BR112014014555B1

BR112014014555B1 - processo para a remoção seletiva de vírus e/ou de adn de vírus de uma solução aquosa

Info

Publication number: BR112014014555B1
Application number: BR112014014555A
Authority: BR
Inventors: Jansson Kepka Cecilia; Johansen Poul
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2020-04-14
Also published as: CN104023752A; KR20140114814A; ES2556004T3; CN104023752B; US20140335594A1; JP2015500860A; NZ625182A; KR101967707B1; WO2013092741A1; BR112014014555A8; CA2861629A1; US9676817B2; AU2012357108A1; JP6141867B2; AU2012357108B2; EP2793956B1; EP2793956A1; CA2861629C; DK2793956T3; BR112014014555A2

Abstract

processo para a remoção seletiva de vírus e/ou de adn de vírus de uma solução aquosa a presente invenção se refere a um processo para a remoção seletiva de vírus e/ou de adn de vírus de uma solução compreendendo uma proteína alvo, em que é utilizada acetona como um agente de precipitação para fazer precipitar o vírus e/ou o adn de vírus, bem como a proteína alvo.

Description

“PROCESSO PARA A REMOÇÃO SELETIVA DE VÍRUS E/OU DE ADN DE VÍRUS DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA”

ÁREA DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção se refere a um processo para a purificação de uma proteína

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] As proteínas isoladas a partir de fontes animais são suscetíveis de estar contaminadas com partículas de vírus e/ou ADN de vírus que é indesejado quando as proteínas devam ser usadas, por exemplo, em alimentos ou produtos farmacêuticos. São conhecidos processos para a purificação de tais proteínas, que também irão reduzir os níveis de partículas de vírus e/ou de ADN de vírus, tais como a cromatografia, filtração, centrifugação, extração ou precipitação. No entanto, em alguns casos a purificação de uma proteína de interesse é difícil, consome tempo e/ou é onerosa. Por consequência, é um objetivo da presente invenção revelar um processo para a remoção, de uma proteína de interesse, de quaisquer partículas contaminantes de vírus e/ou de ADN de vírus. Um tal processo deverá ser rápido, útil à escala industrial, de baixo custo e eficaz.

[0003] A tripsina (EC 3.4.21.4) é uma protease de serina, que se encontra no sistema digestivo de muitos vertebrados, onde hidrolisa as proteínas. A tripsina está disponível em grande quantidade no pâncreas de mamíferos e, por exemplo, a tripsina de porcinos e bovinos pode ser purificada muito facilmente. Deste modo, a tripsina tem sido utilizada largamente em vários processos biotecnológicos. Além disso, a tripsina é usada na alimentação de crianças para assegurar uma pré-digestão da proteína.

[0004] O circovírus tipo 2 de porcinos (PCV2) é um pequeno vírus não envelopado, que replica autonomamente em células eucarióticas. É o agente etiológico do síndroma debilitante multissistémico pós-desmame

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 7/37 / 16 (PMWS), uma nova doença emergente e multifatorial nos suínos.

[0005] Constitui um objetivo da presente invenção revelar um processo para a remoção de partículas de vírus PCV2 e/ou de ADN do vírus da tripsina extraída das glândulas pancreáticas de porcinos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] A invenção revela um processo para a remoção seletiva de vírus e/ou de ADN de vírus de uma solução aquosa compreendendo uma proteína alvo, compreendendo o referido processo:

a) a adição de acetona à solução, a uma concentração que precipita seletivamente o vírus e/ou o ADN de vírus,

b) a realização de uma etapa de separação, para separar o material precipitado da solução contendo a proteína alvo,

c) a adição à solução de uma quantidade adicional de acetona para se alcançar uma concentração final que precipite a proteína alvo, e

d) a recolha, da solução, da proteína alvo precipitada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0007] A presente invenção providencia um processo para a remoção seletiva de vírus e/ou de ADN de vírus de uma solução aquosa contendo uma proteína alvo, compreendendo o referido processo:

d) a recolha, da solução, da proteína alvo precipitada.

[0008] Para se evitar qualquer possível dúvida: As etapas são realizadas pela ordem descrita. Ou seja, a separação na etapa b) é realizada para separar o material precipitado da etapa a) da solução que contém a

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 8/37 / 16 proteína alvo. Na etapa c) é adicionada uma quantidade adicional de acetona à solução obtida na etapa b). E na etapa d), a proteína alvo precipitada, da etapa c), é removida da solução.

[0009] A proteína alvo pode ser qualquer proteína. Pode ser uma proteína que tenha sido isolada de um microrganismo, por exemplo, de células bacterianas ou de fungos. Pode ser uma proteína que tenha sido isolada de uma planta. Preferencialmente, trata-se de uma proteína que foi isolada de uma fonte animal. Tal proteína pode ser suscetível de ter sido contaminada com partículas de vírus e/ou ADN de vírus que podem ser originários, por exemplo, do organismo fonte, a partir do qual a proteína foi expressa.

[0010] A proteína alvo pode ter sido obtida a partir de uma fonte de mamífero. Pode ter sido obtida a partir de tecidos de mamíferos, por exemplo, de uma glândula de mamífero. Em uma variante de realização preferida, a proteína alvo foi obtida a partir do pâncreas de bovino ou de porcino. Em uma variante de realização mais preferida, a proteína alvo foi obtida a partir de pâncreas de porcino.

[0011] A proteína alvo pode ser uma enzima, preferencialmente uma enzima ativa ou uma enzima que pode ser reativada.

[0012] As enzimas que podem ser obtidas a partir de pâncreas de mamíferos, por exemplo, do pâncreas de porcinos, incluem, mas não estão limitadas a estas, proteases, incluindo, sem estar limitadas a estas, tripsina, quimotripsina, quimotripsina B, pancreatopeptidase E, carboxipeptidase A e carboxipeptidase B; lipases, incluindo, sem estar limitadas a estas, glicerol éster hidrolase (lipase), fosfolipase A1, fosfolipase A2 e esterol éster hidrolase; nucleases, incluindo, sem estar limitadas a estas, ribonuclease e desoxirribonuclease; amilases, incluindo, sem estar limitadas a esta, alfaamilase.

[0013] Em uma variante de realização preferida, a proteína alvo é uma

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 9/37 / 16 protease, preferencialmente uma protease obtida a partir de uma fonte de mamífero, por exemplo, do pâncreas, preferencialmente pâncreas de bovino ou de porcino, mais preferencialmente de pâncreas de porcino.

[0014] Em uma variante de realização mais preferida, a proteína alvo é a tripsina, preferencialmente tripsina obtida do pâncreas, mais preferencialmente tripsina obtida do pâncreas de bovino ou de porcino, ainda mais preferencialmente tripsina obtida do pâncreas de porcino.

[0015] A solução aquosa compreendendo a proteína alvo tem preferencialmente uma baixa condutividade, por exemplo, abaixo de 3 mS ou abaixo de 1 mS. Isto pode ser obtido, por exemplo, por diafiltração, por exemplo, usando-se uma membrana com um corte de 10 000 Da. A solução aquosa compreendendo a proteína alvo tem preferencialmente um pH de cerca de 2-5, por exemplo, cerca de 3-4, preferencialmente cerca de 3,1-3,9, tal como cerca de 3,5.

[0016] A concentração de matéria seca da solução aquosa pode ser de cerca de 8-20%, por exemplo, cerca de 8-15%, tal como cerca de 10%.

[0017] No processo da invenção, o vírus e/ou o ADN do vírus é removido seletivamente de uma solução aquosa contendo uma proteína alvo. O vírus podem ser partículas de vírus. Ou seja, em uma variante de realização preferida, o processo é para a remoção seletiva de partículas de vírus e/ou de ADN de vírus, a partir de uma solução aquosa que contém uma proteína alvo. Em uma variante de realização mais preferida, o processo é para a remoção seletiva de ADN de vírus de uma solução aquosa contendo uma proteína alvo. [0018] O vírus pode ser um vírus infeccioso, por exemplo, um vírus infeccioso encontrado em fontes de porcino.

[0019] O vírus pode ser um ADN de vírus, por exemplo, um ADN de vírus de cadeia simples, tal como um vírus com ADN de cadeia simples e circular. O vírus pode ser um ARN de vírus.

[0020] O vírus pode ser um vírus não envelopado, por exemplo, um

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 10/37 / 16 pequeno vírus não envelopado. Pode ser um ADN de vírus não envelopado ou um ARN de vírus não envelopado.

[0021] O vírus pode ser um vírus que replica autonomamente em células eucarióticas.

[0022] Em uma variante de realização preferida, o vírus é um ADN de vírus não envelopado, por exemplo, um pequeno ADN de vírus não envelopado.

[0023] O vírus pode ser selecionado do grupo que consiste em PCV2 (circovírus de porcino 2), PCV1 (circovírus de porcino 1), PPV (parvovírus de porcino), EMCV (vírus de encefalomiocardite de porcino), HEV (vírus de hepatite E de porcino) e SVDV (vírus de doença vesicular de porcino). Em uma variante de realização preferida, o vírus é o PCV2.

[0024] Na etapa a) do processo da invenção, é adicionada acetona à solução contendo a proteína alvo a uma concentração que precipita seletivamente o vírus e/ou o ADN de vírus. Pode tratar-se de partículas de vírus contendo o ADN de vírus que precipita, ou associadas ao mesmo. E/ou pode ser ADN de vírus como tal, por exemplo, ADN de vírus livre, que precipita.

[0025] Entende-se por precipitação seletiva que a maior parte do vírus e/ou do ADN de vírus é precipitada, ou seja, mais de 50%, enquanto menos de 50% da proteína alvo é precipitada.

[0026] Preferencialmente, pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% do ADN de vírus é precipitado na etapa a). Mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como pelo menos 99% ou pelo menos 99,9% do ADN de vírus são precipitados na etapa a).

[0027] Preferencialmente, menos de 40%, tal como menos de 30%, da proteína alvo são precipitados na etapa a). Mais preferencialmente, menos de 25%, tal como menos de 20%, menos de 10% ou menos de 5% da proteína alvo são precipitados na etapa a).

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 11/37 / 16 [0028] Os peritos na técnica sabem como determinar a concentração da acetona a ser usada na etapa a). Em uma variante de realização preferida, a concentração da acetona na etapa a) é de cerca de 12-40% (v/v), preferencialmente cerca de 12-30% (v/v), mais preferencialmente cerca de 1430% (v/v), e ainda mais preferencialmente cerca de 12-50% (v/v). Em uma variante de realização mais preferida, a proteína alvo é a tripsina e a concentração da acetona na etapa a) é de cerca de 12-40% (v/v), preferencialmente cerca de 12-30% (v/v), mais preferencialmente cerca de 1430% (v/v), ainda mais preferencialmente cerca de 15-20% (v/v). Em uma variante de realização ainda mais preferida, a proteína alvo é a tripsina, o vírus é o PCV2 e a concentração da acetona na etapa a) é de cerca de 12-40% (v/v), preferencialmente cerca de 12-30% (v/v), mais preferencialmente cerca de 14-30% (v/v), e ainda mais preferencialmente cerca de 15-20% (v/v).

[0029] Preferencialmente, a precipitação seletiva na etapa a) é realizada a uma temperatura inferior a 15 °C.

[0030] A etapa b) do processo da invenção é uma etapa de separação em que o material que foi precipitado na etapa a) é separado da solução que contém a proteína alvo. Uma tal separação pode ser realizada por qualquer processo conhecido na técnica. A separação pode compreender uma filtração e/ou centrifugação. Em uma variante de realização preferida, a separação na etapa b) compreende uma filtração em profundidade.

[0031] Preferencialmente, pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% do ADN de vírus são separados na etapa b). Mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como pelo menos 99% ou pelo menos 99,9% do ADN de vírus são separados na etapa b).

[0032] Em uma variante de realização preferida, nenhum ADN de vírus pode ser detetado na solução contendo a proteína alvo, depois de o material precipitado ter sido separado na etapa b).

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 12/37 / 16 [0033] Preferencialmente, me nos de 40%, tal como menos de 30% da proteína alvo são separados na etapa b). Mais preferencialmente, menos de 25%, tal como menos de 20%, menos de 10% ou menos de 5% da proteína alvo são separados na etapa b).

[0034] Preferencialmente, mais de 60%, tal como mais de 70% da proteína alvo são recuperados na solução, após a separação na etapa b). Mais preferencialmente, mais de 75%, tal como mais de 80%, mais de 90% ou mais de 95% da proteína alvo são recuperados na solução, após a separação na etapa b).

[0035] Preferencialmente, mais de 60%, tal como mais de 70% da proteína alvo são recuperados, na sua forma ativa, na solução, após a separação na etapa b). Mais preferencialmente, mais de 75%, tal como mais de 80%, mais de 90% ou mais de 95% da proteína alvo são recuperados na solução, após a separação na etapa b).

[0036] Após a etapa b), o pH do filtrado pode ser ajustado, por exemplo, a cerca de pH 4-5, tal como, cerca de pH 4,5. Pode ser usada qualquer base, preferencialmente uma base fraca, por exemplo, amônia aquosa.

[0037] Na etapa c), no processo de acordo com a invenção, é adicionada à solução, contendo a proteína alvo, uma quantidade adicional de acetona. A acetona é adicionada para se alcançar uma concentração final que faça precipitar a proteína alvo.

[0038] Preferencialmente, mais de 60%, tal como mais de 70% ou mais de 80%, da proteína alvo presente na solução após a etapa b), são precipitados na etapa c). Mais preferencialmente, mais de 90%, tal como mais de 95%, mais de 98% ou mais de 99%, da proteína alvo presente na solução após a etapa b), são precipitados na etapa c).

[0039] Os peritos na técnica sabem como determinar a concentração da acetona a ser usada na etapa c). Em uma variante preferida de realização, a

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 13/37 / 16 concentração final da acetona na etapa c) é de 45-95%, preferencialmente de 60-70% (v/v), mais preferencialmente cerca de 66% (v/v). Em uma outra variante preferida de realização, a concentração da acetona na etapa a) é de cerca de 12-40% (v/v), preferencialmente cerca de 12-30% (v/v), ainda mais preferencialmente cerca de 15-20% (v/v), e a concentração final da acetona na etapa c) é de 45-95%, preferencialmente de 60-70% (v/v), mais preferencialmente cerca de 66% (v/v). Em uma outra variante preferida de realização a proteína alvo é a tripsina, a concentração da acetona na etapa a) é de cerca de 12-40% (v/v), preferencialmente cerca de 12-30% (v/v), mais preferencialmente cerca de 14-30% (v/v), ainda mais preferencialmente cerca de 15-20% (v/v), e a concentração final da acetona na etapa c) é de 45-95%, preferencialmente de 60-70% (v/v), mais preferencialmente cerca de 66% (v/v). Em uma variante de realização ainda mais preferida, a proteína alvo é a tripsina, o vírus é o PCV2, a concentração da acetona na etapa a) é de cerca de 12-40% (v/v), preferencialmente cerca de 12-30% (v/v), mais preferencialmente cerca de 14-30% (v/v), ainda mais preferencialmente cerca de 15-20% (v/v), e a concentração final da acetona na etapa c) é de 45-95%, preferencialmente de 60-70% (v/v), mais preferencialmente cerca de 66% (v/v).

[0040] A etapa c) é realizada preferencialmente a uma temperatura inferior a 15 °C.

[0041] Na etapa d), no processo da invenção, a proteína alvo precipitada é recuperada da solução. Uma tal recolha da proteína alvo precipitada pode ser realizada por qualquer processo conhecido na técnica. A recuperação da proteína alvo precipitada pode compreender uma filtração e/ou centrifugação.

[0042] Depois de ter sido recuperada, a proteína alvo pode ser lavada, seca, moída e/ou normalizada.

[0043] Em uma variante preferida de realização, a presente invenção

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 14/37 / 16 se refere a um processo para se removerem, seletivamente, o vírus PCV2 e/ou o ADN do vírus PCV2 de uma preparação de tripsina de porcino, preferencialmente tripsina pancreática de porcino, compreendendo o referido processo:

a) a adição de acetona a uma solução aquosa contendo a tripsina, para se alcançar uma concentração de acetona de 12-30% (v/v),

b) a realização de uma etapa de separação, para se separar o material precipitado da solução contendo a tripsina,

c) a adição à solução de uma quantidade adicional de acetona para se alcançar uma concentração final de 45-95% (v/v), preferencialmente de 60-70% (v/v), e

d) a recolha da tripsina precipitada da solução.

[0044] Preferencialmente, pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% do ADN do vírus são separados da proteína alvo pelo processo da invenção. Mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como pelo menos 99% ou pelo menos 99,9% do ADN de vírus são separados da proteína alvo pelo processo da invenção.

[0045] Preferencialmente, a proteína alvo que foi purificada pelo processo da invenção compreende menos de 50% de ADN de vírus, em comparação com a proteína alvo que foi purificada pela mesma via, mas sem as etapas a) e b) do processo. Mais preferencialmente, a proteína alvo que foi purificada pelo processo da invenção compreende menos de 40%, tal como menos de 30%, menos de 20% ou menos de 10%, de ADN de vírus, em comparação com a proteína alvo que foi purificada pela mesma via, mas sem as etapas a) e b) do processo. Ainda mais preferencialmente, a proteína alvo que foi purificada pelo processo da invenção compreende menos de 5%, tal como menos de 1%, menos de 0,5% ou menos de 0,1% de ADN de vírus, em comparação com a proteína alvo que foi purificada pela mesma via, mas sem

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 15/37 / 16 as etapas a) e b) do processo.

[0046] Em uma variante preferida de realização, a proteína alvo precipitada recolhida na etapa d) não contém ADN de vírus detetável.

[0047] A detecção ou a quantificação do ADN de vírus podem ser realizadas por qualquer método conhecido na técnica. Pode ser usado PCR em tempo real.

[0048] O ADN pode ser extraído usando incubação de lise, seguida por uma extração do ADN com igual volume de clorofórmio. O ADN pode, finalmente, ser purificado e concentrado, usando kits de ADN disponíveis comercialmente. A presença de ADN de vírus pode ser subsequentemente detectada usando PCR em tempo real.

[0049] Em uma variante de realização preferida, o vírus é o PCV2 e a PCR em tempo real é realizada usando um kit de detecção de PCV2 disponível comercialmente.

[0050] O princípio geral da quantificação de ADN por PCR em tempo real basei-se em registrar graficamente a fluorescência contra o número de ciclos, em uma escala logarítmica. Um limiar para a detecção da fluorescência baseada no ADN está situado ligeiramente acima do fundo e o limiar de ciclo (Ct) é definido como o número de ciclos necessários para o sinal de fluorescência transpor o limiar (ou seja, exceder o nível do fundo). Durante a fase de amplificação exponencial, a sequência do ADN alvo duplica em cada ciclo. Por exemplo, uma amostra de ADN cujo Ct precede o de uma outra amostra em 3 ciclos, continha 2³ = 8 vezes mais o padrão.

[0051 ] Em uma variante de realização, a quantidade do ADN de vírus que pode ser detectada no ADN total extraído da proteína alvo precipitada recolhida na etapa d), quando analisada em um ensaio de PCR em tempo real suportando 40 ciclos de amplificação e usando um iniciador que é específico para o ADN de vírus relevante, resulta em um valor Ct de pelo menos 38, preferencialmente pelo menos 39, mais preferencialmente 40.

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 16/37 / 16 [0052] Um valor Ct de 40 significa que, após 40 ciclos de amplificação, o limiar para a detecção da fluorescência baseada no ADN não foi excedido, ou seja, nunca foi detectado qualquer sinal. Do mesmo modo, os valores Ct ligeiramente abaixo de 40 muito provavelmente são falsos positivos e, por consequência, não igualam a detecção do ADN de vírus.

[0053] Em uma variante de realização preferida, o vírus é PCV2 e a quantidade de ADN de PCV2 que pode ser detectada no ADN total extraído da proteína alvo precipitada recolhida na etapa d), quando analisada em um ensaio PCR em tempo real suportando 40 ciclos de amplificação e usando um iniciador que é específico para o ADN de vírus de PCV2, resulta em um valor Ct de pelo menos 38, preferencialmente pelo menos 39, mais preferencialmente 40.

EXEMPLOS

Exemplo 1 [0054] Fonte: um lote de tripsina positiva de PCV2, obtido por extração aquosa de glândulas pancreáticas de porcino.

[0055] O lote de tripsina foi dissolvido em água corrente fria para perfazer uma solução a 11%. O pH da solução foi ajustado a 3,5 por adição de ácido clorídrico. Foi adicionada acetona até uma concentração final de 20% v/v, seguido da adição de 1% de um auxiliar de filtração (Kieselguhr Hyflo Super Cel®). Durante a adição da acetona e do auxiliar de filtração a solução foi agitada e a temperatura foi mantida abaixo de 15 °C. Subsequentemente, a solução não límpida foi filtrada em um filtro prensa com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno) e folhas para filtração de gérmens. (Seitz EKS). A pressão foi mantida inferior a 1,8 bar durante a filtração. As impurezas que foram retidas sobre o filtro foram descartadas. O filtrado límpido foi recolhido em um tanque e o pH foi ajustado a 4,5 com amônia aquosa. Foi adicionada acetona até uma concentração final de 66% v/v. Durante a adição da acetona a solução foi agitada e a temperatura foi mantida

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 17/37 / 16 abaixo de 15 °C. Formou-se um precipitado (tripsina). O precipitado foi recolhido por filtração sobre um filtro prensa, com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno). A pressão foi mantida inferior a 3,5 bar durante a filtração. Finalmente, o precipitado foi seco em um secador de vácuo. a pressão final foi de 0,5 mbar e a temperatura final foi de 38 °V.

[0056] O ADN foi extraído usando incubação de lise, seguida de uma extração do ADN em igual volume de clorofórmio. O ADN foi finalmente purificado e concentrado, usando kits de ADN disponíveis comercialmente. A presença do ADN de PCV2 foi subsequentemente analisada em um instrumento de PCR em tempo real, usando umkit de detecção de PCV2 disponível comercialmente. A tripsina seca era negativa para o PCV2.

Exemplo 2 [0057] Fonte: um lote de tripsina líquida positiva para PCV2, obtido por extração aquosa de glândulas pancreáticas de porcino. Foi adicionado um auxiliar de filtração (Kieselguhr Hyflo Super Cel®) e a filtração foi realizada em um filtro prensa com almofadas filtrantes Seitz HS9000. O filtrado foi diafiltrado (usando uma membrana com um corte de 10 000 Da) até a condutividade ser inferior a 1 mS. A concentração foi ajustada a 10% de matéria seca e o pH foi ajustado a 3,5 com ácido clorídrico. O lote foi dividido em duas partes iguais.

a) foi adicionada acetona até uma concentração final de 15% v/v, seguida da adição de 1% de um auxiliar de filtração (Kieselguhr Hyflo Super Cel®). Durante a adição da acetona e do auxiliar de filtração a solução foi agitada e a temperatura foi mantida inferior a 15 °C. Subsequentemente, a solução não límpida foi filtrada em um filtro prensa com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno) e folhas para filtração de gérmens (Seitz EKS). A pressão foi mantida inferior a 1,8 bar durante a filtração. As impurezas que foram retidas sobre o filtro foram descartadas. O filtrado límpido foi recolhido em um tanque e o pH foi ajustado a 4,5 com amônia

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 18/37 / 16 aquosa. Foi adicionada acetona até uma concentração final de 66% v/v. Durante a adição da acetona a solução foi agitada e a temperatura foi mantida abaixo de 15 °C. Formou-se um precipitado (tripsina). O precipitado foi recolhido por filtração sobre um filtro prensa, com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno). A pressão foi mantida inferior a 3,5 bar durante a filtração. Finalmente, o precipitado foi seco em um secador de vácuo. a pressão final foi de 0,5 mbar e a temperatura final foi de 38 °V.

[0058] O ADN foi extraído usando incubação de lise, seguida de uma extração do ADN em igual volume de clorofórmio. O ADN foi finalmente purificado e concentrado, usando kits de ADN disponíveis comercialmente. A presença do ADN de PCV2 foi subsequentemente analisada em um instrumento de PCR em tempo real, usando umkit de detecção de PCV2 disponível comercialmente. Verificou-se que a tripsina seca era negativa para o PCV2 (Ct: 40).

b) foi adicionado à solução 1% de um auxiliar de filtração (Kieselguhr Hyflo Super Cel®). Durante a adição do auxiliar de filtração, a solução foi agitada e a temperatura foi mantida inferior a 15 °C. Subsequentemente, a solução não límpida foi filtrada em um filtro prensa com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno) e folhas para filtração de gérmens (Seitz EKS). A pressão foi mantida inferior a 1,8 bar durante a filtração. As impurezas que foram retidas sobre o filtro foram descartadas. O filtrado límpido foi recolhido em um tanque e o pH foi ajustado a 4,5 com amônia aquosa. Foi adicionada acetona até uma concentração final de 66% v/v. Durante a adição da acetona a solução foi agitada e a temperatura foi mantida abaixo de 15 °C. Formou-se um precipitado (tripsina). O precipitado foi recolhido por filtração sobre um filtro prensa, com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno). A pressão foi mantida abaixo de 3,5 bar durante a filtração. Finalmente, o precipitado foi seco em um secador de vácuo. a pressão final foi de 0,5 mbar e a temperatura final foi de 38 °V.

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 19/37 / 16 [0059] O ADN foi extraído usando incubação de lise, seguida de uma extração do ADN em igual volume de clorofórmio. O ADN foi finalmente purificado e concentrado, usando kits de ADN disponíveis comercialmente. A presença do ADN de PCV2 foi subsequentemente analisada em um instrumento de PCR em tempo real, usando umkit de detecção de PCV2 disponível comercialmente. Verificou-se que a tripsina seca era positiva para o PCV2 (Ct: 36).

Exemplo 3 [0060] Fonte: um lote de tripsina líquida positiva para PCV2, obtido por extração aquosa de glândulas pancreáticas de porcino. Foi adicionado um auxiliar de filtração (Kieselguhr Hyflo Super Cel®) e a filtração foi realizada em um filtro prensa com almofadas filtrantes Seitz HS9000. O filtrado foi diafiltrado (usando uma membrana com um corte de 10 000 Da) até a condutividade ser inferior a 1 mS. A concentração foi ajustada a 10% de matéria seca e o pH foi ajustado a 3,5 com ácido clorídrico. O lote foi dividido em duas partes iguais.

a) foi adicionada acetona até uma concentração final de 10% v/v, seguida da adição de 1% de um auxiliar de filtração (Kieselguhr Hyflo Super Cel®). Durante a adição da acetona e do auxiliar de filtração a solução foi agitada e a temperatura foi mantida inferior a 15 °C. Subsequentemente, a solução não límpida foi filtrada em um filtro prensa com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno) e folhas para filtração de gérmens (Seitz EKS). A pressão foi mantida inferior a 1,8 bar durante a filtração. As impurezas que foram retidas sobre o filtro foram descartadas. O filtrado límpido foi recolhido em um tanque e o pH foi ajustado a 4,5 com amônia aquosa. Foi adicionada acetona até uma concentração final de 66% v/v. Durante a adição da acetona a solução foi agitada e a temperatura foi mantida abaixo de 15 °C. Formou-se um precipitado (tripsina). O precipitado foi recolhido por filtração sobre um filtro prensa, com tecidos filtrantes

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 20/37 / 16 resistentes a acetona (polipropileno). A pressão foi mantida inferior a 3,5 bar durante a filtração. Finalmente, o precipitado foi seco em um secador de vácuo. a pressão final foi de 0,5 mbar e a temperatura final foi de 38 °V.

[0061] O ADN foi extraído usando incubação de lise, seguida de uma extração do ADN em igual volume de clorofórmio. O ADN foi finalmente purificado e concentrado, usando kits de ADN disponíveis comercialmente. A presença do ADN de PCV2 foi subsequentemente analisada em um instrumento de PCR em tempo real, usando umkit de detecção de PCV2 disponível comercialmente. Verificou-se que a tripsina seca era positiva para o PCV2 (Ct: 35).

b) foi adicionado à solução 1% de um auxiliar de filtração (Kieselguhr Hyflo Super Cel®). Durante a adição do auxiliar de filtração, a solução foi agitada e a temperatura foi mantida inferior a 15 °C. Subsequentemente, a solução não límpida foi filtrada em um filtro prensa com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno) e folhas para filtração de gérmens (Seitz EKS). A pressão foi mantida inferior a 1,8 bar durante a filtração. As impurezas que foram retidas sobre o filtro foram descartadas. O filtrado límpido foi recolhido em um tanque e o pH foi ajustado a 4,5 com amônia aquosa. Foi adicionada acetona até uma concentração final de 66% v/v. Durante a adição da acetona a solução foi agitada e a temperatura foi mantida abaixo de 15 °C. Formou-se um precipitado (tripsina). O precipitado foi recolhido por filtração sobre um filtro prensa, com tecidos filtrantes resistentes a acetona (polipropileno). A pressão foi mantida inferior a 3,5 bar durante a filtração. Finalmente, o precipitado foi seco em um secador de vácuo. a pressão final foi de 0,5 mbar e a temperatura final foi de 38 °V. [0062] O ADN foi extraído usando incubação de lise, seguida de uma extração do ADN em igual volume de clorofórmio. O ADN foi finalmente purificado e concentrado, usando kits de ADN disponíveis comercialmente. A presença do ADN de PCV2 foi subsequentemente analisada em um

Petição 870190101749, de 10/10/2019, pág. 21/37 / 16 instrumento de PCR em tempo real, usando umkit de detecção de PCV2 disponível comercialmente. Verificou-se que a tripsina seca era positiva para o PCV2 (Ct: 36).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a remoção seletiva de vírus e/ou de ADN de vírus de uma solução aquosa compreendendo uma proteína alvo, referido processo caracterizado pelo fato de que compreende:

a) a adição de acetona à solução, a uma concentração que precipita seletivamente o vírus e/ou o ADN de vírus,

b) a realização de uma etapa de separação, para separar o material precipitado da solução contendo a proteína alvo,

c) a adição à solução de uma quantidade adicional de acetona para se alcançar uma concentração final que precipite a proteína alvo, e

d) o recolhimento, da solução, da proteína alvo precipitada; em que a concentração de acetona na etapa a) é 12-40% (v/v).
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração da acetona na etapa a) é de 12-30% (v/v).
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração da acetona na etapa a) é de 14-30% (v/v).
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração da acetona na etapa a) é de 15-20% (v/v).
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração da acetona na etapa a) é de 15% (v/v).
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a concentração final da acetona na etapa c) é 45-95%, preferencialmente de 60-70% (v/v), mais preferencialmente de cerca de 66% (v/v).
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a proteína alvo é a tripsina.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a precipitação seletiva na etapa a) é realizada a uma temperatura inferior a 15 °C.

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9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a separação na etapa b) compreende filtração e/ou centrifugação.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a separação na etapa b) compreende uma filtração em profundidade.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a etapa d) compreende filtração e/ou centrifugação.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o vírus é um vírus não envelopado.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vírus é PCV2.