BR112014023742B1 - Método para selecionar uma planta de progênie de cana-deaçúcar com comprimento de caule aumentado - Google Patents
Método para selecionar uma planta de progênie de cana-deaçúcar com comprimento de caule aumentado Download PDFInfo
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Abstract
MARCADOR RELACIONADO AO COMPRIMENTO DO CAULE DERIVADO DO GENOMA DE CANA-DE- AÇÚCAR DO TIPO SELVAGEM E USO DO MESMO. A presente invenção refere-se a um marcador associado com o comprimento do caule entre traços quantitativos de plantas Poaceae. Esse marcador associado com o comprimento do caule de plantas Poaceae compreende uma região de ácido nucleico contígua selecionada de uma região intercalada entre a sequência base mostrada no número de sequência 1 e a sequência base mostrada no número de sequência 2 no cromossoma de uma planta Poaceae.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um marcador relacionado ao comprimento do caule que pode ser usado para selecionar uma planta Gramineae com os traços relacionados às características do comprimento do caule de uma espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem, e ao uso do mesmo.
[002] A cana-de-açúcar tem sido cultivada como uma matéria prima para o açúcar, a solução alcoólica, e outros ainda para o uso comestível. Além disso, a cana-de-açúcar tem sido usada como, por exemplo, uma matéria prima para o biocombustível em uma variedade de campos industriais. Sob tais circunstâncias, há uma necessidade de desenvolver novas variedades da cana-de-açúcar que tenham características desejáveis (por exemplo, teor de açúcar, capacidade vegetativa realçada, capacidade de brotar, resistência a doenças, resistência a insetos, resistência ao frio, um aumento no comprimento da lâmina da folha, um aumento na área da folha, e um comprimento de caule aumentado). Além disso, as plantas Gramineae, incluindo a cana- de-açúcar, são usadas de modo geral para materiais de partida para bebidas alcoólicas e biocombustíveis.
[003] A hibridização de plantas Gramineae, incluindo a cana-de- açúcar, o arroz e o milho, vem sendo realizada ativamente em uma tentativa de melhorar as variedades existentes; isto é, a produção de novas variedades com traços de interesse. De modo geral, os três métodos a seguir podem ser usados para a identificação de uma variedade/linhagem de planta: a "comparação das características" para a comparação de dados das características, a "comparação durante o cultivo" para a comparação das plantas cultivadas sob as mesmas condições, e o "ensaio de DNA" para a análise do DNA. Há muitos problemas na identificação das linhagens com a comparação das características ou a comparação durante o cultivo, incluindo a baixa precisão devido às diferenças nas condições de cultivo e na pesquisa de campo de longo prazo que requer um número de etapas.
[004] Em particular, as plantas de cana-de-açúcar são muito maiores do que outras culturas e, por conseguinte, é difícil realizar a identificação das linhagens através da pesquisa de campo. Além disso, a produção de uma nova variedade de cana-de-açúcar requer a produção de dezenas de milhares de híbridos através de cruzamento, seguido pela seleção das mudas e pela seleção por etapas de linhagens excelentes. Eventualmente, 2 ou 3 tipos de novas variedades que têm características desejadas podem ser obtidos. A fim de produzir uma nova variedade de cana-de-açúcar, tal como descrito acima, é necessário cultivar e avaliar um número enorme de linhagens, para preparar uma estufa ou um campo, e despender esforços que consomem muito tempo.
[005] Portanto, tornou-se necessário o desenvolvimento de um método para identificar uma planta Gramineae, e em particular uma linhagem da cana-de-açúcar, com características desejáveis com o uso dos marcadores presentes no genoma. Em particular, com a produção de uma nova variedade de cana-de-açúcar, se marcadores excelentes pudessem ser usados para examinar uma variedade de características, os problemas acima particulares da cana-de-açúcar seriam resolvidos, e os marcadores poderiam servir como ferramentas muito eficazes. Uma vez que as plantas de cana-de-açúcar têm um grande número de cromossomas (cerca de 100 a 130) devido a uma poliploidia elevada, no entanto, o desenvolvimento da tecnologia de marcadores tem sido lento. Embora o USDA tenha relatado a genotipificação a respeito de plantas de cana-de-açúcar com o uso de marcadores de SSR (Documento que não de Patente 1), a precisão da genotipificação é baixa por causa dos pequenos números de marcadores e polimorfismos em cada marcador. Além disso, a genotipificação acima é disponível somente para variedades americanas/australianas e, portanto, ela não pode ser usada para a identificação das principais variedades cultivadas no Japão, em Formosa, na Índia ou em outros países, ou das linhagens que servem como recursos genéticos úteis.
[006] Além disso, o Documento que não de Patente sugere a possibilidade que um mapa genético da cana-de-açúcar pode ser produzido mediante o aumento do número de marcadores, a comparação de marcadores individuais em termos de uma relação característica, e a verificação dos resultados. O Documento que não de Patente 2, no entanto, não apresenta um número suficiente de marcadores, e os marcadores ligados às características desejadas não foram encontrados.
[007] Um exemplo do desenvolvimento de marcador é aquele de um marcador relacionado resistente a Aphanomyces cochlioides na beterraba apresentado no Documento de Patente 1. Além disso, o Documento de Patente 2 apresenta uma técnica para selecionar uma variedade de milho com a utilização de um marcador ligado a um traço de interesse.
[008] Há espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem (nome científico: Saccharum spontaneum L.). Os exemplos de espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem incluem Glagah encontrada na Indonésia, Saccharum spontaneum encontrada no Japão, e Kash (grama Kans) encontrada nas regiões que falam o idioma Bengali. Glagah, Saccharum spontaneum e Kash são nomes gerais das espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem em áreas relevantes. A fim de designar uma variedade ou linhagem específica, de acordo com a necessidade, os nomes sistêmicos individuais que incluem informações tais como os nomes das áreas em que as amostras foram obtidas ou os números que indicam as nações relevantes são usados ocasionalmente. De modo geral, uma espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem é caracterizada pelo crescimento exuberante e pela elevada tolerância ambiental, tem um caule que é fino mas robusto, é rica em fibras, e tem uma excelente tolerância contra doenças e pragas, tais como a doença anã e o vírus de estrias amarelas. Embora o teor de açúcar seja em geral baixo, e é de 1% a 3% ou mais baixo no caso de Glagah, o teor de açúcar de algumas espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem colhidas no Japão excede 10%. Isto é, o grau de variação é grande.
[009] Por meio do cruzamento entre espécies ou do cruzamento entre gêneros com espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem, propriedades excelentes de espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem em termos da extensão do caule ou da ramificação múltiplas são introduzidas em variedades produtoras de açúcar ou em variedades da planta Gramineae que não a cana-de-açúcar. Foi verificado que muitos híbridos entre espécies são excelentes na extensão a baixa temperatura e no comprimento de caule final através de experimentos, e é deduzido que o genoma de uma espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem tem um gene distinto que causas um aumento no comprimento do caule. Tais propriedades não são observadas em variedades produtoras de açúcar. No entanto, nenhum marcador relacionado a várias propriedades de espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem é conhecido. Atualmente, por conseguinte, é necessário executar procedimentos laboriosos e demorados tal como descrito acima, a fim de selecionar híbridos entre espécies ou entre gêneros com tais propriedades.
[0010] Documentos da Técnica Anterior
[0011] Documentos de Patente
[0012] Documento de Patente 1: WO 2007/125958
[0013] Documento de patente 2: JP 2010-516236 A
[0014] Documentos que não de Patente
[0015] Documento que não de Patente 1: Maydica 48, 2003, 319 329, "Molecular genotyping of sugar clones with microsatellite DNA markers"
[0016] Documento que não de Patente 2: Nathalie Piperidis et al., Molecular Breeding, 2008, Vol. 21, 233-247
[0017] A presente invenção provê um marcador relacionado ao comprimento do caule derivado do genoma de uma espécie de cana- de-açúcar do tipo selvagem ligado a traços que estão relacionados ao comprimento do caule da espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem, e o uso do mesmo.
[0018] Os autores da presente invenção realizaram estudos concentrados a fim de atingir o objetivo acima. Eles prepararam muitos marcadores de plantas de cana-de-açúcar, incluindo aquelas de espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem, e a análise de ligação entre traços quantitativos e marcadores em linhagens de progênies híbridas. Em consequência disto, eles descobriram os marcadores derivados de espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem e relacionados aos traços quantitativos que estão relacionados ao comprimento do caule. Isto conduziu à conclusão da presente invenção.
[0019] Um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae, que compreende uma região de ácido nucleico contínua que existe em uma região imprensada entre a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2 de um cromossoma de uma planta Gramineae.
[0020] O marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae de acordo com (1), em que a região do ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 2 ou uma parte da mesma.
[0021] O marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae de acordo com (1), em que uma das plantas paternas da planta Gramineae é uma planta de uma espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem.
[0022] Um método para a produção de uma planta Gramineae que tem um aumento no comprimento do caule, o qual compreende: uma etapa de extração de um cromossoma da planta Gramineae e/ou de um pai da mesma; e uma etapa de determinação da presença ou ausência do marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae de acordo com qualquer um de (1) a (3) no cromossoma obtido na etapa precedente.
[0023] Um método para a produção de uma planta Gramineae de acordo com (4), em que a planta Gramineae está na forma de uma semente ou muda nova e o cromossoma é extraído da mesma.
[0024] Um método para a produção de uma planta Gramineae de acordo com (4), o qual também compreende uma etapa de produção da planta Gramineae ao sujeitar uma espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem ao cruzamento como um dos pais.
[0025] Esta descrição inclui uma parte ou todo o conteúdo tal como divulgado na descrição e/ou nos desenhos do Pedido de Patente Japonês no. 2012-069850, que é um documento de prioridade do presente pedido de patente.
[0026] De acordo com a presente invenção, um novo marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae que é ligado ao comprimento do caule que é um dos traços quantitativos de uma planta Gramineae tal como a cana-de-açúcar pode ser provido. Com o uso do marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção, o comprimento do caule de uma linhagem obtida pelo cruzamento de plantas Gramineae, tais como plantas de linhagens da cana-de-açúcar, pode ser testado. Desse modo, uma planta Gramineae caracterizada pelo comprimento aumentado do caule pode ser identificada de uma maneira muito econômica.
[0027] A Figura 1 é um diagrama característico que mostra dados do comprimento do caule para os grupos de variedades/linhagens de cana-de-açúcar usados nos exemplos.
[0028] A Figura 2 é um diagrama característico que mostra os resultados da análise de QTL a respeito do comprimento do caule (o 10° grupo de ligação de S3-19).
[0029] A Figura 3 é um diagrama característico que mostra níveis de sinal de S310951 para linhagens individuais.
[0030] A Figura 4 é um diagrama característico que mostra níveis de sinal de S311375 para linhagens individuais. MODALIDADES PARA PRATICAR A INVENÇÃO
[0031] Daqui por diante, o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae e o método para o uso do mesmo de acordo com a presente invenção são descritos. Em particular, um método para a produção de uma planta Gramineae ao usar o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae é descrito. <Marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae>
[0032] O marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção corresponde a uma região específica presente em um cromossoma de uma planta Gramineae, tal como a cana-de-açúcar, e é ligado aos genes causativos (isto é, um grupo de genes) para os traços que causam o comprimento aumentado do caule de uma planta Gramineae, de modo que os traços relacionados ao comprimento do caule de uma planta Gramineae podem ser identificados. Especificamente, uma linhagem de progênie obtida com o uso de uma planta Gramineae, tal como uma variedade/linhagem de cana-de-açúcar conhecida, pode ser determinada como dotada de traços que são característicos do comprimento aumentado do caule ao confirmar a presença ou a ausência do marcador relacionado ao comprimento do caule da planta Gramineae em tal linhagem de progênie.
[0033] O marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção é ligado a traços que estão relacionados ao comprimento aumentado do caule. Se uma planta Gramineae particular compreender o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção, por exemplo, pode ser determinado que tal planta tem traços relacionados ao comprimento do caule aumentado. O termo "comprimento do caule aumentado" aqui usado refere-se ao comprimento aumentado do caule no estágio inicial do crescimento, em particular. Em outras palavras, tal planta tem uma taxa rápida de extensão do caule no estágio inicial de crescimento. O comprimento do caule da cana-de-açúcar é uma altura da base da planta à base da primeira folha (folha de papada visível superior: +1) do caule mais alto. No Japão, o comprimento inicial do caule é o comprimento do caule durante os primeiros 5 meses após a germinação, em geral (e tal duração pode variar de acordo com a área de cultivo, as condições de cultivo, e outros fatores).
[0034] O termo "planta Gramineae" aqui usado refere-se a uma planta que pertence às Gramineae, sem limitação particular. Isto é, o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção pode ser usado para todas as plantas classificadas como plantas Gramineae. Plantas. As plantas Gramineae também são classificadas como Bambusoideae, Pooideae, Ollyra ou Panicoideae.
[0035] Entre as plantas Gramineae para as quais o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção pode ser usado, em particular, Bambusoideae inclui plantas dos gêneros Arundinaria, Bambusa, Chimonobambusa, Chusquea, Dendrocalamus, Melocanna, Oxytenanthera, Phyllostachys, Pleioblastus, Pseudosasa, Sasa, Sasamorpha, Semiarundinaria, Shibataea, Sinobambusa e Tetragonocalamus.
[0036] Entre as plantas Gramineae para as quais o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção pode ser usado, Pooideae inclui plantas dos gêneros Beckmannia, Brachypodium, Briza, Bromus, Dactylis, Festuca, Glyceria, Lamarckia, Lolium, Melica, Poa, Puccinellia, Sesleria, Triodia, Agropyron, Elymus, Horudeum, secale, Triticum, Agrostis, Arrhenatherum, Avena, Deschampsia, Helictotrichon, Holcus, Koeleria, Lagurus, Arundo, Cortaderia, Hakonechloa, molinia, Phragmites, Arundinella, Loudetia, Tristachya, Phalaris, Spartina, milium e Stipa.
[0037] Entre as plantas Gramineae para as quais o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção pode ser usado, Micraira inclui plantas do gênero Micraira.
[0038] Entre as plantas Gramineae para as quais o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção pode ser usado, Eragrostis inclui plantas dos gêneros Diplachne, Eleusine, Eragrostis, Muhlenbergia, Sporobolus, Tripogon, Chloris, Cynodon, Aristida e Zoysia.
[0039] Entre as plantas Gramineae para as quais o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção pode ser usado, a subfamília Gramineae inclui plantas dos gêneros Leersia, Oryza e Zizania.
[0040] Entre as plantas Gramineae para as quais o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção pode ser usado, a subfamília Ollyra inclui plantas dos gêneros Ollyra, Cryptochloa e Leptaspis.
[0041] Entre as plantas Gramineae para as quais o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção pode ser usado, a subfamília Panicoideae inclui plantas dos gêneros Brachiaria, Digitaria, Echinochloa, Panicum, Paspalum, Pennisetum, Setaria, Isachne, Andropogon, Schizoachyrium, Arthraxon, Bothriochloa, Cymbopogon, Dimeria, Eccoilopus, Erianthus, Eremochloa, Eulalia, Hemarthria, Imperata, Ischaemum, Microstegium, Miscanthus, Phacelurus, Pogonatherum, Saccharum, Sorghum, Themeda, Coix e Zea.
[0042] O marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção é aplicável a todas as plantas Gramineae classificadas como membros das subfamílias descritas acima. Especificamente, é possível determinar que as linhagens de progênies de tais plantas Gramineae têm traços caracterizados pelo comprimento aumentado do caule ao confirmar a presença ou a ausência do marcador relacionado ao comprimento do caule da planta Gramineae da presente invenção nas mesmas.
[0043] Como uma planta Gramineae à qual o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção deve ser aplicado, uma planta Schizachyrium à qual pertence Saccharum e uma linhagem de progênie da mesma são particularmente preferíveis. Com o uso do marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção, é preferível inspecionar os traços relacionados ao comprimento do caule de uma linhagem de progênie obtida ao cruzar uma linhagem de cana-de-açúcar com uma outra linhagem. O cruzamento entre espécies ou o cruzamento entre gêneros de uma planta Saccharum e de uma planta tal como Miscanthus, Sorghum ou Erianthus, podem ser realizados de acordo com uma técnica convencional.
[0044] O termo "cana-de-açúcar" aqui usado refere-se a uma planta que pertence ao gênero Saccharum da família Gramineae. Além disso, o termo "cana-de-açúcar" refere-se a qualquer uma das chamadas canas nobres (nome científico: Saccharum officinarum), canas selvagens (nome científico: Saccharum spontaneum), Saccharum barberi, Saccharum sinense e Saccharum robustum, que é uma cana progenitora de Saccharum officinarum. O termo "variedade/linhagem de cana-de-açúcar conhecida" não é particularmente limitado. Ele inclui qualquer variedade/linhagem que pode ser usado no Japão e qualquer variedade/linhagem que é usada fora do Japão. Os exemplos das variedades de cana-de-açúcar cultivadas no Japão incluem, mas sem ficar a elas limitadas, Ni1, NiN2, NiF3, NiF4, NiF5, Ni6, NiN7, NiF8, Ni9, NiTn10, Ni11, Ni12, Ni14, Ni15, Ni16, Ni17, NiTn19, NiTn20, Ni22 e Ni23. Os exemplos das variedades principais de cana-de-açúcar no Japão incluem, mas sem ficar a elas particularmente limitadas, NiF8, Ni9, NiTn10 e Ni15. Além disso, os exemplos das variedades principais de cana-de-açúcar que foram introduzidas no Japão incluem, mas sem ficar a elas particularmente limitadas, F177, NCo310 e F172. Os exemplos de espécies de cana-de-açúcar do tipo selvagem incluem, mas sem ficar a elas particularmente limitadas, Glagah Kloet, Glagah 1286, Mandalay, SES14, Us56-15-8 e JW599.
[0045] Em particular, é preferível determinar os traços relacionados ao comprimento do caule de uma linhagem de progênie obtida por meio de cruzamento ao usar uma espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem que tem propriedades excelentes em termos do comprimento inicial do caule e/ou de uma linhagem de progênie de tal espécie do tipo selvagem (por exemplo, S3-19) como uma linha paterna com o uso do marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção. O marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção corresponde a uma região do cromossoma da linhagem S3-19 derivada de Glagah, que é uma espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem excelente em termos do comprimento inicial do caule, e tal marcador é ligado aos traços que estão relacionados ao comprimento do caule de tal espécie do tipo selvagem. Através da detecção da presença ou da ausência do marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção, por conseguinte, pode ser determinado se a linhagem de progênie alvo herdou ou não traços do comprimento de caule inicial excelente.
[0046] Além disso, uma linhagem de progênie pode ser obtida pelo cruzamento de irmãos em que uma planta materna e uma planta paterna são ambas uma variedade/linhagem de cana-de-açúcar, ou pode ser uma linhagem híbrida obtida de plantas paternas quando uma das quais é uma variedade/linhagem de cana-de-açúcar e a outra das quais é uma variedade/linhagem proximamente relacionada (isto é, Erianthus arundinaceus). Além disso, uma linhagem de progênie pode ser obtida através do chamado retrocruzamento.
[0047] O marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção foi identificado recentemente pela análise quantitativa dos loci de traços (QTL) ao usar um mapa de ligação genética que contém 9.485 marcadores derivados de NiF8 e 11.238 marcadores derivados de S3-19 obtidos dos dados de sinais de NiF8, S3- 19, e a linhagem híbrida 214 e dados do comprimento do caule. Muitos genes são associados presumivelmente com o comprimento do caule, que é um traço quantitativo que exibe uma distribuição contínua. A análise de QTL é feita ao usar o software de análise de genes QTL Cartographer (Wang S., C. J. Basten e Z. B. Zeng, 2010; QTL Cartographer 1.17. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, N.C.) de acordo com o método de mapeamento de intervalo composto (CIM). Além disso, os 9.485 marcadores derivados de NiF8 e os 11.238 marcadores derivados de S3-19 obtidos originalmente dos cromossomas da cana-de- açúcar podem ser selecionados com o uso de microarranjos de DNA que compreendem sondas projetadas de acordo com os métodos apresentados nos documentos de patente JP 2011-120558 A e WO 2011/074510.
[0048] Especificamente, uma região com uma contagem de LOD equivalente a ou excedendo um determinado limite (por exemplo, 2,5) foi encontrada no mapa de ligação genética acima ao usar a análise QTL tal como descrito acima. Isto é, uma região de cerca de 5.38 cM (centimorgans) foi identificada em uma posição de cerca de 93,72 cM do 10° grupo de ligação de S3-19 como uma região QTL associada com o comprimento do caule. O termo "morgan(s) (cM)" aqui usado refere- se a uma unidade que representa a distância relativa entre os genes em um cromossoma, e é expressa como uma porcentagem da taxa de cruzamento. No caso de um cromossoma de cana-de-açúcar, 1 cM corresponde a cerca de 2.000 kb. Além disso, é sugerido que os genes causativos (isto é, um grupo de genes) para os traços que causam o comprimento aumentado do caule em S3-19 ou em sua cepa paterna (isto é, Glagah do tipo selvagem) podem estar presentes nas posições de pico ou na vizinhança das mesmas.
[0049] A região de 5,38-cM é imprensada entre o marcador S310951 e o marcador S311375 mostrados na Tabela 1 abaixo.
[0050] Na Tabela 1, o "Grupo de ligação" representa o número dado a cada grupo entre uma pluralidade de grupos de ligação especificados pela análise QTL, o "Nome do marcador" representa o nome dado a cada marcador obtido originalmente na presente invenção, e o "Limite de sinal" representa o limite usado para a determinação da presença ou da ausência de um marcador.
[0051] Uma região de ácido nucleico que contém os marcadores mostrados na Tabela 1 pode ser usada como um marcador relacionado ao comprimento do caule da planta Gramineae. O termo "região de ácido nucleico" aqui usado refere-se a uma região que compreende uma sequência de nucleotídeo que tem 95% ou menos, de preferência 90% ou menos, com mais preferência 80% ou menos, e ainda com maior preferência 70% ou menos identidades a uma região diferente que está presente em um cromossoma da planta Gramineae. Se a identidade de uma região de ácido nucleico que serve como um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae para uma região diferente estiver dentro da faixa acima, a região de ácido nucleico pode ser especificamente detectada de acordo com uma técnica convencional. O nível de identidade aqui descrito pode ser calculado ao usar parâmetros padrão e BLAST ou um algoritmo similar.
[0052] Além disso, o comprimento do nucleotídeo de uma região de ácido nucleico que serve como um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae pode ser pelo menos de 8 nucleotídeos, de preferência 15 nucleotídeos ou mais, com mais preferência 20 nucleotídeos ou mais, e ainda com maior preferência 30 nucleotídeos. Se o comprimento de nucleotídeo de uma região de ácido nucleico que serve como um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae estiver dentro da faixa acima, a região de ácido nucleico pode ser especificamente detectada de acordo com uma técnica convencional.
[0053] Em particular, um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae é selecionado de preferência de uma região de 5,38-cM; isto é, uma região imprensada entre a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2. Isto ocorre porque o pico acima está presente na região imprensada entre a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2.
[0054] Além disso, um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae pode ser uma região de ácido nucleico que contém um dos dois tipos de marcadores mostrados na Tabela 1. Por exemplo, é preferível usar uma região de ácido nucleico que contém um marcador (S310951) que compreende a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 ou uma região de ácido nucleico que contém um marcador (S311375) que compreende a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2 como um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae. Em tal caso, a sequência de nucleotídeo de uma região de ácido nucleico que contém o marcador pode ser identificada por um método para determinar a sequência do vizinho mais próximo, tal como PCR inversa, ao usar iniciadores projetados com base na sequência de nucleotídeo de tal marcador.
[0055] Além disso, os dois tipos de marcadores per se podem ser usados como marcadores relacionado ao comprimento do caule de Gramineae. Especificamente, pelo menos um dos dois tipos de marcadores pode ser usado como um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae. Por exemplo, é preferível usar um marcador (S310951) que consiste na sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 ou um marcador (S311375) que consiste na sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2 como um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae. < Uso de marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae >
[0056] Com o uso de um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae, pode ser determinado se uma planta Gramineae com um fenótipo que exibe um comprimento desconhecido do caule tem um fenótipo do comprimento aumentado do caule. A expressão "o uso de marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae" aqui usado indica o uso de um microarranjo de DNA que tem sondas que correspondem ao marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae. A expressão "sondas que correspondem ao marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae" indica os oligonucleotídeos que podem hibridizar especificamente sob condições estritas para o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae tal como definido acima. Por exemplo, tais oligonucleotídeos podem ser projetados como regiões parciais ou inteiras com comprimentos de nucleotídeo de pelo menos 10 nucleotídeos contínuos, 15 nucleotídeos contínuos, 20 nucleotídeos contínuos, 25 nucleotídeos contínuos, 30 nucleotídeos contínuos, 35 nucleotídeos contínuos, 40 nucleotídeos contínuos, 45 nucleotídeos contínuos, ou 50 nucleotídeos contínuos ou mais da sequência de nucleotídeo do marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae ou de um cordão complementar do mesmo. Além disso, um microarranjo de DNA que tem tais sondas pode ser qualquer tipo de microarranjo, tal como um microarranjo que tem um substrato planar do vidro ou silicone como portador, um arranjo de grânulos que compreende microgrânulos como portadores, ou um microarranjo tridimensional que tem uma parede interna que compreende fibras ocas às quais as sondas são fixadas.
[0057] Com o uso de um microarranjo de DNA preparado tal como descrito acima, pode ser determinado se uma linhagem da planta Gramineae, tal como uma linhagem de progênie com um fenótipo que exibe um comprimento desconhecido do caule tem um fenótipo do comprimento aumentado do caule. Sem o uso de um microarranjo de DNA, também pode ser determinado se uma linhagem da planta Gramineae com um fenótipo que exibe um comprimento desconhecido do caule tem um fenótipo do comprimento aumentado do caule ao detectar o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae acima de acordo com uma técnica convencional.
[0058] O método que envolve o uso de um microarranjo de DNA é descrito em mais detalhes nos documentos de patente JP 2011-120558 A e WO 2011/074510. De acordo com tal método, é detectado se a planta Gramineae alvo compreende ou não o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção. Quando o marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae da presente invenção está presente, pode ser determinado se a linha da planta Gramineae alvo tem os traços que são característicos do comprimento aumentado do caule.
[0059] De acordo com o método descrito acima, em particular, não é necessário cultivar uma planta Gramineae alvo, tal como a cana-de- açúcar, até uma extensão tal que o seu comprimento real do caule se torna mensurável. Por exemplo, as sementes de uma linhagem de progênie ou uma muda nova obtida em consequência da germinação de tais sementes podem ser usadas. Com o uso do marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae, por conseguinte, a área de um campo usado para o cultivo de plantas Gramineae e custo do cultivo podem ser reduzidos por uma extensão significativa.
[0060] Quando da produção de uma nova variedade de cana-de- açúcar, em particular, é preferível a primeiramente produzir várias dezenas de milhares de variedades híbridas através do cruzamento e identificar então uma nova variedade de cana-de-açúcar ao usar um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae antes ou em vez da seleção de mudas. Desse modo, o número de linhagens excelentes que precisam ser cultivadas em um campo real pode ser reduzido até uma extensão significativa, e isto pode reduzir de maneira significativa o trabalho e o custo requeridos para a produção de uma nova variedade de cana-de-açúcar.
[0061] Alternativamente, a presença ou a ausência de um marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae em uma linhagem paterna sujeitada ao cruzamento pode ser primeiramente examinada, para produzir uma nova variedade de cana-de-açúcar que exiba o comprimento aumentado do caule. Com a produção de uma linhagem de progênie com o uso preferencial de uma linhagem paterna que exibe o comprimento aumentado do caule, uma linhagem de progênie com um traço tal como o comprimento aumentado do caule pode ser desenvolvida a uma alta frequência. Desse modo, o número de linhagens satisfatórias a ser cultivadas pode ser reduzido até uma extensão significativa, e o trabalho e o custo requeridos para a produção de novas plantas Gramineae, tal como a cana-de-açúcar, podem ser reduzidos a extensões significativas. Exemplos
[0062] Daqui por diante, a presente invenção é descrita em mais detalhes com referência aos exemplos a seguir, embora o âmbito técnico da presente invenção não seja limitado aos mesmos. < 1. Produção de sondas de microarranjos de DNA > Materiais
[0063] As seguintes variedades foram usadas: variedades de cana- de-açúcar: NiF8, Ni9, Us56-15-8, POJ2878, Q165, R570, Co290 e B3439; variedades de cana-de-açúcar do tipo selvagem proximamente relacionadas: Glagah Kloet, Chunee, Natal Uba e Robustum 9; e variedades de Erianthus: IJ76-349 e JW630. (2) tratamento de enzima de restrição
[0064] Os DNAs genômicos foram extraídos das variedades de cana-de-açúcar acima, variedades de cana-de-açúcar do tipo selvagem proximamente relacionadas e variedades de Erianthus ao usar Nimi Kits de Plantas DNeasy (Qiagen). Os DNAs genômicos (750 ng cada) foram tratados com uma enzima de restrição de PstI (25 unidades, NEB) a 37°C por 2 horas. Em seguida, uma enzima de restrição de BstNI (25 unidades, NEB) foi adicionada aos mesmos, e a resultante foi sujeitada a um tratamento a 60°C por 2 horas. (3) Ligação de adaptador
[0065] Adaptadores de sequência de PstI (5'- CACGATGGATCCAGTGCA-3' (SEQ ID NO: 3) e 5'- CTGGATCCATCGTGCA-3' (SEQ ID NO: 4)) e a ligase de DNA T4 (800 unidades, NEB) foram adicionados aos fragmentos de DNA genômico tratados em (2) (120 ng cada), e as resultantes foram sujeitadas a um tratamento a 16°C por um dia inteiro. Desse modo, os adaptadores foram adicionados seletivamente aos fragmentos de DNA genômico que têm sequências de reconhecimento de PstI em ambas as suas extremidades entre os fragmentos de DNA genômico tratados em (2). (4) Amplificação de PCR
[0066] Um iniciador de reconhecimento de adaptador da sequência de PstI (5'-GATGGATCCAGTGCAG-3' (SEQ ID NO: 5)) e Taq polimerase (1,25 unidade, PrimeSTAR, TAKARA) foram adicionados ao fragmento de DNA genômico (15 ng) que tem os adaptadores obtidos em (3). O fragmento de DNA genômico foi amplificado então por PCR (30 ciclos a 98°C por 10 segundos, a 55°C por 15 segundos e a 72°C por 1 minuto, e tratamento a 72°C por 3 minutos, seguido por uma armazenagem a 4°C). (5) Aquisição da sequência de genoma
[0067] A sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA genômico amplificado por PCR em (4) foi determinada ao usar FLX454 (Roche) ou pelo método de Sanger. Além disso, a informação sobre uma sequência de nucleotídeo imprensada entre sequências de reconhecimento de PstI foi obtida com base na informação total da sequência de genoma de Sorghum armazenada no banco de dados do genoma (Gramene:http://www.gramene.org/). (6) Desenho da sonda e produção de microarranjo de DNA
[0068] Com base da informação da sequência de genoma em (5), sondas de 50 a 75 bp foram desenhadas. Com base na informação da sequência de nucleotídeo das sondas desenhadas, um microarranjo de DNA com tendo as sondas foi produzido. < 2. Aquisição de sinais de dados ao usar microarranjo de DNA > Materiais
[0069] Variedades/linhagens de cana-de-açúcar (NiF8 e S3-19) e a linhagem de progênie (linha 214) foram usadas. (2) Tratamento de enzima de restrição
[0070] Os DNAs genômicos foram extraídos de NiF8, S3-19 e da linhagem de progênie (linha 214) ao usar Mini Kits de Plantas DNeasy (Qiagen). Os DNAs genômicos (750 ng cada) foram tratados com uma enzima de restrição de PstI (25 unidades, NEB) a 37°C por 2 horas. Em seguida, uma enzima de restrição de BstNI (25 unidades, NEB) foi adicionada aos mesmos, e a resultante foi sujeitada ao tratamento a 60°C por 2 horas. (3) Ligação do adaptador
[0071] Adaptadores da sequência de PstI (5'- CACGATGGATCCAGTGCA-3' (SEQ ID NO: 3) e 5'- CTGGATCCATCGTGCA-3' (SEQ ID NO: 4)) e ligase de DNA T4 (800 unidades, NEB) foram adicionados aos fragmentos de DNA genômico tratados em (2) (120 ng cada), e as resultantes foram tratadas a 16°C por um dia inteiro. Desse modo, os adaptadores foram adicionados seletivamente a um fragmento de DNA genômico que tem sequências de reconhecimento de PstI em ambas as suas extremidades entre os fragmentos de DNA genômico tratados em (2). (4) Amplificação de PCR
[0072] Um iniciador de reconhecimento de adaptador da sequência de PstI (5'-GATGGATCCAGTGCAG-3' (SEQ ID NO: 5)) e polimerase de Taq (1,25 unidade, PrimeSTAR, TAKARA) foram adicionados ao fragmento de DNA genômico (15 ng) que tem os adaptadores obtidos em (3). O fragmento de DNA genômico foi amplificado então por PCR (30 ciclos a 98°C por 10 segundos, a 55°C por 15 segundos e a 72°C por 3 minutos, e tratamento a 72°C por 3 minutos, seguido por uma armazenagem a 4°C). (5) Etiquetagem
[0073] O fragmento de amplificado por PCR obtido em (4) acima foi purificado com uma coluna (Qiagen), e 9mers etiquetados com Cy3 (1 O.D., TriLink) foram adicionados ao mesmo. A resultante foi tratada a 98°C por 10 minutos e mantida gelada por 10 minutos. Em seguida, Klenow (100 unidades, NEB) foi adicionado, e a resultante foi sujeitada a um tratamento a 37°C por 2 horas. Uma amostra etiquetada foi preparada então por meio da precipitação de etanol. (6) Hibridização/Detecção de sinal
[0074] A amostra etiquetada obtida em (5) foi sujeitada à hibridização ao usar o microarranjo de DNA preparado em 1. acima de acordo com o NimbleGen Array User’s Guide, e os sinais que resultam da etiquetagem foram detectados. < 3. Identificação de QTL relacionado ao comprimento do caule de Graminae e desenvolvimento de marcadores > Produção da planilha de dados do mapa genético
[0075] Os dados do genótipo de 9.485 marcadores derivados de NiF8 e de 11.238 marcadores derivados de S3-19 possíveis foram obtidos com base nos dados dos sinais das variedades de cana-de- açúcar NiF8 e S3-19 e sua linhagem de progênie (linhagem 214) detectada em 2. acima. No banco de dados obtidos do genótipo, a informação sobre a posição do marcador no cromossoma foi obtida por meio de cálculo ao usar a função de distância de gene (Kosambi) e o software de produção de mapa genético AntMap (Iwata, H. e Ninomiya, S., 2006, AntMap: constructing genetic limkage maps using an ant colony optimization algorithm, Breed Sci. 56: 371-378). Além disso, uma planilha de dados de mapa genético foi produzida com base na informação da posição de marcador obtida ao usar Mapmaker/EXP ver. 3.0 (A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Terceira Edição, janeiro de 1993). (2) Aquisição de dados do comprimento do caule
[0076] Em 13 de abril de 2011, variedades de cana-de-açúcar (NiF8 e S3-19) e a linhagem de progênie (linha 214) foram plantadas em 2 replicatas a uma densidade de plantação de 13 plantas/2,2 m2 por replicata. Em 28 de julho de 2011, 5 indivíduos em cada replicata foram sujeitados à medição da altura da base da planta à base da folha da papada visível superior. A média obtida dos resultados para duas replicatas foi empregada como dados do comprimento do caule da cana-de-açúcar (cm). Os comprimentos do caule das linhagens de cana-de-açúcar medidos são mostrados coletivamente na Figura 1. NiF8 e S3-19 foram observados nas faixas de dados de 62 (cm) e 67,7 (cm), respectivamente. (3) Análise do traço quantitativo (loci de traços quantitativos: Análise QTL)
[0077] Com base na planilha de dados de mapa genético obtida em (1) acima e nos dados do comprimento do caule obtidos em (2) acima, a análise QTL foi realizada pelo método de mapeamento de intervalo composto (CIM) ao usar o software de análise de gene QTL Cartographer (Wang S., C. J. Basten, e Z. B. Zeng, 2010, QTL Cartographer 1.17, department of Sstatistics, North Carolina State University, Raleigh, N.C.). Com a análise, o limite de LOD foi determinado como 2,5. Em consequência disto, tal como mostrado na Figura 2, um pico excedendo o limite de LOD foi observado em uma faixa entre os marcadores S310951 e S311375 presentes no 10° grupo de ligação da linhagem S3-19 de cana- de-açúcar. Tal como mostrado na Tabela 2, o pico obtido pode ser identificado. Isto indica a presença dos genes causativos (isto é, um grupo de genes), cada um dos quais tem a função de causar o comprimento aumentado do caule em posições de pico relevantes. A coluna que mostra os efeitos (cm) na Tabela 2 demonstra quantitativamente os efeitos de causar o comprimento aumentado do caule.
[0078] Tal como mostrado na Figura 4, os marcadores localizados na vizinhança dos picos relevantes são herdados na ligação com genes causativos (isto é, um grupo de genes) cada um dos quais tem a função de causar o comprimento aumentado do caule. Isto indica que os marcadores podem ser usados como marcadores relacionados ao comprimento do caule de Gramineae. Especificamente, foi verificado que os 2 tipos de marcadores mostrados na Figura 4 podem ser usados como marcadores relacionados ao comprimento do caule de Gramineae.
[0079] Como exemplos dos sinais detectados em 2 (6) acima, os níveis de sinais dos marcadores S310951 e S311375 de NiF8, S3-19 e suas 12 linhagens de progênie são mostrados na Tabela 3 e nas Figuras. 3 e 4.
(4) Determinação das origens dos marcadores S310951 e S311375
[0080] Subsequentemente, as origens dos marcadores S310951 e S311375 contidos no marcador relacionado ao comprimento do caule de Gramineae identificado em (3) acima foram determinadas. Especificamente, a homologia genômica entre Irk67-1 e Glagah, que são linhagens paternas da variedade S3-19 de cana-de-açúcar, foi inspecionada através de um experimento à base de arranjos de DNA. O experimento foi realizado ao usar um arranjo de DNA que compreende as sondas desenhadas de acordo com o método apresentado no documento de patente JP 2011-120558 A. Em consequência disto, foi determinado que os marcadores S310951 e S311375 identificados em (3) eram derivados de Glaga, que é uma espécie de cana-de-açúcar do tipo selvagem, tal como mostrado na Tabela 4.
[0081] Na Tabela 4, os resultados obtidos com o uso das mesmas amostras (isto é, Glaga_1 e Glaga_2) foram obtidos ao usar as mesmas amostras no arranjo de DNA. Além disso, os resultados obtidos com o uso de IRK67-1_1 e IRK67-1_2 foram obtidos ao usar a mesma amostra. Na Tabela 4, também "A" indica que o marcador é derivado do genoma da variedade indicada na coluna relevante, e "B" indica que o marcador não é derivado do genoma da variedade indicada na coluna relevante.
[0082] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui citados são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
Claims (2)
1. Método para selecionar uma planta de progênie de cana- de-açúcar com comprimento de caule aumentado, caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de extrair DNA genômico da planta de progênie de cana-de-açúcar; e uma etapa de analisar o referido DNA genômico para detectar a presença de um marcador relacionado ao comprimento do caule de progênie de cana-de-açúcar no DNA genômico extraído e selecionar uma planta de progênie com o marcador em seu genoma, selecionando assim uma progênie de cana-de-açúcar com comprimento de caule aumentado, em que o referido marcador relacionado ao comprimento de caule compreende pelo menos trinta nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta de progênie de cana-de-açúcar está na forma de uma semente ou plântula jovem e o referido DNA genômico é dela extraído.
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| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A RPI 2697 DE 13/09/2022, QUANTO AO ITEM (72) NOME DO INVENTOR. |
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| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 11A ANUIDADE. |
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| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2767 DE 16-01-2024 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |