CN104321440B - 来源于甘蔗野生种基因组的茎长相关标志物及其利用 - Google Patents

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Abstract

提供禾本科植物的量的性状中与茎长相关的标志物。禾本科植物茎长相关标志物，包含从由禾本科植物的染色体中的序列号1所示的碱基序列和序列号2所示的碱基序列所夹的区域中选择的连续的核酸区域。

Description

来源于甘蔗野生种基因组的茎长相关标志物及其利用
技术领域
本发明涉及能够挑选具有甘蔗野生种所特有的茎长的性状的禾本科植物的茎长相关标志物及其利用方法。
背景技术
甘蔗除了为了砂糖的原料、酒类原料等食用而栽培之外，还在包含作为生物燃料原料的利用的各种产业领域被利用。在这样的状况下，有开发具有所期望的特性(例如，糖含量、生长力的增强、新芽形成能力、耐病性和虫害抵抗性、耐寒性、叶长的增大、叶面积的增大、茎长的增大等)的甘蔗植物的新品种的需要。另外，对于包含甘蔗的禾本科植物，也可以全面地在酒类原料和/或生物燃料原料中利用。
对于甘蔗和/或稻、玉米等禾本科植物，以现有品种的改良、即具有所期望的性状的新品种的制成等为目的的交配广泛进行。一般地，作为植物品种·系统的识别，有比较特性数据的“特性比较”、在同一条件下栽培而进行比较的“比较栽培”、分析DNA的“DNA分析”3种方法。利用特性比较和比较栽培的系统识别存在根据栽培条件的不同而精度低下和/或需要巨大工时的长时间的农场调查等大量问题。
特别是，甘蔗与其他作物相比植物体极大，难以实施利用农场调查的系统识别。另外，甘蔗的新品种制成，要首先通过交配制作数万种的交配种，从中进行种子发芽生长挑选、进而阶段性地挑选优良的系统，最终获得具有所希望的特性的2～3种新品种。这样，甘蔗的新品种制成需要对非常多的系统进行栽培·评价，准备如上所述的温室和/或农场需要花费巨大的工夫。
因此，要求开发使用在基因组中存在的标志物来识别具有所期望的特性的禾本科植物、特别是甘蔗系统的方法。特别是在使用甘蔗的新品种制成时，如果能够对于各种特性使用优异的标志物，则可以避免如上所述的甘蔗所特有的诸问题，能够成为非常有效的工具。然而，甘蔗植物由于为高倍体性、染色体数多(约100～130)、标志物技术开发缓慢。对于甘蔗，虽然USDA有关于使用SSR标志物的基因型确定的报告(非专利文献1)，但由于标志物数和来自各标志物的多态性数少，因而精度低，适用范围限于美洲、澳大利亚品种，因此不能在日本国内和台湾、印度等的主要品种和有用的遗传资源的系统识别中利用。
另外，非专利文献2显示了通过增加标志物数、比较、验证各个标志物的特性关系来制作甘蔗的基因图谱的可能性。然而，非专利文献2中没有公开充分数量的标志物，也没有发现与目的特性连锁的标志物。
作为标志物开发的一例，可列举例如，如专利文献1所记载的那样，开发甜菜中的黑根病抵抗性相关标志物。另外，如专利文献2所示，开发了在玉米中利用与目的性状连锁的标志物来挑选品种的技术。
此外，甘蔗有称为野生种(学名：Saccharum spontaneum L.)的品种。作为该甘蔗野生种，已知印度尼西亚等的Glagah、日本国内能见到的ワセオバナ、孟加拉语圈中的Kash(Kans Grass)等。Glagah、ワセオバナ、Kash均是当地的甘蔗野生种的一般惯称。此外，为了指特定的品种·系统，根据需要，有时使用带有收集地名和/或各国的收集号等信息的个别系统名。甘蔗野生种一般具备生长繁殖旺盛且环境耐性能力高这样的特征，具有细而强韧的茎，纤维多，对萎缩病、黄条病等病虫害的抵抗性优异。含糖率一般较低，Glagah多为1～3％以下，日本国内收集的甘蔗野生种也发现超过10％的个体等，变异的幅度大。
通过与这样的甘蔗野生种的种间杂交和/或属间杂交，可以将甘蔗野生种所具有的优异的茎伸长性、多秸性等特性导入制糖用品种和/或除甘蔗以外的禾本科植物品种中。经验上已知种间杂种中低温伸长性和/或最终的茎长优异的系统多，推定甘蔗野生种基因组中有制糖用品种中没有的、带来茎长的增加的独特基因。然而，关于甘蔗野生种的各种特性的标志物完全未被知晓，现状是为了挑选具有这样的特性的种间杂种和/或属间杂种，如上所述，只有花费巨大工夫的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2007/125958
专利文献2：日本特开2010-516236号公报
非专利文献
非专利文献1：Maydica 48(2003)319-329“Molecular genotyping of sugarcaneclones with microsatellite DNA markers”
非专利文献2：Nathalie Piperidis et al.,Molecular Breeding,2008,Vol21,233-247
发明内容
发明要解决的课题
于是，本发明的目的在于提供与甘蔗野生种中的茎长特性相关的、来源于甘蔗野生种基因组的茎长相关标志物及其利用。
用于解决课题的方法
本发明者们为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果，准备包含甘蔗野生种的甘蔗植物中的多种标志物，通过杂交后代系统中的量的性状与标志物的连锁分析，从而发现了与茎长这样的量的性状连锁的来源于甘蔗野生种的标志物，从而完成了本发明。
本发明包含以下(1)～(6)。
(1)禾本科植物茎长相关标志物，包含从由禾本科植物的染色体中的序列号1所示的碱基序列和序列号2所示的碱基序列所夹的区域中选择的连续的核酸区域。
(2)根据(1)所述的禾本科植物茎长相关标志物，其特征在于，所述核酸区域包含序列号1或2所记载的碱基序列或该碱基序列的一部分。
(3)根据(1)所述的禾本科植物茎长相关标志物，其特征在于，所述禾本科植物的一方的亲本是甘蔗野生种。
(4)茎长增大的禾本科植物的制造方法，包括：
提取禾本科植物的染色体和/或该禾本科植物的亲本的染色体的工序；和
测定上述所得的染色体中存在还是不存在上述(1)～(3)的任一项所述的禾本科植物茎长相关标志物的工序。
(5)根据(4)所述的禾本科植物的制造方法，其特征在于，所述禾本科植物是种子或幼苗，从该种子或幼苗提取染色体。
(6)根据(4)所述的禾本科植物的制造方法，其特征在于，还包括：使一方的亲本为甘蔗野生种，通过交配来制作所述禾本科植物的工序。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2012-069850号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
根据本发明，可以提供甘蔗等禾本科植物中的量的性状中与茎长连锁的新的禾本科植物茎长相关标志物。通过利用本发明的禾本科植物茎长相关标志物，可以鉴定甘蔗等禾本科植物的交配系统中的茎长。由此，可以非常低成本地识别具有茎长增大的特性的禾本科植物。
附图说明
图1是显示对于实施例中使用的甘蔗品种·系统群进行测量而得的茎长数据的特性图。
图2是显示关于茎长的QTL分析的结果(S3-19中的第10连锁群)的特性图。
图3是显示各系统中的S310951的信号值的特性图。
图4是显示各系统中的S311375的信号值的特性图。
具体实施方式
以下，对于本发明的禾本科植物茎长相关标志物及其利用方法、特别是使用禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物的制造方法进行说明。
＜禾本科植物茎长相关标志物＞
本发明的禾本科植物茎长相关标志物是在甘蔗等禾本科植物的染色体上存在的特定区域，与禾本科植物的茎长这样的性状的应答基因(群)连锁，具有能够判别禾本科植物的茎长这样的性状的功能。即，在使用已知的甘蔗系统等禾本科植物得到的后代系统中，通过确认禾本科植物茎长相关标志物存在还是不存在，可以判断是否是具有茎长的增大这样的性状的系统。
另外，本发明的禾本科植物茎长相关标志物，是与茎长增大的性状连锁的标志物。例如，可以判断，在特定的禾本科植物中，如果存在本发明的禾本科植物茎长相关标志物，则具有茎长增大的特征。这里，茎长的增大是特别包含生长繁殖初期的茎长的增大的含义，可以换句话说成生长繁殖初期的茎伸长速度快。茎长在甘蔗的情况下，是指对于株中的最高茎，从发芽位置到+1叶(最上展开叶)的肥厚带的高度。初期的茎长在日本国内的情况下，一般是指从发芽后开始5个月的期间中的茎长(根据栽培地域、耕作类型等而期间可以变化)。
这里，对禾本科植物不特别限定，指属于禾本科的植物。即，本发明的禾本科植物茎长相关标志物可以对于分类于禾本科的所有植物使用。此外，禾本科植物进一步分类为竹亚科、早熟禾亚科、オリラ亚科和黍亚科。
详细地，在能够使用本发明的禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物中，竹亚科包含青篱竹属(Arundinaria)、簕竹属(Bambusa)、方竹属(Chimonobambusa)、丘斯夸竹属(Chusquea)、牡竹属(Dendrocalamus)、梨竹属(Melocanna)、锐药竹属(Oxytenanthera)、刚竹属(Phyllostachys)、大明竹属(Pleioblastus)、茶秆竹属(Pseudosasa)、赤竹属(Sasa)、华箬竹属(Sasamorpha)、业平竹属(Semiarundinaria)、倭竹属(Shibataea)、唐竹属(Sinobambusa)、四方竹属(Tetragonocalamus)的植物。
在能够使用本发明的禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物中，早熟禾亚科包含菵草属(Beckmannia)、短柄草属(Brachypodium)、凌风草属(Briza)、雀麦属(Bromus)、鸭茅属(Dactylis)、羊茅属(Festuca)、甜茅属(Glyceria)、ラマルキア属(Lamarckia)、黑麦草属(Lolium)、臭草属(Melica)、早熟禾属(Poa)、碱茅属(Puccinellia)、天蓝草属(Sesleria)、三齿稃属(Triodia)、冰草属(Agropyron)、披碱草属属(Elymus)、大麦属(Horudeum)、黑麦属(Secale)、小麦属(Triticum)、剪股颖属(Agrostis)、燕麦草属(Arrhenatherum)、燕麦属(Avena)、发草属(Deschampsia)、异燕麦属(Helictotrichon)、绒毛草属(Holcus)、洽草属(Koeleria)、兔尾草属(Lagurus)、芦竹属(Arundo)、蒲苇属(Cortaderia)、箱根草属(Hakonechloa)、麦氏草属(Molinia)芦苇属(Phragmites)、野古草属(Arundinella)、ロウデティア属(Loudetia)、苔草属(Tristachya)、虉草属(Phalaris)、米草属(Spartina)粟草属(Milium)和针茅属(Stipa)的植物。
在能够使用本发明的禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物中，ミクライラ亚科(micrairoideae)包含ミクライラ属(Micraira)的植物。
在能够使用本发明的禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物中，画眉草亚科包含双稃草属(Diplachne)、穇属(Eleusine)、画眉草属(Eragrostis)、乱子草属(Muhlenbergia)、鼠尾粟属(Sporobolus)、草沙蚕属(Tripogon)、虎尾草属(Chloris)、狗牙根属(Cynodon)、三芒草属(Aristida)和结缕草属(Zoysia)的植物。
在能够使用本发明的禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物中，稻亚科包含假稻属(Leersia)、稻属(Oryza)和菰属(Zizania)的植物。
在能够使用本发明的禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物中，オリラ亚科包含オリラ属(Ollyra)、クリプトクロア属(Cryptochloa)和囊稃竹属(Leptaspis)的植物。
在能够使用本发明的禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物中，黍亚科包含臂形草属(Brachiaria)、马唐属(Digitaria)、稗属(Echinochloa)、黎属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、狗尾草属(Setaria)和柳叶箬属(Isachne)、须芒草属(Andropogon)、裂稃草属(Schizoachyrium)、荩草属(Arthraxon)、孔颖草属(Bothriochloa)、香茅属(Cymbopogon)、觿茅属(Dimeria)、油芒属(Eccoilopus)、蔗茅属(Erianthus)、蜈蚣草属(Eremochloa)、金茅属(Eulalia)、牛鞭草属(Hemarthria)、白茅属(Imperata)、鸭嘴草属(Ischaemum)、莠竹属(Microstegium)、芒属(Miscanthus)、束尾草属(Phacelurus)、金发草属(Pogonatherum)、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、菅属(Themeda)、薏苡属(Coix)和玉米属(Zea)的植物。
本发明的禾本科植物茎长相关标志物可以适用于分类于这些亚科的全部禾本科植物。即，例如，通过对于这些禾本科植物的后代系统检测本发明的禾本科植物茎长相关标志物存在还是不存在，可以对于该后代系统判断是否具有茎长增大的性状。
特别是作为适合使用本发明的禾本科植物茎长相关标志物的禾本科植物，优选甘蔗属所归属的黍亚科的植物和来自该植物的后代系统。尤其对于通过以至少一方亲本为甘蔗的交配而获得的后代系统，优选利用本发明的禾本科植物茎长相关标志物来判断关于茎长的性状。此外，甘蔗属的植物与例如芒、高粱、蔗茅等植物的“种·属间交配”可以通过现有公知的方法来实施。
此外，甘蔗是指属于禾本科甘蔗属的植物。另外，甘蔗是包含所谓高贵种(学名：甘蔗(Saccharum officinarum))和野生种(学名：甜根子草(Saccharum spontaneum))、细秆甘蔗种(Saccharum barberi)、竹蔗种(Saccharum sinense)、作为高贵种的祖先种的大茎野生种(Saccharum robustum)的任一者的含义。作为已知的甘蔗品种·系统不特别限定，是包含日本国内可使用的所有品种·系统、日本以外的国家使用的品种·系统等的含义。例如，作为甘蔗的日本国内育成品种不特别限定，可列举Ni1、NiN2、NiF3、NiF4、NiF5、Ni6、NiN7、NiF8、Ni9、NiTn10、Ni11、Ni12、Ni14、Ni15、Ni16、Ni17、NiTn19、NiTn20、Ni22和Ni23等。另外，作为甘蔗日本国内主要品种不特别限定，可列举NiF8、Ni9、NiTn10和Ni15等。进而，作为甘蔗日本国内主要引入品种不特别限定，可列举F177、Nco310和F172等。另外，作为甘蔗野生种不特别限定，可列举Glagah Kloet、Glagah 1286、Mandalay、SES14、US56-15-8和JW599等。
特别是对于通过以具有初期的茎长优异这样的性状的甘蔗野生种和/或该野生种的后代系统(例如，S3-19)作为一方亲本的交配而得的后代系统，优选利用本发明的禾本科植物茎长相关标志物来判断关于茎长的性状。本发明的禾本科植物茎长相关标志物与来源于具有初期的茎长优异这样的性状的甘蔗野生种Glagah的系统S3-19的染色体区域对应，与该野生种所具有的茎长的性状相关。因此，通过检测本发明的禾本科植物茎长相关标志物存在还是不存在，可以确认检查对象的后代品种是否继承了初期的茎长优异这样的性状。
此外，后代系统既可以是母本和父本两方都是甘蔗品种·系统的同种交配的系统，也可以是任一方是甘蔗品种·系统、另一方是亲缘的斑茅(Erianthus arundinaceus)那样的杂交系统。另外，后代品种可以通过所谓回交来获得。
本发明的禾本科植物茎长相关标志物是由NiF8、S3-19和杂交后代214系统的信号数据，通过使用包含来源于NiF8的9,485个标志物和来源于S3-19的11,238个标志物的基因连锁图谱与茎长数据的QTL(数量性状位点，Quantitative Trait Loci)分析而新鉴定的。此外，茎长被认为与多个基因相关，是采取连续分布的量的性状。QTL分析使用遗传分析软件QTL Cartographer(Wang S.,C.J.Basten,and Z.-B.Zeng(2010).Windows QTLCartographer 2.5.Department of Statistics,North Carolina State University,Raleigh,NC)，应用Composite interval mapping(复合区间作图法，CIM)法。此外，由甘蔗的染色体独自获得的来源于NiF8的9,485个标志物和来源于S3-19的11,238个标志物，可以使用具有通过日本特开2011-120558号公报和WO2011/074510号公报所公开的方法设计的探针的DNA微阵列。
具体地，通过上述的QTL分析，在上述基因连锁图谱中发现了优势对数分值(LODscore)为规定的阈值(例如2.5)以上的区域。即，在S3-19的第10连锁群的约93.72cM(分摩尔根)的位置特定了包含约5.38cM的区域作为茎长相关QTL区域。这里，“摩尔根(M)”是相对地显示染色体上的基因间的距离的单位，是将交叉值作为百分数而得的值。在甘蔗的染色体上，1cM相当于约2000kb。此外，显示该峰位置或其附近存在使S3-19和/或作为其亲本的野生种Glagah中的茎长增大的性状的应答基因(群)。
上述约5.38cM的区域是由表1所示的标志物S310951和S311375所夹入的区域。
表1
此外，表1中，连锁群是对于在QTL分析中特定的多个连锁群分别赋予的号。表1中标志物名是赋予本发明中独自获得的标志物的名称。表1中信号阈值是用于判断标志物的有无的阈值。
可以使用包含表1所示的标志物的核酸区域作为禾本科植物茎长相关标志物。这里，核酸区域是指包含与禾本科植物的染色体中存在的其他区域的同一性为95％以下、优选为90％以下、更优选为80％以下、最优选为70％以下那样的碱基序列的区域。如果成为禾本科植物茎长相关标志物的核酸区域与其他区域的同一性在上述范围，则可以按照常规方法特异性地检测出该核酸区域。这里，同一性的值例如可以使用BLAST并使用默认参数算出。
另外，成为禾本科植物茎长相关标志物的核酸区域的碱基长可以至少为8碱基长以上、优选为15碱基长以上、更优选为20以上、最优选为30碱基长。如果成为禾本科植物茎长相关标志物的核酸区域的碱基长在上述范围，则可以按照常规方法特异性地检测出该核酸区域。
特别是作为禾本科植物茎长相关标志物，优选选自5.38cM的区域，即由序列号1所示的碱基序列与序列号2所示的碱基序列所夹入的区域。因为上述峰存在于由序列号1所示的碱基序列与序列号2所示的碱基序列所夹入的区域。
另外，作为禾本科植物茎长相关标志物，还可以是包含选自上述表1所示的2种标志物的1种标志物的核酸区域。例如，作为禾本科植物茎长相关标志物，优选使用包含由序列号1所示的碱基序列组成的标志物(S310951)的核酸区域、或包含由序列号2所示的碱基序列组成的标志物(S311375)的核酸区域。此时，包含标志物的核酸区域的碱基序列可以通过使用了基于该标志物的碱基序列而设计的引物的反向PCR等邻接序列获得法来特定。
进而，作为禾本科植物茎长相关标志物，可以使用上述2种标志物本身。即，可以使用这2种标志物中的1种以上的标志物作为禾本科植物茎长相关标志物。例如，作为禾本科植物茎长相关标志物，优选使用由序列号1所示的碱基序列组成的标志物(S310951)或由序列号2所示的碱基序列组成的标志物(S311375)。
＜禾本科植物茎长相关标志物的利用＞
通过利用禾本科植物茎长相关标志物，可以对于关于茎长的表型未知的禾本科植物系统判断是否是显示茎长增大这样的表型的系统。这里，利用禾本科植物茎长相关标志物，是包含利用具有与该标志物对应的探针的DNA微阵列的方式的含义。与禾本科植物茎长相关标志物对应的探针是指能够与如上所述定义的禾本科植物茎长相关标志物在严格条件下特异性地杂交的寡核苷酸。这样的寡核苷酸，例如，可以设计成如上所述定义的禾本科植物茎长相关标志物的碱基序列或其互补链的连续的至少10个碱基、15个碱基、20个碱基、25个碱基、30个碱基、35个碱基、40个碱基、45个碱基、50个碱基或这以上的碱基长的部分区域或全区域。此外，作为具有该探针的DNA微阵列，可以是以玻璃、硅氧烷等的平面基板为载体的微阵列，以微珠为载体的珠阵列，或者在中空纤维的内壁固定探针的3维微阵列等任何类型的微阵列。
通过使用如上制作的DNA微阵列，可以对于以后代系统等为代表的关于茎长的表型未知的禾本科植物系统判断是否是显示茎长增大这样的表型的系统。此外，除了使用上述的DNA微阵列的方法以外，也可以使用现有公知的手法检测上述的禾本科植物茎长相关标志物，从而对于关于茎长的表型未知的禾本科植物系统判断是否是具有茎长增大这样的性状的系统。
关于使用DNA微阵列的方法，在日本特开2011-120558号公报和WO2011/074510号公报详细公开。利用这样的使用DNA微阵列的方法等，检测在供试的禾本科植物中本发明的禾本科植物茎长相关标志物存在还是不存在。在本发明的禾本科植物茎长相关标志物存在的情况下，可以判断供试的禾本科植物是茎长增大这样的品种。
特别是，在上述的方法中，不需要使供试的禾本科植物、例如甘蔗成长到能够测量茎长的程度，可以使用例如后代系统的种子和/或使该种子发芽而得的幼苗。因此，通过利用禾本科植物茎长相关标志物，可以大幅削减用于使供试的禾本科植物生长繁殖的农场和/或其他用于生长繁殖的成本。
特别是，例如在制成甘蔗的新品种时，优选首先通过交配制作数万种交配种后，在种子发芽生长挑选之前进行利用禾本科植物茎长相关标志物的判断，或者取代种子发芽生长挑选而进行利用禾本科植物茎长相关标志物的判断。由此，可以在实际的农场中大幅削减栽培优良的系统的数，从而可以大幅抑制制成甘蔗的新品种所花费的工夫和/或成本。
或者，在制成甘蔗的新品种时，还可以首先判定交配所使用的亲本品种中的禾本科植物茎长相关标志物的存在的有无，挑选出茎长增大这样的亲本品种。通过优先使用茎长增大的亲本品种制成后代系统，可以期待具有茎长增大这样的性状的后代系统高频率地出现。由此，可以大幅削减栽培优良的系统的数，从而可以大幅抑制制成甘蔗等禾本科植物的新品种所花费的工夫和/或成本。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于以下的实施例。
＜1.DNA微阵列用探针的制成＞
(1)材料
使用甘蔗品种：NiF8、Ni9、US56-15-8、POJ2878、Q165、R570、Co290和B3439、甘蔗亲缘野生种：Glagah Kloet、Chunee、Natal Uba和Robustum9、以及蔗茅属：IJ76-349和JW630。
(2)限制性酶处理
从这些甘蔗品种、甘蔗亲缘野生种和蔗茅属分别使用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen社制)提取基因组DNA。将基因组DNA(750ng)用限制性酶PstI(NEB社、25unit(活力单位))在37℃处理2小时处理后，添加限制性酶BstNI(NEB社、25unit)，在60℃处理2小时。
(3)衔接物连接
在(2)中处理的基因组DNA片段(120ng)中加入PstI序列衔接物(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(序列号3)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’(序列号4))和T4DNA Ligase(T4DNA连接酶)(NEB社、800unit)，在16℃处理一昼夜。由此，对(2)中处理的基因组DNA片段中两末端具有PstI识别序列的基因组DNA片段选择性地添加衔接物。
(4)PCR扩增
在(3)中得到的具有衔接物的基因组DNA片段(15ng)中加入PstI序列衔接物识别引物(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(序列号5))和Taq聚合酶(TAKARA社PrimeSTAR、1.25unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃15秒、72℃1分钟进行30个循环后，在72℃处理3分钟，然后在4℃保存)扩增基因组DNA片段。
(5)基因组序列获得
对于(4)中PCR扩增而得的基因组DNA片段通过FLX454(Roche社)或桑格法(Sanger法)确定碱基序列。另外，从基因组数据库(Gramene：http://www.gramene.org/)所存储的高粱属全基因组序列信息获得由PstI识别序列所夹入碱基序列信息。
(6)探针设计和DNA微阵列的制成
以(5)的基因组序列信息为基础设计50～75bp的探针。以设计的探针的碱基序列信息为基础，制作具有这些探针的DNA微阵列。
＜2.使用DNA微阵列的信号数据的获得＞
(1)材料
使用甘蔗品种·系统：NiF8和S3-19、以及交配后代214系统
(2)限制性酶处理
从这些NiF8和S3-19、以及214系统的后代系统分别使用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen社制)提取基因组DNA。将基因组DNA(750ng)用限制性酶PstI(NEB社、25unit)在37℃处理2小时后，添加限制性酶BstNI(NEB社、25unit)，在60℃处理2小时。
(3)衔接物连接
在(2)中处理的基因组DNA片段(120ng)中加入PstI序列衔接物(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(序列号3)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’(序列号4))和T4DNA Ligase(NEB社、800unit)，在16℃处理一昼夜。由此，对(2)中处理的基因组DNA片段中两末端具有PstI识别序列的基因组DNA片段选择性地添加衔接物。
(4)PCR扩增
在(3)中所得的具有衔接物的基因组DNA片段(15ng)中加入PstI序列衔接物识别引物(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(序列号5))和Taq聚合酶(TAKARA社PrimeSTAR、1.25unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃15秒、72℃1分钟进行30个循环后，在72℃处理3分钟，然后在4℃保存)扩增基因组DNA片段。
(5)标记化
将上述(4)中所得的PCR扩增片段用柱(Qiagen社)纯化后，加入Cy3-labeled9mers(Cy3-标记的9聚体)(TriLink社、1O.D.)，在98℃处理10分钟后，在冰上静置10分钟。然后，加入Klenow(克列诺片段)(NEB社、100unit)，在37℃处理2小时。然后，通过乙醇沉淀制备标记化样品。
(6)杂交·信号检测
使用(5)的标记化样品，按照NimbleGen Array User’s Guide(NimbleGen阵列用户指南)，使用上述1.所制作的DNA微阵列进行杂交，检出基于标记的信号。
＜3.禾本科植物茎长相关QTL的鉴定和标志物的开发＞
(1)遗传图谱数据片制成
由上述2.所检测出的甘蔗品种NiF8、S3-19和它们的交配后代系统(214系统)的信号数据，获得成为来源于NiF8的9,485个标志物和S3-19型的11,238个标志物的基因型数据。以该基因型数据为基础，使用遗传图谱制成软件AntMap(Iwata H,Ninomiya S(2006)AntMap:constructing genetic linkage maps using an ant colony optimizationalgorithm.Breed Sci56:371-378)，通过遗传距离计算式Kosambi计算出染色体中的标志物的位置信息。进而，以获得的标志物的位置信息为基础，通过Mapmaker/EXP ver.3.0(AWhitehead Institute for Biomedical Research Technical Report,Third Edition,January,1993)制成遗传图谱数据片。
(2)茎长数据的获得
将NiF8、S3-19和杂交后代214系统在2011年4月13日分别作为1反复13个体/2.2m2，以2反复栽种。2011年7月28日，对于各反复5个体测量从发芽位置到最上展开叶的肥厚带的长度，使用2反复的平均值作为甘蔗的茎长数据(cm)。将测量的各系统的茎长归纳于图1。NiF8包含在62(cm)的数据区间，S3-19包含在67.7(cm)的数据区间。
(3)量的性状(Quantitative trait loci(数量性状座位):QTL)的分析
以上述(1)所得的遗传图谱数据片和上述(2)所得的茎长数据为基础，使用遗传分析软件QTL Cartographer(Wang S.,C.J.Basten,and Z.-B.Zeng(2010).QTLCartographer 1.17.Department of Statistics,North Carolina State University,Raleigh,NC)，通过复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM法)来进行QTL分析。此时LOD的阈值为2.5。其结果如图2所示，在甘蔗系统S3-19的第10连锁群中存在的标志物S310951至S311375的附近，得到了超过LOD的阈值的峰。所得的峰可以如表2所示那样特定，启示在该峰的位置存在具有使茎长增大的功能的应答基因(群)。此外，表2中效果(cm)的栏定量地显示茎长的增大效果。
表2
连锁群 位置(cM) 范围(cM) 邻近标志物 LOD值 效果(cm)
S3-19 93.72 5.38 S310951-S311375 2.73 6.1
并且，如图4所示，显示位于该峰的近傍的标志物可以作为用于与具有使茎长增大的功能的应答基因(群)连锁而遗传的禾本科植物茎长相关标志物使用。即，明确了图4所示的2种标志物可以作为禾本科植物茎长相关标志物使用。
此外，作为上述2.中的(6)信号检测的一例，将NiF8、S3-19、以及后代系统12系统中的标志物S310951和S311375的信号值示于表3，以及分别示于图3和4。
(4)标志物S310951和S311375的来源判定
接着，对上述(3)所特定的禾本科植物茎长相关标志物所含的标志物S310951和S311375判定来源。具体地，对于作为甘蔗品种S3-19的亲本的IRK67-1和Glagah，进行DNA阵列实验来调查各自的基因组间的同源性。此外，DNA阵列实验使用具有通过日本特开2011-120558所公开的方法设计的探针的DNA微阵列。其结果如表4所示，判定上述(3)所特定的标志物S310951和S311375来源于作为甘蔗野生种的Glaga。
表4
此外，表4中，Glaga_1与Glaga_2是在DNA阵列中使用相同样品而得的结果，同样地IRK67-1_1与IRK67-1_2显示相同样品中的结果。另外，表4中A是指可以判定为该列所示的品种的基因组来源。表4中B是指不能判定为该列所示的品种的基因组来源。
本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。

Claims (6)

1.甘蔗茎长相关标志物的用途，用于判断甘蔗茎长的性状，所述甘蔗茎长相关标志物由从甘蔗的染色体中的序列号1所示的碱基序列或序列号2所示的碱基序列中选择的连续的15碱基以上的核酸区域组成。
2.根据权利要求1所述的甘蔗茎长相关标志物的用途，其中所述核酸区域是从序列号1或2所记载的碱基序列中选择的连续的20碱基以上的核酸区域。
3.根据权利要求1所述的甘蔗茎长相关标志物的用途，其中所述核酸区域是从序列号1或2所记载的碱基序列中选择的连续的30碱基以上的核酸区域。
4.茎长增大的甘蔗的判断方法，包括：
提取甘蔗的染色体和/或该甘蔗的亲本的染色体的工序；和
测定上述所得的染色体中存在还是不存在权利要求1～3的任一项所述的甘蔗茎长相关标志物的工序。
5.根据权利要求4所述的甘蔗的判断方法，其特征在于，所述甘蔗的染色体和/或该甘蔗的亲本的染色体是从甘蔗的种子或幼苗提取的染色体。
6.茎长增大的甘蔗的制造方法，其特征在于，包括：使一方的亲本为甘蔗野生种，一方的亲本为茎长增大的甘蔗通过交配来制作甘蔗的工序；自得到的甘蔗提取染色体的工序；和测定上述所得的染色体中存在还是不存在权利要求1～3的任一项所述的甘蔗茎长相关标志物的工序。
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