BR112014029936B1 - Método e sistema para caracterizar uma variação na velocidade de partículas ou aglomeração de partículas - Google Patents

Método e sistema para caracterizar uma variação na velocidade de partículas ou aglomeração de partículas Download PDF

Info

Publication number
BR112014029936B1
BR112014029936B1 BR112014029936-6A BR112014029936A BR112014029936B1 BR 112014029936 B1 BR112014029936 B1 BR 112014029936B1 BR 112014029936 A BR112014029936 A BR 112014029936A BR 112014029936 B1 BR112014029936 B1 BR 112014029936B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
indicator
fluid chamber
image
liquid
particles
Prior art date
Application number
BR112014029936-6A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112014029936A2 (pt
Inventor
Vincent Poher
Myriam-Laure Cubizolles
Patrick Pouteau
Cédric Allier
Johanna Spiaczka
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives filed Critical Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Publication of BR112014029936A2 publication Critical patent/BR112014029936A2/pt
Publication of BR112014029936B1 publication Critical patent/BR112014029936B1/pt

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/4905—Determining clotting time of blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means, e.g. by light scattering, diffraction, holography or imaging
    • G01N15/0227—Investigating particle size or size distribution by optical means, e.g. by light scattering, diffraction, holography or imaging using imaging, e.g. a projected image of suspension; using holography
    • G01N15/1433—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
    • G01N15/1436—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement the optical arrangement forming an integrated apparatus with the sample container, e.g. a flow cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C12M1/3446—Photometry, spectroscopy, laser technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G01N15/075—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N2015/0092—Monitoring flocculation or agglomeration
    • G01N2015/012—
    • G01N2015/018—
    • G01N2015/1027—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
    • G01N2015/144—Imaging characterised by its optical setup
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
    • G01N2015/1454—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement using phase shift or interference, e.g. for improving contrast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1486—Counting the particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1497—Particle shape
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/251—Colorimeters; Construction thereof
    • G01N21/253—Colorimeters; Construction thereof for batch operation, i.e. multisample apparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/062—LED's
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/12—Circuits of general importance; Signal processing
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
    • G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
    • G03H1/04—Processes or apparatus for producing holograms
    • G03H1/0443—Digital holography, i.e. recording holograms with digital recording means
    • G03H2001/0447—In-line recording arrangement

Abstract

método e sistema para caracterizar a velocidade de movimento de partículas contidas em um líquido, como partículas sanguíneas. o método de acordo com a invenção tem a capacidade de caracterizar uma variação na velocidade de partículas ou de aglomeração de partículas, em que as partículas estão contidas em um líquido (12). o método de caracterização inclui as seguintes etapas: introduzir o líquido em uma câmara de fluido (14); iluminar a câmara de fluido com o uso de um feixe de laser de excitação (18) emitido por uma fonte de luz (16), em que o feixe de laser estende-se através da câmara de fluido em uma direção longitudinal (x); capturar pelo menos uma imagem com o uso de um fotodetector de matriz (20), em que a imagem é formada por meio de radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada; e calcular, a partir de pelo menos uma imagem capturada, pelo menos um indicador que caracteriza a variação da velocidade ou da aglomeração das partículas. durante a etapa de captura, o fotodetector é posicionado a uma distância (d2) menor do que 1 cm da câmara de fluido na direção longitudinal.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um método para caracterizar uma variação na velocidade de partículas ou aglomeração de partículas, as partículas, como partículas sanguíneas, são contidas em um líquido, sendo que o método inclui as seguintes etapas:
[0002] - introduzir o líquido em uma câmara de fluido;
[0003] - iluminar a câmara de fluido com o uso de um feixe luminoso de excitação emitido por uma fonte de luz, sendo que o feixe luminoso se estende através da câmara de fluido em uma direção longitudinal;
[0004] - capturar pelo menos uma imagem com o uso de um fotodetector de matriz, sendo que a imagem é formada por radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada; e
[0005] - calcular, a partir de uma imagem capturada, pelo menos um indicador que caracteriza a variação da velocidade ou aglomeração das partículas.
[0006] A invenção também se refere a um sistema que caracteriza a variação da velocidade de partículas ou aglomeração de partículas contidas no líquido, por exemplo, partículas sanguíneas.
[0007] A invenção em particular se refere ao campo de formação de imagem sem lente do feixe luminoso que ilumina a câmara de fluido, a fim de caracterizar um líquido, como sangue.
[0008] A invenção, em particular, se aplica à determinação de um parâmetro em relação à coagulação sanguínea, em particular à medição do tempo de coagulação. O mesmo também se aplica à determinação de um parâmetro a respeito da aglutinação de partículas no sangue, em particular, a determinação do grupo sanguíneo caracterizando-se uma agregação de célula entre o sangue a ser testado e um anticorpo.
[0009] São conhecidos a partir do documento no EP 2 233 923 A1 um método e sistema de caracterização do tipo mencionado acima. O método descrito tem como objetivo caracterizar a coagulação ou dinâmicas de sedimentação de um fluido que contém sangue. O sistema para implantar esse método compreende uma câmara de fluido que recebe líquido, uma fonte de luz espacialmente coerente com capacidade para emitir um feixe de laser de iluminação e um espelho para refletir o feixe luminoso em direção à câmara.
[0010] O feixe luminoso se estende em uma direção longitudinal do espelho refletor em direção à câmara de fluido.
[0011] O sistema também compreende um sensor de imagem, como um sensor matriz do tipo CCD (Dispositivo de Carga Acoplada) ou CMOS (Semicondutor de Metal-Óxido Complementar) disposto para tornar possível adquirir uma série temporal de imagens de um padrão de granularidade óptica criado pela interação entre as partículas contidas na câmara e o feixe luminoso. O sistema de caracterização também compreende uma unidade de processamento para processar a dita série temporal de imagens.
[0012] A câmara de fluido é posicionada entre o espelho e o sensor de imagem na direção longitudinal. A distância entre a câmara de fluido e o sensor de imagem na direção longitudinal é de diversos centímetros ou dezenas de centímetros. O feixe luminoso emitido pela fonte de luz espacialmente coerente tem uma superfície compreendida entre 10 μm2e diversos mm2 ao longo de um plano perpendicular à direção longitudinal e que passa através da câmara de fluido.
[0013] Tal sistema e método tornam possível caracterizar de modo efetivo a coagulação ou dinâmicas de sedimentação do sangue contido no líquido.
[0014] No entanto, tal sistema é relativamente volumoso. Além disso, o mesmo torna possível observar o fenômeno de coagulação apenas em um volume relativamente pequeno da câmara de fluido.
[0015] O objetivo da invenção é, portanto, propor um método e sistema de caracterização que torna possível observar um volume maior de líquido enquanto limita a massa do sistema de caracterização.
[0016] Para essa finalidade, a invenção se refere a um método de caracterização do tipo mencionado acima, caracterizado pelo fato de que, durante a etapa de aquisição, o fotodetector é posicionado a uma distância menor que 1 cm da câmara de fluido na direção longitudinal.
[0017] De acordo com outros aspectos vantajosos da invenção, o método de caracterização compreende um ou mais dos seguintes recursos, considerado sozinho ou de acordo com quaisquer combinações tecnicamente possíveis:
[0018] - o feixe luminoso tem uma área de superfície compreendida entre 5 mm2 e 200 mm2, preferencialmente igual a 25 mm2, em um piano perpendicular à direção longitudinal, o dito plano que é disposto em contato com a câmara de fluido;
[0019] - o feixe luminoso ilumina diretamente a câmara de fluido e a imagem é formada diretamente pela radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada, na ausência de uma lente de ampliação posicionada entre a câmara de fluido e o fotodetector; isso não exclui o possível uso de microlentes objetivas posicionadas em cada pixel do fotodetector;
[0020] - durante a etapa de aquisição, diversas imagens de transmissão são capturadas sequencialmente em momentos diferentes e durante a etapa de cálculo, um primeiro indicador calculado é um indicador de correlação capaz de caracterizar a variação da velocidade das partículas, sendo que o indicador de correlação é representativo da correlação entre pelo menos duas imagens de transmissão, respectivamente capturadas em momentos n e n+m, ou a correlação para uma região predeterminada das ditas imagens de transmissão;
[0021] - o método também inclui uma etapa para misturar o líquido com um reagente com capacidade para beneficiar a redução das partículas, como um reagente com capacidade para beneficiar a redução das partículas sanguíneas por meio de coagulação do sangue;
[0022] - o método também inclui uma etapa para determinar, a partir do primeiro indicador calculado da coagulação de partículas sanguíneas e/ou a partir de um intervalo de tempo, chamado tempo de coagulação, entre um momento inicial e o momento no qual o primeiro indicador calculado toma um valor predeterminado;
[0023] - a fonte de luz é uma fonte de luz espacial e temporalmente coerente, como um laser;
[0024] - o primeiro indicador é calculado a partir de uma imagem de correlação que define a correlação espacial entre as ditas imagens de transmissão ou a partir de uma região predeterminada da dita imagem de correlação;
[0025] - a imagem de correlação é determinada pela seguinte equação:
Figure img0001
[0026] em que x e y representam as coordenadas de um ponto da imagem, Icorrn+m(x,y) é uma matriz que tem X fileiras e Y colunas,
[0027] k1(x,y) representa uma matriz predeterminada que tem fileiras P e colunas Q,
[0028] An(x,y) e An+m(x,y) são definidas pelas seguintes equações:
Figure img0002
[0029] In(x,y), In+m(x,y) que representa duas imagens de transmissão sucessivas em momentos n e n+m, In(x,y), In+m(x,y) que são matrizes com X fileiras e Y colunas,
[0030] e o símbolo ®representa o número inteiro de convolução definido por:
Figure img0003
PQ
[0031] F(x,y) que é uma matriz com X fileiras e Y colunas,
[0032] X, Y, P e Q que são números inteiros que verificam X > P > 1 e Y > Q > 1;
[0033] - o primeiro indicador é calculado com o uso da seguinte equação:
Figure img0004
[0034] em que Ind1n,n+m representa o primeiro indicador,
[0035] Cn(x,y) e Cn+m(x,y) são definidos pelas seguintes equações:
Figure img0005
[0036] I’n(x,y), I’n+m(x,y) respectivamente representam uma região predeterminada de duas imagens de transmissão sucessivas em momentos n e n+m, x e y que designam as coordenadas de um ponto da imagem, I’n(x,y), I’n+m(x,y) que são matrizes que têm fileiras N e colunas M, e
[0037] I'n, I'n+m que representa um valor principal de respectivas regiões predeterminadas I’n(x,y) e I’n+m(x,y);
[0038] - o método também inclui uma etapa para misturar o líquido com um reagente com capacidade para criar uma aglomeração de partículas, na qual, durante a etapa de cálculo, um segundo indicador calculado é um indicador para cada imagem capturada, sendo que o segundo indicador é representativo da intensidade dos pixels da imagem em uma região predeterminada da imagem e em que o método também inclui uma etapa para determinar um estado de aglomeração das partículas do segundo indicador calculado;
[0039] - o estado de aglomeração é determinado quando o segundo indicador excede um limite predeterminado;
[0040] - o estado de aglomeração é determinado quando o segundo indicador excede um indicador de referência obtido por uma imagem feita na área de referência;
[0041] - as partículas sanguíneas são eritrócitos, o reagente inclui um anticorpo e uma parte de informações relativa ao grupo sanguíneo também é determinada do estado de aglomeração;
[0042] - o líquido inclui um analito, o método, então, inclui estimar a quantidade do dito analito no líquido, que depende do dito segundo indicador; e
[0043] - a câmara de fluido inclui diversos canais de circulação de fluido e em que durante a etapa de cálculo, um indicador é calculado para cada um dos canais.
[0044] A invenção também se refere a um sistema que caracteriza a variação da velocidade de partículas ou a aglomeração de partículas, as partículas, como partículas sanguíneas, estão contidas no líquido, sendo que o sistema compreende:
[0045] - uma câmara de fluido projetada para receber o líquido;
[0046] - uma fonte de luz com capacidade para emitir um feixe luminoso de excitação para iluminar a câmara de fluido, o feixe luminoso que se estende através da câmara de fluido em uma direção longitudinal;
[0047] - um fotodetector de matriz com capacidade para capturar pelo menos uma imagem, de uma radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada; e
[0048] - uma unidade de processamento de informações que inclui meios para cálculo para calcular, a partir de uma imagem capturada, pelo menos um indicador que caracteriza a variação da velocidade ou a aglomeração das partículas;
[0049] caracterizada pelo fato de que o fotodetector é posicionado em uma distância menor que 1 cm da câmara de fluido na direção longitudinal.
[0050] De acordo com outro aspecto vantajoso da invenção, o fotodetector de matriz inclui uma pluralidade de pixels, sendo que cada pixel tem dimensões, sendo cada uma menor que ou igual a 4 μm.
[0051] Esses recursos e vantagens da invenção irão aparecer mediante a leitura da descrição seguinte, fornecida exclusivamente como um exemplo não limitante e feita em referência aos desenhos anexos, nos quais:
[0052] - A Figura 1 é uma ilustração muito diagramática de um sistema de caracterização de acordo com a invenção, que compreende uma câmara de fluido que recebe líquido a ser caracterizada, uma fonte de luz com capacidade para iluminar a câmara em uma direção longitudinal, um fotodetector de matriz para capturar imagens da radiação transmitida pela câmara iluminada e uma unidade de processamento de informações,
[0053] - A Figura 2 é uma ilustração muito diagramática do sistema de caracterização de acordo com a invenção, de acordo com outra disposição da fonte de luz relativa ao fotodetector de matriz,
[0054] - A Figura 3 é uma vista diagramática da câmara de fluido na direção longitudinal, bem como a disposição do fotodetector de matriz da Figura 1 relativa à câmara, de acordo com uma primeira alternativa,
[0055] - A Figura 4 é uma vista similar àquela da Figura 3 de acordo com uma segunda alternativa,
[0056] - A Figura 5 é um fluxograma de um método de caracterização de acordo com a invenção,
[0057] - A Figura 6 é uma imagem de um canal vazio da câmara da Figura 1, capturada pelo fotodetector de matriz,
[0058] - As Figuras 7 e 8 são imagens da câmara que contém o líquido, capturadas pelo fotodetector em momentos diferentes,
[0059] - As Figuras 9 e 10 são imagens de correlação, calculadas pela unidade de processamento da Figura 1, a partir de imagens capturadas em momentos diferentes,
[0060] - A Figura 11 é uma retratação da evolução ao longo do tempo de um indicador que caracteriza uma variação da velocidade das partículas contidas no líquido, como uma redução das partículas,
[0061] - A Figura 12 é uma tabela que ilustra o caso de agregação de células como uma função do grupo sanguíneo e o anticorpo depositado,
[0062] - A Figura 13 é uma vista similar àquela das Figuras 3 e 4 de acordo com uma segunda modalidade, a câmara de fluido que inclui dois canais,
[0063] - As Figuras 14 e 15 são imagens respectivas do primeiro e do segundo canais da câmara da Figura 13, o segundo canal que tem uma agregação de célula, as imagens são capturadas pelo fotodetector da Figura 1,
[0064] - Figuras 16 e 17 são histogramas do nível cinza das imagens capturadas nas Figuras 14 e 15,
[0065] - As Figuras 18 a 21 são imagens do líquido a ser caracterizado, capturadas pelo fotodetector de acordo com um segundo exemplo da segunda modalidade, o líquido a ser caracterizado contém sangue, para o qual uma quantidade variável de anticorpos é adicionada, essas imagens são capturadas para aumentar as quantidades de anticorpos,
[0066] - As Figuras 22 a 25 são histogramas do nível cinza das imagens capturadas nas Figuras 18 a 21, respectivamente,
[0067] - As Figuras 26 a 29 são imagens do líquido caracterizado nas Figuras 18 a 21, respectivamente, obtidas, após a diluição, com o uso de um microscópio e que forma imagens de referência,
[0068] - As Figuras 30 a 34 são imagens do líquido a ser caracterizado, capturadas pelo fotodetector de acordo com um terceiro exemplo da segunda modalidade, sendo que o líquido a ser caracterizado contém sangue, uma quantidade variável de proteína A e uma mesma quantidade adicionada de anticorpos,
[0069] - As Figuras 35 a 39 são histogramas do nível cinza das imagens capturadas nas Figuras 30 a 34, respectivamente,
[0070] - As Figuras 40 a 44 são imagens do líquido caracterizado nas Figuras 30 a 34, respectivamente, obtido após a diluição com o uso de um microscópio e que forma imagens de referência, e
[0071] - A Figura 45 é uma ilustração muito diagramática da aglutinação dos eritrócitos e proteínas A com o uso de anticorpos.
[0072] Na Figura 1, um sistema de caracterização 10 é projetado para caracterizar uma variação da velocidade de partículas ou a aglomeração de partículas, as partículas, como partículas sanguíneas, estão contidas em um líquido 12, através da captura de imagens formadas por uma radiação transmitida pelo líquido iluminado 12, então, o processamento dessas imagens. A variação da velocidade de partículas é, por exemplo, uma redução das partículas conforme será descrito em maiores detalhes a seguir no presente documento. Uma pessoa versada na técnica irá entender que o sistema de caracterização 10 de acordo com a invenção é similar à capacidade que caracteriza a aceleração das partículas.
[0073] Desse modo, em geral, o sistema de caracterização 10 é projetado para caracterizar um parâmetro de um líquido que compreende partículas, em que o líquido em particular é sangue. Esse parâmetro é, por exemplo, uma coagulação ou uma aglomeração de partículas que fabricam o líquido. Alternativamente, o mesmo é uma contagem das partículas ou uma observação da morfologia das partículas.
[0074] O termo “partículas” em particular se refere a uma partícula biológica, isto é, uma célula (por exemplo, um eritrócito, um leucócito ou uma plaqueta), uma bactéria, um vírus ou qualquer outra molécula (por exemplo, uma proteína).
[0075] A aglutinação (ou aglomeração) se refere à formação de uma estrutura tridimensional de partículas conectadas umas às outras, sob o efeito de um reagente que foi introduzido.
[0076] O estado de aglutinação (ou aglomeração) se refere a uma estimativa, que pode ser relativa ou absoluta, do tamanho dos aglutinados ou relativo à quantidade de partículas presentes no aglutinado.
[0077] O sistema de caracterização 10 compreende uma câmara de fluido 14 projetada para receber o líquido 12, uma fonte de luz 16 com capacidade para emitir um feixe luminoso de excitação 18 para iluminar a câmara de fluido 14, o feixe luminoso 18 orientado em uma direção longitudinal X através da câmara de fluido 14 e um fotodetector de matriz 20 com capacidade para capturar imagens da radiação transmitidas pela câmara de fluido 14 iluminadas pelo feixe luminoso 18. A radiação transmitida se refere à radiação que passa através da câmara de fluido, para que o fotodetector de matriz 20 e a fonte de luz 16 estejam situados em cada lado da câmara de fluido 14.
[0078] O sistema de caracterização 10 compreende uma unidade de processamento de informações 21 e uma tela 22 para exibir uma imagem da câmara 14.
[0079] Na modalidade descrita, o sistema de caracterização 10 tem capacidade para caracterizar a coagulação do sangue ou a aglutinação de partículas sanguíneas, sendo que a aglutinação de partículas sanguíneas torna possível determinar o grupo sanguíneo associado. O líquido 12, então, contém sangue. O líquido 12 é, por exemplo, todo o sangue, uma fração do sangue ou um plasma sanguíneo. Alternativamente, o líquido 12 é outro líquido corporal, como urina, transpiração, etc.
[0080] A câmara de fluido 14 é posicionada entre a fonte de luz 16 e o fotodetector de matriz 20 na direção longitudinal X. A câmara de fluido 14 compreende uma área de depósito 26 do líquido e um ou mais canais de circulação 28 para o líquido 12, conforme mostrado na Figura 3.
[0081] A câmara de fluido 14 inclui pelo menos um canal de fluido, delimitado, na direção X, por uma placa superior e uma placa inferior, não mostrada. Essas placas são pelo menos parcialmente translúcidas de modo a tornar possível iluminar o líquido 12 com o uso da fonte de luz 16, bem como detectar a radiação transmitida pela matriz detector 20.
[0082] As placas superiores e inferiores são, por exemplo, lâminas de vidro, não mostradas, e separadas por espaçadores, não mostrados, para que as lâminas de vidro sejam separadas por aproximadamente 160 μm na direção longitudinal X.
[0083] A câmara de fluido 14 tem uma espessura E na direção longitudinal X. A espessura E, por exemplo, tem um valor compreendido entre 20 μm e 1000 μm, preferencialmente compreendido entre 30 μm e 300 μm.
[0084] A fonte de luz 16 tem capacidade para emitir o feixe luminoso 18 na direção longitudinal X.
[0085] A fonte de luz 16 é posicionada em uma primeira distância D1 da câmara de fluido 14 na direção longitudinal X. A primeira distância D1 preferencialmente tem um valor compreendido entre 1 cm e 30 cm, por exemplo, igual a 20 cm.
[0086] Na modalidade descrita, a fonte de luz 16 é uma fonte espacial e temporalmente coerente. A fonte de luz 16 é, por exemplo, um laser. Alternativamente, a fonte de luz 16 é um diodo laser (LD) ou um diodo laser do tipo VCSEL (Laser de Emissão Superficial de Cavidade Vertical).
[0087] Também, de modo alternativo, a fonte de luz 16 é um diodo emissor de luz (LED), monocromático e que tem dimensões pequenas o suficiente para ser considerado espacialmente coerente, o diâmetro do LED é menor que 1/10 da primeira distância D1 que separa aquele LED da câmara.
[0088] O feixe luminoso 18, orientado na direção longitudinal X, tem, no nível da câmara de fluido, uma área de superfície compreendida entre 5 mm2 e 200 mm2, preferencialmente igual a 25 mm2, em um plano P perpendicular à direção longitudinal X, conforme mostrado na Figura 1. O plano P é disposto em contato com a câmara de fluido 14. Desse modo, a superfície de fluido iluminada é maior que no estado da técnica. Isso torna possível eliminar oscilações locais do parâmetro que um indivíduo deseja determinar.
[0089] O feixe luminoso 18 tem capacidade para iluminar a câmara de fluido 14 diretamente, preferencialmente na ausência de uma lente de ampliação posicionadas entre a fonte de luz 16 e a câmara de fluido 14.
[0090] O fotodetector de matriz 20 é um sensor de imagem pixelada, que inclui uma pluralidade de pixels, não mostrados. Cada pixel do fotodetector 20 tem dimensões menores que ou iguais a 10 μm ou mesmo de 4 μm. Cada pixel é, por exemplo, quadrado, cada lado tem um valor menor que ou igual a 10 μm ou mesmo de 4 μm. Na modalidade descrita, cada pixel está na forma de um quadrado com lados que medem 4 μm. Alternativamente, cada pixel está na forma de um quadrado com cada lado medindo 2,2 μm.
[0091] O fotodetector de matriz 20 é posicionado em uma segunda distância D2 da câmara de fluido 14 na direção longitudinal X. A segunda distância D2 tem um valor menor que 1 cm, e preferencialmente compreendida entre 100 μm e 2 mm. O favorecimento de uma distância curta entre o detector e a câmara torna possível limitar os fenômenos de interferência entre os diferentes padrões de difração. De fato, quando essa distância aumenta, essas interferências podem tornar a imagem inutilizável, em particular quando o número de partículas difratadas aumenta. Isso se deve ao fato de que o volume de fluido que é iluminado ser maior que no dispositivo descrito no pedido no EP 2 233 923 A1 do estado da técnica. Colocando-se o detector a uma distância de mais que 1 cm na direção oposta, a imagem obtida no detector seria difícil de ser usada.
[0092] As imagens capturadas pelo fotodetector de matriz 20 são formadas pela radiação transmitida diretamente pela câmara de fluido iluminada 14, na ausência de uma lente de ampliação posicionada entre a câmara de fluido 14 e o fotodetector de matriz 20. O fotodetector de matriz 20 também é chamado de um dispositivo de formação de imagem sem lente e tem capacidade para formar uma imagem da câmara de fluido 14 enquanto está situada a uma distância pequena a partir da mesma. Uma distância pequena se refere a uma distância menor que 1 cm.
[0093] O fotodetector de matriz 20 tem capacidade para gerar pelo menos uma imagem a cada 5 segundos e o ritmo de captura é, portanto, maior que 0,2 Hz. O fotodetector de matriz 20 é um sensor de imagem bidimensional, isto é, em um plano perpendicular ao eixo geométrico longitudinal X. A frequência de captura das imagens é preferencialmente compreendida entre 1 Hz e 20 Hz.
[0094] O fotodetector de matriz 20 é, por exemplo, um sensor CCD. Alternativamente, o fotodetector 20 é um sensor CMOS.
[0095] O fotodetector de matriz 20 é, por exemplo, substancialmente alinhado com a câmara de fluido 14 na direção longitudinal X, conforme ilustrado na Figura 3, em que o fotodetector 20 é mostrado em linhas pontilhadas.
[0096] Alternativamente, o fotodetector de matriz 20 é levemente desviado em relação à câmara 14 ao longo do eixo geométrico longitudinal X, conforme ilustrado na Figura 4, em que o fotodetector 20 também é mostrado em linhas pontilhadas.
[0097] A unidade de processamento de informações 21, mostrada na Figura 1, inclui um processador de dados 30 e uma memória 32 associada ao processador.
[0098] Na modalidade exemplificativa da Figura 2, o fotodetector de matriz 20, a fonte de luz 16 e opcionalmente toda ou parte da unidade de processamento de informações 21 são presos a um segundo substrato 23. O sistema de caracterização 10 compreende um sistema óptico 24, por exemplo, um espelho, que torna possível devolver o feixe luminoso 18 da fonte de luz 16 em direção ao fotodetector 20. Isso torna possível ter um sistema compacto. A câmara de fluido 14 é, por exemplo, formada em um apoio removível 25. O apoio removível 25 é, por exemplo, disposto e projetado para ser inserido em suspensão no fotodetector 20, a uma distância pequena a partir do mesmo, para que a câmara de fluido possa ser iluminada pelo feixe luminoso 18. De acordo com essa modalidade exemplificativa, o apoio 25 é projetado para receber o fluido a ser analisado 12, então, para ser inserido próximo ao fotodetector 20 de modo que a análise possa ser feita. Isso, por exemplo, inclui um conduto, no qual o fluido 12 circula na medida em que o canal 28 da câmara de fluido, a câmara de fluido 14 está conectada ao conduto. Quando a análise é completada, o apoio 25 é removido, em particular, para ser jogado fora. O sistema de caracterização 10 é, então, disponível para realizar outra medição com outro apoio.
[0099] Uma pessoa versada na técnica irá entender que, na modalidade exemplificativa da Figura 2, a direção longitudinal X corresponde à última porção do feixe luminoso 18 entre o espelho correspondente do sistema óptico 24 e o fotodetector 20, que passa através da câmara de fluido 14.
[00100] O ou cada canal de circulação 28 tem uma largura L, mostrada nas Figuras 3 e 4. A largura L, por exemplo, tem um valor compreendido entre 50 μm e 5 mm, preferencialmente igual a 1,5 mm.
[00101] A memória 32 tem capacidade para armazenar software 34 que recebe as imagens capturadas pelo fotodetector de matriz 20, primeiro software 36 para calcular um primeiro indicador Ind1n,n+m com capacidade para caracterizar o parâmetro desejado; nesse caso, a variação da velocidade das partículas, como sua redução. Adicional ou alternativamente, a memória 32 pode armazenar o segundo software 38 para calcular um segundo indicador Ind2 com capacidade para caracterizar outro parâmetro desejado, nesse caso, a aglomeração das partículas. A memória 32 também tem capacidade para armazenar software 40 para caracterizar a variação da velocidade das partículas e/ou a aglomeração das partículas.
[00102] Alternativamente, os meios de recepção 34, o primeiro meio para cálculo 36, o segundo meio para cálculo 38 e os meios de caracterização 40 que são produzidos na forma de componentes lógicos programáveis ou na forma de circuitos integrados dedicados.
[00103] O software de recepção 34 tem capacidade para receber regularmente, do fotodetector 20, as imagens capturadas sequencialmente em momentos diferentes. O software de recepção 34 tem capacidade para receber pelo menos uma imagem por segundo e o ritmo de recepção das imagens é maior que 0,2 Hz, tipicamente de 1 Hz a 20 Hz.
[00104] O primeiro software de cálculo 36 tem capacidade para calcular uma imagem An, que representa a imagem de transmissão In(x,y), a partir da qual um meio local é concedido. I último é obtido enrolando-se em espiral a imagem In(x,y) com um núcleo k1. Esse núcleo k1 é uma matriz com dimensões pequenas relativas à In. Por exemplo, as dimensões do núcleo k1 são 10 pixels por 10 pixels e as dimensões de In são pelo menos duas vezes maiores que aquelas do núcleo k1 ou mesmo 10 vezes maiores. O núcleo k1, que inclui fileiras P e colunas Q é, por exemplo, homogêneo, todos os seus valores são idênticos. De acordo com o precedente, P e Q são números inteiros, por exemplo, igual a 10. Desse modo, duas imagens An e An+m são estabelecidas, respectivamente as que correspondem aos momentos n e n+m, sendo que m é um número inteiro. Em geral, m é igual a 1, as imagens de transmissão In e In+1 são duas imagens de transmissão sucessivas.
Figure img0006
Figure img0007
[00105] em que In(x, y), In+m(x, y) representam duas imagens de transmissão sucessivas em momentos n e n+m, x e y representam as coordenadas de um ponto da respectiva imagem, In(x,y), In+m(x,y) são matrizes que têm X fileiras e Y colunas, o símbolo ® representa o número inteiro de convolução definido pela seguinte equação:
Figure img0008
[00106] F é uma matriz com X fileiras e Y colunas,
[00107] k1 que representa um núcleo para a correlação das imagens capturadas, k1 sendo uma matriz com fileiras P e colunas Q,
[00108] X, Y, P e Q sendo números inteiros que verificam X > P > 1 e Y > Q > 1.
[00109] As imagens são, por exemplo, capturadas a cada segundo pelo fotodetector de matriz 20 e as duas imagens de transmissão In(x,y), In+1(x,y) são, então, imagens capturadas com um intervalo de um segundo.
[00110] O primeiro software de cálculo 36 tem, então, capacidade para calcular uma imagem de correlação Icorrn,n+m(x,y) representativa da correlação entre duas imagens de transmissão In(x,y), In+m(x,y), por exemplo, de acordo com a seguinte equação:
Figure img0009
[00111] em que Icorrn,n+m(x,y) representa a imagem de correlação de duas imagens de transmissão In, In+m, estabelecidas nos respectivos momentos n e n+m; sendo que x e y representam as coordenadas de um ponto da imagem, Icorrn,n+m(x,y) que é uma matriz com X fileiras e Y colunas.
[00112] O primeiro software de cálculo 36 tem, finalmente, capacidade para calcular o primeiro indicador Ind1n,n+m da imagem de correlação Icorrn,n+m(x,y) anteriormente obtida. Esse indicador Ind1n,n+m é representativo da intensidade da imagem Icorrn,n+m(x,y). Esse indicador Ind1n,n+m tem, então, capacidade para caracterizar a variação da velocidade das partículas, como sua redução.
[00113] O indicador de correlação Ind1n,n+m é representativo da correlação entre pelo menos duas imagens de transmissão In(x,y) e In+m(x,y) respectivamente capturadas em momentos n e n+m, sendo que a correlação é estabelecida por uma região de interesse 142 da imagem de correlação Icorrn,n+m(x,y). A dita região de interesse 142 é determinada pelo usuário. A mesma corresponde à área da imagem de correlação Icorrn,n+m(x,y) que um indivíduo deseja usar para determinar o indicador de correlação Ind1n,n+m. Isso é, por exemplo, uma área quadrada que tem diversas dezenas de pixels por lado, por exemplo, 50 x 50 pixels. O indicador de correlação Ind1n,n+m traduz o valor da intensidade naquela região de interesse 142. Isso é em particular determinado a partir da intensidade de meio ou da intensidade total na região de interesse 142 da imagem Icorrn,n+m(x,y). Esse indicador Ind1 n,n+m, por exemplo, representa o nível de intensidade de meio ou a dita intensidade total na região de interesse 142.
[00114] Alternativamente, o primeiro software de cálculo 36 tem capacidade para calcular imagens intermediárias Cn(x,y), Cn+m(x,y) de duas imagens de transmissão In(x,y), In+m(x,y) capturadas em momentos n e n+m, de acordo com a seguinte equação:
Figure img0010
[00115] em que I'n(x,y), I'n+m(x,y) respectivamente representa uma região de interesse das duas imagens de transmissão I n e In+m. Conforme anteriormente afirmado, o índice m é, por exemplo, igual a 1. As coordenadas x e y designam as coordenadas de um ponto da imagem, Cn(x,y), Cn+m(x,y) que são matrizes que têm fileiras N e colunas M, e
[00116] In', Im'representam um valor principal das respectivas regiões de interesse In‘(x,y), Im'(x,y). Deve-se especificar que a subtração de I'n e I'm por In' e Im', respectivamente, é opcional. Isso corresponde a uma etapa de normalização, que torna possível obter um indicador compreendido entre 0 e 1. Além disso, isso torna possível eliminar o efeito de flutuação da intensidade de iluminação do meio entre duas imagens.
[00117] De acordo com essa alternativa, o primeiro software de cálculo 36 tem, então, a capacidade para calcular o primeiro indicador Ind1n,n+m de acordo com a seguinte equação:
Figure img0011
[00118] em que Ind1n,n+m representa o primeiro indicador.
[00119] O software de caracterização 40 tem capacidade para caracterizar a variação da velocidade e/ou aglomeração de partículas contidas no líquido 12. Mais especificamente, o software de caracterização 40 tem capacidade para determinar, a partir do primeiro indicador calculado Ind1n,n+m, a variação da velocidade das partículas contidas no líquido 12, como sua redução. Na modalidade descrita em que o líquido 12 contém sangue, o primeiro software de caracterização 40 tem capacidade para determinar, a partir do primeiro indicador calculado Ind1n,n+m, a coagulação das partículas sanguíneas e/ou um intervalo de tempo, chamado tempo de coagulação, entre um momento inicial e o momento quando o primeiro indicador calculado Ind1n,n+m toma um valor predeterminado. Desse modo, em geral, Ind1n,n+m caracteriza um parâmetro de coagulação do sangue, com base na observação de imagens de transmissão In, In+m em momentos n e n+m, m que, geralmente, estão compreendidos entre 1 e 10, e preferencialmente iguais a 1.
[00120] A operação do sistema de caracterização 10 de acordo com a invenção será descrito agora com o uso da Figura 5, que mostra um fluxograma do método de caracterização de acordo com a invenção.
[00121] Antes do uso do mesmo, os canais de circulação 28 da câmara de fluido são esvaziados e uma imagem inicial I0 da câmara 14, então, mostra uma área branca que corresponde ao canal de circulação 28 e áreas que delimitam o canal, que nesse exemplo aparece na forma de áreas escuras que correspondem ao resto da câmara de fluido 14, conforme mostrado na Figura 6.
[00122] Durante a etapa inicial 100, o líquido 12 é introduzido na área de depósito 26 da câmara de fluido. O líquido 12 flui por capilaridade na área de depósito 26 em direção aos canais de circulação 28.
[00123] O líquido 12 é, então, opcionalmente, na etapa 110, misturado com um reagente 112, mostrado nas Figuras 3 e 4 e com capacidade para iniciar ou beneficiar um fenômeno de redução das partículas. O reagente 112 é, por exemplo, um reagente liofilizado com capacidade para beneficiar a redução das partículas sanguíneas através da coagulação do sangue.
[00124] O reagente 112 é, por exemplo, depositado a montante da área de detecção óptica que corresponde à área dentro das linhas pontilhadas na Figura 3 para a qual uma imagem é capturada pelo fotodetector 20. Alternativamente, o reagente 112 é posicionado dentro da área de detecção óptica, conforme mostrado na Figura 4. A mistura entre o líquido 12 e o reagente 112 ocorre quando o líquido 12 flui em contato com o reagente 112 dentro do canal de circulação 28 (seta F1).
[00125] Na modalidade descrita, o reagente 112 é uma proteína pró-coagulante. Essa proteína é depositada, desidratada ou liofilizada no canal de circulação 28. O reagente 112 é, por exemplo, uma proteína protrombina, também chamada PT, quando o parâmetro de INR (Razão Normalizada Internacional) é determinado.
Figure img0012
[00126] T sendo o tempo de coagulação medido, Tref sendo o tempo de referência considerado, ISI sendo um fator de correção que depende dos reagentes usados para iniciar a coagulação.
[00127] Alternativamente, o reagente 112 é a proteína Ecarina, quando o tempo de coagulação é medido com o uso do teste ECT (Tempo de Coagulação de Ecarina). Alternativamente, o reagente 112 é a proteína Trombina quando o tempo de coagulação é medido com o uso do teste TT (Tempo de Trombina Time).
[00128] O líquido 12 é iluminado pelo feixe luminoso 18 durante a etapa 120. A fonte de luz 16 de fato emite o feixe luminoso 18 em direção à câmara de fluido 14 no qual o líquido 12 é revelado na direção longitudinal X.
[00129] Durante a etapa 130, o fotodetector de matriz 20, então, sequencialmente captura diversas imagens de transmissão In(x,y), In+m(x,y) em momentos diferentes n e n+m. Cada imagem de transmissão In(x,y), In+m (x,y) é formada pela radiação transmitida e o momento de captura correspondente pela câmara de fluido iluminada 14.
[00130] As imagens In(x,y), In+m(x,y) são, por exemplo, imagens imediatamente sucessivas, m, então, é igual a 1, preferencialmente capturada a cada segundo, conforme mostrado nas Figuras 7 e 8, em que o espaço de tempo entre as duas imagens In(x,y), In+1(x,y) capturadas de modo sucessivo é igual a 1 segundo.
[00131] As imagens capturadas In(x,y), In+1(x,y) correspondem às interferências de padrões de difração criados por partículas suspensas no líquido 12. A iluminação das partículas pelo feixe espacial e temporalmente coerente 18, como um feixe de laser, cria um padrão de difração, que varia ao longo do tempo devido ao movimento de partículas contidas no líquido 12.
[00132] A observação de um padrão de difração usável, colocando-se o fotodetector de matriz 20 a tal distância pequena na direção oposta, é em particular devido à ausência de uma lente de ampliação entre a câmara de fluido 14 e o fotodetector 20.
[00133] Durante a etapa de aquisição 130, o fotodetector 20 é posicionado a uma distância pequena da câmara de fluido 14, a segunda distância D2 entre a câmara de fluido 14 e o fotodetector 20 na direção longitudinal X que é menor que 1 cm.
[00134] No final da etapa de aquisição 130, em particular, após a captura das imagens In(x,y), In+1(x,y), o primeiro software de cálculo 36 começa, na etapa 140, calculando-se as imagens An(x,y), An+1(x,y) com o uso de equações (1), (2) e (3).
[00135] O primeiro software de cálculo 36, então, calcula a imagem de correlação correspondente Icorrn,n+1(x,y) das imagens An(x,y), An+1(x,y) e com o uso de equação (4).
[00136] Na modalidade descrita, as imagens de correlação evoluem como uma função de tempo, conforme mostrado nas Figuras 9 e 10, em que a imagem de correlação IcorrN1,N1+1(x,y), denotada IcorrN1(x,y), corresponde à correlação entre duas imagens de transmissão In, In+1 feitas com n = N1 antes da coagulação (Figura 9), tem uma aparência muito diferente da imagem IcorrN2(x,y) que corresponde a uma correlação entre duas imagens de transmissão IN2, IN2+1, feitas com n = N2 após a coagulação (Figura 10).
[00137] O primeiro software de cálculo 36 finalmente calcula o valor do primeiro indicador Ind1n,n+1 para cada imagem de correlação Icorrn,n+1(x,y) obtida. O valor do primeiro indicador Ind1n,n+1 é, por exemplo, o valor principal dos pontos da imagem de correlação Icorrn,n+1(x,y) na região predeterminada de interesse 142, visível nas Figuras 9 e 10. Alternativamente, o valor do primeiro indicador Ind1n,n+1 é o integral da imagem na região de interesse 142 (isto é, a soma dos níveis cinza de cada pixel). Também, de modo alternativo, o valor do primeiro indicador Ind1n,n+1 é uma função daquele integral.
[00138] Alternativamente, o primeiro software de cálculo 36 começa, na etapa 140, calculando-se as imagens intermediárias Cn(x,y), Cn+1(x,y) com o uso de equações (5) e (6).
[00139] O primeiro software de cálculo 36, então, preenche o valor do primeiro indicador Ind1n,n+1 a partir de imagens intermediárias Cn(x,y), Cn+1(x,y) e com o uso de equação (7).
[00140] Na modalidade descrita, no final da etapa de cálculo 140, o método de caracterização retorna para a etapa 130 a fim de capturar uma imagem nova da câmara de fluido iluminada 14, então, para calcular, de modo similar durante a etapa 140, uma imagem nova de correlação Icorrn+1,n+2(x,y) e um valor novo do primeiro indicador Ind1 n+1, n+2.
[00141] As etapas de captura 130 e cálculo 140 são, então, repetidas de modo regular, por exemplo, a cada segundo, durante um período predeterminado de tempo, por exemplo, maior que 60 segundos ou até uma pausa iniciada pelo usuário, em particular, a luz da evolução ao longo do tempo do primeiro indicador.
[00142] A evolução ao longo do tempo do primeiro indicador Ind1n,n+m, mostrada na modalidade descrita pela curva 145 mostrada na Figura 11, então, torna possível calcular a variação da velocidade das partículas contidas no líquido 12, como a redução das partículas sanguíneas.
[00143] Na Figura 11, um momento inicial t0 corresponde à mistura do reagente 112 com o líquido 12 e o canal de circulação 28 através da área de detecção óptica é, então, preenchido em um primeiro momento t1. Em outras palavras, a modalidade exemplificativa da Figura 11 corresponde ao caso em que o reagente 112 é depositado imediatamente antes da área de detecção óptica, conforme mostrado na Figura 3.
[00144] A curva 145, então, mostra, a partir do primeiro momento t1, uma diminuição no valor do primeiro indicador Ind1n,n+m para alcançar um valor mínimo menor que 0,1. A curva 145, então, mostra, a partir do segundo momento t2A, um aumento rápido no valor do primeiro indicador Ind1n,n+m até que o valor se estabilize a cerca de 0,8.
[00145] A fase entre o primeiro e o segundo momentos t1, t2A, também chamada primeira fase, durante a qual o valor do primeiro indicador Ind1n,n+m é baixo, corresponde a uma correlação baixa entre as imagens de transmissão capturadas de modo sucessivo. De fato, isso se deve a uma mudança significativa no padrão de difração de uma imagem para a outra durante a primeira fase, devido ao movimento das partículas suspensas em um líquido 12, no espaço que corresponde à região de interesse 142.
[00146] O início de fase no segundo momento t2A e até o final da caracterização, também chamado segundo fase, corresponde a um inchaço das partículas em um líquido 12, que equivale a um aumento na correlação entre as imagens sucessivas.
[00147] O software de caracterização 40, então, determina, do primeiro indicador populado Ind1n,n+m, o intervalo de tempo entre o momento inicial t0 e o momento t2A no qual o primeiro indicador novamente tem valores de correlação aumentados. O intervalo de tempo entre o momento original t0 e o segundo momento t2A também é chamado tempo de coagulação Tc. Na modalidade exemplificativa da Figura 11, o tempo de coagulação Tc é aproximadamente igual a 29 s.
[00148] O software de caracterização 40 também determina a coagulação de partículas sanguíneas do primeiro indicador populado Ind1n,n+m. O tempo de coagulação T, por exemplo, corresponde ao espaço de tempo entre o momento inicial t0 (t = 0 na curva 145 na Figura 11) e o momento de coagulação, que caracteriza a coagulação sanguínea.
[00149] Esse momento de coagulação, por exemplo, corresponde a um ponto em que a curva 145 alcança um patamar, além do qual os valores do primeiro indicador Ind1n,n+m praticamente não evoluem mais (segundo momento t2A). Então, será entendido que esse momento de coagulação t2A também pode ser determinado a partir do derivativo da função de tempo que descreve a evolução do primeiro indicador Ind1n,n+m, por exemplo, quando o último cai abaixo de certo limite.
[00150] Alternativamente, esse momento de regulação é determinado a partir do segundo derivativo daquela função. A partir segundo derivativo, é possível situar um ponto de inflexão 146 da curva 145. O momento t2A que corresponde àquele ponto de inflexão 146 é, então, por exemplo, usado para determinar i momento de coagulação.
[00151] Na modalidade exemplificativa da Figura 11, uma tangente 147 à curva 145 que passa através do dito ponto de inflexão 146 é desenhada. O momento de coagulação, então, corresponde à abscissa na qual a dita tangente 147 cruza a linha de base da dita curva (segundo momento t2A) ou a abscissa na qual a dita tangente 147 cruza o eixo geométrico (terceiro momento t2B). Uma linha de base se refere à porção da curva, substancialmente plana, precedendo o aumento acentuado no valor do primeiro indicador Ind1n,n+m. No exemplo ilustrado, a linha de base corresponde à porção da curva 145 da qual as abscissas são compreendidas entre aproximadamente 15 segundos e 28 segundos (segundo momento t2A).
[00152] Conforme previamente indicado, o tempo de coagulação T é obtido por uma diferença entre o momento de coagulação t2A, t2B e o momento inicial t0, escolhido na origem do eixo geométrico x da curva 145.
[00153] O sistema de caracterização 10 e o método de caracterização de acordo com a invenção, portanto, tornam possível caracterizar a variação da velocidade das partículas contidas no líquido 12 sobre uma grande porção dos canais de circulação 28 da câmara de fluido devido à distância pequena entre a câmara de fluido 14 e o fotodetector 20.
[00154] Na modalidade exemplificativa da Figura 11, o sistema de caracterização 10 e o método de caracterização de acordo com a invenção tornam possível caracterizar uma redução das partículas detectando-se um aumento na correlação entre as imagens sucessivas.
[00155] Uma pessoa versada na técnica irá entender que o sistema de caracterização 10 e o método de caracterização de acordo com a invenção tornam possível, de modo similar, caracterizar uma aceleração das partículas detectando-se uma diminuição na correlação entre as imagens sucessivas.
[00156] A segunda distância D2 menor que 1 cm entre a câmara de fluido 14 e o fotodetector 20 também torna possível limitar a massa do sistema de caracterização 10.
[00157] Adicionalmente, o escopo significante do feixe luminoso 18 ao longo do plano P, isto é, maior que 5 mm2 e, por exemplo, compreendido entre 5 mm2 e 200 mm2, torna possível limitar o aquecimento do líquido 12 contido na câmara de fluido 14. De fato, a área de superfície significante do feixe luminoso 18 torna possível ter uma densidade óptica com uma potência baixa.
[00158] Além disso, com o uso de um feixe luminoso estendido e que forma uma imagem da distância pequena da câmara torna possível examinar um volume ainda maior de fluido. A influência de fenômenos locais com capacidade para se tornar predominantes quando o feixe luminoso for menor é, então, eliminada e o volume de fluido analisado é praticamente único. Mediante a análise de correlação entre duas imagens de transmissão In, In+m torna-se possível levar em consideração a estrutura espacial da coagulação, no plano do canal microfluídico 28. Em outras palavras, a evolução da coagulação do sangue é observada em duas dimensões.
[00159] As Figuras 12 a 17 ilustram uma segunda modalidade para a qual os elementos similares à primeira modalidade previamente descrita são identificados com o uso de referências idênticas e não são descritos novamente.
[00160] De acordo com a segunda modalidade, o sistema de caracterização 10 é projetado mais particularmente para caracterizar a aglomeração de partículas contidas em um líquido 12. O sistema de caracterização 10 tem, por exemplo, capacidade para caracterizar a aglomeração de partículas sanguíneas, como eritrócitos, também chamada aglutinação de partículas sanguíneas.
[00161] Então, as informações relativas ao grupo sanguíneo também são determinadas a partir do estado de aglomeração, também chamado estado de aglutinação.
[00162] Conforme conhecido por si só, o grupo sanguíneo pode ser determinado com o uso do teste Beth-Vincent detectando-se a presença de antígenos A ou B implicando a ausência de anticorpos anti-A ou anti-B. No caso em que os eritrócitos do sangue testado têm um antígeno A ou B, um antígeno-anticorpo complexo será formado e levará a uma agregação celular conforme lembrado na tabela 200, mostrado na Figura 12.
[00163] A câmara de fluido 14 inclui dois canais de circulação separados 202, 204, isto é, um primeiro canal 202 e um segundo canal 204, conforme mostrado na Figura 13.
[00164] De acordo com a segunda modalidade, a fonte de luz 16 é qualquer tipo de fonte de luz. O laser 16 não é necessariamente espacial e temporalmente coerente.
[00165] De acordo com a segunda modalidade, o segundo software de cálculo 38 tem capacidade para calcular o segundo indicador Ind2 com capacidade para caracterizar a aglomeração das partículas, o segundo indicador Ind2 tem um indicador de intensidade para cada imagem capturada In(x,y). O segundo indicador Ind2 é representativo do histograma da intensidade de cada pixel na imagem In, ou em uma região de interesse do mesmo. É determinado, por exemplo, medindo-se a intensidade total da imagem In ou em uma região predeterminada de interesse da imagem In, opcionalmente após operação de limiar.
[00166] O software de caracterização 40 é o próximo com capacidade para determinar um estado de aglomeração das partículas do líquido 12 proveniente do segundo indicador calculado Ind2. O estado de aglomeração é, por exemplo, determinado quando o segundo indicador Ind2 excede um limiar predeterminado.
[00167] Na modalidade descrita, quando o líquido 12 contém sangue, as partículas são, por exemplo, eritrócitos e o software de caracterização tem, então, a capacidade para determinar informações referentes ao grupo sanguíneo proveniente do estado de aglomeração.
[00168] A operação da segunda modalidade será agora descrita com o uso das figuras 13 a 17.
[00169] Durante a etapa inicial 100, o líquido 12, por exemplo, uma amostra de sangue de um doador do qual se deseja determinar o grupo sanguíneo, é introduzida na área de depósito 26 da câmara de fluido. O líquido 12, então, flui da área de depósito 26 em direção aos canais de circulação 202, 204, por exemplo, por capilaridade.
[00170] O líquido 12 é, então, misturado com o primeiro 206 e o segundo 208 reagentes distantes, durante a etapa 110, conforme mostrado na figura 13.
[00171] Cada reagente 206, 208 é, por exemplo, depositado a montante da área de detecção óptica que corresponde à área dentro das linhas pontilhadas na figura 13 para a qual uma imagem for capturada pelo fotodetector 20.
[00172] A mistura entre o líquido 12 e o primeiro e o segundo reagentes 206, 208 é feita quando o líquido 12 flui em contato com o primeiro reagente 206 dentro do primeiro canal 202 (seta F2) e respectivamente o segundo reagente 208 dentro do segundo canal 204 (seta F3).
[00173] Na modalidade descrita, o primeiro reagente 206 é um soro do doador A, isto é, que contém anticorpos anti-B e o segundo reagente 208 é um soro do doador B, isto é, que contém anticorpos anti-A.
[00174] Dependendo do grupo sanguíneo associado à amostra de sangue 12, uma agregação celular irá ou não ocorrer, então, em cada um dos canais de circulação 202, 204.
[00175] O líquido 12, tal como a amostra de sangue misturada com o primeiro e o segundo reagentes 206, 208, é, então, iluminada pelo feixe luminoso 18 durante a etapa 120.
[00176] Durante a etapa 130, o fotodetector de matriz 20, então, captura uma imagem de transmissão I (x,y) que corresponde a uma área de detecção óptica que engloba os dois canais de circulação 202, 204.
[00177] Uma pessoa versada na técnica observará que, de acordo com a segunda modalidade, a captura de uma única imagem de transmissão I (x,y) torna possível caracterizar a aglomeração das partículas contidas no líquido 12, mediante a comparação daquela imagem com uma imagem de referência Iref (x,y), a última, por exemplo, sendo uma imagem feita sobre uma área de referência, não mostrada, na qual o sangue não é misturado com o reagente. Essa área de referência é, por exemplo, um terceiro canal, com uma geometria idêntica àquela do primeiro ou segundo canal 202, 204 e que não inclui qualquer reagente.
[00178] Alternativamente, isso é uma área situada no primeiro canal 202 ou no segundo canal 204, a montante do reagente 206, 208.
[00179] Alternativamente, a imagem de referência Iref (x,y) é produzida no mesmo local que a imagem de transmissão, logo após encher o canal pelo líquido analisado, a imagem de transmissão I (x,y) sendo feita, sob as mesmas condições, após um certo tempo, por exemplo, 1 minuto, de modo que qualquer efeito do reagente no líquido analisado é mensurável.
[00180] A imagem capturada I (x,y) corresponde similarmente à difração e à difusão do feixe luminoso 18 pelas partículas suspensas em um líquido 12. De preferência, essa imagem é feita sob condições idênticas para os dois canais, assim como para a área de referência. Para condições idênticas, faz-se referência particular às condições de iluminação, à distância fonte-detector, às características do detector usado, ao tempo de colocação, ao campo observado e ao tamanho da imagem.
[00181] A iluminação das partículas pelo feixe luminoso 18 cria um padrão de difração. Conforme indicado anteriormente, a ausência de uma lente de aumento entre o fluido e o fotodetector 20, acoplado com a superfície significante do feixe incidente, torna possível formar uma imagem usável a uma curta distância, que cobre um largo campo fluido, tal como um campo que tem uma área de vários milímetros quadrados.
[00182] Durante a etapa de captura 130, o fotodetector 20 é colocado próximo à câmara de fluido 14, a segunda distância D2 entre a câmara de fluido 14 e o fotodetector 20 na direção longitudinal X sendo menor do que 1 cm.
[00183] Na modalidade exemplificativa da figura 14, que mostra uma imagem capturada 210 do primeiro canal 202 e respectivamente uma imagem capturada 212 do segundo canal 204, a agregação celular é observada apenas no segundo canal 204 através da presença de manchas brancas na imagem 212. Em outras palavras, o grupo sanguíneo associado com a amostra de sangue testada é do grupo B de acordo com a tabela 200 da figura 12.
[00184] Ao final da etapa de captura 130, o segundo software de cálculo 38 calcula, durante a etapa 140, o segundo indicador Ind2 apto a caracterizar a aglomeração das partículas, o segundo indicador Ind2 que tem um indicador de intensidade para cada imagem capturada I (x,y). O segundo indicador Ind2 é representativo da intensidade na região predeterminada de interesse da imagem, em particular a distribuição da intensidade dos pixels na dita região region.
[00185] O segundo indicador Ind2 é, por exemplo, uma característica da imagem e em particular do histograma do nível cinza da imagem capturada proveniente de cada canal 202, 204 e, caso aplicável, o canal de referência conforme ilustrado nas figuras 16 e 17, que mostra um histograma 214 do nível cinza da capturada do primeiro canal 202 e respectivamente um histograma 216 do nível cinza da capturada do segundo canal 204. Cada histograma de nível cinza 214, 216 tem os valores de nível cinza no eixo geométrico x e a população de pixels no eixo geométrico y, isto é, a quantidade de pixels, para um nível cinza dado no eixo geométrico x. Uma característica do histograma é, por exemplo, a principal intensidade dos pixels, denotada em Imédia, após a operação de limiar da imagem, essa operação de limiar torna possível manter apenas a informação para os pixels nos quais a intensidade está acima de um certo limiar.
[00186] Em referência ao exemplo mostrado nas figuras 16 e 17, após ter realizado a operação de limiar na intensidade que corresponde ao valor 120, entende-se que a intensidade principal da imagem que corresponde à figura 17 é mais alta do que a intensidade principal da imagem que corresponde à figura 16. Isso se dá devido ao fato de que o histograma da figura 17, que mostra a observação de uma angulação de partículas, compreende pixels mais intensos (níveis cinzas mais altos que 200) que o histograma da figura 16, o último mostrando a observação de uma não-aglutinação. O segundo indicador Ind2 é então, por exemplo, estabelecido de acordo com a intensidade principal da imagem.
[00187] De acordo com uma alternativa, determina-se, para cada imagem produzida, a intensidade Imáx, a última que corresponde, no histograma da imagem, ao valor mais alto da intensidade que traz junto uma quantidade predeterminada de pixels, por exemplo, 500 pixels. Determina-se, então, o desvio entre Imáx e Imédia, pela subtração Imáx-Imédia, o segundo indicador Ind2 que, então, representa esse desvio. No histograma da figura 17, o segundo indicador Ind2 assim definido é mais alto que no histograma da figura 16. O valor do segundo indicador Ind2 assim determinado torna possível concluir sobre a presença ou ausência de um fenômeno de aglutinação através de uma comparação, por exemplo, com um valor Ind2ref obtido em uma área de referência ou com um valor predeterminado, a predeterminação desse valor, por exemplo, deve ser feita de acordo com testes experimentais.
[00188] De acordo com uma alternativa, em cada imagem de transmissão, a intensidade Ipico que corresponde ao valor máximo do histograma é determinada, isto é, o valor de intensidade que traz junto a quantidade mais alta de pixels. Nas figuras 16 e 17, esse valor corresponde ao pico de cada distribuição, respectivamente igual a 120 e 130. Também se determina o valor máximo Imáx que traz junto uma quantidade de pixels com um valor acima de um limiar predeterminado. Em referência às figuras 16 e 17 e pela adoção de um limiar de 500, Imáx é respectivamente igual a 181 e 256. O segundo indicador Ind2 corresponde à distância entre Imáx e Ipico, 61 para a figura 16 e 126 para a figura 17, respectivamente. Conclui-se sobre uma aglutinação quando o segundo indicador Ind2 é mais alto, por exemplo, em 25%, que um certo limiar predeterminado ou quando é mais alto que o indicador Ind2ref estabelecido para a área de referência.
[00189] De acordo com uma alternativa, o segundo indicador Ind2 é um indicador de comparação entre uma região de interesse da imagem de transmissão I e uma imagem de referência Iref que não contém reagente (e, portanto, na qual a aglutinação não ocorre), conforme abaixo:
Figure img0013
[00190] O segundo indicador Ind2 é comparado com um limiar predeterminado, por exemplo, 0,25. Assim, caso o segundo indicador Ind2 esteja acima desse limiar, uma aglutinação é encontrada.
[00191] O software de caracterização 40 tem capacidade para, então, determinar um estado de aglomeração das partículas do líquido 12 a partir do segundo indicador calculado Ind2.
[00192] O estado de aglomeração é, por exemplo, determinado quando o segundo indicador Ind2 excede um limiar predeterminado.
[00193] Caso a comparação seja positiva, isto é, caso o nível cinza obtido seja maior que o limiar predeterminado, então, o software de caracterização 40 deduz a presença de uma agregação celular no canal correspondente 202, 204.
[00194] Na segunda modalidade descrita, o software de caracterização 40 determina por último o grupo sanguíneo associado à amostra de sangue 12 testada a partir do tipo das primeira e segunda região 206, 208, assim como da tabela 200.
[00195] A vantagem dessa segunda modalidade é idêntica àquelas da primeira modalidade descrita anteriormente.
[00196] Como um complemento à primeira modalidade, a câmara de fluido 14 inclui uma pluralidade de canais, por exemplo, os dois canais 202, 204 visíveis na figura 13, para caracterizar a variação da velocidade das partículas do líquido 12 quando o líquido 12 é misturado com diferentes reagentes, um reagente respectivo sendo posicionado em cada canal 202, 204 da câmara de fluido 14. Isso torna possível, com um mesmo dispositivo, determinar diferentes parâmetros de análise da mesma amostra líquida, por exemplo, o tempo de coagulação e o grupo sanguíneo.
[00197] Tal câmara de fluido 14 é, por exemplo, vantajosa para caracterizar a coagulação do líquido 12 que contém sangue, com diferentes reagentes com capacidade para favorecer a redução das partículas sanguíneas através de uma coagulação do sangue, tais como os diferentes reagentes 112 definidos acima.
[00198] Pode-se observar que o sistema de caracterização 10 de acordo com a invenção torna possível observar uma parte maior da câmara de fluido 14, sendo que tem uma massa limitada.
[00199] As figuras 18 e 29 ilustram um segundo exemplo da segunda modalidade, na qual o líquido a ser caracterizado 12 é um líquido biológico, em particular sangue ou sangue diluído, e o sistema de caracterização 10 tem capacidade para caracterizar a aglomeração de partículas, nesse caso eritrócitos, no líquido biológico 12.
[00200] O líquido a ser caracterizado 12 nesse exemplo inclui sangue diluído a 1/20 em um tampão PBS (salino tamponado com fosfato), sendo que o tampão inclui 1% em volume de FBS (soro bovino fetal).
[00201] O volume de sangue diluído é 40 μl, ao qual uma quantidade variável de anticorpos é adicionada, tal como um antieritrócito denominado CD235A, por exemplo, comercializado pela empresa Becton Dickinson sob a referência BD 555569. A quantidade de anticorpos adicionados varia de 0 a 1 μg de anticorpos por μl de sangue não diluído, que corresponde a uma concentração compreendida entre 0 e 6.7 μM.
[00202] A adição desses anticorpos torna possível mascarar os antígenos de superfície dos eritrócitos (em particular, glicoforina A), que causa a aglutinação dos mesmos.
[00203] O objetivo desse segundo exemplo é mostrar que é possível caracterizar um estado de aglutinação de partículas sanguíneas, por exemplo, eritrócitos, por formação de imagem sem lente com o uso do sistema de caracterização 10.
[00204] Para cada quantidade de anticorpos adicionados no líquido a ser caracterizado 12, a amostra líquida a ser caracterizada 12 é obtida com o uso do sistema de caracterização 10, isto é, pela formação de imagem sem lente, as imagens obtidas 220A, 220B, 220C e 220D estando visíveis nas figuras 18 a 21. Um histograma em escala de cinza da intensidade dos pixels de cada uma dessas imagens 220A, 220B, 220C e 220D é, então, calculado, os histogramas calculados 222A, 222B, 222C e 222D estando visíveis nas figuras 22 a 25. As imagens de referência 224A, 224B, 224C e 224D da amostra líquida a ser caracterizada 12 também são obtidas com um microscópio, conforme mostrado nas figuras 26 a 29. Deve ser percebido que, para observação microscópica, a amostra de sangue é diluída com um fator de diluição de 1/10.
[00205] No segundo exemplo, a fonte de luz 16 é um diodo laser, que em um espectro de emissão centralizado em um comprimento de onda À, por exemplo, igual a 670 nm, e a primeira distância D1 é substancialmente igual a 8 cm. A amostra é confinada na câmara de fluido 14 que inclui um canal 28 com uma espessura de 150 μm formada entre duas paredes transparentes com uma espessura de 200 μm. Essas paredes são feitas de um material plástico, por exemplo, de COP (polímero de ciclo- olefina).
[00206] A câmara de fluido 14 é colocada diretamente na capa de vidro do fotodetector de matriz 20, tal como um sensor de sensor CMOS, que inclui pixels 1280 * 1024, cada pixel tendo o tamanho de 5 μm x 5 μm, de modo que a câmara de fluido 14 esteja posicionada entre o sensor CMOS e a fonte de luz 16. A segunda distância D2 é, então, preferencialmente menor do que 1 cm, por exemplo, igual a 550 μm.
[00207] As capturas de imagem são feitas, por exemplo, com um tempo de exposição de 5 ms, com uma imagem por captura. As imagens 220A, 220B, 220C e 220D correspondem respectivamente a uma quantidade adicionada crescente de anticorpos. Mais especificamente, as imagens 220A, 220B, 220C e 220D respectivamente correspondem a:
[00208] - uma quantidade de anticorpos substancialmente zero,
[00209] - uma quantidade de anticorpos abaixo de uma concentração limiar C,
[00210] - uma quantidade de anticorpos igual à concentração limiar C, e
[00211] - uma quantidade de anticorpos igual a 2 vezes a concentração limiar C.
[00212] Quando a quantidade de anticorpos adicionados excede a concentração limiar C, os eritrócitos se aglomeram e as imagens obtidas por formação de imagem sem lente com o uso do sistema de caracterização 10 refletem o tamanho dos aglutinados. O valor da concentração limiar C é, por exemplo, igual a 250 ng de anticorpos para 1 μl de sangue não diluído, o que corresponde a 1.7 μM.
[00213] Esses resultados em uma evolução do histograma de cada imagem, o último tendendo a se esticar em direção aos valores baixos de nível cinza conforme a quantidade de aglomerados aumenta, conforme mostrado a partir do histograma 222A que corresponde à imagem 220A em direção ao histograma 222D que corresponde à imagem 220D.
[00214] O estado de aglutinação da amostra de sangue é, então, quantificado pelo cálculo do segundo indicador Ind2 de acordo com várias alternativas possíveis:
[00215] - de acordo com uma primeira alternativa, o segundo indicador Ind2 é igual ao desvio padrão da distribuição de intensidade dos pixels da área de interesse examinada e é, então, denotado Ind2A,
[00216] - de acordo com uma segunda alternativa, o segundo indicador Ind2 é igual à quantidade de pixels abaixo de um certo limiar, esse limiar, por exemplo, sendo uma fração do nível cinza máximo, dividido pela quantidade total de pixels na área de interesse examinada e o segundo indicador Ind2 calculado de acordo com essa segunda alternativa é, então, denotado Ind2B. No exemplo das figuras 22 a 25, o valor de limiar é igual a 125.
[00217] A Tabela 1 abaixo mostra o valor do segundo indicador Ind2 de acordo com essas duas alternativas e para cada uma das áreas de interesse mostradas nas figuras 18 a 21.
Figure img0014
[00218] Quand o o segundo indicador Ind2A de acordo com a primeira alternativa está abaixo de um valor de limiar, por exemplo, compreendido entre 40 e 45, não há aglutinação observável. Além desse valor de limiar, quanto maior o valor do segundo indicador Ind2A, maior a quantidade de partículas aglutinadas.
[00219] O segundo indicador Ind2B, calculado de acordo com a segunda alternativa, torna possível chegar às mesmas conclusões, tomando um valor de limiar compreendido entre 1 10-2 e 5 10-2.
[00220] Pode-se observar que é possível observar, ou mesmo quantificar, um estado de aglutinação de partículas no líquido biológico 12, com o uso de um indicador calculado a partir de uma imagem obtida pelo sistema de caracterização 10, isto é, por formação de imagem sem lente, e em particular o segundo indicador Ind2A, Ind2B, de acordo com as primeira e segunda alternativas desse exemplo, o dito segundo indicador dependendo da distribuição da intensidade dos pixels das imagens 220A, 220B, 220C e 220D capturadas pelo sistema de caracterização 10.
[00221] O sistema de caracterização 10 também pode ser usado em um teste de diagnóstico baseado na detecção de aglutinados em um fluido biológico.
[00222] As figuras 30 a 45 ilustram um terceiro exemplo da segunda modalidade, na qual o líquido a ser caracterizado 12 é um líquido biológico, em particular sangue ou sangue diluído, e o sistema de caracterização 10 tem capacidade para caracterizar a aglomeração, também denominada de aglutinação, de partículas no líquido biológico 12.
[00223] Nesse terceiro exemplo, a detecção da aglutinação de eritrócitos em uma amostra de sangue é mostrada, que inclui uma quantidade variável de proteína A, a aglutinação sendo causada pela adição de uma quantidade dada de um reagente (um anticorpo).
[00224] O líquido a ser caracterizado 12, por exemplo, inclui sangue diluído a 1/20 em um tampão PBS (salino tamponado com fosfato), sendo que o tampão inclui 1% em volume de FBS (soro bovino fetal).
[00225] O volume de sangue diluído é 40 μl, para o qual um anticorpo é incubado, tal como um antieritrócito denominado CD235A, por exemplo, comercializado pela empresa Becton Dickinson sob a referência BD 555569, com uma solução de proteína A em uma quantidade variável. A duração da incubação é de 1 hora.
[00226] Assim, existem vários dos denominados anticorpos - soluções de proteína A disponíveis, nas quais o anticorpo - razão molar de proteína A é variável. As soluções podem causar a aglutinação de eritrócitos, o que resulta no nome "soluções pró-equipamento". Um volume de 1,2 μl de cada uma dessas soluções é incubada com 40 μl de amostra de sangue diluída descrita acima, por 1,5 hora, cada uma dessas misturas formando uma amostra líquida a ser caracterizada 12.
[00227] Em cada uma das misturas assim obtidas, a concentração de anticorpo molecular S está abaixo do limiar C determinado no segundo exemplo anterior. Em outras palavras, essa concentração de anticorpo não permite a aglutinação espontânea de eritrócitos. No presente caso, essa concentração S é de 100 ng de anticorpos por μl de sangue não diluído, isto é, 0,7 μM.
[00228] Para cada uma das amostras líquidas a ser caracterizada 12, uma captura de imagem é feita com o uso do sistema de caracterização 10, isto é, por formação de imagem sem lente, as imagens capturadas 230A, 230B, 230C, 230D e 230E obtidas sendo mostradas nas figuras 30 a 34. Um histograma em escala de cinza da intensidade dos pixels de cada uma dessas imagens 230A, 230B, 230C, 230D e 230E é, então, calculado, sendo que os histogramas calculados 232A, 232B, 232C, 232D e 232E sendo mostrados nas figuras 35 a 39. As imagens de referência 234A, 234B, 234C, 234D e 234E de cada uma das amostras líquidas a ser caracterizada 12 também são obtidas com um microscópio, conforme mostrado nas figuras 40 a 44. Deve ser constatado que, para observação microscópica, a amostra de sangue é diluída com um fator de diluição de 1/10.
[00229] Nesse terceiro exemplo, a fonte de luz 16 é um diodo laser, que tem um espectro de emissão centrado em um comprimento de onda À igual a 670 nm e a primeira distância D1 é substancialmente igual a 8 cm. A amostra é confinada na câmara de fluido 14 que inclui um canal 28 com uma espessura de 150 μm formada entre duas paredes transparentes com uma espessura de 200 μm. Essas paredes são feitas de um material plástico, por exemplo, COP (polímero ciclo-olefina).
[00230] A câmara de fluido 14 é diretamente colocada sobre a capa de vidro do fotodetector de matriz 20, tal como um sensor CMOS. O sensor CMOS, por exemplo, tem uma matriz de 1280 por 1024 pixels, cada pixel estando no formato de um quadrado, cada lado medindo 5 μm, de modo que a câmara de fluido 14 é posicionada entre o sensor CMOS e a fonte de luz 16. A segunda distância D2 é, então, preferencialmente menor do que 1 cm, por exemplo, igual a 550 μm.
[00231] As capturas de imagem são, por exemplo, feitas com um tempo de exposição de 5 ms, com uma imagem por captura. As imagens 230A, 230B, 230C, 230D e 230E respectivamente correspondem a uma quantidade adicionada crescente de proteína A. Mais especificamente, as imagens 230A, 230B, 230C, 230D e 230E respectivamente correspondem a:
[00232] - ausência de anticorpos, isto é, um Anticorpo : razão molar de proteína A = 0 : 40 (0 moléculas de anticorpo por 40 moléculas de proteína A),
[00233] - ausência de proteína A, isto é, um Anticorpo - razão molar de proteína A = 1 : 0 (1 molécula de anticorpo para 0 moléculas de proteína A),
[00234] - Anticorpo : razão molar de proteína A = 1 : 1 (1 molécula de anticorpo por 1 molécula de proteína A),
[00235] - Anticorpo : razão molar de proteína A = 1 : 5 (1 molécula de anticorpo por 5 moléculas de proteína A), e
[00236] - Anticorpo : razão molar de proteína A = 1 : 40 (1 molécula de anticorpo por 40 moléculas de proteína A).
[00237] O anticorpo aqui serve como um agente de ligação entre uma molécula de proteína A e um eritrócito, conforme será delineado mais adiante.
[00238] Na presença de proteína A e na ausência de anticorpos, nenhuma aglutinação de eritrócito é observada, conforme mostrado na figura 30. Na presença de anticorpos e na ausência de proteína A, nenhuma aglutinação de eritrócito é observada, o que é mostrado na figura 31.
[00239] Quando a razão anticorpo: proteína A é igual a 1 : 1, nenhuma aglutinação de eritrócito é observada, conforme mostrado na figura 32.
[00240] Quando a razão anticorpo: proteína A é igual a 1 : 5, a aglutinação de eritrócito é observada, mostrado na figura 33. Quando a razão anticorpo : proteína A é igual a 1 : 40, a aglutinação de eritrócito também é observada, mostrado na figura 34, o tamanho dos aglutinados observados na figura 34 sendo maiores que aqueles dos aglutinados observados na figura 33.
[00241] As figuras 35 a 39 mostram o histograma da intensidade dos pixels das figuras 30 a 34, respectivamente.
[00242] Pode ser visto que a aglomeração de eritrócitos causa a aparição de áreas claras (alto nível cinza) delimitadas por uma área escura (baixo nível cinza). Esse efeito de segmentação de imagem nas áreas incluindo várias dezenas ou centenas de pixels de níveis cinzas comparáveis, pode ser observado pela comparação das imagens 230A (figura 30) ou 230B (figura 31) ou 230C (figura 32), nas quais nenhuma aglutinação é observada, com as imagens 230D (figura 33) e 230E (figura 34), nas quais a aglutinação é observada. A presença ou ausência de uma aglutinação de partículas observável nas imagens 230A, 230B, 230C, 230D e 230E é confirmada por observações microscópicas mostrada nas imagens 234A (figura 40), 234B (figura 41), 234C (figura 42), 234D (figura 43) e 234E (figura 44), respectivamente. Isso resulta em uma evolução do histograma de cada imagem, a última tendendo a se esticar em direção a valores baixos de nível cinza conforme a quantidade de aglomerados aumenta, conforme mostrado a partir do histograma 232A que corresponde à imagem 230A em direção ao histograma 232E que corresponde à imagem 230E. O estado de aglutinação da amostra de sangue é, então, quantificado pelo cálculo do segundo indicador Ind2 de acordo com várias alternativas possíveis:
[00243] - de acordo com uma primeira alternativa, o segundo indicador Ind2 é igual ao desvio padrão da distribuição de intensidade dos pixels da área de interesse examinada e é, então, denotado Ind2A,
[00244] - de acordo com uma segunda alternativa, o segundo indicador Ind2 é igual à quantidade de pixels abaixo de um certo limiar, esse limiar, por exemplo, sendo uma fração do nível cinza máximo, dividido pela quantidade total de pixels na área de interesse examinada e o segundo indicador Ind2 calculado de acordo com essa segunda alternativa é, então, denotado Ind2B. No exemplo das figuras 22 a 25, o valor de limiar é igual a 125.
[00245] A tabela 2 abaixo mostra o valor do segundo indicador Ind2 de acordo com essas duas alternativas e para cada uma das áreas de interesse mostradas nas figuras 30 a 34.
Figure img0015
[00246] Quando o segundo indicador Ind2A de acordo com a primeira alternativa está abaixo de um valor de limiar, por exemplo, compreendido entre 40 e 45, não há aglutinação observável. Além desse valor de limiar, quanto mais alto o valor do segundo indicador Ind2A, maior a quantidade de partículas aglutinadas.
[00247] O segundo indicador Ind2B, calculado de acordo com a segunda alternativa, torna possível chegar às mesmas conclusões, com o uso de um valor de limiar compreendido entre 1 10-2 e 5 10-2.
[00248] Pode-se observar assim que é possível observar, ou mesmo quantificar, um estado de aglutinação de partículas no líquido biológico 12, com o uso de um indicador calculado a partir de uma imagem obtida pelo sistema de caracterização 10, isto é, por formação de imagem sem lente e em particular o segundo indicador Ind2A, Ind2B, de acordo com as primeira e segunda alternativas desse exemplo, o que depende da distribuição da intensidade dos pixels das imagens 230A, 230B, 230C, 230D e 230E capturadas pelo sistema de caracterização 10.
[00249] Adicionalmente, quanto maior a quantidade de proteína A, maior o tamanho dos aglutinados, a quantidade de anticorpos adicionados sendo constante. Assim, o segundo indicador Ind2A, Ind2B que quantifica o estado de aglutinação também pode quantificar a quantidade de proteína na amostra de sangue.
[00250] Dependendo da razão molar anticorpo-proteína A, os eritrócitos se aglomeram e as imagens 230A, 230B, 230C, 230D e 230E obtidas por formação de imagem sem lente refletem o tamanho dos aglutinados, isto é, o grau de aglutinação. Entende-se, então, que pela introdução de uma quantidade predeterminada de anticorpos na amostra de sangue, é possível estimar a quantidade de proteína A presente na amostra de acordo com o estado de aglutinação, isto é, de acordo com o segundo indicador Ind2A, Ind2B descrito anteriormente.
[00251] Em outras palavras, a quantidade de proteína A além da qual a aglutinação é observada constitui o limite de detecção para ensaiar a proteína em uma amostra de sangue, pela introdução de uma quantidade dada de anticorpos na amostra líquida a ser caracterizada 12.
[00252] Assim, será entendido que é possível observar, ou mesmo quantificar, um estado de aglutinação de partículas em um fluido biológico, com o uso de indicadores relativos à imagem obtida por formação de imagem sem lente, e em particular o segundo indicador Ind2A, Ind2B, de acordo com as primeira e segunda alternativas desse segundo exemplo, o que depende da distribuição da intensidade dos pixels. Esse estado de aglutinação, por exemplo, depende da concentração de um analito no líquido biológico, a quantificação do estado de aglutinação, então, torna possível ensaiar o analito no líquido. O exemplo mostra que o ensaio pode ser feito pela introdução de um reagente bifuncional, nesse caso o anticorpo 300, em uma amostra de sangue, capaz de se ligar tanto a uma partícula no fluido biológico, nesse caso os eritrócitos 302, e ao analito a ser ensaiado, nesse caso a proteína A 304, que forma, desse modo, uma ponte entre um analito 304 e os eritrócitos 302, conforme mostrado na figura 45.
[00253] O termo bifuncional designa a habilidade do reagente a se ligar tanto a uma partícula quanto a um analito.
[00254] Em geral, o termo "analito" se refere a uma espécie química ou biológica presente no líquido, tal como uma molécula, uma macromolécula (por exemplo, proteína ou ácido nucleico), uma célula, uma bactéria, um vírus ou esporo.
[00255] Adicionalmente, o analito 304 deve incluir pelo menos duas áreas de ligação com o reagente bifuncional, conforme mostrado na figura 45. Assim, cada analito 304 pode ser ligado, através do reagente bifuncional, a pelo menos duas partículas. Isso causa aglutinação das partículas.
[00256] Em outras palavras, o estado de aglutinação das partículas no líquido 12 depende da quantidade de analito presente no líquido 12, quantidade que deve ser ensaiada para adicionar um reagente capaz de causar a formação de aglutinados, o reagente 300 que, então, é capas de se ligar entre uma das ditas partículas 302 e um analito 304 de modo a formar um aglutinado.
[00257] Conforme uma função da quantidade de analito 304 presente no líquido, um aglutinado é formado, feito de partículas 302 e analitos 304. Pela determinação do estado de aglutinação que corresponde à quantidade dada de reagente introduzido, é possível, então, estimar a quantidade de analito 304 presente no líquido 12.
[00258] No segundo e terceiro exemplos da segunda modalidade, descritos anteriormente, a segunda distância D2 é menor do que 1 cm. Os inventores, não obstante, também observaram que, no caso da caracterização de aglutinação, os valores da segunda distância D2 maiores que 1 cm, tais como valores de vários centímetros, ou mesmo várias centenas de centímetros, de fato, tornam possível obter resultados utilizáveis, embora valores da segunda distância D2 abaixo de 1 cm continuem preferíveis.
[00259] Em geral, esses segundo e terceiro exemplos demonstram outro aspecto da invenção. De acordo com esse outro aspecto, a invenção refere-se a um método para caracterizar a aglutinação de partículas, tais como partículas biológicas, em um líquido, por exemplo, um líquido biológico, e em particular um fluido corporal, o método de caracterização que inclui as seguintes etapas:
[00260] - introduzir líquido em uma câmara de fluido,
[00261] - iluminar a câmara de fluido com o uso de um feixe luminoso, o feixe luminoso que em particular vem de uma fonte de luz, tal como um diodo laser ou um diodo emissor de luz,
[00262] - capturar uma imagem ou uma pluralidade de imagens, da câmara de fluido com o uso de um fotodetector de matriz, sendo que o fotodetector está, de preferência, colocado a uma distância da câmara de fluido de menos de 1 cm, a câmara de fluido estando posicionada entre a fonte de luz e o fotodetector de matriz.
[00263] - processar a imagem ou a pluralidade de imagens, para determinar um indicador que caracteriza a aglutinação de partículas no líquido biológico, e
[00264] - caracterizar a aglutinação de partículas no líquido, dependendo do valor do indicador.
[00265] Deve ser constatado que a imagem for capturada pelo fotodetector, de preferência, sem uma lente de ampliação entre a câmara de fluido e o fotodetector de matriz. Entretanto, microlentes objetivas podem ser fornecidas a cada pixel do detector, conforme dito anteriormente.
[00266] Adicionalmente e opcionalmente, o indicador é um indicador que representa a distribuição da intensidade dos pixels em uma imagem ou, mais geralmente, qualquer outro indicador que translada a segmentação da imagem em diferentes áreas, Cada área incluindo de várias dezenas a centenas de pixels de intensidade comparável, isto é, em que a intensidade é distribuída em uma faixa de níveis cinzas de aproximadamente metade, ou mesmo um terço, ou mesmo um quarto ou mesmo menos de um quarto da dinâmica da imagem.
[00267] Adicionalmente e opcionalmente, o método de caracterização inclui a adição de um reagente, que pode causar a aglutinação de partículas no líquido.
[00268] Conforme ilustrado no terceiro exemplo da segunda modalidade, a aglutinação das partículas, por exemplo, depende de uma quantidade de analito presente no líquido.
[00269] De acordo com essa alternativa, a invenção refere-se a um método para detectar a quantidade de um analito em um líquido, por exemplo, um líquido biológico, e em particular um fluido corporal, o método de detecção que inclui as seguintes etapas:
[00270] - introduzir um líquido em uma câmara de fluido,
[00271] - iluminar a câmara de fluido com o uso de um feixe luminoso, sendo que o feixe luminoso, em particular, é proveniente de uma fonte de luz, tal como um diodo laser ou um diodo emissor de luz,
[00272] - adicionar um reagente, capaz de causar a formação de aglutinados de partículas e analitos no líquido,
[00273] - capturar uma imagem ou uma pluralidade de imagens da câmara de fluido com o uso de um fotodetector de matriz, o fotodetector que está, de preferência, colocado a uma distância da câmara de fluido de menos de 1 cm, a câmara de fluido estando posicionada entre a fonte de luz e o fotodetector de matriz,
[00274] - processar a imagem, ou a pluralidade de imagens, para determinar um indicador que caracteriza aglutinação de partículas no líquido biológico, e
[00275] - estimar a quantidade de analito no líquido, como uma função do valor do indicador.
[00276] Ainda de acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um método para determinar um parâmetro do líquido 12, incluindo sangue, o método que inclui as seguintes etapas:
[00277] - introduzir o líquido 12 na câmara de fluido 14,
[00278] - iluminar a câmara de fluido 14 com o uso do feixe luminoso de excitação 18 emitido pela fonte de luz 16, o feixe luminoso 18 que se estende através da câmara de fluido 14 na direção longitudinal X,
[00279] - capturar pelo menos uma imagem In(x,y), In+m(x,y), I (x,y) com o uso do fotodetector de matriz 20, a imagem In(x,y), In+m(x,y), I (x,y) que é formada pela radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada 14, e
[00280] - determinar um indicador Ind1n,n+m, Ind2, proveniente da pelo menos uma imagem In(x,y), In+m(x,y), I (x,y).
[00281] Durante a etapa de captura, o fotodetector 20 é posicionado à distância D2, menor do que 1 cm, da câmara de fluido 14 na direção longitudinal X.
[00282] Como um complemento e opcionalmente, o método para determinar compreende um ou mais dos seguintes recursos, considerados sozinhos ou de acordo com todas as combinações tecnicamente possíveis:
[00283] - o feixe luminoso 18 ilumina diretamente a câmara de fluido 14 e a imagem In(x,y), In+m(x,y), I (x,y) é formada diretamente pela radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada 14, na ausência de uma lente de aumento posicionada entre a câmara de fluido 14 e o fotodetector 20;
[00284] - o parâmetro é uma coagulação e o método, então, inclui as seguintes etapas:
[00285] + misturar o líquido 12 com um reagente para favorecer a coagulação do sangue,
[00286] + capturar uma série de imagens de transmissão In(x,y), In+m(x,y) em diferentes instantes n, n+m,
[00287] + calcular um indicador Ind1n,n+m para estabelecer um correlação entre duas áreas das imagens de transmissão In(x,y), In+m(x,y),
[00288] a coagulação sendo determinada como uma função do valor do dito indicador;
[00289] - o parâmetro é um tempo de coagulação e o método, então, inclui as seguintes etapas:
[00290] + misturar o líquido 12 com um reagente para favorecer a coagulação do sangue,
[00291] + adquirir uma série de imagens de transmissão In(x,y), In+m(x,y) em diferentes instantes n, n+m,
[00292] + calcular um indicador Ind1n,n+m para estabelecer uma correlação entre duas imagens In(x,y), In+m(x,y), e
[00293] + determinar um intervalo de tempo, denominado tempo de coagulação, entre um instante inicial t0 e o instante t2A, t2B em cujo indicador Ind1n,n+m toma um valor predeterminado.
[00294] - O parâmetro é uma aglutinação de partículas sanguíneas e o método, então, inclui as seguintes etapas:
[00295] + misturar o líquido 12 com um reagente capaz de criar uma aglutinação das partículas sanguíneas,
[00296] + adquirir uma imagem de transmissão I (x,y),
[00297] + calcular um indicador Ind2 como uma função da intensidade em uma área predeterminada da imagem de transmissão I (x,y), e
[00298] + determinar um estado de aglutinação quando o indicador Ind2 excede um limiar predeterminado;
[00299] - as partículas sanguíneas são eritrócitos, o reagente que inclui um anticorpo, o estado de aglutinação que, então, fornece informação referente ao grupo sanguíneo.
[00300] De acordo com esse outro aspecto independente, a invenção também se refere a um sistema para determinar um parâmetro do líquido 12, que inclui sangue, o sistema de determinação que compreende:
[00301] - a câmara de fluido 14 designado para receber o líquido 12;
[00302] - a fonte de luz 16 capaz de emitir o feixe luminoso de excitação 18 para iluminar a câmara de fluido 14, o feixe luminoso 18 que se estende na direção longitudinal X;
[00303] - o fotodetector de matriz 20 capaz de adquirir pelo menos uma imagem In(x,y), In+1(x,y), I (x,y) de uma radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada 14; e
[00304] - a unidade de processamento de informações 21 que inclui meios para determinar um indicador Ind1n,n+m, Ind2, proveniente da dita uma imagem In(x,y), In+m(x,y), I (x,y).
[00305] O fotodetector 20 é posicionado à distância D2, menor do que 1 cm, da câmara de fluido 14 na direção longitudinal X.
[00306] O parâmetro é uma coagulação, tempo de coagulação ou uma aglutinação de partículas sanguíneas.

Claims (19)

1. Método para caracterizar uma variação na velocidade de partículas ou aglomeração de partículas, as partículas estando contidas em um líquido (12), o método incluindo as seguintes etapas: introduzir (100) o líquido (12) em uma câmara de fluido (14); iluminar (120) a câmara de fluido (14) com o uso de um feixe luminoso de excitação (18) emitido por uma fonte de luz (16), em que o feixe luminoso (18) estende-se através da câmara de fluido (14) em uma direção longitudinal (X); capturar (130) pelo menos uma imagem (In(x,y), In+m(x,y) ; I(x,y)) com o uso de um fotodetector de matriz (20), em que a imagem (In(x,y), In+m(x,y) ; I(x,y)) é formada por meio de radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada (14); e calcular (140), a partir de pelo menos uma imagem capturada (In(x,y), In+m(x,y) ; I(x,y)), pelo menos um indicador (Ind1n,n+m, Ind2) que caracteriza a variação da velocidade ou aglomeração das partículas; caracterizadopelo fato de que, durante a etapa de captura (130), o fotodetector (20) é posicionado a uma distância (D2) menor do que 1 cm da câmara de fluido (14) na direção longitudinal (X).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o feixe luminoso (18) tem uma área superficial compreendida entre 5 mm2 e 200 mm2 em um plano (P) perpendicular à direção longitudinal (X), em que o dito plano (P) é disposto em contato com a câmara de fluido (14).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o feixe luminoso (18) ilumina diretamente a câmara de fluido (14) e a imagem (In(x,y), In+m(x,y) ; I(x,y)) é formada diretamente pela radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada (14) na ausência de uma lente de ampliação posicionada entre a câmara de fluido (14) e o fotodetector (20).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que, durante a etapa de captura (130), são capturadas diversas imagens de transmissão (In(x,y), In+m(x,y)), sequencialmente, em instantes diferentes (n, n+m), e em que, durante a etapa de cálculo (140), um primeiro indicador calculado (Ind1n,n+m) é um indicador de correlação que tem a capacidade de caracterizar a variação da velocidade das partículas, em que o indicador de correlação (Ind1n,n+m) é representativo da correlação entre pelo menos duas imagens de transmissão (In(x,y), In+m(x,y)), respectivamente capturadas nos instantes n e n+m, ou da correlação para uma região predeterminada das ditas imagens de transmissão (In(x,y), In+m(x,y)).
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que também inclui uma etapa (110) para misturar o líquido (12) com um reagente (112) que tem a capacidade de se beneficiar da redução das partículas.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o reagente (112) é um reagente (112) que tem a capacidade de beneficiar da redução das partículas sanguíneas por meio de coagulação do sangue.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que também inclui uma etapa para determinar, a partir do primeiro indicador calculado (Ind1n,n+m), a coagulação de partículas sanguíneas e/ou um intervalo de tempo (Tc), chamado de tempo de coagulação, entre um instante inicial (t0) e o instante (t2A, t2B) no qual o primeiro indicador calculado (Ind1n,n+m) assume um valor predeterminado.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que a fonte de luz (16) é uma fonte de luz espacial e temporalmente coerente, tal como um laser.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro indicador (Ind1n,n+m) é calculado a partir de uma imagem de correlação (Icorrn,n+m(x,y)), que define a correlação espacial entre as ditas imagens de transmissão (In, In+m), ou de uma região predeterminada (142) da dita imagem de correlação (Icorrn,n+m(x,y)).
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a imagem de correlação (Icorrn,n+m(x,y)) é determinada através da seguinte equação:
Figure img0016
em que x e y representam as coordenadas de um ponto da imagem, Icorrn+m(x,y) é uma matriz que tem X fileiras e Y colunas, k1(x,y) representa uma matriz predeterminada que tem P fileiras e Q colunas, An(x,y) e An+m(x,y) são definidos através das seguintes equações:
Figure img0017
em que In(x,y), In+m(x,y) representa duas imagens de transmissão sucessivas nos instantes n e n+m, sendo que In(x,y), In+m(x,y) são matrizes com X fileiras e Y colunas, e o símbolo ®representa o número inteiro de convolução definido por:
Figure img0018
em que F(x,y) é uma matriz com X fileiras e Y colunas, X, Y, P e Q são números inteiros que verificam X > P > 1 e Y > Q > 1.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro indicador (Ind1n,n+m) é calculado com o uso da seguinte equação:
Figure img0019
em que Ind1 n,n+m representa o primeiro indicador, Cn(x,y) e Cn+m(x,y) são definidos através das seguintes equações:
Figure img0020
I’n(x,y), I’n+m(x,y) respectivamente representam uma região predeterminada de duas imagens de transmissão sucessivas nos instantes n e n+m, em que x e y designam as coordenadas de um ponto da imagem, I’n(x,y), I’n+m(x,y) são matrizes que têm N fileiras e M colunas, e I'n, I'n+mrepresentam um valor médio de respectivas regiões predeterminadas I’n(x,y) e I’n+m(x,y).
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que também inclui uma etapa (110) para misturar o líquido (12) a um reagente (206, 208) que tem a capacidade de criar uma aglomeração de partículas, em que, durante a etapa de cálculo (110), um segundo indicador calculado (Ind2) é um indicador para cada imagem capturada (I(x,y)), em que o segundo indicador (Ind2) é representativo da intensidade dos pixels da imagem (l(x,y)) em uma região predeterminada da imagem (I(x,y)), e em que o método também inclui uma etapa para determinar um estado de aglomeração das partículas do segundo indicador calculado (Ind2).
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o estado de aglomeração é determinado quando o segundo indicador (Ind2) exceder um limiar predeterminado.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o estado de aglomeração é determinado quando o segundo indicador (Ind2) exceder um indicador de referência (Ind2ref), obtido por uma imagem feita na área de referência.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que as partículas sanguíneas são eritrócitos, o reagente (206, 208) inclui um anticorpo e uma porção de informações relacionadas ao grupo sanguíneo também é determinada a partir do estado de aglomeração.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o líquido (12) inclui um analito, em que o método inclui, então, estimar a quantidade do dito analito no líquido (12), como uma função do dito segundo indicador (Ind2).
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a câmara de fluido (14) inclui diversos canais de circulação de fluido (202, 204) e em que, durante a etapa de cálculo (140), é calculado um indicador (Ind1n,n+m, Ind2) para cada um dos canais (202, 204).
18. Sistema (10) para caracterizar a variação da velocidade de partículas ou da aglomeração de partículas, as partículas estando contidas no líquido (12), o sistema (10) compreendendo: uma câmara de fluido (14) designada para receber o líquido (12); uma fonte de luz (16) que tem a capacidade de emitir um feixe luminoso de excitação (18) para iluminar a câmara de fluido (14), em que o feixe luminoso (18) estende-se através da câmara de fluido (14) em uma direção longitudinal (X); um fotodetector de matriz (20) que tem a capacidade de capturar pelo menos uma imagem (In(x,y), In+1(x,y) ; I(x,y)) de uma radiação transmitida pela câmara de fluido iluminada (14); e uma unidade de processamento de informações (21) que inclui meios de cálculo (36, 38) para calcular, a partir de pelo menos uma imagem capturada (In(x,y), In+1(x,y); I(x,y)), pelo menos um indicador (Ind1n,n+m, Ind2) que caracteriza a variação da velocidade ou da aglomeração das partículas; caracterizado pelo fato de que o fotodetector (20) é posicionado a uma distância (D2) menor do que 1 cm da câmara de fluido na direção longitudinal (X).
19. Sistema (10), de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o fotodetector de matriz (20) inclui uma pluralidade de pixels, em que cada pixel tem dimensões, em que cada um é menor do que ou igual a 4 μm.
BR112014029936-6A 2012-06-01 2013-05-31 Método e sistema para caracterizar uma variação na velocidade de partículas ou aglomeração de partículas BR112014029936B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1255115A FR2991457B1 (fr) 2012-06-01 2012-06-01 Procede et systeme de caracterisation de la vitesse de deplacement de particules contenues dans un liquide, telles que des particules sanguines
FR1255115 2012-06-01
PCT/EP2013/061245 WO2013178777A1 (fr) 2012-06-01 2013-05-31 Procédé et système de caractérisation d'une variation de la vitesse de particules ou d'une agglomération de particules contenues dans un liquide, telles que des particules sanguines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112014029936A2 BR112014029936A2 (pt) 2017-06-27
BR112014029936B1 true BR112014029936B1 (pt) 2021-10-13

Family

ID=48483005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112014029936-6A BR112014029936B1 (pt) 2012-06-01 2013-05-31 Método e sistema para caracterizar uma variação na velocidade de partículas ou aglomeração de partículas

Country Status (9)

Country Link
US (2) US9341636B2 (pt)
EP (2) EP2669678B1 (pt)
JP (1) JP6226965B2 (pt)
CN (1) CN104508481B (pt)
BR (1) BR112014029936B1 (pt)
CA (1) CA2893022C (pt)
ES (1) ES2523947T3 (pt)
FR (1) FR2991457B1 (pt)
WO (1) WO2013178777A1 (pt)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110579435B (zh) 2012-10-15 2023-09-26 纳诺赛莱克特生物医药股份有限公司 颗粒分选的系统、设备和方法
FR3020682B1 (fr) 2014-04-30 2016-05-27 Commissariat Energie Atomique Procede et systeme de detection d'au moins une particule dans un liquide corporel, et procede associe de diagnostic de la meningite
EP2975383A1 (en) 2014-07-14 2016-01-20 Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt am Main Method and device for analyzing a fluid medium such as a blood sample
PL410603A1 (pl) * 2014-11-28 2016-06-06 Geomobile Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Sposób wykrywania aglutynacji
FR3034524B1 (fr) * 2015-03-31 2017-04-28 Commissariat Energie Atomique Procede de determination du niveau d'agglutination de particules dans un echantillon
DE102015207289A1 (de) * 2015-04-22 2016-10-27 Robert Bosch Gmbh Partikelsensorvorrichtung
JP2016215192A (ja) * 2015-05-15 2016-12-22 アイセル株式会社 流体の混合方法
EP3350644B1 (en) 2015-09-17 2021-04-28 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Methods and apparatus for detecting an entity in a bodily sample
FR3046238B1 (fr) * 2015-12-24 2018-01-26 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Procede d’observation d’un echantillon par imagerie sans lentille
FR3049348B1 (fr) * 2016-03-23 2023-08-11 Commissariat Energie Atomique Procede de caracterisation d’une particule dans un echantillon
US11733150B2 (en) 2016-03-30 2023-08-22 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Distinguishing between blood sample components
EP3239689B1 (en) * 2016-04-26 2021-10-06 Atten2 Advanced Monitoring Technologies S.L. Fluid monitoring system
WO2017195205A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 S.D. Sight Diagnostics Ltd Sample carrier for optical measurements
WO2018069582A1 (fr) * 2016-10-14 2018-04-19 Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives Procédé de caractérisation d'un échantillon comportant des particules
WO2019097387A1 (en) 2017-11-14 2019-05-23 S.D. Sight Diagnostics Ltd Sample carrier for optical measurements
CN108120851B (zh) * 2017-12-20 2024-03-08 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种血液仿体的流速测量方法及仪器
EP3830545A1 (en) * 2018-08-03 2021-06-09 Verily Life Sciences LLC Systems and methods for detecting particles in a fluid channel
CN109240064A (zh) * 2018-08-06 2019-01-18 浙江工业大学 基于am335x处理器的便携式数字全息显微系统
US20220063253A1 (en) * 2018-12-28 2022-03-03 Borealis Ag Multilayer film
EP3867627B1 (en) * 2019-03-29 2023-10-25 Becton, Dickinson and Company Parameters for use in particle discrimination
CN113939730A (zh) * 2019-05-13 2022-01-14 荷语布鲁塞尔自由大学 用于颗粒表征的方法和系统
WO2020249803A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 Ams Ag Particulate matter sensor
FR3138212A1 (fr) 2022-07-19 2024-01-26 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Dispositif d'imagerie sans lentille

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04316478A (ja) * 1991-04-12 1992-11-06 Nec Corp 生物試料観察装置、システムおよび方法
JPH06311879A (ja) * 1993-03-15 1994-11-08 Nec Corp バイオセンサ
JP3411112B2 (ja) * 1994-11-04 2003-05-26 シスメックス株式会社 粒子画像分析装置
CA2301153C (en) * 1998-06-24 2008-08-26 Chen & Chen, Llc Fluid sample testing system
US20030113925A1 (en) 2001-09-07 2003-06-19 Gordon John Francis Nuclear morphology based identification and quantification of white blood cell types using optical bio-disc systems
AU2002333589A1 (en) 2001-09-12 2003-03-24 Burstein Technologies, Inc. Methods for differential cell counts including related apparatus and software for performing same
JP2006505788A (ja) * 2002-11-12 2006-02-16 インバーネス・メデイカル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング 無希釈の全血における凝固時間の光度判定
FR2860300B1 (fr) * 2003-09-25 2006-01-27 Formulaction Procede et dispositif d'analyse du mouvement dans un milieu diffusant.
GB0701201D0 (en) 2007-01-22 2007-02-28 Cancer Rec Tech Ltd Cell mapping and tracking
CN101874208B (zh) * 2007-11-26 2016-09-07 藤森工业株式会社 微型薄片及血液观测装置
JP5146462B2 (ja) 2007-11-28 2013-02-20 コニカミノルタアドバンストレイヤー株式会社 血液流動性計測システム
US20090274348A1 (en) 2008-04-30 2009-11-05 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Immunodiagnostic test apparatus having at least one imager to provide agglutination evaluations during centrifugration cycle
FR2931288B1 (fr) * 2008-05-19 2010-08-20 Thierry Prigent Procede d'enregistrement d'images et de donnees de restauration de ces images
JP2010032327A (ja) * 2008-07-28 2010-02-12 Panasonic Corp 被検出物質検出方法および被検出物質検出装置ならびに深さ位置計測方法および深さ位置計測装置
FR2943789B1 (fr) * 2009-03-26 2013-07-26 Commissariat Energie Atomique Procede et dispositif pour la caracterisation de la dynamique de coagulation ou sedimentation d'un fluide tel que le sang ou le plasma sanguin
FR2951542B1 (fr) * 2009-10-16 2011-12-02 Commissariat Energie Atomique Procede de detection optique d'objets micrometriques en solution
JP5639654B2 (ja) * 2009-10-20 2014-12-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア オンチップでの非干渉性のレンズフリーのホログラフィおよび顕微鏡法
ES2588703T3 (es) * 2009-12-07 2016-11-04 Meso Scale Technologies, Llc. Un cartucho de ensayo
JP5703781B2 (ja) * 2010-09-03 2015-04-22 ソニー株式会社 画像処理装置および方法
CA3177188A1 (en) * 2011-01-06 2012-07-12 Meso Scale Technologies, Llc. Assay cartridges for pcr analysis and methods of use thereof
AR085087A1 (es) * 2011-01-21 2013-09-11 Theranos Inc Sistemas y metodos para maximizar el uso de muestras
US8647886B1 (en) * 2012-01-13 2014-02-11 Alcor Scientific, Inc. Apparatus, method, system for the determination of the aggregation rate of red blood cells
US9506935B2 (en) 2012-06-01 2016-11-29 Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives Method and system for estimating the quantity of an analyte contained in a liquid

Also Published As

Publication number Publication date
FR2991457A1 (fr) 2013-12-06
JP6226965B2 (ja) 2017-11-08
WO2013178777A1 (fr) 2013-12-05
EP2669678A1 (fr) 2013-12-04
JP2015521288A (ja) 2015-07-27
EP2669678B1 (fr) 2014-08-27
US20160299158A1 (en) 2016-10-13
US20130323757A1 (en) 2013-12-05
BR112014029936A2 (pt) 2017-06-27
US9341636B2 (en) 2016-05-17
CA2893022A1 (en) 2013-12-05
FR2991457B1 (fr) 2014-07-18
CN104508481A (zh) 2015-04-08
US10126315B2 (en) 2018-11-13
CN104508481B (zh) 2017-06-16
ES2523947T3 (es) 2014-12-02
EP2821786A1 (fr) 2015-01-07
CA2893022C (en) 2021-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112014029936B1 (pt) Método e sistema para caracterizar uma variação na velocidade de partículas ou aglomeração de partículas
Daaboul et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging
Ugele et al. Label‐free high‐throughput leukemia detection by holographic microscopy
Ashcroft et al. Determination of the size distribution of blood microparticles directly in plasma using atomic force microscopy and microfluidics
Gifford et al. A detailed study of time‐dependent changes in human red blood cells: from reticulocyte maturation to erythrocyte senescence
ES2661735T3 (es) Método para usar células no raras para detectar células raras
Gardiner et al. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis
US9442125B2 (en) Method and a device for characterizing the coagulation or sedimentation dynamics of a fluid such as blood or blood plasma
EP2788773A1 (en) Apparatus, system and method for identifying circulating tumor cells
RU2650165C2 (ru) Устройство анализа клеточной подвижности
US20200116617A1 (en) Method and Device for Label-Free, High Throughput Holographic Screening and Enumeration of Tumor Cells in Blood
US9506935B2 (en) Method and system for estimating the quantity of an analyte contained in a liquid
BR112015001048B1 (pt) Métodos, dispositivo e sistema de medição de uma pluralidade de parâmetros de coagulação de uma amostra de sangue
FR2945350A1 (fr) Appareil et dispositif consommable pour effectuer des analyses sanguines
WO2017126634A1 (ja) 希少細胞を用いて癌患者の予後を予測する方法
Paul et al. Quantitative absorption imaging of red blood cells to determine physical and mechanical properties
Olofsson et al. A collagen-based microwell migration assay to study NK-target cell interactions
Yang et al. Enhanced prognostic value of combined circulating tumor cells and serum carcinoembryonic antigen in patients with colorectal cancer
JP5348357B1 (ja) 血中の目的細胞の定量方法および該細胞を定量するシステムの評価方法
Zhao et al. Physical cytometry: detecting mass-related properties of single cells
Liang et al. Magnetic levitation and sorting of neoplastic circulating cell hybrids
Lee et al. Enhanced functionalities of immune cells separated by a microfluidic lattice: assessment based on holotomography
Niu et al. Morphology and expression status investigations of specific surface markers on B‐cell chronic lymphocytic leukemia cells
Zheng et al. Coherent Optical Scattering and Interferometry (COSI) for label-free multiparameter quantitative imaging of intra-thrombus stability in vitro
Zhang Hands-free cytometry of whole blood: controlled antibody release from hydrogels for on-chip cell staining

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06I Publication of requirement cancelled [chapter 6.9 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.6.1 NA RPI NO 2462 DE 13/03/2018 POR TER SIDO INDEVIDA.

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 31/05/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.