KR20150032266A - Ｃｒｍ１９７ 담체 단백질에 커플링된 ｈｉｖ ｇｐ４１ 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HIV 패밀리의 바이러스에 대항하는 백신 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 하기 화학식 (I) 의 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물에 관한 것이다:
NH2- [Nt]y-P-W-N-X1-S- X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH (I),
화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
본 발명은 또한 이러한 면역원성 화합물을 함유하는 조성물 및 HIV 바이러스에 의한 개체의 감염에 의해 야기되는 상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 이들 면역원성 화합물 및 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

ＣＲＭ１９７ 담체 단백질에 커플링된 ＨＩＶ ＧＰ４１ 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물 {IMMUNOGENIC COMPOUNDS COMPRISING HIV GP41 PEPTIDE COUPLED TO CRM197 CARRIER PROTEIN}
본 발명은 HIV 패밀리의 바이러스에 대항하는 백신 분야와 관련된다.
인간 HIV 감염 중 약 90% 는 HIV-1 바이러스에 의해 야기된다. 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 은 바이러스 복제 동안 발생하는, 돌연변이의 축적에 의해 야기되는, 및 또한 재조합 사건에 의해 야기되는 현저한 유전적 변이성을 특징으로 한다. HIV 치료의 화학요법의 장기간 실패는 특히 HIV-1 바이러스 균주의 높은 돌연변이원성 활성에 의해 설명된다. 상이한 과정의 항레트로바이러스 요법 후에 및 심지어는 다중약물 요법 (HAART) 후에 환자에서 저항성 바이러스 변종이 신속히 발생한 것이 이전에 밝혀졌다. 이들 저항성 바이러스는 그들의 단백질 입체형태 및 구조에서 특정 변경을 보유한다. 통상적으로 현행 치료법으로부터 HIV-1 탈출의 원인이 되는 그러한 돌연변이는 치료 조건 하에서의 선별의 결과로서 연속적 바이러스 세대를 통해 유지되고 축적된다.
항-HIV-1 약에 의한 치료는 기존 저항성 돌연변이, 뿐만 아니라 새로 발생하는 돌연변이의 선별 및 축적을 허용하는 바이러스의 복제를 완전히 차단하지 않아서, 바이러스에게 확산될 새로운 기회를 제공한다. 기존 항레트로바이러스 약 (NRTI, NNRTI, 프로테아제 저해인자, 융합 저해인자 및 그들의 혼합물, 예컨대 HAART) 은 오직 저항성 바이러스 균주의 발생 및 증식 전까지, 다소 연장된 기간 동안 HIV-1 복제를 둔화시킬 수 있다. HIV-1 저항성 변종의 광범위한 확산은 심각한 우려를 일으키고, 추가의 항-HIV-1 치료 도구의 이용가능성을 요구한다.
게다가, HAART 의 명백한 임상적 유익에도 불구하고, 결점이 계속 존재한다: 많은 부작용 (지방이상증, 젖산산증, 인슐린 저항성, 만성 신장 질환, 고지질혈증...), 평생 치료, 높은 순응도 (compliance) 가 요구됨, 바이러스 저항성, 인지 및 운동 결손으로서 HIV 감염의 병원성 효과의 지속, 및 면역 활성화. 더욱이, 기대 수명의 연장으로, 환자는 부작용, 약물 저항성, 대사 이상 및 HIV-1 감염과 연관되는 암의 출현을 직면해야 한다.
또한, 치료된 환자 중 20% 내지 30 % 는 바이러스 억제에도 불구하고 때때로 면역학적 실패를 경험한다. 다시 말해서 바이러스 복제의 저해에도 불구하고 그들의 CD4+ T 세포 총수 (cell count) 는 감소한다. 이는 바이러스 복제의 저해에도 불구하고 CD4+ T 세포에 대한 HIV-1 감염의 병원성 사건이 여전히 존재함을 보여준다.
따라서, CD4+ T 세포를 보호하는, 항레트로바이러스 치료법에 상호보완적일 수 있는 안전하고 적당한 치료적 접근이 필요하고, 충족되지 않은 의학적 필요에 해당한다.
화학적 항-레트로바이러스 물질을 사용하는 것 이외의, 다양한 항-HIV 치료 전략이 고려되었으며, 이는 (i) 항-HIV 항체의 사용, (ii) HIV 입자 파괴-기반 백신, (iii) HIV 펩티드-기반 백신 및 (iv) DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터-기반 백신을 포함하며, 이들 각각은 그들의 특정 결점을 갖는다.
HIV 가 1983 년도에 AIDS 의 원인으로 확인된 이후, HIV 감염 및 AIDS 를 예방하는 백신에 대한 다수의 후보가 인간 시험에서 시험되었으며 성공이 매우 제한되었다. 국제적 AIDS 백신 계획, IAVI 는 이들 백신 및 시험의 데이타베이스를 유지한다 (www.IAVI.org). 거의 모든 이들 시험은 백신 안전성 및 예비 면역 반응의 매우 조기 (제 I 상) 시험이었다. 오직 하나의 백신 (2 가지 제형의 동일한 기본적 gpl20 백신) 이 대규모 제 III 상 연구에서 시험되었다. VaxGen gpl20 하위유형 B 단백질은 미국, 캐나다 및 네덜란드에서 완료된 제 III 상 시험에서 효과가 없는 것으로 밝혀졌다. 2003 년 이후에, AIDSVAX 의 두번째 시험이 태국에서 완료되었다. 2 개의 시험 모두 후보가 효과가 없음을 밝혔다. HIV 에 대항하는 단백질 백신을 제조하는 것은 이전에 어려웠는데, 이는 외피 단백질의 높은 다양성, 사용되는 실험실 적응 균주 및 임상 분리주의 외피 사이의 차이 및 백신에서의 gpl20 의 단량체 본질 및 바이러스에서의 삼량체 구조로 인한 것이고, 특히 세포 면역은 유도되지 않고 항체만 유도되기 때문이다. AIDSVAX 단백질 (VAXGene 로부터의) 과 카나리아 두창에서 전달되는 유전자 (Aventis Pasteur 로부터의 ALVAC) 의 조합이 또한 추가 정보를 위해 제 III 상 단계에 있고, Merck 의 아데노바이러스-기반 후보를 시험하는 네번째 대규모 시험이 시작될 것으로 예상된다. 세포독성 T-림프구 (CTL) 는 HIV-I 를 포함하는 바이러스의 면역 통제의 중요한 구성성분으로 여겨지고, 관련 CTL 면역원은 치료적 백신으로 고려된다.
HIV 유행병은 매년 수백만 명의 사람들을 계속 감염시키고 있으며, 효과적인 백신에 대한 필요가 증가하고 있다. 광범위 중화 항-HIV 항체를 유발할 수 있는 면역원성 제품을 개발하는 것의 어려움으로 인해, 항-HIV 백신의 개발은 크게 위축되었다.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 의 일차 분리주에 대항하는 광범위 중화 항체 (NtAb) 의 유도는 AIDS 백신 연구의 주요한 충족되지 않은 목표로 남아 있다. 외피-기반 백신을 사용하는 조기의 시도는 실험실-적응 분리주에 대해서만 효과적인 항체를 유도했다. 이들 경우에, 보호는 gp120 의 V3 초가변부를 겨냥하는 높은 역가 NtAb 와 상호연관되었다. 그러나, 생성된 중화 활성은 대체로 분리주-특이적이고, HIV-1 의 가장 일차적인 분리주에 대항해서는 최소로 효과적이다. 제 III 상 임상 시험에서 HIV-1 어퀴지션 (acquisition) 에 대항해 보호하는 서브유닛 gp120 백신의 실패는 과제의 어려움을 강조한다.
그럼에도 불구하고, NtAb 는 종종 HIV 감염된 개체에서 발견될 수 있다. 감염 초기에 생성되는 응답은 통상적으로 특이성이 협소하며, 숙주에서 전파된 바이러스를 중화시키지만, 동시에 발생하는 것은 그렇지 않다. 그러한 응답은 감염을 통제할 수 있는 일부 장기 생존자에서 감염 과정 동안 항바이러스 치료의 부재 하에 넓어진다. 그러나, 교차-중화 항체 응답의 본질 및 그것의 생성을 초래하는 메카니즘은 이해되지 않고 있다.
자연적으로, Env 에 대한 NtAb 는 감염 후 수주 내에 생성되지만, 이러한 조기 응답은 특정 바이러스 하위유형에 대해서만 효과적이다; 그러나, bNtAb (교차-반응성 중화 Ab) 가 HIV 의 경과 동안 발생할 수 있다. 최근 여러 주요 연구는 HIV-감염된 대상 (1 년 이상 동안 감염됨) 중 대략 25% 가 bNtAb 응답을 갖고, 1% 가 대다수의 분기군에 대해 매우 강한 활성을 갖는 "엘리트 중화제 (Elite neutralizers) 를 갖는 것을 밝혔다. 중요하게, 이들 결과는 질환의 경과 동안 감염된 사람의 면역계가 생체내에서 HIV-1 에 대항하는 NtAb 를 생성하는 능력을 입증한다. 그들은 또한 광범위 반응성 NtAb 활성이 시간의 흐름에 따라 발달하는 것으로 보이고, 보호성일 수 있는 bNtAb 의 역가에 대한 지식의 부재 하에 만성 항원 노출에 의해 조성되는 것을 시사한다.
끊임없이 반복되는 바이러스 복제는, 저 잡음으로, NtAb 를 회피하는 Env 의 지속적 진화를 초래한다. 그러한 항원성 진화는 새로운 백신 전략을 Env 단백질의 더욱 보존된 영역에 집중시키고, 백신 면역원이 핵심 고도로 보존된 에피토프를 모방하도록 디자인될 수 있음을 시사한다.
효율적 항-HIV 백신의 디자인에 대한 주요 장애물 중 하나는 bNtAb 의 표적은 바이러스 외피 단백질 (Env) 인데 이는 고도로 가변적이며, 한편 보존된 엘레먼트는 면역원성이 불량해 보인다는 점이었다. 이는 운동 및 특수한 제약이 bNtAb 가 수용체 결합 및 융합 과정 동안 잠재적으로 취약한 자리에 접근하는 것을 방해함을 의미한다. 실제로 적은 양의 NtAb 가 기술되었다. 예를 들어, 확인된 첫번째 bNtAb 는 b12 였는데, 이는 gp120 상의 CD4 결합 자리를 막고, CD4+ T 림프구 상에서의 바이러스의 CD4 부착을 방지한다. gp41 서브유닛은 입체형태 재배열을 수반하는 gp120 보다 훨씬 더욱 보존되어 있고, 모든 균주에 공통된다. 가려져 있거나, 접근하기 어렵거나 일시적인 gp41 의 보존된 구조 엘레먼트에 대항해 매우 적은 bNtAb 활성이 유발된다; 2F5 및 4E10 을 포함하는, bNtAb 는 gp41 의 막-근위 엑토도메인 영역 (MPER) 을 표적으로 삼는다. 그러나, 다년의 연구에도 불구하고, 이러한 bNtAb 를 유발할 수 있는 NtAb 면역원은 여전히 알려지지 않았으며, 이는 에피토프가 입체형태를 갖기 때문이다.
HIV 바이러스에 의한 감염에 대항하는 안전하고 효율적인 예방적 또는 치료적 백신 전략의 디자인에서 맞닥뜨리는 수많은 어려움에도 불구하고, 유망한 항-HIV 백신 조성물의 개념에 큰 진보가 이루어져 왔다. 설명적으로, 항-HIV 백신의 576 개 이상의 임상 연구가 2012 년도 초반에 미국, 캐나다 및 호주에서 수행 중이었다. 이들 임상 연구 중 27 개가 제 IV 상 단계를 완료했음을 언급할 만하다. 이들 발전은, 시간이 흐름에 따라, 항-HIV 백신이 HIV 바이러스에 감염될 위험에 처해 있거나 이미 감염된 개체를 예방 및/또는 치료하기 위한 더욱 실제적이고 신뢰할 수 있는 의학적 도구에 해당함을 보여준다. 개발 중에 있는 모든 이들 백신은 바이러스의 바이러스 복제를 감소시키는 것을 목표로 삼는다.
기술분야에서 공개된 유망한 예방적, 뿐만 아니라 치료적 항-HIV 백신 전략 중 하나는 "3S" 로 명명된, HIV gp41 외피 단백질의 고도로 보존된 모티프에 대항하는 항체의 유발에 관한 것이다. 불완전 프로인트 보강제 (IFA) 와 조합된 KLH 담체 단백질에 커플링된 3S 펩티드 (KLH-3S 로 명명됨) 로 이루어지는 면역원성 조성물은 마카크속 원숭이에서 항-3S 항체를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 항-3S 항체는 면역화된 마카크속 원숭이에서 CD4+ T 세포 감소에 대항해 보호 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 HIV 질환 발달을 통제하는 것을 목표로 하는 면역 개입의 부가적 전략에 대한 길을 열었다 (Vieillard 등, 2008, PNAS, Vol. 105 (6) : 2100-2104).
이러한 전략은 최초로 바이러스 복제가 아닌 HIV-1 병원성의 바이러스 결정인자를 표적으로 삼는다.
HIV-1 바이러스에 의해 야기되는 감염을 예방 또는 치료하는 것을 목표로 하는 치료적 도구에 대한 필요가 기술분야에 여전히 존재한다.
본 발명은 하기 화학식 (I) 의 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물에 관한 것이다:
NH2- [Nt]y-P-W-N-X1-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH (I),
식 중 :
- y 는 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- z 는 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- Nt 는 1 내지 100 아미노산 길이를 갖는 펩티드로 이루어지고,
- Ct 는 1 내지 100 아미노산 길이를 갖는 펩티드로 이루어지고,
- X1 은 A (알라닌), T (트레오닌), S (세린) 및 N (아스파라긴) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X2 는 W (트립토판) 및 A (알라닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X3 은 K (리신) 및 R (아르기닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X4 는 S (세린) 및 T (트레오닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X5 는 L (류신), Y (티로신) 및 Q (글루타민) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X6 은 D (아스파르트산), N (아스파라긴), E (글루탐산), S (세린), G (글리신) 및 K (리신) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X7 은 D (아스파르트산), Q (글루타민), L (류신), A (알라닌), K (리신) 및 E (글루탐산) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
일부 구현예에서, 면역원성 화합물은 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 결합되어 있는 SEQ ID N°2 [NH2-PWNASWSNKSLDDIW-COOH] 의 펩티드를 포함한다.
특히, 본 발명은 하기 화학식 (V) 의 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물에 관한 것이다:
NH2-(A1)m-SEQ IDN°2-(A2)n-COOH (V),
식 중 :
- m 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- n 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- A1 은 아미노산 잔기이고,
- A2 는 아미노산 잔기이고,
화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
본 발명에 따른 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, 화학식 (I) 의 펩티드는 SEQ ID N°5 의 펩티드를 포함하거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본 발명에 따른 면역원성 화합물의 일부 다른 구현예에서, 화학식 (I) 의 펩티드는 SEQ ID N°6 의 펩티드를 포함하거나, 또는 그것으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 상기 면역원성 화합물은 상기 담체 단백질에 그것의 N-말단 아미노산 잔기에 의해, 직접 또는 링커 모이어티를 통해 공유적으로 결합되어 있다.
이와 같이, 일부 구현예에서, 상기 면역원성 화합물은 상기 담체 단백질에 링커 모이어티, 바람직하게는 2 개의 반응성 숙신이미딜 기를 포함하는 링커 모이어티를 통해 공유적으로 결합되어 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 면역보강제 물질과 조합하여 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 면역보강제 물질은 알루미늄 히드록시드 (Al(OH)3) 를 포함하거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본 발명은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물 또는 조성물을 포함하는 백신 조성물을 다룬다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한, 또는 대안적으로 HIV 바이러스에 의한 개체의 감염에 의해 야기되는 상태를 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물 또는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HIV 바이러스에 의한 개체의 감염에 의해 야기되는 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 조성물을 제조하기 위한 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 위에 정의된 바와 같은 백신 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, HIV 바이러스에 의한 개체의 감염에 의해 야기되는 상태의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
도 1 은 KLH 또는 CRM197 과 접합된 3S16Nter 펩티드에 의한 면역화시 항-3S-펩티드 항체의 유발을 나타낸다. 각각의 기호는 하나의 마우스로부터 수득된 결과를 나타낸다. 각각의 막대기 모양은 마우스의 상응하는 푸울로부터 수득된 결과의 기하 평균 값을 나타낸다. 가로좌표 : 사용된 조성물의 종류; 세로좌표 : 임의의 단위 (Arbitrary Units) (A.U.) 로 표현되어 있는 항-3S IgG 역가. 1 임의의 단위는 1 ng/㎕ 의 최종 농도에서 마우스 모노클로날 항-3S 항체 15C8f2 의 용액에 의해 생성되는 신호에 상응한다. 도 1A : 첫번째 주입 후 제 21 일에서의 결과; 도 1B : 첫번째 주입 후 제 35 일에서의 결과; 도 1C : 첫번째 주입 후 제 49 일에서의 결과.
도 2 는 마우스에서 최적 3S-펩티드-CRM197 면역-접합체 (3S 약물 물질) 백신 투여량 범위를 나타낸다. 가로좌표 : 항원성 당량의 양으로서 표현되어 있는 면역-접합체의 투여량 (각각 0 ("보강제"), 0.02 ㎍, 0.2 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍ 및 4 ㎍). 세로좌표 : 1/중간점 희석률 로서 표현되어 있는 항-3S16Nter IgG 역가. 중간점 희석률은 최대 신호의 절반을 제공하는 항혈청의 희석률이다. X 축은 3S 약물 물질의 3S16Nter 펩티드 당량의 마이크로그램 (㎍) 으로 표현되는 증가하는 투여량으로 백신접종된 마우스의 상이한 그룹을 나타낸다. 각각의 기호는 하나의 마우스를 나타낸다. CRM197-3S 면역-접합체로 백신접종된 마우스로부터의 혈청의 푸울이 사용되어 ELISA 검정을 정규화한다. 비모수 만 휘트니 검증 (Mann Whitney test) 에 의해 계산된 통계적 유의성이 보고되어 있다. *: 0.5>p>0.1; **: 0.1>p>0.01; ***: p<0.01.
도 3 은 랫트에서의 최적 3S-펩티드-CRM197 백신 투여량 범위를 나탄내다. 가로좌표 : 담체의 중량 및 링커의 중량을 고려하지 않고 담체에 접합된 펩티드의 양 (펩티드-당량) 으로서 표현되어 있는 면역-접합체 (3S 약물 물질) 의 투여량 (각각 0 ("보강제"), 0.02 ㎍, 0.2 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍ 및 4 ㎍). 세로좌표 : 1/중간점 희석률 로서 표현되어 있는 항-3S16Nter IgG 역가. 중간점 희석률은 최대 신호의 절반을 제공하는 항혈청의 희석률이다. X 축은 3S-약물 물질의 펩티드-당량의 마이크로그램 (㎍) 으로 표현되는 증가하는 투여량으로 백신접종된 랫트의 상이한 그룹을 나타낸다. 각각의 기호는 하나의 랫트를 나타낸다. 알루미늄 히드록시드와 함께 제형화된 20 ㎍ 및 50 ㎍ 의 CRM197-3S 면역-접합체로 백신접종된 랫트로부터의 혈청의 푸울이 사용되어 ELISA 검정을 정규화한다. 비모수 만 휘트니 검증에 의해 계산된 통계적 유의성이 보고되어 있다. *: 0.5>p>0.1 ; **: 0.1>p>0.01 ; ***: p<0.01.
도 4 및 5 는 본원에 기재된 바와 같은 담체 단백질 (KLH 또는 CRM197) 에 접합된 3S16Nter 로 영장류를 포함하는 동물의 면역화 후에 수득된 항-3S16Nter 항체의 능력을 나타낸다.
도 4 는 대조군 웰의 PE-평균 형광을 나타낸다.
CD4 + T 세포의 표면에서의 NKp44L 의 밀도를 나타내는 측정된 PE 형광 평균은 웰 번호 4 내지 번호 1 의 세포로부터 세포형광측정법에 의해 측정되었다. Y 축은 X-평균 형광을 나타낸다. X 축은 상이한 대조군을 나타낸다. 3S16Nter 펩티드 존재 (3S) 또는 부재 (-), 및 항-3S16Nter IgG 음성 (토끼 음성) 또는 양성 (토끼 양성) 토끼로부터의 혈청 부재 (-) 또는 존재 (1/50 희석률). 대조군은 2 회 반복 시험되었고, 표준 편차가 보고되어 있다 (에러 바 (error bars)).
도 5 는 시험 항목 웰의 X-평균 형광을 나타낸다.
CD4 + T 세포의 표면에서의 NKp44L 의 밀도를 나타내는 측정된 PE 형광 평균은 웰 번호 16 내지 번호 45 의 세포로부터 세포형광측정법에 의해 측정되었다. Y 축은 X-평균 형광을 나타낸다. X 축은 상이한 시험된 조건을 나타낸다. 모든 웰은 3S16Nter 펩티드의 존재 하에 시험되었다. 보강된 (ajuvanted) CRM197-3S16Nter 면역접합체 (R122 d49) 로 백신접종된 랫트로부터의 혈청이 시험되었다. 각각의 희석률은 3 회 반복 시험되었고, 표준 편차가 보고되어 있다 (에러 바). 항-3S16Nter IgG 음성 혈청 (음성 대조군) 은 1/50 희석률에서 시험되었다. 항-3S16Nter IgG 양성 혈청은 1/100, 1/400, 1/1600 및 1/6400 희석률에서 시험되었다.
도 6 은 CRM197 와 접합된 m3S16Nter 펩티드로 면역화시 항-3S-펩티드 항체의 유발을 나타낸다. 각각의 기호는 하나의 마우스로부터 수득된 결과를 나타내고, 6 마리의 마우스가 그것으로 면역화되었다. 마우스는 각각 제 0, 14, 28, 169 및 212 일에 주입되었으며, 이는 상응하는 화살표에 의해 표시되어 있다. 가로좌표 : 일수로 표현되어 있는 면역접합체의 첫번째 주입 후 시간. 세로좌표 : 1/중간점 으로서 표현되어 있는 항-3S 항체 역가.
본 발명은 주로 조성물, 특히 HIV 에 대항하는 백신 조성물을 제조하는데 유용한 신규한 면역원성 화합물을 제공한다.
본 발명자들은 3S 펩티드에 대항하는 높고 효율적인 항체 응답을 유도하는 능력이 부여된 면역원성 화합물을 디자인하는 것을 고려하는 철저한 연구 작업을 수행했다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 3S 펩티드는 본 명세서에서 아래 기재되어 있는 화학식 (I) 의 펩티드로서 집합적으로 정의된다. 3S 펩티드는 기술분야에서 알려져 있는 SEQ ID N°5 (NH2-CPWNASWSNKSLDDIW-COOH) 의 3S 펩티드를 망라한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 항-3S 항체는 화학식 (I) 의 펩티드를 겨냥하는 항체로 이루어지고, SEQ ID N°5 의 3S 펩티드를 겨냥하는 항체를 포함한다.
SEQ ID N°5 의 3S 펩티드는 이전에 Vieillard 등 (Vieillard 등, 2008, PNAS, Vol. 105 (6) : 2100-2104) 에 의해 후보 항-HIV 항원으로서 식별되었다. Vieillard 등이 잘 알려진 KLH 담체 단백질에 공유적으로 연결된 3S SEQ ID N°5 의 펩티드로 이루어지는 면역-접합체 화합물을 사용함으로써 항-3S 항체를 유도했음이 상기된다.
항원-단백질 담체 접합체 형태 하에 면역원성 물질을 포함하는 백신 조성물에서 현재 사용되는 거의 유일한 담체 단백질임이 본원에서 상기된다. 더욱이 KLH 는 항체를 생성하는데 널리 사용되어 왔다 (Lee, Huang, Lasanthi, Jayathilaka, Lateef and Gupta, 2010. Production of antipeptide antibodies, Methods in Molecular Biology, 657:93-108, S.D. Schwartzbach and T. Osafune (eds.), Springer; Ragupathi, Gathuru and Livington, 2005, Antibody inducing polyvalent cancer vaccines, Cancer Treat Res, 123:157-150; Harris and Markl, 1999, Keyhole limpet hemocyanin (KLH) : a biomedical review, Micron, 30-597-623).
놀랍게도, 발명자들은 Vieillard 등에 의해 사용된 KLH 관습적 담체 단백질이 HIV 패밀리의 바이러스, 특히 HIV-1 바이러스에 의한 개체 감염에 의해 야기되는 면역 장애에 대항하여 보호 효과를 유도하는 것을 목표로 하는 효율적 항-3S 항체 응답을 유발하는 면역원성 화합물을 디자인하는데 적합하지 않음을 발견했다. 특히, 발명자들은 예상 외로 3S 펩티드-그래프팅된 KLH 분자 (KLH-3S) 가 응집물을 형성했고, 이것이 다양한 겉보기 분자량의 연관되는 엔터티 (entity) 를 포함하는 이종성 최종 면역원성 화합물을 초래했음을 발견했다. 이와 같이, 발명자들은 KLH-3S 접합체를 포함하는 면역원성 화합물이 약제로서, 특히 인간용 약제로서 유용한 화학적으로 정의된 제품을 수득하는 것을 목표로 재현가능하게 제조될 수 없음을 발견했다.
매우 놀랍게도, 발명자들은 담체 분자가 CRM197 단백질로 이루어지는 항원-담체 접합체로 이루어지는 특정 면역원성 화합물을 사용함으로써 효율적 항-3S 항체 응답이 수득될 수 있음을 발견했다. 특히, CRM197 을 담체 단백질로서 사용함으로써, 동일한 항원성 펩티드가 관습적 KLH 담체 단백질에 공유적으로 결합되어 있는 면역원성 화합물과 비교할 때, 항-3S 항체의 약 100 배 증가가 수득됨이 발견되었다.
CRM197 단백질은 잘 알려진 디프테리아 독소의 비-독성 돌연변이체로 이루어지며, 이 돌연변이체는 Uchida 등 (1973, J. Biol. Chem., Vol. 248 : 3838-3844) 에 의해 최초로 기술되었다. CRM197 돌연변이체 단백질은 G→A 전이가 야생형 디프테리아 독소의 위치 52 에서 글리신 (G) 잔기의 글루탐산 잔기 (E) 에 의한 치환을 초래한 돌연변이체 tox97 유전자의 번역 산물로서 최초로 기술되었다.
출원인의 지식에 따르면, CRM197 은 면역원성 화합물의 제조를 위한, 특히 펩티드 접합을 위한, 담체 분자로서 현재까지 저조하게 이용되어 왔다. 출원인의 지식에 따르면, CRM197 은 올리고당 항원을 위한, 즉, 매우 특수한 면역 거동을 보유하는 기술분야에 잘 알려져 있는 비-단백질 구조에 대항하는 항체를 유발하기 위한, 담체 물질로서 배타적으로 사용되어 왔다. 더욱더 정확히, (i) 폐렴연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae) 의 캡슐형 항원에서 유래하는 올리고사이드, (ii) 수막염균 (Neisseria menigitidis) 으로부터의 올리고사이드 및 (iii) 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenza) 유형 B 의 캡슐형 다당류에 대한 담체 분자로서 배타적으로 사용되어 온 것으로 보인다.
본 발명은 하기 화학식 (I) 의 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물에 관한 것이다:
NH2- [Nt]y-P-W-N-X1-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH (I),
식 중 :
- y 는 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- z 는 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- Nt 는 1 내지 100 아미노산 길이를 갖는 펩티드로 이루어지고,
- Ct 는 1 내지 100 아미노산 길이를 갖는 펩티드로 이루어지고,
- X1 은 A (알라닌), T (트레오닌), S (세린) 및 N (아스파라긴) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X2 는 W (트립토판) 및 A (알라닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X3 은 K (리신) 및 R (아르기닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X4 는 S (세린) 및 T (트레오닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X5 는 L (류신), Y (티로신) 및 Q (글루타민) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X6 은 D (아스파르트산), N (아스파라긴), E (글루탐산), S (세린), G (글리신) 및 K (리신) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- X7 은 D (아스파르트산), Q (글루타민), L (류신), A (알라닌), K (리신) 및 E (글루탐산) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
본 명세서의 목적을 위해, 화학식 (I) 의 면역원성 화합물은 또한 본원에서 NH2- [Nt]y-SEQ ID N°1-[Ct]z-COOH (I) 로 명명될 수 있다.
화학식 (I) 의 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, X1 은 바람직하게는 A 를 의미하고,
화학식 (I) 의 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, X2 는 바람직하게는 W 를 의미하고,
화학식 (I) 의 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, X3 은 바람직하게는 K 를 의미하고,
화학식 (I) 의 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, X4 는 바람직하게는 S 를 의미하고,
화학식 (I) 의 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, X5 는 바람직하게는 L 을 의미하고,
화학식 (I) 의 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, X6 은 바람직하게는 D 를 의미하고,
화학식 (I) 의 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, X7 은 바람직하게는 D 를 의미하고.
화학식 (I) 의 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 중 하나 이상은 위에 명시된 그들 각각의 바람직한 의미를 갖는다. 일부 구현예에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개는 위에 명시된 그들 각각의 바람직한 의미를 갖는다.
X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 7 개의 아미노산이 위에 명시된 그들 각각의 바람직한 의미를 갖는 구현예에서, 상기 면역원성 펩티드는 하기 화학식 (IIa) 의 펩티드로 이루어진다:
NH2- [Nt]y-P-W-N-A-S-W-S-N-K-S-L-D-D-I-W-[Ct]z-COOH (IIa),
이는 또한 하기로 명명될 수 있다:
NH2- [Nt]y-SEQ ID N°2-[Ct]z-COOH (IIa).
X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 6 개의 아미노산이 위에 명시된 그들 각각의 바람직한 의미를 갖고, 아미노산 X2 가 A (알라닌) 를 의미하는 구현예에서, 상기 면역원성 펩티드는 하기 화학식 (IIb) 의 펩티드로 이루어진다:
NH2- [Nt]y-P-W-N-A-S- A-S-N-K-S-L-D-D-I-W-[Ct]z-COOH (IIb),
이는 또한 하기로 명명될 수 있다:
NH2- [Nt]y-SEQ ID N°6-[Ct]z-COOH (IIb)
1 내지 100 아미노산 잔기 길이를 갖는 Nt 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100 아미노산 잔기 길이를 갖는 펩티드를 망라한다.
일부 구현예에서, Nt 펩티드는 5 아미노산 잔기 이하의 아미노산 길이를 포괄하는 10 아미노산 잔기 길이 이하를 갖는다.
일부 구현예에서, Nt 펩티드의 N-말단 잔기는 C (시스테인) 잔기로 이루어진다.
일부 구현예에서, Nt 펩티드는 하기 화학식 (III) 을 갖는다:
SEQ ID N°3 의 NH2-C-Y1-T-Y2-V-(III),
식 중 :
- Y1 은 T (트레오닌) 및 P (프롤린) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- Y2 는 A (알라닌), T (트레오닌) 및 N (아스파라긴) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산임.
일부 다른 구현예에서, Nt 펩티드는 1 개의 시스테인 잔기 (또한 "C" 로 명명됨) 로 이루어진다.
1 내지 100 아미노산 잔기 길이를 갖는 Ct 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100 아미노산 잔기 길이를 갖는 펩티드를 망라한다.
일부 구현예에서, Ct 펩티드는 5 아미노산 잔기 이하의 아미노산 길이를 포괄하는 10 아미노산 잔기 길이 이하를 갖는다.
일부 구현예에서, Ct 펩티드의 C-말단 잔기는 C (시스테인 잔기) 로 이루어진다.
일부 구현예에서, Nt 펩티드는 하기 화학식 (IV) 를 갖는다:
SEQ ID N°4 의 -Y3-Y4-M-T-W-COOH (IV),
식 중 :
- Y3 은 D (아스파르트산), Q (글루타민), E (글루탐산) 및 N (아스파라긴) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
- Y4 는 N (아스파라긴), H (히스티딘), S (세린) 및 K (리신) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산임.
일부 다른 구현예에서, Ct 펩티드는 1 개의 시스테인 잔기 (또한 "C" 로 명명됨) 로 이루어진다.
일부 다른 구현예에서, Ct 펩티드는 본 발명의 면역원성 화합물에 부재한다.
본 발명에 따른 면역원성 화합물의 일부 특정 구현예에서, 상기 펩티드는 아래 기재된 화학식 (V) 를 갖는다.
이와 같이, 본 발명 하기 화학식 (V) 의 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물에 관한 것이다:
NH2-(A1)m-SEQ IDN°1-(A2)n-COOH (V),
식 중 :
- m 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- n 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- A1 은 아미노산 잔기이고,
- A2 는 아미노산 잔기이고,
화학식 (V) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
화학식 (V) 의 펩티드의 일부 구현예에서, m 은 1 이고, n 은 0 이고, A1 은 시스테인 (C) 잔기를 의미한다.
본 발명은 또한 하기 화학식 (VIa) 의 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물에 관한 것이다:
NH2-(A1)m-SEQ IDN°2-(A2)n-COOH (VIa),
식 중 :
- m 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- n 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- A1 은 아미노산 잔기이고,
- A2 는 아미노산 잔기이고,
화학식 (VIa) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
본 발명 또한 하기 화학식 (VIb) 의 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물에 관한 것이다:
NH2-(A1)m-SEQ IDN°6-(A2)n-COOH (VIb),
식 중 :
- m 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- n 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
- A1 은 아미노산 잔기이고,
- A2 는 아미노산 잔기이고,
화학식 (VIb) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
화학식 (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드의 일부 구현예에서, m 은 1 이고, n 은 0 이고, A1 은 시스테인 (C) 잔기를 의미한다.
이미 명백한 바와 같이, 화학식 (V), (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드는 본 발명에 따른 화학식 (I) 의 펩티드의 특정 구현예이다. 이와 같이, 화학식 (I) 의 펩티드에 관하여 기재된 본 발명의 면역원성 화합물의 모든 구현예는, 다르게 명시되지 않으면, 화학식 (I) 의 펩티드가 화학식 (V) 의 펩티드 또는 화학식 (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드로 이루어지는 동일한 구현예를 망라한다.
또한 이미 명백한 바와 같이, 화학식 (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드는 본 발명에 따른 화학식 (V) 의 펩티드의 특정 구현예이다. 이와 같이, 화학식 (I) 또는 화학식 (V) 의 펩티드에 관하여 기재된 본 발명의 면역원성 화합물의 모든 구현예는, 다르게 명시되지 않으면, 화학식 (I) 또는 화학식 (V) 의 펩티드가 화학식 (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드로 이루어지는 동일한 구현예를 망라한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 아미노산 잔기는 알라닌 (또한 "A" 또는 "Ala" 로 명명됨), 아르기닌 (또한 "R" 또는 "Arg" 로 명명됨), 아스파라긴 (또한 "N" 또는 "Asn" 로 명명됨), 아스파르트산 (또한 "D" 또는 "Asp" 로 명명됨), 시스테인 (또한 "C" 또는 "Cys" 로 명명됨), 글루타민 (또한 "Q" 또는 "Gln" 로 명명됨), 글루탐산 (또한 "E" 또는 "Glu" 로 명명됨), 글리신 (또한 "G" 또는 "Gly" 로 명명됨), 히스티딘 (또한 "H" 또는 "His" 로 명명됨), 이소류신 (또한 "I" 또는 "Ile" 로 명명됨), 류신 (또한 "L" 또는 "Leu" 로 명명됨), 리신 (또한 "K" 또는 "Lys" 로 명명됨), 메티오닌 (또한 "M" 또는 "Met" 로 명명됨), 페닐알라닌 (또한 "F" 또는 "Phe" 로 명명됨), 프롤린 (또한 "P" 또는 "Pro" 로 명명됨), 세린 (또한 "S" 또는 "Ser" 로 명명됨), 트레오닌 (또한 "T" 또는 "Thr" 로 명명됨), 트립토판 (또한 "W" 또는 "Trp" 로 명명됨), 티로신 (또한 "Y" 또는 "Tyr" 로 명명됨) 및 발린 (또한 "V" 또는 "Val" 로 명명됨) 을 망라한다.
이미 명시된 바와 같이, CRM197 은 면역계의 세포에 대한 단백질 항원 제시를 위한 비-관습적 담체 분자이다. CRM197 은 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다. CRM197 은 특히 Company Pfenex Inc (San Diego, USA) 에 의해 레퍼런스 CRM197 (rDNA) 하에 상품화되어 있다. CRM197 은 본원에서 SEQ ID N°8 의 단백질로서 정의된다.
본원에 기재된 바와 같은, 화학식 (V) 및 화학식 (VIa) 또는 (VIb) 의 그것의 특정 구현예를 포함하는, 화학식 (I) 의 펩티드는 알려진 클로닝 기술에 의해 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
예를 들어, 화학식 (I) 의 펩티드를 인코딩하는 DNA 가 클로닝 기술을 이용하여 제조되고, 자가 복제가능 벡터 내에 삽입되어 재조합 DNA 가 제조된다. 재조합 DNA 는 적당한 숙주, 예컨대 대장균 (Escherichia coli), 고초군 (Bacillus subtilis), 방선균 (Actinomyces), 효모, 사상균, 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포 내에 삽입되어 형질전환체가 수득된다. 형질전환체의 배양 산물로부터, 화학식 (I) 의 펩티드를 함유하는 펩티드가 수득될 수 있다. 대안적으로, 화학식 (I) 의 펩티드를 인코딩하는 DNA 가 제조되고, 맥아 및 대장균 (Escherichia coli) 으로부터의 세포 추출물을 사용하는 무세포 단백질-합성 시스템에 적용되어 본 발명의 펩티드가 합성된다. 화학식 (I) 의 펩티드가 담체 단백질에 연결되어 있는 일부 구현예에서, 화학식 (I) 의 펩티드 및 요망되는 담체 단백질을 둘다 함유하는 융합 단백질로 이루어지는 면역원성 생성물이 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있다.
더욱이, 화학식 (I) 의 펩티드의 관습적 화학적 합성 방법, 예컨대 "고체 상 방법" 또는 "액체 상 방법" 을 사용하여, 아미노산들이 탈수/축합에 의해 연속적으로 연결되고 확장된다.
위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물을 제조하기 위해, 필요에 따라 임의의 적합한 링커와의, 임의의 적합한 접합 반응이 사용될 수 있으며, 이는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
화학식 (V), (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드의 특정 구현예에서, 정수 m 및/또는 n 이 각각 0 일 때 아미노산 잔기 A1 및/또는 A2 는 부재한다.
화학식 (V), (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드의 일부 구현예에서, A1 은 존재하고 (즉, 정수 m=1), A2 는 부재한다 (즉, 정수 n=0)
화학식 (V), (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드의 일부 구현예에서, A1 은 부재하고 (즉, 정수 m=0), A2 는 존재한다 (즉, 정수 n=1).
화학식 (V), (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드의 일부 바람직한 구현예에서, A1 및/또는 A2 는, 존재할 때, 시스테인 잔기로 이루어진다.
화학식 (V), (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드의 일부 바람직한 구현예에서, A1 은 존재하고 N-말단 시스테인 잔기로 이루어지고, A2 는 부재하고, 즉, 정수 n 은 0 이다. 이들 바람직한 구현예에서, 화학식 (V), 또는 (VIa) 의 펩티드는 SEQ ID N°5 의 펩티드로 이루어진다. 이들 바람직한 구현예에서, 화학식 (V) 또는 (VIb) 의 펩티드는 SEQ ID N°7 의 펩티드로 이루어진다.
기술적 관점에서, 상기 화학식 (V) 또는 화학식 (VI) 의 펩티드를 포함하는, 화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 에, 직접 또는 링커 모이어티를 통해, 그들의 N-말단 아미노산 잔기를 통해 또는 그들의 C-말단 아미노산 잔기를 통해 공유적으로 연결되어 있을 수 있다. 이들 일반적 구현예에서, 공유 연결은 화학식 (I) 의 펩티드로부터의 상기 아미노산 잔기의 이용가능한 알파-아미노 기 또는 알파-카르복시 기를 수반할 수 있다. 대안적으로, 공유 연결은 화학식 (I) 의 펩티드로부터의 상기 아미노산 잔기의 측면 사슬에 위치하는 이용가능한 아미노 기, 카르복시 기 또는 티올 기를 수반할 수 있다.
그러나, 화학식 (I) 의 펩티드가 CRM197 에 그들의 C-말단을 통해 공유적으로 연결되어 있는 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물은 최적이 아닌 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 그러한 면역원성 펩티드가 응집물을 형성하는 경향을 갖고, 이것이 화학적으로 정의되고 용이하게 재현할 수 있는 약학적 조성물을 수득하는데 상당한 문제가 될 수 있기 때문이다.
이와 같이, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물의 일부 바람직한 구현예에서, 화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 에 그들의 N-말단을 통해 공유적으로 결합되어 있다.
나아가, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물에서, 화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 에 가장 바람직하게는 적당한 링커제를 통해 공유적으로 연결되어 있다. 본원에서 화학식 (I) 의 펩티드와 CRM197 을 가교하는 링커제의 존재는 분자 내에 약간의 유연성을 도입하고, 그에 따라 면역계의 세포, 즉, 주로 T 세포 및 B 세포의 표면에 존재하는 상응하는 수용체에 대한 화학식 (I) 의 펩티드에 함유된 관련 에피토프의 더 나은 이용가능성을 허용하는 것이 발견되었다.
이와 같이, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물의 일부 바람직한 구현예에서, 화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 에 링커 모이어티를 통해 공유적으로 결합되어 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 에 그들의 N-말단에 의해, 링커 모이어티를 통해 공유적으로 결합되어 있다.
상기 링커 모이어티는 링커제를 CRM197 및 화학식 (I) 의 펩티드 둘다와 반응시킴으로써 수득된다.
바람직한 구현예에서, 링커제는 2 개의 구별되는 반응성 기, (i) 숙신이미딜 기 및 (ii) 말레이미드 기를 각각 보유한다. 각각의 반응성 기는 각각 (i) CRM197 및 (ii) 화학식 (I) 의 펩티드의 아미노 기 또는 티올 기와의 반응에 이용가능하다.
그러한 종류의 링커제는 기술분야에서 매우 잘 알려져 있고, 용이하게 상업적으로 입수가능하다.
그러나, 이들 이종이관능성 (heterobifunctional) 링커제 중 일부는, 특히 백신 조성물의 제조가 추구될 때, 최적이 아닌 것으로 본원에서 발견되었다. 설명적으로, 발명자들은 이종이관능성 링커제 예컨대 MBS (m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미딜 에스테르) 의 사용이 매우 난용성인 최종 생성물을 초래하는 것을 발견했다. 면역원성 화합물의 낮은 물-용해도는 백신 조성물 제조의 관점에서 상당한 기술적 문제를 구성할 수 있는데, 그 이유는 투여할 준비가 된 백신 조성물의 최종 형태는 통상적으로 결국 또한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 수용성 용매를 함유할 수 있는 물-기반 염류 액체 용액 또는 현탁액이기 때문이다. 본원의 실시예에 나타난 바와 같이, CRM197 이 화학식 (I) 의 펩티드에 MBS 를 통해 공유적으로 연결되어 있는 면역-접합체는, 그것의 응집물 형성 경향으로 인해, 백신 조성물의 활성 구성요소로서 사용될 수 없음에도 불구하고, 여전히 면역원성이며, 즉, 생체내에 주입될 때 관련 항-3S 항체를 유발할 수 있다.
놀랍게도, 발명자들은 백신 조성물의 면역원성 활성 구성요소로서의 자격의 관점에서 완전 수용성이어야 하고, 따라서 액체 조성물의 전체 부피 전체에 균일하게 분포되어야 하는 본원에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물의 제조에 링커제의 한정된 패밀리가 가장 적당하다는 것을 확인했다. 상기 링커제의 한정된 패밀리는 각각 SMPB 및 술포-SMPB 로 명명되는 링커제를 망라하거나, 또는 심지어는 그것으로 이루어진다.
이와 같이, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물의 일부 바람직한 구현예에서, 상기 링커제는 SMPB (숙신이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트) 및 술포-SMPB (술포숙신이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
2 개의 단백질을 일반적으로 링커제로, 더욱 특히 SMPB 및 술포-SMPB 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커제로 접합시키는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 설명적으로, 그러한 프로토콜은 Pierce Company (Illinois, Etats-Unis) 에 의해 공개적으로 입수가능한 전단에 개시되어 있다.
SMPB 및 술포-SMPB 는 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 기 및 말레이미드 기를 둘다 함유하는 이종이관능성 링커제로 이루어진다. SMPB 또는 술포-SMPB 를 사용하는 접합은 통상적으로 2-단계 절차에 의해 수행된다. 첫번째 단계에서, 아민-함유 단백질 (예를 들어, CRM197) 이 pH 7-9 에서 여러 배의 몰 과잉의 링커제와 반응되어 아미드 결합을 형성한 후에, 통상적으로 탈염 또는 투석에 의해, 과잉의 미반응 링커제를 제거한다. 두번째 단계에서, 술프히드릴-함유 분자 (예를 들어, 화학식 (I) 의 펩티드) 가 첨가되어 pH 6.5-7.5 에서 첫번째 단백질에 이미 부착된 말레이미드 기 (예를 들어, CRM197 에 이미 공유적으로 연결되어 있는 링커 사슬의 자유 말레이미드 기) 와 반응되어 안정적 티오에테르 결합을 형성한다.
화학식 (I) 의 펩티드를 CRM197 담체 단백질에 공유적으로 연결하기 위해 SMPB 또는 술포-SMPB 를 링커제로서 사용하면 하기 화학식 (VII) 의 접합체가 초래된다:
Figure pct00001
식 중 :
- R1 은 CRM197 의 하나의 반응성 기로 이루어지고, 여기에서 거기에 부착된 NH 기는 (i) CRM197 의 N-말단에 위치하는 알파 아미노 기 또는 (ii) CRM197 의 리신 (K) 아미노산 잔기로부터의 측면 사슬 아미노 기에서 유래하고,
- R2 는 화학식 (I) 의 펩티드로 이루어지고, 여기에서 거기에 부착된 황 (들) 원자는 화학식 (I) 의 펩티드의 N-말단에 또는 C-말단에 위치하는 시스테인 잔기의 술프히드릴 (SH) 기에서 유래한다. 일부 구현예에서, 술프히드릴 모이어티는 비천연 아미노산, 또는 화학식 (I) 의 펩티드의 종단에 존재하는 임의의 기타 분자의 일부일 수 있다.
기술분야에 알려져 있는 바와 같이, CRM197 단백질은 복수의 반응성 기 R1 을 포함하여, 화학식 (VII) 의 접합체에서 복수의 화학식 (I) 의 펩티드가 CRM197 에 연결될 수 있다.
이와 같이, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물의 가장 바람직한 구현예는 상기 화학식 (VII) 로 표시되는 공유 연결에 따라, 그것의 N-말단에서 시스테인 잔기를 보유하는 SEQ ID N°5 또는 SEQ ID N°7 을 갖는 화학식 (I) 의 펩티드에 CRM197 의 복수의 반응성 기가 공유적으로 연결되어 있는 것이다.
위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물의 일부 구현예에서, 평균 개수 2 내지 20 의 화학식 (I) 의 펩티드가 1 개의 CRM197 분자에 공유적으로 연결되어 있다. 바람직한 구현예에서, 평균 개수 7-8 의 화학식 (I) 의 펩티드를 포함하는 평균 개수 5 내지 10 의 화학식 (I) 의 펩티드가 1 개의 CRM197 분자에 공유적으로 연결되어 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 면역보강제 물질과 조합하여, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물을 포함하고, 추가로 하나 이상의 면역-보강제 물질을 포함하는 본원에 정의된 바와 같은 조성물은 본 명세서에서 또한 "면역원성 조성물" 또는 대안적으로 "백신 조성물" 로 명명될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신 조성물의 특색이 인간 또는 수의학적 용도의 판매 권한 부여를 위한 다양한 약품 기관 (Drug agencies) 의 기술적 요구조건에 부합해야 하는 점을 제외하면, 본 발명에 따른 면역원성 조성물 및 본 발명에 따른 백신 조성물 사이에 그러한 조성물의 지정에 이용되는 용어를 넘어서는 실질적 차이가 없다. 대신에, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 약품 기관의 요구조건에 부합하지 않지만, 예를 들어, 탐지 또는 진단 시약으로서의 추가의 용도를 포함하는, 추가의 용도를 가질 수 있는 항-3S 항체를 생산하기 위한, 동물에 대한 투여에 사용가능할 수 있다.
더욱 정확히, 면역원성 조성물은, 면역화된 포유류 유기체에서 생성되는 항체가 예방적 또는 치료적 효과를 발휘하지 않는 상황에서, 그것이 포유류 유기체, 예를 들어, 마우스, 토끼, 양, 말 또는 염소 유기체에게 투여될 때 화학식 (I) 의 펩티드를 겨냥하는 항체를 생성하는 것을 목표로 한다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물은, 예를 들어, HIV-1 바이러스 탐지 시약 또는 HIV-1-유래 펩티드 탐지 시약으로서의, 이들 항체의 추가의 비-치료적 용도를 위해, 화학식 (I) 의 펩티드를 겨냥하는 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
다른 한편으로는, 본 발명에 따른 백신 조성물은, 면역화된 포유류 유기체에서 생성되는 항체가 예방적 또는 치료적 효과를 발휘하는 것이 예상되는 상황에서, 상기 백신 조성물이 투여되는 포유류 유기체에서 화학식 (I) 의 펩티드를 겨냥하는 항체를 생성하는 것을 목표로 한다.
이와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 (i) 면역원성 조성물 및 (ii) 백신 조성물을 둘다 망라한다. 나아가, 면역원성 조성물 및 백신 조성물은 면역-보강제 물질 및 거기에 함유되어 있는 부형제를 포함하는, 보조 물질의 유형에서 상이할 수 있다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 예방적 또는 치료적 효과가 추구되지 않는 HIV 바이러스에 의한 감염과 관련되는 위험에 처해 있지 않는 동물을 포함하는, 동물에서 항-3S 항체 생산을 유발할 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은, 그것이 투여된 개체에서, HIV 바이러스에 의한 감염에 대항하는 예방적 또는 치료적 효과, 특히 바이러스의 병원성 감소를 야기하는 HIV-감염된 개체에서 CD4+ T 세포 감소에 대항하는 보호 효과를 발휘할 항-3S 항체의 생산을 유발하는 것을 목표로 한다.
본원에 정의된 바와 같은 면역원성 조성물 또는 백신 조성물의 일부 구현예에서, 면역보강제는 (i) 무기염, (ii) 에멀전, (iii) 미생물 천연 또는 합성 유도체, (iv) 조합 보강제, (v) 사이토카인-유래 또는 부속 분자-유래 보강제, 및 (vi) 미립자 제형으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
적합한 면역보강제의 목록이 하기 표에 기재되어 있다.
Figure pct00002
무기염을 포함하는 면역보강제는 바람직하게는 (1) 바람직하게는 화학식 KAl(SO4)2, 12 H2O 의, 알루미늄 염, 및 (2) 칼슘 포스페이트로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
에멀전-기반 면역보강제는 바람직하게는 (1) MF59 (이는 미소유체화된 세제 안정화된 스쿠알렌 수중유 에멀전임), (2) 불완전 프로인트 보강제 (또한 IFA 로 명명됨), (3) 몬타나이드 (Montanide) ISA 51 (이는 유중수 안정화된 에멀전임), 및 (4) ISA-720 (이는 물 및 스쿠알렌을 포함하는 안정화된 조성물임) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
천연 또는 합성 미생물 유도체를 포함하는 면역-보강제는 바람직하게는 (1) 모노포스포릴 지질 A (MPL) (예를 들어, Corixa, Hamilton, Mont., USA 로부터의) (2) Detox (MPL+CWS) (이는 모노포스포릴 지질 A 및 마이코박테리아 세포 벽 골격의 유적 에멀전으로 이루어짐), (3) OM-174 (이는 대장균 지질 A 에서 유래하는 가용성 보강제임), (4) 비독성 박테리아 독소, 바람직하게는 개질된 독소, 예컨대 대장균으로부터의 열 불안정성 독소, 콜레라 독소, 특히 그의 B 서브유닛 (각각 LTB 및 CTB 로 명명됨), 및 (5) CpG ODN (이는 면역자극성 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드임) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
조합 보강제는 바람직하게는 (1) AS04 (이는 alum 및 모노포스포릴 지질 A (MPL) 의 조합임), (2) AS02 (이는 모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 QS-21 (예를 들어, Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass., USA 로부터의) 의 조합을 포함하는 수중유 에멀전임), 및 (3) AS01 (이는 리포솜과 2 개의 면역자극 성분: 3'-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 퀼라야 사포나리아 21 (Quillaja saponaria 21) (QS-21) 의 액체 현탁액으로 이루어짐) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
사이토카인-유래 또는 부속 분자-유래 보강제는 바람직하게는 (1) 사이토카인 예컨대 IL-2, IL-12 (예를 들어, Genetics Institute, Cambridge, Mass., USA 로부터의), GM-CSF (예를 들어, Hoffman La-Roche, Basel, Switzerland 로부터의) 및 Flt3 및 (2) 부속 분자 예컨대 B7.1 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
미립자 제형은 바람직하게는 (1) 리포솜 예컨대 DNPC/Chol 의 리포솜, 또는 DC Chol (리포솜으로 자가 조직화할 수 있는 유지질 면역조정인자), (2) 바이로솜™ (Virosomes™) (이는 단층 리포솜 비히클, 면역자극성 재구성된 인플루엔자 바이로솜 [IRIV] 임), (3) ISCOMS® (이는 사포닌 및 지질의 구조화된 복합체임), (4) 폴리락트산 (PLA) 및 폴리[락티드-co-글리콜리드] (PLG 미소입자, 및 (5) 프로테오솜™ (Proteosomes™) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
위에 기재된 면역보강제 화합물 또는 조성물은, 특히 그들이 상업적으로 입수가능하기 때문에, 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다.
그러나, 발명자들은 구체적으로 본원에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물을 사용할 때, 상기 면역원성 화합물이 면역-보강제 물질로서의 알루미늄 히드록시드 (Al(OH)3) 와 조합되었을 때, 효율적 항체 응답, 즉, 인간 개체에서 예방적 또는 치료적 효과에 부합하는 규모를 갖는 항체 응답이 수득되는 것을 발견했다. 알루미늄 히드록시드-기반 면역-보강제 물질은 입자 크기 분포 약 1-10 ㎛ 와 평균 입자 크기 약 2-3 ㎛ 를 갖는 콜로이드 현탁액 형태 하의 미립자 물질로 이루어진다 (Lindblad, 2004, Immunology and Cell Biology, Vol. 82 : 497-505).
특히, 발명자들은, 특히 잘 알려진 면역-보강제 알루미늄 포스페이트를 포함하는, 기타 매우 관습적인 면역-보강제 물질이, 알루미늄 히드록시드와 비교할 때, 더 낮은 항-3S 펩티드 항체 역가 수준의 유도를 허용하는 것을 발견했으며, 이러한 항체 역가 수준은 실험실 시약으로 항체를 생산하는데는 유용할 수 있으나 예방적 또는 치료적 의학적 효과를 발휘할 수 있는 항-3S 항체의 내생적 생산에는 너무 많이 낮다.
이와 같이, 본 발명에 따른 조성물의 바람직한 구현예에서, 상기 면역-보강제 물질은 알루미늄 히드록시드로 이루어진다.
나아가, 발명자들은, 최적 항-3S 항체 응답을 수득하기 위해, 알루미늄 히드록시드는 Al(OH)3 입자의 응집을 회피하기 위해 바람직한 조건에서 사용되고, 최종 액체 현탁액 중 이들 입자의 균일한 분포를 보장해야 한다는 것을 발견했다.
본 발명에 따르면, 최종 사용할 준비가 된 (ready-to-use) 조성물이 100-200 mM NaCl 및 0.5-2.0 mM 나트륨 포스페이트, 가장 바람직하게는 150 mM NaCl 및 1 mM 나트륨 포스페이트를 포함할 때, 알루미늄 히드록시드 입자 응집물의 형성은 회피되거나, 적어도 상당히 연기 또는 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 이 구현예에 따르면, 알루미늄 히드록시드 입자 응집의 속도는, 면역원성 화합물에 흡착하는 입자의 능력을 변경하지 않고, 매우 최소화되며, 이러한 특정 조건은 효율적 보호성 항-3S 펩티드 항체 생산을 유발하는 조성물의 능력을 증강시킨다.
이와 같이, 본 발명에 따른 조성물의 일부 구현예에서, 상기 조성물은 알루미늄 히드록시드를 0.1 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.05 ㎎/㎖ 내지 2 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 약 1 ㎎/㎖ (Al3+ 이온 함량으로서 표현됨) 의 최종 농도로 포함하는 사용할 준비가 된 백신 조성물을 형성하도록 적응되어 있다. 유럽 약전에 따르면, 알루미늄 보강제의 양은 투여물 당 1.25 ㎎ 미만의 알루미늄 및 투여물 당 850 ㎍ 의 알루미늄 (미국에서) (미국연방규정집에 따라) 이어야 한다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 특정 구현예에 따르면, 상기 조성물은 최종 농도 0.1 mM 내지 50 mM 의 나트륨 포스페이트, 바람직하게는 0.5 mM 내지 15 mM 의 나트륨 포스페이트, 가장 바람직하게는 약 1 mM 의 나트륨 포스페이트를 포함하는 사용할 준비가 된 백신 조성물을 형성하도록 적응되어 있다.
특정 양상에서, 본 발명에 따른 조성물은 상기 면역원성 화합물을 투여 단위 당 0.01 ㎍ 내지 200 ㎍ (항원성 펩티드 당량으로서 표현됨), 바람직하게는 투여 단위 당 0.05 ㎍ 및 50 ㎍, 가장 바람직하게는 투여 단위 당 0.1 ㎍ 내지 20 ㎍ 의 양으로 포함하는 사용할 준비가 된 백신 조성물을 형성하도록 적응되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "항원성 펩티드 당량" 으로서 표현되는 면역원성 화합물의 양은 고려되는 면역원성 화합물 재료에 함유되어 있는 화학식 (I) 의 펩티드의 양으로 이루어진다. 본 발명에 따르면, 1 개의 CRM197 분자에 연결되어 있는 화학식 (I) 의 펩티드의 양은 바람직하게는 아미노산 분석에 의해 측정된다. 이 방법은 단백질의 아미노산 조성을 확인하는데 관습적으로 사용되는 방법이다. 단백질은 선형 중합체로서 조직된 공유적으로 결합된 아미노산 잔기로 이루어지는 거대분자이다. 펩티드 결합은 산성 조건 하에 인큐베이션시 파괴되어 아미노산의 방출을 초래한다. 아미노산 분석은 그 후 가수분해 산물에 대해 수행된다.
본 발명에 따르면, 아미노산 분석은 바람직하게는 CRM197 에 대한 화학식 (I) 의 펩티드의 커플링 속도를 확인하는데 사용된다. 이것은 일부 아미노산은 CRM197 및 그래프팅된 펩티드 둘다에 존재하고, 다른 아미노산 예컨대 F (페닐알라닌) 은 오직 CRM197 에만 존재하기 때문에 가능하다. CRM197 에만 존재하는 아미노산의 결과 및 CRM197 및 그에 접합된 화학식 (I) 의 펩티드 둘다에 존재하는 아미노산의 결과에 기초하는 계산은 CRM197 에 대한 화학식 (I) 의 펩티드의 커플링 속도를 확인하는 것을 허용했다.
전형적으로, CRM197 과 화학식 (I) 의 펩티드 사의 접합체의 가수분해 후에, 시험 샘플에 존재하는 아미노산은 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 에 의해 분리된다. 통상적으로, 이러한 장비는 사전- 또는 사후-칼럼 유도체화 능력을 갖고, 사용되는 유도체화 방법에 따라 탐지기는 자외선-가시광선 또는 형광 탐지기이다. 적분기 (integrator) 를 사용하여 탐지기로부터의 아날로그 신호를 변환하고 각각의 아미노산을 정량한다 (Amino acid analysis of peptide loading ratios in conjugate vaccines: a comparison of electrochemical detection and 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate pre-column derivatization methods Nahas DD et al Bioconj Chem 2008 Jan 19(1) 322-6 Epub 2007 dec 12). 1 개의 CRM197 분자에 연결되어 있는 화학식 (I) 의 펩티드의 양은 또한 질량 분광분석법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 액체 또는 고체 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은, 액체 현탁액 농축물 또는 사용할 준비가 된 액체 현탁액으로서, 액체 현탁액으로 이루어진다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 고체 미립자 재료 (즉, 접합체) 로 이루어지며, 이 제료는 특히 동결건조된 재료를 포함하고 주입에 앞서 보강제 및 다른 부형제와 접촉되어야 한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물, 또는 위에 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는 백신 조성물와 관련된다.
그러한 면역원성 조성물의 제형은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 임의의 및 모든 관습적 용매, 분산매, 충전제, 고체 담체, 수용액, 코팅, 항세균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어, 하나 이상의 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 그들의 조합을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 항체의 저장 수명 또는 효과를 향상시키는 적은 양의 보조 물질 예컨대 습윤 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 제조 및 용도는 기술분야에서 잘 알려져 있다. 임의의 관습적 매질 또는 작용제가 활성 구성요소와 비화합성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 면역원성 조성물에서 그것의 사용이 고려된다.
그러한 면역원성 조성물은, 예를 들어, 피하 또는 근육내 주입, 뿐만 아니라 경구 또는 비강내 및 기타 점막 경로에 의해 비경구 투여될 수 있다. 기타 투여 방식은, 예를 들어, 경구 제형, 폐 제형, 좌제, 및 경피 적용을 제한 없이 이용한다. 경구 제형은, 예를 들어, 통상적으로 이용되는 부형제, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트 등을 제한 없이 포함한다.
적당한 면역-보강제 물질 및 적당한 약학적으로 허용가능한 부형제(들)과 조합하여 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물을 포함하는 조성물은, 개체에게 투여될 때, 높은 역가의 높은 역가의 항-3S 펩티드 IgG 항체를 유도하는 것이 본원의 실시예에서 보여진다.
중요하게, 본원의 실시예는 본 발명에 따른 조성물로 면역화된 개체의 혈청에서 발견되는 항-3S 펩티드 항체가 CD4+ T 세포의 표면에서 NKp44L 의 발현을 용량-의존적 방식으로 저해하는 것을 보여준다.
기술분야에 알려져 있는 바와 같이, CD4+ T 세포의 표면에서 NKp44L 발현의 저해는 HIV-감염된 개체에서 NK 세포 활성화 및 CD4+ T 세포를 향하는 NK 세포 세포독성을 감소시킴으로써 CD4+ T 세포 감소에 대해 보호 효과를 야기한다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물, 또는 위에 정의된 바와 같은 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HIV 바이러스에 의한 개체의 감염에 의해 야기되는 상태를 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물, 또는 위에 정의된 바와 같은 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, HIV-1 바이러스에 의한 개체의 감염의 예방 또는 치료는 (i) AIDS 를 포함하는, HIV-1 바이러스에 의한 상기 개체의 감염과 관련된 질환의 예방 또는 치료 및 (ii) HIV-1 질환의 진행의 방지를 망라한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "HIV 감염" 은 일반적으로 유형 1 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1) 에 의한, 숙주 동물, 특히 인간 숙주의 감염을 망라한다. "HIV-1" 은 본원에서 HIV-1 패밀리 내의 임의의 균주, 형태, 하위유형, 분기군 및 변형을 지칭하는데 사용될 수 있다. 이와 같이, HIV-1 감염의 치료는 레트로바이러스의 HIV-1 패밀리 중 임의의 보균자인 사람 또는 활성 AIDS 로 진단받은 사람의 치료, 뿐만 아니라 그러한 사람에서 AIDS-관련 상태의 치료 또는 예방을 망라할 것이다. HIV-1 의 보균자는 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, 사람은 그 사람이 항-HIV-1 항체 양성이거나, HIV-1-양성이거나, AIDS 의 증상을 갖는 것에 기초하여 HIV-1 보균자로서 식별될 수 있다. 즉, "HIV-1 감염의 치료" 는, 예를 들어, 급성 일차 감염 증후군 (이는 무증상이거나, 열, 권태감, 설사 및 신경 증상 예컨대 두통을 수반하는 인플루엔자-유사 질병과 연관될 수 있음), 무증상 감염 (이는 순환성 CD4+ T 세포의 개수가 점진적으로 감소하는 긴 무증상 기간임), 및 AIDS (이는 더욱 심각한 AIDS-규정 질병 및/또는 효과적인 면역 기능과 화합성인 수준 미만으로 순환성 CD4 세포 총수의 감소에 의해 정의됨) 를 포함하는, HIV-1 감염 진행의 여러 시기 중 임의의 하나의 시기에 있는 환자를 치료하는 것으로 이해될 것이다. 또한, "HIV-1 감염의 치료 또는 예방" 은 또한, 예를 들어, HIV-1-오염된 혈액과의 접촉, 수혈, 체액 교환, 감염된 사람과의 "불안전한" 성관계, 우발적 주사바늘 상해, 오염된 기구로 문신 또는 침술을 받는 것, 또는 임신, 출산 중 또는 그 이후에 어머니로부터 아기에게로 바이러스의 전파에 의한, HIV-1 에의 의심되는 과거 노출 후에 HIV-1 에 의한 의심되는 감염을 치료하는 것을 망라할 것이다.
용어 "HIV-1 감염의 치료" 는 또한 항-레트로바이러스 요법의 맥락에서, 바이러스 존재량 (viral load) 및/또는 CD4 T 세포 총수의 면에서 환자가 그러한 요법에 완전 응답성 또는 부분 응답성인지 여부로 이해될 것이다.
용어 "HIV-1 감염의 예방" 은 HIV-1 에 감염되지 않았지만 조만간 HIV-1 에 감염될 위험이 있는 것으로 예상되는 사람을 치료하는 것을 망라할 수 있다.
용어 "AIDS 의 치료" 는 더욱 심각한 AIDS-규정 질병 및/또는 효과적 면역 기능과 화합성인 수준 미만으로 순환성 CD4+ T 세포 총수의 감소를 나타내는 환자를 치료하는 것을 의미한다. 용어 "AIDS 의 치료" 는 또한 AIDS 또는 HIV-1 감염에 부수적인 또는 그와 연관되는 장애 및 질환 예컨대 AIDS-관련 증후군 (ARC), 진행성 전신성 림프절병 (PGL), 항-HIV 항체 양성 상태, 및 HIV-양성 상태, AIDS-관련 신경 상태 (예컨대 치매 또는 열대성 대부전마비), 카포시 육종, 혈소판 감소성 자반증 및 연관된 기회 감염 예컨대 폐포자충폐렴, 마이코박테리아 폐결핵, 식도 칸디다증, 뇌의 톡소플라스마증, CMV 망막염, HIV-관련 뇌병증, HIV-1-관련 소모 증후군 등을 의미하는, AIDS-관련 상태를 치료하는 것을 망라한다.
이와 같이, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "AIDS 의 예방" 은 HIV-1 감염된 또는 HIV-1 감염이 의심되는 또는 HIV-1 감염 위험에 처한 환자에서 AIDS (이는 더욱 심각한 AIDS-규정 질병 및/또는 효과적 면역 기능과 화합성인 수준 미만으로 순환성 CD4+ T 세포 총수의 감소를 특징으로 함) 및/또는 AIDS-관련 상태의 발달을 예방하는 것을 의미한다.
이와 같이, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "HIV-1 진행의 예방" 은 HIV-1 감염된 환자에서, 질환의 합병증 및 질환의 중증도 증가와 연관된 2 개의 주된 마커인, 그것의 CD4+ T 세포 총수의 감소를 예방하는 것 및/또는 그것의 바이러스 존재량의 증가를 예방하는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 HIV 바이러스에 의한 개체의 감염에 의해 야기되는 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 조성물을 제조하기 위한, 위에 정의된 바와 같은 면역원성 화합물, 또는 위에 정의된 바와 같은 조성물의 용도를 다룬다.
본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 백신 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, HIV 바이러스에 의한 개체의 감염에 의해 야기되는 상태의 예방 및/또는 치료 방법과 관련된다.
본 발명은 이후 실시예에 의해, 그에 제한되지 않으면서, 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1 : 면역원성 화합물의 제조 및 그들의 특성의 일부의 확인
A. 면역원성 화합물의 제조
하기 면역원성 화합물 또는 접합체를 합성했다. 그들을 KLH 및 CRM197 로부터 가교제 분자로서 MBS 또는 SMPB 를 사용하여 유도했다. 사용된 펩티드 는 그것의 아미노-말단에서 또는 그것의 카르복시-말단에서 부가적 시스테인 잔기를 갖는 SEQ ID N°2 로 이루어지는 3S 펩티드였다.
- CRM197-MBS-Nter(Cys)- 3S
- CRM197-SMPB-Nter(Cys)- 3S
- CRM197-SMPB-Cter(Cys)- 3S
- KLH-MBS-Nter(Cys)- 3S
명확성을 위해, 위에서 "Nter(Cys)-3S" 로 명명되어 있는 펩티드는 여기에서 SEQ ID N°5 의 3S 펩티드로 이루어진다.
2 가지 이종이관능성 교차-링커를 시험했다: 술포-SMPB (술포-(숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트) 및 술포-MBS (술포-(m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드) 에스테르). 이들 분자는 폴리에틸렌 사슬에 의해 N-히드록시숙신이미드의 에스테르에 연결되어 있는 말레이미드 모이어티로 이루어진다 (Cross-linking of protein by w-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters. Partis M.D and al. Journal of Protein Chemistry, vol.2, No 3, 1983). 숙신이미드 모이어티는 단백질의 아미노 기와 반응할 수 있다. 이 반응이 일어나면, 말레이미드 모이어티는 3S 펩티드의 술프히드릴 기와 반응한다. 그들은 길이가 상이하며, 술포-MBS 의 경우 7,3 Å이고, 술포-SMPB 의 경우 11.6 Å이다. 링커 제거 및 완충액 교환을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 에 의해 실시했다.
커플링 반응은 2-단계 반응이었다. 첫번째 단계는 교차-링커에 의한 CRM197 의 활성화였다. 디메틸 술폭시드 중에 희석시킨, 15 밀리그램의 링커를 5-20 ㎖ 부피의 접합 완충액 (PBS 10 mM pH7-pH7.4) 중 20 밀리그램의 CRM197 에 첨가하고, 30-90 분 동안 실온에서 부드럽게 혼합했다 (Protective immunogenicity of two synthetic peptides selected from the amino acid sequence of Bordetella pertussis toxin subunit S1. Askeloef P. and al. PNAS, vol.87, pp 1347-1351, February 1990). 이 반응에 뒤이어 활성화된 CRM197 을 SEC (PD10 칼럼 (GE Healthcare, Chalfont St. Giles United Kingdom) 또는 Bio-Gel P2 칼럼 (Biorad Marnes-la-Coquette, France)) 에 의해 정제했다. 두번째로, 활성화된 CRM197 및 3S-유래된 펩티드를 실온에서 30 분 - 2 시간 동안 혼합하여, 활성화된 CRM197 에 대한 펩티드의 공유 커플링을 허용했다. 활성화된 CRM197 의 미반응 말레이미도 기를 차단하기 위해, 접합 반응 후에 시스테인-HCl (SIGMA, Missouri, USA) 을 과잉량으로 용액에 첨가했다 (A practical approach to crosslinking. Mattson G. and al. Molecular Biology Reports 17: 167-183, 1993). 이 단계는 다량체의 생성을 제한했다. 그 후 면역-접합체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제했다. 면역-접합체를 아미노산 분석법 (AAA) 을 사용하여 분석하여 펩티드/CRM197 비율을 확인했다. CRM197-3S 펩티드를 동결건조보호제 (lyoprotector) 로 동결건조시켰다 (Lyophilisation and development of solid protein pharmaceuticals. Wang W. International Journal of Pharmaceutics 203 (2000) 1-60; Fundamentals of freeze-drying. Nail S.L and al. Pharm Biotechnol. 2002; 14:281-360).
B. 이들 면역원성 화합물의 특성
놀랍게도, C-말단에서 Cys 를 갖는 SEQ ID N°2 의 3S 펩티드, CRM197 담체 및 링커로서의 SMPB 또는 MBS 에 상응하는 수득된 모든 면역-접합체는 가열 또는 진탕하면서 심지어는 긴 시간 후에도 물에 또는 0.9% NaCl 용액에 가용성이 아니었다. 이들 면역-접합체는 균일하고 재현가능한 물질을 수득하는데 적합하지 않았으므로, 이들 화합물을 동물에서 시험하지 않았다.
놀랍게도, N-말단에서 Cys 를 갖는 SEQ ID N°2 의 3S 펩티드, CRM197 담체 및 링커로서의 MBS 를 사용하는 면역-접합체는 가열 또는 진탕하면서 심지어는 긴 시간 후에도 물에 또는 0.9 % NaCl 용액에 가용성이 아니었다. 이들 면역-접합체는 균일하고 재현가능한 물질을 수득하는데 적합하지 않았음에도 불구하고, 이들 화합물을 마우스에서 시험했다.
놀랍게도 N-말단에서 Cys 를 갖는 SEQ ID N°2 의 3S 펩티드, CRM197 담체 및 링커로서의 SMPB 에 상응하는 면역-접합체는 물에 또는 0.9% NaCl 용액에 자발적으로 가용성인 것으로 발견되었다. 그러한 면역-접합체를 추가로 연가했다.
실시예 2 : 비교 검정
A. 재료 및 방법
A.1. 실시예 2 에서 시험된 다양한 면역-접합체 화합물을 실시예 1 에 개시된 바와 같이 제조했다.
A.2. 시험된 다양한 조성물이 하기 표 1 에 개시되어 있다.
표 1
Figure pct00003
SEQ ID N°5 의 펩티드는 또한 항-3S16Nter 펩티드로 명명된다.
- SMPB 및 MBS 는 PIERCE (Illinois, USA) 또는 SIGMA (Missouri, USA) 로부터 구입했다.
- 아드주포스® (Adjuphos®) 2% (알루미늄 포스페이트 겔) 는 Brenntag (Frederikssund, Denmark) 로부터 구입했다. 아드주포스® 는 3 ㎎/㎖ 의 Al3+ 이온의 최종 농도로 사용했으며, 상기 최종 농도는 주입 당 300 ㎍ 의 Al3+ 이온의 투여에 적응되어 있다.
- 알히드로겔® (Alhydrogel®) 2% (알루미늄 히드록시드 겔) 은 Brenntag (Frederikssund, Denmark) 로부터 구입했다. 알히드로겔® 은 3 ㎎/㎖ 의 Al3+ 이온의 최종 농도로 사용했으며, 상기 최종 농도는 주입 당 300 ㎍ 의 Al3+ 이온의 투여에 적응되어 있다.
- 불완전 프로인트 보강제 (IFA) 는 SIGMA (Missouri, USA) 로부터 구입했다. 50 ㎕ 의 IFA 와 50 ㎕ 의 수성 면역-접합체 용액의 혼합물을 1 시간 동안 볼텍싱함으로써 IFA 를 면역-접합체 화합물과 유화시켰다.
A.3. 동물
동물은 Charles River Laboratories (Lyon, France) 에 의해 공급된 BALB/cJ 암컷이었으며, 실험 제 0 일에 8 주령이었다.
A.4. 투여 방법
표 1 에 기재된 각각의 조성물을 마우스에게 피하 경로에 의해 항원성 펩티드 당량의 양으로서 표현되는, 40 ㎍ 의 투여량으로 주입했다.
마우스에게 100 ㎕ 의 시험되는 각각의 조성물을 각각 제 0 일, 제 14 일 및 제 28 일에 피하 주입했다.
각각의 마우스의 중량을 각각 제 0, 14, 35 및 49 일에 추적조사했다.
A.5. ELISA 검정
ELISA 검정을, 또한 항-3S16Nter 펩티드로도 호칭되는, SEQ ID N°2 의 펩티드를 인지할 IgG 항체의 측정을 수행하도록 디자인했다.
항-3S16Nter IgG 항체 역가를 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 에 의해 확인했다. 제 0 일, 제 14 일 및 제 28 일에 20 또는 50 ㎍/백신접종 의 3S16Nter 펩티드 당량의 표 1 에 보고된 면역-접합체로 백신접종된 랫트로부터의 혈청의 푸울을 사용하여 상이한 96-웰 플레이트 사이의 값들을 정규화시켰다.
제 49 일 혈청의 8 개의 희석물을 시험했다 (1/50 내지 1/150, 1/450, 1/1350, 1/4050, 1/12150, 1/36450, 및 1/109350). Nunc Maxisorp 마이크로 플레이트에 코팅된 항원은 면역-접합체의 합성에 사용된 것과 상이한 하기 링커로 소 혈청 알부민 (BSA) 에 접합된 3S16Nter 펩티드였다: SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 로부터 구입한 Imject® 말레이미드 활성화된 BSA 단백질 키트로부터 생성됨). 항-3S16Nter IgG 항체는 호올스래디시 퍼옥시다제 (HRP) (Jackson Immunoresearch, West Grove, USA) 에 접합된 염소 항-랫트 IgG (Fc), 및 HRP 기질: 테트라메틸벤지딘 (TMB) (Sigma, Missouri, USA) 을 사용하는 비색 반응에 의해 밝혔다.
B. 결과
항-3S 항체의 IgG 역가를 재료 및 방법 섹션에 기재된 ELISA 검정에 의해 측정했다.
결과가 도 1 에 나타나 있다.
도 1 의 결과는 담체 단백질로서 KLH 를 포함하는 면역-접합체 화합물 (E, F 및 G) 은, 담체 단백질로서 CRM197 을 포함하는 면역-접합체 화합물 (A, B, C 및 D) 과 비교할 때, 각각 제 21 일 (도 1A), 제 35 일 (도 1B) 및 제 49 일 (도 1C) 에 매우 낮은 항-3S 항체 생산을 유도하는 것을 보여준다.
도 1 의 결과는 또한, 저장 시간이 증가함에 따라 증가하는 양의 응집물을 함유하는 이종성 현탁액을 형성하는 그들의 능력으로 인해, 그들이 저조하게 사용가능함에도 불구하고, 링커제로서 MBS 를 사용하여 수득된 면역-접합체 화합물 (B 및 D) 이 양호한 면역원성 특성을 보유하는 것을 보여준다. 화합물 A 및 C 에 존재하는 면역-접합체도 또한 양호한 면역원성 특성을 나타낸다. 명확성을 이유로 그것은 이제부터 "3S 약물 물질" 로서 호칭된다.
도 1 의 결과는 또한, 아드주포스® 를 함유하는 조성물이 응집물을 형성하는 경향을 갖고, 그에 따라 상이한 취급 특성을 갖는 최종 생성물로 이루어지는 사실에도 불구하고, 면역-보강제 물질로서 아드주포스® 를 함유하는 조성물 (A, B) 이 면역-보강제 물질로서 알히드로겔® 을 함유하는 조성물과 동일한 정도의 면역원성 특성을 보유하는 것을 보여준다.
실시예 3: 면역-접합체의 제형의 최적화
알루미늄 염에 대한 항원의 흡착은 보강제 효과에 중요하고, 백신 항원의 제형, 특히 염은 알루미늄과 항원 사이의 잠재적 상호작용의 중요한 구성요소이다. 알루미늄 히드록시드 표면은 알루미늄에 배위된 히드록실 기로 구성되어 있다. 포스페이트 알루미늄의 표면 전하는 히드록실 및 포스페이트 기 둘다로 구성되어 있다. 알루미늄 보강제에 의한 단백질의 흡착은 착물 과정이고, 정전기, 소수성 및 기타 인력의 기여를 수반한다.
이들 제형 연구의 목적은 부드러운 진탕 후에 가시적 응집물 없이 균일한 유백색 (乳白色) 양상을 갖는 백신 제제를 수득하는 것이었다. 이 연구의 목적은 1 시간의 인큐베이션 후에 95 % 이상의 3S 약물 물질을 알루미늄 입자 위에 흡착시키는 제형을 수득하는 것이었다.
첫번째 탐색 연구에서, 3S 약물 물질을 135 mM 나트륨 클로리드 및 0.5 mM 나트륨 포스페이트 중 알루미늄 히드록시드 보강제와 혼합했다. 응집물이 관찰되었으나, 거의 100 % 의 3S 약물 물질이 알루미늄 염 위에 흡착되었다. 알루미늄 포스페이트를 사용했을 때, 혼합은 균일한 용액을 초래했으나, 오직 80 % 의 3S 약물 물질만 알루미늄 염 위에 흡착되었다.
제형의 스크리닝을 수행했다. 상이한 물리-화학적 파라미터를 시험했다: pH, 나트륨 클로리드 농도 및 포스페이트 농도. 흡착 연구를 1 ㎎ /㎖ 의 알루미늄 이온을 함유하는 현탁액에서 수행했다. 37.5 ㎍ 의 단백질 (12.5 ㎍ 의 펩티드 당량에 상응함) 을 보강제 현탁액과 혼합하여 낮은 흡착 튜브를 사용하여 0.250 ㎖ 의 최종 부피를 생성했다. 알루미늄 히드록시드를 함유하는 제형에서 pH 를 포스페이트 음이온으로 pH7.2 로 조정했다. 제제를 부드럽게 혼합했다. 예비 실험은 흡착이 수 분 내에 완료되는 것을 나타냈다. 현탁액을 원신분리하고, 투명한 상청액을 단백질에 대해 분석했다. 상청액의 항원 농도를 비신코닌산 단백질 검정의 마이크로 프로토콜 (Pierce, Rockford, IL, USA) 을 사용하여 확인했다. 마이크로플레이트에서의 절차가 뒤따랐다. 흡수성을 562nm 에서 측정했다.
응집물을 회피하기 위해 제형에 포스페이트 음이온을 첨가하는 것의 효과를 연구했다. 보강제를 포스페이트 음이온으로 사전처리함으로써 항원과 관련하여 알루미늄의 표면 전하를 최적화하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 처리는 정전기 인력에 의해 염기성 단백질의 흡착을 초래할 수 있다. 포스페이트 음이온은 또한 pH 를 조절하기 위해 백신 제제에 포함시킨다.
이온 강도의 효과를 또한 조사했다. 나트륨 클로리드를 첨가하여 이온 강도를 250 mM 로 증가시키는 경우 흡착률이 개선되었다.
알루미늄 히드록시드를 사용할 때, 제제에 포스페이트 음이온을 첨가함으로써 제형의 양상이 개선되었다.
지속적으로 균일한 유백색 양상을 제공하는 2 가지 제형이 수득되었다:
제형 1: 7 mM 나트륨 포스페이트, 135 mM 나트륨 클로리드, 1 ㎎/㎖ 의 Al 3+ 이온에서 알루미늄 히드록시드 pH 7
제형 2: 15 mM 나트륨 포스페이트, 135 mM 나트륨 클로리드, 1 ㎎/㎖ 의 Al 3+ 이온에서 알루미늄 히드록시드 pH 7
알루미늄 포스페이트를 사용할 때, 이들 제형은 균일한 유백색이었으나 흡착 능력은 목표 95% 에 도달하지 않았다. 대조 알루미늄 포스페이트에서, 부가적 포스페이트 음이온은 음성 표면 전하를 증가시켰다. 따라서 포스페이트 음이온에 의한 알루미늄 포스페이트의 처리는 흡착되는 단백질의 유형, 즉, 염기성을 변화시킬 것으로 예상되지 않는다. 우리는 알루미늄 포스페이트 보강제를 HCl 로 사전처리하여 pH 를 감소시킴으로써 알루미늄 포스페이트 보강제의 표면 전하를 변화시켰다. 보강제 제형의 pH 가 5.5 로 감소되었을 때, 100% 의 흡착이 수득되었다. 그러므로 하기 제형 3 을 선택했다:
제형 3: 150 mM 나트륨 클로리드, 1 ㎎/㎖ 의 Al 3+ 이온에서 알루미늄 포스페이트 pH 5.5
3 가지 제형은 마우스에서 유사한 면역원성을 나타냈다. 제형 1 (1 ㎎/㎖ 의 Al3+ 이온에서, 7 mM 나트륨 포스페이트 및 135 mM 나트륨 클로리드, pH 7) 을 선택하여, 에이징 (aging) 동안 흡착에 대한 포스페이트 음이온의 효과를 제한했다.
제형의 최적화를 계속했다. 나트륨 포스페이트 및 나트륨 클로리드 농도를 변화시켜 하기 2 개의 기준에 따라 허용가능한 제형을 수득했다: 거의 100 % 의 흡착 및 균일한/유백색 양상. 등장성 제제를 수득하기 위해, 나트륨 클로리드의 농도를 150 mM 로 증가시켰다. 포스페이트 음이온은 알루미늄 히드록시드의 표면에 대한 흡착에 영향을 미칠 수 있으므로, 농도를 제제 중 1 mM 로 감소시켰다. 1 ㎎/㎖ 의 Al3+ 이온의 농도에서 알루미늄 히드록시드와 함께 1 mM 나트륨 포스페이트 및 150 mM 나트륨 클로리드를 함유하는 제형 pH 7,2 을 선택했다 (제형 4: 1 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM 나트륨 클로리드, 1 ㎎/㎖ 의 Al 3+ 이온에서 알루미늄 히드록시드 pH 7.2). 마지막으로, 상이한 실험 (제형 및 안정성 시험) 후에, 보강제 및 3S 약물 물질의 pH 와 화합성인, pH 6.8 을 선택했다 (제형 5: 1 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM 나트륨 클로리드, 1 ㎎/㎖ 의 Al 3+ 이온에서 알루미늄 히드록시드 pH 6.8).
제형 5 를 상기 이유 (면역원성, 알루미늄 히드록시드에 대한 면역-접합체의 양호한 흡착, 유백색 양상, 인간에서 사용하기 위한 순응도 - pH - 인간에서 사용하기 위해 선택된 등장성) 로 선택했다.
제형 5 내에 제형화된 3S 약물 물질을 이제부터 "VAC-3S" 로 명명한다.
실시예 4 : 최적 투여량 범위의 확인
이 실시예는 마우스 및 랫트에서 상기 3S 약물 물질 후보의 면역 응답에 따라, 인간 내에 주입될 수 있는 3S 약물 물질의 양을 기술한다.
A. 방법
최초 인체 시험 동안 사용될 최대 인간 투여량을 결정하기 위해 3S 약물 물질 또는 CRM197-3S16Nter 로 마우스 BalB/CByJ (Charles River Laboratories, Lyon, France) 및 랫트 CD® IGS (Charles River Laboratories, Lyon, France) 에서 2 개의 투여량-범위 발견 연구를 수행했다. 시험된 제형은 알루미늄 히드록시드 (1 ㎎/㎖ 의 Al3+ 이온), 150 mM 나트륨 클로리드 및 3.6 mM 나트륨 포스페이트 내였다. 기재된 실험에서, -3S 약물 물질의 시험된 로트 (lot) 중 나트륨 포스페이트의 너무 높은 농도 때문에 3S 약물 물질을 3.6 mM 나트륨 포스페이트로 시험했다. 약물 제품, 즉 "VAC-3S" 는 3.6 mM 나트륨 포스페이트 대신에 1 mM 나트륨 포스페이트 내에 제형화했다. 알루미늄 히드록시드에 대한 3S 약물 물질의 흡착은 1 및 3.6 mM 포스페이트 사이에서 동등했다. 더욱이, VAC-3S 및 3.6 mM 나트륨 포스페이트와 함께 제형화된 3S 약물 물질 사이에 면역원성의 가교 실험을 수행할 것이다. 임상 시험에서, 투여 일정은 1 달 간격으로 3 회의 백신접종이다. 마우스 및 랫트에서, 동일한 일정을 3 회의 백신접종으로 그러나 14 일 간격으로 수행했다. 항-3S16Nter IgG 역가를 3S 약물 물질에 대한 생물학적 응답으로서 측정했다. 그러한 항체는 3S 펩티드 및 인간 CD4+ T 세포 상의 그것의 수용체 사이의 상호작용을 저해하는 것으로 알려져 있다.
B. 마우스에서 최적 투여량 범위의 확인
증가하는 투여량의 하기 3S 약물 제품으로 백신접종된 9 마리 마우스로 이루어지는 6 개 그룹: 부피 0.05 ㎖ 의 보강제로서의 150 mM 나트륨 클로리드, 3.6 mM 나트륨 포스페이트, 및 1 ㎎/㎖ 의 알루미늄 히드록시드 내에 제형화된 0.02, 0.2, 1, 2, 및 4 ㎍ 의 3S16Nter-펩티드-당량의 3S 약물 물질. 6 마리 마우스로 이루어지는 1 개의 그룹은 보강제 단독으로 백신접종했다.
4, 2 및 1 ㎍ 의 펩티드 당량의 투여량은 유의하게 상이하지 않은 항-3S16Nter IgG 항체 역가를 유도한다.
그러므로, 마우스에서 2 주 간격으로 0.05 ㎖ 의 보조 3S 약물 물질의 3 회의 단일 자리 백신접종 후에, 3S 약물 물질에 의해 유도되는 면역 응답 (순환성 항-3S16Nter IgG 항체 역가) 의 정점지속기 (plateau) 는 0.2 와 1 ㎍ 3S16Nter-펩티드 당량 사이에 포함된 값에서 시작한다.
C. 랫트에서 최적 투여량 범위의 확인
6 마리의 랫트로 이루어지는 5 개의 그룹을 증가하는 투여량의 하기 3S 약물 제품으로 백신접종했다: 백신접종 당 부피 0.5 ㎖ 의 보강제로서의 150 mM 나트륨 클로리드, 3.6 mM 나트륨 포스페이트, 및 1 ㎎/㎖ 의 알루미늄 히드록시드 내에 제형화된 0.02, 0.2, 2, 20 및 40 ㎍ 의 3S16Nter-펩티드-당량의 약물 물질. 6 마리의 랫트로 이루어지는 1 개의 그룹은 음성 대조군으로서 백신접종하지 않았다
40 ㎍ 의 펩티드-당량에 의한 백신접종은 2 ㎍ 의 펩티드-당량 (기하 평균=1/1413, p=0.03) 보다, 0.2 ㎍ 의 펩티드-당량 (기하 평균=1/1736, p=0.02) 보다 및 0.02 ㎍ 의 펩티드-당량 (기하 평균= 1/861, p=0.009) 보다 유의하게 더 높은 항-3S16Nter IgG 역가 (기하 평균=1/5776) 를 초래한다.
40 ㎍ 의 펩티드-당량에 의한 백신접종은 20 ㎍ 의 펩티드-당량에 의한 백신접종과 유의하게 상이하지 않은 항-3S16Nter IgG 항체 역가를 초래한다 (기하 평균: 각각 1/5776 및 1/4284, p=0.70).
그러므로, 랫트에서 2 주 간격으로 보조 3S 약물 물질의 3 회의 주입 후에, 약물 물질에 의해 유도되는 면역 응답 (순환성 항-3S16Nter IgG 항체 역가) 의 정점지속기는 2 와 20 ㎍ 의 3S16Nter-펩티드 당량 사이에 포함된 값에서 시작한다.
D. 인간에서 최적 투여량 범위의 확인
우리가 사용한 근거는 마우스에서 항-3S16Nter IgG 항체 역가 정점지속기를 수득하는데 필요한 보조 3S 약물 물질 투여량이 인간에서 항-3S16Nter IgG 항체 역가 정점지속기를 수득하는데 필요한 투여량의 10 분의 1 에 상응할 것이라는 점이다. 이는 인간에서 항-S16Nter IgG 의 정점지속기가 2 (0,2 ㎍ 의 10 배) 와 10 ㎍ (1 ㎍ 의 10 배) 의 3S16Nter-펩티드 당량 사이에서 획득될 것임을 의미한다.
우리는 랫트에서 항-3S16Nter IgG 항체 역가 정점지속기를 수득하는데 필요한 보조 3S 약물 물질 투여량이 인간에서 항-3S16Nter IgG 항체 역가 정점지속기를 수득하는데 필요한 동일한 투여량에 상응할 것이라는 점을 고려했다.
결과적으로, 마우스에서 수행된 투여량-범위 발견에 따르면, 인간에서 면역 응답의 정점지속기는 2 와 10 ㎍ 의 3S16Nter-펩티드 당량 사이에 포함되는 보조 3S 약물 물질의 최소 투여량에서 획득될 것으로 예상될 수 있다.
랫트에서 수행된 투여량-범위 발견에 따르면, 인간에서 면역 응답의 정점지속기는 2 와 20 ㎍ 의 3S16Nter-펩티드 당량 사이에 포함되는 보조 3S 약물 물질의 최소 투여량에서 획득될 것으로 예상될 수 있다.
인간에게 주입되는 보조 3S 약물 물질의 최대 인간 투여량은 0.5 ㎖ 의 1 ㎎/㎖ 의 알루미늄 히드록시드, 150 mM 나트륨 클로리드 및 나트륨 포스페이트 완충액 내에 제형화될 때 백신접종 당 10 ㎍ 의 3S16Nter 펩티드-당량으로 설정되었다.
그러므로 인간에서 사용되는 투여량은 예를 들어, 백신접종 당 10 ㎍ 의 3S16Nter 펩티드-당량이어야 하고, 바람직하게는 백신접종 당 0.1 내지 20 ㎍ 의 3S16Nter 펩티드-당량일 수 있다.
실시예 5 : 백신 조성물의 보호 효과.
실시예 5 의 목적은 3S 펩티드, 즉 3S16Nter 펩티드에 의해 유도되는 활성화된 인간 CD4+ T 세포의 표면에서 NKp44L 의 발현을 저해하는 보조 3S 약물 물질로 백신접종된 랫트의 항혈청의 능력을 시험하는 것이었다.
CD4+ T 세포를 인간 PBMC 로부터 소팅 (sort) 하고, 3 일 동안 PHA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 로 활성화시킨 후, 3 일 동안 재조합 IL-2 (Novartis, Horsham, United Kingdom) 로 증식시켰다. 세포를 그들의 표면에서 NKp44L 의 발현을 유도하기 위해 3S16Nter 펩티드 (Covalab, Villeurbanne, France) 의 존재 하에 두었다.
세포의 표면에서의 NKp44L 의 발현을 세포형광측정법에 의해 측정되는 특이적 형광 염색의 강도를 사용하여 측정했다.
백신접종된 랫트의 항혈청에 의한 NKp44L 발현의 저해를 연구했다.
항혈청을 상이한 희석률에서 3 회 반복 시험했다.
A. 재료 및 방법
세포:
인간 CD4+ T 세포를 EFS ("Etablissement Francais du Sang") 로부터 주문한 류코-혈소판 잔류물 파우치 (leuko-platelet residue pouch) 로부터 자기 분리에 의해 수득했다.
인간 CD4+ T 세포를 하기 프로토콜에 따라 파우치로부터 소팅했다:
1. 파우치를 50 ㎖ 의 팔콘 튜브 (Falcon tube) 4 개에 분배한다: 4 X 15 ㎖.
2. RPMI1640 + 글루타맥스 배지 (ref 72400-054, GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, USA) 로 50 ㎖ 로 완성한다.
3. 희석된 혈액을 8 개의 50 ㎖ 튜브에 15 ㎖ 의 피콜 (Ficoll) (Ref 17-829E, Eurobio, Les Ulis, France)) 상에 분배한다.
4. 2800 rpm 에서 20 분 동안 중단 없이 실온에서 원심분리한다.
5. 백혈구 고리 (ring) 를 수집하고, 그들을 4 개의 50 ㎖ 튜브에 튜브 당 최대 25 ㎖ 를 분배한다.
6. RPMI1640 배지로 튜브를 50 ㎖ 로 완성한다.
7. 2000 rpm, 7 분, 실온에서 원심분리한다.
8. 상청액을 버린다.
9. 펠렛을 모으고, 50 ㎖ 의 RPMI1640 배지 중에서 세정하고, 1500 rpm 에서 5 분 동안 실온에서 원심분리한다.
10. 트리판 블루 중에서 세포의 총수를 계수한다.
11. 400 백만 개의 PBMC 를 소팅한다.
12. 세포를 15 ㎖ 의 소팅 완충액 (Mg 및 Ca 미함유 PBS, 0.5 % BSA, 2 mM EDTA) 중에서 세정한다. 그 순간부터, 자석 구슬의 식균작용을 회피하기 위해 세포를 4 ℃ 에서 또는 얼음 내에서 유지한다.
13. 20 x 106 개의 PBMC 당 10 ㎕ 의 자석 구슬을 첨가한다 = 400 백만 개의 PBMC 의 경우 200 ㎕ 의 자석 구슬 현탁액 (MACS CD4 미세구슬, Miltenyi Biotec, Paris, France).
14. 30 분 동안 4 ℃ 에서 인큐베이션한다.
15. 세포를 1 ㎖ 의 소팅 완충액에 재현탁시킨다.
16. 2 개의 LS 칼럼 (Miltenyi Biotec, Paris, France) 을 quadroMACS 자석 (Miltenyi Biotec, Paris, France) 위에 배치한다.
17. 각각의 2 개의 LS 칼럼을 3 ㎖ 의 소팅 완충액으로 평형시킨다.
18. 세포 현탁액을 칼럼 (각각의 칼럼 중 0.5 ㎖) 을 통해 중력에 의해 수득한다.
19. 각각의 칼럼을 5 ㎖ 의 소팅 완충액으로 2 회 세정한다.
20. 칼럼을 자석으로부터 제거한다.
21. 각각의 칼럼을 5 ㎖ 의 소팅 완충액으로 2 회, 첫번째는 중력에 의해, 두번째는 피스톤을 사용하여, 용리시킨다.
22. 각각의 칼럼으로부터 용리된 세포를 15 ㎖ 의 완전 배지 (RPMI1640 + 글루타맥스, 10 % 보체제거된 SVF Gibco, 비필수 아미노산 100X (ref GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, USA), 항생제/항진균제 (ref 15240-112, GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, USA) 중에서 세정한다.
23. 아세틱 블루 (acetic blue) 중에서 세포의 총수를 계수한다.
인간 CD4+ T 세포를 활성화시키고, 하기 프로토콜에 따라 증식시킨다:
1. 50 백만 개의 CD4+ T 세포를 37 ℃, 5% CO2 의 습한 통풍 인큐베이터 내에 수직으로 배치된 75cm2 (Ref 353136, Falcon, lieu, pays) 플라스크 내의 30 ㎖ 완전 배지 중 배양물에 넣는다.
2. 피토헤마글루티닌 (PHA) 을 1 ㎍/㎖ 의 최종 농도로 첨가한다: 배지 1 ㎖ 당 분취량 (1 ㎎/㎖) 1 ㎕. (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 로부터의 PHA).
3. 3 일의 PHA 활성화 후, IL-2 (알데스류킨 (Aldesleukine), lieu, pays) 를 100 UI/㎖ 로 첨가한다.
PHA 활성화 및 IL-2 증식 동안, 배지를 그것이 약간 노란색으로 변할 때마다 절반씩 교체한다.
시험 항목
랫트 (시궁쥐 (Rattus norvegicus)) Crl/CD(SD) 로부터의 혈청을 시험했다: 이 동물을 2 ㎍ 의 3S16Nter 펩티드 당량/백신접종 의 알루미늄 히드록시드로 보강된 3S 약물 물질로 제 0 일, 제 14 일 및 제 28 일에 백신접종했다. 제 49 일에 그것의 혈청은 항-3S16Nter 항체에 대해 양성이었다.
음성 대조군으로서, 랫트 482 로부터의 면역전 혈청을 시험했다.
대조군
양성 대조군: 제 49 일에 채취한 Charles River Laboratories, Lyon, France 로부터의 뉴질랜드 토끼 (집토끼 (Oryctolagus cuniculus)) 로부터의 항혈청을 양성 대조군으로서 1/50 희석률로 사용했다. 이 토끼를 제 0 일, 제 14 일 및 제 28 일에 알루미늄 히드록시드로 보강된 CRM197-(3S16Nter) 면역-접합체로 백신접종했고, 제 49 일에 그것의 혈청은 항-3S16Nter IgG 에 대해 양성이었다.
음성 대조군: 무관련 백신으로 백신접종된 토끼로부터의 항혈청을 음성 대조군으로서 1/50 희석률로 사용했다.
표 2: 실험 대조군의 웰의 식별 번호
대조군을 3S16Nter 펩티드의 부재 또는 존재 하에 2 회 반복 시험했다. 웰 및 튜브의 식별 번호가 하기 표 2 에 제시되어 있다.
Figure pct00004
시험관내에서 3S16Nter 펩티드에 대한 노출에 응답하여 NKp44L 의 발현을 허용하는 CD4+ T 세포의 활성화 상태가 알려져 있지 않으므로, 모든 대조군의 타당성을 확인해야 했다.
실험의 타당성을 확인하기 위해, NKp44L 은 웰 6, 7, 10 및 11 의 세포의 표면에서 발현되어야 하고, 웰 4, 5, 8, 9, 12, 13, 14 및 15 의 세포의 표면에서는 발현되지 않아야 한다.
프로토콜
1. 시험하는 혈청을 3 회 반복 시험했다.
2. 20 ㎕ 의 1/40 희석률의 3S16Nter 펩티드 용액 (2 ㎎/㎖) : 25 ㎕ 의 IVV-B122 + 975 ㎕ 의 완전 RPMI1640 배지. 따라서 3S16Nter 펩티드는 최종 농도가 5 ㎍/㎖ 였다.
3. 플라스크로부터의 180 ㎕ 의 CD4+ T 세포의 세포 현탁액.
1/50 희석률의 혈청의 경우, 웰 당 혈청 4 ㎕ 를 첨가한다.
1/100 희석률의 혈청의 경우, 1/4 희석률의 혈청 8 ㎕ 를 첨가한다.
1/400 희석률의 혈청의 경우, 1/16 희석률의 혈청 8 ㎕ 를 첨가한다.
1/1600 희석률의 혈청의 경우, 1/64 희석률의 혈청 8 ㎕ 를 첨가한다.
표 3 : 랫트 혈청의 웰의 식별 번호
랫트 혈청을 3S16Nter 펩티드의 존재 하에 3 회 반복 시험했다. 웰 및 튜브의 식별 번호가 하기 표 3 에 제시되어 있다.
Figure pct00005
3 개의 웰을 세포형광측정 분석을 위한 대조군으로서 사용한다.
표 4 : 세포형광측정법 대조군 웰의 식별 번호
웰 1 에서, 세포가 염색되지 않았다; 웰 2 에서, 배경을 평가하기 위해 세포를 항-IgM-PE 항체 단독의 존재하에 두었다; 웰 3 에서, 세포를 항-CD4-APC 단독으로 염색했다.
Figure pct00006
4. 마이크로플레이트를 4 시간 동안 세포 인큐베이터 (37 ℃, 습한 공기, 5 % CO2) 에서 인큐베이션한다.
5. 마이크로플레이트를 5 분 동안 400g 에서 원심분리한다.
6. 상청액을 제거한다.
7. 10 ㎕/웰 의 쥐 항-NKp44L IgM 7.1 + 30 ㎕/웰 의 PBS, 0.5 % BSA (500 ㎕ 의 항체 용액 + 1500 ㎕ 의 PBS, BSA 0.5 %) 를 첨가한다.
8. 1 시간 동안 4 ℃ 에서 인큐베이션한다.
9. 150 ㎕/웰 의 PBS, BSA 0.5 % 를 첨가한다.
10. 마이크로플레이트를 5 분 동안 400g 에서 원심분리한다.
11. 상청액을 제거한다.
12. 50 ㎕/웰 의 2차 항체 항- 마우스 IgM-PE 의 PBS, 0.5 % BSA 중 1/25 희석물을 첨가한다.
13. 30 분 동안 4 ℃ 에서 인큐베이션한다.
14. 150 ㎕/웰 의 PBS, BSA 0.5 % 를 첨가한다.
15. 마이크로플레이트를 5 분 동안 400g 에서 원심분리한다.
16. 50 ㎕ 의 항-인간 CD4-APC 항체의 PBS, 0.5 % BSA 중 1/25 희석물을 첨가한다.
17. 세포 현탁액을 FACS 튜브 내에 옮긴다.
18. 15 분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
19. 2 ㎖/튜브 의 PBS 1X 를 첨가한다.
20. 5 분 동안 400g 에서 원심분리한다.
21. 300 ㎕ 의 PBS 1X 를 첨가한다.
22. 세포형광측정기에서 튜브를 획득한다.
기구 SN: AN52257 소프트웨어 버전: Gallios
굵은 활자체의 번호는 웰 식별 번호에 해당한다.
분석일에 소프트웨어 Gallios 로 데이타를 분석하고 프린트한다.
결과는 세포의 PE 마커의 X-평균 형광을 보고한다.
- APC 강도/앞쪽 강도 점 도표에서 CD4+ T 세포에 대해 게이팅됨.
- SSC 강도/앞쪽 강도 점 도표에서 림프구에 대해 게이팅됨.
이러한 X-평균 값은 CD4+ T 세포의 표면에서 NKp44L 마커의 밀도를 나타낸다.
B. 결과
표 5
Figure pct00007
도 4 는 대조군 웰의 PE-평균 형광을 나타낸다.
수득된 결과는 하기를 보여준다:
- 혈청이 부재하고, 3S16Nter 펩티드가 부재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포는 NKp44L 을 발현하지 않았다.
- 혈청이 부재하고, 3S16Nter 펩티드가 존재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포는 NKp44L 을 평균 수준 62 로 발현했다.
- 1/50 희석률의 토끼 항-3S16Nter 항체 음성 혈청이 존재하고, 3S16Nter 펩티드가 부재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포는 NKp44L 을 발현하지 않았다.
- 1/50 희석률의 토끼 항-3S16Nter 항체 음성 혈청이 존재하고, 3S16Nter 펩티드가 존재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포는 NKp44L 을 평균 수준 63 으로 발현했다.
- 1/50 희석률의 토끼 항-3S16Nter 항체 양성 혈청이 존재하고, 3S16Nter 펩티드가 존재 또는 부재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포는 NKp44L 을 발현하지 않았다.
이들 결과는 이 실험에서 사용된 시험관내에서 활성화된 CD4+ T 세포가
- 그들의 표면에서 NKp44L 을 자발적으로 발현하지 않았고,
- 3S16Nter 펩티드에 대한 노출에 응답하여 그들의 표면에서 NKp44L 을 발현하는 능력이 없었고,
- 이러한 발현은 무관련 항혈청에 의해 유도되거나 저해되지 않았고,
- NKp44L 의 표면은 항-3S16Nter IgG 양성 혈청에 의해 완전히 저해되었음을 보여줬다.
나아가, 도 5 는 시험 항목 웰의 X-평균 형광의 결과를 나타낸다.
수득된 결과는 하기를 보여준다:
> 1/50 희석률의 랫트 항-3S16Nter 항체 음성 혈청이 존재하고, 3S16Nter 펩티드가 존재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포는 NKp44L 을 형광의 평균 수준 53 으로 발현했다.
> 1/50 희석률의 랫트 항-3S16Nter 항체 양성 혈청이 존재하고, 3S16Nter 펩티드가 존재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포 상에서의 NKp44L 의 표면 발현은 완전히 저해되었다.
> 1/100 희석률의 랫트 항-3S16Nter 항체 양성 혈청이 존재하고, 3S16Nter 펩티드가 존재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포는 NKp44L 을 형광의 평균 수준 14 로 발현했다.
> 1/400 및 1/1600 희석률의 랫트 항-3S16Nter 항체 양성 혈청이 존재하고, 3S16Nter 펩티드가 존재하는 웰에서, 활성화된 CD4+ T 세포 상에서의 NKp44L 의 표면 발현은 저해되지 않았다.
실시예 5 를 요약하면, 수득된 결과는, 활성화된 CD4+ T 림프구의 시험관내 인간 세포 모델에서, 알히드로겔로 보강된 3S 약물 물질로 백신접종된 랫트의 항혈청은 둘 모두 CD4+ T 림프구의 표면에서 NKp44L 의 발현을 용량-의존적 방식으로 고도로 저해했음을 보여준다. 이것은 CD4+ T 림프구 상에서의 NKp44L 발현에 대한 3S 펩티드의 효과를 기능적으로 차단할 수 있는 항체를 유도하는 이들 백신 제제의 능력을 반영한다.
실시예 6: 주사용 조성물의 제조 및 인간 사용을 위한 투여 방법
백신의 제조:
VAC-3S 은 완충 등장성 식염수 중 알루미늄 히드록시드 상에 흡착된 3S 약물 물질을 함유하는 근육내 주입을 위한 멸균 현탁액이다. VAC-3S 의 제조를 GMP 에 따라 수행했다.
VAC-3S 를 수득하기 위해, 3S 약물 물질을 Brenntag (알히드로겔 85 2%-Ph Eur) 에 의해 제공되는 0.5 ㎖ 의 알루미늄 히드록시드 (1 ㎎/㎖ 의 Al3+ 이온), 150 mM 나트륨 클로리드 (유럽 약전) 및 1 mM 나트륨 포스페이트 (유럽 약전) 중 0.02 ㎎/㎖ 의 3S16Nter 펩티드 당량의 농도로 제형화한다. 주입용 제품을 백신의 제형화에 사용한다. 최종 pH 는 6.8 이다. VAC-3S 는 보존제를 함유하지 않는다.
주입:
진탕 후에, 백신은 사용할 준비가 된 (ready to use) 균일한 백색 현탁액이다. 상기 백신은 삼각근에 근육내 주사될 수 있다. 멸균 바늘이 있는 멸균 주사기를 주사에 사용한다. 환자는 각각 0.5 ㎖ 의 3 개의 투여물을 백신접종 사이에 4 주 간격으로 수령할 것이다.
실시예 7 : 면역원성 화합물의 제조.
A. 면역원성 화합물의 제조
하기 면역원성 화합물 또는 접합체를 합성했다. 그들을 CRM197 로부터 가교제 분자로서 SMPB (실시예 1 에 나타나 있음) 를 사용하여 유도했다. 사용된 펩티드는 그것의 아미노-말단에서 부가적 시스테인 잔기를 가져서, 가교제의 화학적 커플링을 허용하여 CRM197-SMPB-Nter(Cys)-m3S 를 초래하는, SEQ ID N°6 (NH2-PWNASASNKSLDDIW-COOH) 로 이루어지는 돌연변이된 3S (m3S) 펩티드였다.
명확성을 위해, 위에서 "Nter(Cys)-m3S" 로 명명되는 펩티드는 여기에서 SEQ ID N°7 의 3S 펩티드로 이루어진다.
이종이관능성 교차-링커 술포-SMPB (술포-(숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트) 를 사용했다. 이들 분자는 폴리에틸렌 사슬에 의해 N-히드록시숙신이미드의 에스테르에 연결되어 있는 말레이미드 모이어티로 이루어진다 (Cross-linking of protein by w-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters. Partis M.D and al. Journal of Protein Chemistry, vol.2, No 3, 1983). 숙신이미드 모이어티는 단백질의 아미노 기와 반응할 수 있다. 이 반응이 일어나면, 말레이미드 모이어티는 3S 펩티드의 술프히드릴 기와 반응한다. 그들은 길이가 상이하며, 술포-MBS 의 경우 7,3 Å이고, 술포-SMPB 의 경우 11.6 Å이다. 링커 제거 및 완충액 교환을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 에 의해 실시했다.
커플링 반응은 2-단계 반응이었다. 첫번째 단계는 교차-링커에 의한 CRM197 의 활성화였다. 디메틸 술폭시드 중에 희석시킨, 15 밀리그램의 링커를 5-20 ㎖ 부피의 접합 완충액 (PBS 10 mM pH7-pH7.4) 중 20 밀리그램의 CRM197 에 첨가하고, 30-90 분 동안 실온에서 부드럽게 혼합했다 (Protective immunogenicity of two synthetic peptides selected from the amino acid sequence of Bordetella pertussis toxin subunit S1. Askeloef P. and al. PNAS, vol.87, pp 1347-1351, February 1990). 이 반응에 뒤이어 활성화된 CRM197 을 SEC (PD10 칼럼 (GE Healthcare, Chalfont St. Giles United Kingdom) 또는 Bio-Gel P2 칼럼 (Biorad Marnes-la-Coquette, France)) 에 의해 정제했다. 두번째로, 활성화된 CRM197 및 3S-유래된 펩티드를 실온에서 30 분 - 2 시간 동안 혼합하여, 활성화된 CRM197 에 대한 펩티드의 공유 커플링을 허용했다. 활성화된 CRM197 의 미반응 말레이미도 기를 차단하기 위해, 접합 반응 후에 시스테인-HCl (SIGMA, Missouri, USA) 을 과잉량으로 용액에 첨가했다 (A practical approach to crosslinking. Mattson G. and al. Molecular Biology Reports 17: 167-183, 1993). 이 단계는 다량체의 생성을 제한했다. 그 후 면역-접합체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제했다. 면역-접합체를 아미노산 분석법 (AAA) 을 사용하여 분석하여 펩티드/CRM197 비율을 확인했다.
B. 이들 면역원성 화합물의 특성
N-말단에서 Cys 잔기를 포함하는 SEQ ID N°7 의 m3S 펩티드, CRM197 담체 및 링커로서의 SMPB 에 상응하는 수득된 면역-접합체는 물에 또는 0.9% NaCl 용액에 자발적으로 가용성인 것으로 발견되었다. 그러한 면역-접합체의 면역원성이 하기 실시에 10 에서 추가로 연구되었다.
실시예 8 : 실시예 9 의 면역원성 화합물의 면역원성
A. 재료 및 방법
A.1. 실시예 9 에 개시된 바와 같이 제조된 실시예 10 에서 시험된 면역-접합체 화합물.
그것을 실시예 3 에 기재된 바와 같이 제형화했다. 그 목적을 위해 알히드로겔® 2% (알루미늄 히드록시드 겔) 을 보강제로서 사용했고, Brenntag (Frederikssund, Denmark) 로부터 구입했다. 알히드로겔® 을 1 ㎎/㎖ 의 Al3+ 이온의 최종 농도로 사용했으며, 상기 최종 농도는 주입 당 50 ㎍ 의 Al3+ 이온의 투여에 적응되어 있다.
A.2. 동물
동물은 Charles River Laboratories (Lyon, France) 에 의해 공급된 BALB/cByJ 암컷이었으며, 실험 제 0 일에 8 주령이었다.
A.3. 투여 방법
실시예 5 에 기재된 백신 제제를 마우스에게 근육내 경로에 의해 항원성 펩티드 당량의 양으로서 표현되는 2 ㎍ 의 투여량으로 주입했다.
마우스에게 50 ㎕ 의 시험되는 각각의 조성물을 각각 제 0 일, 제 14 일, 제 28 일 및 제 169 일 및 제 212 일에 근육내 주입했다.
A.5. ELISA 검정
ELISA 검정을, 또한 항-m3S 펩티드 항체로도 호칭되는, SEQ ID N°6 의 펩티드를 인지할 IgG 항체의 측정을 수행하도록 디자인했다.
항-m3S IgG 항체 역가를 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 에 의해 확인했다.
제 169 일, 제 204 일 및 제 260 일 혈청의 8 개의 희석물을 시험했다 (1/3000, 1/6000, 1/12000, 1/24000, 1/48000, 1/96000, 1/192000, 및 1/384000). Nunc Maxisorp 마이크로 플레이트에 코팅된 항원은 면역-접합체의 합성에 사용된 것과 상이한 하기 링커로 소 혈청 알부민 (BSA) 에 접합된 m3S 펩티드였다: SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 로부터 구입한 Imject® 말레이미드 활성화된 BSA 단백질 키트로부터 생성됨). 항-m3S IgG 항체는 호올스래디시 퍼옥시다제 (HRP) (Jackson Immunoresearch, West Grove, USA) 에 접합된 염소 항-마우스 IgG (Fc), 및 HRP 기질: 테트라메틸벤지딘 (TMB) (Sigma, Missouri, USA) 을 사용하는 비색 반응에 의해 밝혔다.
B. 결과
항-3S 항체의 IgG 역가를 재료 및 방법 섹션에 기재된 ELISA 검정에 의해 측정했다.
결과가 도 6 에 나타나 있다.
도 6 의 결과는 담체 단백질로서 CRM197 을 포함하는 면역접합체 화합물이 제 0 일, 제 14 일 및 제 28 일에 3 회의 백신접종 후 제 169 일에 높은 항-m3S 항체 생산을 유도하는 것을 보여준다.
도 6 의 결과는 담체 단백질로서 CRM197 을 포함하는 면역접합체 화합물이 제 0 일, 제 14 일 및 제 28 일 및 제 169 일에 4 회의 백신접종 후 제 260 일에 높은 항-m3S 항체 생산을 유도하는 것을 보여준다.
표 7
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> INNAVIRVAX <120> Vaccine composition <130> PR98282 <150> EP12305602.0 <151> 2012-05-31 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X means Alanine, Threonine, Serine or Asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X means Tryptophane or Alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X means Lysine or Arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X means Serine or Threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X means Leucine, Tyrosine or Glutamine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X means Aspartic acid, Asparagine, Glutamic acid, Serine, Glycine, or Lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X means Aspartic acid, Glutamine, Leucine, Alanine, Lysine and Glutamic acid <400> 1 Pro Trp Asn Xaa Ser Xaa Ser Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Trp 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 2 Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Asp Asp Ile Trp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X means Threonine or Proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X means Alanine, Threonine or Asparagine <400> 3 Cys Xaa Thr Xaa Val 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X means Aspartic acid, Glutamine, Glutamic acid or Asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X means Asparagine, Histidine, Serine or Lysine <400> 4 Xaa Xaa Met Thr Trp 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 5 Cys Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Asp Asp Ile Trp 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 6 Pro Trp Asn Ala Ser Ala Ser Asn Lys Ser Leu Asp Asp Ile Trp 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 7 Cys Pro Trp Asn Ala Ser Ala Ser Asn Lys Ser Leu Asp Asp Ile Trp 1 5 10 15 <210> 8 <211> 535 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 8 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400 Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His 405 410 415 Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val 420 425 430 Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445 His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile 450 455 460 Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480 Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu 500 505 510 Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 530 535

Claims (16)

  1. 하기 화학식 (I) 의 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물:
    NH2- [Nt]y-P-W-N-X1-S- X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH (I),
    식 중 :
    - y 는 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
    - z 는 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
    - Nt 는 1 내지 100 아미노산 길이를 갖는 펩티드로 이루어지고,
    - Ct 는 1 내지 100 아미노산 길이를 갖는 펩티드로 이루어지고,
    - X1 은 A (알라닌), T (트레오닌), S (세린) 및 N (아스파라긴) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    - X2 는 W (트립토판) 및 A (알라닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    - X3 은 K (리신) 및 R (아르기닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    - X4 은 S (세린) 및 T (트레오닌) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    - X5 은 L (류신), Y (티로신) 및 Q (글루타민) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    - X6 은 D (아스파르트산), N (아스파라긴), E (글루탐산), S (세린), G (글리신) 및 K (리신) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    - X7 은 D (아스파르트산), Q (글루타민), L (류신), A (알라닌), K (리신) 및 E (글루탐산) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    화학식 (I) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 화학식 (VIa) 및 (VIb) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함하는 면역원성 화합물:
    NH2-(A1)m-SEQ IDN°2-(A2)n-COOH (VIa),
    NH2-(A1)m-SEQ IDN°6-(A2)n-COOH (VIb),
    식 중 :
    - m 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
    - n 은 0 또는 1 을 의미하는 정수이고,
    - A1 은 아미노산 잔기이고,
    - A2 는 아미노산 잔기이고,
    화학식 (VIa) 또는 (VIb) 의 펩티드는 CRM197 단백질로 이루어지는 담체 단백질에 공유적으로 연결되어 있음.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SEQ ID N°5 및 SEQ ID N°7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 면역원성 화합물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 그것의 N-말단 아미노산 잔기에 의해 CRM197 단백질에 공유적으로 결합되어 있는 면역원성 화합물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 모이어티를 통해 CRM197 단백질에 공유적으로 결합되어 있는 면역원성 화합물.
  6. 제 5 항에 있어서, 링커 모이어티가 2 개의 반응성 기를 갖는 링커제와 CRM197 및 화학식 (I) 의 펩티드 둘 모두와의 반응 산물인 면역원성 화합물.
  7. 제 6 항에 있어서, 링커 모이어티가 숙신이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트 (SMPB) 또는 술포-SMPB 로 이루어지는 면역원성 화합물.
  8. 하나 이상의 면역보강제 물질과 조합하여 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 화합물을 포함하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 면역원성 화합물을 투여 단위 당 0.01 ㎍ 내지 200 ㎍ (항원성 펩티드 당량으로서 표현됨), 바람직하게는 투여 단위 당 0.05 ㎍ 내지 50 ㎍, 가장 바람직하게는 투여 단위 당 0,1 ㎍ 내지 20 ㎍ 의 양으로 포함하는 사용할 준비가 된 (ready-to-use) 백신 조성물을 형성하도록 적응된 조성물.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 면역보강제 물질이 알루미늄 히드록시드 (Al(OH)3) 로 이루어지는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 알루미늄 히드록시드를 0.1 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.05 ㎎/㎖ 내지 2 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 약 1 ㎎/㎖ (Al3+ 이온 함량으로서 표현됨) 의 최종 농도로 포함하는 사용할 준비가 된 백신 조성물을 형성하도록 적응된 조성물.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 나트륨 포스페이트를 0.1 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 0.5 mM 내지 15 mM, 가장 바람직하게는 약 1 mM 의 최종 농도로 포함하는 사용할 준비가 된 백신 조성물을 형성하도록 적응된 조성물.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 형태 또는, 동결건조된 형태를 포함하는, 고체 형태인 조성물.
  14. 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 화합물, 또는 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 백신 조성물.
  15. 약제로서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제 14 항에 따른 백신 조성물.
  16. HIV 바이러스에 의한 개체의 감염에 의해 야기되는 상태를 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 화합물, 또는 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제 14 항에 따른 백신 조성물.
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