:493;Rowinsky EK等人,J Clin Oncol.2005;23:9394)。
其它专利涉及指向DR4,或DR5或DR4和DR5的激动性抗体的应用,或者涉及针对DR5的抗体和另一化学治疗剂的组合应用:US20040147725;US20090022707;US20080248037;US20020155109;US 6,461,823;US 6,872,568;US7,064,189;US 6,521,228;US 7,704,502。
而且,已经开发了使用指向不同的TRAIL受体(例如DR4和DR5)的激动性抗体的组合治疗。为了制备结合DR4或DR5的激动性双特异性抗体(或产生这样的激动性MAb的杂交瘤),可以利用DR4或DR5作为各种程序中的起始材料(WO 2002/0155109)。
这些包括抗DR5MAb来沙木单抗(lexatumumab)(Plummer R.等人,ClinCancer Res.2007;13:6187),抗DR5MAb apomab(Adams C.等人,Cell DeathDiffer.2008;15:751),抗DR5MAb LBy135(Li J.等人,AACR Meeting Abstracts.2007.Abstract 4874),抗DR5MAb WD-1(Wang J.等人,Cell Mol Immunol.2008;5:55),及抗DR5MAb AMG655(Wall J.等人,AACR Meeting Abstracts.2008.Abstract 1326,Kaplan-Lefko P.等人,AACR Meeting Abstracts.2008.Abstract399)。来自这些研究的一致的发现是各种肿瘤细胞系对抗-DR5介导的细胞毒性的敏感性具有相当大的易变性。
另外,抗-DR4或抗-DR5的激动性抗体(包括mapatumumab或lexatumumab)分别在患者中耐受良好(Herbst R.S.等人,J Clin Oncol.2006;24(18S)/3013;Hotte S.J.等人,Clin Cancer Res.2008;14/3450-3455;Wakelee H.A等人,AnnOncol.2010;21/376-381;Fox N.L.等人,Expert Opin Biol Ther.2010;10/1-18)。
Lexatumumab(还已知为ETR2-ST01)是在癌症治疗中使用的针对DR5的激动性人类单克隆抗体。HGS-ETR2抗体通常由HGS通过与剑桥抗体技术(Cambridge Antibody Technology)合作生成。
Tigatuzumab(CS-1008)是由mTRA-8的CDR区域组成的人源化的IgG1单克隆抗体。从一系列抗-DR5单克隆抗体中,基于它们的特异性、不使用交联试剂的情况下在体外引发凋亡的能力并且对人类肝细胞没有毒性,选择了鼠抗-DR5单克隆抗体TRA-8(mTRA-8)(Buchsbaum DJ等人,Clin Cancer Res.2003;9:3731;Ichikawa K.等人,Nat Med.2001;7:954)。
Tigatuzumab介导与mTRA-8非常类似的体外细胞毒性和体内抗肿瘤功效的模式。已知对人类各种肿瘤细胞系具有强有力的体外细胞毒性,并且在人类癌症的鼠异种移植物模型中具有体内抗肿瘤功效。与各种化学治疗剂和/或辐射组合时,它的体外细胞毒性和体内抗肿瘤功效可以得到实质地提高(BuchsbaumDJ等人,Clin Cancer Res.2003;9:3731;DeRosier LC等人,Clin Cancer Res.2007;13:5535s)。
已经与其它化学治疗剂或疗法相关联、一起地测试了抗-DR4和抗-DR5抗体。使用两种激动性抗体HGS-ETR1(抗-DR4)和HGS-ETR2(抗-DR5)和放射疗法组合治疗结直肠肿瘤,在体外产生增强的效果,并且在体内产生计量依赖性的生长延迟(Marini P等人,Oncogene.2006;25(37):5145-54)。针对DR4和DR5的人类全长的激动性抗体证实在原代和培养的淋巴瘤细胞中诱导凋亡并且增强阿霉素和硼替佐米-诱导的细胞死亡(Georgakis GV等人,Oncogene.2006;25(37):5145-54)。已经发现辐射增强DR5的表达和对乳癌细胞的TRAIL-诱导的凋亡的易感性,暗示与辐射组合,会提高TRAIL在癌症治疗中的效率(Chinnaiyan A.M等人,PNAS.2000;97/1754-1759)。
抗体和化学治疗的组合通常增强凋亡的程度,并且可以部分反转一些细胞系中的抗性(Buchsbaum DJ等人,J Clin Cancer Res.2003;9:3731;DeRosier LC等人,Clin Cancer Res.2007;13:5535s;Oliver PG等人,Clin Cancer Res.2008;14:2180;Derosier LC等人,Mol Cancer Ther.2007;6:3198;Long JW.等人,JSurg Res.2007;137:167)。
发明内容
发明人现在出乎意料地发现了,通过使用针对DR5受体的至少两个不同表位的两种抗体,可以诱导DR5凋亡通路。与同一受体上的两个表位结合对受体具有激动作用,并且以有效地方式诱导凋亡。如本文所公开的抗体DR5-01和DR5-05的组合显示了比配体自身强的激动作用。
相对于针对单一表位的一种抗体,通过使用分别针对DR5受体上的不同表位的两种抗体,已经观察到了出乎意料的协同的作用。不希望受到理论的束缚,假定与DR5的两个表位的结合允许有协同的激动剂功能,从而出乎意料地提高凋亡诱导。已经发现了上述出乎意料的协同的作用可以有利于治疗处理或与治疗方案整合。因此,已经发现了抗体的组合可以导致尤其是在神经胶质瘤中对癌症细胞增殖的抑制的协同增加。还已经发现了,在难以治疗的癌症(诸如对化学治疗药物有或多或少的抗性的神经胶质瘤、肺癌和乳癌)的情况中,抗体和化学治疗药物的组合可以导致对癌症细胞增殖的抑制的协同增加。还已经发现了,抗体和药物的组合可以允许获得治疗效果(诸如抑制细胞增殖),该治疗效果是在大范围的药物和/或抗体剂量上稳定获得的。
因此,现在可以提供药物组合物,包括:两种多肽或抗体,该多肽或抗体通过与DR5上的两个不同表位结合充当激动剂;或双特异性抗体,该双特异性抗体通过与DR5上的两个不同表位结合充当激动剂,以及含有相同物质的药物组合物。
用于天然受体的“激动剂”或“激动性多肽或抗体”是如下的化合物,该化合物结合受体以形成受体-激动剂复合物,并且激活所述受体,起始信号传导通路并且进一步起始生物过程。在本发明的上下文中,激动剂功能的获得归功于本发明的多肽或抗体与DR5受体的两个不同表位之间的同时或顺序地相互作用,从而起始DR5凋亡通路。
因此,本发明的目标是一种组合物,该组合物包括都具有与DR5结合的能力的两种多肽,或抗体或其片段:包括第一抗原-结合位点的第一多肽或抗体,该第一抗原-结合位点与所述DR5的第一表位结合;以及,包括不同的第二抗原-结合位点的第二多肽或抗体,该第二抗原-结合位点与所述DR5的第二表位结合。所述第一抗原-结合位点和第二抗原-结合位点的每一个都与同一DR5分子上的不同表位结合。两种多肽,或抗体或其片段用于同时、单独或顺序地给予哺乳动物(包括人类)。
上述组合物或药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。上述多肽或抗体组合时是协同激动性的,这意味着它们具有与DR5分子的两个表位结合以诱导DR5凋亡通路的能力。
因此,本发明的目标还是双特异性抗体或双互补位(biparatopic)抗体或它们的片段,该双特异性抗体或双互补位抗体或它们的片段具有与DR5结合的能力,所述抗体包括:与所述DR5的第一表位结合的第一抗原-结合位点;以及,与所述DR5的第二表位结合的不同的第二抗原-结合位点。所述第一抗原-结合位点和第二抗原-结合位点的每一个都与同一DR5分子上的不同表位结合。多肽或抗体组合时是协同激动性的,这意味着它们具有与DR5分子的它们的特异性表位结合以诱导DR5凋亡通路的能力。
本发明包括一种双特异性抗体与同一DR5分子的两个不同表位的结合,或两种双特异性抗体与同一DR5分子的两个表位的结合,一种抗体与第一表位结合,第二抗体与同一DR5分子的第二表位结合。
双特异性抗体可以被配制在药物组合物中,该药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
在不希望受到理论束缚的情况下,对于作用机制,认为根据本发明的抗体组合或双特异性抗体可以促使DR5聚集。与单特异性抗体相比,这些组分可以促使较高浓度的DR5的积聚。
抗体组合或双特异性抗体还可以促使构象变化,该构象变化诱导引发凋亡信号传导或逆转癌症细胞对凋亡的抗性的较高的发生率。与单特异性抗体相比,这些组分可以促使较高浓度的DR5的积聚。
本发明的另一目标包括至少两种、三种、四种、五种或更多种多价结合的多肽或抗体或它们的片段的结合,都具有与DR5结合的能力,第一多肽或抗体包括与所述DR5的第一表位结合的第一抗原-结合位点,并且,第二多肽或抗体包括与所述DR5的第二表位结合的不同的第二抗原-结合位点。
因此,本发明的目标是一种组合物,该组合物包括至少一种化学治疗药物和两种多肽或抗体或它们的片段,该两种多肽或抗体或它们的片段都具有与DR5结合的能力,第一多肽或抗体包括与所述DR5的第一表位结合的第一抗原-结合位点,并且,第二多肽或抗体包括与所述DR5的第二表位结合的不同的第二抗原-结合位点。所述第一抗原-结合位点和第二抗原-结合位点的每一个都与同一DR5分子上的不同表位结合。上述药物和两种多肽或抗体或其片段用于同时、单独或顺序地给予哺乳动物,包括人类。在此目标中,两种多肽可以被如本文所公开的双特异性抗体或双互补位抗体或它的片段替代。
根据本发明的多肽,特别是抗体,可以进一步由鼠抗体DR5-01和DR5-05的VH和VL区域的CDR,或它们的整个VH和VL区域来限定。
本发明的目标是一种组合物,该组合物包括特异性结合DR5受体的至少一种或两种多肽,其中,该至少一种或两种多肽包括两种免疫球蛋白结合结构域,包括:
第一结合结构域,包括成对的VH链和VL链,其中,
所述VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:13或由序列SEQ ID NO:13组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:15或由序列SEQ ID NO:15组成;并且所述VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:16或由序列SEQ ID NO:16组成;CDR2,该CDR2包括序列FAS或由序列FAS组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:17或由序列SEQ ID NO:17组成;或者其中,所述VH链包含:包括序列SEQ ID NO:22或由序列SEQ ID NO:22组成的CDR1,包括序列SEQ ID NO:23或由序列SEQ ID NO:23组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:24或由序列SEQ ID NO:24组成的CDR3;并且,所述VL链包含:包括序列SEQ ID NO:25或由序列SEQ ID NO:25组成的CDR1,包括序列SEQ ID NO:26或由序列SEQ ID NO:26组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:17或由序列SEQ ID NO:17组成的CDR3;或者
其中,所述VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:32或由序列SEQ ID NO:32组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ IDNO:24或由序列SEQ ID NO:24组成;并且,所述VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:16或由序列SEQ ID NO:16组成;CDR2,该CDR2包括序列FAS或由序列FAS组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:17或由序列SEQ ID NO:17组成;
和
第二结合结构域,包括成对的VH链和VL链,其中,
所述VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:18或由序列SEQ ID NO:18组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:19或由序列SEQ ID NO:19组成;并且,所述VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:20或由序列SEQ ID NO:20组成;CDR2,该CDR2包括序列RTS或由序列RTS组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:21或由序列SEQ ID NO:21组成;或者
其中,所述VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:27或由序列SEQ ID NO:27组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:28或由序列SEQ ID NO:28组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ IDNO:29或由序列SEQ ID NO:29组成;并且,所述VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:30或由序列SEQ ID NO:30组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:31或由序列SEQ ID NO:31组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:21或由序列SEQ ID NO:21组成;
其中,所述VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:33或由序列SEQ ID NO:33组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ IDNO:29或由序列SEQ ID NO:29组成;并且,所述VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:20或由序列SEQ ID NO:20组成;CDR2,该CDR2包括序列RTS或由序列RTS组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:21或由序列SEQ ID NO:21组成;
其中,
所述至少一种多肽包括两种免疫球蛋白结合结构域,或者
所述至少两种多肽包括含第一结合结构域的第一多肽以及含第二结合结构
域的第二多肽,用于同时、单独或顺序地给予哺乳动物,包括人类,以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中,上述组合物进一步包括用于同时、单独或顺序地给予哺乳动物(包括人类)的化学治疗药物。
本发明的其它目标是根据本发明的单独的多肽或抗体及它们的各种组合,包括至少两种多肽或抗体的试剂盒,及包括至少一种多肽或抗体和至少一种药物的试剂盒,其中,抗体或多肽和药物是独立的或不是独立的。
本发明的多肽或抗体可以包括一种或几种,优选两种,结合位点或结构域或抗体决定簇(paratope)。本发明的目标是特异性结合DR5受体的多肽,该多肽包括一种或多种,优选一种或两种免疫球蛋白结合结构域,该免疫球蛋白结合结构域包括:
包括成对的VH链和VL链的结合结构域,其中:
该VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:13或由序列SEQ IDNO:13组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:15或由序列SEQ ID NO:15组成;并且,该VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:16或由序列SEQ ID NO:16组成;CDR2,该CDR2包括序列FAS或由序列FAS组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:17(DR5-01型CDR)或由序列SEQ IDNO:17(DR5-01型CDR)组成;或
该VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:22或由序列SEQ IDNO:22组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:23或由序列SEQ ID NO:23组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:24或由序列SEQ ID NO:24组成;并且,该VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:25或由序列SEQ ID NO:25组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:26或由序列SEQ ID NO:26组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:17(DR5-01型CDR)或由序列SEQ ID NO:17(DR5-01型CDR)组成;或
该VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:32或由序列SEQ IDNO:32组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:24或由序列SEQ ID NO:24组成;并且,该VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:16或由序列SEQ ID NO:16组成;CDR2,该CDR2包括序列FAS或由序列FAS组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:17(DR5-01型CDR)或由序列SEQ IDNO:17(DR5-01型CDR)组成;
和/或
包括成对的VH链和VL链的结合结构域,其中:
该VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:18或由序列SEQ IDNO:18组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:19或由序列SEQ ID NO:19组成;并且,该VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:20或由序列SEQ ID NO:20组成;CDR2,该CDR2包括序列RTS或由序列RTS组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:21(DR5-05型CDR)或由序列SEQ IDNO:21(DR5-05型CDR)组成;或
该VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:27或由序列SEQ IDNO:27组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:28或由序列SEQ ID NO:28组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:29或由序列SEQ ID NO:29组成;并且,该VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:30或由序列SEQ ID NO:30组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:31或由序列SEQ ID NO:31组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:21(DR5-05型CDR)或由序列SEQ ID NO:21(DR5-05型CDR)组成;或
该VH链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:33或由序列SEQ IDNO:33组成;CDR2,该CDR2包括序列SEQ ID NO:14或由序列SEQ ID NO:14组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:29或由序列SEQ ID NO:29组成;并且,该VL链包含:CDR1,该CDR1包括序列SEQ ID NO:20或由序列SEQ ID NO:20组成;CDR2,该CDR2包括序列RTS或由序列RTS组成;CDR3,该CDR3包括序列SEQ ID NO:21(DR5-05型CDR)或由序列SEQ IDNO:21(DR5-05型CDR)组成。上述结合结构域最好由VH链和VL链来限定,该VH链和VL链包括基于相同方法(或普通编号系统)限定的CDR,见下文的CDR表。
VH链和VL链一起限定了单个结合位点。这些结合结构域的每一个都与DR5受体上的不同表位特异性结合。上述多肽是协同激动性的,这意味着它们具有与DR5分子的两个表位结合以诱导DR5凋亡通路的能力。
“免疫球蛋白结合结构域”或“结合结构域”指由两个可变的轻(VL)链和可变的重(VH)链构成的免疫球蛋白的抗体决定簇。抗体决定簇能够特异性结合靶定的表位。
根据本发明,VL链和VH链具有免疫球蛋白的轻链或重链的传统结构,该免疫球蛋白具有骨架区(FR)。该结构可以被限定为结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在优选的实施方式中,本发明的多肽包括一种或多种,优选一种或两种免疫球蛋白结合结构域,该免疫球蛋白结合结构域包括mDR5-01的VH+VL区和/或mDR5-05的VH+VL区。在一个实施方式中,多肽包括一种或两种包括mDR5-01的VH+VL区的结合结构域。在一个实施方式中,多肽包括一种或两种包括mDR5-05的VH+VL区的结合结构域。在一个实施方式中,多肽包括两种结合结构域,该两种结合结构域一方面包括mDR5-05的VH+VL区,并且另一方面包括mDR5-01的VH+VL区。在优选的实施方式中,本发明的多肽包括一种或多种,优选一种或两种免疫球蛋白结合结构域,该免疫球蛋白结合结构域包括HzDR5-01的VH+VL区和/或HzDR5-05的VH+VL区。在一个实施方式中,多肽包括一种或两种包括HzDR5-01的VH+VL区的结合结构域。在一个实施方式中,多肽包括一种或两种包括HzDR5-05的VH+VL区的结合结构域。在一个实施方式中,多肽包括两种结合结构域,该两种结合结构域一方面包括HzDR5-05的VH+VL区,并且另一方面包括HzDR5-01的VH+VL区。
因此,抗-DR5的多肽包括一种或两种结合结构域。在一个实施方式中,结合结构域对DR5受体上的相同表位是具有特异性的。这些结合结构域包括在如本文所公开和提供的VH和VL上的3个CDR的相同组,并且在骨架区中可以是相同或稍微不同的,只要这不影响结合靶定表位的特异性。
抗-DR5的多肽尤其可以是抗体,优选是单克隆抗体,或者是适当的抗体片段,诸如Fv、Fab、F(ab’)2、单链可变的片段(scFv)。
本发明还包括多肽或抗体的组合应用,或双特异性多肽或抗体或片段等的组合应用,从而利用与结合本发明所揭示的两种表位相关的协同活性。该应用可以进一步与本文所公开的化学治疗药物的给予组合起来。
本发明的另一目标包括至少两种、三种、四种、五种或更多种单价结合的多肽或抗体或它们的片段的结合,这些多肽或抗体或它们的片段都具有与DR5结合的能力,第一多肽或抗体包括与所述DR5的第一表位结合的第一抗原-结合位点,并且,第二多肽或抗体包括与所述DR5的第二表位结合的不同的第二抗原-结合位点。
因此,本发明的另一目标是用于同时、独立或顺序地给予包括人类的哺乳动物的组合物,该组合物包括都具有与DR5结合的能力的两种多肽,或抗体或其片段;该第一多肽或抗体包括与所述DR5的第一表位结合的第一抗原-结合位点,该第一表位是与包括成对的VH链和VL链的结合结构域特异性结合的表位,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:13的CDR1、序列SEQ ID NO:14CDR1的CDR2、序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1、序列FAS的CDR2、序列SEQ ID NO:17的CDR3;并且,第二多肽或抗体包括与所述DR5的第二表位结合的不同的第二抗原-结合位点,该表位是与包括成对的VH链和VL链的结合结构域特异性结合的表位,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:18的CDR1、序列SEQ ID NO:14的CDR2、序列SEQ IDNO:19的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1、序列RTS的CDR2、序列SEQ ID NO:21的CDR3。作为选择,本领域技术人员可以将上文对CDR的限定替换为根据或如表1和表2中所述的普通编号系统对CDR的限定。
本发明的另一目标是具有与DR5结合的能力的双特异性抗体或其片段,所述抗体包括:与所述DR5的第一表位结合的第一抗原-结合位点,该第一表位是与包括成对的VH链和VL链的结合结构域特异性结合的表位,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:13的CDR1、序列SEQ ID NO:14CDR1的CDR2、序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1、序列FAS的CDR2、序列SEQ ID NO:17的CDR3,以及,与所述DR5的第二表位结合的不同的第二抗原-结合位点,该表位是与包括成对的VH链和VL链的结合结构域特异性结合的表位,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:18的CDR1、序列SEQ ID NO:14的CDR2、序列SEQ ID NO:19的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1、序列RTS的CDR2、序列SEQ ID NO:21的CDR3。作为选择,本领域技术人员可以将上文对CDR的定义替换为如表1和表2中所述的根据或普通编号系统对CDR的定义。
本发明的另一目标是治疗方法,包括给予有效量或足量的如本文公开的至少两种多肽或抗体,或如本文公开的至少一种双特异性或双互补位多肽或抗体,或如本文公开的至少两种多肽或抗体和至少一种药物,或如本文公开的至少一种双特异性或双互补位多肽或抗体和至少一种药物。治疗尤其指治疗表达DR5抗原的各种癌症、自身免疫疾病、传染病。
定义
术语“凋亡”和“凋亡活性”在广义上使用,并且指哺乳动物中有序或受控形式的细胞死亡,典型地伴随有一种或多种特有的细胞变化,包括细胞质凝聚、质膜微绒毛的丢失、细胞核片段化、染色体DNA的降解或线粒体功能的丢失。该活性可以例如通过细胞活力检测、FACS分析或DNA电泳,并且更具体地通过annexin V(膜联蛋白)的结合、DNA的片段化、细胞皱缩、内质网膨胀、细胞破裂和/或膜囊泡(被称为凋亡小体)的形成来确定。
如本文使用的,术语“协同”或“协同作用”或“协同地”指两种或更多种试剂相互作用,从而使它们的组合效果大于它们各自效果的总和。
当在本文中使用时,术语“激动剂”或“激动性”指或描述能够实质上直接或间接地诱导促进或增强DR5生物活性或活化的分子。任选地,“激动剂DR5抗体”是抗体,该抗体具有至少与DR5的配体相当的活性,DR5的配体已知为Apo-2配体(TRAIL);或者“激动剂DR5抗体”能够激活DR5受体,从而产生另一细胞内信号传导通路的激活,该细胞内信号传导通路可以包括caspase 3、caspase 8、caspase 10或FADD的激活。
当在本文中使用时,术语“拮抗剂”或“拮抗性”指或描述能够实质上直接或间接地阻碍、降低或抑制DR5激活的DR5生物活性的分子。任选地,拮抗剂是抵消由DR5的激活,或DR5和其配体(诸如Apo-2配体)之间的复合物的形成所产生生物活性的分子。
术语“抗体”以最广泛的意义使用,并且具体地涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整的抗体形成的多价抗体(例如双特异性抗体),及抗体片段,只要它们显示出期望的生物活性。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是大约150,000道尔顿的异四聚体(heterotetrameric)糖蛋白,由两条相同的轻(L)链和相同的重(H)链组成。每一条轻链都通过一个共价二硫键与重链相连,同时,二硫键合的数量在不同的免疫球蛋白同型的重链之间是不同的。每一条重链和轻链还有规律地具有间隔开的链内二硫桥。每一条重链在一端都具有可变的结构域(VH)。
如本文所使用的,“抗体”指由一种或多种多肽组成的蛋白质,该一种或多种多肽基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。经验证的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因,以及极大数量的免疫球蛋白的可变区基因。轻链被划分为κ或λ。重链被划分为γ、μ、α、δ或ε,这相应地限定了免疫球蛋白的种类,分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
对于本发明的抗体,术语“免疫特异性”或“特异性结合”指抗体,该抗体与感兴趣的蛋白(例如DR5/TRAIL R2)的一种或多种表位结合,但是基本不识别和结合含有抗原生物分子的混合群体的样品中的其它分子。
“表位DR5-01”和“表位DR5-05”是DR5的胞外结构域中的区域,DR5-01和DR5-05抗体分别与这些区域结合。
如本文所使用的,术语“双特异性抗体”指包括两种抗原结合位点的抗体,第一结合位点具有对第一抗原或表位的亲和力,并且第二结合位点具有对第二抗原或表位的亲和力,第二抗原或表位与第一抗原或表位不同。
“双特异性抗体(bispecific antibody)”或“双互补位抗体(biparatopicantibody)”是单个双价抗体,该单个双价抗体具有两种不同的特异性抗原结合位点。根据本发明,这些抗体具有两种不同的结合位点,每一种结合位点针对DR5分子上的特异且不同的表位。该定义还包括双特异性抗体或双互补位抗体的片段,该双特异性抗体或双互补位抗体的片段都包括结合位点,并且其中这些结合位点的每一个都具有与DR5上的对应的表位结合的能力。这样的片段例如可以是F(ab’)2抗体片段。
如本文所使用的,术语“双价双特异性抗体”指如上所述的抗体,在该抗体中,两对重链和轻链(HC/LC)中的每一对都特异性结合的不同的表位,即,第一重链和第一轻链一起特异性结合第一表位,并且,第二重链和第二轻链一起特异性结合第二表位;这样的双价双特异性抗体能够同时或非同时地特异性结合两种不同的表位。
根据本发明,通过替换仅一对重链和轻链(HC/LC)中的特定结构域,可以提高期望的双价双特异性抗体与不期望的副产物的比率。同时,两个HC/LC对的第一HC/LC对源自与第一表位特异性结合的抗体并且基本是不变的,两个HC/LC对的第二HC/LC对源自与第二表位特异性结合的抗体并且通过以下替换进行改变:
·轻链:可变的轻链结构域VL被特异性结合第二表位的所述抗体的可变的重链结构域VH替换,并且恒定的轻链结构域CL被特异性结合第二表位的所述抗体的恒定的重链结构域CH替换,以及
·重链:可变的重链结构域VH被特异性结合第二表位的所述抗体的可变的重链结构域VL替换,并且恒定的重链结构域CH被特异性结合第二表位的所述抗体的恒定的轻链结构域CL替换。
经设计的蛋白,诸如能够结合两种或更多种抗原或表位的双价抗体或多价抗体,在本领域中是已知的。这样的多价结合蛋白可以使用细胞融合、化学偶联或重组DNA技术生成。
在一个途径中,已经使用四源杂交瘤技术生产出了与天然抗体非常相似的双特异性抗体(Milstein C.等人,Nature.1983;305:537-40),该四源杂交瘤技术基于表达鼠单克隆抗体的两种不同的杂交瘤细胞系的体细胞融合,该鼠单克隆抗体具有双特异性抗体的期望的特异性。因为两种不同的抗体重链和轻链在得到的杂种-杂交(或四源杂交瘤)细胞系内的随机配对,生成多达十种不同的抗体种类,这十种不同的抗体种类中,仅一种是期望的有功能的双特异性抗体。由于存在错配的副产物并且显著降低的生产产量,意味着需要复杂的纯化程序(Morrison S.L.,Nature Biotech.2007;25:1233-1234)。通常,如果使用重组表达技术,则仍然存在错配的副产物的相同问题。
克服错配的副产物的问题的途径(已知为“球进洞(knobs-into-holes)”)的目标是,通过在CH3结构域中引入突变以改变接触界面,推动两种不同的抗体的重链的配对。在一条链上,大体积氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换,以产生洞。相反地,具有大的侧链的氨基酸被引入其它CH3结构域中,以产生“球(knob)”。通过共表达这两种重链(和两种相同的轻链,两种相同的轻链必须适于两种重链),可以观察到杂二聚体形成(“球-洞”)对同二聚体形成(“洞-洞”或“球-球”)的高产量(Ridgway,JB等人,Protein Eng.1996;9:617-621;和WO 96/027011)。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分,优选完整抗体的抗原结合区或可变区。适当的“抗体片段”是抗体的片段,该抗体的片段具有结合DR5表位并且起始凋亡通路的能力。
抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段;双链抗体;线性抗体(Zapata等人,Protein Eng.1995;8(10):1057-1062);单链抗体分子;以及由抗体片段形成的单价抗体。
“完整的”抗体是包括如下区域的抗体:抗原结合的可变区域,以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域、CH1、CH2和CH3。抗体经木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,每一种“Fab”片段都包括单个抗原结合位点和CL区和CH1区,以及剩余的Fc片段。胃蛋白酶处理产生“F(ab’)2”片段,该“F(ab’)2”片段具有两种抗原-结合位点并且仍然能够使抗原交联。
“Fv”是最小的抗体片段,包含完整的抗原-识别和抗原-结合位点。该区域由一条重链和一条轻链的可变结构域以紧密、非共价结合体的形式的二聚体组成。在这种构象中,每一可变结构域的三个高变区(CDR)相互作用,以限定VH-VL二聚体表面上的抗原-结合位点。共同地,六个高变区或CDR共同赋予抗体抗原-结合的特异性。
“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1),并且仅具有一种抗原-结合位点。
“Fab’”片段通过在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基而不同于Fab片段,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
F(ab’)2抗体片段最初产生为在它们之间具有铰链半胱氨酸的成对的Fab’片段。抗体片段的其它化学偶联也是已知的(Hermanson等人,BioconjugateTechniques(生物偶联技术),Academic Press(学术出版社),1996,US 4342566)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH结构域和VL结构域,其中,这些结构域存在于单个多肽链中。优选地,scFv包括在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头,使得scFv能够形成用于抗原结合的期望的结构。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用,指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于天然出现的氨基酸聚合物,以及其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。这些术语也包括传统肽键上的变体,该传统肽键连接构成多肽的氨基酸。优选的“肽”、“多肽”和“蛋白”是氨基酸链,其中氨基酸的碳通过肽键连接。
因此,在链一端(氨基末端)处的末端氨基酸具有自由的氨基,同时在链另一端(羧基末端)处的末端氨基酸具有自由的羧基。如在本文中使用的,术语“氨基末端”(简称为N-末端)指在肽的氨基末端处的氨基酸上的自由α-氨基,或者指肽内任何其它位置处的氨基酸的α-氨基(当参与肽键时是氨基)。类似地,术语“羧基末端”指肽的羧基末端上的自由羧基,或者指肽内任何其它位置处的氨基酸的羧基。肽还基本包括任何聚氨基酸,该聚氨基酸包括(但并不限于)肽模拟物,诸如通过与胺键完全不同的醚连接的氨基酸。
术语“可变”指如下事实:在抗体之间,可变结构域的特定部分在序列上普遍不同,并且该可变结构域用于每一具体抗体对其具体抗原的结合和特异性。但是,可变性在抗体的可变结构域上并不是均匀分布的。它集中在轻链和重链的可变结构域中的三个被称为互补决定区(CDR)的片段或高变区中。可变结构域中恒定性较高的部分被称为框架(FR)。天然的重链和轻链的可变结构域都包括四个FR区,这四个FR区主要采取β-折叠的构象且通过三个CDR相连。这三个CDR形成环,连接β-折叠结构,并且在一些情况中形成β-折叠结构的一部分。每一条链中的CDR通过FR区被很接近地保持在一起,并且与来自另一条链的CDR一起促使抗体的抗原结合位点的形成(Kabat等人,NIH Publ.1991;No.91-3242,Vol.1,647-669)。恒定结构域不直接参与抗体和抗原的结合,但是显示出各种效应物的功能,诸如在抗体-依赖的细胞毒性中抗体的参与。
本文中的单克隆抗体只要能显示出期望的生物活性,则具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及这样的抗体的片段,在“嵌合”抗体中,重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种的抗体中的对应序列是相同或同源的,或属于特定的抗体种类或亚类;同时,链的剩余部分与来源于另一物种的抗体中的对应序列是相同或同源的,或属于另一抗体种类或亚类,(U.S.Pat.No.4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是如下的嵌合抗体:在这些嵌合抗体中,已经自原始抗体的恒定区修改或改变了恒定区,以生成根据本发明的特性,特别是在C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合方面的特性。
这样的嵌合抗体还被称为“类别转换抗体(class-switched antibody)”。嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物,该免疫球蛋白基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段。用于产生嵌合抗体的方法涉及常规的重组DNA,并且基因转染技术在本领域是公知的。例如参见Morrison,S.L等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984;81:6851-6855,美国专利号5,202,238和美国专利号5,204,244。WO 2006/093794涉及杂二聚体蛋白结合组合物。WO99/37791描述了多种用途的抗体衍生物。Morrison等人,the J.Immunolog.1998;160:2802-2808涉及可变区结构域互换对IgG的功能特性的影响。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人的免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗体结合序列)。人源化抗体大部分是人类的免疫球蛋白(受体抗体),其中,来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体受体)的具有期望的特异性、亲和力和能力的CDR的残基取代,该非人物种诸如为小鼠、大鼠或兔。在一些实例中,人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被对应的非人类残基取代。
在优选的实施方式中,鼠源CDR被植入人类抗体的骨架区中,以制备“人源化抗体”。例如参见Riechmann,L.等人,Nature.1988;332:323-327,和Neuberger,MS等人,Nature.1985;314:268-270。特别优选的CDR对应于上面提到的嵌合抗体的代表识别抗原的序列的那些CDR。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是如下的人源化抗体:在这些人源化抗体中,已经自原始抗体的恒定区额外地修改或改变了恒定区,以生成根据本发明的特性,特别是在C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合方面的特性。
进一步地,人源化抗体可包括既没有在受体抗体中发现也没有在引入的CDR或骨架序列中发现的残基。做出这些修改,以进一步改进和最大化抗体的性能。通常,人源化抗体基本上都将包括至少一种、并且典型地两种可变结构域,其中,所有CDR区或基本所有的CDR区都对应非人的免疫球蛋白,并且所有FR区或基本所有FR区都是人类免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最好还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,典型地将包括人类免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分。具体细节参见Jones等人,Nature.1986;321:522-525;Reichmann等人,Nature.1988;332:323-329和Presta等人,Curr.Op.Struct.Biol.1992;2:593-596。
已经示出有助于抗体介导的细胞毒性的免疫效应物的功能包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。
还可以经由抗增殖效果来介导细胞毒性。对于肿瘤细胞增殖的抗体调节的机制知道的很少。但是,在对抗体与Fcg受体(FcgR)的相互作用对免疫效应细胞的影响的理解上的进步,已经能够进行效应物功能显著提高的抗体的基因改造。
MAb的作用机制复杂,并且不同的MAb显现出不同的作用机制。存在很多机制,MAb通过这些机制引起靶细胞的死亡。这些包括凋亡、CDC、ADCC和信号传导的抑制。
效应物功能(诸如CDC和ADCC)是对于MAb的临床疗效可能很重要的效应物功能。所有这些效应物功能由抗体的Fc区介导,并且允许作者以或多或少的成功尝试氨基酸的修改。糖基化,特别是Fc区的岩藻糖基化对抗体的效能具有显著的影响。这使得作者为了改变糖基化谱,而修改CHO细胞中的抗体产生条件,从而再次以或多或少的成功尝试改进一些效应物的功能。
之前的研究已经示出,FcgRIIIa基因的多态性在氨基酸158处编码苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)。缬氨酸亚型的表达与增强的亲和力和与MAb的结合相关(Rowland AJ,等人1993.Cancer Immunol Immunother.37(3):195-202;Sapra P,Allen TM.2002.Cancer Res 62:7190–4;M,等人2007.Mol Immunol.44(8):1935-43)。一些临床研究已经支持了这一发现,在患非霍奇金淋巴瘤的患者中对利妥昔单抗具有更大的临床反应,其中患非霍奇金淋巴瘤的患者显露出V/V多态性(Bargou R,等人2008.Science.321:974-7;Bruenke J,2005.Br JHaematol.130(2):218-28;Cartron G,Blood.2002Feb 1;99(3):754-8;HekmanA,等人1991.Cancer Immunol Immunother 32:364–72)。
WO1999051642描述了变体人类IgG Fc区,包括第270位或第329位上的氨基酸取代,或者第270、322、329和331位上的两个或多个取代。这些修改的目的在于提高CDC和ADCC效应物的功能。
“处理”或“治疗”指治疗处理和预防性或防护性措施。
用于处理或治疗目的的“哺乳动物”指被分类为哺乳动物的任何动物,包括人类,家畜和耕畜,以及动物园动物、体育动物或宠物动物,诸如狗、马、猫、牛等。优选地,哺乳动物是人类。
术语“癌症(cancer)”和“癌性的(cancerous)”指或描述哺乳动物中的生理条件,典型的特征是不受控制的细胞生长。癌症的实例包括,但并不限于,癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、肾癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、唾腺癌、肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌,和各种类型的头颈癌。
本文中的术语“核酸”或“寡核苷酸”或语法等价语指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸优选是单链或双链的,并且将通常含有磷酸二酯键。
抗体的氨基酸序列“变体”(或突变体)是通过在抗体DNA中引入适当的核苷酸改变,或通过核苷酸合成制备的。但是,这样的修改仅能在非常有限的范围(例如如上所述的范围)内进行。例如,修改不改变上述抗体的诸如IgG同型和抗原结合的特征,但是可能改进重组生产的产量、蛋白稳定性或便于纯化。
具体实施方式
CDR序列可以根据或普通编号系统限定,该普通编号系统保留和之间的常见序列。
本发明的抗DR5的抗体mDR5-01(具有鼠VH和VL及人Fc的嵌合抗体)和HzDR5-01(具有鼠CDR和人FR,具有或没有回复突变,并且经Fc优化或未经Fc优化的人源化抗体)的CDR包括以下CDR:
表1
本发明的抗DR5的抗体mDR5-05和HzDR5-05的CDR包括以下CDR:
表2
根据定义,这些CDR包括缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的变体CDR,该变体保持初始CDR的特异性。普通编号系统规定了具有最短的氨基酸序列的CDR定义或最小的CDR定义。
mDR5-01、mDR5-05、HzDR5-01和HzDR5-05具有VH和VL氨基酸序列,并且核酸序列描述在下表中:
表3
|
氨基酸序列VH |
氨基酸序列VL |
mDR5-01 |
SEQ ID NO:4 |
SEQ ID NO:2 |
mDR5-05 |
SEQ ID NO:8 |
SEQ ID NO:6 |
HzDR5-01 |
SEQ ID NO:35 |
SEQ ID NO:37 |
HzDR5-05 |
SEQ ID NO:39 |
SEQ ID NO:41 |
表4
|
核酸序列VH |
核酸序列VL |
mDR5-01 |
SEQ ID NO:3 |
SEQ ID NO:1 |
mDR5-05 |
SEQ ID NO:7 |
SEQ ID NO:5 |
HzDR5-01 |
SEQ ID NO:34 |
SEQ ID NO:36 |
HzDR5-05 |
SEQ ID NO:38 |
SEQ ID NO:40 |
DR5-01和DR5-05具有CH和CL氨基酸序列,并且核酸序列描述在下表中:
表5
|
CH |
CL |
氨基酸序列 |
SEQ ID NO:10 |
SEQ ID NO:12 |
核酸序列 |
SEQ ID NO:9 |
SEQ ID NO:11 |
在一个实施方式中,上述多肽包括一个或两个结合结构域,该结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:13的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1,序列FAS的CDR2,序列SEQ ID NO:17的CDR3。该多肽特异性结合DR5受体上的第一表位。在一个实施方式中,多肽包括两个这样的结合结构域。
在一个实施方式中,多肽包括一个或两个结合结构域,该结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:22的CDR1,序列SEQ ID NO:23的CDR2,序列SEQ ID NO:24的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:25的CDR1,序列SEQ ID NO:26的CDR2,序列SEQ ID NO:17的CDR3。该多肽特异性结合DR5受体上的第一表位。在一个实施方式中,上述多肽包括两个这样的结合结构域。
在一个实施方式中,多肽包括一个或两个结合结构域,该结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:32的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:24的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1,序列FAS的CDR2,序列SEQ ID NO:17的CDR3。该多肽特异性结合DR5受体上的第一表位。在一个实施方式中,多肽包括两个这样的结合结构域。
在一个实施方式中,多肽包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:18的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:19的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1,序列RTS的CDR2,序列SEQ ID NO:21的CDR3。该多肽特异性结合DR5受体上的不同的第二表位。在一个实施方式中,多肽包括两个这样的结合结构域。
在一个实施方式中,多肽包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:27的CDR1,序列SEQ ID NO:28的CDR2,序列SEQ ID NO:29的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:30的CDR1,序列SEQ ID NO:31的CDR2,序列SEQ ID NO:21的CDR3。该多肽特异性结合DR5受体上的不同的第二表位。在一个实施方式中,多肽包括两个这样的结合结构域。
在一个实施方式中,多肽包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:33的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:29的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1,序列RTS的CDR2,序列SEQ ID NO:21的CDR3。该多肽特异性结合DR5受体上的不同的第二表位。在一个实施方式中,多肽包括两个这样的结合结构域。
在另一实施方式中,抗DR5的多肽包括两种结合结构域,并且这两种结合结构域各自对DR5受体上的不同表位具有特异性。这些结合结构域包括在如本文中公开和提供的VH和VL上的3个CDR的具体组,并且在骨架区中可以是相同或稍微不同的。
抗DR5多肽尤其可以是F(ab’)2、Fab、Fv、二价的单链可变片段(scFv)、抗体、优选单克隆抗体、片段、纳米抗体、多聚scFv。
在该实施方式中,抗DR5的多肽,优选抗体,是双特异性或双互补位的,并且包括:
包括成对的VH链和VL链的第一结合结构域,其中,该VH链包含:包括序列SEQ ID NO:13或由序列SEQ ID NO:13组成的CDR1,包括序列SEQ IDNO:14或由序列SEQ ID NO:14组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:15或由序列SEQ ID NO:15组成的CDR3;并且,该VL链包含:包括序列SEQ ID NO:16或由序列SEQ ID NO:16组成的CDR1,包括序列FAS或由序列FAS组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:17或由序列SEQ ID NO:17组成的CDR3,以及
包括成对的VH链和VL链的第二结合结构域,其中,该VH链包含:包括序列SEQ ID NO:18或由序列SEQ ID NO:18组成的CDR1,包括序列SEQ IDNO:14或由序列SEQ ID NO:14组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:19或由序列SEQ ID NO:19组成的CDR3;并且,该VL链包含:包括序列SEQ ID NO:20或由序列SEQ ID NO:20组成的CDR1,包括序列RTS或由序列RTS组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:21或由序列SEQ ID NO:21组成的CDR3。
在一个实施方式中,抗DR5的多肽,优选抗体,是双特异性或双互补位的,并且包括:
包括成对的VH链和VL链的第二结合结构域,其中,该VH链包含:包括序列SEQ ID NO:22或由序列SEQ ID NO:22组成的CDR1,包括序列SEQ IDNO:23或由序列SEQ ID NO:23组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:24或由序列SEQ ID NO:24组成的CDR3;并且,该VL链包含:包括序列SEQ ID NO:25或由序列SEQ ID NO:25组成的CDR1,包括序列SEQ ID NO:26或由序列SEQ ID NO:26组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:17或由序列SEQ ID NO:17组成的CDR3,以及
包括成对的VH链和VL链的第二结合结构域,其中,该VH链包含:包括序列SEQ ID NO:27或由序列SEQ ID NO:27组成的CDR1,包括序列SEQ IDNO:28或由序列SEQ ID NO:28组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:29或由序列SEQ ID NO:29组成的CDR3;并且,该VL链包含:包括序列SEQ ID NO:30或由序列SEQ ID NO:30组成的CDR1,包括序列SEQ ID NO:31或由序列SEQ ID NO:31组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:21或由序列SEQ ID NO:21组成的CDR3。
在一个实施方式中,抗DR5的多肽,优选抗体,是双特异性或双互补位的,并且包括:
包括成对的VH链和VL链的第一结合结构域,其中,该VH链包含:包括序列SEQ ID NO:32或由序列SEQ ID NO:32组成的CDR1,包括序列SEQ IDNO:14或由序列SEQ ID NO:14组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:24或由序列SEQ ID NO:24组成的CDR3;并且,该VL链包含:包括序列SEQ ID NO:16或由序列SEQ ID NO:16组成的CDR1,包括序列FAS或由序列FAS组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:17或由序列SEQ ID NO:17组成的CDR3,以及
包括成对的VH链和VL链的第二结合结构域,其中,该VH链包含:包括序列SEQ ID NO:33或由序列SEQ ID NO:33组成的CDR1,包括序列SEQ IDNO:14或由序列SEQ ID NO:14组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:29或由序列SEQ ID NO:29组成的CDR3;并且,该VL链包含:包括序列SEQ ID NO:20或由序列SEQ ID NO:20组成的CDR1,包括序列RTS或由序列RTS组成的CDR2,包括序列SEQ ID NO:21或由序列SEQ ID NO:21组成的CDR3。
该双特异性或双互补位抗DR5的多肽或抗体包括本发明的两种不同的结构域,并且可以特异性结合两种不同的表位中的任意一种或同时结合两种不同的表位。
在一些实施方式中,本发明的抗DR5的多肽,优选抗体,包括:
氨基酸序列对SEQ ID NO:2和4(来自DR5-01的VL和VH)及氨基酸序列对SEQ ID NO:6和8(来自DR5-05的VH和VL)中的一种或多种,
氨基酸序列对SEQ ID NO:2和4(来自DR5-01的VL和VH),
氨基酸序列对SEQ ID NO:6和8(来自DR5-05的VL和VH),或者
氨基酸序列对SEQ ID NO:2和4(来自DR5-01的VL和VH)及氨基酸序列对SEQ ID NO:6和8(来自DR5-05的VL和VH),
氨基酸序列对SEQ ID NO:35和37(来自HzDR5-01的VH和VL)及氨基酸序列对SEQ ID NO:39和41(来自HzDR5-05的VH和VL)中的一种或多种,
氨基酸序列对SEQ ID NO:35和37(来自HzDR5-01的VH和VL),
氨基酸序列对SEQ ID NO:39和41(来自HzDR5-05的VH和VL),或者
氨基酸序列对SEQ ID NO:35和37(来自HzDR5-01的VH和VL)及氨基酸序列对SEQ ID NO:39和41(来自HzDR5-05的VL和VH),
在一些实施方式中,本发明的抗DR5的多肽,优选抗体,包括:
每种氨基酸序列SEQ ID NO:4、10、2和12(例如全部或完整的DR5-01
抗体)两个;
氨基酸序列SEQ ID NO:4、10、2和12(基于DR5-01的单链Fv);
每种氨基酸序列SEQ ID NO:8、10、6和12(例如全部或完整的DR5-05
抗体)两个;
氨基酸序列SEQ ID NO:8、10、6和12(基于DR5-05抗体的单链Fv);
氨基酸序列SEQ ID NO:4、8、2、6、10和12(双特异性抗体),特别是双
特异性抗体包括SEQ ID NO:4、8、2、6(每种一个)和10、12(每种两
个);
氨基酸序列SEQ ID NO:2和12(轻链);
氨基酸序列SEQ ID NO:6和12(轻链);
氨基酸序列SEQ ID NO:4和10(重链);
氨基酸序列SEQ ID NO:8和10(重链);
每种氨基酸序列SEQ ID NO:35、10、37和12(例如全部或完整的HzDR5-01
抗体)两个;
氨基酸序列SEQ ID NO:35、10、37和12(基于HzDR5-01的单链Fv);
每种氨基酸序列SEQ ID NO:39、10、41和12(例如全部或完整的HzDR5-05
抗体)中两个;
氨基酸序列SEQ ID NO:39、10、41和12(基于HzDR5-05的单链Fv);
氨基酸序列SEQ ID NO:35、39、37、41、10和12(双特异性抗体),特别
是双特异性抗体包括SEQ ID NO:35、39、37、41(每种一个)和10、12
(每种两个);
氨基酸序列SEQ ID NO:37和12(轻链);
氨基酸序列SEQ ID NO:41和12(轻链);
氨基酸序列SEQ ID NO:35和10(重链);
氨基酸序列SEQ ID NO:39和10(重链)。
本发明的抗DR5的多肽,优选抗体,可以是完全鼠源的,说明它们包括与母源抗体或初始的鼠源抗体的氨基酸序列匹配的氨基酸序列。本发明的多肽还可以是嵌合或人源的,说明它们可以包括来源于人的氨基酸序列。具体地,上述多肽可以包括来源于人的抗体的骨架区和/或恒定区。
本发明的另一目标是包括如上公开并且在本文中提供的,根据本发明的一种、两种或更多种多肽的组合物或药物组合物,以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。这些组合物的实施方式通过使用根据的CDR定义来限定。但是,本发明还涵盖和涉及使用如上所示的序列的等价或替代的组合物,其中,编号被编号或普通编号系统取代。因此,在组合物的以下实施方式中,其它实施方式是本发明的一部分,其中,根据上表,一个实施方式使用编号取代了用编号定义的CDR。另外,在组合物的以下实施方式中,其它实施方式是本发明的一部分,其中,根据上表,一个实施方式使用普通编号系统取代了用编号定义的CDR。
在第一实施方式中,上述组合物包括多肽,优选抗体,该多肽优选抗体包括一种或两种结合结构域,该结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:13的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1,序列FAS的CDR2,序列SEQ ID NO:17的CDR3。在第二实施方式中,上述组合物包括多肽,优选抗体,该多肽优选抗体包括一种或两种结合结构域,该结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:18的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:19的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1,序列RTS的CDR2,序列SEQ ID NO:21的CDR3。在第三实施方式中,上述组合物包括这两种多肽或抗体的混合物。作为选择,本领域技术人员可以将上文对CDR的定义替换为如表1和表2中所述的根据或普通编号系统对CDR的定义。
在另一实施方式中,上述组合物包括抗DR5的双特异性多肽、优选抗体,该抗DR5的双特异性多肽、优选抗体包括第一结合结构域和第二结合结构域,该第一结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:13的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1,序列FAS的CDR2,序列SEQ IDNO:17的CDR3。该第二结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:18的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ IDNO:19的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1,序列RTS的CDR2,序列SEQ ID NO:21的CDR3。作为选择,本领域技术人员可以将上文对CDR的定义替换为如表1和表2中所述的根据或普通编号系统对CDR的定义。
在一个实施方式中,上述组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:2和4的抗DR5的多肽,优选抗体;包括氨基酸序列对SEQ ID NO:6和8的抗DR5的多肽,优选抗体;以及药学上的载剂、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中,该组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:35和37的抗DR5的多肽,优选抗体;包括氨基酸序列对SEQ ID NO:39和41的抗DR5的多肽,优选抗体;以及药学上的载剂、稀释剂或赋形剂。
本发明还涉及包括至少两种多肽、优选抗体的这些组合物用于同时、独立或顺序地给予包括人类的哺乳动物。
具体的目标是一种组合物,该组合物包括双特异性抗DR5的抗体,以及药学上可接受的载剂;该双特异性抗DR5的抗体包括氨基酸对SEQ ID NO:2和4及氨基酸对SEQ ID NO:6和8,或包括氨基酸对SEQ ID NO:35和37及氨基酸对SEQ ID NO:39和41。
本发明的目标特别是一种组合物,该组合物包括特异性结合DR5受体的至少一种或两种多肽以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂,其中,该至少一种或两种多肽包括两种免疫球蛋白结合结构域,该两种免疫球蛋白结合结构域包括:
包括成对的VH链和VL链的第一结合结构域,其中,VH链含有序列SEQID NO:13的CDR1、序列SEQ ID NO:14的CDR2、序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1、序列FAS的CDR2、序列SEQ ID NO:17的CDR3,以及
包括成对的VH链和VL链的第二结合结构域,其中,VH链含有序列SEQID NO:18的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:19的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1,序列RTS的CDR2,序列SEQ ID NO:21的CDR3,
其中,
所述至少一种多肽包括两种免疫球蛋白结合结构域,或者
所述至少两种多肽包括含第一结合结构域的第一多肽以及含第二结合结构
域的第二多肽,用于同时、单独或顺序地给予包括人类的哺乳动物。
作为选择,本领域技术人员可以将上文对CDR的定义替换为如表1和表2中所述的根据或普通编号系统对CDR的定义。
在一些实施方式中,本发明的组合物包括抗DR5的多肽,优选抗体,该抗DR5的多肽优选抗体包括:
每种氨基酸序列SEQ ID NO:4、10、2和12(例如全部或完整的DR5-01抗体)两个;
氨基酸序列SEQ ID NO:4、10、2和12(基于DR5-01的单链Fv);
每种氨基酸序列SEQ ID NO:8、10、6和12(例如全部或完整的DR5-05抗体)两个;
氨基酸序列SEQ ID NO:8、10、6和12(基于DR5-05的单链Fv);
氨基酸序列SEQ ID NO:4、8、2、6、10和12(双特异性抗体),特别是双特异性抗体包括SEQ ID NO:4、8、2、6(每种一个)和10、12(每种两个);
氨基酸序列SEQ ID NO:2和12(轻链);
氨基酸序列SEQ ID NO:6和12(轻链);
氨基酸序列SEQ ID NO:4和10(重链);
氨基酸序列SEQ ID NO:8和10(重链);
每种氨基酸序列SEQ ID NO:35、10、37和12(例如全部或完整的HzDR5-01抗体)两个;
氨基酸序列SEQ ID NO:35、10、37和12(基于HzDR5-01的单链Fv);
每种氨基酸序列SEQ ID NO:39、10、41和12(例如全部或完整的HzDR5-05抗体)两个;
氨基酸序列SEQ ID NO:39、10、41和12(基于HzDR5-05的单链Fv);
氨基酸序列SEQ ID NO:35、39、37、41、10和12(双特异性抗体),特别是双特异性抗体包括SEQ ID NO:35、39、37、41(每种一个)和10、12(每种两个);
氨基酸序列SEQ ID NO:37和12(轻链);
氨基酸序列SEQ ID NO:41和12(轻链);
氨基酸序列SEQ ID NO:35和10(重链);
氨基酸序列SEQ ID NO:39和10(重链)。
这些组合物可以包括针对另一靶点的至少一种额外的多肽或抗体,和/或至少一种化学治疗药物(诸如小分子),用于将本发明的多肽或抗体同时、独立或顺序地给予哺乳动物(包括人类)。作为额外的活性成分,可以引用阿霉素、吉西他滨(gemcitabine)、喜树碱、紫杉醇。上述组合物可以包括两种多肽或抗体或它们的片段,两种多肽或抗体或它们的片段都具有结合DR5的能力,且被修改以包括变体的人优化的IgG Fc区、优选IgG1Fc区,其中该变体区包括氨基酸取代,以调节PDCC、ADCC和/或CDC。两种多肽或抗体或它们的片段尤其具有结合DR5的能力,并且缀合至细胞的细胞毒性组分(ADC)。
根据本发明的组合物或药物组合物要用作药剂,特别用于诱导肿瘤细胞的凋亡。根据本发明的组合物或药物组合物要用作药剂,特别用于治疗癌症,优选用以治疗实体癌症。
本文公开和提供的分离的核酸序列也是本发明的目标。
因此,本发明还涉及分离的核苷酸序列,该分离的核苷酸序列包括以下核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、5或7,或连接在一起的核苷酸序列的组合;SEQ IDNO:9和7或SEQ ID NO:9和3,SEQ ID NO:11和1或SEQ ID NO:11和5。本发明还涉及分离的核苷酸序列,该分离的核苷酸序列包括以下核苷酸序列SEQ ID NO:34、36、38或40,或连接在一起的核苷酸序列的组合;SEQ ID NO:9和34或SEQ ID NO:9和38,SEQ ID NO:11和36或SEQ ID NO:11和40。
本发明还涉及一种预防和/或治疗疾病的方法,其中,诱导一些细胞的凋亡对哺乳动物是有利的,就预防或治或疗(治疗或预防性)而言尤其对人是有利的。那些疾病尤其是癌症,特征是在上面定义中列出的那些疾病,自身免疫疾病、炎症症状、病毒传染或病毒性疾病中的一种。该方法包括给予哺乳动物,包括人类,有效量的本文公开和提供的组合物。该方法包括给予根据本发明的针对两种不同表位的两种多肽、优选抗体,或给予根据本发明的针对两种不同表位的双特异性多肽、优选抗体。这些组合物的实施方式通过使用根据的CDR定义来限定。但是,本发明还涵盖和涉及使用如上所示的序列的等价或可选的方法,其中,编号被编号或普通编号系统取代。因此,在上述方法的以下实施方式中,其它实施方式是本发明的一部分,其中,根据上表,一个实施方式使用编号取代了用编号定义的CDR。另外,在上述方法的以下实施方式中,其它实施方式是本发明的一部分,其中,根据上表,一个实施方式使用普通编号系统取代了用编号定义的CDR。
在第一实施方式中,上述方法包括给予包括多肽、优选抗体的组合物,该多肽优选抗体具有一种或两种结合结构域,该结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:13的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1,序列FAS的CDR2,序列SEQ ID NO:17的CDR3。在第二实施方式中,上述方法包括给予包括多肽、优选抗体的组合物,该多肽优选抗体具有一种或两种结合结构域,该结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:18的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ IDNO:19的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1,序列RTS的CDR2,序列SEQ ID NO:21的CDR3。在第三实施方式中,上述方法包括给予包括这两种多肽或抗体的混合物的组合物,或给予两种组合物,一种组合物含有提到的第一多肽或抗体,并且第二组合物包括提到的第二多肽或抗体。作为选择,本领域技术人员可以将上文对CDR的定义替换为如表1和表2中所述的根据或普通编号系统对CDR的定义。
在另一实施方式中,上述方法包括给予包括双特异性多肽、优选抗体的组合物,该双特异性多肽、优选抗体包括第一结合结构域和第二结合结构域;该第一结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:13的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:16的CDR1,序列FAS的CDR2,序列SEQ IDNO:17的CDR3;该第二结合结构域包括成对的VH链和VL链,其中,VH链含有序列SEQ ID NO:18的CDR1,序列SEQ ID NO:14的CDR2,序列SEQ IDNO:19的CDR3;并且,VL链含有序列SEQ ID NO:20的CDR1,序列RTS的CDR2,序列SEQ ID NO:21的CDR3。作为选择,本领域技术人员可以将上文对CDR的定义替换为如表1和表2中所述的根据或普通编号系统对CDR的定义。
在一个实施方式中,上述方法提供了给予组合物,该组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:2和4的抗DR5的多肽,优选抗体;包括氨基酸序列对SEQ ID NO:6和8的抗DR5的多肽,优选抗体;以及药学上的载剂、稀释剂或赋形剂。在另一实施方式中,上述方法提供了给予两种组合物,一种组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:2和4的抗DR5的多肽,优选抗体;并且另一种组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:6和8的抗DR5的多肽,优选抗体。在一个实施方式中,上述方法提供了组合物的给予,该组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:35和37的抗DR5的多肽,优选抗体;包括氨基酸序列对SEQ ID NO:39和41的抗DR5的多肽,优选抗体;以及药学上的载剂、稀释剂或赋形剂。在另一实施方式中,上述方法提供了给予两种组合物,一种组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:35和37的抗DR5的多肽,优选抗体;并且另一种组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:39和41的抗DR5的多肽,优选抗体。
在另一实施方式中,上述方法提供了组合物的给予,该组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:2和4,和氨基酸序列对SEQ ID NO:6和8的双特异性抗DR5的抗体;以及药学上可接受的载剂。在另一实施方式中,上述方法提供了组合物的给予,该组合物包括:包括氨基酸序列对SEQ ID NO:35和37,和氨基酸序列对SEQ ID NO:39和41的双特异性抗DR5的抗体;以及药学上可接受的载剂。
在另一实施方式中,上述方法提供了组合物的给予,该组合物包括本文公开和提供的DR5-01和DR5-05抗体,或通过如本文所述的基因工程产生的类似的抗体,DR5-01抗体基于核苷酸序列SEQ ID NO:9、3、11和1或SEQ ID NO:9、34、11和36,DR5-05抗体基于核苷酸序列SEQ ID NO:9、7、11和5或SEQ ID NO:9、38、11和40;可以应用包括这些抗体的组合物,这些抗体通过它们的氨基酸序列限定,并且DR5-01抗体包括SEQ ID NO:4、10、2和12并且DR5-05抗体包括SEQ ID NO:8、10、6和12,或者HzDR5-01抗体包括SEQID NO:35、10、37和12并且HzDR5-05抗体包括SEQ ID NO:39、10、41和12。
因此,药物组合物、应用和治疗方法用于本发明和/或治疗癌症。在定义中,给出了可以从本发明得到改善的癌症列表。
因此,药物组合物、应用和治疗方法还用于本发明和/或治疗自身免疫疾病和炎症病症。尤其涉及下面的疾病。
因此,药物组合物、应用和治疗方法还用于本发明和/或治疗病毒传染或病毒性疾病。病毒传染和疾病包括,但并不限于,巨细胞病毒、流感病毒、新城疫病毒、疾病病毒、水疱性口炎病毒、单纯性疱疹病毒、肝炎病毒、2型腺病毒、牛病毒性腹泻病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)和埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)引起的传染。
在具体的实施方式中,本发明的多肽、抗体或双特异性抗体还可用于特异性标记癌症细胞、实体肿瘤等,并且更普遍地,用于将任何缀合或用其它方式联接的效应物(例如放射性同位素、标签、细胞毒素、药物、脂质体、抗体、核酸、树状分子等)特异性靶定/递送至癌症细胞,癌症细胞包括但并不限于分离的癌症细胞、转移细胞、实体肿瘤细胞等。
因此,本发明的另一目的是根据本发明的多肽和分子的复合物,该分子是效应物分子,效应物分子的功能可以得益自通过上述多肽对DR5受体的靶定。这样的效应物分子可以是放射性同位素、标签、细胞毒素、药物、脂质体、抗体、核酸、树状分子。本发明还涉及药物组合物,该药物组合物含有该复合物和药学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。
本发明还涉及这样的组合物在预防或治疗癌症,诸如上面在定义中引用的那些癌症中的一种的应用以及方法。
本发明的一种多肽或多种多肽可以用于鉴定其它多肽或抗体,该其它多肽或抗体结合DR5-01和DR5-05针对的表位中的一种。因此,在某些实施方式中,针对一种表位的本发明的多肽或抗体可以用于与对DR5上的其它表位具有结合特异性的另一抗体配对。
本发明的一种多肽或多种多肽可以用于鉴定结合DR5上的另一表位的其它多肽或抗体,这些其它多肽或抗体在多肽或抗体结合在DR5上的这些不同表位上时,诱导凋亡。针对DR5-01和/或DR5-05。因此,在某些实施方式中,针对一种表位(DR5-01或DR5-05)的本发明的多肽或抗体,或者针对两种表位(DR5-01和DR5-05)的本发明的多肽或抗体可以与另一抗体一起使用,该另一抗体对DR5上的另一表位具有结合特异性。
本发明的一种或多种多肽、抗体、双特异性抗体和/或功能化的双特异性抗体和/或嵌合部分,或者含有这些组分的药物组合物可以通过注射给予,也就是说通过静脉内注射、肌肉内注射、皮内注射、皮下注射、十二指肠内注射或腹膜内注射给予。另外,在某些实施方式中,化合物可以通过吸入,例如通过鼻内吸收给予。也可以利用其它药物递送系统,例如脂质体。
使用本发明的多肽或抗体来靶定DR5与现存的化学治疗组合将比仅用化学治疗更有效地杀死肿瘤细胞。在癌症的化学治疗中已经利用了各种各样的药物。实例包括,但并不限于,顺铂、他克唑(taxol)、依托泊苷、米托蒽醌、放线菌素D、喜树碱(campthotecin)、甲氨蝶呤、吉西他滨、丝裂霉素、达卡巴嗪、5-氟尿嘧啶、阿霉素和道诺霉素。
在一种途径中,将抗体组合或双特异性抗体抗DR5MAb添加到标准的化学治疗方案中,以治疗癌症患者。对于这些组合(其中的抗体和额外的抗癌试剂发挥对癌症细胞的协同效果),与第二试剂仅单独给予时的标准剂量相比,可以降低额外的试剂的剂量。抗体可与一定量的抗癌药物一同给予,该抗癌药物有效增强癌症细胞对抗体组合或双特异性抗体的敏感性。
在本发明的一种方法中,在给予第二抗癌试剂之前,给予患者抗体组合或双特异性抗体以靶定DR5。一种可选择的方法包括,在以可选择的时间表给予抗体组合或双特异性抗体和第二试剂之前,给予第二抗癌试剂。在另一实施方式中,同时给予抗体组合或双特异性抗体和第二试剂。
本发明的方法可以提供在治疗方案中的包含物,涉及至少一种其它治疗方法的应用,诸如辐射、使用小分子或抗体的化学治疗。本发明的方法可以直接包括给予有效量的针对另一靶点的至少一种额外的多肽或抗体,和/或至少一种化学治疗药物(诸如小分子),用于将本发明的多肽或抗体同时、独立或顺序地给予哺乳动物,包括人类。作为额外的活性成分,可以引用阿霉素、吉西他滨、喜树碱、紫杉醇或上面提到的其它药物。在一个实施方式中,使用这样的组合治疗肺癌和乳癌。更一般地,该组合物对癌症(尤其是侵袭性癌症)是有用的,该癌症对单独使用药物或单独使用本发明的多种抗体/抗体的治疗响应不良,并且,上述组合对癌症产生协同效果。
在本发明的一种方法中,在治疗病毒性传染及由病毒性传染引起的相关病症时,可以利用抗体组合或双特异性抗体或多价抗体片段靶定DR5。病毒传染包括,但并不限于,巨细胞病毒、流感病毒、新城疫病毒、疾病病毒、水疱性口炎病毒、单纯性疱疹病毒、肝炎病毒、2型腺病毒、牛病毒性腹泻病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)和埃-巴二氏病毒引起的传染。
哺乳动物细胞是用于产生治疗糖蛋白的优选宿主,因为它们以用于人类应用的最相容形式具有使蛋白糖基化的能力。细菌很少使蛋白糖基化,并且像其它类型的常见宿主(诸如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞)那样,产生与从血流中快速清除相关的糖基化模式。
在哺乳动物细胞中,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是最常用的。除了呈现适当的糖基化模式之外,这些细胞还允许一致地生成遗传稳定的、高产的克隆细胞系。能够在简单的生物反应器中,使用无血清的培养基将它们培养至高密度,并且使开发安全且可重复的生物工艺成为可能。其它经常使用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞、NSO-小鼠骨髓瘤细胞和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。
在一个实施方式中,根据本发明的多肽和抗体在哺乳动物细胞,优选野生型哺乳动物细胞,优选啮齿目动物起源的哺乳动物细胞,特别是CHO细胞中产生或表达。
可以在本发明的多肽结构中进行修改和变化,并且仍然获得具有类似特征的分子。例如,序列中的某些氨基酸可以被取代为其它氨基酸,而不会有活性的明显损失。因为是多肽相互作用的能力和性质限定了多肽的生物功能活性,所以可以在多肽序列(或者,当然它的潜在的DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列取代,并且仍然获得具有类似特性的多肽。
在进行这样的改变时,可以考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathic index)。氨基酸的亲水性指数在赋予多肽相互作用的生物功能中的重要性在本领域中是普遍理解的。已知,某些氨基酸可以被取代为具有类似亲水性指数或得分的其它氨基酸,并且仍然产生具有类似生物活性的多肽。每一种氨基酸在它的疏水性和电荷特征的基础上都具有指定的亲水性指数。
人们相信,氨基酸的相对亲水特性决定了所得多肽的二级结构,该二级结构反过来限定了多肽与其它分子,例如酶、底物、受体、抗体、抗原等的相互作用。在本领域中,已知氨基酸可以被具有类似亲水性指数的另一氨基酸取代,并且仍然获得生物功能等价的多肽。在这样的改变中,优选亲水性指数在±2内的氨基酸的取代,尤其优选亲水性指数在±1内的氨基酸的取代,甚至更尤其优选亲水性指数在±0.5内的氨基酸的取代。
在亲水性的基础上,还可以进行相似的氨基酸的取代,尤其当由此产生的生物功能等价的肽或多肽用于免疫实施方式中时。U.S.专利4,554,101指出多肽(如通过它临近的氨基酸的亲水性控制的)的最大局部平均亲水性与它的免疫原性和抗原性相关,即与多肽的生物特性相关,U.S.专利4,554,101通过引用并入本文中或者本领域技术人员可以参考该专利。
如在U.S.专利4,554,101中详细描述的,已经为氨基酸残基指定了以下亲水性值:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸盐(+3.0±1);谷氨酸盐(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);脯氨酸(-0.5±1);苏氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。应理解的是,氨基酸可以被取代为另一具有类似亲水性值的氨基酸,并且仍然获得生物等价的多肽,特别是免疫等价的多肽。在这样的改变中,优选亲水性指数在±2内的氨基酸的取代,尤其优选亲水性指数在±1内的氨基酸的取代,甚至更尤其优选亲水性指数在±0.5内的氨基酸的取代。
如前所述,氨基酸取代因此通常是基于氨基酸侧链取代基的相对类似性,例如,它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。
表5
可以不同地挑选或选择氨基酸取代。可能的取代已经记载在WO99/51642、WO2007024249和WO2007106707。
根据定义,本发明的CDR包括缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的变体CDR,该变体保持初始CDR的特异性。普通编号系统规定了具有最短的氨基酸序列的CDR定义或最小的CDR定义。
抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人类的抗体、双特异性抗体、抗体药物缀合物或抗体片段。“人源化抗体”或“嵌合的人源化抗体”应指来源于非人类抗体的抗体,典型地指鼠源抗体,其保留或基本保留了亲本抗体的抗原结合特性,但是在人类中具有较低的免疫原性。
用于生产多肽和抗体的方法对于本领域技术人员来说是已知的。哺乳动物,优选啮齿目动物细胞诸如CHO细胞,优选野生型细胞经一种或几种表达载体转染。优选地,细胞经轻链的表达载体和重链的表达载体共转染。
细胞转染对于本领域技术人员来说也是已知的。作为可以进行的转染,技术人员在没有限制的情况下可以提及本领域技术人员公知的标准的转染程序,诸如磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、磁转染、核转染(AMAXAGmbh,GE)、脂质体介导的转染(例如使用或技术)或显微注射。
表达载体是已知的。作为可以使用的载体,技术人员可以在没有限制的情况下提及:pcDNA3.3、pOptiVEC、pFUSE、pMCMVHE、pMONO、pSPORT1、pcDV1、pcDNA3、pcDNA1、pRc/CMV、pSEC。技术人员可以使用表达多肽或抗体的不同部分的单种表达载体或几种表达载体。
CH1、铰链区、CH2和CH3的表达载体包括SEQ ID NO:9,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:10的核酸序列。
表达载体含有编码本发明的可变区VH的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:3,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:4的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:7,或者包括编码氨基酸序列SEQ IDNO:8的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:34,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:35的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ IDNO:38,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:39的核酸序列。
一组编码重链的表达载体包括如下表达载体,该表达载体包括SEQ ID NO:9(或包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:10的核酸序列),以及SEQ ID NO:3(或编码氨基酸序列SEQ ID NO:4的核酸序列)或SEQ ID NO:7(或编码氨基酸序列SEQ ID NO:8的核酸序列)。一组编码重链的表达载体包括如下表达载体,该表达载体包括SEQ ID NO:9(或包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:10的核酸序列),以及SEQ ID NO:34(或编码氨基酸序列SEQ ID NO:35的核酸序列)或SEQ ID NO:38(或编码氨基酸序列SEQ ID NO:39的核酸序列)。
单个重链表达载体含有编码VH、CH1、铰链区、CH2、CH3的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:3和9,或者包括编码氨基酸序列SEQID NO:4和10的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:7和9,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:8和10的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:34和9,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:35和10的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:38和9,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:39和10的核酸序列。
恒定轻链的表达载体包括SEQ ID NO:11,或者包括编码氨基酸序列SEQID NO:12的核酸序列。
表达载体含有编码本发明的可变区VL的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:1,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:5,或者包括编码氨基酸序列SEQ IDNO:6的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:36,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:37的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ IDNO:40,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:41的核酸序列。
表达载体含有编码本发明的轻链的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:1和11,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:2和12的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:5和11,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:6和12的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:36和11,或者包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:37和12的核酸序列。在一个实施方式中,载体包括SEQ ID NO:40和11,或者包括编码氨基酸序列SEQ IDNO:41和12的核酸序列。
用于生产完整抗体的表达载体包括几种载体,例如包括两种或三种载体。
还可以使用单种表达载体,该单种表达载体包括SEQ ID NO:3、9、1和11(或编码氨基酸序列SEQ ID NO:4、10、2和12的核酸序列),或者包括SEQID NO:7、9、5和11(或编码氨基酸序列SEQ ID NO:8、10、6和12的核酸序列)。还可以使用单种表达载体,该单种表达载体包括SEQ ID NO:34、9、36和11(或编码氨基酸序列SEQ ID NO:35、10、37和12的核酸序列),或者包括SEQ ID NO:38、9、40和11(或编码氨基酸序列SEQ ID NO:39、10、41和12的核酸序列)。
表达载体包括核酸序列或编码希望的可变区的核酸序列。下面示出了可以通过载体表达的可变区的各种实施方式。这些载体的实施方式通过使用根据的CDR定义来限定。但是,本发明还涵盖和涉及使用如上所示的序列的等价或可选的载体,其中,编号被编号或普通编号系统取代。因此,在载体的以下实施方式中,其它实施方式是本发明的一部分,其中,根据上表,一个实施方式使用编号取代了用编号定义的CDR。另外,在载体的以下实施方式中,其它实施方式是本发明的一部分,其中,根据上表,一个实施方式使用普通编号系统取代了用编号定义的CDR。
表达载体编码VH,该VH包括序列SEQ ID NO:13的CDR1、序列SEQ IDNO:14CDR1的CDR2、序列SEQ ID NO:15的CDR3。
表达载体编码VL,该VL包括序列SEQ ID NO:16的CDR1、序列FAS的CDR2、序列SEQ ID NO:17的CDR3。
一组表达载体包括编码VH的表达载体和编码VL的表达载体,该VH包括序列SEQ ID NO:13的CDR1、序列SEQ ID NO:14的CDR2、序列SEQ ID NO:15的CDR3;并且,该VL包括序列SEQ ID NO:16的CDR1、序列FAS的CDR2、序列SEQ ID NO:17的CDR3。
表达载体包括编码VH的核酸序列和编码VL的核酸序列,该VH包括序列SEQ ID NO:13的CDR1、序列SEQ ID NO:14CDR1的CDR2、序列SEQ IDNO:15的CDR3;并且,该VL包括序列SEQ ID NO:16的CDR1、序列FAS的CDR2、序列SEQ ID NO:17的CDR3。
表达载体编码VH,该VH包括序列SEQ ID NO:18的CDR1、序列SEQ IDNO:14的CDR2、序列SEQ ID NO:19的CDR3。
表达载体编码VL,该VL包括序列SEQ ID NO:20的CDR1、序列RTS的CDR2、序列SEQ ID NO:21的CDR3。
一组表达载体包括编码VH的表达载体和编码VL的表达载体,该VH包括序列SEQ ID NO:18的CDR1、序列SEQ ID NO:14的CDR2、序列SEQ ID NO:19的CDR3;并且,该VL包括序列SEQ ID NO:20的CDR1、序列RTS的CDR2、序列SEQ ID NO:21的CDR3。
表达载体包括编码VH的核酸序列和编码VL的核酸序列,该VH包括序列SEQ ID NO:18的CDR1、序列SEQ ID NO:14的CDR2、序列SEQ ID NO:19的CDR3;并且,该VL包括序列SEQ ID NO:20的CDR1、序列RTS的CDR2、序列SEQ ID NO:21的CDR3。
因此,本发明包括单一载体或一组载体在生产本发明的多肽或抗体中的应用。这些载体单独或作为一组载体也是本发明的目标。
本发明的另一目标是含有本发明的载体或一组载体的宿主细胞。宿主细胞可以哺乳动物的细胞,优选啮齿目动物细胞,更优选CHO细胞。还更优选地,宿主细胞可以是野生型哺乳动物细胞,优选野生型啮齿目动物细胞,最优选野生型CHO细胞。
本领域技术人员完全拥有使用这样的一种载体或多种载体和诸如CHO细胞的细胞来生成根据本发明的抗体的方法。
附图说明
现在,将通过参照附图的实例的方式进一步详细地描述本发明。应注意,除了当图例置于方框中时,在图中的图例中示出的方块之外,在框图中,方块以相同的顺序从左至右显示。
图1示出在人神经胶质瘤细胞系(H4、HS683、A172、T98G、U87MG)中的抗DR5抗体组的FACS分析。
图2示出在一些癌症细胞系,诸如人肾腺癌(A704、ACHN、Caki1)、人结肠癌(SW948、HCT 116)、人膀胱癌(5637)和人乳腺癌(MCF7)中的抗DR5表达的FACS分析。
图3是示出ELISA测定结果的图表,该ELISA测定评价MAb(1μg/mL)与Fas(50ng/mL)、FasL(100ng/mL)、TRAIL(100ng/mL)的结合,及MAb(1μg/mL)与DR4、DR5、DcR1或DcR2(50ng/mL)的结合,(平均值+/-SD,n=2)。
图4是柱状图,示出使用T98G细胞(1.106个细胞/mL),在其它未缀合的抗体抗DR5(5μg/mL)的存在下,生物素标记的抗DR5对MAb结合(1μg/mL,FACS分析)的抑制百分比(%),(平均值+/-SD,n=2)。
图5是柱状图,示出使用H4细胞(5.105个细胞/mL)在不同浓度下测试,在抗体(抗TRAIL的MAb,MAb抗DR5的MAb)的存在下,TRAIL结合(100ng/mL,FACS分析)的抑制百分比(%),(平均值+/-SD,n=2)。
图6是柱状图,示出使用H4细胞(5.104个细胞/mL),与TRAIL(10ng/mL)相比,在1μg/mL时测试单独或组合的抗DR5的抗体,对细胞增殖抑制(ATP生物发光的生物测定,72小时)的百分比(%)。
图7是柱状图,示出使用H4细胞(5.104个细胞/mL),在不同浓度下测试,选择性抗DR5的激动性抗体组合(mDR5-01+mDR5-05)对中性抗体组合(mDR5-05+mDR5-04),对细胞增殖抑制(BrDU生物测定,72小时)的百分比(%),(平均值+/-SD,n=2)。
图8是柱状图,示出使用H4细胞(1.105个细胞/mL),还与TRAIL(10ng/mL)相比,在1μg/mL时测试选择性抗DR5的激动性抗体组合(mDR5-01+mDR5-05)对中性抗体组合(mDR5-05+mDR5-04)的凋亡(碘化丙啶染色,72小时)百分比(%),(平均值+/-SD,n=2)。
图9是柱状图,示出使用H4细胞(1.105个细胞/mL),还与TRAIL相比,选择性抗DR5的激动性抗体组合(mDR5-01+mDR5-05)对中性抗体组合(mDR5-05+mDR5-04)的被剪切的半胱天冬酶(caspase)3(FACS分析,48小时)的百分比(%),(代表性实验,n=2)。
图10是western(蛋白)印记,示出使用H4细胞(2.105个细胞/mL,5小时),选择性抗DR5的激动性抗体组合(mDR5-01+mDR5-05)对中性抗体组合(mDR5-05+mDR5-04)诱导或不诱导被剪切的PARP。
图11是柱状图,示出使用H4细胞(5.104个细胞/mL),在存在或不存在抗DR5的MAb(mDR5-01、mDR5-02、mDR5-04或mDR5-05,1μg/mL)的情况下,选择性抗DR5的激动性抗体组合(10μg/mL mDR5-05+0.1μg/mLmDR5-01)对细胞增殖抑制(ATP生物发光的生物测定,72小时)的百分比,(平均值+/-SD,n=2)。
图12是柱状图,示出使用H4、HS683、A172、T98G或U87MG神经胶质瘤细胞(5.104个细胞/mL),与TRAIL(20ng/mL)相比,选择性抗DR5的激动性抗体组合(10μg/mL mDR5-05+0.1μg/mL mDR5-01),并且然后以1/2稀释,并且然后以1/2稀释,对细胞增殖抑制(ATP生物发光的生物测定,72小时)的百分比,(平均值+/-SD,n=2)。
图13是柱状图,示出使用神经胶质瘤细胞H4(5.104个细胞/mL),以5μg/mL然后稀释1/2进行单独测试的嵌合抗体(chDR5-01或chDR5-05的MAb)对抗体组合(5μg/mL chDR5-05+0.05μg/mL chDR5-01)(然后稀释1/2)对增殖抑制(ATP生物发光的生物测定,72小时)的百分比,(平均值+/-SD,n=2)。
图14是柱状图,示出使用离体人神经胶质瘤细胞(5.104个细胞/mL),与TRAIL(50ng/mL)相比,在10μg/mL时测试单独或组合的抗DR5的抗体,对细胞增殖抑制(ATP生物发光的生物测定,72小时)的百分比(%),(平均值+/-SD,n=3来自三批独立的离体GBM细胞)。
图15~图18是柱状物,示出使用HS683、A172、42MGBA或T98G神经胶质瘤细胞,在组合的小鼠抗DR5抗体(10μg/mL以1/10稀释测试)的存在下,在仅药物(1μg/mL以1/10稀释)的存在下,或与组合的小鼠抗DR5抗体和药物联合,对细胞增殖抑制(ATP生物发光的生物测定,72小时)的百分比(%),(平均值+/-SD,n=2)。
图19~图22是柱状图,示出使用人乳细胞系(MCF7、MDAMB231)或人肺腺癌细胞系(NCIH1703、A549)(5.104个细胞/mL),在组合的小鼠抗DR5抗体(10μg/mL以1/10稀释测试)的存在下,在仅药物(1μg/mL以1/10稀释)的存在下,或与组合的小鼠抗DR5抗体和药物联合,对细胞增殖抑制(ATP生物发光的生物测定,72小时)的百分比(%),(平均值+/-SD,n=2)。
图23是柱状图,示出使用H4神经胶质瘤细胞(5.104个细胞/mL),与单独的或组合的人抗DR5抗体相比,在1μg/mL(以1/1组合)时测试单独或组合的小鼠抗DR5抗体,对细胞增殖抑制(ATP生物发光的生物测定,72小时)的百分比(%),(平均值+/-SD,n=2)。
图24是经SC2人神经胶质瘤原位移植的裸鼠的存活曲线,该SC2人神经胶质瘤经过或未经组合的小鼠抗DR5抗体处理。通过以每只小鼠5mg/kg腹膜内注射(IP)给予MAb治疗,直至小鼠因为体重下降而实施安乐死,并且在最多36天的时间内实施MAb治疗。使用Kaplan-Meier法(生存率估计的乘积限法)和Wilcoxon(威斯康星)统计学检验(JMP软件),将对照组获得的存活时间与治疗组(mDR5-01+mDR5-05对mDR5-04+mDR5-05)获得的存活时间进行对比。
图25是VH HzDR5-01的氨基酸和核酸序列,描述了根据限定的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3。
图26是VL HzDR5-01的氨基酸和核酸序列,描述了根据限定的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3。
图27是VH HzDR5-05的氨基酸和核酸序列,描述了根据限定的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3。
图28是VL HzDR5-05的氨基酸和核酸序列,描述了根据限定的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3。
实例
提供以下实例用于例示要保护的发明,而不是用于限制要保护的发明。
实例1:鼠源抗DR5的MAb的制备
该实例例示了分泌抗DR5的抗体的杂交瘤细胞系的制备。
抗体。使用标准的杂交瘤技术(Zola等人,Aust J.Exp Biol Med Sci.1981;59:303-6)产生抗DR5的抗体、对DR5特异性的鼠源单克隆抗体。简单来说,在第0、2和4周对小鼠i.p.注射重组的DR5(10μg)(R&D Systems公司,里尔,法国)。然后i.v.注射重组的DR5(10μg),并且脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653融合。通过ELISA,并且通过对DR5阳性细胞系进行流式细胞术,筛选杂交瘤上清液的DR5结合。获得鼠源抗DR5的MAb组,标注为mDR5-01、mDR5-02、mDR5-04和mDR5-05。
实例2:细胞培养
各种肿瘤来源的细胞系包括在靶细胞之中,该靶细胞可以在这样的测定程序中与单独的TRAIL抗DR5的MAb、MAb组合接触。
细胞系。已建立的人神经胶质瘤细胞H4、HS683或A172(可购自ATCC),且已建立的人肺腺癌细胞A549生长在杜氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium)(Sigma(西格玛),伊泽尔省(St Quentin Fallavier),法国)中,该杜氏改良伊格尔氏培养基补充有10%热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma,伊泽尔省,法国)、4nM L-谷氨酰胺(Sigma,伊泽尔省,法国)和100U/mL、100μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma,伊泽尔省,法国)。已建立的人神经胶母细胞瘤星形细胞瘤细胞U87MG或T98G、人肾腺癌细胞A704、人肾腺癌细胞A704、人肾腺癌细胞ACHN和人乳腺癌细胞MCF7(可购自ATCC)生长在伊格尔氏最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium)(Sigma,伊泽尔省,法国)中,该伊格尔氏最低必需培养基补充有10%热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma,伊泽尔省,法国)、4nM L-谷氨酰胺(Sigma,伊泽尔省,法国)和100U/mL、100μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma,伊泽尔省,法国)。已建立的人结肠腺癌细胞SW948和人乳腺癌细胞MDAMB231(可购自ATCC)生长在Leibovitz’s L-15(Sigma,伊泽尔省,法国)中,该Leibovitz’s L-15补充有10%热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma,伊泽尔省,法国)、4nM L-谷氨酰胺(Sigma,伊泽尔省,法国)和100U/mL、100μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma,伊泽尔省,法国)。已建立的人肾癌细胞Caki-1和人结直肠癌细胞HCT-116(可购自ATCC)生长在改性的McCoy’s 5A培养基(Sigma,伊泽尔省,法国)中,该改性的McCoy’s 5A培养基补充有10%热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma,伊泽尔省,法国)、4nM L-谷氨酰胺(Sigma,伊泽尔省,法国)和100U/mL、100μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma,伊泽尔省,法国)。已建立的人膀胱癌细胞5637和已建立的人肺腺癌细胞NCIH1703(可购自ATCC)生长在RPMI-1640培养基(Sigma,伊泽尔省,法国)中,该RPMI-1640培养基补充有10%热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma,伊泽尔省,法国)、4nM L-谷氨酰胺(Sigma,伊泽尔省,法国)和100U/mL、100μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma,伊泽尔省,法国)。已建立的人神经胶质瘤细胞42MGBA(可购自DSMZ)生长在以1:1混合的RPMI-1640培养基和伊格尔氏最低必需培养基(Sigma,伊泽尔省,法国)占80%的混合物中,该混合物补充有20%热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma,伊泽尔省,法国)、4nM L-谷氨酰胺(Sigma,伊泽尔省,法国)和100U/mL、100μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma,伊泽尔省,法国)。
实例3:抗体结合测定(FCM,ELISA)
该实例描述了如下的方法:通过具有包被的抗原的ELISA,确定特异性抗DR5的MAb;研究细胞表面上的DR5细胞表达;以及,在通过流式细胞术分析,确定遵照MAb竞争的表位。
用于DR5细胞表达的流式细胞术实验。简单来讲,2.105个细胞/96孔与10μg/mL未缀合的抗DR5的MAb以1/10稀释的稀释液一起孵育。使用补充有1%牛血清白蛋白(Sigma,伊泽尔省,法国)的PBS(Invitrogen(英俊公司),Villebonsur Yvette((维勒邦叙尔伊沃特),法国)洗掉未结合的抗体。然后,离心细胞(400g时5分钟),并且使用异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的羊(Fab’)2多克隆抗小鼠(MP Biomedical,Illkirch(伊尔基希),法国)在4℃检测结合的抗体30min。洗掉检测试剂,并且离心细胞(400g时5min),并将细胞重悬在300μLPBS中。在FACSCAN(BD Biosciences,Rungis(瀚吉斯),法国)(FL1通道,每次采集2000个事件)上,对结合的检测抗体进行定量。在实验过程中,包括各自的同型对照,以排除任何非特异性结合事件。
实验结果示于图1(以10μg/mL)中,图2和表6(以5μg/mL)作为实例示出了使用浓度或者为5μg/mL的MAb染色的细胞。各种癌细胞系表达不同的TRAIL受体亚单位。各细胞系之间的表达模式不同。在本研究中,DR5表达在所有测试的细胞系上。无论测试什么样抗DR5的MAb(mDR5-01、mDR5-02、mDR5-04或mDR5-05),都观察到类似的细胞模式。
表6示出了在其它实体肿瘤细胞系(1.106个细胞/mL),即人乳腺癌细胞系(MCF7、MDAMB231)中,和在人肺腺癌细胞系(NCIH1703、A549)上,使用5μg/mL的抗DR5抗体进行的DR5表达的FACS分析。
表6
通过使用包被抗原的ELISA进行的MAb特异性分析。在具有包被的Fas(50ng/mL)(R&D Systems,里尔,法国)、FasL(100ng/mL)(Tebu-bio,Le Perray en Yvelines,法国)、TRAIL(100ng/mL)(R&D Systems,里尔,法国)、DR4(50ng/mL)(R&D Systems,Lille,法国)、DR5(50ng/mL)(R&DSystems,里尔,法国)、DcR1(50ng/mL)(R&D Systems,里尔,法国)或DcR2(50ng/mL)(R&D Systems,里尔,法国)抗原的ELISA中,评价抗体的特异性结合特性。以1μg/mL测试抗DR5的MAb组,并且通过使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的羊多克隆抗小鼠IgG1(AbD Serotec,Colmar)(科尔马),法国)使抗DR5的MAb组显示出来。
实验结果示于图3中。mDR5-01、mDR5-02、mDR5-04和mDR5-05抗体(1μg/mL)仅与DR5包被的抗原(50ng/mL)反应。使用其它的凋亡相关的抗原(FAS、FASL,TRAIL,DR4,DcR1,DcR2)没有观察到反应性(2次独立实验的平均值+/-SD)。
用于MAb竞争结合的流式细胞术实验。简单来讲,每96孔2.105个T98G细胞,作为参照与生物素化的鼠源抗DR5抗体的稀释液(10μg/mL,然后以1/10稀释)一起孵育,并且在有或没有未缀合的抗体(5μg/mL)存在下,与生物素化的鼠源抗DR5抗体的稀释液(10μg/mL,然后以1/10稀释)一起孵育,并且在4℃孵育30min。仅示出了使用1μg/mL的生物素化的抗体获得的数据。使用补充有1%牛血清白蛋白(Sigma,伊泽尔省,法国)的PBS(Invitrogen(英俊公司),Villebon sur Yvette((维勒邦叙尔伊沃特),法国)洗掉未结合的抗体。然后,离心细胞(400g时5min),并且使用藻红蛋白缀合的链酶亲和素(Interchim,(蒙吕松),法国)检测(4℃,30min)结合的抗体。洗掉检测试剂,并且离心细胞(400g时5min),并将细胞重悬在300μL PBS中。在FACSCAN(BD Biosciences,Rungis(瀚吉斯),法国)(FL2通道,每次采集2000个事件)上,对结合检测抗体进行定量。在实验过程中,包括各自的同型对照,以排除任何非特异性结合事件。
实验结果示于图4中。例如,未缀合的mDR5-02和mDR5-05抗体(5μg/mL)不与生物素化的mDR5-01抗体(1μg/mL)竞争。相比之下,未缀合的mDR5-01和mDR5-04抗体与生物素化的mDR5-01抗体竞争。因此,表位DR5-01和DR5-04是共有或相邻的,而表位DR5-02和DR5-05是两个独立的表位。此外,表位DR5-01也与表位DR5-05不同(两次独立实验的平均值+/-SD)。
实例3:体外生物MAb活性
该实例例示了如下方法:评价抗DR5的MAb对TRAIL细胞结合它们的能力,以引发对癌症细胞的细胞毒性效果的影响。使用许多适当的测定法中的任何方法,可以测定这些组分的抗肿瘤活性,其中适当的测定法包括但并不限于用于测定体外减缓肿瘤生长或杀死癌症细胞的能力的方法。各种肿瘤来源的细胞系包括在靶细胞之中,该靶细胞可以在这样的测定程序中与MAb组合接触。
为了鉴定或选择诱导凋亡的抗DR5抗体的组合,评定相对于对照(未经处理的细胞),并且与重组的TRAIL相比的膜完整性丧失(图8),其中通过例如PI指示膜完整性丧失。通过ATP或BrDU量化,评定减缓肿瘤生长的能力(图6,图7)。通过剪切的caspase 3(图9)或剪切的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)(图10)的量化,评定凋亡反应。
生物化学试剂。用于凋亡研究的生物试剂是:碘化丙啶(PI)(Sigma,伊泽尔省,法国)、Caspase 3抗体(Ozyme,Saint Quentin Yvelines(圣康坦伊夫林),法国)、细胞增殖ELISA-BrdU(Roche Diagnostics(罗氏诊断),Meylan(梅朗),法国)、Cell Titer(细胞滴度)GLo-ATP(Promega,Charbonnières-les-bains,法国)和抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的多克隆体(罗氏诊断,梅朗,法国)。
MAb对TRAIL结合的影响的流式细胞术实验。以每96孔1.105的密度接种H4细胞系。细胞与抗TRAIL或抗DR5(mDR5-01、mDR5-02、mDR5-3、mDR5-4)的MAb一起在4℃孵育30min,MAb以1μg/mL然后以1/10稀释进行测试。使用补充有1%牛血清白蛋白(Sigma,伊泽尔省,法国)的PBS(Invitrogen(英俊公司),Villebon sur Yvette(维勒邦叙尔伊沃特),法国)洗掉未结合的抗体。然后,细胞与重组的TRAIL(100ng/mL)(R&D Systems,里尔,法国)在4℃孵育30min。使用补充有1%牛血清白蛋白(Sigma,伊泽尔省,法国)的PBS(Invitrogen(英俊公司),Villebon sur Yvette(维勒邦叙尔伊沃特),法国)洗掉未结合的抗体。使用生物素化的缀合的抗TRAIL的MAb B-S23(iDDbiotech,达迪利,法国),检测结合的重组的TRAIL。清洗之后,在4℃添加藻红蛋白缀合的链酶亲和素(Interchim,蒙吕松,法国)30min。洗掉检测试剂,并且离心细胞(400g时5min),并将细胞重悬在300μL PBS中。在FACSCAN(BD Biosciences,Rungis(瀚吉斯),法国)(FL2通道,每次采集000个事件)上,对结合的检测抗体进行定量。在实验过程中,包括各自的同型对照,以排除任何非特异性结合事件。
使用在细胞表面表达DR5的人H4,以确定四种抗DR5抗体(指mDR5-01、mDR5-02、mDR5-04和mDR5-05)的激动剂或拮抗剂活性。实验结果示于图5中。使用拮抗剂抗TRAIL的MAb B-T24(iDD biotech,Dardilly(达迪利),法国),抑制重组的TRAIL在细胞表面的结合。在测试的抗DR5的MAb组中,MAb mDR5-01、mDR5-04和mDR-5-05抑制重组的TRAIL的结合,而没有任何mDR5-02的MAb的影响。
在ATP水平确定之后的细胞活力分析。使用冷光细胞活力检测(Promega,Charbonnières les Bains,法国),以基于存在的ATP量化(新陈代谢活跃的细胞的指示物)确定培养物中的存活细胞的数量。检测基于:使用荧光素酶反应以测量来自存活细胞的ATP的量。在膜完整性丧失的几分钟之内,细胞丧失合成ATP的能力,并且内源ATP酶破坏了所有剩余的ATP。因此,ATP水平陡然下降。细胞培养物(5.104个细胞/mL)单独,或与单独的抗DR5的MAb(1μg/mL),或与两种组合的MAb(每种MAb都为1μg/mL)一起孵育72小时(图6)。使用的TRAIL配体浓度为10ng/mL。以50μL试剂比200μL培养基的比率,将试剂直接添加到培养的细胞中。测定板在室温孵育10min,并且使用标准的多孔荧光计Mithras LB940(Berthold,Thoiry(图瓦里),法国)记录生物发光信号。
确定四种抗DR5抗体的激动剂活性的实验结果示于图6中。测试的单独的抗DR5的MAb都不能在H4细胞中诱导细胞毒性。相比之下,仅抗DR5的MAb组合mDR5-01和mDR5-05在H4细胞中引发凋亡。该受限的抗DR5的MAb组合(1/10)的能力与MAb染色水平(图1)无关。有趣的是,MAb mDR5-01和mDR5-05识别两种不同的表位(图4)。但是,mDR5-05与其它mDR5的MAb(诸如mDR5-02)的也识别不同表位的MAb组合不能引发H4凋亡(图6)。
在BrDU掺入确定之后的细胞活力分析。H4靶细胞(5.104个细胞/mL)与不同的MAb浓度范围的MAb组合mDR5-05和mDR5-01,或与MAb组合mDR5-05和mDR5-04一起培养。使用细胞增殖ELISA-BrdU(Roche Diagnostics,Meylan(梅郎),法国),根据制造商的说明书确定细胞生长。该方法基于:嘧啶类似物BrdU,而不是胸苷掺入增殖细胞的DNA中。在它掺入DNA之后,使用抗BrdU的MAb检测BrdU。在终止显露之后,使用标准的多孔荧光计Mithras LB940(Berthold,Thoiry(图瓦里),法国)记录生物发光信号。
实验结果示于图7中。如通过BrDU定量所证明的,特异性的MAb组合mDR5-01和mDR5-05协同性地在H4细胞系中诱导凋亡(两次独立实验的平均值+/-SD)。使用MAb组合mDR5-05和mDR5-04,没有观察到显著性影响。
通过流式细胞术测量碘化丙啶的摄入,用于测量MAb诱导的凋亡。以每96孔2.104的密度接种H4细胞系。在存在或不存在抗DR5的MAb的情况下,孵育细胞3天的时间。单独测试1μg/mL的每一种抗DR5的MAb,或者在测试1μg/mL的MAb组合之后再单独测试1μg/mL的每一种抗DR5的MAb(图8)。使用的TRAIL配体浓度为10ng/mL。然后,在4℃,2000rpm离心细胞5min,将细胞团重悬在70%的乙醇(Sigma,伊泽尔省,法国)中以使细胞具有渗透性。在新的离心之后,细胞与每孔100μL PI(100μg/mL)和100μL Rnase(核糖核酸酶)(100μg/mL)(Sigma,伊泽尔省,法国)一起孵育15min。离心细胞(2000rpm,5min),并且重悬在300μL PBS中。在FACSCAN(BDBiosciences,Rungis(瀚吉斯),法国)(FL2通道,每次采集3000个事件)上,对结合的检测抗体进行定量。
实验结果示于图8中。然而,如通过PI摄入所证明的,单独测试的MAb没有获得PCD,特异性的MAb组合mDR5-01和mDR5-05协同性地在H4细胞系中诱导凋亡(两次独立实验的平均值+/-SD)。不需要MAb交联。使用MAb组合mDR5-05和mDR5-04,没有获得PCD。
通过流式细胞术量化剪切的caspase-3,用于测量MAb诱导的凋亡。以每96孔2.104的密度接种H4细胞系。在存在或不存在抗DR5的MAb的情况下,孵育细胞48小时。单独或在MAb组合(1μg/mL mDR5-05,与0.01μg/mLmDR5-01或mDR5-04)的存在下,测试每一种抗体DR5的MAb(图9)。使用的TRAIL配体浓度为10ng/mL。然后,在4℃,2000rpm离心细胞5min,将细胞团重悬在90%的乙醇(Sigma,伊泽尔省,法国)中以使细胞具有渗透性。然后,在4℃,2000rpm离心细胞5min,并且细胞在4℃与alexa fluor 488缀合的MAb抗有活性的caspase-3抗体(Ozyme,Saint Quentin Yvelines(圣康坦伊夫林),法国)一起孵育30min。离心细胞(2000rpm,5min),并且重悬在300μLPBS中。在FACSCAN(BD Biosciences,Rungis(瀚吉斯),法国)(FL2通道,每次采集3000个事件)上,对结合的检测抗体进行定量。
当凋亡被激活时,caspase剪切多个蛋白底物,这些蛋白底物导致细胞结构和功能的丧失,并且最终引起细胞死亡。在凋亡中尤其涉及caspase-8、caspase-9和caspase-3:caspase-9处于线粒体通路中,caspase-8处于Fas/CD95通路中,并且caspase-3处于更下游,由多个通路活化。如通过剪切的caspase-3定量所证明的,特异性的MAb组合mDR5-01和mDR5-05协同性地在H4细胞系中诱导凋亡(两次独立实验的平均值+/-SD)。如与TRAIL(也称为Apo2L)相比,与MAb组合mDR5-04和mDR5-05相比,仅MAb组合mDR5-01和mDR5-05引发细胞凋亡。
PARP的Western(蛋白)印记。以每瓶(T25cm2)1.106的密度接种H4细胞系。在存在或不存在抗DR5的MAb的情况下,孵育细胞5小时。将细胞提取物重悬在pH 7的50mM的Tris-HCl、150mM KCl中,并且进行超声处理,并且在65℃孵育15min。样品(10μg)进行还原的SDS-PAGE,并且使用标准方法被转移至PVDF膜。在5%奶中封闭之后,将印迹孵育在1/2000的抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)(Roche Diagnostics,Meylan,法国)中。在清洗之后,将膜孵育在1/10000的PAb山羊抗兔的IgG辣根过氧化物酶缀合的抗体(AbD Serotec,Colmar,法国)中。经ECL增强的蛋白印迹(ECL AdvanceWestern blotting)使印迹显影,该ECL增强的蛋白印迹使用增强的基于鲁米诺的发光底物以检测辣根过氧化物酶(GE Healthcare,St Cyr au Mont d’Or,法国)。
已经鉴定了caspase的很多靶点特异性的底物,包括DAN修复酶、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)。已经广泛地使用PARP剪切的蛋白印迹检测作为凋亡的指示物。在人类序列中,PARP在Asp213和Gly 214之间被剪切,产生分子量为24kDa和89kDa的清晰可见的两个片段。从经MAb组合mDR5-01和mDR5-05处理的H4细胞中,检测到剪切的PARP的片段,而在未经处理的H4细胞或经MAb组合mDR5-05和mDR5-04处理的细胞中没有观察到类似效果(图10)。
如图11所示,MAb组合mDR5-01和mDR5-05(以比率1/100(10μg/mL+0.1μg/mL)测试),引发MAb mDR5-02(1μg/mL)阻断的凋亡。使用其它抗DR5的MAb(mDR5-01、mDR5-04或mDR5-05),没有观察到显著性影响。基于ATP存在的量(作为新陈代谢活跃的细胞的指示物),评价细胞活力。
基于对存在的ATP(新陈代谢活跃的细胞的指示物)的定量,评价五种神经胶质瘤细胞系H4、HS683、A172、T98G和U87MG对以比率1/100测试的TRAIL或抗DR5的MAb组合(mDR5-01+mDR5-05对mDR5-05+mDR5-04)(10μg/mL+0.1μg/mL)的易感性(图12)。然而,四种细胞系(HS683、A172、T98G和U87MG)对TRAIL诱导的凋亡有抵抗力或有非常低的敏感性,抗DR5的MAb组合mDR5-01和mDR5-05的使用避开了这一调节机制。
基于对存在的ATP(新陈代谢活跃的细胞的指示物)的定量,评价来自患者的离体(ex vivo)神经胶质瘤细胞对以10μg/mL测试的小鼠抗DR5的MAb组合(mDR5-01+mDR5-05)(比率1/10)的易感性。
单独或与喜树碱联合,评价四种神经胶质瘤细胞系(HS683、A172、42MGBA、T98G)对以10μg/mL然后以1/10稀释的测试的小鼠抗DR5的MAb组合(mDR5-01+mDR5-05)(比率1/1)的易感性(图15~图18)。这些细胞系显示出,经小鼠抗DR5的MAb组合或在喜树碱的存在下诱导的凋亡的不同水平。抗DR5的MAb组合与喜树碱联合使用避开了这一调节机制,并且提高了凋亡水平。
单独或与紫杉醇、吉西他滨或阿霉素(Doxorobucine)联合,评价其它表达DR5的实体肿瘤细胞系,诸如人乳腺癌细胞系(MCF7、MDAMB231)和人肺腺癌细胞系(NCIH1703、A549)对以10μg/mL然后以1/10稀释测试的小鼠抗DR5的MAb组合(mDR5-01+mDR5-05)(比率1/1)的易感性。这些细胞系显示出,经小鼠抗DR5的MAb组合或在测试的不同药物的存在下诱导的不同水平的凋亡。抗DR5的MAb组合与这些药物联合使用避开了这一调节机制,并且提高了凋亡水平。
实例4:针对DR5的嵌合单克隆抗体的制备
使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠源抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易分离编码单克隆抗体的DNA,并且进行对其进行测序。杂交瘤细胞用作这样的DNA的优选来源。
鼠源MAb至天然嵌合MAb的转化:使用两种途径获得对应于杂交瘤的可变区的cDNA。第一种途径包括,利用通过N-末端测序生成的简并的N-末端氨基酸相关的引物组的PCR;并且第二种途径包括,利用通过引物数据库和之前所述的特异性引物生成的简并的引物组的PCR(Essono等人,JImmunol Methods.2003;203:279:25-66,Wang等人,Mol Immunol.1991;28:1387-97)。通过埃德曼降解(Edman degradation)确定N-末端可变区的序列。使用Tri试剂盒,根据供应商Sigma所述的方案,进行总RNA的提取。将扩增的VL和VH片段克隆到TOPO-TA克隆载体(Invitrogen)中,以通过双去氧终止法(dideoxytermination method)进行序列分析(Sanger等人,Nature.1977;265:687-95)。然后,通过PCR扩增抗体变体构建体,并且克隆到表达载体中。
根据和指数(相同的V区氨基酸序列和具有不同特异性的抗体中的序列片段)对位置进行编号。分析VH和VL基因、微小基因和互补决定区对抗体结合位点的结合的相对贡献(Kabat等人,NIH Publ.1991;No.91-3242,Vol.1,647-669)。
如图13中所示,以比率1/100(5μg/mL+0.05μg/mL)测试时,嵌合的MAb组合chDR5-01和chDR5-05引发H4细胞凋亡。单独测试的嵌合MAb没有观察到显著的MAb影响。基于存在的ATP(新陈代谢活跃的细胞的指示物)的定量,评价细胞活性。
对于嵌合的MAb DR5-01和DR5-05的核酸序列或氨基酸序列示于序列表中:
抗DR5的DR5-01抗体的可变鼠源轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)及其来源的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
抗DR5的DR5-01抗体的可变鼠源重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)及其来源的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
抗DR5的DR5-05抗体的可变鼠源轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)及其来源的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
抗DR5的DR5-05抗体的可变鼠源重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)及其来源的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。
抗DR5的DR5-01或DR5-05抗体的恒定人源重链的核苷酸序列(SEQ IDNO:9)及其来源的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
抗DR5的DR5-01或DR5-05抗体的恒定人源轻链的核苷酸序列(SEQ IDNO:11)及其来源的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。
实例5:MAb的生产和蛋白A的纯化
哺乳动物细胞是用于产生治疗性糖蛋白的优选宿主,因为它们以用于人类应用的最相容形式具有使蛋白糖基化的能力(Jenkins等人,Nat Biotech.1996;14:975-81)。可以使用的哺乳动物的宿主细胞包括:人类的Hela、283、H9和Jurkat细胞,小鼠的NIH3T3和C127细胞,非洲绿猴细胞Cos 1、Cos 7和CV1细胞,鹌鹑的QC1-3细胞,小鼠的L细胞和中国仓鼠卵巢细胞。细菌很少使蛋白糖基化,并且像其它类型的常见宿主(诸如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞)那样,产生与从血流中快速清除相关的糖基化模式。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞允许一致地生成遗传稳定的、高产的克隆细胞系。能够在简单的生物反应器中,使用无血清的培养基将它们培养至高密度,并且使开发安全且可重复的生物工艺成为可能。其它经常使用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞、NSO-小鼠骨髓瘤细胞和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。也已经测试了来自转基因动物的产生(Jenkins等人,Nat Biotech.1996;14:975-81)。
典型的哺乳动物表达载体含有:启动子元件(来自SV40早期和晚期启动子),来自反转录病毒例如RSV、HTLV1、HIV1的长末端重复(LTR),以及介导mRNA的转录起始的巨细胞病毒(mCMV、hCMV)的早期启动子,蛋白编码序列,以及转录终止所需的信号和转录物的聚腺苷酸化(BGH polyA、单纯性疱疹病毒polyA的胸苷激酶基因(TKpa)、晚期SV40polyA和3’UTR_Beta_Globin_polyA)。额外的元件包括:增强子(Eμ、hIE1),Kozak序列,信号肽,以及两侧为用于RNA剪接的供体位点和受体位点的间隔序列。在实践本发明时,在实践中使用的适当的表达载体包括:例如,诸如pcDNA3.1、pcDNA3.3、pOptiVEC、pRSV、pEμMCMV、pMCMVHE-UTR-BG、pHCMVHE-UTR-BG、pMCMV-UTR-BG、pHCMV-UTR-BG、pMCMVHE-SV40、pHCMVHE-SV40、pMCMV-SV40、pHCMV-SV40、pMCMVHE-TK、pHCMVHE-TK、pMCMV-TK、pHCMV-TK、pMCMVHE-BGH、pHCMVHE-BGH、pMCMV-BGH、pHCMV-UTR-BGH的载体。
遵照我们的实验室中建立的瞬时转染或稳定的转染程序,空的CHO Easy C细胞(购自CCT收藏中心)经轻链和重链的MAb表达载体共转染。使H链和L链能够通过各自的人IgH前导序列分泌。将抗DR5的MAb的轻链和重链的编码区引入到MAb表达载体的多克隆位点中。分析转化体的正确取向和阅读框,表达载体可以被转染到CHO细胞系中。
来自鼠腹水的蛋白A的色谱。使用平衡缓冲液0.1M Tris和1.5M的硫酸铵将鼠腹水调节至pH 8.3,然后加载到rProtein A琼脂糖快速流动柱(GEHealthcare,Saint Cyr au Mont d’or,法国)上。未结合的蛋白流过,并且经几次平衡缓冲液的清洗被去除。使用洗脱缓冲液,pH 3.50.1M柠檬酸钠,从蛋白A柱上洗脱掉抗DR5的MAb。通过A280监控柱子的洗脱液。将抗DR5的MAb的峰集中起来。
来自收获的CHO细胞培养液的蛋白A的色谱。将CHO细胞产生的收获的细胞培养液加载到Hi Trap rProtein A柱子上(GE Healthcare,Saint Cyr au Montd’Or,法国),该Hi Trap rProtein A柱子经pH 7.2的磷酸盐缓冲的盐水平衡。未结合的蛋白流过,并且接着经几次PBS冲液的清洗被去除。使用pH3.0的0.1M柠檬酸的洗脱步骤,从蛋白A柱上洗脱掉抗DR5的MAb。通过A280监控柱子的洗脱液。将抗DR5的MAb的峰集中起来。
实例6:针对DR5的人源化单克隆抗体的制备
根据各种编号途径,诸如IMGT(ImMunoGeneTics Informationhttp://imgt.cines.fr)、Kabat或普通编号系统,已经确定了抗体的CDR和FR区。但是,对于给定的抗体,IMGT确定的CDR与通过其它编号系统限定的CDR不是必然相同的。感谢IMGT编号系统,本发明人已经鉴定了可变结构域CDR和骨架区。
嵌合MAb至人源化MAb的转化:通过PCR方法,使用CDR-嫁接(grafting)生成人源化的DR5抗体的H链和L链。为了生成人源化抗体,其中小鼠的单克隆抗体的CDR被嫁接到人类抗体上,优选在小鼠单克隆抗体的可变区和人类抗体的可变区之间存在高同源性。因此,使用软件IMGT/DomainGapAlign,将小鼠抗人的DR5单克隆抗体的H链和L链的V区与所有已知的人类抗体的V区进行对比。如所述的,当通过常规技术将小鼠抗体人源化时,支持CDR的小鼠抗体的一些V区FR的氨基酸序列可以被嫁接到人类V区的FR上。
对于人源化的H链和L链的V区,有可能选择L链和H链的V区和J区,与mDR5抗体的H链和L链的V区和J区具有高度同源性的IGKV3-D-15*01、IGHV1-3*01、IGKJ2*01和IGHJ4*01,以及与mDR5-05抗体的H链和L链的V区和J区具有高度同源性的IGKV1-16*01、IGHV1-3*01、IGKJ4*01和IGHJ4*01。
之后,确定HzDR5-01和HzDR5-05的人源化可变区的序列。通过PCR扩增HzDR5-01和Hz-DR5-05的H链和L链的可变区,并且克隆到含有人类IgG1恒定区的表达载体p3U中。
在人类CDR-嫁接的抗体的情况中,通过仅将CDR的氨基酸序列嫁接到小鼠抗体中,降低结合活性。为了避免这种下降,在人类抗体和小鼠抗体之间不同的FR中的氨基酸残基中,将认为对结合活性有影响的氨基酸残基与CDR的氨基酸序列一起嫁接。相应地,在本实例中还尝试了鉴定FR中认为对结合活性有影响的氨基酸残基。
基于存在的ATP(新陈代谢活跃的细胞的指示物)的定量,评价神经胶质瘤细胞系H4对以1μg/mL然后以1/2稀释测试的小鼠或人源化抗DR5的MAb组合(mDR5-01+mDR5-05)(比率1/1)的易感性。与小鼠的MAb组合(mDR5-01和mDR5-05)相比,人源化的MAb组合(hzDR5-01和hzDR5-05)以较高的水平引发细胞凋亡。
实例7:体内的生物MAb活性
通过将来自异型人类神经胶质瘤异种移植小鼠模型Sc2的100000个分离细胞脑内注射到裸鼠中,获得原位人类神经胶质瘤异种移植小鼠模型。通过以每只小鼠5mg/kg腹膜内注射(IP)给予MAb治疗,直至小鼠因为体重下降而实施安乐死,并且在最多36天的时间内实施MAb治疗。使用Kaplan-Meier法(生存率估计的乘积限法)和Wilcoxon(威斯康星)统计学检验(JMP软件),将对照组获得的存活时间与治疗组(mDR5-01+mDR5-05对mDR5-04+mDR5-05)获得的存活时间进行对比(图24)。该研究证实了小鼠抗DR5的MAb组合(mDR5-01+mDR5-05)对脑内的神经胶质瘤具有抗肿瘤活性。