BR112014015391A2 - deinococcus ou bactéria relacionada; bactéria; composição; extrato enzimático de um deinococcus ou bactéria relacionada; biocatalisador; processo para a transformação de biomassa; processo para a produção de um álcool, preferencialmente etanol; e uso de um deinococcus ou bactéria relacionada - Google Patents

Abstract

  DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA; COMPOSIÇÃO; EXTRATO ENZIMÁTICO DE UM DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA; BIOCATALISADOR; PROCESSO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE BIOMASSA; PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM ÁLCOOL, PREFERENCIALMENTE ETANOL; E USO DE UM DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA. A presente invenção se refere a bactérias recombinantes e aos usos destas, em particular para a produção de etanol. A invenção também se refere a métodos para a produção de tais bactérias, bem como a construtos de ácido nucleico adequados para tal produção. A invenção se refere especificamente a bactérias que têm uma unidade reconstruída de degradação da biomassa.

Description

DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA; COMPOSIÇÃO; EXTRATO ENZIMÁTICO DE UM DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA; BIOCATALISADOR; PROCESSO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE BIOMASSA; PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM ÁLCOOL, PREFERENCIALMENTE ETANOL; E USO DE UM DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA

[001] A presente invenção se refere às bactérias recombinantes, a sua preparação e o uso destas. Mais particularmente, a invenção se refere às bactérias que têm unidades transcricionais reconstruídas e o seu uso para a conversão de biomassa e/ou a produção de biocombustíveis, particularmente o etanol. A invenção também se refere os construtos de ácidos nucleicos, culturas mistas, composições de bactérias ou extratos isolados destas, assim como métodos de produção de bioetanol.

Introdução

[002] Biocombustíveis podem ser produzidos a partir de material de biomassa através de um número de etapas de processamento, incluindo a degradação da biomassa e fermentação usando, por exemplo, tratamentos químicos e físicos e/ou biológicos e catalisadores. Normalmente, a produção de biocombustíveis requer o pré-tratamento da biomassa para hidrolisar pelo menos parcialmente a hemicelulose, remover a lignina e descristalizar a celulose, de modo que as enzimas de celulase possam acessar oO seu substrato. Além disso, a fim de converter eficientemente os açúcares em etanol, os microrganismos devem apresentar propriedades específicas, tais como rendimento e produtividade de etanol elevado, alta tolerância aos ácidos, etanol e inibidores, e estar ativo no meio de crescimento simples e sob as condições do processo selvagem. A produção de biocombustíveis, tais como o bioetanol de lignocelulose teria a vantagem adicional de matéria-prima abundante, diversificada e custo baixo. No entanto, isto também requer uma quantidade substancial de processamento para tornar os açúcares disponíveis para a fermentação por microrganismos que são normalmente usados para a produção de etanol.

[003] Nenhum microrganismo natural, incluindo bactérias ou leveduras, atende a todos esses requisitos.

[004] Desde as últimas décadas, os microrganismos foram selecionados ou manipulados de modo a melhorar o seu desempenho para a produção de etanol. As bactérias gram-negativas, tais como a Escherichia coli, Klebsiella oxvtoca e Zymomonas mobilis, as bactérias Gram- positivas, tais como Clostridium cellulolyticiim ou Lactobacillus casei, e diversas cepas de leveduras foram projetadas para a produção de bioetanol a partir de substratos celulósicos. Particularmente, genes biossintéticos, (tais como os genesPDC ou ADH) foram clonados em cepas bacterianas. Além disso, as vias competitivas foram alteradas.

[005] Estes microrganismos ainda mostram inconvenientes. Em particular, os potenciais microrganismos produtores de etanol, tais como Zymomonas mobilis e Saccharomyces cerevisiae não são normalmente capazes de hidrolisar complexos de açúcares tais como lignocelulose. Z. mobilis, não é bem adequado para a conversão de biomassa porque só fermenta glicose, frutose e sacarose. Além disso, mostra tolerância ao ácido acético muito baixa. Para as leveduras Saccharomyces, a temperatura ótima é muitas vezes aproximadamente 37 ºC, o que pode não ser ótimo em instalações de cultura em larga escala industrial onde a temperatura pode aumentar de forma substancial.

[006] Cepas gram-positivas ou Geobacillus geneticamente alteradas foram mencionadas (ver WO95/27064 e WO2006/131734). Do ponto de vista industrial, no entanto, nenhuma produção de metabolitos satisfatória foi divulgada para estas cepas. Além disso, as cepas Geobacillus produzem esporos, o que é uma desvantagem substancial para o uso industrial.

[007] A obtenção de altos rendimentos de etanol significa encontrar cepas que produzem etanol com alguns produtos secundários e metabolizam os principais açúcares tais como glucose, xilose, arabinose, galactose e manose. Além disso, o processo industrial adequado requer que as condições de enzima e cultura sejam compatíveis com respeito ao pH e temperatura.

[008] Deinococcus é uma bactéria gram positiva que foi isolada em 1956 por Anderson e colaboradores. Este organismo extremófilo é resistente a danos do DNA por radiações UV e ionizante ou pelo agente de reticulação (mitomicina C) e é tolerante à dessecação. WO 01/023526 mostra a resistência incomum de Deinococcus à radiação e ainda propõe a sua engenharia e uso em biorremediação. WO2009/063079 mostra que as bactérias Deinococcus podem resistir aos solventes e transformar biomassa para gerar etanol. MWO2010/130806 divulga ainda cepas recombinantes Deinococcus em que genes da biossíntese de etanol foram inseridos. Estas cepas recombinantes exibem um desempenho melhorado para a produção de etanol.

[009] A presente invenção revela agora uma nova geração de bactérias melhoradas, com propriedades de degradação de biomassa mais elevadas e notáveis. Mais particularmente, a invenção revela bactérias Deinococcus modificadas ou relacionadas com a melhoria da degradação de biomassa e propriedades de produção de biocombustíveis. Estas bactérias foram projetadas pelos inventores para conter unidades de transcrição funcionais reconstruídas e/ou vias metabólicas alteradas, levando a performances biológicas substancialmente melhoradas. Vantajosamente, estas bactérias têm sido engenheiradas com genes particulares isolados e caracterizadas pelos inventores, ou modificadas pelos inventores para melhorar a sua expressão, o que resulta em bactérias não-GMO, melhoradas. Estas bactérias são compatíveis com as condições de cultura industrial, uso de material de biomassa cru, e foram engenheiradas para manter a expressão adequada de genes integrados para a produção de etanol ideal. Estas bactérias, extratos destas, ou composições compreendendo as mesmas, são particularmente adequadas para uso para modificar a biomassa e a produção de biocombustíveis.

Sumário da invenção

[010] Um objetivo da invenção se refere à bactéria Deinococcus ou bactérias afins que compreendem uma unidade transcricional de degradação de biomassa reconstruída inserida no seu genoma. Mais especificamente, estas bactérias compreendem uma unidade transcricional de degradação da biomassa reconstruída compreendendo pelo menos dois genes sob o controle de um único promotor, sendo referidos pelo menos dois genes que codificam enzimas distintas de degradação da biomassa.

[011] Em uma modalidade preferida, a unidade transcricional reconstruída de degradação da biomassa não contém material genético de Deinococcus, o que melhora a sua atividade e aumenta a aceitação regulamentar.

[012] Em outra modalidade preferida da invenção, as bactérias ainda compreendem uma unidade transcricional “recombinante da produção de álcool, de preferência uma unidade transcricional recombinante da produção de etanol.

[013] Em outra modalidade preferida, as bactérias contêm vias biossintéticas alteradas de competição por etanol. Mais especificamente, os objetivos específicos da presente invenção consistem em Deinococcus ou bactérias afins compreendendo um gene endógeno inativado selecionado a partir de um gene de acetil fosfato transferase, um gene de desidrogenase de alanina, gene da desidrogenase da glucose, um gene da fosfoenolpiruvato carboxiquinase, um gene fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou um gene da desidrogenase do malato.

[014] Outro objetivo da invenção se refere a uma composição compreendendo uma bactéria, tal como definido acima e pelo menos uma outra bactéria.

[015] Outro objetivo da invenção se refere a uma composição compreendendo uma bactéria, tal como definido acima e um meio de cultura.

[016] Outro objetivo da invenção se relaciona a um extrato enzimático de uma bactéria, tal como definido acima.

[017] A invenção também diz respeito a um biotacalisador compreendendo uma bactéria ou extrato desta,

como definido acima.

[018] A invenção reside ainda em um processo para a transformação de biomassa, compreendendo a exposição de uma biomassa a uma bactéria ou um extrato ou uma composição como definido acima.

[019] Outro objetivo da invenção é um processo para a produção de um álcool, em particular o etanol, compreendendo a exposição de um açúcar ou biomassa a uma bactéria ou um extrato ou uma composição como definido acima e, preferencialmente, coletar o álcool produzido.

[020] A invenção também se relaciona ao uso de uma bactéria tal como acima definido para a produção de um álcool, em particular o etanol.

[021] A invenção também se refere a um método para a produção de uma bactéria Deinococcus ou afins, ou de um ancestral desta, o método compreendendo: a) fornecer um dos parentes da Deinococcus ou bactéria relacionada; b) simultaneamente ou sequencialmente nserir no genoma da dita bactéria progenitora pelo menos dois genes que estão sob o controle de um único promotor, O referido com pelo menos dois genes codificando enzimas de degradação da biomassa distintas, e

Cc) selecionar uma bactéria de b), que expressa tanto ambos pelo menos os dois genes.

[022] A invenção também se refere a um ácido nucleico compreendendo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 23, e 24.

[023] A invenção também se refere a proteína isolada compreendendo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NOs: 12 e 14, ou uma variante funcional ou um fragmento desta.

Legenda das figuras

[024] Figura 1: Representação esquemática das etapas de inserção para construir Deinococcus com unidade de degradação da biomassa reconstruída.

[025] Figura 2: Atividade amilolítica de células reconstruídas.

[026] Figura 3: Atividade da amilase de células reconstruídas. O cultivo foi realizado em dois frascos de 5L paralelos contendo 2 L de meio. À esquerda: Medições OD600 como uma função do tempo. À direita: Atividades de ceralfa em função do tempo medidas a partir do sobrenadante livres de células (azul e vermelho) e os sedimentos celulares (violeta e verde). A atividade foi determinada a 45ºC em tampão de MOPS 100 mM (pH 7,0) contendo ImM CaCl2.

[027] Figura 4: Localização das atividades a- amilase em cepa M23-3A selvagem e as células reconstruídas. Concentrado (20x) de sobrenadantes de cultura (2=M23-3A, 3=DG 4), pellets celulares (4=M23-3a, 5=DG4) e extratos Triton X-100 dos pellets celulares (6=M23-3A, 7=DG 4) foram analisados por SDS-PAGE e pela técnica zimograma (pH 7,0). SDS-PAGE foi realizada em condições não redutoras, sem fervura das amostras.

[028] Figura 5: Quantificação da Biomassa e da Glucose durante o cultivo de trigo a 3%.

[029] Figura 6: Quantificação do etanol e dos ácidos orgânicos durante o cultivo em trigo a 3%.

[030] Figura 7: Quantificação da Biomassa e açúcares durante o cultivo em leite de amido a 20%.

[031] Figura 8: Quantificação do etanol e dos ácidos orgânicos durante o cultivo em leite de amido a 20%.

[032] Descrição detalhada da invenção

[033] A presente invenção se refere a Deinococcus ou bactérias afins e o uso para a transformação de biomassa e/ou a produção de biocombustíveis ou outros metabólitos.

[034] A presente descrição será melhor compreendida com referência às seguintes definições:

[035] Definições

[036] Dentro do contexto da invenção, o termo "derivado de uma bactéria" em relação a uma enzima indica que a enzima foi isolada a partir de tal bactéria, ou que a enzima compreende a totalidade ou uma parte biologicamente ativa da sequência de aminoácidos de uma enzima isolada ou caracterizada de tal bactéria. O termo "derivado de uma bactéria Deinococcus ou bactéria relacionada" inclui ainda qualquer enzima recombinante, sintética e/ou opcionalmente modificada (por exemplo, modificação química, enzimática, física) sintetizada a partir de um ácido nucleico Ou sequência de aminoácidos identificada em um Deinococcus ou uma bactéria relacionada.

[037] Bactéria Deinococcus designa qualquer bactéria do gênero Deinococcus, tais como, sem limitação, uma bactéria D. geothermalis, D. cellulolysiticus, D. radiodurans, D. proteolyticus, D. radiopugnans, D. radiophilus, D. grandis, D. indicus, D. frigens, D. saxicola, D. maricopensis, D. marmoris, D. deserti, D. murrayi, D. Aerius, D. aerolatus, D. aerophilus, D. aetherius, D. alpinitundrae, D. altitudinis, D. apachensis, D. aquaticus, D. aquatilis, D. aquiradiocola, D. aquivivus, D. caeni, D. claudionis, D. ficus, D. gobiensis, D. hohokamensis, D. hopiensis, D. misasensis, D. navajonensis, D. papagonensis, D. peraridilitoris, D. pimensis, D. piscis, D. radiomollis, D. roseus, D. sonorensis, D. wulumugiensis, D. xibeiensis, D. xinjiangensis, D. yavapaiensis ou OD. yunweiensis. As bactérias preferidas de Deinococcus são D. geothermalis, D. cellulolysiticus, D. deserti, D. murrayi, e D. radiodurans.

[038] Uma bactéria "relacionada" a Deinococcus designa uma bactéria que (i) contém um DNAr 16S que, após a amplificação, utilizando iniciadores GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA (SEQ ID NO: 26) e GGTATCTACGCATTCCACCGCTA (SEQ ID NO: 25), gera um fragmento de aproximadamente 158 pares de bases e/ou (ii) resiste a um tratamento com UV de 4 mJI/cm2. Em uma modalidade particular, as bactérias relacionadas a Deinococcus são bactérias com uma molécula de DNAr 168, que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80% idêntica na sequência de uma sequência de Deinococcus rDNA 168.

[039] Um "gene" designa qualquer ácido nucleico codificando uma proteína. O termo “gene” abrange DNA, tal como CcDNA ou gDNA, bem como RNA. O gene pode ser preparado em primeiro lugar por, por exemplo, técnicas recombinantes, enzimáticas e/ou químicas, e subsequentemente replicado em uma célula hospedeira ou um sistema in vitro. O gene compreende tipicamente um quadro de leitura aberto que codifica uma proteína desejada. O gene pode conter sequências adicionais, tais como um terminador de transcrição, um peptídeo de sinal, um IRES, um íntron, etc. Preferencialmente, o gene não contém um íntron.

[040] Uma "unidade transcricional" designa, no escopo da presente invenção, um grupo de pelo menos um gene sob o controle de um promotor.

[041] o termo "reconstituída" ou "recombinante", em relação a uma sequência de ácido nucleico, ou a unidade de uma bactéria, indica que a sequência de ácido nucleico ou a unidade não existe naturalmente na bactéria e foi montada e/ou inserida na dita bactéria ou um seu ancestral. Em uma unidade recombinante ou reconstruída, as sequências são preferencialmente da mesma origem que a bactéria na qual são montadas ou inseridas. Como um exemplo, uma unidade reconstruída em uma bactéria Deinococcus compreende preferencialmente essencialmente ácido nucleico derivado de bactérias Deinococcus.

[042] O termo "fragmento", em relação a uma proteína ou enzima, designa qualquer fragmento desta compreendendo pelo menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 40, 50 ou ainda mais preferencialmente pelo menos 60 aminoácidos contíguos da dita proteína. Fragmentos mais preferidos são funcionais, tanto sozinhos ou quando fundidos ou combinados com outro polipeptídeo. Um fragmento de uma proteína também designa uma forma madura da proteína (isto é, que não contém um peptídeo de sinal na extremidade N-terminal da proteína).

[043] O termo "variante", em relação a uma proteína ou enzima, designa qualquer proteína que exibe pelo menos 50% de identidade de sequência de aminoácidos em relação à proteína de referência, ainda mais preferencialmente pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%, e que mantém uma atividade da proteína de referência. O grau de identidade de sequência (homologia) pode ser determinado usando qualquer programa de computador e parâmetros associados, incluindo BLAST 2.2.2 ou FASTA versão 3.0t78, com os parâmetros principais. As variantes preferidas têm um grau de identidade de pelo menos 90%> com a sequência de referência, mais preferencialmente de pelo menos 92, 95 ou 97%. Em uma modalidade preferida, as variantes compreendem no máximo entre 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, de 1 a 20, l a 15, 1 a 10, ou 1 a 5 resíduos de aminoácidos modificados (por exemplo, eliminados, substituídos ou inseridos), em comparação com a proteína de referência. Proteínas se qualificam como variantes se apresentam pelo menos 20%, preferencialmente pelo menos 30% e mais preferencialmente pelo menos 50% de uma atividade enzimática de proteína de referência.

[044] O termo "biomassa", de acordo com a invenção normalmente designa uma biomassa compreendendo em particular celulose e/ou xilano. O termo biomassa inclui assim o material biológico de origem biológica, incluindo o material orgânico vegetal ou animal. A biomassa pode ser transformada ou pré-tratada. A biomassa é tipicamente um material vegetal ou animal orgânico contendo celulose Ou xilano. Exemplos de biomassa incluem, sem limitação, OS produtos florestais, incluindo árvores maduras impróprias para madeira ou produção de papel, resíduos orgânicos, produtos agrícolas, tais como gramíneas, culturas e estrume de animais e produtos aquáticos, como algas e algas marinhas. Exemplos de biomassa incluem madeira ou material vegetal derivado de vários tipos de plantas, incluindo miscanto, cânhamo, beterraba, trigo, milho, choupo, salgueiro, Sorgo, cana de açúcar, e uma variedade de espécies de árvores, que variam de eucalipto ao óleo de palma. Fontes específicas de biomassa incluem, sem limitação, resíduos vegetais, caules de madeira dura ou madeira macia, espigas, palha, grama, folhas, sementes, papel, etc. (ver, por exemplo, Sun et al., Bioresource Tecnologia 83 (2002) 1-11). O termo biomassa abrange também biomassa transformada ou biomassa secundária, que contém essencialmente produtos hidrolisados de biomassa pré-tratada.

[045] "Modificação" de uma biomassa dentro do contexto da presente invenção inclui qualquer modificação da mesma, incluindo a transformação, degradação, hidrólise, conversão ou processamento. O termo "modificar" a biomassa geralmente engloba qualquer modificação da biomassa, que resulta na produção de açúcares fermentáveis. Modificação também engloba tipicamente a hidrólise de polímeros biológicos da biomassa.

[046] Uma "enzima de degradação da biomassa" é uma enzima que está envolvida na degradação de uma biomassa (ou de um componente de uma biomassa) em produtos degradados. A enzima de degradação da biomassa é preferencialmente uma enzima que contribui para a degradação ou a hidrólise de biomassa em açúcares fermentáveis. Exemplos de tais enzimas incluem as amilases, celulases, arabinofuranosidases (como, por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidases), xilanases, lacases, alfa-glucuronidases e esterases, tais como esterases de ácido ferúlico ou esterases de acetil xilano.

[047] O termo "álcool" ou bioálcool designa mais especificamente um álcool, diol ou triol linear ou ramificado compreendendo entre 1 e 5 átomos de carbono, preferencialmente de 1 a 4 átomos de carbono. Os exemplos específicos e preferidos de "álcoois" incluem álcoois C1-4 selecionados a partir de metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, propanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4- butanodiol, isobutanol, ou glicerol, mais preferencialmente etanol.

[048] O biocombustível de acordo com a invenção inclui, sem limitação, óleos vegetais, biodiesel, biogás, bioálcool, syngas e biocombustíveis sólidos.

Unidade Transcricional de Degradação da Biomassa

[049] As bactérias Deinococcus têm mostrado a capacidade de reagrupar O seu genoma, totalmente ou parcialmente, quando modificado por um estresse. A capacidade das bactérias Deinococcus para produzir produtos de bioenergia a partir de biomassa é divulgada na WO2009/063079. A presente invenção mostra agora que o desempenho destas bactérias pode ser melhorado por vias metabólicas de reengenharia. Mais particularmente, a invenção fornece novas bactérias que têm uma unidade transcricional reconstruída de degradação da biomassa. A invenção mostra que uma unidade deste tipo pode ser inserida no genoma de uma bactéria Deinococcus ou afins, sem alterar o crescimento celular. A invenção mostra que a expressão de vários genes de um único promotor é viável e permite uma melhor regulação dos níveis de enzimas na célula. A invenção descreve ainda bactérias compreendendo uma unidade funcional reconstruída de degradação da biomassa com cinco genes de um único sítio de inserção, que exibe desempenho melhorado. A invenção descreve ainda essas bactérias reengenheiradas construídas com ácido nucleico derivado de Deinococcus, e que não contêm material genético heterólogo.

[050] Estas bactérias representam produtos valiosos e biocatalisadores e são particularmente adaptados para modificar biomassa com melhor capacidade.

[051] Uma unidade transcricional de degradação da biomassa da invenção designa preferencialmente uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos dois genes distintos, colocados sob o controle de um único promotor, os ditos dois genes distintos codificando duas enzimas de degradação da biomassa distintas. A presente invenção descreve a inserção, em uma única localização no genoma de uma bactéria Deinococcus, de diversos genes que estão sob o controle de um promotor único. Esta configuração fornece uma expressão ótima dos genes e não afeta o crescimento da bactéria. A enzima de degradação da biomassa pode ser selecionada a partir de amilases, xilanases, celulases, lacases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases e esterases. Os exemplos preferidos de esterases incluem, sem limitação, as esterases do ácido ferúlico ou esterases de acetil xilano. Um exemplo específico de arabinofuranosidase inclui, sem limitação, alfa-L-arabinofuranosidase. Em uma modalidade preferida, as enzimas de degradação da biomassa são selecionadas a partir de amilases, celulases e arabinofuranosidases.

[052] Em uma modalidade preferida, a unidade compreende três genes sob o controle de um único promotor. Exemplos específicos de tais unidades da invenção contêm: - 2 genes de amilase distintos, ou - 1 gene de amilase e 1 gene arabinofuranosidase, ou - 2 genes de amilase disintos e 1 gene arabinofuranosidase.

[053] As amilases estão envolvidas na hidrólise de polissacarídeos, particularmente amido. O amido é um carboidrato que consiste em um grande número de unidades de glicose unidas entre si por ligações glicosídicas 1-4 e 1-6. O termo "amilases" inclui polipeptídeos possuindo atividades alfa-amilase, beta-amilase, glucoamilase, alfa-glicosidase ou pululanase (glicosil hidrolase). As alfa-amilases têm a capacidade de hidrolisar ligações glicosídica alfa-l,4 internas em amido para a produção de malto-dextrina com peso molecular menor. Glicoamilases tem capacidade para hidrolisar polímeros de glicose ligados por ligações 1,4 - e 1,6- glicosídicas. Glicoamilases têm a capacidade de liberar beta- D-glicose a partir de glucanas.

[054] O gene da amilase para uso na invenção é preferencialmente um gene codificando uma alfa-amilase. Mais preferencialmente, o gene da amilase codifica uma amilase derivada de uma bactéria Deinococcus. A este respeito, oO depositante identificou novos genes de amilase a partir de bactérias Deinococcus, com propriedades melhoradas, as sequências as quais estão representadas nas SEQ ID NOs: 2 e 4 (sequências de aminoácidos).

[055] Em uma modalidade preferida, a unidade transcricional da invenção compreende um gene codificando uma alfa-amilase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 4, ou um fragmento ou variante deste.

[056] As análises funcionais realizadas pelos inventores mostraram que a alfa-amilase da SEQ ID NOs 2 e 4 exibem especificidade para o substrato diferente, de modo que através da combinação destas duas amilases de uma bactéria da invenção, o espectro da atividade é aumentada.

[057] As celulases são enzimas que catalisam a hidrólise de celulose ou hemicelulose, um componente principal da madeira dura e madeira macia. As celulases podem ser de diferentes tipos, tais como endoglucanases, celobiohidrolases, endocellulases (CBH) ou celobiosidases ou B-glucosidases (celobiases; BGL). O gene da celulase para uso na presente invenção é preferencialmente um gene codificando uma endocelulase ou um exocelulase. Mais preferencialmente, o gene da celulase codifica uma celulase derivada de uma bactéria Deinococcus. A este respeito, o depositante identificou novos genes de celulase a partir de bactérias Deinococcus, com propriedades melhoradas, as sequências as quais estão representadas nas SEQ ID NOs: 8 e 10 (sequências de aminoácidos).

[058] Em uma modalidade preferida, a unidade transcricional da invenção compreende um gene codificando uma celulase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 10, ou um fragmento ou variante deste.

[059] o gene arabinofuranosidase pode ser qualquer gene codificando uma arabinofuranosidase, mais preferencialmente uma arabinofuranosidase derivada de uma bactéria Deinococcus. A este respeito, o depositante identificou novos genes de arabinofuranosidase a partir de bactérias “Deinococcus, com propriedades melhoradas, as sequências as quais estão representadas nas SEQ ID NOs: 5 (ácido nucleico) e 6 (aminoácido).

[060] Em uma modalidade preferida, a unidade transcricional da invenção compreende um gene codificando uma arabinofuranosidase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou variante deste.

[061] Exemplos de unidades transcricionais de degradação da biomassa da presente invenção compreendem, sob o controle de um único promotor, pelo menos dois genes selecionados de: - um gene codificando uma alfa-amilase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 4, ou um fragmento ou variante deste.

- um gene codificando uma arabinofuranosidase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou um fragmento ou variante deste; e - um gene codificando uma celulase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 10, ou um fragmento ou variante deste.

[062] Exemplos mais específicos de unidades transcricionais de degradação da biomassa da invenção são descritos nos exemplos, e compreendem, sob o controle de um único promotor, e na ordem de 5' para 3': - um gene codificando uma alfa-amilase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou um fragmento ou variante deste, e um gene codificando uma alfa-amilase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO: 4, ou um fragmento ou variante deste, ou - um gene codificando uma alfa-amilase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou um fragmento ou variante deste, e um gene codificando uma arabinufuranosidase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou variante deste, ou - um gene codificando uma alfa-amilase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou um fragmento ou variante deste, e um gene codificando uma alfa-amilase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, ou um fragmento ou variante deste, e um gene codificando uma arabinufuranosidase compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou variante deste.

[063] A presente invenção mostra que configurações do gene acima permitem a expressão apropriada de genes integrados para a produção de etanol ótima.

[064] A unidade pode incluir genes alternativos ou outros genes, codificando, por exemplo, lacases, xilanases ou esterases. Os exemplos específicos desses outros genes, isolados pelo depositante de Deinococcus ou bactérias relacionadas, estão descritos no PCT/EP2011/069669 e PCT/EP2011/069670, incorporado por referência.

[065] A expressão dos genes na unidade transcricional é regulada por um único promotor. O promotor pode ser homólogo ao hospedeiro (por exemplo, um promotor de um gene Deinoccocus) ou heterólogo (por exemplo, a partir de uma origem diferente, tal como uma bactéria diferente, um fago, um material sintético ou promotor híbrido, etc.) Os promotores preferidos são homólogos. A este respeito, vários promotores têm sido estudados e utilizados para a expressão do gene. Exemplos de promotores de Deinococcus adequados incluem promotores VtufA e VtufB dos genes Tu de fatores do alongamento da tradução tufA (DR0309) e tufB (DR2050), o promotor do gene resU localizado em pI3, e o promotor da região FgroESL do operon groESL (Lecointe et al., 2004; Meima et al., 2001), ou derivados de tais promotores.

[066] A invenção mostra que os níveis adequados de expressão dos genes na unidade transcricionais são obtidos quando os genes são colocados sob o controle de um promotor selecionado ou derivado de PtufA, PtufB ou PgroESL.

[067] A unidade transcricional pode ainda compreender sequências reguladoras adicionais, tais como, por exemplo, terminadores e/ou acentuadores.

[068] A unidade transcricional pode, além disso, compreender outros genes sob o controle de diferentes promotores. A este respeito, é possível inserir os genes adicionais na unidade transcricional codificando enzimas de degradação da biomassa, regulados pelo promotor ou promotores iguais ou diferentes.

[069] Em uma modalidade particular e preferida, a unidade transcricional da invenção compreende ainda pelo menos um gene de degradação da biomassa adicional sob o controle de um segundo promotor. Em outra modalidade preferida, a unidade transcricional compreende dois genes de degradação da biomassa adicionais sob o controle de um promotor. A invenção mostra que tal unidade reconstruída de degradação da biomassa pode ser montada em uma localização no genoma de uma cepa de Deinococcus. A invenção mostra que a configuração em operons fornecer níveis de expressão de genes ideais para a produção de etanol. A invenção mostra que essas bactérias são viáveis e estáveis. Estas bactérias, portanto, representam biocatalisadores muito potentes para a produção de biocombustíveis.

[070] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a uma bactéria Deinococcus ou afins, compreendendo uma unidade transcricional reconstruída de degradação da biomassa, em que o dito aparelho compreende: (i) sob o controle de um único promotor, 2 genes de amilase, ou 1 gene de amilase e 1 gene de arabinofuranosidase, ou dois genes de amilase e um gene de arabinofuranosidase; e (ii) sob o controle de um segundo promotor, pelo menos um gene de celulase, preferencialmente um gene da endocelulase e um gene da exocelulase.

[071] Estas combinações e arranjos de genes particulares permitem expressão e atividade da bactéria melhoradas.

[072] Unidades trancricionais podem ser preparadas, tanto in vitro e em seguida inseridas na célula ou construídas na célula através da inserção sequencial dos genes. Técnicas convencionais de DNA recombinante podem ser usadas para a manipulação de DNA, clonagem e transformação de células. Em particular, o ácido nucleico (s) pode ser inserido no genoma da bactéria, ou inserido como (autonomamente) moléculas replicantes, por exemplo, em um plasmídeo, epissoma, cromossoma artificial, etc.

[073] Em uma modalidade preferida, a unidade transcricional está integrada no genoma da bactéria. Para esse fim, o construto foi clonado em um ou vários cassetes integrativos adequados para integração no genoma de uma bactéria Deinococcus. Tal cassete integrativo compreende, normalmente, o ácido nucleico ligado a (ou flanqueado por) uma ou várias sequências que permitem a integração, preferencialmente a integração sítio específica. Tais sequências podem ser, por exemplo, sequências de ácido nucleico homólogas a uma região alvo do genoma, permitindo a integração através de cruzamento cromossômico.

[074] A inserção pode ser direcionada para não essencial (por exemplo, regiões não codificantes) do genoma. No entanto, em uma modalidade preferida, a inserção é direcionada aos genes específicos no genoma da bactéria. Neste contexto, uma bactéria particular da invenção compreende uma unidade transcricional reconstruída de degradação da biomassa integrada no seu genoma, em substituição total ou parcial de um gene endógeno codificando uma amilase. A invenção mostra que a substituição do gene endógeno através de uma unidade transcricional da presente invenção melhora adicionalmente as propriedades da bactéria. Neste contexto, o termo "parte do gene" significa qualquer porção do gene onde a supressão desta é suficiente para causar a inativação do gene na célula.

[075] Várias técnicas podem ser usadas para introduzir um ácido nucleico em uma bactéria Deinococcus ou afins, tal como divulgado por exemplo em WO2010/130806. Em particular, eles podem ser inseridos através de transformação natural (a qual pode ser ainda melhorada na presença de cloreto de cálcio) ou eletroporação.

[076] os sítios de clonagem alternativos incluem, —preferencialmente, em substituição de um gene selecionado a partir de um gene da acetil-fosfato- transferase, um gene da alanina desidrogenase, um gene da glicose desidrogenase, um gene da fosfoenolpiruvato carboxicinase, um gene fosfoenolpiruvato carboxilase, ou um gene do malato desidrogenase.

[077] Em uma modalidade alternativa, apesar de menos preferida, a unidade transcricional pode ser clonada em um vetor adequado, o qual pode ser replicativo em Deinococcus. Vetores típicos contêm, além do inserto clonado, um gene de seleção (por exemplo, resistência a antibióticos, um corante, etc) e uma origem de replicação eficaz em Deinococcus. Exemplos de tais vetores incluem pMD66, PI3 PRADI e pUE30. pMD66 é um grande vetor de (27 kb) para D. radiodurans e E. coli contendo um fragmento de 12kb de pI3 (Daly et al., 1994). pI3 foi descrito por Masters e Minton (1992). pRADI é um plasmídeo de transferência de D. radiodurans - E. coli contendo um replicon mínimo para D. radiodurans (Meima e Lidstrom, 2000). pUE30 é um plasmídeo endógeno derivado de uma cepa de D. radiopugnans que é capaz de replicar em Deinococcus (ver US2003/0175977).

[078] A invenção também se refere a um método para a produção de uma bactéria Deinococcus ou afins, ou de um ancestral desta, o método compreendendo: a) fornecer um dos parentes da Deinococcus Ou bactéria relacionada; b) simultaneamente ou sequencialmente inserir no genoma da dita bactéria-mãe pelo menos dois genes que estão sob o controle de um único promotor, o referido com pelo menos dois genes codificando enzimas de degradação da biomassa distintas, e c) selecionar uma bactéria de b), que expressa tanto ambos pelo menos os dois genes.

[079] Bactérias possuindo os ácidos nucleicos inseridos podem ser selecionados de acordo com técnicas conhecidas per se. A expressão dos genes pode ser verificada usando PCR (por exemplo, quantitativo) e a produção destas enzimas pode ser verificada por meio de Western blot ou por ensaios enzimáticos conhecidos per se no estado da técnica e ilustradas nos exemplos.

[080] Tal como divulgado na seção experimental, várias bactérias Deinococcus contendo uma unidade transcricional reconstruída de degradação da biomassa foram produzidas. Estas bactérias podem ser cultivadas, são viáveis e contêm estavelmente a unidade inserida. A estabilidade deve ser preferencialmente tal que mais que 95% das bactérias contenham ainda a unidade depois de dois ciclos de crescimento. Outra vantagem da invenção é que a unidade transcricional de degradação da biomassa pode ser feita inteiramente de material genético derivado de Deinococcus. Como resultado, a bactéria é mais estável, mais eficaz, e não uma GMO, e mais adaptada às condições de cultura extremas. Além disso, as enzimas específicas identificadas e caracterizadas pelos inventores apresentam atividades potentes e complementares que conferem atividades notáveis às bactérias.

Unidade transcricional para produção de álcool

[081] Em uma modalidade preferida, as bactérias da presente invenção compreendem, além da unidade transcricional de degradação da biomassa, uma produção unidade transcricional recombinante para a produção de álcool. Tais bactérias portanto, expressam combinações de genes otimizadas para produzir biocombustíveis ou metabólitos a partir de biomassa.

[082] A unidade transcricional da produção de álcool recombinante compreende preferencialmente pelo menos um gene codificando um álcool desidrogenase (ADH) e/ou um piruvato descarboxilase (PDC).

[083] Piruvato descarboxilases (PDC, EC:

4.1.1.1) catalisa a descarboxilação mono-oxidativa de piruvato a acetaldeido e dióxido de carbono. Álcool desidrogenases (ADH, EC: 1.1.1.1) catalisa a conversão do acetaldeído em etanol. A inserção de um gene ADH e/ou PDC em uma Deinococcus foi relatada em um pedido de invenção prévio depositado pela requerente (WO2010/130806). A fim de criar ou melhorar esta via metabólica, os genes codificando uma PDC e/ou ADH já foram clonados e introduzidos com sucesso em Deinococcus ou relacionados às bactérias da presente invenção, possuindo uma unidade reconstruída de degradação da biomassa.

[084] Mais particularmente, um gene codificando uma PDC funcional foi preparado. Tal molécula de ácido nucleico pode compreender toda ou uma parte da sequência de um gene de PDC, natural ou sintética, ou mutante, a medida que a molécula de ácido nucleico codifique uma proteína que catalisa a descarboxilação mono-oxidativa de piruvato para acetaldeído e dióxido de carbono. PDC está presente em plantas, fungos e leveduras, mas é rara em bactérias. Nenhuma PDC aparente foi encontrada no genoma de D. radiodurans que foi completamente sequenciado. os genes PDC foram identificados em várias cepas, tal como em Zymomonas mobilis (Brau and Sahm, 1986; Conway et al., 1987a; Neale et al., 1987), em Acetobacter pasteurianus (Genbank: AF368435 (Chandra et al., 2001), em Sarcina ventrículos (Genbank: AF354297) (Lowe e Zeikus, 1992) e em Zymobacter palmae (Genbank: AF474145) (Raj et al., 2002).

[085] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico compreende a sequência de PDC de todo ou parte de um gene de PDC bacteriano. Em uma modalidade específica, o ácido nucleico compreende a sequência de um gene PDC de Zymomonas mobilis (ZMPDC, ZMO1360). A sequência do gene ZmPDC compreende 1707 pares de bases e está representada em SEQ ID NO: 15. A sequência do gene modificado, otimizada para a expressão em Deinococcus, foi sintetizada pelos inventores que é apresentada na SEQ ID NO: 16.

[086] Os genes ADH foram clonados a partir de organismos diferentes incluindo, sem limitação, Zymomonas mobilis (Ingram et al., 1987), Lactobacillus brevis (Liu et al., 2007), ou Geobacillus stearothermophilus (Genbank: Z25544) (Talarico et al., 2005). Genes ADH de Deinococcus também foram isolados e clonados pelos inventores. A sequência destes genes e enzimas ADH codificados são divulgados em SEQ ID NOs: 11-14.

[087] A fim de criar uma bactéria que codifica uma atividade de ADH, um gene codificando uma ADH funcional é preparado, o qual pode compreender toda ou parte da sequência de um gene ADH, natural ou sintético ou mutante, a medida que a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína que catalisa a conversão do acetaldeído em etanol.

[088] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico ADH compreende a sequência de PDC de todo ou parte de um gene ADH bacteriano. Em uma modalidade específica, oO ácido nucleico compreende a sequência de um gene ADH a partir de Zymomonas mobilis (ZMADH, ZMO1596). ZmMADH II compreende 1152 pares de bases e a sequência do mesmo está descrito na WO2010/130806 (ver também SEQ ID NO: 17). A sequência do gene modificado, otimizada para a expressão em Deinococcus, foi sintetizada pelos inventores, a qual é apresentada na SEQ ID NO: 18.

[089] Em outra modalidade preferida, o ácido nucleico codifica uma ADH compreendendo toda ou parte da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 ou 14.

[090] De acordo com uma outra modalidade específica, a unidade transcricional da produção de álcool é composta por pelo menos um gene codificando uma ADH ou PDC dependente de NADP.

[091] Uma análise da relação de fluxos metabólicos “mostrou que algumas Deinococcus exibem a propriedade surpreendente de consumir glicose principalmente através da Via de Pentose Fosfato, o que indica que uma parte importante do NADPH é produzido como potencial redox. A fim de usar este pool de NADPH, um gene de ADH dependentes de NADP pode ser usado. A este respeito, a unidade de etanol pode compreender o gene ADH, HUC 22-1 derivado de Moorella sp (por exemplo, compreendendo toda ou uma parte funcional da

SEQ ID NO: 19) ou Tzadh a partir de Zymomonas (compreendendo toda ou uma parte funcional da SEQ ID NO: 20). A invenção mostra que a expressão de tais genes em bactérias Deinococcus é particularmente útil uma vez que estas bactérias possuem um elevado nível de fluxo de NADPH.

[092] Um objetivo da invenção, portanto, também reside em uma bactéria Deinococcus ou bactéria relacionada, em que a dita bactéria compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma ADH ou PDC dependente de NADP.

[093] Um outro objetivo da invenção é uma bactéria Deinococcus ou bactéria relacionada, em que a dita bactéria compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma ADH dependente de NADP e pelo menos uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma ADH dependente de NAD.

[094] Em particular, o ácido (s) nucleico pode ser inserido no genoma da bactéria, Ou inserido como (autonomamente) moléculas replicantes, por exemplo, em um plasmídeo, epissoma, cromossoma "artificial, etc., como descrito acima. Em uma modalidade preferida, a unidade transcricional de produção de etanol é inserida no genoma da dita bactéria em substituição de um gene endógeno, mais preferivelmente na substituição de um gene de fosfato acetil transferase.

[095] A este respeito, um objetivo da presente invenção reside em uma bactéria Deinococcus ou bactéria relacionada, em que a dita bactéria contém um gene inativado de fosfato-acetil-transferase (pta) . AcetilCoA, que é produzido durante a glicólise, pode ser usado para a produção de etanol, bem como para a formação de acetato que é uma via competitiva secundária. Ao excluir o gene pta, a produção de acetato deve ser reduzida (ou abolida) para favorecer a produção de etanol. A invenção mostra que este gene pode ser suprimido sem alterar o crescimento das bactérias, enquanto melhora a capacidade das bactérias para produzir biocombustíveis.

[096] A expressão de PDC ou ADH apropriada pode ser verificada usando PCR quantitativo e a produção destas enzimas pode ser verificada por meio de Western blot ou por ensaios enzimáticos conhecidos per se no estado da técnica. A atividade PDC pode ser medida por meio da análise da redução de NAD e a atividade de ADH pode ser medida pela análise da redução de NAD ou oxidação de NADH devido à atividade destas enzimas (Conway et al., 1987a e b).

Supressão das vias competitivas

[097] As propriedades das bactérias da presente invenção podem ser ainda melhoradas através da supressão ou alteração de reações ou vias competitivas na célula.

[098] os inventores criaram agora novas bactérias em que os genes envolvidos em vias competitivas foram inativados. Tais bactérias exibem ainda maior eficácia na produção de biocombustíveis a partir de biomassa, através do uso de mais energia para as vias desejadas. Mais especificamente, os objetivos específicos da presente invenção residem na bactéria Deinococcus ou bactérias relacionadas compreendendo um gene endógeno inativado selecionado a partir de um gene do fosfato acetil transferase, um gene da alanina desidrogenase, um gene da glicose desidrogenase, um gene da fosfoenolpiruvato carboxicinase, um gene da fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou um gene do malato desidrogenase.

[099] Em uma modalidade particular, o gene alvo é suprimido, totalmente ou parcialmente, e não codifica uma proteína funcional. O gene alvo pode ser inativado na dita bactéria ou em um seu ancestral desta, por recombinação homóloga, substituição de genes ou mutagênese direcionada, ou qualquer outra técnica conhecida per se no estado da técnica.

[100] Em uma modalidade preferida, o gene é inativado por supressão de pelo menos uma parte do dito gene, que pode ser substituído pelo ácido nucleico heterólogo (p.ex., um marcador de seleção).

[101] Em uma modalidade preferida, a bactéria da presente invenção não tem uma parte do dito gene, de preferência pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos do mesmo, mais preferencialmente pelo menos 200, 300, 400 ou

500. Nos exemplos, uma cepa de Deinococcus defeituosa foi produzida, a qual não possui o gene inteiro de fosfato acetil transferase. Esta cepa foi preparada por cruzamento de cromossomas duplo utilizando um construto especial compreendendo uma unidade transcricional de produção de etanol flanqueada por duas regiões homólogas em relação a partes do gene. Regiões homólogas típicas devem ser longas o suficiente para permitir a hibridização e cruzamento de cromossomas, por exemplo, acima de 200 nucleotídeos, de preferência acima de 300 nucleotídeos, tipicamente entre 300 e 700. Tais construtos representam objetivo particular da presente invenção.

[102] Neste sentido, a invenção também se refere a um método para a produção de uma bactéria

Deinococcus ou bactéria relacionada, ou de um ancestral desta, o método compreendendo: - fornecer um (progenitor) da bactéria Deinococcus; - tratar a bactéria para inativar um gene endógeno selecionado a partir de um gene do fosfato acetil transferase, um gene da alanina desidrogenase, um gene da glicose desidrogenase, um gene da fosfoenolpiruvato carboxicinase, um gene da fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou um gene do malato desidrogenase, e - Seleção de uma bactéria possuindo dito gene inativado.

Cultura, composições e usos

[103] As bactérias da presente invenção podem ser preparadas a partir de quaisquer espécies de bactérias Deinococcus ou bactérias relacionadas. Exemplos são listados acima no presente pedido. Estes são preferencialmente bactérias Deinococcus de uma espécie selecionada de D. geothermalis, D. cellulolysiticus, D. deserti, D. murrayi, e D. radiodurans.

[104] Exemplos ilustrativos de cepas parentais adequadas para uso na invenção incluem, sem limitação, por exemplo, D. geothermalis DSM 11300 (DRHO5), D. geothermalis DSM 11301 (DRHO6), D. geothermalis DSM 11302 (DRH07), D. geothermalis Hambi 2481 (DRH37), D. geothermalis HAMBI 2480 (DRH38), D. geothermalis HAMBI 2411 (DRH39), D. geothermalis HAMBI 2791 (DRH41), D. geothermalis M36-7D; D. radiodurans Rl (ATCC 13939); D. murrayi M11-9D CNCM 1-4155); ou D. murrayi M13-1A (NCM 1-4157).

[105] Outras cepas de Deinococcus são depositadas em coleções públicas, ou podem ser obtidas pelo técnico no assunto, que pode ser usado para implementar a invenção.

[106] As bactérias da presente invenção podem ser cultivadas e/ou mantidas em um meio de cultura adequado e/ou dispositivo. Exemplos de tais meios incluem meio de glicose complexo ou meio definido como revelado nos exemplos, como por exemplo, meio definido de sacarose, meio definido de amido. Meios adequados também estão disponíveis comercialmente.

[107] Outro objetivo da invenção se refere a uma composição compreendendo uma bactéria, tal como definido acima e pelo menos uma outra bactéria.

[108] Outro objetivo da invenção se refere a uma composição compreendendo uma bactéria, tal como definido acima e um meio de cultura.

[109] Outro objetivo da invenção se relaciona a um extrato enzimático de uma bactéria, tal como definido acima. O extrato enzimático contém pelo menos uma enzima de degradação da biomassa codificada pela unidade reconstruída.

[110] A invenção também diz respeito a um biocatalisador compreendendo uma bactéria ou extrato desta, como definido acima.

[111] A invenção reside ainda em um processo para a transformação de biomassa, compreendendo a exposição de uma biomassa a uma bactéria ou um extrato ou uma composição como definido acima.

[112] Outro objetivo da invenção é um processo para a produção de um biocombustível, compreendendo a exposição de um açúcar ou biomassa a uma bactéria ou um extrato ou uma composição como definido acima.

Preferencialmente, o processo compreende uma etapa de coleta de biocombustível produzido.

[113] A invenção também se relaciona ao uso de uma bactéria tal como acima definido para a produção de um biocombustível ou metabólito.

[114] O substrato pode ser qualquer meio de cultura ou vários tipos de biomassa ou de produtos delas derivados. Em particular, o biocombustível pode ser produzido a partir de recursos renováveis, especialmente biomassa vegetal ou animal, ou a partir de resíduos urbanos e industriais.

[115] Mais preferencialmente, o método da invenção é usado para a produção de etanol.

[116] O método da invenção pode ser realizado em um reator de conversão. Como "reator" é referido um tanque de fermentação convencional ou qualquer aparelho ou sistema para a conversão de biomassa especialmente projetados para implementar a invenção e consequentemente consistindo em particular, de biorreatores, biofiltros, contadores biológicos rotativos, e outros biorreatores de fase gasosa e/ou líquida, especialmente aqueles adaptados para o tratamento de biomassa ou de derivados de biomassa. O aparelho, que pode ser usado de acordo com a invenção, pode ser utilizado continuamente ou em carregamentos de lotes.

[117] No reator, para implementar o método da invenção, pelo menos uma bactéria da invenção, ou um extrato bacteriano da mesma é utilizado, enquanto que o dito reator é arranjado e fornecido de modo que as condições físico- químicas são definidas e mantidas aí de modo a que a dita bactéria é operacional para a aplicação em causa e de modo que, opcionalmente, o crescimento bacteriano é possível, e de preferência aí promovido.

[118] o processo pode ser realizado em aerobiose, anaerobiose ou sob microaerobiose, dependendo do substrato e bactéria. Uma vantagem da invenção se relaciona à habilidade das bactérias da invenção de resistir condições de muito estresse, incluindo a presença do etanol no meio de cultura. O processo da invenção pode assim preferivelmente ser executado em uma temperatura aproximadamente de 40 ºC ou mais, particularmente uma temperatura compreendida entre 40- 70ºC; sob condições de pH ácido, e/ou na presença do etanol.

[119] Outros aspectos e vantagens da invenção serão divulgados nos seguintes exemplos, que devem ser considerados como ilustrativo e não limitam o escopo deste pedido de invenção.

Exemplos: A. Materiais e métodos Cepas bacterianas e condições de crescimento:

[120] Cepas de Escherichia coli (E. coli) SCS 110, JMI09 ou DH5a foram usadas para propagar plasmídeos. Elas foram cultivadas a 37 ºC e 200 rpm em meio de Luria- Bertani (LB) (por litro: 10 g de triptona, 59g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio). Meios sólidos foram preparados por adição de 1,5% de agar.

[121] Bactérias Deinococcus foram cultivadas a 45 ºC e 200RPM em PGY. A composição do meio PGY é a seguinte, por litro: Peptona (109), Extrato de levedura (59) e Glicose (19). Composição do meio sólido é, por litro: Peptona (109), Extrato de levedura (59), Gicose (19) e Agar (159).

[122] Quando necessário, os meios LB ou PGy foram suplementados com antibióticos apropriados: - cloranfenicol, a uma concentração final de 3 uvug/ml para D. geothermalis, e 30 ug/ml para E. coli - Bleocina, em uma concentração final de 6 ug/ml para D. geothermalis, e 10 ug/ml para E. coli - Ampicilina, em uma concentração final de 100 uvug/ml para E. coli Transformação:

[123] A transformação de E. coli foi feita usando células competentes comerciais SCS 110 da Stratagene ou da JM109 da Promega.

[124] Para células de Deinococcus, uma cultura fresca em fase estacionária foi diluída 100 vezes em 50 ml de PGY. As células foram cultivadas até à fase exponencial tardia (OD600nm = 0,8); o pellet foi ressuspenso em um volume apropriado de gelo frio 2xPGY/10%v/v Glicerol/30mMM CaCl2. Para a transformação, quantidade desejada de DNA de plasmídeo foi adicionado a 100 ul das células. A mistura foi incubada durante 30 minutos em gelo, transferida a 42ºC por 90 segundos e novamente em gelo durante 5 minutos. 200 upl de meio fresco de 2XPGY foi adicionado e os transformantes foram agitados a 200 rpm e 37 ºC durante 2 horas. Eles foram serialmente diluídos e espalhados em placas de PGY seletivas apropriadas.

Manipulação de DNA:

[125] Minipreparação de plasmídeo a partir de células de E. coli foi feita usando sistema de purificação de DNA, minipreps da QIAGEN e midipreparação foi feita usando o kit de purificação do DNA de plasmídeo NucleoBondGo Xtra Midi Plus EF de Macherey-Nagel. Estas preparações foram feitas de

3-100 ml de cultura de E. coli em fase estacionária.

[126] A extração do DNA genômico de Deinococcus foi feita usando o kit de sangue e tecido DNeasy8 comercial da Qiagen. Estas preparações foram feitas a partir de 5 ml de culturas em fase estacionária.

[127] Os oligonucleotídeos foram sintetizados por Eurogentec. As polimerases utilizadas para amplificação por PCR foram as polimerases de alta fidelidade Phusion da Finzymne; e a DNA polimerase de início KOD Xtreme-hot da Novagen para PCRs de sobreposição. Fragmentos de PCR foram limpos utilizando o kit de sistema Assistente SV Gel e PCR Clean-Up da Promega.

[128] O material genético foi separado por eletroforese em gel de agarose. O DNA foi quantificado com um biofotômetro da Eppendorf.

[129] Insertos de DNA foram sintetizados por Genecust Europe e clonados no vetor apropriado.

Método de inserção genética em cromossoma de Deinococcus:

[130] A inserção de fragmentos de DNA no cromossoma de Deincoccus foi realizada usando o mecanismo de recombinação homóloga. Cassetes de inserção foram projetados como a seguir: a sequência de DNA da região que tinha que ser inserida foi flanqueada por regiões de 500 pb homólogas às sequências a montante ou a jusante do alvo cromossômico (ver figura 1).

[131] Para as 2 primeiras etapas (supressão da a-amilase endógena de um gene que codifica 12-1103 e inserção de pTufB-amil), cassetes de inserção foram carregados pelo vetor termosensível de transporte pMD66, transformados em

Deinococcus e alta temperatura de exposição (52º C durante 4 dias) foi usada para permitir a inserção cromossômica e perda de plasmídeo.

[132] Para todas as outras inserções/ eliminações, cassetes de inserção foram clonados no vetor suicida pucs7 e transformado em Deinococcus. os transformantes que tinham incorporado a região de interesse dentro do cromossoma foram selecionados em meio contendo o antibiótico PGY apropriado.

[133] Inserções/ exclusões corretas foram verificadas por PCR em DNA genômico, a substituição do marcador (cloranfenicol para bleocin ou bleocin para cloranfenicol quando possível), e sequenciamento do cromossoma modificado na região de interesse.

[134] A Figura 1 é uma representação esquemática dos primeiros passos de inserção e os métodos usados para inserir os genes de degradação da biomassa e verificação para inserções corretas.

Teste de atividade de álcool desidrogenase:

[135] 4 ml de pararosanilina (Sigma) a 2,5 mg/ml em etanol absoluto foram adicionados a 200 ml de agar de LB contendo 50 mg de bissulfito de sódio (Conway et al., 1987b). As células de D. radiodurans com 2 dias foram cultivadas em placas de agar TGY (suplementadas se necessário, com o antibiótico apropriado) foram semeadas em placas indicadoras e incubadas a 37 ºC durante 2 a 3 horas.

Produção de metabólitos:

[136] Este método permite a avaliação da capacidade de microrganismos geneticamente modificados para produzir metabólitos de interesse a partir da biomassa ou um derivado de biomassa.

[137] O teste é realizado a 30 “C.

[138] A partir das pré-culturas (em fase estacionária), preparadas no meio complexo de glicose, 6 ml de meio enriquecido são semeados (semeadura a 1% v/v).

[139] Os meios de cultura enriquecidos testados são Meio Complexo de Glicose, Meio de Sacarose Definido, Meio de Amido Definido.

[140] Meio Complexo de Glicose contém: 29/L de peptona, 59/L de extrato de levedura e 10g9/L glicose em água submetida a osmose: solução esterilizada em autoclave (15 minutos a 120ºC). A esta solução são adicionados as seguintes soluções: solução tampão MOPS (10X) pH7 [ácido MOPS 400mM, NH.Cl 200mM, NaOH 100mM, KOH 100mM, CaCl, 5uM, NasSO, 2,76mM, MgCl, 5,28 mM]; micronutrientes (10000X) [ (NH4) 6 (Mo7) 24 300mM, H;BO; 4mM, CoCl, 0,3mMM, CuSO. O0,l1mM, MnCl2 2,5 mM, ZnSO0s O,l1mM]; FeCl3;(100X) 2mM em Ci«HsNaãaO3z 720mM; 19/L de K;HPOs,: soluções esterilizadas por filtração (0,2um).

[141] Meio Definido contém: 10g9/L de fonte de carbono em água submetida a osmose: solução esterilizada em autoclave (15) minutos a 120 “*C). A esta solução são adicionadas as seguintes soluções: Solução tampão MOPS (10X) pH7 [ácido MOPS 400mM, NH.Cl 200mM , NaOH 100mM , KOH 100mM , CaCcl,; 5pM, Na;SO, 2,76mMM, MgCl, 5,28 mM]; micronutrientes (10000X) [(NHa)s(Mo;)x 300mM, H;BO; 4mM, CoCl, WO0,3mM, CuSO, 0, 1mM, MnCl 22,5 mM, ZnSO0. O,l1mM]; FeCl3(100X) 2MM em CÊ«HsNazO7; 20mM; K2HPO0, l1g/L: soluções esterilizadas por filtração (0,2um).

[142] A estes meios de cultura, com exceção de cepas do tipo selvagem, cloranfenicol é adicionado antes da semeadura: 3 ug/mL do meio de cultura.

[143] As culturas são realizadas tanto em aerobiose e anaerobiose (Biomerieux, Genbag).

[144] Culturas em condição de aerobiose são deixadas na incubadora a 30 “*C, sob agitação, durante 7 dias. As culturas são então centrifugadas durante 10 minutos a 4000rpm. Os sobrenadantes são filtrados (0.2um), vertidos em outros tubos, e colocados a -80ºC.

[145] Culturas em anaerobiose condição são deixadas na incubadora a 30 ºC durante 4 semanas. As culturas são então centrifugadas durante 10 minutos a 4000 rpm. Os sobrenadantes são filtrados (0,2UM), vertidos em outros tubos, e colocados a -80ºC.

[146] Análise Cromatografia Gasosa FID (coluna Varian CP-WAX 57 CB 25m*0,32mm) foi utilizado para quantificar os álcoois. os ácidos orgânicos foram quantificados por Cromatografia Líquida de Espectroscopia de Massa (MicrOTOF-QII Bruker) ou Eletroforese Capilar (2,6- ácido piridinadicarboxílico 5 mM; de 0,5 mM brometo de cetilmetilamônio; tampões ajustados a pH 5,6/ 6lcm de comprimento, capilar Agilent com 50um de diâmetro). Glicose residual foi quantificada por HPLC associada a refratometria (coluna Phenomenex LUNA 3um NH2 100A 150*4, 6mm, acetonitrila/H20 85:15 de fase móvel).

[147] Os ácidos e as produções de etanol foram monitoradas para as diferentes cepas após 7 dias de crescimento em meio contendo trigo 3% - 6%, em condições aeróbias.

[148] B. Engenharia de uma cepa de Deinococcus com unidade transcricional reconstruída de degradação da biomassa em 2 genes.

[149] D. geothermalis DSM 11300 é usada como cepa-mãe. Em duas séries de experiências, o mesmo protocolo é aplicado a outra Deinococcus ou bactérias relacionadas a seguir enumeradas:

[150] DRHOS5 D. geothermalis DSM 11300

[151] DRHO06 D. geothermalis DSM 11301

[152] DRHO7 D. geothermalis DSM 11302

[153] DRH37 D. geothermalis HAMBI 2481

[154] DRIB 8 D. geothermalis HAMBI 2480

[155] DRIB 9 D. geothermalis HAMBI 2411

[156] DRH41 D. geothermalis HAMBI 2791

[157] M36-7D D. geothermalis

[158] DR1 D. radiodurans ATCC 13939

[159] M1 1-9D D. murrayi CNCM 1-4155

[160] M13-1A D. murrayi CNCM 1-4157

[161] Bl. Supressão do gene de codificação wt a-amilase 12 103 (amy)

[162] Um fragmento de DNA contendo o gene de resistência à Bleocin (Bleo) colocado sob o controle de um promotor pTufA foi inserido no cromossoma da cepa de origem, substituindo o gene que codifica a-amilase endógena 12 1103 por recombinação homóloga, gerando a cepa DG 06. A inserção foi realizada utilizando fragmentos de 500 pb para as regiões homólogas diretamente a montante e a jusante do gene de codificação a-amilase endógena. A substituição completa de toda a a-ramilase da moldura de leitura aberta do ATG para o códon de parada foi confirmada por PCR e sequenciamento.

[163] B2. A inserção do gene de codificação a- amilase M23r 3A.18 109-(amyl), a partir da cepa M23-3A, no locus amy

[164] Um fragmento de DNA portador do gene de codificação da a-amilase M23r-3A.18 109 (amyl-SEQ ID NO: 1) no operon com um gene de resistência ao cloranfenicol (cat, SEQ ID NO: 23) e colocado sob o promotor pTufB foi inserido no cromossoma da cepa DG 06 (amy::ptufA-bleo), substituindo pTufA-bleo e grando a cepa DG 02 (amy::pTufB-amil-cat). A inserção foi realizada utilizando fragmentos de 500 pb homólogos às regiões diretamente a montante e a jusante do cassete pTufA-Bleo, substituindo portanto, a substituição de todo o cassete pTufA-Bleo. Inclusão foi verificada por substituição de marcador (Bleo para cat) e PCR. A sequência de codificação de amyl é fundida a uma sequência peptídica de sinal N-terminal para permitir a secreção da proteína.

[165] B3. A inserção do gene que codifica à a amilase M23r-3A.305 673, amy2), a partir da cepa M23-3A, a jusante do gene amyl

[166] Um fragmento de DNA contendo o gene de codificação da a-amilase M23r-3A.305 673. amy2, SEQ ID NO: 3) o cassete de resistência pTufA-bleo foi inserido no cromossoma da cepa DG 02 (amy::pTufB-amyl-cat), diretamente a jusante do gene amyl e substituindo o gene de resistência cat. A inserção foi realizada utilizando fragmentos de 500 pb para as regiões homólogas diretamente a montante e a jusante do gene cat, por conseguinte, a exclusão do gene cat inteiro. A cepa resultante, DG 04 (amy::pTufB-amyl-amy2-pTufA-bleo), abriga um operon de ambas amilases colocadas sob o controle do promotor pTufB. Inclusão foi verificada por substituição do marcador (cat para bleo) e a estrutura de operon confirmada por PCR.

[167] B4. Expressão de amilases e atividade amilolítica das bactérias reconstruídas a- Ensaio amilolítico em placas

[168] As células foram cultivadas em meio rico em PGY para fase exponencial tardia. 2-8 1pl de cultura (quantidade normalizada de acordo com a DO600nm) foram então colocadas em placas de meio mínimo contendo 0,5% de amido e incubadas a 37ºC.

[169] Após 3 dias, os halos amilolíticas foram visualizados utilizando coloração de iodo de Gram

[170] Os resultados são apresentados na figura 2 e mostram a presença de uma atividade de amilase forte nas cepas reconstruídas.

b- Caracterização amilolítica da cepa DG 04

[171] Cepa DG 04 (amy::pTuffi-M23r2A.18 109- M23r-2A.305 673-pTu/A-bleo) contendo a-amilases M23r- 2A.18 109 e M23r-2A.305 673 foi cultivado em meio mínimo definido contendo 0,5% de amido solúvel (Sigma S976). O meio foi enriquecido com 5 mM CaCl; e 6 ug/ml Bleomycin (Calbiochem 203408). Cultivos foram realizadas em frascos de agitação de 5L contendo 2L de meio. As amostras foram coletadas diariamente e medidas para OD600 e atividade de a- amilase.

[172] Conforme apresentado na Figura 3, uma atividade alfa-amilase é observada, e a maior parte da atividade foi detectada a partir da superfície das células.

[173] Extração de Triton X-100 foi testado para o pellet de células para liberar a atividade de a-amilase localizada na superfície da célula. As células foram suspensas em tampão de 100 mM MOPS contendo CaCl; 2 mM e

Triton X-100 foi adicionado a uma concentração final de 0,1%. As amostras foram bem misturadas e incubadas à temperatura ambiente durante 15 min. Após a incubação, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi analisado para a atividade a-amilase. Aproximadamente 45% da atividade a-amilase pode ser liberada da superfície da célula por extração de Triton.

[174] Sobrenadantes de cultura de DG 04 concentrados, células e os extratos de Triton foram ainda analisados por SDS-PAGE e a técnica de zimograma (Figura 4). A cepa amilolítica de Deinococcus M23-3A foi usada como uma cepa de referência. DG 4 mostrou cinco bandas ativas sobre o gel de zimograma. Duas bandas principais foram detectadas perto de 100 kDa enquanto duas outras bandas ativas situadas perto de 65 kDa. O peso molecular teórico da a-amilase alvo (2n a-ramilase) é de 109 kDa e uma das principais bandas mais provavelmente representa a enzima alvo. Uma banda fraca foi observada cerca de 50 kDa, que corresponde ao peso molecular da primeira a-amilase (MW = 53kDa). A cepa de origem contém vários genes amilolíticos. No entanto, as sequências de sinal claras foram identificadas a partir de apenas dois genes de a-amilase inseridos. Assim, as bandas não identificadas podem ser originárias da degradação proteolítica das enzimas extracelulares ou lise celular parcial liberando atividades intracelulares. Artefatos de gel e agregados de proteína também são possíveis explicações para os resultados de zimograma devido às condições de não redução utilizadas na análise. Atividades mais elevadas, com a cepa de origem foram detectadas na amostra de sedimento celular (pista 5) e uma vez que atividade pode em parte ser liberada das superfícies de células com extração de Triton, é sugerido que a purificação da segunda a-amilase será realizada a partir de extratos de Triton. Com a atividade amilolítica da cepa selvagem M23-3A muito fraca com um peso molecular de 50 kDa foi detectada no sobrenadante da cultura (pista 2), enquanto que foram observadas duas bandas ativas próximas de 100 kDa na amostra de pellet celular (pista 4). Os resultados sugerem que, em cepa selvagem M23-3A, a menor oao-amilase M23r- 2A.18 109 (1º a-amilase) está localizada no sobrenadante da cultura. Em contraste, a maior a-amilase (2º-amilase) M23- 3A.305 673 é encontrada a partir das superfícies de células.

[175] C. Engenharia de uma cepa de Deinococcus com uma unidade reconstruída de 3 genes de degradação da biomassa

[176] Um fragmento de DNA contendo a sequência de codificação a-L-arabinofuranosidase 61 237 (arabinofur) da cepa DRH46 e um cassete de resistência ao cloranfenicol pgroESL-cat foram inseridos no gene da cepa DG 04 (amy:: pTufB-amyl-amy2-pTufA-bleo), diretamente a jusante do gene amy2, removendo pTufA-Bleo e colocando o gene arabinofur no mesmo operon que as amilases. A inserção foi realizada utilizando fragmentos de 500 pb para as regiões homólogas diretamente a montante e a jusante do cassete de pTufA-Bleo, portanto, a substituição de todo o cassete pTufA-Bleo. A cepa resultante DG 16 (amy: :pTufB-amil-amy2-arabinofur-pgroESL- cat), foi verificada para a substituição do marcador (Bleo para cat) e sua estrutura operon confirmada por PCR.

[177] D. Engenharia de uma cepa de Deinococcus com uma unidade reconstruída de 4 genes de degradação da biomassa

- Inserção do gene que codifica a endocelulase DRH46.66 2727 f(fendocell), a partir da cepa DRH46, a jusante do gene arabinofur

[178] Um fragmento de DNA abrigando o seguinte construto (pTufA-endocell-Bleo), onde o gene que codifica a endocelulase 66 2727 da cepa DRH046 é em operon com o gene de resistência à Bleo e colocado sob o controle de um promotor pTufA, é inserido a jusante do gene no gene arabinofur da cepa DG 16, originando a cepa DG-16B (amy::pTufB-amyl-amy2- arabinofur-pTufA-endocell-bleo).

[179] E. Engenharia de uma cepa de Deinococcus com uma unidade reconstruída de 5 genes de degradação da biomassa

[180] Um cassete de inserção que contém o gene que codifica exocelulase 284 1-4 (exocell) a partir da cepa M1-3H seguido por uma sequência que codifica para a unidade pgroESL-sacBBs-cat transcricional [sacB, gene levanossacarase de Bacillus subtilis, em operon com o gene de resistência cat e sob o controle do promotor pgroESL] é usado para inserção em operon com o gene endocell no gene da cepa DG 16B, resultando na cepa DG 16C (amy::pTufB-amyl-amy2-arabinofur- pTufA-endocell-exocell-pgroESL-sacB-cat).

[181] F. Engenharia de bactérias Deinococcus com uma unidade transcricional da produção de álcool e uma unidade de degradação da biomassa

[182] Uma unidade de produção de etanol que compreende um gene PDC e um gene ADH, foi introduzida nas células, além da unidade de degradação da biomassa.

[183] Fl. Em um primeiro conjunto de experimentos, um cassete contendo um operon com o gene de codificação de piruvato descarboxilase (pdczm) de Zymomonas mobilis e o gene de codificação do álcool desidrogenase (adhzm) de Z. mobilis, colocado sob o controle do promotor pgroESL, um cassete pTufA -Bleo de resistência a bleocina, foram inseridos no cromossoma da cepa DG 16 em lugar tanto do gene endógeno pta (26 1230) codificando a fosfato acetil- transferase ou de todo o operon produção de acetato, contendo o gene de fosfato acetil-transferase (pta, 26 1230) e o gene da acetato quinase (ack, 26 1224). As cepas resultantes são denominadas DG 17 (amy: : PpTufB-amyl-amy2-arabinofur; pta: :pgroESL-pdezm-adhzm-pTufA-bleo) e DG 19 respectivamente.

[184] Para a supressão do gene pta, 500bp fragmentos homólogos às regiões diretamente a montante e jusante do gene pta foram usados como regiões de homologia. Para evitar o efeito polar no gene ack vizinho (em operon com o gene pta), o primeiro códon ATG de pta foi conservado.

[185] Para a inserção no lugar de todo o operon de produção de acetato, 500pb fragmentos homólogos às regiões diretamente a montante e a jusante do operon ack-pta foram utilizados como regiões de homologia.

[186] A capacidade e desempenho destas bactérias para hidrolisar o amido foram determinados como descrito na seção experimental. Os resultados estão resumidos na Tabela 1 abaixo: —=— (%) Be Ba Dei [8 | Bem Br

[187] Estes resultados mostram a expressão da unidade de degradação da biomassa, não confere uma melhor capacidade para hidrolisar o amido para a bactéria. Além disso, a bactéria ainda está viável e a unidade reconstruída não afeta as propriedades de crescimento.

[188] Como mostrado na tabela 2 a seguir, enquanto que nem DG nem DG 16 produziram etanol nas condições testadas, DG 17 produziu uma quantidade substancial de etanol, e não só em tubos, mas também nos reatores 1L.

Tabela 2 Produção de | Produção de | Produção de EtOH (%) em | ECOH (%) em | [ELCOH (%) em trigo a 3% trigo a 6% trigo a 6%

E DR DC DG 16 A DE 17 Experimentos Experimentos realizados em|realizados em tubos biorreatores de 1L

[189] F2. Em outra etapa de experimentos, outra unidade de produção de etanol foi construída e inserida nas células. Nestes experimentos, seguindo as estratégias similares como em Fl, duas novas cepas foram produzidas a partir de DG 16, utilizando sequências de codons DRHO5 de Deinococcus otimizados de PDC (SEQ ID NO: 16) e genes adh (SEQ ID NO: 18), originando cepas DG 1 8 (amy::pTufB-amyl- amy2-arabinofur; pta: :pgroESL-pdezm*-adhzm*-pTufA-bleo) e DG 20 (amy: :pTufB-amyl-amy2-arabinofur; pta/ack: :pgroESL- pdezm*-adhzm *-pTufA-bleo).

[190] F3. Inserção de um gene que codifica ADH dependente de NADP

[191] Uma análise da relação de fluxos metabólicos mostrou que, na cepa de origem D, até 56% de glicose é consumida através da Via de Pentose Fosfato, o que indica que uma parte importante do NADPH é produzido como potencial redox. A fim de usar este pool de NADPH para a produção de EtOH, um gene de ADH que codifica dependente de NADP de Moorella sp HUC 22-1 é introduzido no gene das cepas DG 17 e DG 18, a jusante do gene de ADH dependente de NAD a partir de Z. mobilis.

[192] Estas novas cepas, denominadas “DG 21 (amy: : TufB-amyl-amy2-arabinofur; pta: :pgroESL-pdezm-adhzm- adhMo-pTufA-kan) e DG 22 (amy::pTufB-amyl-amy2-arabinofur; pta/ack: :pgroESL-pdcezm*-adhzm*-cidhMo-pTufA-kan), foram obtidas por seleção das cepas em placas contendo kanamicina.

[193] Essas cepas expressam dois tipos diferentes de ADH, um dependente de NAD e um dependente de NADP. Como mostrado na tabela 3 a seguir, a co-expressão realmente maximiza a produção de etanol. Na verdade, em comparação com o DG 17, a cepa DG-21 produziu 5 vezes mais etanol em biorreatores de 1L como um resultado da expressão de ambos os genes ADH. Tabela 3 Produção de | Produção de | Produção de EtOH (%) em | ECOH (&) em | ELCOH (%) em trigo a 3% trigo a 6% trigo a 6% Pee |

ESET CR PC Bean E E Dz Experimentos realizados em|Experimentos tubos realizados em biorreatores de 1L

[194] F4. Conclusão da unidade de degradação da biomassa através da inserção do gene que codifica a endocelulase DRH46.66 2727 (endocell), a partir da cepa DRH46, a jusante do gene arabinofur

[195] Um fragmento de DNA portador do seguinte construto (pTufA-endocell-Bleo), onde o gene que codifica a endocelulase DRH46.66 2727 é em operon com o gene de resistência à Bleo e colocado sob o controle de um promotor pTufA, foi inserido a jusante do gene no gene arabinofur da cepa DG 21 (amy::pTufB-amyl-amy2-arabinofur; pta::pgroESL- pdcezm-adhzm-adhMo-pTufB-kan), gerando a cepa DG 23 (amy: :pTufB-amyl-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-bleo; pta: :pgroESL-pdcezm-adhzm-adhMo-pTufA-kan). A inserção foi realizada utilizando fragmentos de 500 pb para as regiões homólogas diretamente a montante e a jusante do gene cat, portanto, a substituição do gene cat inteiro. A cepa foi verificada para a substituição do marcador (cat para Bleo) e confirmado por PCR.

[196] O gene que codifica a endocelulase foi também introduzido na cepa DG 22, gerando a cepa DG 24 (amy: :pTufB-amyl-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-bleo; pta: :pgorESL-pdezm *-adhzm *-adhMo-p TufA -kan) .

[197] F5. A inserção do gene que codifica a exocelulase Ml1-3H.284 1-4 (exocell), a partir da cepa Ml1-3H, no operon com o gene endocell

[198] Um cassete de inserção que contém o gene que codifica exocelulase 284 1-4 (exocell) seguido por uma sequência que codifica a unidade transcricional pgroESL- sacBBs-cat [sacB, gene levanossacarase de Bacillus subtilis em operon com o gene de resistência cat e sob o controle do promotor pgroESL] foi usado para a inserção no cromossoma de DG 23 e DG 24, resultando nas cepas DG 25 (amy::pTufB-amyl- amy2-arabinofur-pTufA-endocell-exocell-pgroESL-sacB-cat, pta: :pgroESL-pdezm-adhzm-adhMo-pTufB-kan) e DG 26 (amy: :pTufB-amyl-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-exocell- pgroESL-sacB-cat, pta: :pgroESL-pdezm*-cidhzm*-cidhMo-pTufA- kan). A inserção foi realizada utilizando fragmentos de 500 pb para as regiões homólogas diretamente a montante e a jusante do gene Bleo, portanto, a substituição do gene Bleo inteira. A cepa resultante foi verificada por PCR, para a estrutura do operon, e para à substituição do marcador (bleo para cat).

[199] G. Inserção de uma via de produção de etanol não-GMO em DG 16

[200] Um operon de produção de etanol com o gene de codificação de acetaldeído desidrogenase (DSM22328.88 978) de Deinococcus misasensis (SEQ ID NO: 11) e o gene que codifica o álcool desidrogenase (DRH46.26 648) a partir de Deinoccocus cellulosilyticus DRH46 (SEQ ID NO: 13), colocado sob o controle do promotor paroESL, e o cassete de resistência à bleocin, pTufA-Bleo foi inserido no cromossoma da cepa DG 16 em vez do gene endógeno pta (26 1230) de codificação do fosfato acetil-transferase. A cepa resultante é chamada DG 29 (amy: :pTufB-amyl-amy2-arabinofur; pta: :pgroESL-acdhDSM22328-adhdrh46-pTufA-bleo).

[201] H. Limpeza final de cepas modificadas a partir de genes de resistência a antibióticos

[202] Para excluir a unidade transcricional pgroESL-sacBBs-cat, um fragmento de DNA que abriga as sequências das regiões de flanqueamento pgroESL-sacBBs-cat,

está inserido no cromossoma da cepa DG 25 e DG 26. A mesma estratégia foi usada para remover o gene de resistência a Kanamicina do operon de "etanol". O gene sacB de B. subtilis é utilizado como um marcador contra-selecionável, uma vez que codifica para a toxicidade a sacarose. As estruturas de operon finais foram confirmadas por PCR e sequenciamento.

[203] Otimização da produção de etanol pela deleção vias de competição do metabolismo

[204] Exclusões de quatro genes alvo que codificam atividades competitivas são feitas em série utilizando o seguinte cassete de eliminação/limpeza. A estrutura do cassete contém a unidade de transcrição sacBss- cat (gene da levanossacarase de B. subtilis em operon com o gene cat de resistência ao cloranfenicol) sob o controle do promotor pgroESL. Este cassete é inserido no cromossoma das cepas DG no lugar dos genes-alvo (um de cada vez), usando seleção de bleocin. Para cada inserção, um fragmento de DNA secundário, onde as duas regiões cromossómicas flanqueadoras do locus alvo são montadas, é usado para obter uma eliminação limpa, eliminando a unidade pgroESL-sacB-cat a partir do cromossoma e de contra-seleção em meio contendo sacarose.

[205] Este método é utilizado para as seguintes deleções genéticas: - O gene que codifica a alanina desidrogenase 31 22 - O gene que codifica a glicose-desidrogenase 1 (GDH1) 52 885 - O gene que codifica a glicose-desidrogenase 2 (GDH2) 22 1025 - o gene que codifica fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) 52 1088

- o gene que codifica o fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) 12 1095 - O gene que codifica a Malato desidrogenase 34 424

[206] J. Produção otimizada em fermentadores

[207] Cepa DG 21 foi cultivada em sistema fermentador de 1L Infors HT multifors 2 vezes. Condições de cultura para ambos os recipientes foram de 45 ºC de temperatura, velocidade de 400 rpm, agitador, fluxo de ar de 65 mL/min, pH 7 foi mantido por NaOH 1 M e H;PO, 1,5 M.

[208] O inóculo foi cultivado em frascos de agitação em meio complexo com 10 g/L de glicose.

[209] O antibiótico Bleocin foi adicionado com uma concentração final de 6ug/mL. Condições para culturas de inóculos foram de 45 ºC e 150 rpm. Primeiras células foram inoculadas a partir de estoque de glicerol para frascos de 250 ml de Erlenmeyer, contendo cada um 20 ml do meio.

[210] Após 16 h, frascos Erlenmeyer de 1 L contendo 200 ml de meio fresco foram inoculados em OD600nm 0,05 e foram incubados durante 22 horas. As quantidades adequadas de suspensão de células a partir de frascos de 250 mL de Erlenmeyer foram centrifugadas e ressuspensas em um frasco de inóculo contendo 10 ml de meio complexo com 10 g/L de glicose. As células foram transferidas de garrafa de inóculo aos recipientes com seringa.

[211] Meio de cultivo foi preparado pelo peso dos componentes em uma garrafa e preenchida a garrafa para a marca de 1 L com água fria da torneira. O meio foi em seguida vertido para um recipiente e 1 mL de anti-espuma de sílica diluída 1:10 foi adicionado na mistura para evitar a formação de espuma durante a esterilização. Os recipientes foram em seguida autoclavados a 121 º C durante 25 minutos. Meios de cultura usados em cada recipiente são descritos abaixo: Recipiente | Substrato NHaC1l K2HPO, CaCl>7,2H;0 o RS ee fes 2 Leite de |1 1 0,5

PET E

[212] As coletas foram feitas manualmente a cada dia através da linhagem de amostragem, utilizando um frasco estéril. A partir destas amostras, foram realizadas várias análises: - Quantificação da biomassa foi feita através da realização de método de aPCR.

- Glicose livre foi quantificada usando um analisador YSI.

- A análise por cromatografia gasosa FID (Varian CP-WAX 57 CB 25m *coluna de 0,32 milímetros) foi usada para quantificar os álcoois.

- Os ácidos orgânicos foram quantificados por Cromatografia Líquida de Espectroscopia de Massa (MicrOTOF- QII Bruker).

[213] Os resultados são apresentados a seguir. Eles mostram que, em fermentadores, DG 21 pode produzir títulos de etanol perto de 2 g/L. Além disso, eles mostram que a cinética de produção é muito positiva, em que o baixo consumo de glicose e a densidade elevada de células pode ser alcançado, documentando ainda os desempenhos notáveis das bactérias da presente invenção.

[214] Mais particularmente, a Figura 5 mostra que uma densidade de células de biomassa de cerca de 7 g/L pode ser alcançada para a fase estacionária após a cultura de trigo, e que o consumo de glicose continuou mesmo na fase estacionária.

[215] A Figura 6 mostra que a produção de etanol foi linear e atingiu aproximadamente 2 g/L em 96 horas de cultura. Quando a glicose estava esgotada do meio, a produção de etanol não aumentou mais e um plateau foi observado. Correlativamente, succinato e acetato foram detectados no sobrenadante, chegando respectivamente a cerca de 3,0 g/L e 1,2 g/L.

[216] A Figura 7 mostra que, após a cultura em leite de amido, uma densidade de células de biomassa de cerca de 15 g/L pode ser alcançada em fase estacionária, e que o consumo de glicose continuou mesmo na fase estacionária. Depois de 144 horas, o total de glicose remanescente era cerca de 20 g/L, o que indica uma taxa de consumo baixa de glicose.

[217] A Figura 8 mostra que a produção de etanol aumentou gradualmente, atingindo aproximadamente 2 g/L em 144 horas de cultura no leite de amido. Correlativamente, a produção de acetato diminuiu drasticamente.

[218] Estes resultados, por conseguinte, ilustram o desempenho das bactérias para produzir etanol a partir de níveis elevados de biomassa.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA, caracterizada por compreender uma unidade transcricional reconstruída de degradação da biomassa inserida no seu genoma, a dita unidade compreendendo pelo menos dois genes sob o controle de um único promotor, os ditos pelo menos dois genes codificando enzimas de degradação da biomassa distintas envolvidas na degradação ou hidrólise de biomassa em açúcares fermentáveis, preferencialmente selecionadas a partir de amilases, arabinofuranosidases, celulases, xilanases, lacases, alfa-glucuronidases e esterases, preferencialmente a partir de amilases, arabinofuranosidases e celulases.

2. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita unidade compreender três genes sob o controle de um único promotor, cada um dos ditos três genes codificando uma enzima de degradação da biomassa distinta selecionada a partir preferencialmente de amilases, arabinofuranosidases e celulases.

3. BACTÉRIA, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pela dita unidade compreender, sob o controle do dito promotor único, 2 genes distintos de amilase, ou 1 gene de amilase e 1 gene de arabinofuranosidase, ou 2 genes distintos de amilase e 1 gene de arabinofuranosidase, e opcionalmente a dita unidade compreender ainda pelo menos um gene adicional, preferencialmente pelo menos um gene de celulase, mais preferencialmente 1 gene de endocelulase e 1 gene de exocelulase, sob o controle de um segundo promotor.

4. BACTÉRIA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela amilase(s) ser

(serem) amilases alfa, de preferência selecionadas a partir de amilases que compreendem a SEQ ID NO: 2 ou 4 (sequências de aminoácidos), a celulase(s) ser (serem) endocelulase(s) ou exocelulase(s), preferencialmente selecionada a partir de celulases que compreendem a SEQ ID NO: 8 ou 10 (sequências de aminoácidos), e/ou a arabinofuranosidase compreender a SEQ ID NO: 6 (sequência de aminoácidos).

5. BACTÉRIA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela dita bactéria ser uma bactéria Deinococcus e as ditas enzimas de degradação da biomassa originárias de bactérias Deinococcus.

6. BACTÉRIA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo único Ou oO segundo promotor ser selecionado de um promotor PpTufA, promotor pTufB, ou promotor pGroESL de Deinococcus.

7. BACTÉRIA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela unidade transcricional reconstruída da degradação da biomassa não conter ácido nucleico derivado de não-Deinococcus e/ou ser inserida no genoma da dita bactéria em substituição de um gene endógeno, preferencialmente um gene endógeno da amilase.

8. BACTÉRIA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela dita bactéria compreender ainda uma unidade transcricional recombinante de produção de álcool, preferencialmente uma unidade transcricional recombinante de produção de etanol, preferencialmente compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando um álcool desidrogenase, preferencialmente um ADH dependente de NADP e/ou uma piruvato descarboxilase,preferencialmente dita unidade transcricional de produção de álcool sendo inserida no genoma da dita bactéria, preferencialmente em substituição de um gene endógeno de fosfato acetil transferase.

9. DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA, caracterizada pela dita bactéria conter um gene de fosfato acetil transferase inativado ou compreender pelo menos uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma ADH dependente de NADP.

10. BACTÉRIA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser uma D. geothermalis, D. cellulolysiticus, D. radiodurans, D. proteolyticus, D. radiopugnans, D. radiophilus, D. grandis, D. indicus, D. frigens, D. saxicola, D. maricopensis, D. marmoris, D. deserti, D. murrayi, D. aerius, D. aerolatus, D. aerophilus, D. aetherius, D. alpinitundrae, D. altitudinis, D. apachensis, D. aquaticus, D. aquatilis, D. aquiradiocola, D. aquivivus, D. caeni, D. claudionis, D. ficus, D. gobiensis, D. hohokamensis, D. hopiensis, D. misasensis, D. navajonensis, D. papagonensis, D. peraridilitoris, D. pimensis, D. piscis, D. radiomollis, D. roseus, D. sonorensis, D. wulumugiensis, D. xibeiensis, D. xinjiangensis, D. yavapaiensis ou D. yunweiensis.

11. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma bactéria, conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, e pelo menos uma outra bactéria.

12. EXTRATO ENZIMÁTICO DE UM DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA, caracterizado por ser conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

13. BIOCATALISADOR, caracterizado por compreender uma bactéria, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou um extrato, conforme definido na reivindicação 12.

14. PROCESSO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE BIOMASSA, caracterizado por compreender a exposição de uma biomassa a um Deinococcus ou bactéria, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou a um extrato, conforme definido na reivindicação 12, ou a uma composição, conforme definida na reivindicação 11.

15. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM ÁLCOOL, preferencialmente etanol, caracterizado por compreender a exposição de um açúcar ou biomassa a um Deinococcus Ou bactéria, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a um extrato, conforme definido na reivindicação 12, ou a uma composição, conforme definida na reivindicação 11.

16. USO DE UM DEINOCOCCUS OU BACTÉRIA RELACIONADA, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou de um extrato, conforme definido na reivindicação 12, ou de uma composição, conforme definida na reivindicação 11, caracterizado por ser para produzir um álcool, preferencialmente etanol.

Degradação da biomassa 1 121103 2 —NEBENC=——-——.— Cromossoma WT > | Geneamy ./ ST on DP Deleção do gene endógeno amy Lt fa Inserção do cassete construído em sobreposição de PCR Vetor usado: pMD66 Prospecção: bleoR, PCR, sequenciamento AN DME Px Inserção do gene pTufB- amy 1 DN 3 À >. — Inserção do cassete construído em sobreposição de PCR Vetor usado: pMDS6 1 : 2 Prospecção: bleoS, catR, PCR, sequenciamento, x 7 > amilolítico X a A A PA & Deleção do gene amy 2 7 oNfa SS Inserção do cassete sintetizado pela Eurogentec À À Vetor usado: pucS7 COI emy2 | be] Prospecção: bleoR, cats, PCR, sequenciamento, a 2 amilolítico s ore omfa . . : à à : Inserção do gene arabinofur , Inserção do cassete sintetizado pela Eurogentec LL omyi [| amy2 | Bleo Vetor usado pucô? NX, e Prospecção: bleoS, catR, PCR, sequenciamento A see / X À NX A, [ Lorabinofu | car | 4 2 Figura 1

DG O DG 4 wT amy::oTufB-omy1 omy::eTufB-omy1-0my2 Figura 2 2 os nu a x - ["”. os 7x FE E P Sobrenadante Ãã 7 3 o JÔ? DG EA Í Tt f Células DG (a) : / E. / télulas DG (a) 8» 7 zo Y aSobrenadante 9 os / É É DG (b) f.

Z o o% / a" É — Células DG. a + É » É Í 7 = | 8 A o% 00 dam o O 40 60 mo amo am o so 100 Tempo de cultivo (h) Tempo de cultivo (h) Figura 3

IT EE e en EEE no - i os E tas - A s— tas - me — - -—. pe à tó E s mm

DP EE po saem Figura 4 25,00 crer EEE e, o É NAO o PR TARA 2000 EEB US OE Po ASA ARE UE Ea 1500 AÇO ESRIaTt EO: &— Glicosetotalg/L) : as , E e * Ao e é Ne me cos res) 1000 | ea ob ST; que SS E += Biomassa Xg/L) 500 [CA NO ESET mo GE fBEasAa Er DIE IS ORI manias ea o so fe Figura 5

Sã “e Succinato g/L) vs e Acetatog/L) 1 mt EtOH g/L os o o 50 100 Tempo horas Figura 6 40,00 35,00 30,00 25,00 = 20,00 —- Glicosetotal g/L) 15,00 Mm Glicose livre g/L) 40,05 4 Biomassa Xg/L) ã 5,00 0,00 o so 100 Tempo horas Figura 7

Figura 8