BR112014029861B1

BR112014029861B1 - Compostos imunogênicos, composição e uso de composto

Info

Publication number: BR112014029861B1
Application number: BR112014029861-0A
Authority: BR
Inventors: Joël Crouzet; Raphaël Ho Tsong Fang; Dominique Desfontaines
Original assignee: Innavirvax
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2022-05-24
Also published as: HRP20150058T1; CN104507496B; KR20150032266A; PL2668959T3; RS53769B1; EP2668959A1; ES2528109T3; ZA201409023B; EP2668959B1; MX2014014526A; SI2668959T1; MX360206B; ES2701084T3; EA201491969A1; PT2668959E; CA2875162A1; JP6352251B2; IN2014DN10128A; EA027803B1; DK2668959T3

Abstract

COMPOSTOS IMUNOGÊNICOS COMPREENDENDO PEPTÍDEO GP41 DE HIV ACOPLADO À PROTEÍNA CARREADORA CRM197. A presente invenção se refere ao campo de vacinas direcionadas contra o vírus da família do HIV. Mais particularmente, se refere a um composto imunogênico que compreende um peptídeo da seguinte fórmula (I): NH2- [Nt]y-P-W-N- X1-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH (I) que é covalentemente ligado a uma proteína carreadora que consiste em uma proteína CRM197. A presente invenção também se refere a uma composição que contém esse composto imunogênico e os usos desses compostos imunogênicos e composições para prevenção e/ou tratamento de uma condição ocasionada pela infecção de um indivíduo por um vírus HIV.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de vacinas direcionadas contra vírus da família HIV.

FUNDAMENTOS

[0002] Cerca de 90% das infecções por HIV humanas são causadas por um vírus HIV-1. O vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é caracterizado por uma variabilidade genética marcante causada pelo acúmulo de mutações, que surgem durante a replicação viral e também causada pelos eventos recombinantes. A falha em longo prazo de métodos quimioterápicos de tratamento contra HIV é particularmente explicada pela alta atividade mutagênica das cepas virais de HIV-1. Foi mostrado antes que variantes virais resistentes surgiram rapidamente em pacientes após diferentes cursos de terapia antirretroviral e até mesmo após terapia com multifármaco (HAART). Esses vírus resistentes têm alterações específicas na conformação e na estrutura de proteínas dos mesmos. Normalmente, tais mutações responsáveis pela fuga do HIV-1 dos tratamentos atuais são mantidas pelas sucessivas gerações de vírus e acumulam, como resultado da seleção sob as condições de tratamento.

[0003] O tratamento com medicinas anti-HIV-1 não bloqueia totalmente a replicação do vírus, o que permite uma seleção e acúmulo de mutações de resistência pré-existentes, assim como de mutações que ocorrem recentemente, o que traz assim novas oportunidades para o vírus se espalhar. As medicinas antirretrovirais existentes (NRTI, NNRTI, inibidores de protease, inibidores de fusão e misturas dos mesmos como HAART) podem somente desacelerar a replicação do HIV-1 por um período de tempo mais ou menos prolongado, até o surgimento e propagação de cepas virais resistentes. O amplo espalhamento de variantes resistentes de HIV-1 traz sérias preocupações e exige a disponibilidade de ferramentas terapêuticas anti-HIV-1 adicionais.

[0004] Ademais, mesmo com os claros benefícios clínicos de HAART, as desvantagens persistem: muitos efeitos colaterais (lipodistrofia, acidose láctica, resistência à insulina, doença renal crônica, hiperlipidemia...), tratamento por toda a vida, alta conformidade necessária, resistências virais, persistência de efeitos patogênicos da infecção por HIV, como déficits cognitivos e motores e ativação imune. Além disso, com a extensão da expectativa de vida, os pacientes devem enfrentar o surgimento de efeitos colaterais, resistências a fármaco, distúrbios metabólicos e cânceres associados à infecção por HIV-1.

[0005] Além disso, 20% a 30% dos pacientes tratados experimentam uma falha imunológica algumas vezes independente de uma supressão viral. Isso que dizer que as contagens de célula T CD4+ diminuem independente da inibição de replicação viral. Isso mostra que eventos patogênicos de infecção por HIV-1 em uma célula T CD4+ ainda existem independentes da inibição da replicação viral.

[0006] Assim, para uma abordagem terapêutica segura e acessível que pode ser complementar aos tratamentos antirretrovirais, proteger as células T CD4+ é necessário e representa uma necessidade médica não cumprida.

[0007] Várias estratégias terapêuticas anti-HIV, além daquelas que fazem uso de substâncias antirretrovirais químicas, foram consideradas, as quais incluem (i) o uso de anticorpos anti-HIV, (ii) vacinas com base no rompimento de partículas de HIV, (iii) vacinas com base em peptídeos de HIV e (iv) plasmídeo de DNA ou vacinas com base em vetor viral, cada um tendo desvantagens específicas.

[0008] Uma vez que o HIV foi identificado como a causa da AIDS em 1983, múltiplos candidatos para uma vacina para evitar a infecção por HIV e AIDS foram testados em ensaios em humanos com sucessos muito limitados. A iniciativa de vacina contra AIDS internacional, IAVI, mantém um banco de dados dessas vacinas e ensaios (www.IAVI.org). Quase todos esses ensaios tiveram testes de segurança de vacina e resposta imune preliminar muito precoces (fase I). Somente uma vacina (duas formulações da mesma vacina gpl20 básica) foi testada nos estudos da fase III em larga escala. Foi encontrado que a proteína VaxGen gpl20 subtipo B é ineficaz em um ensaio de fase III que foi terminado em 2003 nos USA, Canadá e Holanda. Depois em 2003, um segundo ensaio de AIDSVAX foi terminado na Tailândia. Ambos os ensaios encontraram que os candidatos são ineficazes. Previamente foi difícil preparar vacinas com proteína contra o HIV, o que pode ser devido à alta diversidade na proteína do envelope, às diferenças entre o envelope da cepa adaptada para laboratório usada e os isolados clínicos, à natureza monomérica da gpl20 na vacina e à organização trimérica no vírus e, em particular, devido a induzir somente anticorpos e não imunidade celular. Uma combinação de proteína AIDSVAX (da VAXGene) com genes entregues na varíola de canário (ALVAC junto à Aventis Pasteur) também está na fase III para informações adicionais e espera-se o começo de um quarto ensaio em larga escala para testar o candidato com base em adenovírus da Merck. Linfócitos T citotóxicos (CTL) são considerados um componente crítico do controle imune do vírus que inclui HIV-1 e imunógenos CTL relevantes são considerados para vacinas terapêuticas.

[0009] Conforme a HIV pandêmica continua a infectar milhões de pessoas a cada ano, a necessidade por uma vacina eficaz aumenta. O desenvolvimento de vacinas anti-HIV foi profundamente prejudicado devido à dificuldade no desenvolvimento de um produto imunogênico que pode obter anticorpos anti-HIV amplamente neutralizantes.

[0010] A indução de anticorpos amplamente neutralizantes (NtAb) contra isolados primários do vírus da imunodeficiência humana (HIV) permanece um objetivo principal e inalcançado por pesquisa contra vacina de AIDS. Tentativas anteriores com o uso de vacinas com base em envelope obtiveram anticorpos que são eficazes somente contra isolados adaptados em laboratório. Nesses casos, a proteção foi correlacionada com uma alta titulação de NtAb direcionada para a região hipervariável V3 de gp120. Entretanto, as atividades neutralizadas geradas são, em grande parte, específicas para o isolado e são pouco eficazes contra a maioria dos isolados primários de HIV-1. A falha da subunidade de vacinas gp120 em proteger contra a aquisição de HIV-1 nos ensaios clínicos da fase III enfatiza a dificuldade da tarefa.

[0011] Mesmo assim, um NtAb pode, com frequência, ser encontrado em indivíduos infectados por HIV. As respostas geradas no início da infecção são normalmente limitadas em especificidade, o que neutraliza o vírus transmitido no hospedeiro, mas não os contemporâneos. Tais respostas aumentam durante o curso da infecção em alguns sobreviventes em longo prazo que são capazes de controlar a infecção na ausência de tratamento antiviral. Entretanto, a natureza da resposta de anticorpo de neutralização cruzada e os mecanismos que levam à gênese da mesma não são compreendidos.

[0012] Naturalmente, NtAbs contra Env são gerados dentro de semanas após a infecção, mas essa resposta precoce somente é eficaz contra um subtipo viral específico; entretanto, bNtAbs (Abs neutralizantes de reação cruzada) podem se desenvolver durante o curso do HIV. Recentemente, diversos estudos principais mostraram que aproximadamente 25% dos sujeitos infectados com HIV (infectados por pelo menos 1 ano) têm resposta bNtAb e 1% dos “neutralizadores de Elite” com uma atividade muito robusta contra uma grande maioria de clados. Mais importante, esses resultados demonstram a habilidade do sistema imunológico de pessoas infectadas de gerar in vivo NtAbs contra o HIV-1 durante o curso da doença. Os mesmos também sugerem que atividades de NtAb amplamente reativas parecem ser desenvolvidas ao longo do tempo e são estimuladas pela exposição a um antígeno crônico, na ausência do conhecimento sobre a titulação de bNtAbs que seria protetora.

[0013] A replicação viral persistente, bem baixo ruído, leva a uma evolução contínua de Env para evitar NtAbs. Tal evolução antigênica pode focar uma nova estratégia de vacina na região mais conservada da proteína Env e sugere que imunógenos de vacina poderiam ser projetados para imitar epítopos chave altamente conservados.

[0014] Um dos principais obstáculos para o projeto de vacinas anti-HIV eficazes é que o alvo de bNtAbs é a proteína do envelope viral (Env), a qual é altamente variável, enquanto que os elementos conservados para ser pouco imunogênicos. Isso significa que os conceitos cinéticos e especiais impedem o bNtAbs de acessar sítios potencialmente vulneráveis durante processos de ligação e fusão de receptor. De fato, poucas quantidades de NtAbs foram descritas. Por exemplo, o primeiro bNtAb identificado foi b12, o qual obstrui o sítio de ligação CD4 em gp120 e evita a ligação de CD4 do vírus em linfócitos T CD4+. A subunidade gp41 é bem mais conservada que a gp120 que envolve redisposições conformacionais é comum em todas as cepas. Poucas atividades de bNtAb são obtidas contra elementos estruturais conservados da gp41 que são protegidos, difíceis de acessar ou transitórios; essas bNtAbs, que incluem 2F5 e 4E10, almejam a região de ectodomínio próxima à membrana (MPER) de gp41. Entretanto, mesmo com muitos anos de pesquisa, os imunógenos de NtAb capazes de obter esses bNtAbs ainda são desconhecidos uma vez que os epítopos são conformacionais.

[0015] Mesmo com as inúmeras dificuldades encontradas no projeto de estratégias de vacina preventivas ou terapêuticas seguras e eficazes contra a infecção por um vírus HIV, foi feito um grande progresso na concepção de composições de vacina anti-HIV promissoras. De modo ilustrativo, não menos que 576 estudos clínicos de vacinas anti-HIV foram conduzidos no início do ano 2012 nos Estados Unidos, Canadá e Austrália. Vale mencionar que 27 desses estudos clínicos terminaram um estágio da fase IV. Esses avanços mostram que, com o tempo, vacinas anti-HIV representam ferramentas médicas cada vez mais tangíveis e confiáveis para evitar e/ou tratar indivíduos que estão em risco ou que já estão sujeitos à infecção com um vírus HIV. Todas essas vacinas em desenvolvimento almejam reduzir a replicação viral do vírus.

[0016] Uma das estratégias promissoras preventivas, assim como terapêuticas de vacina anti-HIV revelada na técnica se refere à elevação de anticorpos contra um motivo altamente conservado da proteína do envelope gp41 de HIV, que foi denominada "3S". Foi mostrado na técnica que uma composição imunogênica que consiste do peptídeo 3S acoplado à proteína carreadora KLH (denominada KLH-3S) em combinação com o Adjuvante do Freund Incompleto (IFA) pode induzir anticorpos anti-3S em macacos. Também foi mostrado que os anticorpos anti-3S tinham um efeito protetor contra o declínio de célula T CD4+ nos macacos imunizados. Esses resultados abriram a maneira para estratégias adicionais de intervenção imune almejada no controle do desenvolvimento da doença do HIV (Vieillard et al., 2008, PNAS, Vol. 105 (6): 2100 a 2104).

[0017] Essa estratégia é a primeira a alvejar uma determinante viral de patogenicidade de HIV-1 e não a replicação viral.

[0018] Ainda existe uma necessidade na técnica por ferramentas terapêuticas que almejam a prevenção ou tratamento de uma infecção causada por um vírus HIV-1. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0019] A presente invenção se refere a um composto imunogênico que compreende um peptídeo da seguinte fórmula (I):NH2- [Nt]y-P-W-N-X1-S- -X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH (I),

[0020] em que:

[0021] - y é um inteiro que significa 0 ou 1,

[0022] - z é um inteiro que significa 0 ou 1,

[0023] - Nt consiste de um peptídeo que tem de 1 a 100 aminoácidos em comprimento,

[0024] - Ct consiste de um peptídeo que tem de 1 a 100 aminoácidos em comprimento,

[0025] - X1 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de A (Alanina), T (treonina), S (Serina) e N (Asparagina),

[0026] - X2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de W (Triptofano) e A (Alanina),

[0027] - X3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de K (Lisina) e R (Arginina),

[0028] - X4 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de S (Serina) e T (Treonina),

[0029] - X5 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de L (Leucina), Y (Tirosina) e Q (Glutamina),

[0030] - X6 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de D (Ácido Aspártico), N (Asparagina), E (Ácido Glutâmico), S (Serina), G (Glicina) e K (Lisina),

[0031] - X7 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de D (Ácido Aspártico), Q (Glutamina), L (Leucina), A (Alanina), K (Lisina) e E (Ácido glutâmico),

[0032] cujo peptídeo da fórmula (I) é ligado de forma covalente a uma proteína carreadora que consiste de uma proteína CRM197.

[0033] Em algumas modalidades, o composto imunogênico compreende o peptídeo da SEQ ID N° 2 [NH2-PWNASWSNKSLDDIW-COOH] que é ligada de forma covalente a uma proteína carreadora que consiste da proteína CRM197.

[0034] Notavelmente, a presente invenção se interessa em um composto imunogênico que compreende um peptídeo da seguinte fórmula (V): NH2-(A1)m-SEQ IDN°2-(A2)n-COOH (V),

[0035] em que :

[0036] - m é um inteiro que significa 0 ou 1,

[0037] - n é um inteiro que significa 0 ou 1,

[0038] - A1 é um resíduo de aminoácido, e

[0039] - A2 é um resíduo de aminoácido,

[0040] cujo peptídeo da fórmula (I) é ligado de forma covalente a uma proteína carreadora que consiste de uma proteína CRM197.

[0041] Em algumas modalidades de um composto imunogênico de acordo com a invenção, o peptídeo da fórmula (I) compreende ou consiste de um peptídeo da SEQ ID N°5.

[0042] Em algumas outras modalidades de um composto imunogênico de acordo com a invenção, o peptídeo da fórmula (I) compreende ou consiste de um peptídeo da SEQ ID N°6.

[0043] Em algumas modalidades, o dito composto imunogênico é ligado de forma covalente à dita proteína carreadora pelo resíduo de aminoácido de extremidade N- terminal ou diretamente ou através de um grupamento ligante.

[0044] Assim, em algumas modalidades, o dito composto imunogênico é ligado de forma covalente à dita proteína carreadora através de um grupamento ligante, preferencialmente um grupamento ligante que compreende dois grupos succinimidila reativos.

[0045] Esta invenção também pertence a uma composição que compreende um composto imunogênico conforme definido acima em combinação com uma ou mais substâncias imunoadjuvantes.

[0046] Preferencialmente, as ditas uma ou mais substâncias imunoadjuvantes compreendem ou consistem de hidróxido de alumínio (Al(OH)3).

[0047] A presente invenção também lida com uma composição de vacina que compreende um composto imunogênico ou uma composição conforme definido acima em combinação com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[0048] Esta invenção também se refere a um composto imunogênico ou a uma composição conforme definido acima para uso em um medicamento ou alternativamente para uso para prevenir e/ou tratar uma condição causada pela infecção de um indivíduo com um vírus HIV.

[0049] A mesma também se refere ao uso de um composto imunogênico ou de uma composição conforme definido acima para preparar uma composição de vacina para prevenir e/ou tratar uma condição causada pela infecção de um indivíduo com um vírus HIV.

[0050] A presente invenção também se refere a um método para prevenir e/ou tratar uma condição causada pela infecção de um indivíduo com um vírus HIV que compreende uma etapa de administração, a um indivíduo que necessita da mesma, de uma quantidade eficaz de uma composição de vacina conforme definido acima. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0051] A Figura 1 ilustra a elevação de anticorpos de peptídeo anti-3S ao imunizar com o peptídeo 3S16Nter conjugado com KLH ou CRM197. Cada símbolo representa os resultados obtidos de um camundongo. Cada barra representa o valor médio geométrico dos resultados obtidos do grupo de camundongos correspondente. Abscissa: tipo de composição usada; Ordenada: titulações de IgG anti-3S conforme expressadas em Unidade Arbitrária (A.U.). Uma Unidade Arbitrária corresponde ao sinal gerado por uma solução do anticorpo 15C8f2 anti-3S monoclonal de camundongo na concentração final de 1 ng/μl. Figura 1A: resultados no Dia 21 após a primeira injeção; Figura 1B: resultados no Dia 35 após a primeira injeção; Figura 1C: resultados no Dia 49 após a primeira injeção.

[0052] A Figura 2 ilustra a faixa de dose de vacina de imunoconjugado 3S- peptídeo-CRM197 ótima (substância de fármaco 3S) em camundongos. Abscissa: dose do imunoconjugado conforme expressa como a quantidade de equivalente antigênico (respectivamente 0 ("Adjuvante"), 0,02 μg, 0,2 μg, 1 μg, 2 μg e 4 μg). Ordenada: titulações de IgG Anti-3S16Nter conforme expressas como 1/diluição no ponto médio). A diluição no ponto médio é a diluição do antissoro que dá metade do sinal máximo. O eixo X representa os diferentes grupos de camundongos vacinados com doses crescentes expressas em microgramas (μg) de peptídeo 3S16Nter equivalente da substância de fármaco3S. Cada símbolo representa um camundongo. Um agrupamento de soros de camundongos vacinados com imunoconjugado CRM197-3S é usado para normalizar o ensaio ELISA. Importâncias estatísticas calculadas por um teste de Mann Whitney não paramétrico são relatadas. *: 0,5>p>0,1; **: 0,1>p>0,01; ***: p<0,01.

[0053] A Figura 3 ilustra a faixa de dose de vacina de 3S-peptídeo-CRM197 ótima em ratos. Abscissa: dose do imunoconjugado (a substância de fármaco 3S) conforme expressa como a quantidade de peptídeo conjugado ao carreador sem levar em conta o peso do carreador e o peso do ligante (equivalente a peptídeo) (respectivamente 0 ("Adjuvante"), 0,02 μg, 0,2 μg, 1 μg, 2 μg e 4 μg). Ordenada: titulações de IgG Anti- 3S16Nter conforme expressas como 1/diluição no ponto médio). A diluição no ponto médio é a diluição do antissoro que dá metade do sinal máximo. O eixo X representa os diferentes grupos de ratos vacinados com doses crescentes expressas em microgramas (μg) de equivalente a peptídeo da substância de fármaco 3S. Cada símbolo representa um rato. Um agrupamento de soros de ratos vacinados com 20 μg e 50 μg do imunoconjugado CRM197-3S formulado com hidróxido de alumínio é usado para normalizar o ensaio ELISA. As importâncias estatísticas calculadas por um teste de Mann Whitney não paramétrico são relatadas. *: 0,5>p>0,1; **: 0,1>p>0,01; ***: p<0,01

[0054] As Figuras 4 e 5 ilustram a capacidade dos anticorpos anti-3S16Nter obtidos após imunização de animais que incluem primatas, com um conjugado 3S16Nter para proteínas carreadoras (KLH ou CRM197) conforme descrito no presente documento.

[0055] A Figura 4 ilustra fluorescência de PE Médio de cavidades de controle.

[0056] A média de fluorescência de PE medida que representa a densidade de NKp44L na superfície das células T CD4+ foi medida por citofluorimetria das células das cavidades número 4 a número 1). O eixo Y representa a fluorescência média X. O eixo X representa os diferentes controles. Os peptídeos 3S16Nter com (3S) ou sem (-) e sem (-) ou com soro de coelhões negativo em IgG anti-3S16Nter IgG (coelho neg) ou positivo (coelho pos) na diluição de 1/50. Os controles foram testados em duplicada e os Desvios Padrões são relatados (barras de erro).

[0057] A Figura 5 ilustra uma fluorescência média X de cavidades de itens de teste.

[0058] A medida de média de fluorescência de PE que representa a densidade de NKp44L na superfície das células T CD4+ foi medida pela citofluorimetria das células das cavidades número 16 a número 45. O eixo Y representa a fluorescência média X. O eixo X representa as diferentes condições testadas. Todas as cavidades foram testadas na presença de peptídeos 3S16Nter. O soro de um rato vacinado com imunoconjugado CRM197-3S16Nter com adjuvante (R122 d49) foi testado. Cada diluição foi testada em triplicata, o Desvio Padrão foi relatado (barras de erro). Soro negativo em IgG Anti-3S16Nter (controle negativo) foi testado na diluição de 1/50. O soro positivo em IgG anti-3S16Nter foi testado nas diluições de 1/100, 1/400, 1/1600 e 1/6400.

[0059] A Figura 6 ilustra o aumento de anticorpos de peptídeo anti-3S após imunização com peptídeo conjugado m3S16Nter com CRM197. Cada símbolo representa os resultados obtidos de um camundongo e seis camundongos foram imunizados nos mesmos. Os camundongos foram injetados nos dias 0, 14, 28, 169 e 212, respectivamente, conforme ilustrado pelas setas correspondentes. Abscissa: período de tempo após a primeira injeção do imunoconjugado conforme expresso em dias. Ordenada: titulações de anticorpo anti-3S conforme expressas como 1/ponto médio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0060] A presente invenção fornece em primeiro lugar um composto imunogênico novo útil para preparar composições e especialmente composições de vacina contra HIV.

[0061] Os inventores realizaram um trabalho de pesquisa completo em vista do projeto de um composto imunogênico provido com a habilidade de induzir uma resposta de anticorpo alta e eficaz contra um peptídeo 3S.

[0062] Conforme usado no presente documento, um peptídeo 3S é definido de forma coletiva no presente relatório descritivo como um peptídeo da fórmula (I) que é descrito abaixo. Um peptídeo 3S abrange o peptídeo 3S da SEQ ID N° 5 (NH2- CPWNASWSNKSLDDIW-COOH) que é conhecido na técnica.

[0063] Conforme usado no presente documento, os anticorpos anti-3S consistem de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) e incluem anticorpos direcionados contra o peptídeo 3S da SEQ ID N° 5.

[0064] O peptídeo 3S da SEQ ID N° 5 foi identificado previamente como um antígeno anti-HIV candidato por Vieillard et al. (Vieillard et al., 2008, PNAS, Vol. 105 (6) : 2100 a 2104). É relembrado que Vieillard et al. induziram anticorpos anti-3S pelo uso de um composto imunoconjugado que consiste de peptídeos 3S de SEQ ID N° 5 que foram ligados de forma covalente à proteína carreadora KLH.

[0065] É relembrado no presente documento que KLH é quase a única proteína carreadora que está atualmente presente nas composições de vacina que compreendem substâncias imunogênicas sob a forma de conjugados de carreador de antígeno-proteína. Além disso, KLH foi usado amplamente para gerar anticorpos (Lee, Huang, Lasanthi, Jayathilaka, Lateef e Gupta, 2010. Production of antipeptyde antibodies, Methods in Molecular Biology, 657:93-108, S.D. Schwartzbach e T. Osafune (eds.), Springer; Ragupathi, Gathuru e Livington, 2005, Anti-body inducing polyvalent cancer vaccines, Cancer Treat Res, 123:157 a 150; Harris e Markl, 1999, Keyhole limpet hemocyanin (KLH): a biomedical review, Micron, 30 a 597 a 623).

[0066] Surpreendentemente, os inventores encontraram que a proteína carreadora convencional KLH usada por Vieillard et al. não era adequada para projetar um composto imunogênico que eleva uma resposta de anticorpo anti-3S eficaz alvejada na indução de um efeito protetor contra os distúrbios imunológicos causados pela infecção de um indivíduo com um vírus da família HIV e, particularmente, um vírus HIV-1. Notavelmente, os inventores encontraram inesperadamente os agregados formados com moléculas de KLH enxertadas com peptídeo 3S (KLH-3S) que levam a um composto imunogênico final heterógeno que compreende entidades associadas de vários pesos moleculares aparentes. Assim, os inventores encontraram que um composto imunogênico que compreende conjugados de KLH-3S não pode ser fabricado de forma reprodutível com o objetivo de obter um produto definido quimicamente útil como um medicamento e, especialmente, como um medicamento para uso humano.

[0067] De forma altamente surpreendente, os inventores encontraram que uma resposta de anticorpo anti-3S eficaz pode ser obtida pelo uso de um composto imunogênico específico que consiste de um conjugado antígeno-carregador em que a molécula carreadora consiste de uma proteína CRM197. Notavelmente, foi encontrado que um aumento de aproximadamente 100 vezes no anticorpo anti-3S é obtido pelo uso de CRM197 como a proteína carreadora em comparação a um composto imunogênico em que o mesmo peptídeo antigênico é ligado de forma covalente à proteína carreadora KLH convencional.

[0068] A proteína CRM197 consiste de um mutante não tóxico da toxina de difteria bem conhecida, cujo mutante foi inicialmente descrito por Uchida et al. (1973, J. Biol. Chem., Vol. 248 : 3838 a 3844). A proteína mutante CRM197 foi descrita inicialmente como o produto da tradução do gene tox97 mutante onde uma transição de G^A leva à substituição do resíduo de glicina (G) na posição 52 da toxina de difteria do tipo selvagem com um resíduo de ácido glutâmico (E).

[0069] De acordo com o conhecimento do depositante, a CRM197 foi usada pouco até agora como uma molécula carreadora para preparar compostos imunogênicos, especialmente para conjugação de peptídeo. De acordo com o conhecimento do depositante, a CRM197 foi usada exclusivamente como uma substância carreadora para antígenos de oligossacarídeos, isto é, para elevar anticorpos contra estruturas não-proteicas que são bem conhecidas na técnica para possuir um comportamento imunológico bem específico. Ainda mais precisamente, parece que a CRM197 foi usada exclusivamente como uma molécula carreadora para (i) oligosídeos derivados dos antígenos em cápsula de Streptococcus pneumoniae, (ii) oligosídeos de Neisseria menigitidis e (iii) para o polissacarídeo em cápsula de Haemophilus influenza tipo B.

[0070] A presente invenção se refere a um composto imunogênico que compreende um peptídeo da seguinte fórmula (I):NH2- [Nt]y-P-W-N-X1-S- X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH (I),

[0071] em que :

[0072] - y é um inteiro que significa 0 ou 1,

[0073] - z é um inteiro que significa 0 ou 1,

[0074] - Nt consiste de um peptídeo que tem de 1 a 100 aminoácidos em comprimento,

[0075] - Ct consiste de um peptídeo que tem de 1 a 100 aminoácidos em comprimento,

[0076] - X1 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de A (Alanina), T (treonina), S (Serina) e N (Asparagina),

[0077] - X2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de W (Triptofano) e A (Alanina),

[0078] - X3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de K (Lisina) e R (Arginina),

[0079] - X4 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de S (Serina) e T (Treonina),

[0080] - X5 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de L (Leucina), Y (Tirosina) e Q (Glutamina),

[0081] - X6 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de D (Ácido Aspártico), N (Asparagina), E (Ácido glutâmico), S (Serina), G (Glicina) e K (Lisina),

[0082] - X7 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de D (Ácido Aspártico), Q (Glutamina), L (Leucina), A (Alanina), K (Lisina) e E (Ácido glutâmico),

[0083] cujo peptídeo da fórmula (I) é ligado de forma covalente a uma proteína carreadora que consiste de uma proteína CRM197.

[0084] Para o propósito da presente descrição, o composto imunogênico da fórmula (I) também pode ser denominado no presente documento NH2- [Nt]y-SEQ ID N° 1-[Ct]z-COOH (I).

[0085] Em algumas modalidades do composto imunogênico da fórmula (I), X1 preferencialmente significa A,

[0086] Em algumas modalidades do composto imunogênico da fórmula (I), X2 preferencialmente significa W,

[0087] Em algumas modalidades do composto imunogênico da fórmula (I), X3 preferencialmente significa K,

[0088] Em algumas modalidades do composto imunogênico da fórmula (I), X4 preferencialmente significa S,

[0089] Em algumas modalidades do composto imunogênico da fórmula (I), X5 preferencialmente significa L,

[0090] Em algumas modalidades do composto imunogênico da fórmula (I), X6 preferencialmente significa D, e

[0091] Em algumas modalidades do composto imunogênico da fórmula (I), X7 preferencialmente significa D.

[0092] Em algumas modalidades do composto imunogênico da fórmula (I), um ou mais dentre os aminoácidos selecionados do grupo que consiste de X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 podem ter o significado preferencial especificado acima. Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dentre os aminoácidos selecionado do grupo que consiste de X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 podem ter o significado preferencial especificado acima.

[0093] Nas modalidades em que os sete aminoácidos selecionados do grupo que consiste de X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 podem ter o significado preferencial especificado acima, então o dito peptídeo imunogênico consiste do peptídeo da fórmula (IIa): NH2- [Nt]y-P-W-N-A-S-W-S-N-K-S-L-D-D-I-W-[Ct]z-COOH (IIa),

[0094] que também pode ser denominado: NH2- [Nt]y-SEQ ID N° 2-[Ct]z-COOH (IIa).

[0095] Nas modalidades em que os seis aminoácidos selecionados do grupo que consiste de X1, X3, X4, X5, X6, e X7 podem ter o significado preferencial especificado acima e em que o aminoácido X2 significa A (Alanina), então o dito peptídeo imunogênico consiste do peptídeo da fórmula (IIb): NH2- [Nt]y-P-W-N-A-S- A-S-N-K-S-L-D-D-I-W-[Ct]z-COOH (IIb),

[0096] que também pode ser denominado: NH2- [Nt]y-SEQ ID N° 6-[Ct]z-COOH (IIb).

[0097] Um peptídeo Nt que tem de 1 a 100 resíduos de aminoácido em comprimento abrange peptídeos que têm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100 resíduos de aminoácido em comprimento.

[0098] Em algumas modalidades, um peptídeo Nt tem 10 resíduos de aminoácido em comprimento ou menos, o que abrange um comprimento de aminoácido de 5 resíduos de aminoácido ou menos.

[0099] Em algumas modalidades, o resíduo N-terminal de um peptídeo Nt consiste de um resíduo C (Cisteína).

[00100] Em algumas modalidades, o peptídeo Nt é da seguinte fórmula (III): NH2-C-Y1-T-Y2-V-(III) de SEQ ID N° 3 em que:

[00101] - Y1 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de T (Treonina) e P (Prolina),

[00102] - Y2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de A (Alanina), T (Treonina) e N (Asparagina).

[00103] Em algumas outras modalidades, o peptídeo Nt consiste de um resíduo de cisteína (também denominado “C”).

[00104] Um peptídeo Ct que tem de 1 a 100 resíduos de aminoácido em comprimento abrange peptídeos que têm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100 resíduos de aminoácido em comprimento.

[00105] Em algumas modalidades, um peptídeo Ct tem 10 resíduos de aminoácido em comprimento ou menos, o que abrange um comprimento de aminoácido de 5 resíduos de aminoácido ou menos.

[00106] Em algumas modalidades, o resíduo C-terminal de um peptídeo Ct consiste de um C (Resíduo de cisteína).

[00107] Em algumas modalidades, o peptídeo Nt é da seguinte fórmula (IV):

[00108] -Y3-Y4-M-T-W-COOH (III) of SEQ ID N° 4, em que:

[00109] - Y3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de D (Ácido Aspártico), Q (Glutamina), E (Ácido glutâmico) e N (Asparagina), e

[00110] - Y4 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de N (Asparagina), H (Histidina), S (Serina) e K (Lisina).

[00111] Em algumas outras modalidades, o peptídeo Ct consiste de um resíduo de cisteína (também denominado “C”).

[00112] Em algumas outras modalidades, o peptídeo Ct está ausente em um composto imunogênico da invenção.

[00113] Em algumas modalidades específicas de um composto imunogênico de acordo com a invenção, o dito peptídeo é da fórmula (V) descrita abaixo.

[00114] Assim, a presente invenção se refere a um composto imunogênico que compreende um peptídeo da seguinte fórmula (V): NH2-(A1)m-SEQ IDN°1-(A2)n-COOH (V),

[00115] em que:

[00116] - m é um inteiro que significa 0 ou 1,

[00117] - n é um inteiro que significa 0 ou 1,

[00118] - A1 é um resíduo de aminoácido, e

[00119] - A2 é um resíduo de aminoácido,

[00120] cujo peptídeo da fórmula (V) é ligado de forma covalente a uma proteína carreadora que consiste de uma proteína CRM197.

[00121] Em algumas modalidades de um peptídeo da fórmula (V), m é igual a 1, n é igual a 0 e A1 significa um resíduo de Cisteína (C).

[00122] A presente invenção também se refere a um composto imunogênico que compreende um peptídeo da seguinte fórmula (VIa):NH2-(A1)m-SEQ IDN°2-(A2)n-COOH (VIa),

[00123] em que:

[00124] - m é um inteiro que significa 0 ou 1,

[00125] - n é um inteiro que significa 0 ou 1,

[00126] - A1 é um resíduo de aminoácido, e

[00127] - A2 é um resíduo de aminoácido,

[00128] cujo peptídeo da fórmula (VIa) é ligado de forma covalente a uma proteína carreadora que consiste de uma proteína CRM197.

[00129] A presente invenção também se refere a um composto imunogênico que compreende um peptídeo da seguinte fórmula (VIb):NH2-(A1)m-SEQ IDN°6-(A2)n-COOH (VIb),

[00130] em que:

[00131] - m é um inteiro que significa 0 ou 1,

[00132] - n é um inteiro que significa 0 ou 1,

[00133] - A1 é um resíduo de aminoácido, e

[00134] - A2 é um resíduo de aminoácido,

[00135] cujo peptídeo da fórmula (VIb) é ligado de forma covalente a uma proteína carreadora que consiste de uma proteína CRM197.

[00136] Em algumas modalidades de um peptídeo da fórmula (VIa) ou (VIb), m é igual a 1, n é igual a 0 e A1 significa um resíduo de cisteína (C).

[00137] Conforme é imediatamente evidente, peptídeos das fórmulas (V), (VIa) ou (VIb) são modalidades específicas de um peptídeo da fórmula (I) de acordo com a invenção. Assim, toda a modalidade de um composto imunogênico da invenção que é descrito com uma referência a um peptídeo da fórmula (I) abrange a mesma modalidade onde o peptídeo da fórmula (I) consiste de um peptídeo da fórmula (V) ou um peptídeo da fórmula (VIa) ou (VIb), a menos que seja especificado o contrário.

[00138] Conforme também é imediatamente evidente, os peptídeos das fórmulas (VIa) ou (VIb) são as modalidades específicas de um peptídeo da fórmula (V) de acordo com a invenção. Assim, toda a modalidade de um composto imunogênico da invenção que é descrita com uma referência a um peptídeo da fórmula (I) ou da fórmula (V) abrange a mesma modalidade onde o peptídeo da fórmula (I) ou da fórmula (V) consiste de um peptídeo da fórmula (VIa) ou (VIb), a menos que seja especificado o contrário.

[00139] Conforme usado no presente documento, os resíduos de aminoácido abrangem Alanina (também denominado “A” ou “Ala”), Arginina (também denominado (“R” ou “Arg”), Asparagina (também denominado “N” ou “Asn”), Ácido Aspártico (também denominado “D” ou “Asp”), Cisteína (também denominado “C” ou “Cys”), Glutamina (também denominado “Q” ou Gln”), Ácido glutâmico (também denominado (“E” ou “Glu), Glicina (também denominado “G” ou “Gly”), Histidina (também denominado “H” ou “His”), Isoleucina (também denominado “I” ou “Ile”), Leucina (também denominado “L” ou “Leu”), Lisina (também denominado “K” ou “Lys”), Metionina (também denominado “M” ou “Met”), FenilAlanina (também denominado (“F” ou “Phe”), Prolina (também denominado “P” ou “Pro”), Serina (também denominado “S” ou “Ser”), Treonina (também denominado “T” ou “Thr”), Triptofano (também denominado “W” ou “Trp”), Tirosina (também denominado “Y” ou “Tyr”) e Valina (também denominado “V” ou “Val”).

[00140] Conforme especificado anteriormente, a CRM197 é uma molécula carreadora não convencional para apresentação de antígeno de proteína para as células do sistema imunológico. A CRM197 está facilmente disponível para um versado na técnica. A CRM197 é notavelmente comercializada sob a referência CRM197 (rDNA) pela Company Pfenex Inc (San Diego, USA). A CRM197 é definida como a proteína da SEQ ID N° 8 no presente documento.

[00141] Um peptídeo da fórmula (I) que inclui as modalidades específicas do mesmo da fórmula (V) e das fórmulas (VIa) ou (VIb), conforme descrito no presente documento, pode ser produzido por uma técnica de clonagem conhecida ou por síntese química.

[00142] Por exemplo, DNA que codifica um peptídeo da fórmula (I) é preparado pelo uso de uma tecnologia de clonagem e inserido em um vetor autonomamente replicável para preparar um DNA recombinante. O DNA recombinante é introduzido em um hospedeiro apropriado como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces, levedura, bolor, uma célula vegetal, uma célula de inseto e uma célula animal para obter um transformante. A partir do produto cultivado do transformante, um peptídeo que contém um peptídeo da fórmula (I) pode ser obtido. Alternativamente, um DNA que codifica um peptídeo da fórmula (I) é preparado e submetido a um sistema de síntese de proteína acelular que usa germe de trigo e um extrato celular de Escherichia coli para sintetizar o peptídeo da invenção. Em algumas modalidades onde o peptídeo da fórmula (I) é ligado a uma proteína carreadora, então um produto imunogênico que consiste de uma proteína de fusão que contém tanto um peptídeo da fórmula (I) quanto uma proteína carreadora desejada pode ser sintetizado por uma técnica de DNA recombinante.

[00143] Além disso, com o uso de um método de síntese química comum para um peptídeo da fórmula (I) como um "método de fase sólida" ou um "método de fase líquida", os aminoácidos são conectados sucessivamente e estendidos por desidratação/condensação.

[00144] Para a fabricação de um composto imunogênico conforme definido acima, qualquer reação de conjugação pode ser usada com qualquer ligante adequado onde necessário, o que é bem conhecido pelo versado na técnica.

[00145] Em certas modalidades de um peptídeo da fórmula (V), (VIa) ou (VIb), os resíduos de aminoácido A1 e/ou A2 estão ausentes, onde os inteiros m e/ou n é(são) iguais a 0, respectivamente.

[00146] Em algumas modalidades de um peptídeo da fórmula (V), (VIa) ou (VIb), A1 está presente (isto é, o inteiro m=1) e A2 está ausente (isto é, o inteiro n=0)

[00147] Em algumas modalidades de um peptídeo da fórmula (V), (VIa) ou (VIb), A1 está ausente (isto é, o inteiro m=0) e A2 está presente (isto é, o inteiro n=1).

[00148] Em algumas modalidades preferenciais de um peptídeo da fórmula (V), (VIa) ou (VIb), A1 e/ou A2, quando presentes, consistem de um resíduo de cisteína.

[00149] Em algumas modalidades preferenciais de um peptídeo da fórmula (V), (VIa) ou (VIb), A1 está presente e consiste de um resíduo de cisteína N-terminal e A2 está ausente, isto é, o inteiro n é igual a 0. Nessas modalidades preferenciais, o peptídeo ou a fórmula (V), ou (VIa) consiste do peptídeo da SEQ ID N°5. Nessas modalidades preferenciais, o peptídeo da fórmula (V) ou (VIb) consiste do peptídeo de SEQ ID N° 7.

[00150] Em um ponto de vista técnico, os peptídeos da fórmula (I), os quais incluem peptídeos da fórmula (V) ou da fórmula (VI), acima podem ser ligados de forma covalente a CRM197 ou diretamente ou através de um grupamento ligante, através do resíduo de aminoácido de extremidade N-terminal dos mesmos ou através do resíduo de aminoácido de extremidade C-terminal dos mesmos. Nessas modalidades gerais, a ligação covalente pode envolver um grupo alfa-amino disponível ou grupo alfa-carbóxi do dito resíduo de aminoácido de um peptídeo da fórmula (I). Alternativamente, a ligação covalente pode envolver um grupo amino disponível, grupo carbóxi ou grupo tiol localizado em uma cadeia lateral do dito resíduo de aminoácido de um peptídeo da fórmula (I).

[00151] Entretanto, foi encontrado no presente documento que um composto imunogênico conforme definido acima em que os peptídeos da fórmula (I) são ligados de forma covalente à CRM197 através da extremidade C-terminal do mesmo não é ótimo, uma vez que tal peptídeo imunogênico tem uma propensão em formar agregados, os quais podem representar uma desvantagem significativa para obtenção de uma composição farmacêutica quimicamente definida e facilmente reprodutível.

[00152] Assim, em algumas modalidades preferenciais de um composto imunogênico conforme definido acima, o peptídeos da fórmula (I) são ligados de forma covalente à CRM197 através da extremidade N-terminal dos mesmos.

[00153] Adicionalmente, em um composto imunogênico conforme definido acima, os peptídeos da fórmula (I) são ligados de forma covalente à CRM197 mais preferencialmente através de um agente ligante próprio. Foi encontrado no presente documento que a presença de um agente ligante que liga em ponte peptídeos da fórmula (I) e CRM197 introduz alguma flexibilidade na molécula, o que permite assim uma melhor disponibilidade dos epítopos relevantes contidos nos peptídeos da fórmula (I) para os receptores correspondentes presentes na superfície das células do sistema imunológico, isto é, principalmente T células e B células.

[00154] Assim, em algumas modalidades preferenciais de um composto imunogênico conforme definido acima, peptídeos da fórmula (I) são ligados de forma covalente à CRM197 através de um grupamento ligante.

[00155] Em algumas modalidades preferenciais, os peptídeos da fórmula (I) são ligados de forma covalente à CRM197 pela extremidade N-terminal dos mesmos, através de um grupamento ligante.

[00156] O dito grupamento ligante é obtido pela reação de um agente ligante tanto com CRM197 quanto com peptídeos da fórmula (I).

[00157] Em modalidades preferenciais, o agente ligante possui dois grupos reativos distintos, (i) um grupo succinimidila e (ii) um grupo maleímida, respectivamente. Cada um dos grupos reativos está disponível para reação com um grupo amino ou um grupo tiol de (i) CRM197 e de (ii) um peptídeo da fórmula (I), respectivamente.

[00158] Tal tipo de agente ligante é bem conhecido na técnica e é facilmente disponível comercialmente.

[00159] Entretanto, foram encontrados no presente documento alguns desses agentes ligantes heterobifuncionais não são ótimos, especialmente quando a fabricação de uma composição de vacina é procurada. De modo ilustrativo, os inventores encontraram que o uso de um agente ligante heterobifuncional similar a MBS (éster de m-MaleimidoBenzoil-N-hidroxiSuccinimidila) leva a um produto final que é bem pouco solúvel em água. Uma baixa solubilidade em água de um composto imunogênico pode consistir de uma desvantagem técnica substancial tendo em vista a fabricação de uma composição de vacina, uma vez que as formas finais das composições de vacina que estão prontas para ser administradas normalmente consistem de soluções líquidas salinas com base em água ou suspensões que podem eventualmente também conter um ou mais solventes solúveis em água farmaceuticamente aceitáveis. Conforme ilustrado nos exemplos no presente documento, um imunoconjugado em que CRM197 é ligado de forma covalente a peptídeos da fórmula (I) através de MBS permanece imunogênico, isto é, capaz de elevar anticorpos anti-3S relevantes quando injetado in vivo, independente da incapacidade do mesmo de ser usado como o ingrediente ativo de uma composição de vacina devido à propensão do mesmo em formar agregados.

[00160] Surpreendentemente, os inventores determinaram que uma família restrita de agentes ligantes é a mais apropriada para fabricar um composto imunogênico conforme definido no presente documento que deve ser completamente solúvel em água e, assim, deve ser distribuído de forma homogênea por todo o volume de uma composição líquida com a o objetivo de ser elegível como o ingrediente ativo imunogênico de uma composição de vacina. A dita família restrita de agentes ligantes abrange ou até mesmo consiste dos agentes ligantes denominados SMPB e sulfo- SMPB, respectivamente.

[00161] Assim, em algumas modalidades preferenciais de um composto imunogênico conforme definido acima, o dito agente ligante é selecionado do grupo que consiste de SMPB (succinimidila 4-[p-maleimidofenil]butirato) e Sulfo-SMPB (sulfosuccinimidila 4-[p-maleimidofenil]butirato).

[00162] Os métodos para conjugar duas proteínas com um agente ligante em geral e, mais particularmente com um agente ligante selecionado do grupo que consiste de SMPB e Sulfo-SMPB, são bem conhecidos pelo versado na técnica. De modo ilustrativo, tais protocolos são revelados nos folhetos que são disponibilizados publicamente pela Pierce Company (Illinois, Estados Unidos).

[00163] SMPB e Sulfo-SMPB consistem de agentes ligantes heterobifuncionais que contêm tanto um grupo de éster N-hidroxisuccinimida (NHS) e um grupo maleímida. A conjugação com o uso de SMPB ou Sulfo-SMPB normalmente é realizada por um procedimento de duas etapas. Em uma primeira etapa, a proteína que contém amina (por exemplo, CRM197) é reagida com um excesso molar de diversas grandezas do agente ligante em um pH de 7 a 9 para formar ligações de amida, seguida pela remoção do agente ligante não reagido em excesso, normalmente pela dessalinização ou diálise. Em uma segunda etapa, a molécula que contém sulfidrila (por exemplo, o peptídeo da fórmula (I)) é adicionado para reagir com os grupos maleímida já fixados à primeira proteína (por exemplo, grupos maleímida livres da cadeia de ligante que já está ligada de forma covalente à CRM197) em um pH de 6,5 a 7,5 para formar ligações de tioéter estáveis.

[00164] Usar SMPB ou Sulfo-SMPB como agentes ligantes para ligar de forma covalente peptídeos da fórmula (I) à proteína carreadora CRM197 leva a um conjugado da fórmula (VII) abaixo:

[00165] em que:

[00166] - R1 consiste de um grupo reativo de CRM197 e em que o grupo NH fixado ao mesmo deriva (i) do grupo alfa-amino localizado na extremidade de N-terminal de CRM197 ou (ii) de um grupo amino de cadeia lateral de um resíduo de aminoácido Lisina (K) de CRM197

[00167] - R2 consiste de um peptídeo da fórmula (I) e em que o átomo de enxofre (S) fixado ao mesmo deriva de um grupo sulfidrila (SH) de um resíduo de cisteína localizado na extremidade N-terminal ou na extremidade C-terminal de um peptídeo da fórmula (I). Em algumas modalidades, o grupamento de sulfidrila poderia ser parte de um aminoácido não natural ou qualquer outra molécula presente na extremidade do peptídeo da fórmula (I).

[00168] Conforme é conhecido na técnica, a proteína CRM197 compreende uma pluralidade de grupos reativos R1, de forma que uma pluralidade de peptídeos da fórmula (I) pode ser ligada à CRM197 em um conjugado da fórmula (VII).

[00169] Assim, as modalidades mais preferenciais de um composto imunogênico conforme definido acima são aquelas em que uma pluralidade de grupos reativos de CRM197 são ligados de forma covalente a um peptídeo da fórmula (I) que tem a SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°7, cujo peptídeo possui um resíduo de cisteína na extremidade N-terminal do mesmo de acordo com a ligação covalente representada pela fórmula (VII) acima.

[00170] Em algumas modalidades de um composto imunogênico conforme definido acima, um número médio de peptídeos da fórmula (I) na faixa de 2 a 20 são ligados de forma covalente a uma molécula de CRM197. Em modalidades preferenciais, um número médio de 5 a 10 peptídeos da fórmula (I) que inclui um número médio de 7 a 8 peptídeos da fórmula (I) são ligados de forma covalente a uma molécula de CRM197.

[00171] Esta invenção também se refere a composições que compreendem um composto imunogênico conforme definido acima em combinação com uma ou mais substâncias imunoadjuvantes.

[00172] Uma composição conforme definida no presente documento que compreende um composto imunogênico conforme definido acima e que compreende adicionalmente uma ou mais substâncias imunoadjuvantes também pode ser denominada uma "composição imunogênica" ou alternativamente uma “composição de vacina” no presente relatório descritivo.

[00173] Em algumas modalidades, não há distinção substancial a ser feita entre uma composição imunogênica de acordo com a invenção e uma composição de vacina de acordo com a invenção, além dos termos empregados para designar tais composições, exceto que os recursos da composição de vacina devem se adequar aos requisitos técnicos das várias agências de fármaco para a concessão de autorizações de comercialização para uso humano ou veterinário. Ao invés disso, uma composição imunogênica de acordo com a invenção pode não se adequar aos requisitos das agências de fármaco enquanto ainda é útil para administração em animais, por exemplo, para produzir anticorpos anti-3S que podem ser para uso adicional que inclui um uso adicional como um reagente de detecção ou diagnóstico.

[00174] Mais precisamente, uma composição imunogênica é almejada na geração de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) quando a mesma é administrada a um organismo mamífero, por exemplo, um camundongo, um coelho, uma ovelha, um cavalo ou um organismo de cabra, em situações em que não se espera que os anticorpos gerados exerçam um efeito preventivo ou terapêutico no organismo mamífero imunizado. As composições imunogênicas de acordo com a invenção podem ser usadas para produzir anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) para um uso não terapêutico adicional desses anticorpos, por exemplo, como um reagente de detecção do vírus HIV-1 ou como um reagente de detecção de peptídeo derivado do HIV-1.

[00175] Por outro lado, uma composição de vacina de acordo com a invenção é almejada na geração de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) no organismo mamífero ao qual a dita composição de vacina é administrada em situações em que se espera que os anticorpos gerados exerçam um efeito preventivo ou terapêutico no organismo mamífero imunizado.

[00176] Assim, as composições de acordo com a invenção abrangem tanto (i) composições imunogênicas quanto (ii) composições de vacina. Adicionalmente, as composições imunogênicas e composições de vacina podem diferir no tipo de substâncias auxiliares, as quais incluem substâncias imunoadjuvantes e excipientes que são contidos nas mesmas. Uma composição imunogênica de acordo com a invenção pode elevar uma produção de anticorpo anti-3S em um animal que inclui animais que não estão em risco em relação a uma infecção por um vírus HIV, para os quais nenhum efeito preventivo nem terapêutico é procurado. Uma composição de vacina de acordo com a invenção é almejada, no indivíduo que foi administrado com a mesma, na elevação da produção de anticorpos anti-3S que irão exercer um efeito preventivo ou terapêutico contra uma infecção por um vírus HIV, especialmente um efeito protetor contra o declínio de célula T CD4+ em indivíduos infectados com HIV, o que causa uma diminuição da patogenicidade do vírus.

[00177] Em algumas modalidades de uma composição imunogênica ou de uma composição de vacina conforme definido no presente documento, um imunoadjuvante pode ser selecionado do grupo que consiste de (i) sais minerais, (ii) emulsões, (iii) derivados microbianos naturais ou sintéticos, (iv) adjuvantes de combinação, (v) adjuvantes derivados de citocina ou derivados de moléculas assessoras e (vi) formulações particuladas.

[00178] Uma lista de imunoadjuvantes adequados é descrita na Tabela abaixo.

[00179] Os imunoadjuvantes que compreendem sais minerais são preferencialmente selecionados do grupo que consiste de (1) sais de alumínio, preferencialmente da fórmula KAl(SO4)2, 12 H2O e (2) fosfato de cálcio.

[00180] Os imunoadjuvantes com base em emulsão são preferencialmente selecionados do grupo que consiste de (1) MF59 que é uma emulsão de óleo em água de esqualeno estabilizado detergente microfluidizado, (2) adjuvante de Freund incompleto, também denominado IFA, (3) Montanide ISA 51 que é uma emulsão estabilizada de água em óleo, (4) e (4) ISA-720 que é uma composição estabilizada que compreende água e esqualeno.

[00181] Os imunoadjuvantes que compreendem derivados microbianos naturais ou sintéticos são preferencialmente selecionados do grupo que consiste de (1) monofosforil lipídio A (MPL) (por exemplo, de Corixa, Hamilton, Mont., USA) (2) Detox (MPL+CWS), que consiste de uma emulsão de gotícula de óleo de monofosforil lipídio A e esqueleto de parede celular micobacteriana, (3) OM-174 que é um adjuvante solúvel derivado de Escherichia coli lipídio A, (4) toxinas bacterianas não tóxicas, preferencialmente toxinas modificadas como a toxina instável no calor de E. coli, a toxina cólera e, em particular, as subunidades B das mesmas (denominadas LTB e CTB, respectivamente), e (5) CpG ODN que são oligonucleotídeos sintéticos que contêm motivos CpG imunoestimulantes.

[00182] Adjuvantes de combinação são preferencialmente selecionados do grupo que consiste de (1) AS04 que é uma combinação de alume e monofosforil lipídio A (MPL), (2) AS02 que é uma emulsão óleo em água que compreende uma combinação de monofosforil lipídio A (MPL) e QS-21 (por exemplo, da Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass., USA), e (3) AS01 que é consiste de uma suspensão líquida de lipossomos com dois componentes imunoestimulantes: 3’-O-desacil-4’- monofosforil lipídio A (MPL) e Quillaja saponaria 21 (QS-21).

[00183] Adjuvantes derivados de citocina ou derivados de moléculas assessoras são preferencialmente selecionados do grupo que consiste de (1) citocinas como IL- 2, IL-12 (por exemplo, da Genetics Institute, Cambridge, Mass., USA), GM-CSF (por exemplo, da Hoffman La-Roche, Basel, Suíça) e Flt3 e (2) moléculas assessoras como B7.1

[00184] Formulações particuladas são preferencialmente selecionadas do grupo que consiste de (1) lipossomos como lipossomos de DNPC/Chol ou DC Chol, sendo que o posterior consiste de imunomoduladores lipoides que são capazes de se autoorganizar em lipossomos, (2) Virosomes™ que são veículos lipossômicos unilamelares, virossomos de influenza reconstituídos imunoestimulantes [IRIV], (3) ISCOMS® que é complexo estruturado de saponinas e lipídeos, (4) ácido poliláctico (PLA) e poli[lactídeo-co-glicolídeo] (micropartículas de PLG, e (5) Proteosomes™.

[00185] Os compostos ou composições imunoadjuvantes descritos acima estão facilmente disponíveis para um versado na técnica, notavelmente devido aos mesmos estarem comercialmente disponíveis.

[00186] Entretanto, os inventores encontraram que, ao usar especificamente um composto imunogênico conforme definido no presente documento, uma resposta de anticorpo eficaz é obtida, isto é, uma resposta de anticorpo que tem uma ordem de magnitude que se adequa a um efeito preventivo ou terapêutico em indivíduos humanos, quando o dito composto imunogênico é combinado com hidróxido de alumínio (Al(OH)3) como a substância imunoadjuvante. A substância imunoadjuvante com base em hidróxido de alumínio consiste de um material particulado sob a forma de uma suspensão coloidal que tem uma distribuição de tamanho de partícula de cerca de 1 a 10 μm com um tamanho de partícula médio de cerca de 2 a 3 μm (Lindblad, 2004, Immunology and Cell Biology, Vol. 82: 497 a 505).

[00187] Visivelmente, os inventores encontraram que outras substâncias imunoadjuvantes altamente convencionais, incluindo especialmente o fosfato de alumínio imunoadjuvante bem conhecido, permitem a indução de menores níveis de titulação de anticorpo 3S antipeptídeo em comparação ao hidróxido de alumínio, cujos níveis de titulação de anticorpo podem ser úteis para produzir anticorpos como reagentes laboratoriais, mas são muito baixos para uma produção endógena de anticorpos anti-3S capazes de exercer um efeito médico preventivo ou terapêutico.

[00188] Assim, em modalidades preferenciais de uma composição de acordo com a invenção, a dita substância imunoadjuvante consiste de hidróxido de alumínio.

[00189] Adicionalmente, os inventores encontraram que, para obter uma resposta de anticorpo anti-3S ótima, hidróxido de alumínio deve ser usado em condições preferenciais para evitar a agregação das partículas de Al(OH)3 e garantir uma distribuição homogênea dessas partículas na suspensão líquida final.

[00190] De acordo com a invenção, foi encontrado que a formação de agregados de partícula de hidróxido de alumínio pode ser evitada ou pelo menos substancialmente atrasada ou reduzida, quando a composição pronta para uso final compreende 100 a 200 mM de NaCl e 0,5 a 2,0 mM de fosfato de sódio e mais preferencialmente 150 mM de NaCl e 1 mM de fosfato de sódio. De acordo com essa modalidade, a taxa de agregação de partículas de hidróxido de alumínio é altamente minimizada, com a alteração da habilidade das partículas de adsorver o composto imunogênico, cujas condições específicas melhoram a habilidade da composição em elevar uma produção de anticorpo 3S antipeptídeo protetora eficaz.

[00191] Assim, em algumas modalidades de uma composição de acordo com a invenção, a dita composição é adaptada para formar uma composição de vacina pronta para uso que compreende uma concentração final de hidróxido de alumínio na faixa de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, preferencialmente de 0,05 mg/ml a 2 mg/ml e é mais preferencialmente de cerca de 1 mg/ml, conforme expressa como teor de íons Al3+. De acordo com a European Pharmacopoeia, a quantidade de adjuvante de alumínio deve ser menor que 1,25 mg de alumínio por dose e 850 μg de alumínio por dose nos Estados Unidos (de acordo com o Código das Regulações Federais)

[00192] Além disso, de acordo com certas modalidades de uma composição de acordo com a invenção, a dita composição é adaptada para formar uma composição de vacina pronta para uso que compreende uma concentração final de 0,1 mM a 50 mM de fosfato de sódio, preferencialmente 0,5 mM a 15 mM de fosfato de sódio e mais preferencialmente ao redor de 1 mM de fosfato de sódio.

[00193] Em um aspecto específico, uma composição de acordo com a invenção é adaptada para formar uma composição de vacina pronta para uso que compreende uma quantidade do dito composto imunogênico na faixa de 0,01 μg a 200 μg por unidade de dosagem conforme expresso no peptídeo antigênico equivalente, preferencialmente de 0,05 μg e 50 μg por unidade de dosagem e mais preferencialmente de 0,1 μg a 20 μg por unidade de dosagem.

[00194] Conforme usada no presente documento, uma quantidade de um composto imunogênico expresso como "peptídeo antigênico equivalente" consiste da quantidade de peptídeos da fórmula (I) que é contida no material de composto imunogênico considerado. De acordo com a invenção, a quantidade de peptídeos da fórmula (I) que são ligados a uma molécula de CRM197 é medida preferencialmente por análise de aminoácido. Esse método é a metodologia normalmente usada para determinar a composição de aminoácidos das proteínas. As proteínas são macromoléculas que consistem de resíduos de aminoácido, ligados de forma covalente, organizados como um polímero linear. As ligações peptídicas são quebradas após incubação sob condições ácidas que levam à liberação de aminoácidos. Uma análise de aminoácido é, então, realizada no produto da hidrólise.

[00195] De acordo com a presente invenção, a análise de aminoácido é preferencialmente usada para determinar a taxa de acoplamento de peptídeo da fórmula (I) em CRM197. Isso foi possível uma vez que alguns aminoácidos estão presentes tanto em CRM197 quanto nos peptídeos enxertados e outros como F (FenilAlanina) estão presentes somente em CRM197. Com base nos resultados dos aminoácidos presentes somente em CRM197 e daqueles presentes tanto em CRM197 quanto no peptídeo da fórmula (I) conjugado ao mesmo, um cálculo permitiu determinar a razão de acoplamento do peptídeo da fórmula (I) em CRM197.

[00196] Normalmente, após hidrólise do conjugado entre CRM197 e peptídeos da fórmula (I), os aminoácidos presentes nas amostras de teste são separados por cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa (RP-HPLC). Normalmente, esse instrumento tem uma capacidade de derivação pré- ou pós-coluna e o detector é um detector de ultravioleta visível ou fluorescência dependendo do método de derivação usado. Um integrador é usado para a transformação do sinal analógico do detector e para quantificação de cada aminoácido. (Amino acid analysis of peptide loading ratios in conjugate vaccines: a comparison of electrochemical detection and 6-aminoquinolyl- N-hydroxysuccinimidyl carbamate pre-column derivatization methods Nahas DD et al Bioconj Chem 19 de janeiro de 2008 (1) 322 a 6 Epub 12 de dezembro de 2007). Uma quantidade de peptídeos da fórmula (I) que são ligados a uma molécula de CRM197 também pode ser medida por análise de espectrometria em massa.

[00197] Uma composição de acordo com a invenção pode estar nas formas líquida e sólida.

[00198] Em algumas modalidades, uma composição de acordo com a invenção consiste em uma suspensão líquida, tanto como um concentrado de suspensão líquida como como uma suspensão líquida pronta para uso.

[00199] Em outras modalidades, uma composição de acordo com a invenção consiste em um material particulado sólido (isto é, o conjugado), que inclui especialmente um material liofilizado e tem de ser colocado em contato com o adjuvante e outros excipientes antes da injeção.

[00200] Esta invenção também diz respeito a uma composição de vacina que compreende um composto imunogênico conforme definido acima, ou uma composição conforme definido acima, com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[00201] A formulação de tais composições imunogênicas é conhecida às pessoas versadas na técnica. Composições imunogênicas da invenção incluem preferencialmente um carreador farmaceuticamente aceitável. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis e/ou diluentes adequados incluem qualquer um e todos os solventes convencionais, meios de dispersão, cargas, carreadores sólidos, soluções aquosas, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de atraso de absorção, e similares. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, um ou mais dentre água, salino, solução salina tamponada de fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, assim como combinações dos mesmos. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem compreender adicionalmente quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes e emulsificantes, conservantes ou tampões, que intensificam a vida de prateleira ou eficácia do anticorpo. A preparação e uso de carreadores farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica. Exceto na medida que quaisquer meios ou agente convencional sejam incompatíveis com o ingrediente ativo, o uso dos mesmos nas composições imunogênicas da presente invenção é contemplado.

[00202] Tais composições imunogênicas podem ser administradas de modo parenteral, por exemplo, por injeção, de modo tanto subcutâneo como intramuscular, assim como de modo oral ou intranasal e por meio de vias mucosas. Outros modos de administração empregam formulações orais, formulações pulmonares, supositórios, e aplicações transdérmicas, por exemplo, sem limitação. Formulações orais, por exemplo, incluem tais excipientes normalmente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, e similares, sem limitação.

[00203] É mostrado nos exemplos no presente documento que uma composição que compreende um composto imunogênico conforme definido acima em combinação com a substância imunoadjuvante apropriada e com o(s) excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(is) apropriado(s) induz, quando administrado a um indivíduo, a produção de altas titulações de anticorpos igG de peptídeo anti-3S.

[00204] Com importância, os exemplos no presente documento mostram que os anticorpos igG de peptídeo anti-3S constatados no soro de indivíduos imunizados com uma composição de acordo com a invenção inibem a expressão de NKp44L na superfície de células CD4+ T de maneira dependente de dose.

[00205] Conforme é conhecido na técnica, a inibição de expressão de NKp44L na superfície das células CD4+ T causa um efeito protetor no declínio de células CD4+ T diminuindo-se a ativação de célula NK e citotoxidade de célula NK às células CD4+ T em indivíduos infectados com HIV.

[00206] A presente invenção também diz respeito ao composto imunogênico conforme definido acima, ou à composição conforme definido acima, para uso como um medicamento.

[00207] Esta invenção também se refere ao composto imunogênico conforme definido acima, ou à composição conforme definido acima, para uso para prevenir e/ou tratar uma afecção causada pela infecção de um indivíduo com um vírus HIV.

[00208] Conforme usado no presente documento, a prevenção ou tratamento de uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1 abrange (i) prevenir ou tratar uma doença ligada a uma infecção do dito indivíduo com um vírus HIV-1, incluindo AIDS e (ii) prevenir o progresso de doença HIV-1.

[00209] Conforme usado no presente documento, o termo "infecção por HIV" geralmente abrange infecção de um animal hospedeiro, particularmente um hospedeiro humano, pelo vírus de imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). "HIV-1" pode ser usado no presente documento para se referir a quaisquer cepas, formas, subtipos, clados e variações na família HIV-1. Desse modo, tratar infecção por HIV-1 abrangerá o tratamento de uma pessoa que é um portador de qualquer um da família HIV-1 de retrovírus ou uma pessoa que é diagnosticada como AIDS ativo, assim como o tratamento ou profilaxia das afecções associadas à AIDS em tais pessoas. Um portador de HIV-1 pode ser identificado por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma pessoa pode ser identificada como um portador de HIV-1 com base de que a pessoa é positiva para anticorpo anti-HIV-1, ou é positiva para HIV-1, ou tem sintomas de AIDS. Ou seja, "tratar infecção por HIV-1" deve ser entendido como tratar um paciente que está em qualquer um dos diversos estágios de infecção por progressão de HIV-1, que, por exemplo, incluem síndrome de infecção primária aguda (que pode ser assintomática ou associada a uma enfermidade similar à influenza com febres, mal-estar, diarreia e sintomas neurológicos tais como dor de cabeça), infecção assintomática (que é o longo período assintomático com um declínio gradual no número de células circulatórias CD4+ T), e AIDS (que é definida por mais enfermidades sérias que definem AIDS e/ou um declínio na contagem de célula CD4 circulatória a abaixo de um nível que é compatível com a função imune eficaz). adicionalmente, "tratar ou prevenir infecção por HIV-1" também abrangerá tratar infecção suspeita por HIV-1 após exposição passada esperada a HIV-1 por, por exemplo, contato com sangue contaminado com HIV-1, transfusão de sangue, troca de fluidos corporais, relação sexual "não segura" com uma pessoa infectada, seringa acidental, receber uma tatuagem ou acupuntura com instrumentos contaminados, ou transmissão do vírus de uma mãe a um bebê durante gestação, entrega ou assim por diante. • termo “tratar infecção por HIV-1” também deve ser entendido no contexto de terapias antirretrovirais, sejam os pacientes totalmente responsivos ou parcialmente responsivos a tais terapias em termos de carga viral e/ou contagem de célula CD4 T. • termo "prevenir infecção por HIV-1" pode abranger tratar uma pessoa que é livre de infecção por HIV-1 mas é considerada como em risco de infecção por HIV-1, mais cedo ou mais tarde. • termo "tratar AIDS" significa tratar um paciente que exibe enfermidades mais sérias que definem AIDS e/ou um declínio na contagem de célula CD4+ T circulatória a abaixo de um nível que é compatível com a função imune eficaz. O termo "tratar AIDS" também abrange tratar afecções associadas à AIDS, que significa distúrbios e doenças incidentais ou associadas a AIDS ou infecção por HIV-1 tais como complexo associado à AIDS (ARC), linfadenopatia generalizada progressiva (PGL), afecções positivas para anticorpo anti-HIV anticorpo, e afecções positivas para HIV, afecções neurológicas associadas à AIDS (tais como demência ou paralisia tropical), sarcoma de Kaposi, trombocitopenia púrpura e infecções oportunistas associadas tais como pneumonia Pneumocystis carinii, tuberculose micobacteriana, candidíase esofágica, toxoplasmose do cérebro, retinite de CMV, encefalopatia associada à HIV, síndrome de definhação associada à HIV-1, etc.

[00210] Desse modo, o termo "prevenir AIDS" conforme usado no presente documento significa prevenir em um paciente que tem infecção por HIV-1 ou é suspeito de ter infecção por HIV-1 ou está em risco de infecção por HIV-1 de desenvolver AIDS (que é caracterizada por enfermidades mais sérias que definem AIDS e/ou um declínio na contagem de célula CD4+ T circulatória a abaixo de um nível que é compatível com a função imune eficaz) e/ou afecções associadas à AIDS.

[00211] Desse modo, os termos “prevenir progresso de HIV-1” conforme usado no presente documento significa prevenir em um paciente que tem uma infecção por HIV- 1, a diminuição de sua contagem de célula CD4+ T e/ou prevenir o aumento de sua carga viral, os dois marcadores principais ligados à complicação da doença e a um aumento de severidade da doença.

[00212] A invenção também lida com o uso do composto imunogênico conforme definido acima, ou a composição conforme definido acima, para preparar uma composição de vacina para prevenir e/ou tratar uma afecção causada pela infecção de um indivíduo com um vírus HIV.

[00213] A presente invenção também diz respeito a um método para prevenir e/ou tratar uma afecção causada pela infecção de um indivíduo por um vírus HIV, que compreende uma etapa de administrar a um indivíduo em necessidade da mesma, uma quantidade eficaz de uma composição de vacina conforme definido no presente relatório descritivo.

[00214] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos doravante sem se limitar aos mesmos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE UM COMPOSTO IMUNOGENICO E DETERMINAÇÃO DE ALGUMAS DE SUAS PROPRIEDADES A. PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS IMUNOGENICOS

[00215] Os compostos imunogênicos ou conjugados a seguir foram sintetizados. Os mesmos foram derivados de KLH e CRM197 com o uso tanto de MBS como de SMPB como moléculas reticulantes. O peptídeo usado foi o peptídeo 3S que consiste em SEQ ID N°2 com tanto um resíduo de cisteína adicional em sua extremidade amino-terminal como em sua extremidade carbóxi-terminal. - CRM197-MBS-Nter(Cys)- 3S - CRM197-SMPB-Nter(Cys)- 3S - CRM197-SMPB-Cter(Cys)- 3S - KLH-MBS-Nter(Cys)- 3S

[00216] Para fins de clareza, o peptídeo que é denominado “Nter(Cys)-3S” acima consiste no peptídeo 3S de SEQ ID N°5 no presente documento.

[00217] Dois reticulantes heterobifuncionais foram testados: sulfo-SMPB (Masirato de Sulfo-(Succinimidil-4-(p-maleimidofenil)) e sulfo-MBS (Éster sulfo-(m- Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida)). Essas moléculas consistem em um grupamento de maleimida ligada por uma cadeia de polietileno a um éster de N- hidroxisuccinimida (Reticulação de proteína por ésteres de w-maleimido alcanoil H- hidroxisuccinimido. Partis M.D e al. Journal of Protein Chemistry, vol.2, N° 3, 1983). O grupamento de succinimida pode reagir com grupos amino da proteína. Uma vez que essa reação ocorreu, o grupamento de maleimida reage com grupos sulfidrila dos peptídeos 3S. Os mesmos têm comprimentos diferentes, 7,3 A para sulfo-MBS e 11,6 A for sulfo-SMPB. A eliminação de ligante e a troca de tampão foram feitas por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

[00218] A reação de acoplamento foi uma reação de duas etapas. A primeira etapa foi a ativação do CRM197 com o reticulante. 15 miligramas de ligante, diluído em sulfóxido de dimetila foram adicionados a 20 miligramas de CRM197 em um volume de 5 a 20 ml de tampão de conjugação (PBS 10 mM pH7-pH7,4) e misturado gentilmente por 30 a 90 min em temperatura ambiente (Protective imunogenicity of two synthetic peptides selected from the amino acid sequence od Bordetella pertussis toxin subunit S1. Askelof P. e al. PNAS, vol,87, pp 1347 a 1351, Fevereiro de 1990). Essa reação foi seguida por uma purificação do CRM197 ativado por SEC (Coluna PD10 (GE Healthcare, Chalfont St. Giles Reino Unido) ou coluna Bio-Gel P2 (Biorad Marnes-la-Coquette, França). Em segundo lugar, o CRM197 ativado e o peptídeo derivado de 3S foram misturados por 30 min a 2 horas em temperatura ambiente permitindo o acoplamento covalente do peptídeo no CRM197 ativado. Para bloquear grupos maleimido não reagidos de CRM197 ativado, cisteína-HCl (SIGMA, Missouri, E.U.A) é adicionada em excesso à solução após a reação de conjugação (A practical approach to crosslinking. Mattson G. e al. Molecular Biology Reports 17: 167 a 183, 1993). Essa etapa limitou a criação de multímeros. Os imunoconjugados foram então purificados por cromatografia de exclusão de tamanho. Os imunoconjugados foram analisados com o uso de uma análise de aminoácido (AAA) para determinar a razão de peptídeo/CRM197.O peptídeo CRM197 3S foi liofilizado com um lioprotetor (Lyophilisation and development of solid protein pharmaceuticals. Wang W. International Journal of Pharmaceutics 203 (2000) 1 a 60; Fundamentals of freezedrying. Nail S.L e al. Pharm Biotechnol. 2002; 14:281 a 360).

B. PROPRIEDADES DESSES COMPOSTOS IMUNOGENICOS

[00219] De modo surpreendente, todos os imunoconjugados obtidos e que correspondem ao peptídeo 3S de SEQ ID N° 2 com a Cys na extremidade c-terminal, o carreador de CRM197 e SMPB ou MBS como um ligante, não foram solúveis em água ou em 0,9% de solução de NaCl, mesmo após um longo tempo, com aquecimento ou agitação. À medida que esses imunoconjugados não foram adequados para obter uma substância homogênea e reproduzível, esses compostos não foram testados em animal.

[00220] De modo surpreendente, os imunoconjugados que usam o peptídeo 3S de SEQ ID N° 2 com a Cys na extremidade N-terminal, o carreador de CRM197 e MBS como um ligante não eram solúveis em água ou em 0,9% de solução de NaCl, mesmo após um longo tempo, com aquecimento ou agitação. mesmo que esses imunoconjugados não fossem adequados para obter um composto homogêneo e reproduzível, esses compostos foram testados no camundongo.

[00221] De modo surpreendente, o imunoconjugado correspondente ao peptídeo 3S de SEQ ID N° 2 com a Cys na extremidade N-terminal, o carreador de CRM197 e SMPB como um ligante foram constatados espontaneamente solúveis em água ou em 0,9% de solução de NaCl. tais imunoconjugados foram adicionalmente estudados.

EXEMPLO 2:ENSAIOS COMPARATIVOS A. MATERIAIS E METODOS

[00222] A.1. Os vários compostos imunoconjugados testados no Exemplo 2 foram preparados conforme revelado no Exemplo 1.

[00223] A.2. As várias composições testadas são reveladas na Tabela 1 abaixo.Tabela 1

• peptídeos de SEQ ID N°5 é também nomeado peptídeo anti-3S16Nter. - SMPB e MBS foram adquiridos junto à PIERCE (Illinois, E.U.A) ou SIGMA (Missouri, E.U.A) - Adjuphos® 2% (gel de fosfato de alumínio) foi adquirido junto à Brenntag (Frederikssund, Dinamarca). Adjuphos® foi usado em uma concentração final de 3 mg/ml de íons Al3+, cuja concentração final é adaptada à administração de 300 μg de ions Al3+ por injeção. - Alhydrogel® 2% (gel de hidróxido de alumínio) foi adquirido junto à Brenntag (Frederikssund, Denmark). Alhydrogel® foi usado em uma concentração final de 3 mg/ml de íons de Al3+, cuja concentração final é adaptada à administração de 300 μg de íons de Al3+ por injeção. - Adjuvante de Freund incompleto (IFA) foi adquirido junto à SIGMA (Missouri, E.U.A).IFA foi emulsificado com o composto imunoconjugado por vórtice durante uma hora de uma mistura de 50 μl de IFA com 50 μl da solução imunoconjugada aquosa.

[00224] A.3. Animais

[00225] Os animais eram fêmeas BALB/cJ fornecidas pelos Laboratórios Charles River (Lyon, França) que tinham 8 semanas de idade no dia 0 do experimento.

[00226] A.4. Método de administração

[00227] Cada uma das composições descritas na Tabela 1 foi injetada nos camundongos pela via subcutânea em uma dose de 40 μg, conforme expresso como a quantidade de peptídeo antigênico equivalente.

[00228] Camundongos foram injetados de modo subcutâneo com 100 μl de cada composição testada no dia 0, Dia 14 e Dia 28, respectivamente. • peso de cada camundongo foi acompanhado no dia 0, 14, 35 e 49, respectivamente.

[00229] A.5. Ensaio ELISA • ensaio ELISA foi projetado para realizar a medição de anticorpos IgG em que seriam reconhecidos os peptídeos de SEQ ID N°2, também chamados peptídeos anti-3S16Nter.

[00230] As titulações de anticorpo IgG anti-3S16Nter foram determinadas por um Ensaio de Imunosorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um agrupamento de soros de ratos vacinados com 20 ou 50μ g/vacinação de peptídeo equivalente dos imunoconjugado s relatados na Tabela 1 no dia 0, dia 14 e dia 28 foi usado para normalizar os valores entre diferentes placas com 96 cavidades.

[00231] Oito diluições dos soros do dia 49 são testadas (de 1/50 a 1/150, 1/450, 1/1350, 1/4050, 1/12150, 1/36450, e 1/109350). O antígeno revestido às microplacas Nunc Maxisorp é um peptídeo conjugado à albumina de soro bovino (BSA) com um ligante diferente daquele usado para a síntese do imunoconjugado s: SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato) (produzido a partir de Imject® Kits de proteína BSA ativada por Maleimida adquiridos junto à Thermo Fisher Scientific, Waltham, E.U.A). Os anticorpos IgG anti-3S16Nter são revelados por uma reação colorimetria com o uso de um IgG (Fc) anti-rato cabra, conjugado para Peroxidase de Rábano (HRP) (Jackson Imunoresearch, West Grove, E.U.A), e o substrato de HRP: a tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma, Missouri, E.U.A).

B. RESULTADOS

[00232] Titulações de IgG de anticorpos anti-3S foram medidas pelo ensaio ELISA descrito na seção de Materiais e Métodos.

[00233] Os resultados são retratados na Figura 1.

[00234] Os resultados da Figura 1 mostram que os compostos imunoconjugados que compreendem KLH como a proteína carreadora (E, F e G) induzem a uma produção muito baixa de anticorpo anti-3S, conforme comparado aos compostos imunoconjugados que compreendem CRM197 como a proteína carreadora (A, B, C e D) no dia 21 (Figura 1A), Dia 35 (Figura 1B) e Dia 49 (Figura 1C), respectivamente.

[00235] Os resultados da Figura 1 também mostram que os compostos imunoconjugados obtidos com o uso de MBS (B e D) como o agente ligante têm propriedades imunogênicas satisfatórias, apesar do fato de que os mesmos são fracamente usáveis, devido a sua capacidade de formar suspensão heterogênea que contém uma quantidade crescente de agregados com um tempo crescente de armazenamento. O imunoconjugado presente no composto A e C também apresenta propriedades imunogênicas satisfatórias. Por razões de clareza, o mesmo é, a partir de agora, chamado de “substância de fármaco 3S”.

[00236] Os resultados da Figura 1 também mostram que as composições que contêm Adjuphos® como a substância imunoadjuvante (A, B) tem propriedades imunogênicas da mesma ordem que as composições que contêm Alhydrogel® como a substância imunoadjuvante, apesar do fato de que as composições com Adjuphos® tendem a formar agregados e desse modo consistem em um produto final que tem difíceis propriedades de gerenciamento.

EXEMPLO 3: OTIMIZAÇÃO DA FORMULAÇÃO DO IMUNOCONJUGADO

[00237] A adsorção de antígeno a sais de alumínio é crucial para os efeitos de adjuvante e a formulação dos antígenos de vacina, especialmente sais, é um elemento importante da interação potencial entre alumínio e o antígeno. A superfície de hidróxido de alumínio é composta de grupos hidroxila coordenados a alumínio. A carga de superfície do alumínio de fosfato é composta de grupos tanto hidroxila e de fosfato. A adsorção de proteínas por alumínio adjuvante é um processo complexo e envolve contribuição de forças eletrostáticas, hidrofóbicas e outras forças atrativas.• objetivo desses estudos de formulação foi obter uma preparação de vacina com um aspecto homogêneo e opalescente, sem agregados visíveis após agitação gentil. O alvo do estudo foi obter uma formulação que adsorveria pelo menos 95 % da substância de fármaco 3S nas partículas de alumínios após uma hora de incubação.

[00238] Nos primeiros estudos exploratórios, a substância de fármaco 3S foi misturada com o hidróxido de alumínio adjuvante em 135 mM de cloreto de sódio e 0,5q mM de fosfato de sódio. Agregados foram observados, mas quase 100 % da substância de fármaco 3S foi adsorvido nos sais de alumínio. Quando fosfato de alumínio foi usado, a mistura induziu a uma solução homogênea mas somente 80 % da substância de fármaco 3S foi adsorvida nos sais de alumínio.

[00239] Uma triagem de formulações foi realizada. Os diferentes parâmetros físico- químicos foram testados: pH, concentração de cloreto de sódio e concentração de fosfato. Estudos de adsorção foram realizados em suspensões que contêm 1 mg /ml de alumínio íons. 37,5q μg de proteínas (correspondente a 12,5q μg de pep.eq) foram misturados à suspensão adjuvante para produzir um volume final de 0,250 ml com o uso de tubos de baixa adsorção. Na formulação com hidróxido de alumínio, o pH foi ajustado a pH7,2 com ânions de fosfato. A preparação foi gentilmente misturada. Experimentos preliminares indicaram que a adsorção foi completada em alguns minutos. A suspensão foi centrifugada e o sobrenadante claro analisado para proteína. A concentração de antígeno do sobrenadante foi determinada com o uso de micro protocolos do ensaio de proteína de ácido bicincronínico (Pierce, Rockford, IL, E.U.A). O procedimento em microplaca foi seguido. Absorvências foram medidas a 562 nm.• efeito de adicionar ânions de fosfato à formulação foi estudado de modo a evitar agregados. Pode ser possível otimizar a carga de superfície de alumínio em relação ao antígeno pretratando-se o adjuvante com ânions de fosfato. Esse tratamento pode resultar na adsorção de proteínas básicas por forças atrativas eletroestáticas. Ânions de fosfato também são incluídos na preparação de vacina para controlar o pH. • efeito de força iônica também foi investigado. A adição de cloreto de sódio para aumentar a força iônica a 250 mM aprimorou a taxa de adsorção.

[00240] Com o uso de hidróxido de alumínio, o aspecto da formulação foi aprimorado por adição de ânions de fosfato na preparação.

[00241] Duas formulações que geram de forma consistente um aspecto homogêneo e opalescente foram obtidas:

[00242] Formulação 1: 7 mM de fosfato de sódio, 135 mM de cloreto de sódio, hidróxido de alumínio em 1 mg/ml de íons de Al3+ pH 7

[00243] Formulação 2: 15 mM de fosfato de sódio, 135 mM de cloreto de sódio, hidróxido de alumínio em 1 mg/ml de íons de Al3+ pH 7

[00244] Com o uso de fosfato de alumínio, essas formulações foram homogêneas e opalescentes, mas a capacidade de adsorção não alcançou o alvo de 95%. Em contraste, fosfato de alumínio, ânions adicionais de fosfato aumentaram a carga negativa de superfície. Desse modo, não se espera que o tratamento de fosfato de alumínio com ânions de fosfato mude o tipo de proteína, isto é básica, que é adsorvida. A carga de superfície de fosfato de alumínio adjuvante foi modificada diminuindo-se o pH com um pretratamento de fosfato de alumínio adjuvante com HCl. Quando o pH da formulação adjuvante diminuiu a 5,5, uma adsorção de 100% foi obtida. A formulação 3 a seguir foi, portanto, selecionada:

[00245] Formulação 3: 150 mM de cloreto de sódio, fosfato de alumínio em 1 mg/ml de íons Al3+ pH 5,5

[00246] As três formulações exibiram imunogenicidade similar em camundongo. A formulação 1, em 1 mg/ml de íons de Al3+, 7 mM de fosfato de sódio e 135 mM de cloreto de sódio, pH 7 foi selecionada, para limitar o efeito dos ânions de fosfato na adsorção durante o envelhecimento.

[00247] A otimização da formulação continuou. As concentrações de fosfato de sódio e cloreto de sódio foram alteradas para obter uma formulação aceitável de acordo com os dois critérios: próximos a 100 % de adsorção e aspectos homogêneos/opalescentes. Para obter uma preparação isotônica, a concentração de cloreto de sódio foi aumentada a 150 mM. Visto que os ânions de fosfato podem afetar a adsorção na superfície de hidróxido de alumínio, a concentração foi diminuída a 1 mM na preparação. A formulação com hidróxido de alumínio na concentração de 1 mg/ml de íons de Al3+ com 1 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio pH 7,2 foi selecionada (formulação 4: 1 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio, hidróxido de alumínio em 1 mg/ml de íons de Al3+ pH 7,2). Por fim, após diferentes experimentos (formulação e testes de estabilidade), o pH 6,8 foi escolhido, compatível com o pH do adjuvante e da substância de fármaco 3S (formulação 5: 1 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio, hidróxido de alumínio em 1 mg/ml de íons de Al3+ pH 6,8).

[00248] A formulação 5 foi selecionada pelas razões acima (imunogenicidade, adsorção satisfatória do imunoconjugado em hidróxido de alumínio, aspecto opalescente, conformidade para uso em isotonicidade de humano - pH -selecionada para uso em humanos.

[00249] A substância de fármaco 3S formulada na formulação 5 é denominada de agora em diante “VAC-3S”.

EXEMPLO 4:DETERMINAÇÃO DE FAIXAS IDEAIS DE DOSE

[00250] Esse exemplo descreve a quantidade da substância de fármaco 3S que pode ser injetada em humanos, de acordo com a resposta imune da dita substância de fármaco 3S candidata em camundongos e ratos.

A. METODOS

[00251] Dois estudos de constatação de faixas de dose foram realizados no camundongo BalB/CByJ (Laboratórios Charles River, Lyon, França) e no rato CD® IGS (Laboratórios Charles River, Lyon, França) com a substância de fármaco 3S ou CRM197-3S16Nter de modo a determinar a dose humana máxima a ser usada durante o ensaio primeiro em humano. A formulação testada é em hidróxido de alumínio (1 mg/ml de íons de Al3+, 150 mM de cloreto de sódio e 3,6 mM de fosfato de sódio. Nos experimentos descritos, a substância de fármaco 3S foi testada com 3,6 mM de fosfato de sódio devido a uma concentração muito grande de fosfato de sódio no lote testado da substância de fármaco 3S. O produto de fármaco, ou seja, “VAC- 3S”, é formulado em 1 mM de fosfato de sódio em vez de 3,6 mM de fosfato de sódio. A adsorção da substância de fármaco 3S em hidróxido de alumínio é equivalente entre 1 e 3,6 mM de fosfato. Ademais, um experimento de ligação de ponte de imunogenicidade será realizado entre VAC-3S e a substância de fármaco 3S formulada com 3,6 mM de fosfato de sódio. Em ensaios clínicos, a programação de administração é de três vacinações em um mês de diferença. Em camundongos e ratos, a mesma programação foi realizada com três vacinações mas em quatorze dias de diferença. A titulação anti-3S16Nter IgG foi medida como a resposta biológica à substância de fármaco 3S. Tais anticorpos são conhecidos por inibirem a interação entre peptídeo 3S e seu receptor em células humanas CD4+ T.

B. DETERMINAÇÃO DE FAIXA IDEAL DE DOSE EM CAMUNDONGOS

[00252] Seis grupos de 9 camundongos vacinados com doses crescentes do produto de fármaco 3S: 0,02, 0,2, 1,2, e 4 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter da substância de fármaco 3S formulada em 150 mM de cloreto de sódio, 3,6 mM de fosfato de sódio, e 1 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante em um volume de 0,05 ml. Um grupo de 6 camundongos foi vacinado com o adjuvante por si.

[00253] As doses de 4, 2 e 1 μg de peptídeo equivalentes induzem a titulação de anticorpo igG anti-3S16Nter não significativamente diferente.

[00254] Aqui, o plateau da resposta imune (titulação de anticorpo IgG anti-3S16Nter de circulação) induzido pela substância de fármaco 3S começa em um valor incluído entre 0,2 e 1 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter no camundongo, após três vacinações monosítio de 0,05 ml de substância de fármaco 3S com adjuvante com duas semanas de diferença.

C. DETERMINAÇÃO DE FAIXA IDEAL DE DOSE EM RATOS

[00255] Cinco grupos de 6 ratos foram vacinados com doses crescentes do produto de fármaco 3S: 0,02, 0,2, 2, 20 e 40 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter da substância de fármaco formulada em 150 mM de cloreto de sódio, 3,6 mM de fosfato de sódio, e 1 mg/ml de hidróxido de alumínio as adjuvante em um volume de 0,5q ml por vacinação. Um grupo de 6 ratos não foi vacinado como controle negativo.

[00256] Uma vacinação com 40 μg de Resultados equivalentes a peptídeo em titulações de IgG anti-3S16Nter significativamente maiores (meio geométrico=1/5776) do que com 2 μg de equivalente a peptídeo (meio geométrico=1/1413, p=0,03), do que com 0,2 μg de equivalente a peptídeo (meio geométrico=1/1736, p=0,02) e do que com 0,02 μg de equivalente a peptídeo (meio geométrico= 1/861, p=0,009).

[00257] Uma vacinação com 40 μg de resultados equivalentes a peptídeo em titulação de anticorpo IgG anti-3S16Nter não significativamente diferente do que uma vacinação com 20 μg de equivalente a peptídeo (meios geométricos: 1/5776 e 1/4284 respectivamente, p=0,70).

[00258] Aqui, o plateau da resposta imune (titulação de anticorpo IgG anti-3S16Nter de circulação) induzido pela substância de fármaco começa em um valor incluído entre 2 e 20 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter no rato, após três injeções de substância de fármaco 3S com adjuvante com duas semanas de diferença.

D. DETERMINAÇÃO DE FAIXA IDEAL DE DOSE EM HUMANO

[00259] O raciocínio usado é que a substância de fármaco 3S com dose de adjuvante necessária para obter o plateau de titulação de anticorpo igG anti-3S16Nter no camundongo corresponderia ao décimo da dose necessária para obter o plateau de titulação de anticorpo igG anti-3S16Nter em humanos. Isso significa que o plateau do IgG anti-S16Nter seria alcançado em humano entre 2 (10 vezes 0,2 μg) e 10 μg (10 vezes 1 μg) de equivalente a peptídeo 3S16Nter.

[00260] Considerou-se que a substância de fármaco 3S com dose de adjuvante necessária para obter o plateau de titulação de anticorpo igG anti-3S16Nter no rato corresponderia à mesma dose necessária para obter o plateau de titulação de anticorpo igG anti-3S16Nter em humanos.

[00261] Consequentemente, de acordo com a constatação de faixa de dose realizada no camundongo, poderia se esperar que o plateau da resposta imune em humanos fosse alcançado em uma dose mínima de substância de fármaco 3S com adjuvante incluído entre 2 e 10 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter.

[00262] De acordo com a constatação de faixa de dose realizada no rato, poderia se esperar que o plateau da resposta imune em humanos fosse alcançado em uma dose mínima de substância de fármaco 3S com adjuvante incluído entre 2 e 20 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter.

[00263] A dose humana máxima da substância de fármaco 3S com adjuvante a ser injetada em humanos foi estabelecida a 10 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter por vacinação, quando formulada em 1 mg/ml de hidróxido de alumínio, 150 mM de cloreto de sódio e tampão de fosfato in 0,5q ml.

[00264] Portanto a dose a ser usada em humano deve ser, por exemplo, 10 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter por vacinação, e pode variar preferencialmente entre 0,1 e 20 μg de equivalente a peptídeo 3S16Nter por vacinação. EXEMPLO 5:EFEITO PROTETOR DE UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA. • objetivo de Exemplo 5 foi testar a capacidade dos antissoros de um rato vacinados com a substância de fármaco 3S com adjuvante para inibir a expressão de NKp44L na superfície de células humanas CD4+ T ativadas induzidas pelo peptídeo 3S, ou seja, o peptídeo.

[00265] As células CD4+ T foram classificadas de humano PBMC e ativadas por 3 dias com PHA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, E.U.A) então expandidas por três dias com recombinante IL-2 (Novartis, Horsham, Reino Unido). As células foram postas na presença de peptídeos de 3S16Nter (Covalab, Villeurbanne, França) de modo a induzir a expressão de NKp44L em sua superfície.

[00266] A expressão de NKp44L na superfície das células foi medida com o uso da intensidade de um manchamento fluorescente específico medido por citofluorometria.

[00267] A inibição de expressão de NKp44L pelos antissoros de rato vacinado foi estudada.

[00268] Os antissoros foram testados em diferentes diluições em triplicata.

A. MATERIAIS E METODOS CELULAS:

[00269] Células humanas CD4+ T foram obtidas por separação magnética de uma bolsa residual de leuco-plaqueta ordenada do EFS (“Etablissement Français du Sang”).

[00270] As células humanas CD4+ T foram classificadas da bolsa de acordo com o seguinte protocolo: 1. A bolsa é distribuída em quatro tubos Falcon de 50 ml: 4 X 15 ml 2. Completar a 50 ml com RPMI1640 + meio glutamax (ref 72400-054, GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, E.U.A) 3. Distribuir o sangue diluído em oitos tubos de 50 ml em 15 ml de Ficoll (Ref 17-829E, Eurobio, Les Ulis, França)) 4. Centrifugar em 2800 rpm por 20 minutos sem quebra em temperatura ambiente 5. Coletar os anéis de leucócitos e distribui-los em quatros tubos de 50 ml com um máximo de 25 ml por tubo 6. Completar o tubo a 50 ml com meio RPMI1640 7. Centrifugar a 2000 rpm, 7 minutos, temperatura ambiente 8. Descartar o sobrenadante 9. Agrupar os péletes e lavar em 50 ml de meio RPMI1640, centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente 10. Coutar as células em azul tripano 11. 400 milhões de PBMC são classificadas 12. Lavar as células em 15 ml no tampão de classificação (PBS sem Mg e Ca, 0,5q % de BSA, 2 mM EDTA). A partir desse momento, as células são mantidas a 4 °C ou no gelo de modo a evitar a fagocitose das esferas magnéticas) 13. Adicionar 10 μl de esferas magnéticas por 20 x 106 PBMCs = 200 μl de suspensão de esferas magnéticas para 400 milhões de PBMC (MACS CD4 microesferas, Miltenyi Biotec, Paris, França) 14. Incubar por 30 minutos a 4 °C 15. Ressuspender as células em 1 ml de tampão de classificação 16. Colocar duas colunas LS (Miltenyi Biotec, Paris, França) em um imã de quadroMACS (Miltenyi Biotec, Paris, França) 17. Equilibrar cada uma das duas colunas LS com 3 ml de tampão de classificação 18. Obter a suspensão celular através das colunas (0,5q ml em cada coluna) por gravidade 19. Lavar duas vezes cada coluna com 5 ml de tampão de classificação 20. Remover as colunas do imã 21. Eluir cada coluna duas vezes com 5 ml de tampão de classificação, a primeira vez por gravidade, a segunda vez com o uso do pistão 22. Lavar as células eluídas de cada coluna em 15 ml de meio completo (RPMI1640 + glutamax, 10 % de SVF Gibco descomplementado, Aminoácidos Não Essenciais 100X (ref GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, E.U.A), antibióticos/antimicóticos (ref 15240-112, GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, E.U.A) 23. Contar as células em azul acético.

[00271] As células humanas CD4+ T foram ativadas e expandidas de acordo com o seguinte protocolo: 1. 50 milhões de células CD4+ T foram postas em cultura em 30 ml de meio completo em um frasco de 75cm2 (Ref 353136, Falcon, lieu, pays) verticalmente colocado em um incubador ventilado úmido a 37 °C, 5% CO2. 2. Adicionar fitohemaglutinina (PHA) na concentração final de 1 μg/ml: 1 μl de uma alíquota a 1 mg/ml por ml de meio. (PHA de Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA ). 3. Após 3 dias de ativação de PHA, adicionar IL-2 (Aldesleucina, lieu, pays) a 100 UI/ml.

[00272] Durante a ativação de PHA e expansão de IL-2, o meio é alterado pela metade sempre que o mesmo se torna ligeiramente amarelo.

ITENS DE TESTE

[00273] Soros de um rato (Rattus norvegicus) Crl/CD(SD) foram testados: esse animal foi vacinado com 2 μg de 3S16Nter pep.eq./vacinação de substância de fármaco 3S com adjuvante com hidróxido de alumínio no dia 0, dia 14 e dia 28. seu soro no dia 49 foi positivo para anticorpos

[00274] Como um controle negativo, um soro pré-imune do rato 482 foi testado. CONTROLES

[00275] Controle positivo: O antissoro do coelho Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus) dos Laboratórios Charles River, Lyon, França tomada no dia 49 foi usado como controle positivo na diluição de 1/50. Esse coelho foi vacinado no dia 0, no dia 14 e no dia 28 com um CRM197-(3S16Nter) imunoconjugado com adjuvante com hidróxido de alumínio, e seu soro no dia 49 foi positivo para anti-3S16Nter IgG.

[00276] Controle Negativo: O antissoro de um coelho vacinado com uma vacina não relevante foi usado como um controle negativo na diluição de 1/50 TABELA 2: NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DAS CAVIDADES DO CONTROLE DE EXPERIMENTO

[00277] Controles foram testados em duplicata sem ou com peptídeos de 3S16Nter. Os números de identificação das cavidades e tubes são indicados na Tabela 2 abaixo.

[00278] À med ida que o estad o de ativação das células CD4+ T que permite a expressão de NKp44L em resposta à exposição aos peptídeos de 3S16Nter in vitro não é conhecido, todos os controles têm de ser validados.

[00279] De modo a validar o experimento, NKp44L precisa ser expresso na superfície das células das cavidades 6, 7, 10 e 11 e não precisa ser expresso na superfície das células das cavidades 4, 5, 8, 9, 12, 13, 14 e 15. PROTOCOLO 1. Os soros para teste foram testados em triplicata, 2. 20 μl de diluição de 1/40 de uma solução de peptídeo a 2 mg/ml:25 μl de IVV-B122 + 975 μl de meio completo RPMI1640. Então peptídeos de 3S16Nter estavam em uma concentração final de 5 μg/ml, 3. 180 μl da suspensão celular de células CD4+ T de um frasco.

[00280] Para a diluição de 1/50 dos soros, adicionar 4 μl dos soros por cavidade.

[00281] Para a diluição de 1/100 dos soros, adicionar 8 μl de uma diluição de 1/4 dos soros.

[00282] Para a diluição de 1/400 dos soros, adicionar 8 μl de uma diluição de 1/16 dos soros.

[00283] Para as diluições de 1/1600 dos soros, adicionar 8 μl de uma diluição de 1/64 dos soros.TABELA 3: NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DAS CAVIDADES OF O SOROS DE RATO

[00284] Soros de rato foram testados em triplicata na presença de peptídeos de 3S16Nter. Números de identificação das cavidades e tubos são indicados na tabela 3

[00285] 3 cavidades são usadas como controles para a análise citofluorométrica. TABELA 4: NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DAS CAVIDADES DE CONTROLE DE CITOFLUOROMETRIA

[00286] Na cavidade 1, as células não foram manchadas; na cavidade 2, células foram colocadas na presença do anticorpo anti-IgM-PE por si para avaliar o fundo; na cavidade 3, células foram manchadas com anti-CD4-APC por si.

[00287] 4. A microplaca é incubada por 4 horas na célula incubadora (37 °C, atmosfera úmida, 5 % CO2).

[00288] 5. Centrifugar a microplaca por 5 min em 400g.

[00289] 6. Eliminar o sobrenadante.

[00290] 7. Adicionar 10 μl/cavidade da murina anti-NKp44L IgM 7,1 + 30 μl/cavidade de PBS, 0,5q % de BSA (500 μl de solução de anticorpo + 1500 μl de PBS, BSA 0,5q %).

[00291] 8. Incubar por 1 hora a 4 °C.

[00292] 9. Adicionar 150 μl/cavidade de PBS, BSA 0,5q %.

[00293] 10. Centrifugar a microplaca por 5 minutos em 400g.

[00294] 11. Eliminar o sobrenadante.

[00295] 12. Adicionar 50 μl/cavidade de uma diluição de 1/25 em PBS, 0,5q % de BSA do anticorpo IgM-PE anti- camundongo secundário.

[00296] 13. Incubar por 30 minutos a 4 °C.

[00297] 14. Adicionar 150 μl/cavidade de PBS, BSA 0,5q %.

[00298] 15. Centrifugar a microplaca por 5 minutos em 400g.

[00299] 16. Adicionar 50 μl de uma diluição de 1/25 in PBS, 0,5q % de BSA do anticorpo CD4-APC anti-humano.

[00300] 17. Transferir as suspensões celulares em tubos de FACS.

[00301] 18. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.

[00302] 19. Adicionar 2 ml de PBS 1X por tubo.

[00303] 20. Centrifugar por 5 minutos em 400g.

[00304] 21. Adicionar 300 μl de PBS 1X.

[00305] 22. Adquirir os tubos no citofluorômetro.

[00306] Instrumento SN: AN52257 versão de Software: Gallios.• número em negrito corresponde ao número de identificação de cavidade.

[00307] Dados são analisados no dia da análise no software Gallios e impressos.

[00308] Os resultados relatam a fluorescência de X médio do marcador PE das células - Ligados nas células CD4+ T em uma plotagem de pontos de intensidade de APC /Intensidade Lateral de Avanço. - Ligados nos linfócitos em uma plotagem de pontos de intensidade de SSC /Intensidade Lateral de Avanço.

[00309] Esse valor de X médio representa a densidade de marcadores NKp44L na superfície de células CD4+ T. B. RESULTADOS TABELA 5

[00310] A Figura 4 retrata a fluorescência de Meio PE de cavidades de controle.

[00311] Os resultados obtidos mostram que: - Nas cavidades sem soro, sem peptídeos de 3S16Nter, as células CD4+ T ativadas não expressaram NKp44L. - Nas cavidades sem soro, na presença de peptídeos de 3S16Nter, as células CD4+ T ativadas expressaram NKp44L em um nível médio de 62. - Nas cavidades com coelho anti-3S16Nter anticorpo negative soro na diluição de 1/50, sem peptídeos de 3S16Nter, as células CD4+ T ativadas não expressaram NKp44L. - Nas cavidades com coelho anti-3S16Nter anticorpo negative soro na diluição de 1/50, na presença de peptídeos de 3S16Nter, as células CD4+ T ativadas expressaram NKp44L em um nível médio de 63. - Nas cavidades com coelho soro positivo para anticorpo anti- 3S16Nter na diluição de 1/50, com ou sem peptídeos de 3S16Nter, as células CD4+ T ativadas não expressaram NKp44L.

[00312] Esses resultados mostraram que as células CD4+ T ativadas in vitro usadas nesse experimento

[00313] Não expressaram espontaneamente NKp44L em sua superfície,

[00314] tiveram capacidade de expressar NKp44L em sua superfície em resposta a uma exposição a peptídeos de 3S16Nter,

[00315] que essa expressão não foi induzida nem inibida por um antissoro não relevante,

[00316] que a superfície de NKp44L foi totalmente inibida por um soro positivo de IgG anti-3S16Nter

[00317] Além disso, a Figura 5 retrata os resultados da fluorescência de X médio das cavidades de itens de teste.

[00318] Os resultados obtidos mostram que:

[00319] Nas cavidades com soros negativos de anticorpo anti-3S16Nter de rato na diluição de 1/50, na presença de peptídeos de 3S16Nter, as células CD4+ T ativadas expressaram NKp44L em um nível médio de fluorescência de 53.

[00320] Nas cavidades com rato soro positivo para anticorpo anti-3S16Nters na diluição de 1/50, na presença de peptídeos de 3S16Nter, a expressão de superfície de NKp44L em células CD4+ T ativadas foi totalmente inibida.

[00321] Nas cavidades com rato soro positivo para anticorpo anti-3S16Nters na diluição de 1/100, na presença de peptídeos de 3S16Nter, as células CD4+ T ativadas expressaram NKp44L em um nível médio de fluorescência de 14.

[00322] Nas cavidades com rato soro positivo para anticorpo anti-3S16Nters nas diluições de 1/400 e 1/1600, na presença de peptídeos de 3S16Nter, a expressão de superfície de NKp44L nas células CD4+ T ativadas não foi inibida.

[00323] Em resumo do Exemplo 5, os resultados obtidos mostram que, em um modelo celular humano in vitro de linfócitos de CD4+ T ativados, ambos os antissoros de um rato vacinado com a substância de fármaco 3S com adjuvante com alhydrogel inibiram altamente a expressão de NKp44L na superfície dos linfócitos de CD4+ T de maneira dependente de dose. isso reflete a capacidade dessa preparação de vacinas para induzir anticorpos que podem bloquear funcionalmente o efeito de o peptídeo 3S na expressão de NKp44L em linfócitos de CD4+ T.

EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES INJETAVEIS E METODO DE ADMINISTRAÇÃO PARA USO HUMANO PREPARAÇÃO DE VACINA:

[00324] VAC-3S é uma suspensão estéril para injeção intramuscular que contém a substância de fármaco 3S adsorvida no hidróxido de alumínio na composição salina isotônica tamponada. a fabricação de VAC-3S foi realizada em conformidade com o GMP.

[00325] Para obter VAC-3S, a substância de fármaco 3S é formulada na concentração de 0,02 mg/ml de peptídeo equivalente em 0,5q ml com hidróxido de alumínio (1 mg/ml de íons de Al3+) fornecida por Brenntag (Alhydrogel 85 2% de Ph Eur), 150 mM de cloreto de sódio (Farmacopéia Européia) e 1 mM de fosfato de sódio (Farmacopeia Europeia). produtos para injeção são usados para a formulação da vacina. O pH final está em 6,8. VAC-3S não contém conservante.

INJEÇÕES:

[00326] após a agitação, a vacina é um suspensão branca homogênea pronta para uso. A vacina poderia ser injetada de modo intramuscular em um deltoide. Uma seringa estéril com agulha estéril é usada para injeção. Pacientes devem receber 3 doses de 0,5q ml cada um, com um intervalo de 4 semanas entre as vacinações. EXEMPLO 7:PREPARAÇÃO DE UM COMPOSTO IMUNOGENICO. A. PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS IMUNOGENICOS • composto imunogênico ou conjugado a seguir foi sintetizado. O mesmo foi derivado de CRM197 com o uso de SMPB como molécula reticulante (conforme mostrado no Exemplo 1). O peptídeo usado foi um peptídeo 3S (m3S) mutado que consiste em SEQ ID N°6 (NH2- PWNASASNKSLDDIW-COOH) com um resíduo de cisteína adicional em sua extremidade amino-terminal para permitir o acoplamento químico do retuculante induzindo a CRM197-SMPB-Nter(Cys)-m3S.

[00327] Para fins de clareza, o peptídeo que é denominado “Nter(Cys)-m3S” acima consiste no peptídeo 3S de SEQ ID N°7 no presente documento. • sulfo-SMPB reticulante heterobifunctional (Masirato de sulfo- (Succinimidil-4-(p-maleimidofenil)) foi usado. Essas moléculas consistem em um grupamento de maleimida ligadas por uma cadeia de polietileno a um éster de N- hidroxisuccinimida (Cross-linking of protein by w-maleimido alkanoyl N- hydroxysuccinimido esters. Partis M.D e al. Journal of Protein Chemistry, vol.2, No 3, 1983). O grupamento de succinimida pode reagir com grupos amino da proteína. Uma vez que essa reação ocorreu, o grupamento de maleimida reage com grupos sulfidrila dos peptídeos 3S. Os mesmos têm comprimentos diferentes, 7,3 A para sulfo-MBS e 11,6 A para sulfo-SMPB. A eliminação de ligante e troca de tampão foram feitas por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

[00328] A reação de acoplamento foi uma reação de duas etapas. A primeira etapa foi a ativação do CRM197 com o reticulante. 15 miligramas de ligante, diluídos em sulfóxido de dimetila foram adicionados a 20 miligramas de CRM197 em um volume de 5 a 20 ml de tampão de conjugação (PBS 10 mM, pH7-pH7,4) e misturados gentilmente por 30 a 90 min em temperatura ambiente (Protective immunogenicity of two synthetic peptides selected from the amino acid sequence of Bordetella pertussis toxin subunit S1. Askelof P. e al. PNAS, volume 87, páginas 1.347 a 1.351, Fevereiro 1990). Essa reação foi seguida por uma purificação do CRM197 ativado por SEC (Coluna PD10 (GE Healthcare, Chalfont St. Giles Reino Unido) ou Coluna Bio-Gel P2 (Biorad Marnes-la-Coquette, França)). Em segundo lugar, o CRM197 ativado e o peptídeo derivado de 3S foram misturados por 30 min a 2 horas em temperatura ambiente permitindo o acoplamento covalente do peptídeo no CRM197 ativado. Para bloquear grupos maleimido não reagidos de CRM197 ativado, cisteína-HCl (SIGMA, Missouri, E.U.A) é adicionada em excesso à solução após a reação de conjugação (A practical approach to crosslinking. Mattson G. e al. Molecular Biology Reports 17: 167 a 183, 1993). Essa etapa limitou a criação de multímeros. Os imunoconjugados foram, então, purificados por cromatografia de exclusão de tamanho. Os imunoconjugados foram analisados com o uso de uma análise de aminoácido (AAA) para determinar a razão de peptídeo/CRM197. 8. PROPRIEDADES DESSES COMPOSTOS IMUNOGENICOS • imunoconjugado obtido e correspondente ao peptídeo m3S de SEQ ID N° 7 que compreende um resíduo de Cys na extremidade N-terminal, o carreador de CRM197 e SMPB como um ligante foi constatado espontaneamente solúvel em água ou em 0,9% de solução de NaCl. A imunogenicidade de tais imunoconjugados foi adicionalmente estudada no Exemplo 10 abaixo.

EXEMPLO 8:IMUNOGENICIDADE DO COMPOSTO IMUNOGENICO DO EXEMPLO 9 A. MATERIAIS E METODOS

[00329] A.1. Os compostos imunoconjugados testados no Exemplo 10 foram preparados conforme revelado no Exemplo 9. • mesmo foi formulado conforme descrito no Exemplo 3. Para esse propósito, Alhydrogel® 2% (gel de hidróxido de alumínio) foi usado como um adjuvante e adquirido junto à Brenntag (Frederikssund, Denmark). Alhydrogel® foi usado em uma concentração final de 1 mg/ml de íons de Al3+, cuja concentração final é adaptada à administração de 50 μg de íons de Al3+ por injeção.

[00330] A.2. Animais

[00331] Animais foram fêmeas BALB/cByJ fornecidas pelos Laboratórios Charles River (Lyon, França) que tinham 8 semanas de idade no dia 0 do experimento.

[00332] A.3. Método de administração

[00333] A preparação de vacina descrita no Exemplo 5 foi injetada a camundongos pela via intramuscular em uma dose de 2 μg, conforme expresso como a quantidade de peptídeo antigênico equivalente.

[00334] Camundongos foram injetados de modo intramuscular com 50 μl de cada composição testada no dia 0, Dia 14 , Dia 28 e Dia 169 e Dia 212, respectivamente.

[00335] A.5. Ensaio ELISA • ensaio ELISA foi projetado para realizar a medição de anticorpos IgG que reconheceriam os peptídeos de SEQ ID N°6, também chamados anticorpos de peptídeo anti-m3S.

[00336] As titulações de anticorpo IgG anti-m3S foram determinada por um Ensaio de Imunosorvente Ligado à Enzima (ELISA).

[00337] Oito diluições dos dos soros do dia 169, do dia 204 e dia 260 foram testados (1/3000, 1/6000, 1/12000, 1/24000, 1/48000, 1/96000, 1/192000, e 1/384000). O antígeno revestido às Micro placas de Nunc Maxisorp é um peptídeo m3S conjugado à albumina de soro bovino (BSA) com um ligante diferente daquele usado para a síntese do imunoconjugado s: SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano- 1-carboxilato) (produzido a partir de Imject® Kits de proteína BSA ativada por Maleimida adquirida junto à Thermo Fisher Scientific, Waltham, E.U.A). Os anticorpos IgG anti-m3S são revelados por uma reação colorimetria com o uso de um IgG (Fc) anti-camundongo cabra, conjugado à Peroxidase de Rábano (HRP) (Jackson Imunoresearch, West Grove, E.U.A), e ao substrato de HRP: a tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma, Missouri, E.U.A).

B. RESULTADOS

[00338] Titulações de IgG de anticorpos anti-3S foram medidas pelo ensaio ELISA descrito na seção de Materiais e Métodos.

[00339] Os resultados são retratados na Figura 6.

[00340] Os resultados da Figura 6 mostram que o composto imunoconjugado que compreende CRM197 à medida que a proteína carreadora induz produção de anticorpo com alto anti-m3S no dia 169 após 3 vacinações no dia 0, dia 14 e dia 28.

[00341] Os resultados da Figura 6 mostram que o composto imunoconjugado que compreende CRM197 como a proteína carreadora induz produção de anticorpo com alto anti-m3S no dia 260 após 4 vacinações no dia 0, dia 14 e dia 28 e dia 169.

Claims

1. Composto imunogênico caracterizado pelo fato de que compreende um peptídeo da seguinte fórmula (I): NH2- [Nt]y-P-W-N-X1-S- X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH (I), em que: - y é um número inteiro que significa 0 ou 1, - z é um número inteiro que significa 0 ou 1, - X1 é A (Alanina), - X2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em W (Triptofano), - X3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K (Lisina), - X4 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em S (Serina), - X5 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em L (Leucina), - X6 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D (Ácido aspártico), - X7 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em D (Ácido aspártico), - peptídeo Nt é da seguinte fórmula (III): NH2-C-Y1-T-Y2-V-(III) da SEQ ID N° 3, em que - Y1 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de T (Treonina) e P (Prolina), - Y2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de A (Alanina), T (Treonina) e N (Asparagina), - peptídeo Ct é da seguinte fórmula (IV): Y3-Y4-M-T-W-COOH (IV) da SEQ ID N° 4, em que: - Y3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de D (Ácido Aspártico), Q (Glutamina), E (Ácido glutâmico) e N (Asparagina), e - Y4 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de N (Asparagina), H (Histidina), S (Serina) e K (Lisina), cujo peptídeo da fórmula (I) é covalentemente ligado por conjugação a uma proteína carreadora que consiste em uma proteína CRM197.

2. Composto imunogênico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo Nt do peptídeo de fórmula (I) consiste de um resíduo cisteína (C) e o peptídeo Ct do peptídeo de fórmula (I) consiste de um resíduo cisteína (C).

3. Composto imunogênico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de fórmula (I) é covalentemente ligado à proteína CRM197 por seu resíduo de aminoácido de extremidade N-terminal.

4. Composto imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de fórmula (I) é covalentemente ligado à proteína CRM197 através de um grupamento ligante.

5. Composto imunogênico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito grupamento ligante é o produto de reação de um agente ligante que tem dois grupos reativos tanto com CRM197 quanto com um peptídeo da fórmula (I).

6. Composto imunogênico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito grupamento ligante consiste em succimidil 4-[p- maleimidofenil]butirato (SMPB) e sulfo-SMPB.

7. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um composto imunogênico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em combinação com uma ou mais substâncias imunoadjuvantes.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é adaptada para formar uma composição de vacina pronta para uso que compreende uma quantidade do dito composto imunogênico na faixa de 0,01 μg a 200 μg por unidade de dose conforme expresso em equivalente de peptídeo antigênico, de preferência de 0,05 μg e 50 μg por unidade de dose, de preferência de 0,1μg a 20 μg por unidade de dose.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a dita substância imunoadjuvante consiste em hidróxido de alumínio (Al(OH)3).

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é adaptada para formar uma composição de vacina pronta para uso que compreende uma concentração final de hidróxido de alumínio na faixa de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, de preferência de 0,05 mg/ml a 2 mg/ml, e é com máxima preferência de cerca de 1 mg/ml, conforme expresso como teor de íons de Al3+.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que é adaptada para formar uma composição de vacina pronta para uso que compreende uma concentração final de 0,1 mM a 50 mM de fosfato de sódio, de preferência 0,5 mM a 15 mM de fosfato de sódio, e com máxima preferência em torno de 1 mM de fosfato de sódio.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizada pelo fato de que está em uma forma líquida ou em uma forma sólida, incluindo em uma forma liofilizada.

13. Composição de vacina caracterizada pelo fato de que compreende um composto imunogênico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 12, com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

14. Uso de composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para preparar uma composição de vacina para prevenir e/ou tratar uma condição causada pela infecção de um indivíduo com um vírus HIV.