BR112014020512B1 - Métodos e sistemas para a detecção de microorganismos - Google Patents
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Abstract
MÉTODOS E SISTEMAS PARA A DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS. A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para o isolamento e detecção de micróbios de uma amostra. É descrito o uso de agentes ligantes para o isolamento de um micróbio de interesse de uma amostra. Em certas modalidades, os métodos usam amplificação baseada em ribossomo e/ou baseada em bacteriófago do sinal na detecção de bactérias e de outros microrganismos. Por exemplo, as modalidades da presente invenção podem alcançar a amplificação total de pelo menos 10.000, a partir de uma única célula infectada.
Description
[001] Esse pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. 61/601.231, depositado em 21 de fevereiro de 2012. A divulgação do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano 61/601.231 é incorporada na presente invenção por referência em sua totalidade.
[002] Essa invenção refere-se aos métodos e sistemas para a detecção de microrganismos.
[003] Há um forte interesse na detecção de bactérias e outros microrganismos em amostras de base biológica e de alimentos. Os patógenos bacterianos podem causar substancial morbidade entre os seres humanos e animais, bem como enormes perdas econômicas. Além disso, a detecção de microrganismos é uma alta prioridade no Food and Drug Administration (FDA) devido ao desencadeamento de doenças que ameaçam a vida ou fatais causadas pela ingestão de alimentos contaminados com certos microrganismos, por exemplo, Escherichia coli ou Salmonella spp.
[004] Testes microbiológicos tradicionais para a detecção de bactérias dependem de culturas de enriquecimento não seletivas e seletivas, seguido por plaqueamento em meios seletivos e testes adicionais para confirmar as colônias suspeitas. Tais procedimentos podem exigir vários dias. Uma variedade de métodos rápidos foram investigados e introduzidos na prática para reduzir a necessidade de tempo. No entanto, esses métodos apresentam desvantagens. Por exemplo, técnicas que envolvem imunoensaios diretos ou sondas de gene geralmente requerem uma etapa de enriquecimento para obter a sensibilidade adequada. Testes da reação em cadeia da polimerase (PCR) também incluem uma etapa de amplificação e, portanto, são capazes de sensibilidade e seletividade muito altas, no entanto, o tamanho da amostra que pode ser economicamente submetido ao teste de PCR é limitado. Com suspensões bacterianas diluídas, a maioria das subamostras pequenas será isenta de células e, portanto, etapas de enriquecimento ainda são necessárias. O tempo necessário para o enriquecimento biológico é determinado pela taxa de crescimento da população bacteriana alvo da amostra, pelo efeito da matriz da amostra e pela sensibilidade necessária. Por exemplo, um sistema de PCR magnético/de captura para E. coli verotoxinogênico pode exigir cerca de 5, 7 e 10 horas de cultivo para enriquecimento para detectar 1000, 100 e 1 unidade formadora de colônia por mililitro (UFC/mL), respectivamente, em um sistema modelo, e 15 horas de cultivo para o enriquecimento detectar 1 ufc por grama (g) na carne moída. Na prática, a maioria dos métodos de alta sensibilidade utilizam incubação de um dia para o outro e levam um total de cerca de 24 horas. Devido ao tempo necessário para o cultivo, esses métodos podem levar até três dias, dependendo do organismo a ser identificado e a fonte da amostra. O tempo de latência é geralmente inadequado, uma vez que a comida contaminada, água (ou outro produto) pode ter feito passado para o gado ou seres humanos. Além disso, aumentos de bactérias resistentes a antibióticos e considerações de biodefesa tornam a identificação rápida de patógenos bacterianos em água, alimentos e amostras clínicas prioridades críticas em todo o mundo.
[005] Portanto, há uma necessidade por meios de detecção e identificação de microrganismos mais rápidos, simples e sensíveis, como bactérias e outros microrganismos potencialmente patogênicos.
[006] Em um aspecto, a presente invenção utiliza a biologia dos microrganismos para a detecção de um microrganismo em uma amostra. Uma variedade de microrganismos pode ser detectada usando os métodos descritos na presente invenção.
[007] Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção compreende métodos e sistemas que utilizam uma pluralidade de ribossomos que estão presentes em um único microrganismo como um meio para detectar níveis baixos dos microrganismos presentes em uma amostra. Por exemplo, o método pode compreender as etapas de isolar o microrganismo de outros componentes da amostra, lisando o microrganismo para liberar os ribossomos presentes no microrganismo; e detectar os ribossomos, ou um constituinte dos ribossomos, em que a detecção dos ribossomos ou do constituinte dos ribossomos indica que o microrganismo está presente na amostra. Em certas modalidades, os ribossomos e/ou as proteínas ribossomais liberadas do microrganismo podem ser analisadas usando um imunoensaio amplificado baseado em esferas. Em ainda outras modalidades, a presente invenção pode compreender um ensaio de fluxo lateral juntamente com nanofibras de negro para detectar os ribossomos e/ou as proteínas ribossomais liberadas do microrganismo.
[008] Em outros aspectos adicionais e/ou alternativos, a presente invenção utiliza a alta especificidade dos agentes que podem se ligar aos microrganismos ou seus constituintes como um meio para detectar e isolar os baixos níveis de um microrganismo (por exemplo, um único microrganismo) presente em uma amostra. Por exemplo, em certas modalidades, o método pode compreender as etapas de isolar pelo menos uma bactéria de outros componentes na amostra e infectar a pelo menos uma bactéria com uma pluralidade de bacteriófagos da progenia. O método pode compreender ainda lisar a pelo menos uma bactéria infectada para liberar o bacteriófago da progenia presente na bactéria. O método pode compreender também detectar o bacteriófago da progenia, ou um constituinte do bacteriófago da progenia, sendo que a detecção do bacteriófago ou de um constituinte do bacteriófago indica que a bactéria está presente na amostra.
[009] A presente invenção compreende, também, métodos e sistemas que utilizam a especificidade dos agentes de ligação específicos, tais como bacteriófago e/ou anticorpos, para isolar microrganismos de uma amostra.
[0010] Outras modalidades descritas na presente invenção utilizam bacteriófago da progenia e/ou bactérias marcadas com uma porção detectável para facilitar a detecção de bactérias infectadas. Por exemplo, o bacteriófago da progenia pode compreender uma biomolécula detectável, como a proteína luciferase. Ou o bacteriófago da progenia pode ser quantificado através da infecção de bactérias que compreendem uma biomolécula marcadora, como a proteína luciferase. Ou o bacteriófago da progenia pode ser quantificado utilizando ensaios de fluxo lateral juntamente com nanofibras de negro de fumo.
[0011] Em ainda outras modalidades, a invenção compreende sistemas (por exemplo, kits) que compreendem componentes para realizar os métodos divulgados na presente invenção.
[0012] Assim, as modalidades da presente invenção baseiam-se nos métodos baseados em bacteriófago e baseados em ribossomo para a amplificação da detecção das bactérias. Os princípios aplicados na presente invenção podem ser aplicados para a detecção de outros microrganismos. Devido ao grande número dos ribossomos presentes em um microrganismo ou ao rápido aumento do número de agentes infecciosos presentes em uma célula após a amplificação, pode ser mais fácil detectar os ribossomos e/ou tais agentes infecciosos da progenia do que detectar os microrganismos em si. Dessa forma, as modalidades da presente invenção podem alcançar a amplificação total de pelo menos 10.000, a partir de uma única célula infectada.
[0013] A presente invenção pode ser mais bem compreendida referindo-se às seguintes figuras não limitadoras.
[0014] A figura 1, quadros A e E, representa um diagrama esquemático de uma captura baseada em anticorpo de células bacterianas intactas em solução de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[0015] A figura 2 mostra um ensaio de placa de bactérias capturadas usando uma captura baseada em anticorpo de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[0016] A figura 3, quadros A e B, mostra um western blot ilustrando a captura de proteína ribossomal usando IgG antirribossomal biotinilada e esferas magnéticas ligadas à estreptavidina, de acordo com uma modalidade da invenção.
[0017] A figura 4, quadros A e B, mostram micrografias eletrônicas de uma célula que contém uma pluralidade de ribossomos e ribossomos purificados, respectivamente, onde o quadro A mostra uma micrografia eletrônica de uma porção (cerca de 1/3) de uma seção delgada de Bacillus subtilis, mostrando o grande número de ribossomos (pontos densos de elétrons) e o painel B mostra uma micrografia eletrônica de mancha negativa de ribossomos de E. coli purificados. A célula apresenta aproximadamente 1 μm de diâmetro e os ribossomos possuem aproximadamente 20 nm de diâmetro.
[0018] A figura 5 ilustra um ensaio que compreende o isolamento de uma bactéria de uma amostra através do uso de um agente ligante imobilizado, com a lise celular resultando na liberação de uma pluralidade de ribossomos, e o imunoensaio dos ribossomos de acordo com uma modalidade da invenção.
[0019] A figura 6 ilustra um ensaio que compreende a lise de uma célula bacteriana em uma amostra, o isolamento dos ribossomos liberados da célula através do uso de um agente ligante imobilizado, e um imunoensaio sanduíche dos ribossomos de acordo com uma modalidade da invenção.
[0020] A figura 7, quadros A e B, ilustra um imunoensaio sanduíche para a detecção dos ribossomos, bacteriófago ou duas proteínas constituintes usando um formato de imunoensaio padrão (quadro A) ou uma amplificação do sinal da esfera de acordo com uma modalidade da invenção (quadro B).
[0021] A figura 8, quadros A a F, mostra uma variedade de métodos de detecção para as proteínas ribossomais de acordo com modalidades alternativas da invenção.
[0022] A figura 9 mostra os resultados para a detecção das proteínas ribossomais de acordo com uma modalidade da invenção, onde o eixo x indica o número de células bacterianas e o eixo y indica o sinal relativo a um controle que não tinha células bacterianas.
[0023] A figura 10, quadros A a D, descreve o uso de um ensaio de fluxo lateral para a detecção de ribossomos de acordo com modalidades alternativas encarnações da invenção, onde o quadro A mostra um diagrama esquemático de uma tira de fluxo lateral e uma representação de uma nanofibra de negro de fumo (CNBS); o quadro B mostra uma representação esquemática do uso de um ensaio de fluxo lateral para medir os ribossomos; e os quadros C e D mostram a medição dos ribossomos usando um ensaio de fluxo lateral e métodos de desenvolvimento alternativos.
[0024] A figura 11 mostra o uso de bactérias indicadoras para detectar o fago da progenia isolado de células bacterianas de acordo com uma modalidade da invenção.
[0025] A figura 12, quadros A a C, mostra o uso da detecção do fago da progenia de uma amostra bacteriana de interesse de acordo com modalidades alternativas da invenção, onde o quadro A mostra a detecção de uma ou duas células bacterianas usando o fago da progenia, em comparação com um ensaio de unidade formadora de colônia bacteriana padrão (UFC); o quadro B mostra o efeito de resposta à dose com o ensaio de detecção de fago (PFU) da invenção, também em comparação com o ensaio de formação de colônia bacteriana padrão (CFU); o quadro C mostra a detecção de células indicadoras lisadas do fago que são o equivalente da progenia progênie de uma única célula bacteriana (ou seja, 100 fagos) ou 27 células bacterianas (ou seja, 2700 fagos); o quadro D mostra a detecção de 1, 5 e 7 células bacterianas de amostra por amostra, usando o ensaio de fago com células bacterianas indicadoras; e o quadro E mostra a detecção de números elevados (de até 10.000 células) de células bacterianas de amostra por amostra, usando o ensaio de fago com células indicadoras bacterianas.
[0026] A figura 13 mostra o uso do fago indicador com a proteína capsídeo fundida com a luciferase para detectar o fago da progenia isolado de células bacterianas de acordo com uma modalidade da invenção.
[0027] A figura 14 mostra o uso do fago indicador com uma luciferase solúvel para detectar o fago da progenia isolado de células bacterianas de acordo com uma modalidade da invenção.
[0028] A menos que seja definido de outra forma neste documento, termos científicos e técnicos usados juntamente com a presente invenção devem ter os significados que são comumente compreendidos pelas pessoas normalmente versadas na técnica. Além disso, a menos que seja exigido pelo contexto de outra forma, termos no singular devem englobar o singular. Em geral, as nomenclaturas usadas juntamente com, e técnicas de cultura de células e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e proteínas e química de ácidos nucleicos e hibridização descritas na presente invenção são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas conhecidos geralmente são realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas, que são discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que seja indicado de outra forma. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como é comumente realizado na técnica ou como descrito neste documento. As nomenclaturas utilizadas juntamente com os procedimentos de laboratório e as técnicas descritas na presente invenção são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica.
[0029] Os termos a seguir, a menos que sejam indicados de outra forma, devem ser interpretados como apresentando os seguintes significados:
[0030] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “um”, “uma” e “o/a” podem se referir a um ou mais, a menos que seja especificamente indicado de outra forma.
[0031] O uso do termo "ou" é usado para significar "e/ou", a menos que seja explicitamente indicado para se referir apenas a alternativas ou que as alternativas sejam mutuamente exclusivas, embora a divulgação embase uma definição que se refere a apenas alternativas e "e/ou." Conforme utilizado na presente invenção, “outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[0032] Em todo esse pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método sendo utilizado para determinar o valor ou a variação que existe entre as amostras.
[0033] O termo "suporte sólido" ou "suporte" significa uma estrutura que fornece um substrato no qual as biomoléculas podem se ligar. Por exemplo, um suporte sólido pode ser um poço de ensaio (ou seja, como uma placa de microtitulação), ou o suporte sólido pode ser um local em uma matriz, ou um suporte móvel, como uma pérola.
[0034] O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos e anticorpos quiméricos, por exemplo, gerados por mutagênese combinatória e exibição de fago. O termo "anticorpo" também inclui miméticos ou peptideomiméticos dos anticorpos. Peptideomiméticos são compostos à base de, ou derivados de peptídeos e proteínas. Os peptideomiméticos da presente invenção normalmente podem ser obtidos por modificação estrutural de uma sequência peptídica conhecida usando aminoácidos artificiais, restrições conformacionais, substituição isostérica e similares.
[0035] O termo "agente ligante" refere-se a uma molécula que pode se ligar especificamente e seletivamente a uma segunda molécula (ou seja, diferente) de interesse. A interação pode ser não covalente, por exemplo, como resultado da ligação de hidrogênio, interações de van der Waals ou interações hidrofóbicas ou eletrostáticas, ou pode ser covalente. O termo "agente ligante solúvel" refere-se a um agente ligante que não está associado com (ou seja, covalentemente ou não covalentemente ligado) a um suporte sólido.
[0036] Conforme utilizado na presente invenção, um "analito" refere-se a uma molécula, ou composto ou célula que está sendo mensurado. O analito de interesse pode, em certas modalidades, interagir com um agente de ligação. Conforme descrito na presente invenção, o termo "analito" pode referir-se a uma proteína ou peptídeo de interesse. Um analito pode ser um agonista, um antagonista ou um modulador. Ou um analito pode não ter um efeito biológico. Analisas podem incluir pequenas moléculas, açúcares, oligossacarídeos, lipídios, peptídeos, peptideomiméticos, compostos orgânicos e similares.
[0037] O termo "porção detectável", "biomolécula detectável", "repórter" ou “porção indicadora” refere-se a uma molécula que pode ser mensurada em um ensaio quantitativo. Por exemplo, uma porção detectável pode incluir uma enzima que pode ser usada para converter um substrato em um produto que pode ser mensurado (por exemplo, um produto visível). Ou uma porção detectável pode ser um radioisótopo que pode ser quantificado. Ou uma porção detectável pode ser um fluoróforo. Ou uma porção detectável pode ser uma molécula luminescente. Ou outras moléculas detectáveis podem ser usadas.
[0038] Conforme utilizado na presente invenção, o termo "zona de equivalência" indica a região em uma reação de precipitação em que a concentração do antígeno e do anticorpo leva à precipitação máxima. Assim, se o antígeno ou o anticorpo estiver em excesso, a precipitação não ocorre.
[0039] Conforme utilizado na presente invenção, "bacteriófago" ou "fago" inclui um ou mais de uma pluralidade de vírus bacterianos. Nessa divulgação, os termos “bacteriófago” e “fago” incluem vírus, tais como micobacteriófago (tal como TB e paraTB), micófago (tal como para fungos), fago de micoplasma e qualquer outro termo que se refira a um vírus que possa invadir bactérias, fungos, micoplasma, protozoários, leveduras vivas e outros organismos vivos microscópicos e que os usa para se replicar. Aqui, "microscópico" significa que a maior dimensão é igual a um milímetro ou menos. Bacteriófagos são vírus que evoluíram na natureza para usar bactérias como um meio de se replicar. Um fago faz isso ligando-se a uma bactéria e injetando o seu DNA (ou RNA) naquela bactéria, e a induzindo para replicar o fago centenas ou até mesmo milhares de vezes. Isso é referido como amplificação do fago.
[0040] Conforme utilizado na presente invenção, um "marcador bacteriófago" é qualquer elemento biológico ou orgânico que pode estar associado com a presença do bacteriófago. Sem limitação, esse pode ser o bacteriófago em si; uma proteína ou outra molécula incorporada na estrutura do fago; uma proteína associada com, ou produto de gene manipulado dentro do bacteriófago; RNA ou DNA associado com o bacteriófago; ou qualquer porção de qualquer um dos anteriores. Conforme utilizado na presente invenção, um "marcador bacteriano" é qualquer elemento biológico ou orgânico que pode ser usado para identificar a presença de uma bactéria, como constituintes liberados quando uma bactéria é lisada por um bacteriófago, incluindo componentes da parede celular, ácidos nucleicos bacterianos, proteínas, enzimas, pequenas moléculas ou qualquer parte dos mesmos. Por exemplo, em certas modalidades, a proteína luciferase incorporada por manipulação genética em um componente estrutural do fago (por exemplo, a fusão com a proteína de capsídeo) ou como uma proteína solúvel é um marcador bacteriófago.
[0041] A presente invenção fornece métodos para a detecção dos microrganismos. Cada uma das modalidades dos métodos e sistemas da invenção pode ser aplicada para a detecção e quantificação de uma variedade de microrganismos, incluindo as células bacterianas, e incluindo os patógenos de amostras de alimentos, água, clínicas e comerciais. Os métodos da presente invenção fornecem alta sensibilidade de detecção em um curto período de tempo sem a necessidade de enriquecimento biológico tradicional. Por exemplo, as modalidades da presente invenção podem abranger a detecção e quantificação de um único microrganismo (por exemplo, célula bacteriana) em uma amostra.
[0042] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção compreende um método para detectar um microrganismo de interesse que compreende as s etapas de: isolar o microrganismo de outros componentes na amostra; lisar o microrganismo para liberar os ribossomos presentes no microrganismo; e detectar os ribossomos, ou um constituinte dos ribossomos, em que a detecção dos ribossomos ou de um constituinte dos ribossomos indica que o microrganismo está presente na amostra.
[0043] Uma variedade de microrganismos pode ser detectada usando os métodos da invenção. Em uma modalidade, o microrganismo compreende pelo menos um dentre uma bactéria, um fungo ou levedura.
[0044] Uma variedade dos métodos pode ser usada para isolar o microrganismo. Em uma modalidade, a etapa de isolar o microrganismo compreende ligar o microrganismo a um agente ligante. Por exemplo, a etapa de isolar o microrganismo pode compreender a ligação do microrganismo a um agente de ligação que está ligado a um suporte sólido. Em uma modalidade, o agente ligante pode ser um anticorpo. Ou onde o microrganismo é uma bactéria, o agente de ligação pode ser um bacteriófago e a etapa de isolar a bactéria utiliza um bacteriófago específico para a bactéria.
[0045] Uma variedade dos métodos pode ser usada para detectar ribossomos de um microrganismo. Em uma modalidade, a detecção dos ribossomos compreende o uso de um anticorpo primário que reconhece os ribossomos, e pelo menos um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário. Ou a detecção dos ribossomos pode compreender o uso de um anticorpo primário que reconhece os ribossomos, e de pelo menos um anticorpo secundário que reconhece os ribossomos. Em certas modalidades, o segundo anticorpo primário está ligado a um suporte sólido. Em ainda outras modalidades, o suporte sólido compreende uma pluralidade de segundos anticorpos primários.
[0046] Em outras modalidades, os ribossomos podem ser detectados usando um ensaio de fluxo lateral. Por exemplo, em uma modalidade, os ribossomos são expostos a (ou seja, aplicados a) um suporte sólido que compreende anticorpos antirribossomais e detectados pelo fluxo dos ribossomos por toda a superfície do suporte. Em uma modalidade, os ribossomos ligados à membrana que compreendem anticorpos antirribossomais podem ser visualizados usando pelo menos uma nanofibra de negro de fumo que compreende anticorpos antirribossomais adicionais.
[0047] Outras modalidades da invenção utilizam a especificidade e a multiplicidade dos agentes infecciosos para detectar um microrganismo de interesse. Em outra modalidade, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse que inclui as etapas de: isolar pelo menos um microrganismo de outros componentes na amostra; infectar o pelo menos um microrganismo com uma pluralidade de um agente infeccioso parental; lisar o pelo menos um microrganismo infectado para liberar agentes infecciosos da progenia presentes no microrganismo; e detectar os agentes infecciosos da progenia, ou um constituinte dos agentes infecciosos da progenia, em que a detecção do agente infeccioso ou um constituinte do agente infeccioso indica que o microrganismo está presente na amostra. Em uma modalidade, o agente infeccioso parental é separado do agente infeccioso da progenia. Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago.
[0048] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de um microrganismo de interesse que compreende as etapas de: isolar pelo menos uma bactéria dos outros componentes na amostra; infectar a pelo menos uma bactéria com uma pluralidade de bacteriófagos parentais; lisar a pelo menos uma bactéria infectada para liberar o bacteriófago da progenia presente na bactéria; e detectar o bacteriófago da progenia, ou um constituinte do bacteriófago da progenia, em que a detecção do bacteriófago ou de um constituinte do bacteriófago indica que a bactéria está presente na amostra. Em uma modalidade, os bacteriófagos parentais são separados do bacteriófago da progenia.
[0049] O método pode compreender uma variedade de formatos para a detecção dos agentes infecciosos da progenia como, por exemplo, o bacteriófago. Por exemplo, em uma modalidade, o agente infeccioso da progenia pode compreender uma porção indicadora. Em uma modalidade, a porção indicadora no agente infeccioso da progenia pode compreender a luciferase fundida a uma proteína estrutural (por exemplo, proteína de capsídeo do fago). Em uma modalidade, a porção indicadora no agente infeccioso da progenia pode ser uma porção detectável que é expressa durante a replicação do agente infeccioso, tal como, mas sem se limitar, a uma proteína luciferase solúvel. Em uma modalidade alternativa, o método pode compreender a etapa de infectar um microrganismo indicador com o agente infeccioso da progenia, sendo que o microrganismo indicador pode compreender uma proteína que é liberada após a lise do microrganismo indicador. Em uma modalidade, a liberação da proteína do microrganismo indicador compreende uma porção detectável. Por exemplo, em uma modalidade, a proteína liberada é uma proteína luciferase. Em uma modalidade alternativa, o agente infeccioso da progenia das células de amostras infectadas e/ou células indicadoras pode ser detectado pelo ensaio de fluxo lateral com nanofibras de negro de fumo.
[0050] Ou a proteína libertada do microrganismo indicador pode compreender ribossomos. Dessa forma, o método combina a amplificação fornecida pela infecção com um agente infeccioso (por exemplo, bacteriófago) com a amplificação proporcionada pela detecção do ribossomo.
[0051] Em certas modalidades, a presente invenção utiliza a alta especificidade dos agentes que podem se ligar a um microrganismo de interesse como um meio para detectar níveis baixos de um microrganismo (por exemplo, um único microrganismo) presente em uma amostra. Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção compreende métodos e sistemas que utilizam a especificidade de um agente infeccioso para o isolamento de um microrganismo de uma amostra. Por exemplo, em certas modalidades, o bacteriófago pode ser usado para isolar as bactérias.
[0052] Ou a invenção pode usar anticorpos que são específicos para o microrganismo. Uma vez isolados, por exemplo, através da interação com um anticorpo, agente infeccioso ou outro agente de ligação, o microrganismo pode ser lisado para o ensaio de ribossomos e/ou agentes infecciosos da progenia, como descrito na presente invenção.
[0053] Assim, em certas modalidades, a etapa de isolar o microrganismo compreende ligar o microrganismos a um agente de ligação que reconhece o microrganismo e que, como tal, é usado para sequestrar o microrganismo do restante da amostra. Os métodos aqui descritos podem servir como meios para detectar e isolar os baixos níveis de um microrganismo (por exemplo, um único microrganismo) presente em uma amostra. Por exemplo, uma única bactéria, que pode ter um volume menor que um micrômetro cúbico, pode ser isolada de uma amostra de um mililitro, com um volume de 1012 micrômetros cúbicos.
[0054] Em certas modalidades, a presente invenção compreende métodos e sistemas que utilizam a especificidade dos anticorpos para o isolamento rápido e sensível de uma única célula bacteriana de uma amostra. O método pode incluir a etapa de colocar em contato a amostra com uma pluralidade de anticorpos suscitados contra a célula intacta. Os anticorpos podem ser purificados por afinidade.
[0055] Adicionalmente e/ou alternativamente, os anticorpos podem ser marcados com biotina. O método pode compreender ainda permitir que os anticorpos se liguem à bactéria. No caso onde o anticorpo é marcado com biotina, o método pode compreender ainda o contato da amostra com uma pluralidade de esferas revestidas com estreptavidina magnéticas para se ligar ao complexo anticorpo-bactéria, e sequestrar o complexo esfera-anticorpo-bactéria com um ímã. Ou outros métodos de purificação do complexo biotina- anticorpo:bactéria podem ser usados. Com esse método, uma bactéria em uma amostra de um mililitro pode ser concentrada até cerca de um microlitro (~ 1000 vezes), facilitando a detecção e/ou quantificação adicional pelos métodos descritos na presente invenção. Por exemplo, uma vez isolada, a bactéria pode ser lisada para ensaio dos ribossomos, conforme descrito em mais detalhes na presente invenção.
[0056] Em uma modalidade alternativa, a presente invenção compreende métodos e sistemas que utilizam a especificidade dos agentes infecciosos (por exemplo, vírus específicos para um microrganismo) para o isolamento rápido e sensível de um único microrganismo de uma amostra. Dessa forma, em ainda outra modalidade, o método pode incluir colocar em contato a amostra com uma pluralidade de agentes infecciosos específicos (por exemplo, bacteriófagos em isolamento de células bacterianas) ligados a um suporte sólido (por exemplo, uma esfera magnética) e permitindo que os complexos bacteriófago-suporte sólido encontrem, se liguem e infectem a bactéria. O complexo suporte sólido- bacteriófago-bactéria pode, então, ser sequestrado antes da lise.
[0057] Dessa forma, em certas modalidades, o fago biotinilado pode ser usado para infectar bactérias em uma amostra. O fago biotinilado pode ser imobilizado sobre um suporte sólido revestido com estreptavidina. Em outras modalidades, o agente infeccioso (por exemplo, bacteriófago) pode ser imobilizado sobre um suporte sólido usando um anticorpo que se liga especificamente ao agente infeccioso (por exemplo, ao bacteriófago ou a uma subestrutura do bacteriófago, como a cabeça).
[0058] Posteriormente, o bacteriófago inserido imobilizado, alguns dos quais se ligam aos envelopes da célula bacteriana após a lise celular, pode ser removido da amostra por isolamento do suporte sólido. Por exemplo, em uma modalidade, o suporte sólido é uma esfera magnética, e o fago ligado à esfera pode ser isolado usando um ímã.
[0059] Ou o fago inserido biotinilado pode ser isolado por purificação subsequente das bactérias e/ou fago da progenia. Por exemplo, o lisado da infecção pode ser analisado através de uma coluna de estreptavidina; o fago biotinilado (inserido) parental irá se ligar à ara a coluna, enquanto que o fago da progenia, que não é biotinilado, se encontrará na fração eluída. Dessa forma, o bacteriófago inserido não interfere com a enumeração da progenia do fago produzida na infecção.
[0060] Por exemplo, o método pode incluir as etapas de coletar p microrganismo (por exemplo, bactéria) como, por exemplo, por filtração de uma amostra através de um filtro bacteriológico (por exemplo, um filtro spin com tamanho de poro igual a 0,45 μm) . Ou outros métodos de isolamento físico dos microrganismos na amostra podem ser usados. O método pode compreender ainda infectar a bactéria isolada com bacteriófago, por exemplo, em uma alta multiplicidade de infecção (MOI) e em que o bacteriófago compreende uma porção de ligação (por exemplo, biotina ou outro agente ligante). O método também pode compreender remover pelo menos a maior parte do excesso de fago inserido não absorvido, como por exemplo, por lavagem de tal fago não absorvido através do filtro usado para capturar as bactérias.
[0061] Usando um fago que está ligado a um agente ligante/suporte sólido para isolar as bactérias, os métodos da presente invenção podem superar os problemas associados com a distinção do fago usado para recuperar (isolado) a bactéria (ou seja, a inserção do fago de infecção ligado a um agente ligante ou a um suporte sólido) do fago da progenia (que não está ligado a um agente ligante ou a um suporte sólido). Uma abordagem anterior a esse problema tem sido destruir quimicamente o fago extracelular não adsorvido restante após as células alvo serem infectadas. No entanto, o tratamento químico pode matar as células do patógeno antes que elas sejam capazes de produzir novas partículas de fago. Além disso, com uma alta densidade de inserção, o fago infectante por unidade de área de um suporte sólido elimina o problema potencial associado com multiplicidades de infecção (MOI) muito altas, que podem lisar bactérias sem a produção de partículas de progenia, um processo conhecido como "lise de fora" (lysis from without).
[0062] O bacteriófago pode ser imobilizado em um substrato por um dos muitos procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo específico para o bacteriófago pode ser usado para ligar um bacteriófago a um substrato. Alternativamente, ligantes como avidina, estreptavidina e biotina podem ser usados. Métodos de ligação covalente também podem ser utilizados para ligar um bacteriófago a um substrato. Em geral, os anticorpos com especificidade por proteínas da cauda de bacteriófago não devem ser usadas, pois a ligação de tal anticorpo às proteínas da cauda pode interferir com a capacidade da partícula de bacteriófago se ligar a uma célula bacteriana hospedeira.
[0063] Um exemplo de uma representação do isolamento de um microrganismo é fornecido na figura 1, nos quadros A a E. Dessa forma, conforme ilustrado na figura 1, uma amostra que compreende uma pluralidade de bactérias, por exemplo, bactéria-X e bactéria-Y, 22 e 24, respectivamente, pode ser exposta a um anticorpo específico para as bactérias-X, por exemplo, um anticorpo antibactéria-X 20, conforme mostrado na figura 1A. Em uma modalidade, o anticorpo é complexado com um agente de ligação, por exemplo, com a biotina 21. Ao ligar a bactéria-X 22 ao anticorpo 20, o complexo pode ser exposto a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina 26 (figura 1B). A biotina no anticorpo pode reconhecer a estreptavidina na esfera magnética (figura 1C). Alternativamente, onde o anticorpo primário não é biotinilado, uma esfera revestida com um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo antibactéria-X pode ser usado para revestir esferas magnéticas. Ou uma esfera revestida com proteína A e/ou proteína G que reconhece o anticorpo antibactéria pode ser usada. Nesse ponto, as bactérias ligadas às esferas podem ser isoladas. Em uma modalidade, a eficiência de captura pode ser quantificada por plaqueamento das bactérias ligadas às esferas 32 e a fração do sobrenadante não ligado (figura 1D), e por contagem das colônias resultantes 34 (figura 1E).
[0064] A figura 2 mostra um experimento exemplar da captura específica de E. coli, mas não de S. typhimurim, de amostras pelo uso de anticorpos produzidos contra a E. coli intacta; as contagens de colônia são mostradas abaixo à esquerda/direita de cada placa. Nesse experimento, esferas magnéticas revestidas com estreptavidina foram usadas para isolar uma E. coli complexa ligada aos anticorpos policlonais biotinilados (coelho). Verificou-se que as E. coli estavam presentes apenas na fração da esfera, quando anticorpos de E. coli específicos estavam presentes, e que nenhuma bactéria foi recuperada na fração do sobrenadante (não ligada). Pelo contrário, S. typhimurium foi encontrada principalmente na fração do sobrenadante, quando anticorpos específicos de E. coli foram usados. Na ausência do anticorpo, ambos os tipos de bactérias foram encontrados principalmente na fração sobrenadante.
[0065] As figuras 3A e 3B mostram dados de Western blot de proteínas ribossomais capturadas de um lisado bacteriano (E. coli) contendo ribossomos dissociados com tiocianato de guanidínio 6 M e diluídos até uma solução de tiocianato de guanidínio 0,6 M. A figura 3A mostra que os anticorpos antirribossomais (IgG) marcados com esferas de estreptavidina e biotina são capazes de capturar proteínas ribossomais da solução. Pode-se observar que quando nenhum anticorpo antirribossomal é adicionado (IgG = 0), as proteínas ribossomais ("Ribo prot") não são detectadas. Também pode ser observado que 50 ng de anticorpo é capaz de ligar todas as proteínas ribossomais de 100.000 células.
[0066] A figura 3B demonstra que a adição de anticorpos antirribossomais biotinilados e de esferas de estreptavidina é suficiente para capturar, quantitativamente, todos os ribossomos presentes em solução. Nesse experimento, o lisado de células de E. coli em tampão fosfato de tiocianato de guanidina 6 M foi incubado com, ou sem, 200 ng de IgG antirribossomo biotinilado de coelho. Em seguida, esferas magnéticas de estreptavidina (SA) foram adicionadas para capturar os complexos de Ab-proteína ribossomal. O sobrenadante não ligado foi removido da fração da esfera e recapturado ("recapt") usando 200 ng de anticorpo biotinilado e esferas magnéticas SA. A ausência de proteínas ribossomais no experimento de recaptura com lisado, onde proteínas ribossomais foram anteriormente capturadas, indica que a primeira etapa de captura foi suficiente para capturar todas as proteínas ribossomais.
[0067] Em certas modalidades, a presente invenção compreende métodos e sistemas que utilizam uma pluralidade de ribossomos que estão presentes em um único microrganismo como um meio para detectar níveis baixos dos microrganismos presentes em uma amostra. Em uma modalidade, o método é usado para analisar as células bacterianas. No entanto, conforme divulgado na presente invenção, os métodos da invenção podem ser usados para medir outros tipos de micróbios que contêm ribossomos, tais como, mas sem se limitar, a fungos, micoplasmas, protozoários, leveduras e outros organismos vivos microscópicos. Assim, em determinadas modalidades da invenção, a liberação, identificação e quantificação de ribossomos são usadas para amplificar um sinal de célula de patógeno em uma amostra natural, comercial ou clínica.
[0068] Ribossomos são partículas de ribonucleoproteína compactas consistindo em duas subunidades que são compostas de proteínas contendo todos os aminoácidos e RNAs ribossomais (rRNAs). Ribossomos de bactérias, arquebactérias e eucariotos têm estruturas, proteínas e sequências de RNAr diferentes. Os ribossomos podem ser descritos em termos de suas taxas de sedimentação. Os ribossomos bacterianos geralmente sedimentam-se em cerca de 70S, enquanto que os ribossomos eucarióticos geralmente sedimentam em cerca de 80S. Os ribossomos bacterianos 70S têm duas subunidades que sedimentam em cerca de 50S e 30S, enquanto que as subunidades ribossomais eucarióticas 80S sedimentam em cerca de 60S e 40S.
[0069] A figura 4A mostra uma micrografia eletrônica de uma seção delgada de uma bactéria Bacillus subtilis, que ilustra o grande número de ribossomos (pontos eletrodensos). A célula mostrada apresenta cerca de 1 μm de diâmetro e os ribossomos apresentam cerca de ~ 0,02 μm (20 nm) de diâmetro. Apenas cerca de 1/3 do comprimento da célula é mostrado. Por exemplo, as células bacterianas, tais como E. coli, tipicamente contêm cerca de 20.000 ribossomos por célula, que é responsável por cerca de um terço a um quarto da proteína bacteriana em massa. Dessa forma, a detecção dos ribossomos bacterianos liberados após a lise celular pode proporcionar uma amplificação natural de cerca de 20.000 em relação a de uma única célula bacteriana cultivável. Para produzir a mesma amplificação das células bacterianas inteiras por procedimento de cultivo e de enriquecimento padrão, podem ser necessárias 7 horas ou mais de tempo de incubação, dependendo da taxa de crescimento da bactéria particular.
[0070] Uma micrografia eletrônica de mancha negativa dos ribossomos purificados de E. coli é mostrada na figura 4B. Embora o aparelho de tradução ribossomal da bactéria seja bastante conservado, pode haver diferença suficiente nos epítopos dos ribossomos intactos ou proteínas ribossomais isoladas para distinguir bactérias gram-negativas de bactérias gram-positivas, por exemplo, os anticorpos antirribossomais de E. coli não reconhecem e capturam proteínas ribossomais de Staphylococcus epidermidis. Pequenas diferenças nos epítopos nos ribossomos intactos de espécies diferentes podem ser exploradas, por exemplo, por absorção de soros.
[0071] Para o ensaio de ribossomos intactos, as células concentradas podem ser, em geral, lisadas com uma mistura de enzima e detergente para liberar os ribossomos. Em uma modalidade, os ribossomos podem ser isolados por adição de anticorpos biotinilados específicos do ribossomo e por captura do complexo ribossomo:anticorpo com esferas revestidas com estreptavidina magnéticas, conforme descrito na presente invenção. A presença de ribossomos indica a presença de bactérias específicas para os anticorpos utilizados na concentração celular, e a ausência de ribossomos indica a ausência de bactérias específicas para os anticorpos utilizados na concentração celular.
[0072] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção compreende um método para detectar um microrganismo de interesse que compreende as etapas de isolar o microrganismo de outros componentes na amostra; lisar o microrganismo para liberar os ribossomos presentes no microrganismo; e detectar os ribossomos, ou um constituinte dos ribossomos, em que a detecção dos ribossomos ou de um constituinte dos ribossomos indica que o microrganismo está presente na amostra. A etapa de isolar o microrganismo pode, em certas modalidades, compreender ligar o microrganismo a um agente de ligação que reconhece o microrganismo e que, como tal, é usado para sequestrar o microrganismo do restante da amostra. Por exemplo, em certas modalidades, a etapa de isolar o microrganismo pode compreender ligar o microrganismo a um agente de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fago) que está ligado a um suporte sólido ou que compreende um agente ligante (por exemplo, biotina) que reconheça um segundo agente (por exemplo, estreptavidina ou um segundo anticorpo) ligado a um suporte sólido. Por exemplo, anticorpos policlonais ou monoclonais purificados por afinidade que reconhecem as proteínas ribossomais do micróbio de interesse podem ser usados para a detecção dos ribossomos e de proteínas ribossomais.
[0073] Em outras modalidades adicionais e/ou alternativas, o sinal fornecido pela detecção dos ribossomos intactos pode ser adicionalmente amplificado pela detecção das proteínas ribossomais obtidas pela dissociação dos ribossomos intactos, por exemplo, cada ribossomo de E. coli contém 55 proteínas distintas, 34 proteínas na subunidade 50S e 21 proteínas na subunidade 30S. Por exemplo, as células isoladas de uma amostra, conforme descrito na presente invenção, podem ser lisadas e os ribossomos dissociados na mesma dissociados em moléculas proteicas individuais em uma única etapa, pela adição de um agente caotrópico (por exemplo, tiocianato de guanidínio). Cerca de um terço da massa do ribossomo é proteína, e cerca de dois terços da massa ribossomal é RNA ribossômico (rRNAs). Assim, a detecção das 55 proteínas ribossomais que constituem cada um dos 20.000 ribossomos em uma única célula bacteriana pode proporcionar uma amplificação de sinal hipotética de cerca de um 1 milhão em relação àquela de uma única célula cultivável. Além disso, as 55 moléculas de proteínas distintas de cada ribossomo terão vários epítopos (sequências de aminoácidos de comprimento limitado e composição variável, o número dependendo da massa da proteína) que podem se ligar a anticorpos específicos. Em contraste, menos epítopos da proteína são exibidos na superfície do ribossomo intacto; a maioria dos epítopos são enterrados internamente ou se ligam especificamente aos rRNAs, e não terão acesso aos seus anticorpos específicos. Dessa forma, anticorpos policlonais ou monoclonais que são específicos para proteínas ribossomais a partir do micróbio de interesse podem ser utilizados para o isolamento, detecção e quantificação dos ribossomos ou proteínas ribossomais a partir dos ribossomos dissociados.
[0074] As modalidades da presente invenção utilizam antissoro de coelho e porquinho-da-índia policlonal produzido contra os ribossomos purificados, por exemplo, de Escherichia coli, Salmonella typhimurium e Staphylococcus epidermidis. Ou os anticorpos para proteínas ribossomais de outros microrganismos podem ser usados.
[0075] Por exemplo, e como ilustrado na figura 5, em uma modalidade, um método da invenção pode compreender a etapa de recuperar e concentrar um microrganismo 102 (por exemplo, uma bactéria) de uma amostra 104 pelo uso de um substrato 106 com um agente ligante ou bacteriófago 108 específico para o microrganismo. Em uma modalidade, o agente ligante 108 é imobilizado sobre um suporte sólido 106 (por exemplo, de poliestireno, sílica ou outro suporte, como wafers, tiras de imersão, filtros ou esferas) ou é livre e, posteriormente, imobilizado em um suporte sólido. O microrganismo imobilizado pode, em seguida, ser retirado da amostra (por exemplo, por aspiração, decantação ou força magnética). O microrganismo pode, em seguida, ser lisado in situ sobre o suporte sólido e/ou liberado em um pequeno volume (por exemplo, um poço de microtitulação) 112 para posterior análise. Por exemplo, em uma modalidade, as células de microrganismo concentradas são lisadas pela adição de um pequeno volume de uma mistura de substâncias químicas e enzimas para liberar os ribossomos 114 diretamente sobre o suporte sólido e/ou em um volume menor 112, como um poço de microtitulação.
[0076] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, as proteínas ribossomais podem ser detectadas usando anticorpos antirribossomais 116 (por exemplo, a figura 5). Tal como é conhecido na técnica, os anticorpos antirribossomais primários podem ser diretamente marcados (por exemplo, com uma biomolécula fluorescente) 118, ou a ligação dos anticorpos primários aos ribossomos pode ser detectada com anticorpos secundários.
[0077] Em ainda outras modalidades dos métodos e sistemas da presente invenção, e conforme é ilustrado na figura 6, as células de microrganismo 102 em uma amostra 104 podem ser lisadas in situ (por exemplo, na amostra) pela adição de uma mistura de substâncias químicas e enzimas para liberar os ribossomos 114. Os ribossomos podem, em seguida, ser obtidos e concentrados a partir da amostra mediante o uso de um substrato 106, com um agente ligante imobilizado 122, que se liga especificamente aos ribossomos (por exemplo, um anticorpo ou outro agente ligante). Os ribossomos concentrados podem, em seguida, se dissociar nas subunidades 126 com um agente caotrópico, o agente diluído ou removido, e as proteínas individuais 126 identificadas como, por exemplo, usando um anticorpo 117 que é marcado com uma porção detectável 119. Por exemplo, as subunidades da proteína ribossomal podem ser recuperadas e concentradas por um método tal como, mas sem se limitar, ao uso de um concentrador de rotação, ou que remove o agente de dissociação, e as subunidades de proteína são identificadas conforme descrito na presente invenção.
[0078] Em modalidades alternativas, os ribossomos e/ou as proteínas ribossomais podem ser identificados por um imunoensaio padrão, ou por métodos de amplificação de imunoensaio tipo esfera-anticorpo, tais como aqueles descritos na presente invenção, ou por outros métodos bioquímicos, imunoquímicos, de imunofluorescência ou biofísicos, tal como é conhecido na técnica. Dessa forma, ensaios de ELISA, RIA ou de imunofluorescência podem ser usados para detectar e quantificar as proteínas ribossomais.
[0079] Ou, sem remover o agente de dissociação, as subunidades de proteína ribossomal podem ser depositadas sobre um substrato de ligação adequado em um método de microarranjo de proteína de fase reversa (RPPMA). Em uma modalidade, o substrato pode ser bloqueado para evitar a ligação de outras macromoléculas, e as subunidades de proteína identificadas por ligação às moléculas repórteres. Por exemplo, em um método de micromatriz de fase reversa, as proteínas desnaturadas podem ser dispostas diretamente sobre uma lâmina de vidro revestida com nitrocelulose, sondada com anticorpo primário e desenvolvida com um complexo anticorpo secundário-repórter, como um complexo anticorpo secundário biotinilado-QDot (consulte, por exemplo, Geho et al, 2007, Fluorescence-based analysis of cellular protein lysate arrays using quantum dots, 229-237, em "Quantum Dots, Applications in Biology", Methods in Molecular Biology: 374, Bruchez and Hotz, eds., Humana Press).
[0080] Em outra modalidade adicional e/ou alternativa, e conforme discutido em mais detalhes na presente invenção, os ribossomos intactos ou as moléculas de proteína ribossomal podem ser detectadas (diretamente ou sob uma ampliação de 50 a 100X) por aglutinação de esferas grandes (por exemplo, 15 μm) revestidas com anticorpos antirribossomais por concentrações ótimas de ribossomos ou de proteínas ribossomais na zona de equivalência. As sequências de RNAr sobre a superfície do ribossomo intacta podem apresentar um campo de alta carga negativa, que pode repelir os anticorpos. Em uma modalidade, essas cargas podem ser neutralizadas com pequenas moléculas básicas, tais como BAC (cloreto de benzildimetilalquilamônio). Nessa modalidade, os ribossomos, ao invés de se localizarem em um suporte sólido, podem ser dispersados em um poço de microtitulação.
[0081] Em certos aspectos, a presente invenção utiliza a alta especificidade das biomoléculas que foram acopladas a um suporte sólido para amplificar adicionalmente um sinal como um meio para detectar baixos níveis dos analitos (por exemplo, uma proteína de interesse) presente em uma amostra. Em certas modalidades, para ensaios imunoquímicos (por exemplo, ELISA ou RIA) ou de imunofluorescência, em que uma proteína a ser identificada está ligada diretamente ou por meio de anticorpos de captura a uma superfície passivada, a amplificação de sinal de cerca de 10.000 vezes pode ser alcançada.
[0082] Dessa forma, em certas modalidades, a presente invenção compreende um método para a detecção de um analito de interesse que compreende adicionar ao analito de interesse um suporte de detecção que compreende um suporte sólido, compreendendo uma pluralidade de moléculas de um agente ligante que reconhece e se liga ao analito de interesse; e detectar pelo menos parte da pluralidade das moléculas do agente ligante no suporte de detecção. Em certas modalidades, o método pode compreender ainda adicionar um suporte de captura, o qual compreende pelo menos um agente ligante ao suporte de captura que reconhece e se liga ao analito de interesse, a fim de imobilizá-lo sobre o suporte de captura. Em uma modal idade, o analito de interesse está ligado ao suporte de captura antes de interagir com o suporte de detecção. Ou o analito de interesse pode se ligar ao suporte de captura após interagir com o suporte de detecção. O método pode, em determinadas modalidades, compreender também a adição de um agente de ligação que pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente de ligação sobre o suporte de detecção. Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção é um agente ligante solúvel.
[0083] Em uma modalidade, o suporte de captura sólido pode ser um poço de ensaio (ou seja, como uma placa de microtitulação). Ou o suporte de captura sólido pode ser um local em uma matriz, ou um suporte móvel, como uma esfera. Em uma modalidade, o suporte de detecção é um suporte móvel, como uma pérola. Em determinadas modalidades, o analito de interesse pode estar em solução. Ou o analito de interesse pode ser uma proteína dentro de um microrganismo e/ou tecido, de modo que, após a fixação, as macromoléculas na célula funcionem como um suporte de captura. Por exemplo, em uma modalidade, os métodos de amplificação de imunoensaio podem ser utilizados para a detecção in situ das prot eínas.
[0084] Em uma modalidade, o suporte de detecção que compreende uma pluralidade de moléculas de um agente ligante que reconhecem especificamente o analito de interesse é adicionado em excesso a uma amostra que compreende o analito de interesse. Também em uma modalidade, o suporte de detecção compreende uma pluralidade de molécul as de uma porção detectável. Alternativamente , onde um agente ligante é usado para reconhecer a pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção, por exemplo, um anticorpo secundário, o agente ligante solúvel pode compreender uma porção detectável.
[0085] Uma variedade dos agentes ligantes pode ser usada nos métodos da invenção. Por exemplo, a pluralidade das moléculas de agente ligante ligadas ao suporte de detecção pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que reconhece o analito de interesse. Adicionalmente e/ou alternativamente, o agente ligante ligado ao suporte de captura pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que reconhece o analito de interesse. Além disso e/ou alternativamente, o agente ligante que pode especificamente reconhecer e se ligar a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção (por exemplo, anticorpo secundário) pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Ou o agente de ligação, de acordo com qualquer um dos suportes de captura ou de detecção, ou o agente de ligação que pode reconhecer e se ligar especificamente a pelo menos algumas dentre a pluralidade de moléculas do agente de ligação sobre o suporte de detecção pode compreender uma proteína que se liga a um alvo não proteico (ou seja, por exemplo, uma proteína que se liga especificamente a um analito de molécula pequena de interesse, ou um receptor que se liga a uma proteína).
[0086] Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar especificamente a pelo algumas dentre as várias moléculas de agente ligante no suporte de detecção (por exemplo, anticorpo secundário) não reconhece o agente ligante de captura usado para ligar o analito de interesse ao suporte de captura sólido.
[0087] O uso de um suporte de detecção que compreende uma pluralidade de agentes de ligação que reconhecem o analito de interesse proporciona amplificação do sinal. Em modalidades alternativas, o suporte de detecção compreende mais de 1.000, mais de 10.000, mais de 100.000, mais de 500.000 ou mais de 1.000.000 de moléculas de agente ligante específicas para o analito de interesse. Dessa forma, em modalidades alternativas, os métodos da invenção fornecem uma amplificação que varia de 1.000 a 1.000.000.000, ou de 1.000 a 100.000.000, ou de 5.000 a 10.000.000, ou de 10.000 a 1.000.000, ou de 10.000 a 500.000, ou de 50.000 a 500.000 vezes o sinal observado em um imunoensaio não amplificado padrão, que não compreende um suporte de detecção compreendendo uma pluralidade de agentes ligantes de detecção. Ou intervalos dentro dessas faixas podem ser alcançados.
[0088] O uso do suporte de detecção e/ou do suporte de captura pode compreender uma variedade de formatos.
[0089] Por exemplo, em algumas modalidades, o analito de interesse pode ser primeiramente ligado ao suporte de captura e, em seguida, deixado interagir com o suporte de detecção. Dessa forma, o método pode incluir as etapas de ligar uma pluralidade de agentes de ligação que, podem se ligar especificamente a uma proteína de interesse, a um suporte de captura. O método pode compreender ainda adicionar o analito de interesse ao suporte de captura. Em seguida, o método pode compreender adicionar um suporte de detecção que compreende uma pluralidade de agentes ligantes de detecção específicos para o analito de interesse, que se ligam ao suporte de captura, de modo que a detecção da pluralidade dos agentes ligantes de detecção fornece a amplificação do sinal.
[0090] Da mesma forma, em certas modalidades, o método pode compreender adicionar um agente ligante que pode reconhecer e se associar, especificamente, a uma pluralidade dos agentes ligantes de detecção. Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, à pluralidade dos agentes ligantes de detecção é um agente ligante solúvel. O terceiro agente ligante pode compreender uma porção detectável. Dessa forma, em algumas modalidades, a realização das etapas do método gera um complexo que compreende o suporte de captura:agente ligante de captura:analito de interesse:agente ligante de detecção:suporte de detecção:agente ligante solúvel:porção detectável.
[0091] Por exemplo, em várias modalidades, as proteínas ribossomais e/ou as proteínas do agente infeccioso (por exemplo, as proteínas do bacteriófago) do microrganismo são analisadas pelo uso de um ensaio que compreende a amplificação baseada em esfera, fornecida por um suporte de detecção, conforme descrito na presente invenção.
[0092] Dessa forma, a figura 7A ilustra um sistema de imunoensaio “sanduíche” indireto não amplificado onde os ribossomos, proteínas ribossomais ou fago da progenia (ou outras proteínas de interesse do microrganismo a ser analisado) são imobilizados em um suporte sólido e, em seguida, detectados por um anticorpo. Por exemplo, conforme ilustrado na figura 7A, as moléculas de proteína de fago da progenia 206 produzidas por lise e dissociação das células bacterianas, incluindo ribossomos, pelo tratamento com um agente caotrópico (por exemplo, tiocianato de guanidínio), ou por dissociação da progenia de fago, podem ser imobilizadas em uma superfície sólida 214 revestida com anticorpos antirribossomo ou antifago primários orientados 208 (por exemplo, de coelho). Em uma modalidade, a superfície sólida pode ser revestida com proteína A/G, e posteriormente passivada (ou seja, revestida para reduzir a ligação não específica). Alternativamente, os anticorpos podem ser covalentemente ligados à superfície sólida e à superfície passivada. Tal como é mostrado na figura 7A, os anticorpos imobilizados 208 podem reconhecer, especificamente, o ribossomo, a proteína ribossomal ou a proteína do fago de interesse 206, enquanto que outras proteínas ou biomoléculas, 202, 204 não estão ligadas. O ribossomo, a proteína ribossomal ou a proteína do fago de interesse 206 pode, em seguida, ser detectada pela adição de um segundo anticorpo primário 211 que também reconhece o ribossomo, a proteína ribossomal ou a proteína do fago de interesse. Por exemplo, o anticorpo imobilizado 208 pode ser um anticorpo antirribossomal de coelho, enquanto que o segundo anticorpo primário 211 pode ser um anticorpo antirribossomal de porquinho-da-índia. O segundo anticorpo primário pode, então, ser detectado com um anticorpo secundário (por exemplo, um anticorpo antiporquinho-da- índia) 212. Em uma modalidade, o anticorpo secundário 212 é marcado com uma porção detectável 210. Por exemplo, o anticorpo secundário pode ser marcado com uma porção fluorescente (por exemplo, QDOTS®) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre).
[0093] A figura 7B retrata um imunoensaio de amplificação baseados em esfera "sanduíche" que pode ser usado para detectar os ribossomos, as proteínas ribossomais ou as proteínas do fago da progenia (ou outras proteínas de interesse). Em uma modalidade, os ribossomos, as proteínas ribossomais ou as proteínas do fago da progenia, ou outras proteínas de interesse, são imobilizadas em um suporte sólido e, em seguida, detectadas por um anticorpo. Por exemplo, as moléculas de proteína de interesse 206 produzidas pela lise e dissociação das células bacterianas podem ser imobilizadas sobre uma superfície sólida 214 revestida com anticorpos antirribossomais ou antifagos primários orientados 208 (por exemplo, coelho). A superfície sólida pode, em determinadas modalidades, ser revestida com a proteína A/G, e posteriormente passivada (ou seja, revestida para reduzir a ligação não específica). Alternativamente, os anticorpos podem ser covalentemente ligados à superfície sólida e à superfície passivada. Semelhantemente ao ensaio não amplificado, os anticorpos imobilizados 208 podem reconhecer, especificamente, o ribossomo, a proteína ribossomal ou a proteína do fago de interesse 206, enquanto que outras proteínas ou biomoléculas, 202, 204 não estão ligadas.
[0094] Em seguida, uma esfera revestida com centenas, milhares, dezenas de milhares, ou centenas de milhares de um segundo anticorpo primário 211 que também reconhece o ribossomo, a proteína ribossomal ou a proteína do fago de interesse 206 pode ser adicionada. Por exemplo, o anticorpo imobilizado pode ser um anticorpo antirribossomal de coelho, enquanto que o segundo anticorpo primário pode ser um anticorpo antirribossomal de porquinho-da-índia. Dessa forma, o analito de interesse 206 se liga às esferas compreendendo a pluralidade de amplificação dos segundos anticorpos primários 211 que reconhecem o analito de interesse 206 ao suporte sólido 214. Por fim, um anticorpo secundário (por exemplo, um anticorpo antiporquinho-da-índia) 212 que reconhece o segundo anticorpo primário 211 é adicionado. Em uma modalidade, o anticorpo secundário 212 é marcado com uma porção detectável 210. Por exemplo, o terceiro anticorpo pode ser marcado com uma porção fluorescente (por exemplo, QDOTS®) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre). Assim, uma amplificação muito grande do sinal pode ser originada de uma única molécula de proteína.
[0095] Dessa forma, em modalidades alternativas para a detecção de um microrganismo em uma amostra, onde a dissociação dos ribossomos ou das partículas do fago da progenia às suas subunidades de proteína constituintes proporciona amplificação adicional (uma vez que cada ribossomo de Escherichia coli contém 55 proteínas, e uma partícula de bacteriófago, como T4, pode conter milhares de moléculas de proteína), o método de imunoensaio de amplificação de alto ganho pode incluir as etapas de isolar o microrganismo de outros componentes em uma amostra e dissociar os componentes macromoleculares dos microrganismos, incluindo os ribossomos no mesmo (ou desassociar a progenia do bacteriófago nos constituintes proteicos), em uma única etapa através do uso de um agente caotrópico (por exemplo, tiocianato de guanidínio 6M). O método pode adicionalmente incluir a remoção ou diluição do agente de dissociação. O método pode incluir ainda a ligação de anticorpos específicos do ribossomo primário policlonais biotinilados (ou específicos do bacteriófago) (por exemplo, produzidos em um coelho) e a captura dos complexos proteína-anticorpo por grânulos “de captura” magnéticos revestidos com estreptavidina. Em seguida, o método pode incluir ligar as esferas de “detecção” revestidas com uma pluralidade (por exemplo, dezenas de milhares) de anticorpos específicos de ribossomos específicos (ou específicos de bacteriófago), produzidos em outra espécie (por exemplo, porquinho-da-índia). Nesse ponto, o método pode incluir a etapa de ligar uma pluralidade de anticorpos secundários (por exemplo, de porquinho-da-índia anticabra) conjugados com uma porção detectável (repórter), por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, QDOTS® ou nanofibras de negro de fumo; e um ensaio pelo desenvolvimento de fluorescência ou outro sinal.
[0096] Em uma modalidade, o determinante da amplificação de alto ganho é a grande área superficial das esferas de detecção que podem permitir a ligação de um grande número de anticorpos que são específicos para o analito de interesse (por exemplo, os anticorpos específicos para o ribossomo). A área ocupada por 106 subunidades de proteínas ribossomal (o número aproximado de subunidades de proteína ribossomal obtidas por dissociação dos ribossomos em uma célula bacteriana) é pequena, e esta área deve satisfazer a acessibilidade para as esferas. Em uma modalidade, uma matriz bidimensional confluente de 106 esferas de 1 μm ocupará cerca de 1 mm2. Para um suporte de captura móvel (por exemplo, uma pérola) o número de suportes de detecção de um tamanho específico que podem se ligar pode ser limitado por efeitos estéricos. A ligação das esferas revestidas com 105 anticorpos primários por moléculas de proteína únicas e a subsequente ligação dos anticorpos secundários marcados pode ser analisada por ELISA, RIA ou imunofluorescência, proporcionando amplificação de alto ganho.
[0097] Em ainda outra modalidade, as células na amostra (ou ribossomos liberados das células na amostra pelos métodos descritos na presente invenção) podem ser concentradas por centrifugação sobre a superfície de um filtro spin de tamanho de poro adequado (tipicamente 0,45 μm para bactérias e 0,02 μm para os ribossomos). As células concentradas podem, em seguida, ser lisadas em um pequeno volume de tampão (por exemplo, ~ 20 μL), conforme descrito na presente invenção, para liberar os ribossomos. Os ribossomos (por exemplo, cerca de 20.000 de uma única célula bacteriana) podem ser transferidos da superfície do filtro para um poço de uma placa de microtitulação. Nesse ponto, os ribossomos ou as proteínas ribossomais podem ser identificados pela formação de um retículo após a adição de ~ 3.000 grandes esferas de poliestireno (normalmente de 15 a 20 μm de diâmetro) que são acopladas aos anticorpos policlonais que podem reconhecer vários epítopos nos ribossomos ou nas proteínas ribossomais. Cada esfera grande pode se ligar a ~ 107 anticorpos, e se as esferas são revestidas com a proteína G ou outra proteína que complexa com os anticorpos, estes são orientados para se uma ligação ao antígeno ideal. A formação de um retículo (aglutinação das esferas) como resultado da formação de pontes entre os ribossomos ou as proteínas ribossomais dos anticorpos antirribossomos imobilizados sobre esferas separadas pode ser rápida e pode ser visualizada diretamente sem ampliação, dependendo do tamanho e do número das esferas utilizadas, ou visualizada por microscopia óptica com ampliação de 50 a 100x. O uso de diluições em série das proteínas ribossomais irá identificar a zona de equivalência, onde as concentrações dos anticorpos ligados à esfera e moléculas de proteína são ideais para a aglutinação das esferas. Os complexos de esfera-proteína G- anticorpo agregados (agrupados) com um número conhecido de ribossomos ou proteínas ribossomais podem servir como um controle positivo, e os complexos de esfera-proteína G- anticorpo não agregados em tampão sem ribossomos ou proteínas ribossomais pode servir como um controle negativo.
[0098] A figura 8 ilustra várias modalidades alternativas de imunoensaios que podem ser usados para detectar os analitos de interesse de um microrganismo. Em certas modalidades, os ensaios fornecem amplificação baseada em esfera.
[0099] Como mostrado na figura 8A, os métodos 1a e 1b fornecem modalidades exemplificadoras de um imunoensaio não amplificado e amplificado, respectivamente, para as proteínas ribossomal e/ou de fago. Nesses ensaios, as moléculas de anticorpo biotinilado primárias e livres 230 (por exemplo, de coelho) específicas para um analito de interesse 206 (por exemplo, proteínas ribossomais ou de fago) são adicionadas a fim de e ligar às moléculas alvo em solução. As moléculas de anticorpo biotiniladas 230 podem reconhecer, especificamente, o analito de interesse 206, enquanto que outras proteínas ou biomoléculas, 202, 204, não se ligam. Nesse ponto, uma esfera (ou esferas) de “captura” revestida com estreptavidina magnética 240 (por exemplo, com cerca de um micrômetro de diâmetro) pode ser adicionada para se ligar aos complexos de anticorpo biotinilado-proteína quantitativamente. Em uma modalidade, o método pode incluir bloquear os complexos de pérola- proteína pela adição de biotina e albumina de soro bovino (BSA).
[00100] Nesse ponto, no ensaio amplificado (Método 1b), uma esfera ou esferas de “detecção” 233 revestida(s) com centenas, milhares, dezenas de milhares, centenas de milhares ou mais moléculas de um segundo anticorpo primário antirribossomo primário 211 produzidas em uma espécie diferente (por exemplo, porquinho-da-índia) é adicionada para se ligar aos epítopos abertos e desocupados sobre as moléculas de proteína ribossomal. A quantidade das segundas moléculas de anticorpo primário 211 pode ser detectada usando moléculas de anticorpo secundário (por exemplo, anticorpo antiporquinho-da-índia) 212 que reconhecem o segundo anticorpo primário 211. Em uma modalidade, as moléculas de anticorpo secundário 212 são marcadas com uma porção detectável 210. Por exemplo, o anticorpo secundário pode ser marcado com uma porção fluorescente (por exemplo, QDOTS®) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre). Assim, uma amplificação muito alta de sinal é gerada de uma única molécula de proteína devido à presença de um grande número de segundas moléculas de anticorpo primário na esfera de detecção. Em contraste e para fins de comparação, um ensaio sanduíche de imunofluorescência indireto utilizando esferas de captura, mas sem amplificação de esfera de detecção, é ilustrado no método 1a.
[00101] A figura 8B (método 2) ilustra uma forma alternativa do ensaio não amplificado do método 1a, mas onde as segundas moléculas do anticorpo primário 211 e as primeiras moléculas do anticorpo primário 230 são adicionadas simultaneamente e antes da adição da esfera ou esferas de estreptavidina 240.
[00102] A figura 8C (método 3) ilustra uma forma alternativa do ensaio amplificado do método 1b, mas onde as primeiras moléculas do anticorpo primário 230 e a esfera ou esferas de detecção 233 revestidas com as segundas moléculas de anticorpo antirribossomo primárias 211 produzidas em uma espécie diferente (por exemplo, porquinho-da-índia) são adicionadas antes da adição da esfera ou esferas de captura de estreptavidina 240 que reconhecem as primeiras moléculas do anticorpo primário 230. Em uma modalidade, isso pode promover a formação de um complexo entre o analito de interesse 206 e a esfera ou esferas de suporte de detecção 233, e as primeiras moléculas do anticorpo primário 230.
[00103] A figura 8D (método 4) ilustra uma forma alternativa do ensaio amplificado do método 1b, mas onde a esfera ou esferas de detecção 233 revestida com uma pluralidade das segundas moléculas de anticorpo antirribossomo primárias 211 produzidas em uma espécie diferente (por exemplo, porquinho-da-índia) compreende uma pluralidade de moléculas de uma porção detectável 210 como parte da esfera ou esferas de detecção 233 (por exemplo, por ligação covalente ou revestidas na superfície) ao invés de estar ligada às segundas moléculas de anticorpo antirribossomo primárias 211. A porção detectável 210 pode compreender uma porção fluorescente (por exemplo, QDOTS®) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre). Em uma modalidade, esse método pode permitir o uso de menos agentes ligantes de detecção (por exemplo, os segundos anticorpos antirribossomais primários 211) se o suporte de detecção compreende uma pluralidade de porções detectáveis. Por exemplo, a razão de porções detectáveis 210:agentes ligantes de detecção 211 no suporte de detecção pode ser igual a 1:1, 5:1, 10:1, 100:1, 500:1, 1000:1 ou 10,000:1 ou maior. A porção detectável pode compreender uma porção fluorescente (por exemplo, QDOTS®) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre).
[00104] A figura 8E (método 5) ilustra uma forma alternativa do ensaio do método 4, mas onde a esfera ou esferas de detecção 233 revestidas com as segundas moléculas de anticorpo antirribossomo primárias 211 produzidas em uma espécie diferente (por exemplo, porquinho-da-índia) e uma porção detectável 210 são adicionadas antes da adição de esfera ou esferas de estreptavidina 240 que reconhecem as primeiras moléculas do anticorpo primário 230. Em uma modalidade, isso pode promover a formação de um complexo entre o analito de interesse 206 e a esfera ou esferas de suporte de detecção 233, e as primeiras moléculas do anticorpo primário 230.
[00105] A figura 8F (método 6) ilustra uma forma alternativa do método 3, mas onde a esfera ou esferas de detecção 233 revestidas com as segundas moléculas de anticorpo antirribossomo primárias 211 produzidas em uma espécie diferente (por exemplo, porquinho-da-índia) são adicionadas antes da adição das primeiras moléculas do anticorpo primário 230 e a esfera ou esferas de estreptavidina 240 que reconhecem as primeiras moléculas do anticorpo primário 230. Em uma modalidade, isso pode promover a formação de um complexo entre o analito de interesse 206 e a esfera ou esferas de suporte de detecção 233.
[00106] A figura 9 mostra os resultados com o método 6 mostrando a detecção dos ribossomos do equivalente a 500 ou 2.000 células de E. coli. O eixo x indica o número de células bacterianas e o eixo y indica o sinal relativo a um controle sem células bacterianas.
[00107] Pode ser importante que o anticorpo secundário e/ou o segundo anticorpo primário de detecção não se ligue ao anticorpo de suporte de captura, uma vez que tal ligação poderia gerar um sinal de fundo. Dessa forma, em certas modalidades, a etapa de detecção compreende a adição de um anticorpo secundário que reconhece o agente do anticorpo primário de detecção sobre a esfera de detecção, mas em que o anticorpo secundário não reconhece o agente ligante de captura (por exemplo, o primeiro anticorpo primário) usado para ligar a proteína de interesse ao suporte de captura.
[00108] Em certas modalidades, os suportes sólidos de captura e/ou detecção podem ser tratados com um agente de passivação. Por exemplo, em determinadas modalidades, o analito de interesse pode ser capturado sobre uma superfície passivada superfície passivado (ou seja, uma superfície que foi tratada para reduzir a ligação não específica). Um tal agente de passivação é o BSA. Além disso e/ou alternativamente, onde o agente ligante utilizado é um anticorpo, os suportes sólidos de captura e/ou detecção podem ser revestidos com proteína A, proteína G, proteína A/G, proteína L ou outro agente que se liga com alta afinidade ao anticorpo do agente ligante. Essas proteínas se ligam ao domínio Fc dos anticorpos e, dessa forma, podem orientar a ligação dos anticorpos que reconhecem a proteína ou as proteínas de interesse.
[00109] Os suportes de detecção e/ou captura podem ser pérolas de poliestireno ou grânulos feitos de um material semelhante ou diferente, de modo que as pérolas podem ser revestidas com proteínas, mas que não reagem com outros componentes no ensaio. Em certas modalidades, as pérolas são suficientemente grandes de modo que uma pluralidade das moléculas do anticorpo pode ser fixadas à pérola. Por exemplo, as pérolas podem variar de tamanho de cerca de 0,1 a 50, 0,2 a 40, 0,3 a 30, 1 a 20, 1 a 15 ou cerca de 1 a 3 μm de diâmetro. O tamanho das pérolas pode depender do tamanho do ensaio a ser realizado. Para um ensaio realizado em um poço de microtitulação, pérolas de cerca de 1 micrômetro (μm) podem ser utilizadas.
[00110] Em modalidades alternativas, o suporte de detecção pode compreender uma pluralidade de agentes ligantes de detecção. Por exemplo, em modalidades alternativas, o número de agentes ligantes no suporte de detecção pode ser maior que 100, maior que 500, maior que 1.000, maior que 5.000, maior que 10.000, maior que 20.000, maior que 50.000, maior que 100.000, maior que 500.000 ou maior que 1.000.000 moléculas do agente ligante de detecção. Por exemplo, em uma modalidade, o suporte de detecção pode compreender uma pérola que é revestida com dezenas ou centenas de milhares de moléculas de anticorpo. Em modalidades alternativas, pode haver cerca de 10.000 a 10.000.000, ou cerca de 50.000 a 1.000.000, ou cerca de 100.000 a 500.000 moléculas de agente ligante (por exemplo, um anticorpo primário) para uma pérola de suporte de detecção que apresenta cerca de 15 μm de diâmetro. Para pérolas de suporte de detecção de diferentes tamanhos, uma cobertura de superfície correspondente pode ser usada. Dessa forma, em modalidades alternativas, os métodos da invenção fornecem uma amplificação que varia de 1.000 a 1.000.000.000, ou de 1.000 a 100.000.000, ou de 5.000 a 10.000.000, ou de 10.000 a 1.000.000, ou de 10.000 a 500.000, ou de 50.000 a 500.000 vezes o sinal observado em um imunoensaio não amplificado padrão, que não compreende um suporte de detecção compreendendo uma pluralidade de agentes ligantes de detecção. Ou intervalos dentro dessas faixas podem ser alcançados.
[00111] Em certas modalidades, as esferas de suporte de detecção são suficientemente grandes, de modo que uma pluralidade das moléculas do agente ligante pode se ligar à esfera. Por exemplo, as esferas podem variar de tamanho de cerca de 0,1 a 50, 0,2 a 40, 0,5 a 30, 1 a 20, 1 a 15 ou cerca de 1 a 3 μm de diâmetro. Onde o agente ligante a ser ligado à esfera é um anticorpo, esferas comercialmente disponíveis pré-revestidas com proteína G, proteína A ou proteínas A/G podem ser utilizadas, uma vez que essas proteínas se ligam ao domínio Fc dos anticorpos, orientando os anticorpos, de modo que os domínios Fab fiquem livres para se ligar aos epítopos dos antígenos.
[00112] Conforme descrito acima, um agente ligante (por exemplo, um anticorpo secundário que reconhece o segundo anticorpo primário sobre o suporte de detecção) complexado com uma enzima ou material fluorescente (QDOTS® ou outro marcador fluorescente) pode ser adicionado para se ligar ao grande número de anticorpos usados como agentes ligantes de detecção em um suporte de detecção. Ensaios imunoquímicos (por exemplo, ELISA) ou de excitação e visualização de material fluorescente em um sistema de imageamento por emissão adequado podem ser usados para quantificar a proteína. Em uma modalidade, a chave para o grande fator de amplificação de sinal proporcionado por esse método é a grande área superficial do suporte de detecção que pode acomodar a ligação dos agentes ligantes de detecção. Por exemplo, para os anticorpos, cerca de > 10.000 e > 100.000 moléculas podem ser usadas para revestir, respectivamente, esferas de 1 μm e 2,8 μm.
[00113] Em uma modalidade, os ribossomos podem ser detectados usando um ensaio de fluxo lateral (LFA) ou ensaio imunocromatográfico. Tais ensaios podem ser rápidos e fáceis de executar e podem produzir um resultado visual em até uma hora. Em uma modalidade, o ensaio pode compreender um ensaio de fluxo lateral ultrassensível (CNBS) que serve como o suporte de anticorpo e leitura de resultado (Lonnberg et al., J. Immunol. Methods, 339: 236244 (2008)).
[00114] Por exemplo, em certas modalidades, o ensaio de fluxo lateral pode compreender um suporte sólido que permite o fluxo de moléculas em uma única direção. Em uma modalidade, o suporte sólido pode compreender uma tira com um comprimento maior que a largura (figura 10A). A tira pode consistir em uma membrana (por exemplo, uma membrana de nitrocelulose ou outro tipo de substrato absorvente) e um enchimento absorvente em contato com a membrana (figura 10A). Em uma modalidade, a membrana pode conter uma linha de teste com anticorpos antirribossomais de uma primeira espécie (por exemplo, coelho) que reconhecem o analito de interesse (por exemplo, ribossomos, proteínas ribossomais, proteínas do fago) e uma linhagem de controle com anticorpos secundários que reconhecem os anticorpos da primeira espécie (por exemplo, os anticorpos anticoelho de cabra). Também são mostrados na figura 10A as nanofibras de negro de fumo 300 revestidas com um anticorpo antirribossomal 302.
[00115] Em uma modalidade, o ensaio pode ser realizado aplicando-se a amostra ao fundo da membrana ("região de aplicação de amostra") (figura 10B) e permitindo que a amostra flua, por ação capilar, por toda a superfície da membrana, como mostrado na figura 10A. O analito de interesse presente na amostra, portanto, pode interagir e se ligar com os anticorpos imobilizados na linha de teste (por exemplo, anticorpos antirribossomais para analitos do ribossomo), enquanto o resto do material na amostra continuará no enchimento absorvente. As tiras podem, em seguida, ser incubadas com nanofibras de negro de fumo pré-revestidas com anticorpos (CNBS-Ab) que também reconhecem o analito de interesse (por exemplo, os anticorpos antirribossomais de coelho). Em uma modalidade, as tiras de LFA têm anticorpos da IgG do soro total, enquanto que a IgG no CNBS-Ab é purificada por afinidade com o antígeno de interesse. Os complexos CNBS-Ab podem fluir através da superfície de nitrocelulose. Dessa forma, os complexos CNBS-Ab podem interagir com os ribossomos ligados à linha de teste. Essa interação pode ser visualizada como uma linha de cinza a preto (figura 10B). Qualquer CNBS-Ab não ligado pode continuar até a tira e se ligar à linha de controle anticoelho, que também resulta em uma linha cinza/preta (figura 10B). Se a amostra não contém proteínas ribossomais, nenhuma linha se formará na posição da linha de teste, mas uma linha se formará na posição da linha de controle.
[00116] As figuras 10C e 10D mostram a detecção de ribossomos de E. coli usando tal ensaio de fluxo lateral com nanofibra de negro de fumo revestido com anticorpos antirribossomais de coelho. Dessa forma, a figura 10 mostra a detecção de 10 ng de ribossomos usando CNBS revestido com anticorpos antirribossomais de coelho e a presença de ribossomos na amostra visto como uma linha na posição da linha de teste. A linha no controle indica que o CNBS-Ab migrou até a tira.
[00117] Em algumas modalidades, a sensibilidade do sistema CNBS-LFA pode aumentar pela diminuição da área da linha de teste, a fim de concentrar o CNBS em uma área menor, de modo a aumentar a intensidade da linha. Em outra modalidade, um complexo de anticorpo secundário CNBS que irá se ligar ao CNBS-Ab já localizado na linha de teste pode ser usado para aumentar ainda mais a intensidade do sinal. Um terceiro método pode incorporar uma enzima, por exemplo, a peroxidase de rábano silvestre (HRP) sobre o complexo anticorpo primário-CNBS, ou um complexo anticorpo secundário-CNBS, de modo que um substrato HRP pode ser adicionado diretamente à tira para aumentar a intensidade da linha, mediante conversão do substrato em um produto colorido. Além disso e/ou alternativamente, anticorpos biotinilados no CBNS podem ser utilizados juntamente com estreptavidina solúvel-HRP (SA-HRP) ou SA-HRP ligado ao CNBS, como um meio para aumentar o sinal. A figura 10 mostra um experimento usando CBNS-anticorpos antirribossomais biotinilados e desenvolvido por visualização dos CBNS-anticorpos antirribossomais biotinilados (quadro superior), bem como pela adição do CNBS complexado com estreptavidina conjugado com a peroxidase de rábano silvestre (SA-HRP-CNBS) e, em seguida, um substrato colorimétrico de peroxidase de rábano silvestre adicionado (quadro inferior). Pode-se observar que a detecção de tão pouco quanto 5 ng de ribossomos é possível, usando esse método.
[00118] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método rápido e sensível de detecção de um microrganismo em uma amostra, incluindo: colocar em contato a amostra com um agente infeccioso que é isento ou ligado a um agente ligante, que é ligado a um suporte sólido, sendo que o agente infeccioso é específico para o micróbio e, desse modo, pode isolar o micróbio da amostra. Por exemplo, em certas modalidades, o micróbio de interesse é uma bactéria, e o agente infeccioso é um ou mais bacteriófagos. Ou, para outros tipos de microrganismos, outros agentes infecciosos podem ser utilizados.
[00119] Conforme descrito acima, os bacteriófagos são vírus que se ligam a uma a bactéria específica e injetam o seu material genético. O bacteriófago, em seguida, usa a maquinaria das bactérias para se replicar uma centena ou centenas de vezes em um curto período de tempo. Alguns bacteriófagos são líticos, o que significa que eles rompem as bactérias do hospedeiro, e o fago replicado (progenia) é liberado no ambiente, a fim de procurar e infectar outras bactérias.
[00120] Adicionalmente, a maioria dos bacteriófagos são específicos para bactérias particulares, pelo fato de que a replicação de um bacteriófago específico ocorre apenas em determinadas bactérias. Portanto, a presença do bacteriófago amplificado identifica a presença da bactéria, para a qual ele é específico. Além disso, uma vez que os bacteriófagos podem infectar uma bactéria e produzir o fago da progenia em uma hora ou menos, o tempo de detecção é significativamente reduzido em comparação com a detecção de uma célula cultivável.
[00121] Pode-se determinar se o e o bacteriófago infectou as bactérias por um ensaio que pode identificar a presença da progenia do bacteriófago, ou do marcador bacteriófago, ou um marcador bacteriano que é detectado após a infecção com o fago original ou o fago da progenia. Em uma modalidade, o ensaio não só pode identificar o bacteriófago, o marcador bacteriófago e/ou o marcador bacteriano, mas também a quantidade ou concentração do bacteriófago, do marcador bacteriófago ou do marcador bacteriano.
[00122] Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção fornece um ensaio baseados em bacteriófago ultrassensível para a rápida detecção e quantificação dos patógenos bacterianos. Em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para detectar uma bactéria que compreende as etapas de: isolar pelo menos uma bactéria dos outros componentes na amostra e infectar a pelo menos uma bactéria com bacteriófago. O método pode compreender também a etapa de remover a maior parte do fago inserido não absorvido. O método também pode incluir a etapa de incubar a célula infectada para promover a replicação do fago e a lise da célula para liberar o fago da progenia e detectar o bacteriófago da progenia, ou um constituinte do bacteriófago da progenia dissociado, sendo que a detecção do bacteriófago ou de um constituinte do bacteriófago (ou seja, um marcador bacteriófago) indica que a bactéria está presente na amostra. O método pode compreender ainda remover o fago de entrada restante antes de detectar o fago da progenia.
[00123] Outras modalidades descritas na presente invenção utilizam o fago da progenia e/ou bactérias marcadas com uma porção detectável para facilitar a detecção das bactérias infectadas. Por exemplo, o fago da progenia pode compreender um gene que codifica uma biomolécula detectável, como a proteína luciferase. Em uma modalidade alternativa, o fago da progenia pode ser quantificado através de infecção de bactérias indicadoras, que compreendem uma biomolécula marcadora, como a proteína luciferase (por exemplo, bactérias que compreendem um plasmídeo que codifica tal biomolécula marcadora podem ser utilizadas).
[00124] O uso das bactérias indicadoras para analisar as células de amostra através da detecção do fago da progenia das células indicadoras lisadas é representado na Figura 11. Dessa forma, nesse ensaio, os fagos parentais utilizados para infectar uma amostra bacteriana de interesse são separados do fago da progenia, e então, os fagos da progenia são usados para infectar as bactérias indicadoras manipuladas para expressar uma biomolécula que fornece um sinal detectável após a lise das bactérias. Por exemplo, as bactérias podem ser manipuladas por transfecção com um plasmídeo que codifica uma proteína luciferase.
[00125] Por exemplo, nesses experimentos, uma cultura de células indicadoras 401 (por exemplo, bactérias que expressam a proteína luciferase) é cultivada. Entretanto, pelo menos uma parte da amostra que compreende as bactérias a serem quantificadas 400 são filtradas por rotação para remover o meio, e uma multiplicidade adequada do fago biotinilado 406 (por exemplo, fago T4) adicionado (o fago 406 em excesso pode ser removido por lavagem por centrifugação) e deixado para incubar por tempo suficiente para infectar e, subsequentemente, lisar as bactérias para liberar o fago da progenia. O lisado resultante 411 pode, em seguida, ser coletado, por exemplo, por centrifugação, e o filtrado 410 contendo o fago da progenia e o fago parental biotinilado transferido para um suporte 412 compreendendo estreptavidina 414 (por exemplo, colunas de estreptavidina) para separar o fago parental biotinilado restante dos fagos da progenia 416, que não são biotinilados. Em seguida, as células indicadoras 401 que produzem uma porção detectável 403 (ou seja, bactérias que expressam a proteína luciferase) são adicionadas aos fagos da progenia 416, os quais podem infectar as bactérias. As células indicadoras infectadas podem ser incubadas por um período suficiente para gerar um fago adicional e para que a lise possa ocorrer. O nível de porção detectável 403 (por exemplo, luciferase) liberada das bactérias indicadoras infectadas pode ser, então, quantificado utilizando um luminômetro 418 ou outros métodos de detecção apropriados (por exemplo, um fluorímetro para uma proteína fluorescente).
[00126] Dados dos experimentos dos exemplos usando esse ensaio são mostrados nas figuras 12A a E.
[00127] As figuras 12A a C mostram dados separados da primeira e segunda metades do método descrito na Figura 11. As figuras 12D e 12E mostram os dados do ensaio completo.
[00128] A figura 12A mostra que apenas 1 a 2 células de E. coli podem fornecer uma concentração de unidades formadoras de placa (PFU) mensurável (ou seja, de cerca de 300 a 460 PFU) do fago da progenia através do ensaio de placa. Os pontos próximos de 0 PFU (até cerca de 60 PFU) no eixo y são provavelmente devido ao fato de nenhuma célula ter sido depositada sobre o filtro por acaso, uma vez que é provável que, em uma média de 1 célula por amostra, haja efetivamente 0 célula.
[00129] A figura 12B mostra que o ensaio de fago demonstra uma resposta dose-dependente às células da amostra de entrada, aumentando no fago da progenia a produção de mais células na amostra. Ambas as figuras 12A e 12B são representadas graficamente contra concentrações celulares determinadas a partir do ensaio de unidade formadora de colônia (UFC) de um dia para o outro padrão, demonstrando dessa forma uma sensibilidade semelhante, em uma velocidade inerentemente mais rápida de um ensaio de placa, que pode ser visualizado em menos de 8 horas.
[00130] A figura 12C mostra a detecção dos fagos que são o equivalente a uma única célula (ou seja, 100 fagos) ou 27 células (ou seja, 2700 fagos) usando a segunda metade do método usando a lise das células indicadoras descritas na Figura 11. Isto demonstra que, quando combinado, o ensaio de fago completo deve ser capaz de detectar apenas 1 célula por amostra.
[00131] A figura 12D mostra a detecção de 1, 5 e 7 células de amostra (por exemplo, E. coli) em comparação com um ensaio de UFC padrão (a linha pontilhada indica o nível de fundo). A figura 12E mostra a detecção bem sucedida de 100 a 10.000 células bacterianas (determinado microscopicamente) por amostra usando o ensaio de fago completo (a linha indica o nível de fundo). Demonstrando, dessa forma, a sensibilidade de 1 a 10.000 células sem diluição da amostra. Isso é 1 ou 2 ordens de grandeza mais sensível do que um ensaio de UFC de um dia para o outro padrão, onde mais de 500 a 700 UFC não podem ser contadas de modo confiável em uma placa de Petri, além de ser um ensaio muito mais rápido, realizado em cerca de 3 horas.
[00132] Da mesma forma, em algumas modalidades, o ensaio pode compreender a detecção dos ribossomos liberados das bactérias indicadoras. Nesse formato, o ensaio pode, então, tirar vantagem da amplificação proporcionada pelo fago da progenia, bem como da amplificação proporcionada pelo grande número de ribossomos presentes em uma única célula bacteriana.
[00133] A estratégia de usar o fago indicador é mostrada na figura 13. Nesse método, uma proteína de capsídeo do fago é transgenicamente fundida com a luciferase, de modo que as partículas da progenia separadas do fago de entrada parental biotinilado na coluna de estreptavidina contêm luciferase (ou outra porção de detecção) e podem ser quantificadas diretamente.
[00134] Conforme ilustrado na figura 13, nesse método pelo menos parte da amostra 500 que compreende as bactérias a serem quantificadas 502 são filtradas por rotação para remover o meio, e uma multiplicidade adequada do fago biotinilado 504 (por exemplo, fago T4) adicionado (o fago 504 em excesso pode ser removido por lavagem por centrifugação) e o fago parental remanescente é deixado incubar por tempo suficiente para infectar e lisar as bactérias 511 para liberar o fago da progenia. O lisado resultante 510 pode, em seguida, ser coletado, por exemplo, por centrifugação, e o filtrado contendo o fago da progenia e o fago parental transferido para um suporte 412 compreendendo estreptavidina 414 (por exemplo, colunas de estreptavidina) para separar o fago parental biotinilado restante dos fagos da progenia 516, que não são biotinilados. O nível de luciferase presente e ativa como uma proteína de fusão com a proteína de capsídeo Soc no fago da progenia indicador 516 pode, então ser quantificado utilizando um luminômetro 418. Por exemplo, cerca de 100 a 200 fagos da progenia por célula, cada um compreendendo cerca de 900 cópias da proteína luciferase-capsídeo, produz cerca de 200.000 cópias de luciferase.
[00135] A estratégia do uso do fago indicador que produz luciferase solúvel é mostrada na figura 14. Nesse método, os fagos (por exemplo, o fago T4) são projetados para expressar um luciferase solúvel durante a replicação, ao invés da fusão proteína capsídeo-luciferase. A expressão da luciferase é impulsionado por um promotor de capsídeo viral (por exemplo, o promotor Soc no bacteriófago T4), produzindo uma alta expressão. O fago parental será isento de luciferase, de modo que qualquer luciferase detectada no ensaio deve ser proveniente da replicação do fago da progenia liberado a partir das células bacterianas. Assim, não há necessidade de separar o fago parental do fago da progenia.
[00136] Nesses experimentos, pelo menos parte da amostra 600 compreendendo as bactérias 602 a serem quantificadas é filtrada por rotação para remover o meio, e uma multiplicidade apropriada de fago T4 biotinilado que expressa a luciferase, ao invés da proteína de capsídeo Soc 604, é adicionada. O fago parental 604 e da progenia 616 no filtrado da bactéria infectada 611 pode ser, em seguida, coletado, por exemplo, por centrifugação, e o nível de luciferase quantificado usando um luminômetro 418.
[00137] Dessa forma, em certas modalidades, a presente invenção faz uso tanto a alta especificidade fornecida por agentes infecciosos quanto da amplificação proporcionada pela replicação de agentes infecciosos como um meio para detectar níveis baixos de um microrganismo presente em uma amostra. Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção compreende métodos e sistemas que utilizam a especificidade dos bacteriófagos para o isolamento de bactérias de uma amostra e/ou a amplificação proporcionada pelo bacteriófago da progenia para a detecção de uma bactéria em uma amostra. Por exemplo, a identificação dos constituintes da proteína (por exemplo, o fago lítico T4 de Escherichia coli tem cerca de 2500 subunidades proteicas) do fago da progenia 200 de cada célula infectada pode produzir uma grande amplificação em relação aos métodos dependentes do isolamento e identificação de uma única célula cultivável.
[00138] Dessa forma, as modalidades da presente invenção incluem o uso de um ensaio baseado em bacteriófago ultrassensível para a rápida detecção e quantificação dos patógenos bacterianos. Por exemplo, o método pode compreender as etapas de: concentrar as bactérias de uma amostra em um filtro bacteriológico (por exemplo, com tamanho de poro igual a 0,45 μm); infectar a bactéria com bacteriófago biotinilado; lavar o fago inserido não absorvido através do filtro; Incubar a célula infectada para replicação do bacteriófago e lise celular; e remover o fago biotinilado de entrada restante do lisado usando purificação por estreptavidina (por exemplo, uma coluna spin ou outro suporte sólido).
[00139] A remoção eficiente do fago inserido não absorvido pode ser essencial para quantificar a progenia de fago. A incapacidade para remover ou desativar seletivamente o bacteriófago inserido não absorvido pode evitar a quantificação das partículas da progenia, e esse tem sido um impedimento importante nos métodos de detecção bacterianos baseados em bacteriófago. O bacteriófago da progenia na amostra pode ser quantificado por plaqueamento e contagem de placa (ensaio PFU), ou pelo uso de bactérias indicadoras ou fagos indicadores, ou do imunoensaio de amplificação de alto ganho descrito na presente invenção. A presença do bacteriófago da progenia indica a presença de uma célula bacteriana específica para o bacteriófago na amostra e a ausência do bacteriófago da progenia indica a ausência de uma célula bacteriana específica para o bacteriófago na amostra.
[00140] Em outra modalidade, o método pode incluir colocar em contato a amostra com agentes infecciosos que são ligados a um suporte sólido ou outro agente de ligação (por exemplo, bacteriófagos biotinilados que estão ligados a uma esfera magnética revestida com estreptavidina), em que os bacteriófagos são específicos para a célula bacteriana; incubar a amostra sob condições eficazes para o bacteriófago imobilizado sobre o suporte sólido infectar a célula bacteriana; isolar o complexo célula infectada- bacteriófago-suporte sólido; incubar, para fins de replicação do fago e lise celular, resultando na liberação do fago da progenia progênie que não se liga ao suporte sólido e que, portanto, pode ser distinguido do fago de entrada imobilizado usado para infectar a bactéria; remover o suporte sólido com o bacteriófago inserido em excesso ligado e os complexos de envelope bacteriófago-célula; passar o lisado através de uma coluna spin de estreptavidina para eliminar qualquer fago biotinilado de entrada remanescente; e quantificar o fago da progenia pelos métodos descritos na presente invenção. Novamente, a presença do bacteriófago da progenia indica a presença de uma célula bacteriana específica para o bacteriófago na amostra e a ausência do bacteriófago da progenia indica a ausência de uma célula bacteriana específica para o bacteriófago na amostra.
[00141] Para a detecção de uma determinada célula bacteriana, os bacteriófagos que são capazes de infectar a célula bacteriana, de se replicar dentro da célula bacteriana lisá-la podem ser selecionados. Para qualquer determinada célula bacteriana, uma grande variedade de bacteriófagos é disponível, por exemplo, junto à ATCC (cerca de 500 fagos) ou pelo isolamento de fontes naturais que abrigam as células hospedeiras. O bacteriófago deve também apresentar especificidade para a célula bacteriana. Um bacteriófago é específico para uma célula bacteriana quando ele a infecta, mas não infecta células bacterianas de outras espécies ou cepas. Para a detecção de uma célula bacteriana específica, ser possível selecionar também o bacteriófago que fornece uma dimensão de reforço ideal ou máxima.
[00142] Onde um bacteriófago é usado tanto para o isolamento das bactérias quanto para a amplificação da detecção das bactérias, o intervalo de células bacterianas que pode ser detectado pela presente invenção é limitado apenas pela disponibilidade de um bacteriófago específico para a célula bacteriana, e será considerado como sendo amplo para as pessoas versadas na técnica. Por exemplo, uma lista de tipos de fagos disponíveis junto à ATCC é publicada por eles, como o Catalogue of Bacteria & Bacteriophages, e está disponível na internet em atcc.org. Outros depositários como esse também publicam dados equivalentes em seus catálogos, e isso pode ser usado para identificar possíveis reagentes bacteriófagos para os métodos da presente invenção.
[00143] O tempo reacional total para a infecção do fago de uma bactéria, multiplicação ou amplificação do fago na bactéria, através da lise da bactéria, pode levar desde dezenas de minutos até horas, dependendo do fago e da bactéria em questão, e das condições ambientais. Uma vez que a bactéria é lisada, os fagos da progenia são liberados para o ambiente, juntamente com todo o conteúdo da bactéria. O fago da progenia pode infectar outras bactérias que estão presentes e repetir o ciclo para criar mais fagos e mais fragmentos bacterianos. Dessa forma, o número de fagos aumentará exponencialmente, até não haver, essencialmente, mais bactérias para infectar.
[00144] O bacteriófago tem a capacidade de apresentar especificidade, além da capacidade de produzir uma quantidade substancial de progenia em um curto período de tempo. E a replicação do bacteriófago denota uma célula hospedeira viva. Sob condições de infecção e meio de crescimento de hospedeiro ideais, uma combinação de fago/bactéria dá origem a um número consistente de progenia de fago. Geralmente, o ciclo de infecção lítica produz 100 ou mais partículas do fago da progenia a partir de uma única célula infectada em cerca de meia hora a 1 hora. Em um ensaio, pode ser necessário incluir padrões de comparação de controle, feitos no mesmo meio, com um número conhecido de fagos infectando números conhecidos de células alvo ligadas ao substrato.
[00145] A presença do bacteriófago da progenia e/ou de ribossomos isolados de um microrganismo também pode ser determinada por outros métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o bacteriófago da progenia pode ser detectado por métodos de ensaio de placa convencionais ou por tecnologias automatizadas, incluindo, por exemplo, classificadores de células, tais como separadores de células ativados por fluorescência (FACS).
[00146] O bacteriófago da progenia também pode ser detectado por visualização direta (Anderson et al., (US 2004/0137430, cuja divulgação é incorporada por referência na presente invenção). Tal visualização direta pode utilizar microscopia óptica ou de fluorescência. Corantes ou enzimas que podem ser utilizados incluem, mas não e limitam, à sonda fluorescente Alexa Fluor (disponível junto a Life Technologies/Molecular Probes, Grand Island, NY), Cy3, isotiocianato de fluoresceína, tetrametilrodamina, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, glicose oxidase ou qualquer outro marcador conhecido na técnica. Alternativamente um sistema a laser pode ser usado para detectar bacteriófagos marcados. Outros métodos de detecção incluem a detecção da adenilato quinase, consulte Murphy et al., pp. 320-322 de Bioluminescence and Chemiluminesence in Medicine and Disease, Clinical Chemistry and Microbiology, e a detecção usando um ensaio de detecção de nucleação em gelo bacteriano de base binomial, consulte Irwin et al, Journal of AO AC international 83:1087-95 (2000). Ou, para algumas modalidades, o bacteriófago da progenia também pode ser detectado por métodos utilizando bioluminescência, detectando a expressão de um gene da luciferase clonado no genoma bacteriófago, conforme descrito nas figuras 12 e 13, ou incorporado em bactérias indicadoras, conforme indicado na figura 11. Consulte, por exemplo, Loessner et al., Applied and Environmental Microbiology 62(4):1133-1140 (1996).
[00147] Da mesma forma, nanocristais de QUANTUM DOTS (também referidos na presente invenção como "QDOTS®), fabricados por Life Technologies/Molecular Probes, podem ser utilizados nos métodos da presente invenção para detectar imunocomplexos, por exemplo, como para a detecção de proteínas ribossomais ou proteínas do fago liberadas das células bacterianas. QDOTS® são nanocristais que apresentam um número de características favoráveis em relação aos corantes fluorescentes convencionais. Ao contrário dos corantes fluorescentes, os nanocristais QDOTS® fotobranqueiam muito mais lentamente e fluorescem com muito mais brilho. Devido à matriz de diferentes tamanhos disponíveis, os nanocristais QDOTS® englobam um espectro óptico mais amplo (ou seja, diferentes tamanhos emitem cores diferentes), permitindo assim a detecção de organismos diferentes na mesma amostra. Os nanocristais QDOTS ® são fabricados com a mesma química de conjugação, proporcionando desse modo um comportamento consistente em vários ambientes de ensaio. Atualmente, nanocristais QDOTS® são disponíveis como vários conjugados diferentes, incluindo estreptavidina, proteína A e biotina. Em algumas modalidades da presente invenção, conjugados de estreptavidina podem ser utilizados para fluorescer o bacteriófago da progenia ou ribossomos, ou duas proteínas constituintes através de um complexo QDOTS®-estreptavidina- biotina-anticorpo, ou os QDOTS® podem ser conjugados diretamente com os anticorpos. Os conjugados de estreptavidina são extremamente brilhantes, proporcionam excelente fotoestabilidade e têm uma única fonte de excitação.
[00148] Cada uma das modalidades dos métodos e sistemas da invenção pode possibilitar a rápida detecção e quantificação dos micróbios em uma amostra. Por exemplo, alguns dos métodos de acordo com a presente invenção podem ser realizados, mais preferencialmente, em cerca de duas horas ou menos.
[00149] Os micróbios detectados pelos métodos e sistemas da presente invenção incluem patógenos que são de interesse comercial, clínico ou veterinário. Tais patógenos incluem bactérias gram-negativas, bactérias gram-positivas, micoplasma e vírus (proteínas de vírus apenas, uma vez que os vírus não têm ribossomos). Qualquer micróbio para o qual um agente ligante que é específico para o micróbio particular foi identificado pode ser detectado pelos métodos da presente invenção. As pessoas versadas na técnica perceberão que não há nenhum limite para a aplicação dos métodos presentes além da disponibilidade dos pares de agente ligante específico/micróbio necessários.
[00150] As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, mas não se limitam, às células bacterianas que são patógenos provenientes de alimentos ou água. As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, mas não se limitam, a todas as espécies de salmonela, todas as espécies de Escherichia coli, incluindo, mas sem se limitar, a E. coli 0157/H7, todas as espécies de Listeria, incluindo, mas sem se limitar, a L. monocytogenes, e todas as espécies de Campylobacter:células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, mas não se limitam, às células bacterianas que são patógenos de importância clínica ou veterinária. Tais patógenos incluem, mas não se limitam, ao Bacillus spp., Bordetella pertussis, Camplyobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Clostridium perfringens, Enterobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, e Streptococcus spp.
[00151] A amostra pode ser ambiental, ou amostras de alimentos ou água e amostras clínicas ou veterinárias. As amostras podem ser líquidas, sólidas ou semissólidas. As amostras podem ser swabs de superfícies sólidas. As amostras podem incluir materiais do ambiente, tais como amostras de água, ou os filtros de amostras de ar ou amostras de aerossol dos coletores de ciclone. As amostras podem ser de carne bovina, carne de aves, alimentos processados, leite, queijo ou outros produtos derivados do leite. Amostras clínicas ou veterinárias incluem, mas não se limitam, a sangue, escarro, líquido cefalorraquidiano e amostras fecais, e diferentes tipos de swabs.
[00152] As amostras podem ser usadas diretamente nos métodos de detecção da presente invenção, sem preparação ou diluição. Por exemplo, amostras líquidas incluindo, mas sem se limitar, a leite e sucos, podem ser analisadas diretamente. As amostras podem ser diluídas ou suspensas em solução, que pode incluir, mas sem se limitar, a uma solução tamponada ou um meio de cultura bacteriano. Uma amostra que é um sólido ou semissólido pode ser suspensa em um líquido por trituração, mistura ou maceração do sólido no líquido. Uma amostra deve ser mantida dentro de uma faixa de pH que promove a ligação do bacteriófago à célula hospedeira bacteriana. Uma amostra também deve conter as concentrações adequadas de cátions divalentes e monovalentes, incluindo, mas sem se limitar, aos cátions Na+, Mg2+ e K+. Preferencialmente, uma amostra é mantida a uma temperatura que mantém a viabilidade de quaisquer células patogênicas contidas dentro da amostra.
[00153] De preferência durante os ensaios de detecção, a amostra é mantida a uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula de agente patogênico presente na amostra. Durante as etapas nas quais os bacteriófagos estão se ligando às células bacterianas, é preferível manter a amostra a uma temperatura que facilita a ligação do bacteriófago. Durante as etapas nas quais o bacteriófago está se replicando dentro de uma célula bacteriana infectada ou lisando tal célula infectada, é preferível manter a amostra a uma temperatura que promove a replicação do bacteriófago e a lise do hospedeiro. Tais temperaturas são iguais a pelo menos cerca de 25 graus Celsius (C), mais preferencialmente não superiores a cerca de 45 graus C, mais preferencialmente iguais a cerca de 37 graus C. Também é preferível que as amostras sejam submetidas para à mistura ou agitação suave durante a ligação do bacteriófago, replicação e lise celular. Em outras modalidades, o conjunto do fago pode ser inibido após infecção, de modo que as subunidades das proteínas do fago se acumulam desmontadas e podem proporcionar uma amplificação adicional do fago da progenia.
[00154] Ensaios podem incluir várias amostras de controle apropriadas. Por exemplo, as amostras de controle não contendo bacteriófagos ou amostras de controle contendo bacteriófagos sem bactérias podem ser analisadas como controles para os níveis de sinal de fundo.
[00155] Os substratos a serem usados nos métodos incluem, mas não se limitam, a poliestireno simples ou esferas magnéticas (Spherotech, Libertyville, IL; Life Technologies/Invitrogen, Grand Island, NY; Polyscience, Niles, FL; Thermo Scientific Pierce, Waltham MA; EMD Millipore, Billerica, MA; New England Biolabs, Ipswich, MA), e esferas de sílica magnéticas ou simples (AmsBio, Lake Forest, CA), revestimentos de tintas látex, um filtro de membrana, um filtro de fibra, uma fibra livre ou um substrato sólido poroso. Métodos para o uso de esferas magnéticas podem ser encontrados, por exemplo, com o folheto da embalagem do produto de proteína G Dynabeads No. 10003D, em Kala et al., Analytical Biochemistry 254:263-266 (1997) e em Dutton, Genetic Engineering News, Volume 22 (13), de julho de 2002.
[00156] Um amplo espectro de partículas, particularmente de esferas magnéticas e de poliestireno, é comercialmente disponível em uma ampla gama de tamanhos. Para certas modalidades, um conjunto preferencial de partículas tem um diâmetro médio da partícula de cerca de um micrômetro (ou seja, um mícron). Para algumas modalidades, em particular em ensaios de aglutinação, um conjunto preferencial de partículas tem um tamanho de partícula médio (ou seja, a maior dimensão das partículas) não maior que vinte micrômetros (ou seja, mícrons).
[00157] Para certas modalidades, por exemplo, recuperação de microrganismos, ribossomos, bacteriófagos ou seus constituintes, a concentração de partículas (por exemplo, esferas) é preferencialmente igual a pelo menos 108 por mililitro. Para certas modalidades, a concentração de partículas (por exemplo, esferas), preferencialmente, não é maior que 109 por mililitro.
[00158] Para certas modalidades, por exemplo, aglomeração de partículas pelos ribossomos, bacteriófagos ou seus constituintes, o número de partículas (por exemplo, esferas) é preferencialmente igual a pelo menos 300 partículas e não superior a 3.000 partículas (por exemplo, esferas) em 10 a 20 μL. Nas modalidades envolvendo a visualização dos microrganismos ou vírus ligados às esferas, esse número de partículas (por exemplo, esferas) permite a avaliação sob microscopia óptica em uma matriz bidimensional, sem empilhamento.
[00159] Esferas simples ou magnéticas comercialmente disponíveis exemplares incluem esferas de poliestireno revestidas com proteína G, proteína A, proteínas A/G, epóxi ou estreptavidina, todas disponíveis junto à Invitrogen, Grand Island, NY, ou de Spherotech, Libertyville, 111. MagSi, esferas de sílica magnéticas com esses mesmos revestimentos, estão disponíveis junto a AmsBio, Lake Forest, CA.
[00160] As modalidades da invenção também incluem sistemas (por exemplo, kits) para realizar os métodos da invenção.
[00161] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção compreende um kit que compreende componentes para detectar um microrganismo de interesse que compreende: um componente para isolar o microrganismo de outros componentes na amostra; um componente para lisar o microrganismo para liberar os ribossomos presentes no microrganismo; e um componente para detectar os ribossomos, ou um constituinte dos ribossomos, em que a detecção dos ribossomos ou de um constituinte dos ribossomos indica que o microrganismo está presente na amostra.
[00162] Uma variedade de microrganismos pode ser detectada usando os kits da invenção. Em uma modalidade, o microrganismo compreende pelo menos um dentre uma bactéria, um fungo ou levedura.
[00163] Em uma modalidade, o componente que isola o microrganismo compreende um agente ligante que reconhece e se liga ao microrganismo. O agente de ligação pode se ligar a um suporte sólido. Em uma modalidade, o agente ligante pode ser um anticorpo. Ou onde o microrganismo é uma bactéria, o agente de ligação pode ser um bacteriófago específico para a bactéria.
[00164] Em uma modalidade, o kit pode compreender um anticorpo primário que reconhece os ribossomos, e pelo menos um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário. Ou o kit pode compreender um anticorpo primário que reconhece os ribossomos, e pelo menos um segundo anticorpo primário que reconhece os ribossomos. Em certas modalidades, o segundo anticorpo primário está ligado a um suporte sólido. Em ainda outras modalidades, o suporte sólido compreende uma pluralidade de segundos anticorpos primários.
[00165] Em outras modalidades, os ribossomos podem ser detectados usando um ensaio de fluxo lateral. Por exemplo, em uma modalidade, o kit pode compreender um suporte sólido que compreende anticorpos antirribossomais. Em uma modalidade, o kit pode compreender pelo menos uma nanofibra de negro de fumo que compreende anticorpos antirribossomais adicionais.
[00166] Em outra modalidade, a invenção compreende um kit que compreende componentes para detectar um microrganismo de interesse, que compreende: um componente para isolar pelo menos um microrganismo de outros componentes na amostra; um componente para infectar pelo menos um microrganismo com uma pluralidade agentes infecciosos parentais; um componente para lisar o pelo menos um microrganismo infectado para liberar agentes infecciosos da progenia presentes no microrganismo; e um componente para detectar os agentes infecciosos da progenia, sendo que a detecção do agente infeccioso ou um constituinte do agente infeccioso indica que o microrganismo está presente na amostra. Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago.
[00167] Os kits podem compreender uma variedade de componentes para a detecção de agentes infecciosos da progenia. Por exemplo, em uma modalidade, o agente infeccioso da progenia (por exemplo, bacteriófago) pode compreender uma porção indicadora. Em uma modalidade, a porção indicadora no agente infeccioso da progenia pode compreender a luciferase fundida a uma proteína estrutural (por exemplo, proteína de capsídeo do fago). Em uma modalidade, a porção indicadora no agente infeccioso da progenia (por exemplo, bacteriófago) pode ser uma porção detectável que é expressa durante a replicação, tal como uma proteína luciferase solúvel. Em uma modalidade alternativa, o kit pode compreender um microrganismo indicador (por exemplo, bactérias) que compreendem uma proteína que é liberada mediante a lise dos microrganismos indicadores quando infectados com agentes infecciosos da progenia. Em uma modalidade, a liberação da proteína do microrganismo indicador pode compreender uma porção detectável. Por exemplo, em uma modalidade, a proteína liberada é uma proteína luciferase. Em uma modalidade alternativa, o kit pode compreender componentes, de modo que o agente infeccioso da progenia das amostras infectadas e/ou células indicadoras pode ser detectado pelo ensaio de fluxo lateral com nanofibras de negro de fumo. Ou a proteína libertada do microrganismo indicador pode compreender ribossomos. Dessa forma, o kit combina a amplificação fornecida pela infecção do bacteriófago com a amplificação proporcionada pela detecção do ribossomo.
[00168] Os kits da invenção podem compreender reagentes para o isolamento de bactérias a partir de uma amostra.
[00169] Por exemplo, em certas modalidades, o kit pode compreender um anticorpo específico para os microrganismos de interesse. O anticorpo pode, em certas modalidades, compreender um primeiro agente ligante que pode ser reconhecido por um segundo agente ligante, de modo que o microrganismo possa ser isolado pela interação dos agentes ligantes. Por exemplo, em certas modalidades, o kit pode compreender anticorpos biotinilados que reconhecem um microrganismo de interesse e esferas revestidas com estreptavidina.
[00170] Em modalidades alternativas, o kit pode compreender um fago específico que pode estar ligado a um agente ligante imobilizado tal como, mas sem se limitar, a: estreptavidina; biotina; um anticorpo que se liga especificamente ao bacteriófago ou a uma subestrutura do bacteriófago, tal como a cabeça. Em uma modalidade, o agente ligado ao bacteriófago é usado para ligar o fago a um suporte sólido. Por exemplo, em uma modalidade, o kit pode compreender um fago biotinilado específico para uma bactéria de interesse. Dessa forma, o fago biotinilado pode se ligar a uma esfera magnética com estreptavidina. Em modalidades alternativas, bacteriófagos, fagos, micobacteriófagos (tais como TB e paraTB), micófagos (tais como para fungos), fagos de micoplasma e qualquer outros vírus que pode invadir bactérias vivas, fungos, micoplasma, protozoários, leveduras e outros organismos vivos microscópicos podem ser acoplados a um suporte sólido para o isolamento de um micróbio de interesse. Como exemplo, os fagos bem estudados de E. coli incluem T1, T2, T3, T4, T5, T7 e lambda; outros fagos de E. coli disponíveis na coleção ATCC incluem phiX174, S13, Ox6, MS2, phiV1, fd, PR772 e ZIK1.
[00171] Em certas modalidades, os kits podem compreender reagentes para a detecção dos ribossomos e/ou proteínas ribossomais de um micróbio de interesse. Por exemplo, em uma modalidade, o kit pode compreender antissoros policlonais produzidos em coelhos, camundongos, porquinhos-da-índia ou similares, por exemplo, contra os ribossomos purificados de E. coli ou Salmonella spp, ou uma célula de mamífero.
[00172] Um kit LFA para a detecção de proteínas ribossomais pode incluir tiras de amostra que contendo os anticorpos adequados a ambas as linhas de teste e controle. Tais kits também podem incluir nanofibras de negro de fumo ligadas aos anticorpos específicos para o analito de interesse. O kit também pode incluir um tampão de análise e/ou quaisquer reagentes necessários para a diluição da amostra ou outros reagentes. Reagentes adicionais podem incluir materiais para servir como controles e reagentes para a amplificação de sinal adicional. Por exemplo, o kit pode incluir um CNBS-Ab secundário (ou seja, um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário para o analito de interesse). O kit também pode incluir reagentes de detecção enzimáticos, tais como a peroxidase de rábano silvestre (HRP) e/ou substratos da HRP. Um reservatório de tamanho adequado para a realização do ensaio também pode ser incluído nos kits da invenção.
[00173] Para as técnicas de detecção baseadas em fago, qualquer um dos fagos comercialmente disponíveis pode ser usado para gerar os reagentes para os kits da invenção. Por exemplo, uma lista de tipos de fagos disponíveis junto à ATCC é publicada por eles, como o Catalogue of Bacteria & Bacteriophages, e está disponível na internet em atcc.org, ou em outros depositários conhecidos.
[00174] O bacteriófago pode ser imobilizado em um substrato por um dos muitos procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo específico para o bacteriófago pode ser usado para ligar um bacteriófago a um substrato. Proteína A, proteína G ou ligantes como avidina, estreptavidina e biotina podem ser usados para ligar o anticorpo ao substrato. Métodos de ligação covalente também podem ser utilizados para ligar um bacteriófago a um substrato. Em geral, os anticorpos com especificidade por proteínas da cauda de bacteriófago não devem ser usados, pois a ligação de tal anticorpo às proteínas da cauda pode interferir com a capacidade da partícula de bacteriófago se ligar a uma célula bacteriana hospedeira.
[00175] Os kits da invenção podem compreender bactérias que compreendem as porções de detecção. Tais bactérias são denominadas "bactérias indicadoras", que podem ser compostas de cepas bacterianas também suscetíveis ao mesmo bacteriófago que as bactérias da amostra a ser detectada. Por exemplo, a cepa B de E. coli tipo selvagem (ATCC) pode ser modificada para expressar a luciferase, ou alguma outra porção de detecção, a partir de um plasmídeo de DNA. Os plasmídeos podem ser construídos novamente ou com base em constructos disponíveis comercialmente, como plasmídeos de luciferase, pGL.4.10 (luciferase de vaga- lume) (Promega, Madison WI) e pGL.4.70 (luciferase de Renilla). A adição de um promotor constitutivo ou viral para direcionar a expressão da porção de detecção (por exemplo, luciferase) pode ser incluída, juntamente com outras sequências de DNA comuns conhecidas na técnica (gene de resistência aos antibióticos e origem de replicação).
[00176] Além disso e/ou alternativamente, os kits da invenção podem compreender o "fago indicador". O fago indicador pode consistir em um bacteriófago com seus genomas modificados para incluir os genes para a expressão de porções de detecção comuns, tais como a luciferase, proteína fluorescente verde ou peroxidase de rábano silvestre. Esses genes podem ser integrados em uma proteína com número de cópias elevado em uma fusão, como uma fusão Soc-luciferase em T4, ou como uma proteína solúvel não incorporada na estrutura do fago, porém expressa após infecção do fago das bactérias.
[00177] Os kits também podem compreender filtros para uso na concentração e/ou fornecimento de um substrato para bactérias a serem infectadas por um fago, em seguida lavadas, como através de filtros spin de 0,45 μm (Millipore, Billerica, MA). As colunas de afinidade de estreptavidina também podem ser incluídas no kit, para uso de separação do fago parental biotinilado do fago da progenia (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Os kits também podem conter substratos para uso com as porções de detecção, tais como o substrato do ensaio de D-luciferina ou luciferase (Promega, Madison, WI) para a luciferase de vaga-lume, ou coelenterazina, para a luciferase de Renilla.
[00178] Da mesma forma, um kit LFA para a detecção de proteínas do bacteriófago pode incluir tiras de amostra contendo os anticorpos adequados a ambas as linhas de teste e controle. Tais kits também podem incluir nanofibras de negro de fumo ligadas aos anticorpos específicos para o analito de interesse. O kit também pode incluir um tampão de análise e/ou quaisquer reagentes necessários para a diluição da amostra ou outros reagentes. Reagentes adicionais podem incluir materiais para servir como controles e reagentes para a amplificação de sinal adicional. Por exemplo, o kit pode incluir um CNBS-Ab secundário (ou seja, um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário para o analito de interesse). O kit também pode incluir reagentes de detecção enzimáticos, tais como a peroxidase de rábano silvestre (HRP) e/ou substratos da HRP. Um reservatório de tamanho adequado para a realização do ensaio também pode ser incluído nos kits da invenção.
[00179] Em modalidades alternativas, o kit pode compreender reagentes para um imunoensaio baseado em esfera.
[00180] Em uma modalidade, a invenção pode compreender um kit para analisar um analito de interesse que compreende um suporte de detecção, o qual compreende um suporte sólido compreendendo uma pluralidade de moléculas de agente ligante que podem reconhecer e se ligar ao analito de interesse. Em uma modalidade, o kit pode compreender um suporte de captura, o qual compreende pelo menos um agente ligante ao suporte de captura que reconhece e se liga ao analito de interesse. O kit pode, em algumas modalidades, compreender também um agente de ligação que pode reconhecer e se ligar, especificamente, à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção. Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção é um agente ligante solúvel.
[00181] Os suportes de detecção e/ou captura podem compreender uma variedade de formatos. Em uma modalidade, o suporte de captura sólido pode ser um poço de ensaio (ou seja, como uma placa de microtitulação). Ou o suporte de captura sólido pode ser um local em uma matriz, ou um suporte móvel, como uma esfera. Em uma modalidade, o suporte de detecção é um suporte móvel, como uma pérola.
[00182] Uma variedade dos agentes ligantes pode ser usada nos kits da invenção. Por exemplo, a pluralidade dos agentes ligantes ligados ao suporte de detecção pode ser anticorpos ou fragmentos de anticorpo que reconhecem o analito de interesse. Adicionalmente e/ou alternativamente, o agente ligante ligado ao suporte de captura pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que reconhece o analito de interesse. Além disso e/ou alternativamente, o agente ligante que pode especificamente reconhecer e se ligar à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar especificamente à pluralidade das moléculas do agente ligante no suporte de detecção não reconhece o agente ligante de captura usado para ligar o analito de interesse ao suporte de captura sólido. Ou o agente ligante, ou qualquer um dos suportes de captura ou de detecção, ou o agente ligante que pode reconhecer e se ligar especificamente à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode compreender uma proteína que se liga a um alvo não proteico (ou seja, como uma proteína que se liga especificamente a um analito de molécula pequena de interesse, ou um receptor que se liga a uma proteína).
[00183] O suporte de detecção pode compreender uma pluralidade de porções detectáveis. Além disso ou adicionalmente, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode compreender uma porção detectável.
[00184] O uso de um suporte de detecção que compreende uma pluralidade de agentes de ligação que reconhecem o analito de interesse proporciona amplificação do sinal. Em modalidades alternativas, o suporte de detecção compreende mais de 1.000, mais de 10.000, mais de 100.000, mais de 500.000 ou mais de 1.000.000 de moléculas de agente ligante específicas para o analito de interesse. Dessa forma, em modalidades alternativas, os kits da invenção fornecem uma amplificação que varia de 1.000 a 1.000.000.000, ou de 1.000 a 100.000.000, ou de 5.000 a 10.000.000, ou de 10.000 a 1.000.000, ou de 10.000 a 500.000, ou de 50.000 a 500.000 vezes o sinal observado em um imunoensaio não amplificado padrão, que não compreende um suporte de detecção compreendendo uma pluralidade de agentes ligantes de detecção. Ou intervalos dentro dessas faixas podem ser alcançados.
[00185] Dessa forma, em certas modalidades, o kit pode compreender reagentes para um imunoensaio baseado em esfera. Dessa forma, em uma modalidade, o suporte de detecção pode compreender uma esfera revestida com um anticorpo que reconhece uma proteína de interesse. A esfera pode, em determinadas modalidades, ser uma esfera de poliestireno revestida com proteína G, proteína A ou proteínas A/G, que estão disponíveis comercialmente (por exemplo, junto a Invitrogen, Carlsbad CA) em uma grande variedade de tamanhos. Outras esferas que podem ser úteis incluem esferas de sílica magnéticas revestidas com essas mesmas proteínas (esferas MagSi obtidas junto a AmsBio, Lake Forest, CA).
[00186] Dessa forma, em uma modalidade, o kit pode compreender uma esfera revestida com um anticorpo que reconhece uma proteína ribossomal. Ou o kit pode compreender uma esfera revestida com um anticorpo que reconhece uma proteína do fago. As esferas podem ser de poliestireno, sílica, vidro, ou outros materiais, planas ou derivatizadas para fixação a grupos químicos específicos.
[00187] Os substratos a serem usados nos kits da presente invenção incluem, mas não se limitam, às esferas de poliestireno (Spherotech, Libertyville, 111),esferas magnéticas (Invitrogen; AmsBio), revestimentos de látex, um filtro de membrana, um filtro de fibra, uma fibra livre ou um substrato sólido poroso. Métodos para o uso de esferas magnéticas podem ser encontrados, por exemplo, com o folheto da embalagem do produto de proteína G Dynabeads No. 10003D, em Kala et al., Analytical Biochemistry 254:263-266 (1997) e em Dutton, Genetic Engineering News, Volume 22, Número 13, julho de 2002.
[00188] Um amplo espectro de partículas, particularmente de esferas magnéticas e de poliestireno, é comercialmente disponível em uma ampla gama de tamanhos. Para algumas modalidades, um conjunto preferencial de partículas tem um tamanho de partícula médio (ou seja, a maior dimensão das partículas) igual a cerca de um micrômetro (ou seja, mícron). Para algumas modalidades, um conjunto preferencial de partículas tem um tamanho de partícula médio (ou seja, a maior dimensão das partículas) não menor que 10 micrômetros (ou seja, mícrons). Esferas comercialmente disponíveis exemplares são esferas de poliestireno revestidas com proteína G, proteína A e proteínas A/G, e esferas de poliestireno revestidas com estreptavidina que são disponíveis junto a Invitrogen, Carlsbad, CA ou de Spherotech, Libertyville, Illinois. Outros fornecedores de esferas de poliestireno e magnéticas incluem a Thermo Scientific Pierce, Millipore, Polyscience e New England Biolabs. AmsBio, Lake Forest, IL, é um fornecedor de esferas de sílica magnéticas, que são disponíveis com todos os revestimentos de proteína indicados acima. A Life Technologies/Invitrogen fornece também grânulos magnéticos com superfície de epóxi, que se ligam covalentemente aos anticorpos.
[00189] O número de moléculas de anticorpo sobre os grânulos pode variar. Em modalidades alternativas, pode haver cerca de 10.000 a 10.000.000, ou cerca de 50.000 a 1.000.000, ou cerca de 100.000 a 500.000 anticorpos para uma esfera que apresenta cerca de 15 μm de diâmetro. Para esferas de tamanhos diferentes, uma cobertura de superfície correspondente pode ser usada.
[00190] Em certas modalidades, as pérolas são suficientemente grandes, de modo que uma pluralidade dos anticorpos antirribossomais pode ser ligada à esfera. Por exemplo, as esferas podem variar de tamanho de cerca de 0,1 a 50, 0,2 a 40, 0,5 a 30, 1 a 20, 1 a 15 ou cerca de 1 a 3 μm de diâmetro. Para complexar o anticorpo de interesse com a esfera, esta pode ser pré-revestida com proteína G, proteína, proteínas A/G ou outra proteína que complexa com o anticorpo de interesse. Tais esferas são geralmente disponíveis comercialmente. Os kits para um imunoensaio baseado em esfera podem também compreender anticorpos primários adicionais para a proteína de interesse, onde tais anticorpos são de uma segunda espécie. Esses anticorpos são utilizados nos ensaios sanduíche aqui descritos, porque eles se ligam aos complexos anticorpo secundário-repórter, e os complexos secundários não se ligam aos anticorpos da primeira espécie sobre a superfície sólida, que poderia resultar em reações falso positivas. No entanto, os anticorpos da segunda espécie também podem ser usados para revestir uma superfície sólida e/ou um poço de microtitulação, conforme descrito na presente invenção.
[00191] Os kits também podem compreender anticorpos secundários que podem ser usados para detectar os anticorpos primários, onde tais anticorpos podem ser anticorpos antiglobulina da segunda espécie. Esses anticorpos podem ser ,marcados com um marcador detectável ou um agente de ligação que pode complexar com um marcador detectável. Por exemplo, em certas modalidades, um kit da invenção pode compreender um anticorpo secundário que é ligado a um fluoróforo. Em uma modalidade, o fluoróforo pode incluir um QDOT®. Por exemplo, em uma modalidade, estreptavidina-QDOTS® podem se ligar aos anticorpos secundários biotinilados que reconhecem, por exemplo, um anticorpo primário antirribossomal.
[00192] As modalidades da presente invenção também podem ser caracterizadas pelos seguintes exemplos não limitadores.
[00193] E. coli foi obtida junto à ATCC (No. 11303) e cultivada em meio LB (Difco: 10 g e triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl/L) de um dia para o outro a 37 °C. Uma colônia foi colocada em 5 mL de meio LB e incubada a 37 °C de um dia para o outro. No dia seguinte, a cultura foi diluída em 1:100 em LB fresco, e as células foram cultivadas até uma concentração de Klett 68 (DO a 600 nm = 0,8) (20 unidades Klett em um colorímetro fotoelétrico Summerson = 0,1 DO a 540 nm em um espectrofotômetro), que corresponde a cerca de 4 x 108 células/mL, após crescimento durante cerca de 3,5 horas. As células foram, em seguida, peletizadas em um rotor 80K tipo 19 da Beckman Coulter (No. Cat. 325632) a 5.000 rpm durante 15 minutos. O pélete foi ressuspenso em 1 mL de TMS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM) com 1/10 de volume de 10X Bugbuster (Novagen, PN 70921-3), lisozima a 0,5 mg/mL (Sigma L6876) e DNase1 de alta qualidade (sem RNase) a 10 mg/mL (USB 14365). O lisado foi clarificado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL em um rotor Allegra 64R F2402 da Beckman Coulter a 16.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrífuga novo e a etapa de clarificação foi repetida. Os ribossomos foram peletizados em TMS por centrifugação a 35.000 rpm durante 3 horas a 4 °C, em um rotor SW40Ti da Beckman Coulter, e o pélete foi ressuspenso em 0,5 mL de TMS. A suspensão foi clarificada e carregada em gradientes de sacarose de 10 a 30% (p/v) em TMS (BioComp GradientMaster, BioComp, New Brunswick, CA) e centrifugada a 35.000 rpm durante 3 horas a 4 °C, em um rotor de Beckman Coulter SW40Ti. As bandas resultantes dos ribossomos foram removidas com o uso de uma agulha 21G x 1" em uma seringa de 3 mL. Os ribossomos foram novamente peletizados como descrito acima, e o pélete foi ressuspenso em PBS ou TMS. As proteínas ribossomais foram caracterizadas por SDS-PAGE e a pureza das partículas foi confirmada pela coloração negativa com EM.
[00194] Ribossomos purificados, isolados conforme descrito no exemplo 1, foram combinados com um adjuvante apropriado. Os ribossomos e adjuvante foram injetados abaixo da pele de coelhos jovens (com 2,5 a 3,0 Kg; 10 a 16 semanas de idade). Sangue foi coletado da artéria central da orelha com uma agulha de calibre 19 e deixado coagular e retrair a 37 °C de um dia para o outro. O sangue coagulado foi, em seguida, refrigerado durante 24 horas antes que o soro fosse decantado e clarificado por centrifugação a 2500 rpm durante 20 minutos. Os coelhos foram injetados e sangrados de acordo com o seguinte cronograma: Dia -4: Pré-sangramento Dia 0: Imunização através da via intradérmica (ID) usando CFA (adjuvante de Freund completo), Dia 7: Injeção de reforço através da via intradérmica (ID) usando IFA (adjuvante de Freund incompleto) Dia 14: Injeção de reforço por via subcutânea (SC) usando IFA Dia 28: Injeção de reforço por via subcutânea (SC) usando IFA Dia 38: Teste de sangramento Dia 40: Envio de sangrias pré-imunes e teste de sangria para NGI Dia 45: Sangria terminal (aprovada) Dia 47: Envio da sangria terminal para o NGI Dia 49: Fim do projeto (aprovado)
[00195] Para demonstrar a captura de células bacterianas intactas viáveis da solução, anticorpos policlonais de coelho para os epítopos de superfície de várias espécies bacterianas (por exemplo, de E. coli e S. typhimurium) foram gerados.
[00196] Culturas de E. coli e S. typhimurium foram cultivadas em meio líquido antes da coleta e foram lavadas com tampão fosfato (KH2PO4 1,1 mM, Na2HPO4 5,6 mM, NaCl 154 mM, pH 7,4). As células lavadas foram, em seguida, diluídas até uma concentração entre 5 a 20 células por mL. Cerca de 250 ng de anticorpo anti E. coli policlonal biotinilado (equivalente a cerca de 1 x 1012 moléculas de anticorpo) produzido por Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA foram adicionados à suspensão celular e incubados durante 45 min. Um experimento controle, onde o anticorpo não é adicionado à suspensão celular, também foi feito.
[00197] Após a incubação do anticorpo, 4 x 108 micropartículas magnéticas revestidas com estreptavidina (Solulink, Inc., San Diego, CA) foram adicionadas à mistura e incubadas durante mais 15 min. Os complexos de célula- anticorpo-esfera foram, em seguida, coletados usando uma tira magnética, e a fração não ligada (sobrenadante) foi removida, e as esferas foram suavemente lavadas com tampão fosfato (KH2PO4 1,1 mM, Na2HPO4 5,6 mM, NaCl 154 mM, pH 7,4). Ambas as frações de sobrenadante ("sup") e de esfera ("esfera") foram a seguir espalhadas sobre placas de ágar Luria-Bertani (LB) e incubadas de um dia para o outro a 37 °C. Após a cultura de um dia para o outro, as placas foram inspecionadas quanto à formação de colônias. A figura 2 mostra um experimento exemplar; as contagens de colônias são mostradas abaixo, à esquerda/direita de cada placa.
[00198] As figuras 3A e 3B mostram a captura de proteína ribossomal usando IgG antirribossomal biotinilada e esfera magnética ligada à estreptavidina. A figura 3A demonstra que os anticorpos antirribossomais e esferas de estreptavidina são necessários e capazes de capturar os ribossomos da solução quantitativamente. No experimento mostrado como a figura 3A, o lisado de 100.000 células em tiocianato de guanidina 0,6 M/solução salina tamponada com fosfato com Tween-20 (KH2PO4 1,1 mM, Na2HPO4 5,6 mM, NaCl 154 mM, Tween-20 a 0,01%, pH 7,4) foi incubado durante 1 hora com quantidades variáveis de IgG antirribossomal biotinilada de coelho produzida por Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA. Um controle sem lisado também foi incluído. Em seguida, entre 3,3 x 107 e 1 x 108 esferas Dynabeads magnéticas com estreptavidina (SA) (Life Technologies, CA Carlsbad) foram adicionadas a cada reação, de modo que a razão de anticorpos para esferas foi constante a 6000 moléculas de anticorpo por partículas de esfera. Cerca de 5 x 107 esferas com SA foram adicionadas ao controle “sem anticorpo”.
[00199] As esferas foram coletadas usando uma base magnética e, em seguida, foram desnaturadas por adição de tampão de amostra com dodecilsulfato de sódio contendo beta-mercaptoetanol e submetidas a ebulição. O eluente foi, a seguir, coletado usando um suporte magnético, analisado em gel de poliacrilamida e submetidos a uma análise de Western blot usando anticorpo antirribossomal de coelho e anticorpo secundário de peroxidase de rábano silvestre anticoelho (HRP). Pode-se observar que quando nenhum anticorpo antirribossomal é adicionado, as proteínas ribossomais não são detectadas. Também pode ser observado que 50 ng de anticorpo é capaz de ligar todas as proteínas ribossomais de 100.000 células.
[00200] Na figura 3A, a linha de Ponceau fornece um controle interno para mostrar que a amostra foi carregada em todos os poços, uma vez que Ponceau é uma mancha de proteína total usada para visualizar as proteínas presentes na membrana de Western blot. A linha de SA mostra a estreptavidina removida das esferas Dynabeads SA durante a etapa de desnaturação/ebulição. Pode-se observar que quantidades aproximadamente iguais de esferas foram utilizadas em cada etapa de captura de ribossomo.
[00201] A figura 3B demonstra que a adição de biotina, anticorpos antirribossomais e esferas de estreptavidina é suficiente para capturar todas as proteínas ribossomais presentes em solução. Nesse experimento, o lisado de 270.000 células em tiocianato de guanidina 0,6 M/solução salina tamponada com fosfato com Tween-20 foram incubados com, ou sem, 200 ng de IgG antirribossomal biotinilado de coelho. Em seguida, 1 x 108 esferas magnéticas com SA foram adicionadas para capturar os complexos de proteínas Ab-ribossomo (8000 moléculas de anticorpo por esfera). O sobrenadante não ligado foi removido da fração da esfera e recapturado ("recapt") usando 200 ng de biotina, anticorpo e 1 x 108 esferas magnéticas com SA. As esferas coletadas foram desnaturadas e submetidas à análise de Western blot usando anticorpo antirribossomal de coelho e anticorpo secundário de peroxidase de rábano silvestre (HRP) anticoelho. A ausência de proteínas ribossomais no experimento de recaptura com lisado, onde proteínas ribossomais foram anteriormente capturadas, indica que a primeira etapa de captura foi suficiente para capturar todas as proteínas ribossomais.
[00202] Experimentos foram realizados para comparar os vários formatos de ensaio representados na figura 8, quadros A a C e F (ou seja, os métodos 1a, 1b, 2, 3 e 6). Essencialmente, lisados de E. coli (500.000 células) foram elaborados pela lise de células bacterianas em tiocianato de guanidina 6 M (10.000 células/pL). A concentração de tiocianato de guanidina foi em seguida reduzida até 0,12 ou 0,6 M por diluição em tampão fosfato (por exemplo, diluição de 90.000 células em 450 μL) . Os ribossomos foram, em seguida, capturados usando um dos métodos de detecção de captura mostrados na figura 8 (tabela 1).
[00203] Experimentos adicionais foram realizados usando o método descrito no quadro 8F. Esse método utiliza a adição de esfera-Ab2 (esferas de carbóxi e anticorpos antirribossomais de coelho) ao lisado. Isso permite que os ribossomos se liguem à esfera, semelhantemente ao ELISA sanduíche normal, onde os anticorpos de “captura” são imobilizados em uma superfície. O Ab1-biotina (porquinho- da-índia) foi, em seguida, adicionado diretamente à mistura sem quaisquer etapas de lavagem. Os complexos esfera-Ab2- ribossomo-Ab1 são capturados usando esferas de estreptavidina (SA) e são detectados usando anticorpos secundários ao Ab2. Verificou-se que essa abordagem funcionou quando esferas de Ab-carbóxi (Ab2-esfera) e biotina, anticorpos de porquinho-da-índia (Ab1) foram utilizados.
[00204] Assim, nesse experimento, o lisado de 2.500, 5.000, 10.000 ou 20.000 células foi incubado com cerca de 1,3 x 108 esferas de carbóxi (0,1 μm) com anticorpo antirribossomo de coelho (Ab antirribo). Em seguida, 10 ng (4 x 1010 moléculas de IgG) de anticorpos antirribossomo de porquinho-da-índia biotinilados foram acrescentados e, adicionalmente, incubados. Os complexos de esfera-Ab- riboproteína-Ab foram capturados com cerca de 4 x 107 esferas C1 SA Dynabeads. A detecção foi realizada com 10 ng de anticorpo anticoelho marcado com peroxidase de rábano silvestre (HRP). Um quinto da amostra foi carregado sobre uma microplaca para detecção com substrato Sirius HRP em um luminômetro. Pode-se observar que o sinal foi detectado por apenas 500 células.
[00205] Uma tira de teste LFA foi desenvolvida em colaboração com Medtox (Uma empresa LabCorp). A tira consiste em uma membrana de nitrocelulose e um enchimento absorvente em contato com a membrana de nitrocelulose. A membrana de nitrocelulose contém uma linha de teste com anticorpos antirribossomais de coelho e uma linha de controle com anticorpos anticoelho de cabra. Um esquema da tira é mostrado na figura 10A.
[00206] O ensaio foi realizado aplicando-se a amostra (0 a 10 ng de proteínas ribossomais) à parte inferior da tira ("região de aplicação de amostra") e permitindo que a amostra flua por ação capilar através da superfície de nitrocelulose. Os ribossomos presentes na amostra se ligam aos anticorpos antirribossomais imobilizados na linha de teste, enquanto que o resto do material da amostra continua dentro do enchimento absorvente. As tiras foram, a seguir, incubadas com uma nanofibra de negro de fumo (CNBS) que foi pré-revestida com anticorpos antirribossomais de coelho (CNBS-Ab) e o complexo CNBS-Ab se moveu, por ação capilar, na mesma direção que a amostra através da superfície de nitrocelulose. Essencialmente, o revestimento do anticorpo sobre CNBS é feito por incubação de uma solução de anticorpos com uma solução de CNBS contendo NaCl entre 5 a 25 mM. A ligação do anticorpo ao CNBS não é específica. Após uma hora de incubação, os complexos CNBS-Ab são lavados e passivados usando albumina de soro bovino. Os complexos CNBS-Ab que interagiram com ribossomos ligados à linha de teste resultaram em um linha de cor cinza a preto, enquanto que qualquer CNBS-Ab não ligado continuou na tira e se ligou à linha de controle anticoelho, resultando em uma linha cinza/preta naquela posição da tira. Se a amostra não contém proteínas ribossomais, nenhuma linha se formará na linha de teste, mas uma linha se formará na linha de controle.
[00207] Um experimento exemplar é mostrado na figuras 10C e 10D. O experimento mostrado no quadro C mostra o uso de um único anticorpo antirribossomal de coelho CNBS usado para detecção de ribossomos. Nesse experimento, ribossomos de E. coli purificados (10 ou 100 ng) foram analisados em tiras de LFA em tampão de análise LFA (tricina 25 mM, Maltitol a 5%, sacarina sódica a 2% , polivinilpirrolidona a 0,025%, álcool polivinílico a 0,05%), Tetronic 1307 a 0,5%, Tetronic 904 a 0,005%) e azida de sódio, pH 8,0). Após toda a amostra ter sido inserida na tira, CNBS com anticorpos antirribossomais de coelho foram carregados nas tiras. As tiras foram, em seguida, visualizadas e a intensidade da linha foi quantificada utilizando o software Image J (NIH).
[00208] O experimento demonstrado no quadro D usa dois diferentes complexos de CNBS. Um tem anticorpo antirribossomal com biotina (CNBS-Ab) e o segundo complexo tem estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre (CNBS-SA- HRP). Nesse experimento, ribossomos de E. coli purificados (5 ng) foram analisados sore tiras LFA em tampão de análise LFA. Após toda a amostra ter sido inserida na tira, CNBS com anticorpos antirribossomais de coelho biotinilados foram carregados nas tiras (CNBS-Ab (figura 10D, as quatro tiras superiores). Até metade das amostras, o CNBS secundário com SA-HRP foi carregado sobre as tiras. A porção de SA sobre esse CNBS secundário é capaz de se ligar à porção de biotina sobre o anticorpo de coelho presente no CNBS primário. Isso resulta em uma maior quantidade de CNBS total localizado na linha de teste. Em seguida, substrato HRP (TMB) foi adicionado diretamente à superfície de nitrocelulose e incubado em temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir o desenvolvimento do produto TMB colorido (Figura 10D, quatro tiras inferiores; +TMB (substrato HRP). As tiras foram, em seguida, visualizadas e a intensidade da linha foi quantificada utilizando o software Image J (NIH).
[00209] Cerca de 2,4 x 1010 unidades formadoras de placa (PFU) do fago T4 foram diluídas em 50 μL de salina tamponada com fosfato (PBS). Se o fago estiver no tampão contendo Tris, como TMS, é necessário fazer uma transferência de tampão como, por exemplo, usando colunas Spin Zeba (Thermo Scientific Pierce, Waltham, MA).
[00210] Para preparar o reagente de biotina, 4 mg de reagente Pierce NHS-biotina foram adicionados a 1 mL de água (4 μg/μL). O reagente foi, em seguida, adicionalmente diluído até uma concentração de 49,4 ng/μL (por exemplo, adicionar 2 μL a 160,1 μL de PBS). Em seguida, cerca de 500 ng de reagente biotina (10 μL) foi adicionado a um tubo contendo cerca de 2,4 x 1010 fagos PFU, e deixado incubar durante 2 horas a 4 graus Celsius (°C). O fago biotinilado foi, em seguida, dessalinizado usando uma coluna Zeba. Para dessalinizar o fago, a coluna foi lavada 3 vezes com 300 μL de PBS a 1500 g durante 1 minuto. Em seguida, PBS é adicionado ao fago para avolumar até 100 μL, e o fago (100 μL) é adicionado à coluna Zeba e centrifugado durante 2 min a 1500 g. O fago foi, em seguida, titulado usando um ensaio de placa e armazenado a 4 °C.
[00211] O uso de bactérias indicadoras para analisar o fago da progenia é descrito na figura 11. Dessa forma, nesse ensaio, os fagos parentais utilizados para infectar uma amostra bacteriana de interesse são separados do fago da progenia, e então, os fagos da progenia são usados para infectar as bactérias indicadoras manipuladas para expressar uma biomolécula que fornece um sinal detectável após a lise das bactérias. Por exemplo, as bactérias podem ser manipuladas para expressar a proteína luciferase.
[00212] Nesses experimentos, células indicadoras foram produzidas usando do indicador foram produzidas usando E. coli tipo selvagem originalmente obtida juto à ATCC, transformadas com plasmídeos de luciferase. Os plasmídeos de luciferase foram baseados em pGL.4.10 (luciferase de vaga-lume) e pGL.470 (luciferase de Renilla) (Promega, Madison, WI). Modificações nos plasmídeos para uso em bactérias indicadoras incluíram a inserção de um promotor bacteriano constitutivo (c70) a montante do gene da luciferase. Essa cultura (por exemplo, de bactérias que expressam a proteína luciferase) foi inoculada a 37 °C sob agitação a 220 rpm em caldo LB com ampicilina (100 μg/mL). Entretanto, cerca de 500 μL de bactérias da amostra (ou seja, as bactérias a serem quantificadas) foi carregado no filtro spin MC-HV Ultrafree da Millipore em um tubo de coleta de fundo redondo de 2 mL fundo, centrifugado a > 300 g durante 1 minuto (até 8000 rpm em microcentrífuga) para remover o meio e 40 μL de fago T4 biotinilado (ou seja, cerca de 2,7 x 106 PFU) foi adicionado em caldo LB. As bactérias infectadas foram, em seguida, lavadas aplicando cerca de 500 μL de caldo LB e centrifugando a > 300g durante 1 minuto usando tubos de coleta de 2 mL, 4 vezes. O filtro contendo as bactérias infectadas foi transferido do tubo de coleta de 2 mL para um tubo novo de 1,5 mL e, após a adição de cerca de 200 μL de caldo LB, as bactérias infectadas foram incubadas durante 1 hora a 37 °C. As bactérias infectada foram, em seguida, coletadas por centrifugação (8000 rpm durante 2 minutos) e o filtrado contendo os fagos da progenia e quaisquer fagos parentais biotinilados remanescentes foi transferido para colunas de estreptavidina (por exemplo, colunas SpinTrap de Estreptavidina HP, da GE Healthcare). As colunas foram, em seguida, incubadas durante 20 minutos em à temperatura ambiente, com centrifugação completa. Nesse ponto, o eluato da coluna contendo o fago da progenia foi transferido para um tubo novo, e o fago da progenia foi coletado por centrifugação a 150 g durante 1 minuto. Os fagos da progenia foram detectados a partir desse lisado através de ensaio de placa convencional (ensaio PFU) ou submetidos à detecção com células indicadoras, conforme descrito abaixo.
[00213] A seguir, as células indicadoras (ou seja, bactérias expressando luciferase) foram então diluídas até cerca de 106 células por mL em caldo LB, e 10 μL de células indicadoras foram adicionadas ao tubo contendo fago da progenia. Infectou-se as bactérias com o fago por centrifugação de adsorção (por exemplo, a 8000 rpm durante 30 minutos). As células indicadoras infectadas foram, em seguida, ressuspensas e incubadas sob agitação a 220 rpm a 37 °C durante 1 hora. Nesse ponto, as células indicadoras infectadas foram isoladas usando filtração/centrifugação (8.000 rpm durante 2 minutos) e 10 μL de sobrenadante foram transferidos para um poço em uma placa de 96 poços. O nível de luciferase foi, em seguida, quantificado utilizando um luminômetro e o ensaio da luciferase Promega com 50 μL do substrato de ensaio da luciferase.
[00214] Dados dos experimentos usando esse ensaio são mostrados nas figuras 12A a E. As figuras 12A e 12B demonstram sinais mensuráveis e comparáveis em relação ao fundo usando o ensaio de fago em comparação com um ensaio de UFC padrão realizado de um dia para o outro. A Figura 12A mostra que tão poucas quanto 1 a 2 células de E. coli que proporcionam uma PFU mensurável podem ser detectadas (ou seja, cerca de 300 a 460 PFU) de fago da progenia pormeio de ensaio de placa. A figura 12B compara a sensibilidade de um ensaio de unidade formadora de colônia padrão (CFU) com o ensaio que utiliza fagos da invenção. Pode ser observado que o ensaio de fato, apesar de ser muito mais rápido, fornecer aproximadamente a mesma sensibilidade em comparação com o ensaio de UFC, e demonstra uma resposta dose-dependente, com o aumento de fagos da progenia decorrente do aumento das células na amostra. Embora isto compreenda apenas a primeira metade do ensaio de fago completo, o uso de ensaios de placa pode atingir resultados no mesmo dia em comparados com um ensaio de UFC padrão realizado de um dia para o outro.
[00215] A Figura 12C mostra a detecção dos fagos que são os equivalentes da progenia de uma única célula (ou seja, 100 fagos) ou 27 células (ou seja, 2700 fagos) usando células indicadoras (por exemplo, a segunda metade do ensaio de fago completo), indicador de alta sensibilidade.
[00216] A figura 12D mostra a detecção de 1, 5 e 7 células de amostra (por exemplo, E. coli) em comparação com um ensaio de UFC padrão (a linha pontilhada indica o nível de fundo).
[00217] A figura 12E mostra a detecção bem sucedida de 100 a 10.000 células bacterianas (determinado microscopicamente) por amostra usando o ensaio de fago completo (a linha indica o nível de fundo). Demonstrando, dessa forma, a sensibilidade de 1 a 10.000 células sem diluição da amostra. Isso é 1 ou 2 ordens de grandeza mais sensível do que um ensaio de UFC de um dia para o outro padrão, onde mais de 500 a 700 UFC não podem ser contadas de modo confiável em uma placa de Petri, além de ser um ensaio muito mais rápido, realizado em cerca de 3 horas.
[00218] A figura 12D mostra o equivalente de uma amostra de 5 e 500 células (isto é, de E. coli) e a figura 12E mostra a detecção de 1, 5 e 10 células bacterianas por mL usando o fago da progenia da figura 11. A figura 12D mostra a detecção de 1, 5 e 7 células de amostra (por exemplo, E. coli) em comparação com um ensaio de UFC padrão (a linha vermelha indica o nível basal).
[00219] A figura 12E mostra a detecção bem sucedida de 100 a 10.000 células bacterianas (determinado microscopicamente) por amostra usando o ensaio de fago completo (a linha indica o nível de fundo). Demonstrando, dessa forma, a sensibilidade de 1 a 10.000 células sem diluição da amostra. Isso é 1 ou 2 ordens de grandeza mais sensível do que um ensaio de UFC de um dia para o outro padrão, onde mais de 500 a 700 UFC não podem ser contadas de modo confiável em uma placa de Petri, além de ser um ensaio muito mais rápido, realizado em cerca de 3 horas.
[00220] A estratégia de usar o fago indicador é mostrada na figura 13. Nesse método, a proteína de capsídeo do fago é fundida com a luciferase, de modo que os fagos da progenia que não são biotinilados podem ser separados dos fagos parentais, que são biotinilados e diretamente quantificados.
[00221] Para realizar o ensaio, cerca de 500 μL de bactérias da amostra (ou seja, as bactérias a serem quantificadas) foi carregado no filtro spin MC-HV Ultrafree da Millipore em um tubo de coleta de fundo redondo de 2 mL, centrifugado a > 300 g durante 1 minuto (até 8000 rpm em microcentrífuga) para remover o meio e 40 μL de fago T4 biotinilado (ou seja, cerca de 2,7 x 106 PFU) em caldo LB foi adicionado. As bactérias infectadas serão, em seguida, lavadas aplicando cerca de 500 μL de caldo LB e centrifugando a > 300g durante 1 minuto, usando o tubo de coleta de 2 mL 4 vezes, em seguida a coluna de filtro contendo bactérias infectadas pode ser transferida para um tubo novo e, após a adição de cerca de 200 μL de caldo LB, as bactérias infectadas podem ser incubadas durante 1 hora a 37 °C. As bactérias infectadas são, em seguida, coletadas por centrifugação (8000 rpm durante 2 minutos) e o filtrado contendo os fagos da progenia e fagos parentais biotinilados pode ser transferido para colunas de estreptavidina (por exemplo, colunas SpinTrap de Estreptavidina HP, da GE Healthcare). As colunas são, em seguida, incubadas durante 20 minutos em temperatura ambiente, com centrifugação completa. Nesse ponto, o eluato da coluna contendo o fago da progenia é transferido para um tubo novo, e o fago da progenia é coletado por centrifugação a 150 g durante 1 minuto. A seguir, 10 μL do fluxo passante vai ser transferido para um poço em uma placa de 96 poços, e o nível de luciferase vai ser quantificado usando um luminômetro e o ensaio da Luciferase da Promega, com 50 μL de reagente de ensaio da luciferase.
[00222] A estratégia do uso do fago indicador que produz luciferase solúvel é mostrada na figura 14. Nesse método, o fato expressa a luciferase ao invés das proteínas de capsídeo Soc. A expressão da luciferase é realizada pelo promotor Soc, produzindo alta expressão. Nesse caso, não há necessidade de separar o fago parental do fago da progenia porque o fago parental será isento de luciferase (subproduto da purificação do estoque de fago). Apenas uma infecção produtiva de bactérias na amostra produzirá luciferase detectável.
[00223] Para realizar o ensaio, cerca de 500 μL de bactérias da amostra (ou seja, as bactérias a serem quantificadas) foi carregado no filtro spin MC-HV Ultrafree da Millipore em um tubo de coleta de fundo redondo de 2 mL, centrifugado a > 300 g durante 1 minuto (até 8000 rpm em microcentrífuga) para remover o meio. O filtro spin será, em seguida, transferido para um tubo novo, cerca de 40 μL de fago T4 biotinilado (ou seja, cerca de 2,7 x 106 PFU) de fago em caldo LB é adicionado e, após a adição de cerca de 200 μL de caldo LB, as bactérias infectadas serão incubadas durante 1 hora a 37 °C. As bactérias infectadas serão, em seguida, coletadas por centrifugação (8000 rpm durante 2 minutos), 10 μL de fluxo passante serão transferidos para um poço em uma placa de 96 poços e o nível de luciferase pode ser quantificado utilizando um luminômetro e o ensaio de Luciferase da Promega com 50 μL de substrato de ensaio da luciferase.
[00224] A invenção não está limitada aos detalhes exatos mostrados e descritos, uma vez que variações óbvias para uma pessoa versada na técnica serão incluídas dentro da invenção definida pelas reivindicações. Embora as modalidades preferenciais da invenção tenham sido ilustradas e descritas, será estimado que várias mudanças podem ser feitas nas mesmas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Todas as patentes e publicações impressas referidas na presente invenção são, por meio desse documento, incorporadas na presente invenção em sua totalidade por essa referência.
Claims (10)
1. Método para a detecção de uma bactéria de interesse, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: isolamento da bactéria dos outros componentes na amostra; e infecção de pelo menos uma bactéria com uma pluralidade de bacteriófagos parentais; lisaçao de pelo menos uma bactéria infectada para liberar o bacteriófago descendente presente na bactéria; detectando o bacteriófago descendente, em que o bacteriófago parental é projetado para expressar a proteína solúvel durante a replicação, e a referida expressão é dirigida por um promotor de capsídeo viral, em que a detecção da proteína solúvel indica que o bacteriófago descendente está presente na amostra, em que o método é realizado a uma temperatura de 37 a 45 graus Celsius.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o bacteriófago parental é ligado a um suporte sólido.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERI ZADO pelo fato de que a proteína solúvel ou expressão da proteína compreende luciferase.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que não há separação do fago parental e do fago descendente.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de isolamento da bactéria compreende a ligação da bactéria a um agente ligante; ou em que a etapa de isolamento da bactéria compreende a ligação da bactéria a um agente ligante que está ligado a um suporte sólido.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente ligante é um anticorpo específico para a bactéria.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o isolamento compreende filtragem de rotação.
8. Uso do kit no método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERI ZADO pelo fato de compreender componentes para detecção de uma bactéria de interesse compreendendo: componente para isolamento de pelo menos uma bactéria de interesse de outros componentes na amostra; componente para infecção de pelo menos uma bactéria de interesse com uma pluralidade de bacteriófagos parentais, em que o bacteriófago parental é projetado para expressar uma proteína solúvel, e a referida expressão é dirigida por um promotor de capsídeo viral; componente para lisação de pelo menos uma bactéria infectada para liberar o bacteriófago descendente presente na bactéria; e componente para detecção da proteína solúvel, em que a detecção da proteína solúvel indica que a bactéria está presente na amostra, em que o método é realizado a uma temperatura de 37 a 45 graus Celsius.
9. Uso do kit, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o bacteriófago é ligado a um suporte sólido.
10. Uso do kit, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína solúvel é a luciferase.
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