BR112013024781B1 - Métodos de produção de um anticorpo e de uma composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

método de produção de polipeptídeo recombinante. a presente invenção refere-se a um método capaz de produzir uma proteína com um nível elevado utilizando uma célula de animal cultivada, compreendendo cultivar uma célula que expressa apes (sequência lntensificadora de produção de anticorpos) e na qual um dna que codifica um polipeptídeo desejado, foi introduzido, produzindo desse modo o polipeptídeo pretendido. apes contém uma sequência de nucleotídeo relacionada com nfkbia e tem a função de diminuir a expressão intracelular de nfkbia.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001]A presente invenção refere-se a um método de produção de um polipeptídeo recombinante, e, mais especificamente, a um método de produção de um polipeptídeo de forma eficiente utilizando uma célula animal em que a expressão do KB inibidor α de fator nuclear (NfkBia) foi diminuída.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[0002]Quando as proteínas úteis como medicamentos são produzidas utilizando tecnologia de recombinação genética, o uso de células animais permite modificação pós-tradução complicada e dobragem de células procariotas que não podem executar. Assim, as células animais têm sido frequentemente utilizadas como células hospedeiras para a produção de proteínas recombinantes.

[0003]Nos últimos anos, têm sido desenvolvido um grande número de produtos biofarmacêuticos, tais como anticorpos e proteínas fisiologicamente ativas. Técnicas que permitem que proteínas recombinantes sejam produzidas eficientemente por células animais levam a redução de custo de biofármacos e prometem seu fornecimento estável para os pacientes.

[0004]Sob estas circunstâncias, um método de produção da proteína com uma maior eficiência de produção é desejado.

[0005]NfkBia (IKBα, kB inibidor α de fator nuclear), que é uma abreviatura do fator nuclear de intensificador do gene do polipeptídeo leve kapa em inibidores de células B, alfa está envolvido na ativação de NF-kappa B, um fator de transcrição relacionado com sinalização intracelular. NfkBia é um dos fatores que inativam NF-kapa B.A expressão nuclear induzida de NfkBia recém biosintetizada regula negativamente as atividades de ligação e transcrição de DNA e NF-kapa B (Documento Sem Patente 1). Além disso, a expressão de alguns genes que inibem a proliferação de células, como NfkBia, é suprimida em quase todas as células tumorais humanas e de camundongos (Documento Sem Patente 2). NF-kapa B normalmente existe em um estado onde ele está ligado a um inativador tal como NfkBia. Quando vários estímulos são dados, NF-kapa B é liberado de tal inativador, ativado e translocado para o núcleo, e se liga a uma sequência específica de DNA nas regiões promotoras / intensificadoras de vários genes alvo de citocina, fatores de crescimento, moléculas de adesão, reguladores de morte celular, e semelhantes (5'- GGGACTTTCC-3'; a sequência de DNA é chamada de sequência de ligação de NFkB, motivo KB, elemento de resposta a NFkB, e semelhantes (SEQ ID NO: 35)) e NF-kappa B é, assim, envolvido em modular atividades de transcrição (Documento sem Patente 3).

[0006]Por outro lado, foi totalmente desconhecido como NfkBia está relacionado com a capacidade de produzir proteína recombinante, tal como um comportamento de NfkBia dentro de células animais cultivadas.

LISTA DE CITAÇÃO LITERATURA SEM PATENTE

[0007]Documento sem Patente 1: Inducible nuclear expression of newly synthesized I kappa B alpha negatively regulates DNA-binding and transcriptional activities of NF-kappa B, Mol. Cell. Biol., May 1995, 2689-2696, Vol. 15, No. 5

[0008]Documento sem Patente 2: From mice to humans: Identification of commonly deregulated genes in mammary cancer via comparative SAGE studies, Hu Y., Sun H., Drake J., Kittrell F., Abba M. C., Deng L., Gaddis S., Sahin A., Baggerly K., Medina D. and Aldaz C. M., Cancer Research 2004 64:21 (7748-7755)

[0009]Documento sem Patente 3: "New insights into the Role of Nuclear Factor-kappa B in Cell Growth Regulation", American Journal of Pathology, 2001, Vol. 159, No. 2: 387-397

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[00010] É um objeto da presente invenção proporcionar um método capaz de produzir uma proteína natural ou recombinante a um nível elevado.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[00011] Os presentes inventores usaram cepas de células cultivadas (cepas de células CHO), com alta capacidade de produção de anticorpo recombinante para conduzir estudos sobre genes expressos significativamente em cepas celulares, em esforços diligentes para alcançar o objeto acima. Como resultado, os presentes inventores identificaram um RNA que não codifica um tipo de mRNA que foi reconhecido por meio de uma sequência de camundongo específica como uma sonda. Esta transcrição correspondeu ao filamento complementar da região não traduzida de NfkBia mRNA.Além disso, os presentes inventores verificaram que expressar em células recombinantes cultivadas uma molécula de ácido nucleico consistindo em uma sequência parcial da transcrição aumenta significativamente a capacidade de produção de polipeptídeo recombinante das células cultivadas. Os presentes inventores também descobriram que a expressão de NfkBia foi suprimida nas células altamente produtoras de anticorpo em que a expressão RNA não codificante foi aumentada. Os presentes inventores ainda verificaram que as células cultivadas que têm a capacidade de produzir o anticorpo altamente recombinante suprimiram a expressão de NfkBia nas células. Com base nessas descobertas, os presentes inventores esperaram que a quantidade de produção de um polipeptídeo desejado seria capaz de ser aumentada através da indução de expressão elevada de uma transcrição que regula a expressão de NfkBia em células cultivadas. Estes resultados conduziram à conclusão da presente invenção.

[00012] Tal um seu RNA ou DNA ou sequência dos mesmos que tem a função de aumentar a capacidade de produzir uma proteína tal como um anticorpo recombinante, por expressão aumentada de si mesmo em culturas de células são aqui designados coletivamente como APES (Sequência de Intensificação de Produção de Anticorpo) (também referida como PPES (Sequência de Intensificação de Produção de Polipeptídeo) em alguns casos).

[00013] Os presentes inventores presumiram que a APES (ou PPES) iriam regular a expressão de NfkBia em células cultivadas, melhorando assim a atividade de NF-kappa B e, assim, aumentando a capacidade de produção de polipeptídeo recombinante. Presume-se que o NF- kappa B, tendo atividade melhorada seria translocado para o núcleo, aumentando a expressão de genes relacionados com a imunidade, inflamação e antiapoptose (por exemplo, Bcl-2, Bcl-xL, IAPs (Inibidores de Proteínas de Apoptose)) e contribuindo para o crescimento das células, a manutenção da taxa de sobrevivência das células, e outros semelhantes.

[00014] Além disso, uma pluralidade de sequências de ligação de NF-kapa B existem nas regiões promotoras / intensificadoras de plasmídeos comuns para a expressão de um gene que codifica uma proteína recombinante ou peptídeo, tal como um anticorpo. Assim, presume-se também que o NF-kappa B que foi translocado para dentro do núcleo aumentaria a atividade promotora dos plasmídeos de expressão e contribuiria para a produção de anticorpos mais elevados. Por exemplo, no caso do promotor do MCMV, tais sequências de ligação de NF-kapa B existem em oito sítios de uma sequência derivada de citomegalovírus de camundongo (DD434486) e em três sítios na sequência derivada de citomegalovírus humano (DI097553).

[00015] A presente invenção é resumida como se segue:

[00016](1) Um método de produção de um polipeptídeo compreendendo a cultura de uma célula que expressa APES e no qual um DNA que codifica um polipeptídeo desejado foi introduzido, produzindo, desse modo, o polipeptídeo desejado.

[00017](1-1) O método de acordo com (1), em que a célula é uma célula que expressa fortemente APES.

[00018](2) O método de acordo com (1), em que APES é uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que pode se ligar a DNA ou mRNA do gene NfkBia derivado de humano, camundongo, rato ou hamster por pareamento de bases e, desse modo pode suprimir a expressão do gene NfkBia.

[00019](3) O método de acordo com (2), em que a APES é um RNA pequeno de no máximo 30 nucleotídeos de comprimento compreendendo uma sequência de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento que se ligam a uma parte do NfkBia mRNA por pareamento de bases.

[00020](4-1) O método de acordo com (2), em que a APES é um RNA não codificante do tipo mRNA de no máximo 561 nucleotídeos de comprimento, compreendendo uma sequência de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento que se ligam a uma parte do NfkBia mRNA por pareamento de base.

[00021](4) O método de acordo com (2), em que a APES é um RNA não codificante do tipo mRNA de no máximo 500 nucleotídeos de comprimento, compreendendo uma sequência de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento que se ligam a uma parte do NfkBia mRNA por pareamento de base.

[00022](5-1) O método de acordo com (2), em que a APES é um RNA não codificante do tipo mRNA 561 a 1579 nucleotídeos de comprimento, compreendendo uma sequência de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento que se ligam a uma parte do NfkBia mRNA por pareamento de base.

[00023](5) O método de acordo com (2), em que a APES é um RNA não codificante do tipo mRNA de 500 a 1000 nucleotídeos de comprimento, compreendendo uma sequência de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento que se ligam a uma parte do NfkBia mRNA por pareamento de base.

[00024](6) O método de acordo com qualquer uma das (3) a (5), em que a sequência contínua de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento é qualquer sequência parcial na sequência de nucleotídeo representada por SEQ ID NO: 2.

[00025](7-1) O método de acordo com (6), em que a APES é selecionada a partir de moléculas de ácido nucleico compreendendo cada uma das seguintes sequências de nucleotídeos : (a)um DNA que consiste na sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 16 e 29; (b)um DNA que compreende a sequência de (a) acima e é uma sequência parcial da região 3' não traduzida do gene NfkBia ; (c)um DNA que consiste na sequência de nucleotídeo idêntica à sequência de (a) ou (b) acima, exceto para um ou vários nucleotídeos ; (d)um RNA que é uma transcrição de (a), (b) ou (c) acima; (e)um DNA ou RNA que consiste na sequência que pode se ligar à sequência de (a) acima por pareamento de bases.

[00026](7) O processo de acordo com (6), em que a APES é selecionada a partir de moléculas de ácido nucleico compreendendo cada uma das seguintes sequências de nucleotídeos : (a)um DNA que consiste na sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 4 a 16; (b)um RNA que é uma transcrição de (a) acima; (c)um DNA que consiste na sequência de nucleotídeo idêntica à sequência de (a) acima exceto para um nucleotídeo ; (d)um RNA que é uma transcrição de (c) acima; (e)um DNA ou RNA que consiste na sequência que pode se ligarà sequência de (a) acima por pareamento de bases. (8)O método de acordo com (1), em que um DNA exógeno que codifica o polipeptídeo desejado foi introduzido dentro da célula e a APES foi artificialmente introduzida na célula.

[00027](9) O método de acordo com (8), em que a célula na qual a APES foi artificialmente introduzida é uma célula transfectada com a APES.

[00028](10) O método de acordo com (8), em que a célula na qual a APES foi artificialmente introduzida é uma célula na qual a transcrição de APES endógena foi ativada.

[00029](11) O método de acordo com (8), em que um DNA que codifica para um transportador de taurina foi adicionalmente introduzido na célula.

[00030](12) O método de acordo com (8), em que um DNA que codifica cisteína descarboxilase do ácido sulfínico foi adicionalmente introduzida na célula.

[00031](13) O método de acordo com (8), em que um DNA que codifica a alanina transferase foi adicionalmente introduzido na célula.

[00032](14) O método de acordo com (1), em que o polipeptídeo é um anticorpo.

[00033](15) O método de acordo com (1), em que a célula é uma célula de ovário de hamster chinês.

[00034](16) Um método de produção de uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo produzido por qualquer um dos métodos indicados acima.

[00035](17) Uma molécula de ácido nucleico (PPES ou APES) que compreende qualquer uma das seguintes sequências de nucleotídeos e tem atividade APES, desde que a molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 seja excluída: (a)um DNA que consiste na sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 16 e 29 ; (b)um DNA que compreende a sequência de (a) acima e é uma sequência parcial da região 3' não traduzida do gene NfkBia ; (c)um DNA que consiste na sequência de nucleotídeo idêntica à sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 16 e 29, ou a sequência de (b), exceto para um ou vários nucleotídeos ; (d)um RNA que é uma transcrição de (a), (b) ou (b) acima, ou (e)um DNA ou RNA que consiste na sequência que pode se ligar à sequência de (a) acima, por pareamento de bases.

[00036](18) Um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com (17) acima.

[00037](19) Uma célula na qual a molécula de ácido nucleico de acordo com (17) acima, ou o vetor de acordo com (18) acima foi introduzida artificialmente.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[00038] A presente invenção permite a produção eficiente de proteínas recombinantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00039] A Figura 1 mostra a sequência da transcrição de AI462015 identificada e a sua localização no genoma do camundongo.

[00040] A Figura 2 mostra a intensidade da transcrição de AI462015 no terceiro dia de uma subcultura de uma célula produtora de anticorpo obtida expressando Mab1 (anticorpo de receptor anti-IL-6) a um nível elevado em células CHO-DG44.

[00041] A Figura 3 mostra a intensidade da transcrição de AI462015 no terceiro dia de uma subcultura de uma célula produtora de anticorpo obtida expressando Mab2 (anticorpo anti-glipican 3) a um nível elevado em células CHO-DXB11s.

[00042] A Figura 4 mostra a intensidade da transcrição de AI462015 no terceiro dia de uma cultura de batelada alimentada em frasco de 1L de células produtoras de Mab2 (anticorpo anti-glipican 3).

[00043] A Figura 5 mostra um aumento da intensidade da transcrição de AI462015 no dia 13, na fase final da cultura de batelada alimentada em frasco de 1L das células produtoras de Mab2.

[00044] A Figura 6 mostra a intensidade da transcrição de AI462015 no terceiro dia de uma cultura de batelada alimentada em frasco de 1L de células que tiveram um baixo potencial para produzir Mab1 (anticorpo de receptor anti-IL-6)

[00045] A Figura7mostra umplasmídeo deexpressãodeuma sequência parcial de 434bp da transcrição de AI462015 (437p).

[00046] A Figura8mostra umplasmídeo deexpressãodeuma sequência parcial de 165bp da transcrição de AI462015 (437p).

[00047] A Figura 9 mostra um plasmídeo em que apenas um gene de resistência à higromicina foi expresso como um controle.

[00048] A Figura 10 mostra que a quantidade de produção de Mab1 é aumentada pela forte expressão de sequências parciais da transcrição de AI462015 (437p).

[00049] A Figura 11 mostra a expressão forte da transcrição de AI462015 e expressão de NfkBia suprimida em células altamente produtoras de anticorpos.

[00050] A Figura 12 mostra um conjunto de sonda utilizada para quantificar a expressão de NfkBia.

[00051] A Figura 13 mostra um resultado da quantificação da expressão de NfkBia reprimida nas células altamente produtoras de anticorpos.

[00052] A Figura 14 mostra os oito sítios de ligação de NFKBno no promotor CMV IE2 de camundongo (SEQ ID NO: 23) (os sítios estão sublinhados).

[00053] A Figura 15 é um esboço de um método para a análise da expressão de microRNA.

[00054] A Figura 16 mostra os produtos de PCR derivados de microRNAs que foram expressos em níveis elevados em células altamente produtoras de anticorpos.

[00055] A Figura 17 mostra plasmídeos pPur-APES165 e pPur-ALT1 que foram utilizados para a coexpressão das sequências parciais 165bp da transcrição de AI642048(437p) e coexpressão de ALT1, respectivamente, em células que expressam pHyg-TAUT.

[00056] A Figura 18 mostra um resultado de uma cultura de batelada alimentada em agitador, que mostra um efeito de crescimento celular e alto efeito de produção de anticorpo que resultou da forte expressão de APES.

[00057] A Figura 19 mostra um resultado de uma cultura de batelada alimentada em um frasco de 1L que mostra um efeito de crescimento celular e um alto efeito de produção de anticorpo que resultou da forte expressão de APES.

[00058] A Figura 20 mostra uma correlação entre o nível de expressão de APES fortemente de células hospedeiras candidatas expressando APES165 (nove cepas) e a sua densidade de células viáveis.

[00059] A Figura 21 mostra que a quantidade de produção de Mab1 é aumentada pela forte expressão de sequências parciais da sequência parcial APES165 da transcrição de AI462015 (437p).

[00060] A Figura 22 mostra que as sequências parciais de APES165, que foram verificadas ter um alto efeito de produção de anticorpos, como mostrado na Figura 21, compreendem a sequência complementar NfkBia.

[00061] A Figura 23 mostra que AI462015 é o filamento complementar de NfkBia mRNA de camundongo (Exemplo 8).

[00062] A Figura 24 mostra que existe uma sequência homóloga de AI462015 em genoma celular de CHO-K1 (Exemplo 8).

[00063] Figura 25a mostra que uma sequência parcial (nucleotídeos 7 a 91 a partir da extremidade 5') de AI462015 é conservada independentemente da espécie.

[00064] A Figura 25b mostra que uma sequência parcial (nucleotídeos 7 a 91 a partir da extremidade 5') de AI462015 é conservada independentemente da espécie.

[00065] Figura 25c mostra que uma sequência parcial (nucleotídeos 7 a 91 a partir da extremidade 5') de AI462015 é conservada independentemente da espécie.

[00066] A figura 25d mostra que uma sequência parcial (nucleotídeos 7 a 91 a partir da extremidade 5') de AI462015 é conservada independentemente da espécie.

[00067] A Figura 25e mostra que uma sequência parcial (nucleotídeos 7 a 91 a partir da extremidade 5') de AI462015 é conservada independentemente da espécie.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[00068] Modalidades da presente invenção são descritas abaixo com mais detalhes.

(1)APES (Sequência Intensificadora de Produção de Anticorpo)

[00069] A presente invenção proporciona um método de produção de um polipeptídeo compreendendo cultivar uma célula que expressa APES e na qual um DNA que codifica um polipeptídeo desejado foi introduzido, produzindo desse modo o polipeptídeo desejado.

[00070] Conforme detalhado nos Exemplos descritos mais adiante, os presentes inventores encontraram um RNA não codificante do tipo mRNA, com um aumento do nível de expressão correlacionado com a capacidade produtora de anticorpo em células CHO cultivadas, e os presentes inventores identificaram o RNA não codificante do tipo mRNA como uma transcrição de 437 nucleotídeos do genoma do camundongo (Figura 1, número de acesso GenBank ID: AI462015, SEQ ID NO: 1). A sequência de AI462015 e sua localização no genoma de camundongo são apresentadas na Figura 1. A sequência de AI462015 existe no filamento complementar próximo da região 3' não traduzida de NfkBia (KB inibidor α de fator nuclear) mRNA em genoma de camundongo (Nota: A atualização da informação subsequente pelo dada pelo GeneBank revelou que a transcrição de 437 nucleotídeos de AI462015 corresponde ao filamento complementar da região 3' não traduzida (513 nucleotídeos) de NfkBia mRNA de camundongo (Figura 23)).

[00071] Além disso, os presentes inventores verificaram que a quantidade de produção do polipeptídeo desejado pode ser aumentada através da introdução de moléculas de ácido nucleico cada uma tendo uma sequência parcial derivada de AI462015 em células hospedeiras, para permitir assim a expressão.

[00072] Os presentes inventores presumiram que estas moléculas de ácido nucleico iriam regular a expressão de NfkBia em células cultivadas, melhorando assim a atividade de NF-kappa B e, assim, aumentando a capacidade de produção de polipeptídeo recombinante. Especificamente, os presentes inventores presumiram que o NF-kappa B, tendo atividade melhorada seria translocado para o núcleo, aumentando a expressão de genes relacionados com a imunidade, inflamação e antiapoptose (por exemplo, Bcl-2, Bcl-xL, IAPs (Inibidores de Proteínas de Apoptose)) e contribuindo para o crescimento das células, a manutenção da taxa de sobrevivência das células, e outros semelhantes.

[00073] Os presentes inventores coletivamente denominaram como APES (Sequência Intensificadora de Produção de Anticorpo) (também referido como (PPES Sequência Intensificadora de Produção de Polipeptídeo) em alguns casos) um RNA ou DNA ou sequência dos mesmos, que tem as seguintes funções oferecidas pela sua própria expressão ou expressão aumentada em células cultivadas: regulação da expressão de NfkBia nas células cultivadas e aumento, portanto, da atividade de NF-kappa B, aumentando a capacidade de produzir um polipeptídeo recombinante desejado tal como um anticorpo recombinante, e que de preferência não codifica proteínas.

[00074] A sequência derivada de AI462015 acima ou uma sequência parcial da mesma é conservada em não apenas roedores tais como camundongo e hamster, mas também humanos, e é considerada também uma sequência altamente conservada, em mamíferos e outros animais, tais como peixes e insetos. Assim, uma sequência parcial da região 3' não traduzida de uma variedade de células de animais derivadas de NfkBia mRNA ou sequência complementar à sequência (a sequência parcial e a sequência complementar correspondem à sequência derivada de AI462015 ou a uma sequência parcial da mesma) pode também ser usada como as sequências APES da presente invenção.

[00075] Em uma modalidade, uma parte da sequência de APES compreende a sequência complementar NfkBia ou é a sequência complementar NfkBia, e esta característica resulta na supressão da expressão de NfkBia em células que expressam APES. Este efeito de supressão promove a função de produzir um anticorpo e semelhantes, a níveis elevados.

[00076] Em uma modalidade, APES é uma molécula de ácido nucleico que interfere em NfkBia mRNA (RNA de interferência) e que tem a função de se ligar a NfkBia mRNA em uma célula para regular negativamente a expressão de mRNA. O aumento do nível de expressão intracelular de APES leva à expressão reprimida da função NfkBia e, assim, aumenta o nível de expressão de genes de anticorpos e ainda produz um polipeptídeo recombinante, tal como um anticorpo a níveis elevados.

[00077] Assim, APES pode ser a seguinte sequência compreendendo uma sequência que pode se ligar ao DNA ou mRNA do gene NfkBia por pareamento de bases: um RNA de duplo filamento (dsRNA) ou um siRNA, que é um dsARN curto, ou um siRNA dissociado em filamentos simples, ou um shRNA, um DNA ou RNA antisentido, um microRNA (miRNA) ou um RNA não codificante tipo mRNA.

[00078] Por exemplo, a sequência de APES pode ser um oligonucleotídeo que consiste em uma sequência que compreende uma sequência complementar parcial ao NfkBia mRNA alvo. Tal oligonucleotídeo é, por exemplo, um miRNA que tem uma sequência que corresponde a 19 a 25 nucleotídeos no filamento complementar de NfkBia mRNA ou uma sequência idêntica à sequência acima, exceto para um nucleotídeo e que tem o efeito de suprimir a expressão de NfkBia. Alternativamente, APES pode ser um RNA não codificante do tipo mRNA de cadeia longa e pode ser, por exemplo, tal RNA, que consiste em uma sequência de 561 nucleotídeos de comprimento (561 mer) ou, no máximo, de 500 nucleotídeos de comprimento (500 mer) que compreende uma sequência capaz de se ligar ao DNA ou mRNA do gene NfkBia por pareamento de bases e que tem o efeito de suprimir a expressão de NfkBia. Alternativamente, APES pode apresentar um RNA não codificante do tipo mRNA de cadeia mais longa (centenas a milhares de nucleotídeos). Por exemplo, APES pode ser uma molécula de ácido nucleico ou sequência de 200 a 100.000 nucleotídeos de comprimento ou 300 a 300,000 nucleotídeos de comprimento.

[00079] A sequência que pode ligar por pareamento de bases não está limitada a uma sequência completamente pareada (isto é, uma sequência 100% complementar), mas a presença de nucleotídeos não pareados também é aceitável, desde que eles não interfiram nas suas funções. Em vez disso, a complementação parcial é preferível, dependendo da forma de APES. Assim, por exemplo, uma sequência que é pelo menos 70 %, mais preferivelmente 80 %, ainda mais preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95 % de homologia com um DNA ou mRNA genético compreendendo a região não traduzida NfkBia, ou a sequência complementar à sequência acima é também abrangida na "sequência que pode ligar por pareamento de base". Por exemplo, como para um RNA não codificante do tipo mRNA de 561 mer ou 500 mer, a pelo menos 90 % de homologia de sequência engloba sequências mutantes que compreendem 1 a 50 nucleotídeos incompatíveis (ou 1 a 56 nucleotídeos incompatíveis no caso do RNA de 561 mer) resultante da inserção, deleção ou mutação pontual de nucleotídeos, e que têm a função de aumentar a capacidade de produzir um polipeptídeo recombinante, tal como um anticorpo, em associação com a expressão das próprias sequências mutantes em células hospedeiras, ou a função de supressão da expressão de NfkBia. Assim, considera-se que uma sequência derivada de ortólogo NfkBia (gene homólogo xenogênico) que tem um certo grau de semelhança de sequências (por exemplo, pelo menos 70% de homologia) e é derivada de uma espécie diferente da célula hospedeira também pode ser usada como APES.

[00080] Em alternativa, a sequência que pode ligar por pareamento de base abrange uma sequência que pode se ligar a NfkBia mRNA sob uma condição tal como uma condição intracelular. Tal sequência engloba, por exemplo, uma sequência que hibridiza sob condições conhecidas para aquelas pessoas versadas como condições altamente rigorosas e que tem funções desejadas. Um exemplo das condições altamente rigorosas é a incubação de um polinucleotídeo e um outro polinucleotídeo em uma solução de tampão de hibridação contendo 6 x SSPE ou SSC, formamida a 50%, 5 x reagente de Denhardt, SDS a 0,5% e 100 μg/ml de um DNA de esperma de salmão desnaturado, fragmentado, a uma temperatura de hibridação de 42 °C durante 12 a 16 horas (um dos polinucleotídeos pode ser aderido na superfície de um sólido tal como uma membrana) e várias lavagens subsequentes do material resultante com uma solução de tampão de lavagem que compreende 1 x SSC e 0,5 % de SDS a uma temperatura ideal de 42 °C ou superior. Para outras condições concretas, referem-se a vários manuais experimentais que são bem conhecidos pelo versado na técnica, tais como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Pr; and Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Maruzen Co., Ltd.

[00081] A nova molécula de ácido nucleico tendo atividade de APES ou uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência complementar à molécula é uma característica importante da presente invenção.

[00082] Em uma modalidade, APES é uma molécula de ácido nucleico tendo a função de supressão da expressão de NfkBia ou aumentando a produção de um polipeptídeo recombinante, e é um RNA ou DNA, que pode se ligar ao DNA ou mRNA do gene de NfkBia derivado de humano, camundongo, rato ou hamster por pareamento de base. Presume-se que tal molécula de ácido nucleico compreende uma sequência homóloga ou complementar ao mRNA que codifica NfkBia e pode se ligar ao gene NfkBia ou mRNA e inibir a sua expressão.

[00083] Em uma modalidade, APES é um RNA pequeno de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento compreendendo a sequência complementar de uma parte de NfkBia mRNA, ou um RNA pequeno que tem uma sequência idêntica à sequência, exceto para um nucleotídeo e tem a função de suprimir a expressão de NfkBia ou aumentar a produção de polipeptídeos recombinantes. O RNA pequeno como aqui referido significa um RNA não codificante pequeno (snRNA), e snRNA engloba miRNA.

[00084] Em uma modalidade, APES é um RNA não codificante do tipo mRNA de no máximo 561 nucleotídeos de comprimento ou, no máximo, de 500 nucleotídeos de comprimento, que compreende a sequência complementar de uma parte de NfkBia mRNA (por exemplo, a sequência é uma uma sequência de RNA não codificante pequeno, como descrito acima).

[00085] Em uma modalidade, APES é um RNA não codificante do tipo mRNA de 561 a 1579 nucleotídeos de comprimento, ou 500 a 1000 nucleotídeos de comprimento, que compreende a sequência complementar de uma parte de NfkBia mRNA (por exemplo, a sequência é um uma sequência de RNA não codificante pequeno, como descrito acima).

[00086] Um exemplo específico de APES que foi encontrado na transcrição em células CHO tem a sequência parcial derivada de AI462015 de camundongo ou tal uma sequência parcial em que um ou vários nucleotídeos tenham foram substituídos, suprimidos ou adicionados. Em particular, incluída está uma sequência de DNA de 165 nucleotídeos, que consiste na sequência de nucleotídeo entre G no nucleotídeo 4 e C no nucleotídeo 168 a partir da extremidade 5' (SEQ ID NO: 2, APES165), a sequência de DNA complementar (antissentido) da sequência de DNA; uma sequência que compreende uma sequência de RNA transcrito a partir de um DNA; ou uma sequência parcial de qualquer comprimento na sequência. Em alternativa, é incluída uma sequência de DNA de 434 nucleotídeos, que consiste na sequência de nucleotídeo entre G no nucleotídeo 4 a partir da extremidade 5' e T na extremidade 3' (SEQ ID NO: 3, APES434); a sequência de DNA complementar (antissentido) da sequência de DNA; uma sequência que compreende uma sequência de RNA transcrito a partir de um DNA; ou uma sequência parcial de qualquer comprimento derivada da sequência. Também está incluída uma sequência de nucleotídeo que compreende uma sequência derivada de um mamífero, tal como humano, hamster ou rato que corresponde à sequência de AI462015 de camundongo; uma sequência parcial da sequência que compreende a sequência derivada de mamífero; ou uma sequência parcial em tal um ou vários nucleotídeos foi substituída, suprimida ou adicionada.

[00087] Em uma modalidade, APES tem a sequência de nucleotídeo entre os nucleotídeos 4 e 133 a partir da extremidade 5' (SEQ ID NO: 4, APES130) em AI462015 ou uma sequência parcial derivada da sequência. Por exemplo, é incluída a sequência de DNA entre 4 e 68 nucleotídeos a partir da extremidade 5' (SEQ ID NO: 5, APES4 -68) ou a sequência de DNA entre os nucleotídeos 69 e 133 a partir da extremidade 5' (SEQ ID NO: 6, APES69 -133) ou as suas sequências complementares de DNA, ou uma sequência transcrita a partir deste DNA.

[00088] Em uma modalidade, APES tem a sequência de 52 nucleotídeos entre os nucleotídeos 40 e 91 a partir da extremidade 5' (SEQ ID NO: 7) em AI462015 ou uma sequência derivada de uma sequência parcial obtida pela clivagem dos 52 nucleotídeos em qualquer localização. Por exemplo, é incluída a sequência de DNA da parte formadora (os 29 nucleotídeos de APES40 -68, os 24 nucleotídeos de APES40 -63, ou os 22 nucleotídeos de APES40 -61) ou última parte (os 23 nucleotídeos de APES69 -91) ou a sequência de DNA complementar do mesmo (que corresponde a SEQ ID NOs: 8 a 11, respectivamente) ou uma sequência transcrita a partir deste DNA.

[00089] Os 52 nucleotídeos descritos acima são uma sequência idêntica à do filamento complementar da região 3' não traduzida do gene NfkBia de rato exceto para um nucleotídeo. Os 24 nucleotídeos de 5' (APES40 -63, SEQ ID NO: 9) são uma sequência idêntica à da região 3' não traduzida do gene NfkBia humano. Os 22 nucleotídeos de 5' (APES40 -61, SEQ ID NO: 10: AAGTACCAAAATAATTACCAAC) são uma sequência idêntica a do filamento complementar da região 3' não traduzida do NfkBia mRNA independentemente de espécies, tais como camundongo, macaco rhesus, cão, cavalo. Efeito de RNAi está previsto para ser produzido expressando em células hospedeiras uma sequência parcial complementar à região 3' não traduzida do gene NfkBia. Por exemplo, é possível que um RNA possuindo uma sequência complementar de 19 a 25 nucleotídeos dos 52 nucleotídeos acima agiria como um microRNA (miRNA) na região não traduzida do NfkBia mRNA, interferindo assim com os processos de translação.

[00090] Em alternativa, APES tem a sequência de 85 nucleotídeos entre 7 e 91 nucleotídeos a partir da extremidade 5' (SEQ ID NO: 29) em AI462015 ou uma sequência derivada de uma sequência parcial obtida pela clivagem dos 85 nucleotídeos em qualquer localização. É possível que um RNA possuindo uma sequência complementar de 19 a 25 nucleotídeos dos 85 nucleotídeos acima agiria como um microRNA (miRNA) na região não traduzida do NfkBia mRNA, interferindo assim nos processos de translação.

[00091] Em uma modalidade, APES tem uma sequência encontrada em uma busca por siRNA de 21 nucleotídeos. Exemplos incluem sequências miRNA compreendendo a sequência complementar à sequência de DNA entre os nucleotídeos 84 e 104 (SEQ ID NO: 12, APES84 -104) em AI462015, a sequência de DNA entre os nucleotídeos 99 e 119 (SEQ ID NO: 13, APES99 -119) ou a sequência de DNA entre os nucleotídeos 101 e 121 (SEQ ID NO: 14, APES101 -121). A sequência entre os nucleotídeos 71 e 112 (SEQ ID NO: 16), no APES acima 69-133 é uma região que foi quantificada em GeneChip e realmente expressa a um nível elevado. Assim, julga-se ser altamente possível que APES84 -104 iria funcionar como um miRNA.

[00092] Além disso, com base na característica estrutural ou funcional de APES, uma nova molécula de ácido nucleico tendo atividade APES pode ser sintetizada quimicamente ou isolada de fontes biológicas. A característica estrutural da APES é que é uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência complementar a uma parte do mRNA NfkBia alvo. A molécula de ácido nucleico pode estar em qualquer forma, independentemente da matéria, tal como se ela for um DNA, transcrição do DNA, mRNA ou cDNA, RNA exóssomo, RNA de filamento simples sintetizado quimicamente, ou RNA de filamento duplo sintetizado quimicamente. A característica funcional é o aumento da capacidade de produzir um polipeptídeo recombinante, tal como um anticorpo ou a supressão da expressão de NfkBia, em associação com a expressão de APES em células hospedeiras.

[00093] Se APES é isolada de uma fonte biológica, ela pode ser derivada de qualquer organismo vivo, sem qualquer limitação particular. Exemplos específicos incluem APES derivada de animais, incluindo primatas, como humanos e chimpanzés, roedores, como camundongos, ratos e hamster; gado como bovinos, suínos e caprinos, aves, como frango, peixe, como peixe-zebra, insetos, como mosca; nematóides; e semelhantes. APES é de preferência derivada de humano, um roedor, ou as mesmas espécies que uma célula hospedeira.Por exemplo, quando uma célula expressando fortemente APES é uma célula de ovário de hamster chinês (células CHO), APES é de preferência derivada de humano, camundongo ou hamster.

[00094] Tal uma molécula de ácido nucleico pode ser preparada por um método conhecido pela pessoa versada. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode ser preparada de acordo com os seguintes procedimentos: preparar RNA total a partir de uma célula cultivada que produziu um polipeptídeo recombinante tal como um anticorpo a um nível elevado, sintetizar um oligonucleotídeo com base na sequência de ácido nucleico da presente invenção (por exemplo, APES165 de SEQ ID NO: 2), e realizar PCR utilizando o oligonucleotídeo como um iniciador para amplificar cDNA que tem as características de APES. Além disso, após a preparação de um RNA pequeno a partir da célula cultivada, que produziu um polipeptídeo recombinante tal como um anticorpo a um nível elevado, uma biblioteca de cDNA pode ser preparada para produzir um RNA pequeno compreendendo uma sequência parcial complementar a NfkBia mRNA na base da sequência de nucleotídeo de um cDNA clonado. A biblioteca de cDNA também pode ser construída através de um método descrito em, por exemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), após a preparação de um RNA pequeno, tal como um microRNA (miRNA).

[00095] Além disso, um DNA genômico expressando APES pode ser isolado por meio de determinação da sequência de nucleotídeo do cDNA obtido e selecionando uma biblioteca de DNA genômico utilizando o cDNA como uma sonda.

[00096] Especificamente, os seguintes procedimentos podem ser utilizados: primeiro, RNA total é isolado de células, tecidos, ou similares, que são suscetíveis de expressar APES da presente invenção; para o isolamento de mRNA, um método conhecido tal como o método de ultracentrifugação de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) ou o método de AGPC (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987)162,156-159) é utilizado para preparar RNA total, e em seguida, o RNA total é adicionalmente purificado utilizando Mini Kit RNeasy (QIAGEN) ou semelhante.

[00097] A partir do RNA total obtido, cDNA é sintetizado utilizando uma transcriptase reversa. cDNA também podem ser sintetizado utilizando Transcriptase Reversa SuperScriptTM II (Invitrogen) ou similares. Também é possível sintetizar e amplificar o cDNA, de acordo com o método RACE - 5' (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 89989002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), utilizando 5'- o Kit Ampli FINDER RACE (Clontech) e reação de cadeia da polimerase (PCR), com um iniciador e similares.

[00098] Um fragmento de DNA de interesse é preparado a partir do produto de PCR resultante e ligado a um vetor de DNA, para assim preparar um vetor recombinante. O vetor é introduzido em E. coli ou semelhantes e, em seguida, as colônias obtidas são selecionadas para preparar um vetor recombinante desejado. A sequência de nucleotídeo do DNA de interesse pode ser confirmada através de um método conhecido tal como o método de terminação da cadeia de didesoxinucleotídeo.

[00099] O DNA obtido pode ser modificado usando um kit disponível comercialmente ou um método conhecido. Tal modificação é, por exemplo, a introdução de polimorfismo de nucleotídeo único utilizando o método de mutagênese de sítio dirigido, ou semelhantes. As sequências assim modificadas são também incluídas no âmbito da presente invenção, contanto que elas tenham atividade APES.

[000100] Tal como aqui utilizado, a frase "ter (tendo) atividade APES" refere-se a ter a ação de supressão da expressão de NfkBia em uma célula hospedeira cultivada, para assim ativar NF-kappa B e, assim, aumentar a capacidade de produção de polipeptídeo recombinante. A frase refere-se inequivocamente a ter a função de supressão da expressão de NfkBia por expressão do sujeito em uma célula.

[000101] Em alguns casos, uma molécula de ácido nucleico tendo atividade APES é referida aqui como a molécula de ácido nucleico da presente invenção.

(2)Expressão de APES

[000102] Na presente invenção, verificou-se que usando células que expressam APES, preferivelmente, células que fortemente expressam APES, a quantidade de polipeptídeos produzidos pelas células é aumentada.

[000103] Uma célula que fortemente expressa APES significa uma célula na qual APES foi artificialmente introduzida utilizando um vetor de expressão ou similares, e expressão forte de APES significa que o nível de expressão de APES foi aumentado em comparação com uma célula na qual o gene do anticorpo original gene ainda não foi introduzido. Exemplos de células originais incluem, mas não estão particularmente limitadas a, células para uso como hospedeiros (por exemplo, células CHO) na produção de proteínas recombinantes. Se for explicado com referência aos Exemplos descritos mais adiante, um exemplo específico é o seguinte : em um experimento GeneChip usando uma matriz de oligonucleotídeo produzida pela Affymetrix, Inc. (Affymetrix MOUSE430_2), os valores de sinal de AI462015 são 2000 ou menos em células originais nas quais o gene do anticorpo ainda não foi introduzido. Um aumento do nível de expressão de APES quando comparado com os valores significa que um valor de sinal de AI462015 é, por exemplo, duas ou mais vezes tão elevado quanto aqueles valores.

[000104] Uma célula que expressa fortemente APES compreende APES endógena ou exógena na célula. Exemplos de células que expressam fortemente APES incluem células nas quais APES foi artificialmente introduzida.

[000105] Uma célula na qual APES foi artificialmente introduzida pode ser preparada por um método conhecido pela pessoa versada. Por exemplo, a célula pode ser preparada incorporando uma sequência de DNA que codifica APES em um vetor e transformando o vetor em uma célula.

[000106] A célula na qual APES foi introduzida artificialmente, como referido aqui, engloba ainda células nas quais APES endógena foi ativada por tecnologia de ativação do gene (vide, por exemplo, a Publicação Internacional No WO 94/12650 folheto) que resultou em forte expressão da APES.

[000107] Um exemplo típico da APES endógena é APES como uma sequência de DNA codificado no genoma da célula hospedeira. Na presente invenção, as células também podem ser usadas nas quais após a introdução do gene de anticorpo, a transcrição da APES endógena é ativada devido a algum fator sem utilização de qualquer tecnologia de ativação de gene, resultando em expressão forte.

[000108] Um vetor no qual uma sequência de DNA que codifica APES foi inserida também cai dentro do âmbito da presente invenção. O vetor da presente invenção é útil para reter a molécula de ácido nucleico da presente invenção, dentro ou fora da célula hospedeira e expressando a molécula de ácido nucleico da presente invenção. O vetor da presente invenção também é útil para permitir que uma célula hospedeira expresse fortemente APES. Ao permitir que uma célula hospedeira expresse fortemente APES, a quantidade de um polipeptídeo desejado produzido pela célula hospedeira pode ser aumentada.

[000109] Por exemplo, quando E. coli é utilizado como uma célula hospedeira, é preferível que o vetor tenha um " ori" para a amplificação em E. coli (por exemplo, JM109, DH5a, HB101, XL1Blue) para conseguir a amplificação e preparação de uma quantidade grande do vetor em E. coli ou semelhantes e também tenha um gene para a seleção de E. coli transformado (por exemplo, um gene de resistência ao fármaco que permite a discriminação usando algum fármaco (ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol)). Exemplos do vetor incluem vetores M13, vetores pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, e semelhantes. Além destes vetores pGEM-T, pDIRECT, pT7 e semelhantes são enumerados se os vetores são usados para subclonagem e excisão de cDNA.

(3)Vetor de Expressão

[000110] Na presente invenção, quando é utilizado um vetor para a expressão forte de APES e/ou a produção de polipeptídeo, um vetor de expressão é especialmente útil. Exemplos do vetor de expressão que podem ser usados na presente invenção incluem vetores de expressão derivados de mamífero (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF -BOS (Nucleic Acids Res. 1.990, 18 (17), p5322), PFE, pCDM8), vetores de expressão derivados de células de insetos (por exemplo, "sistema de expressão de baculovairus Bac -to -BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), vetores de expressão derivados de plantas (por exemplo, pMH1, pMH2), vetores de expressão derivados de vírus de animais (por exemplo, pHSV, PMV, pAdexLcw), vetores de expressão derivados do retrovírus (por exemplo, pZIpneo), vetores de expressão derivados de leveduras (por exemplo, "Kit de Expressão Pichia" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01), vetores de expressão derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608, pKTH50), e semelhantes.

[000111] O vetor de expressão para a expressão de um polipeptídeo exógeno compreende um DNA que codifica o polipeptídeo e uma sequência de regulação da expressão capaz de promover a expressão do DNA. Da mesma maneira, o vetor de expressão para a expressão de APES compreende um DNA que codifica APES e uma sequência de regulação da expressão capaz de promover a expressão do DNA. Um único vetor pode ser construído de modo a expressar ambos um polipeptídeo e APES. Por exemplo, se uma APES ou gene de polipeptídeo que é uma parte do genoma do hospedeiro é ativado usando a tecnologia de ativação do gene, uma sequência de regulação da expressão que promove a expressão de tal um DNA derivado de célula hospedeira pode ser introduzida.

[000112] Exemplos da sequência de regulação da expressão incluem um promotor apropriado, intensificador, terminador de transcrição, uma sequência de Kozak contendo um códon de iniciação (isto é, ATG) em um gene que codifica proteína, sinais de splicing para um íntron, um local de poliadenilação, uma códon de terminação, e semelhantes. O vetor pode ser construído de forma adequada pelos versados.

[000113] A sequência de regulação da expressão contém, de preferência uma região promotora / intensificadora capaz de aumentar o nível de transcrição do gene em uma célula animal para ser utilizada. A região promotora / intensificadora envolvida na expressão de um gene que codifica um polipeptídeo desejado pode conter uma sequência de ligação de NF-KBde.

[000114] Quando a expressão em células de mamífero tais como células CHO, células COS e células NIH3T3 é pretendida o vetor preferivelmente possui um promotor necessário para a expressão nas células, tal como o promotor de SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), promotor MMLV -LTR, promotor EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990)18,5322) ou promotor CMV. Mais preferivelmente, o vetor também possui um gene para a seleção em células de transformação (por exemplo, um gene de resistência ao fármaco que permite a discriminação usando um fármaco (por exemplo, neomicina, G418)). Exemplos do vetor com estas características incluem PMAM, pDR2, pBK -RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 e semelhantes.

[000115] Além disso, quando a expressão estável de um gene e a amplificação intracelular do número de cópias do gene são pretendidas, um método pode ser utilizado, no qual, em células CHO que faltam uma via de síntese de ácido nucleico, um vetor tendo o gene DHFR que complementa a falta (por exemplo, pCHOI) é introduzido, seguido pela amplificação com metotrexato (MTX). Quando a expressão transiente de um gene é pretendida, o método pode ser utilizado em células COS, que portam um gene que expressa SV40 antígeno T no cromossoma são transformados com um vetor que tem a origem de replicação de SV40 (por exemplo, pcD). Como a origem de replicação, uma origem de replicação derivada de poliomavírus, adenovírus, vírus do papiloma bovino (BPV), ou outros semelhantes também podem ser usados. Além disso, para amplificar o número de cópias do gene em um sistema de célula hospedeira, o vetor de expressão pode conter um marcador de seleção, tal como o gene aminoglicosídeo transferase (APH), o gene da timidina quinase (TK), o gene da xantina - guanina fosforribosil transferase de E. coli, (Ecogpt), ou gene di-hidrofolato redutase (DHFR).

(4)Célula Hospedeira

[000116] A célula a ser utilizada na presente invenção pode ser tanto natural, uma célula capaz de produzir um polipeptídeo desejado ou uma célula na qual um DNA que codifica um polipeptídeo desejado foi introduzido. De preferência, uma célula transformada em que um DNA que codifica um polipeptídeo desejado que foi introduzido é utilizada.

[000117] Um exemplo da célula transformada em que um DNA que codifica um polipeptídeo desejado foi introduzido é uma célula hospedeira que foi transfectada com um vetor de expressão que contém, pelo menos, um DNA que codifica um polipeptídeo desejado e que expressou fortemente APES endógena ou exógena.

[000118] Além disso, na presente invenção, a célula na qual "um DNA (ou um gene) foi introduzido" abrange as células transfectadas com DNA exógeno, bem como as células nas quais o DNA endógeno é ativado utilizando tecnologia de ativação do gene (consultar, por exemplo, a Publicação Internacional No WO 94/12650 folheto) que resultou na expressão de uma proteína correspondente ao DNA ou o iniciação ou aumento da transcrição de DNA.

[000119] Quando uma célula na qual APES foi artificialmente introduzida é utilizada para produzir um polipeptídeo desejado, a sequência da introdução de APES e um gene que codifica o polipeptídeo desejado não é particularmente limitada; APES pode ser introduzida antes da introdução do gene que codifica o polipeptídeo desejado, ou o gene que codifica o polipeptídeo desejado pode ser introduzido antes da introdução de APES. Alternativamente, APES e o gene que codifica o polipeptídeo desejado podem ser introduzidos simultaneamente.

[000120] Quando um vetor é utilizado, APES e o gene que codifica o polipeptídeo desejado podem ser introduzidos simultaneamente usando um único vetor, ou podem ser introduzidos separadamente utilizando uma pluralidade de vetores.

[000121] A célula a ser utilizada na presente invenção não é particularmente limitada. Ela pode ser qualquer célula, tal como uma célula eucariótica (por exemplo, célula animal, célula de planta, levedura) ou uma célula procariota (por exemplo, E. coli e B. subtilis). Células de animais derivadas de insetos, peixes, anfíbios, répteis e mamíferos são as preferidas, e as células de mamífero são particularmente preferidas. As origens das células de mamíferos são primatas tais como chimpanzés e humanos, roedores tais como camundongos, rato e hamster, e semelhantes, de preferência humano e roedores. Além disso, é preferível que a célula da presente invenção sejam células de mamífero cultivadas que normalmente são frequentemente utilizadas para a expressão de polipeptídeos, tais como células CHO, células COS, células 3T3, células de mieloma, células BHK, células HeLa e células Vero. Para a expressão de uma grande quantidade de um polipeptídeo desejado, as células CHO são particularmente preferivelmente utilizadas. Em particular, dhfr -(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220), que são as células CHO sem o gene de DHFR, ou CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) pode ser utilizado vantajosamente como células CHO.

[000122] Em particular, a cepa DG44, cepa DXB-11, K-1 ou CHO-S é preferida como as células CHO acima, e a cepa DG44 ou DXB-11 é particularmente preferida.

[000123] A célula hospedeira da presente invenção pode ser usada, por exemplo, como um sistema de produção para a produção ou a expressão de um polipeptídeo pretendido. Se o DNA que codifica um polipeptídeo desejado é introduzido em uma célula hospedeira que expressa fortemente APES, o polipeptídeo desejado pode ser produzido a um nível elevado. Dentro da célula hospedeira da presente invenção, um DNA que codifica tanto um transportador de taurina (TauT) ou de um permutador de ânions (AE1) (o DNA pode ser incorporado em um vetor) pode ser adicionalmente introduzido.Dentro da célula hospedeira da presente invenção, um DNA que codifica qualquer cisteína descarboxilase de ácido sulfínico (CSAD) ou alanina transferase (ALT1) pode ser adicionalmente introduzido.Para mais detalhes, consultar WO 2007/119774, WO 2008/114673, WO 2009/ 020144 e WO 2009/ 054433.

[000124] O DNA exógeno (que pode ser incorporado em um vetor) pode ser introduzido na célula hospedeira através de um método tal como o método de fosfato de cálcio, o método de DEAE dextrano, um método utilizando ribossoma DOTAP catiônico (Boehringer Mannheim), eletroporação, método de nucleofection (Amaxa), ou lipofecção.

(5)Polipeptídeo Pretendido

[000125] O polipeptídeo a ser produzido pelo método da presente invenção não é particularmente limitado. Ele pode ser qualquer polipeptídeo, tal como um anticorpo (por exemplo, anticorpo de receptor anti-IL-6, anticorpo anti-IL- 6, anticorpo anti-glipican-3, anticorpo anti- CD3, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-GPIIb/IIIa, anticorpo anti-TNF, anticorpo anti-CD25, anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-Her2/neu, anticorpo anti-RSV, anticorpo anti-CD33, anticorpo anti-CD52, anticorpo anti-IgE, anticorpo anti-CD11a, anticorpo anti-VEGF, anticorpo anti- VLA4), ou uma proteína fisiologicamente ativa (por exemplo, fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colônias de granulócitos - macrófagos (GM-CSF), eritropoietina, interferon, interleucina (por exemplo, IL- 1, IL -6), t-PA, uroquinase, albumina sérica, fator de coagulação do sangue, PTH). Um anticorpo é particularmente preferido, e pode ser qualquer anticorpo tal como um anticorpo natural, um anticorpo de baixo peso molecular (por exemplo, Fab, scFv, SC (Fv) 2), um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humanizado.

(6)Produção de Polipeptídeo

[000126] Um polipeptídeo de interesse pode ser obtido por cultura da célula hospedeira acima descrita, produzindo um polipeptídeo desejado e coletando o polipeptídeo.

[000127] Para a cultura da célula, meios que são utilizados nas culturas de célula comum (de preferência, células de origem animal) podem ser utilizados.Estes meios contêm, geralmente, aminoácidos, vitaminas, fatores de lipídios, fontes de energia, reguladores osmóticos, fontes de ferro e tampões de pH. Em geral, é conveniente que os teores destes componentes estejam dentro das seguintes faixas: aminoácidos 0,05-1500 mg/L, vitaminas 0,001-10 mg/L, fatores lipídicos 0-200 mg/L, fontes de energia 1-20 g/L, reguladores osmóticos,1-10.000 mg/L, fontes de ferro 0,1-500 mg/L, tampões de pH 1-10000 mg/L, oligoelementos metálicos 0,00001-200 mg/L, surfactantes 0-5000 mg/L, cofatores de crescimento de 0,05 10000 ug/L e nucleosídeos 0,001-50 mg/L. No entanto, o conteúdo não se limita a estas faixas e pode ser adequadamente determinado dependendo do tipo de célula a ser cultivada, o tipo de polipeptídeo desejado, e outros semelhantes.

[000128] Em adição aos componentes acima descritos, por exemplo, oligoelementos metálicos, surfactantes, cofatores de crescimento, nucleosídeos e semelhantes podem ser adicionados.

[000129] Exemplos específicos incluem aminoácidos tais como a L- alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L- cistina, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L- serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina (de preferência, L- alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cistina, L- glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L- triptofano, L-tirosina e L-valina), vitaminas, tais como o i- inositol, biotina, ácido fólico, ácido lipóico, ácido nicotínico, nicotinamida, ácido p - aminobenzóico, pantotenato de cálcio, cloridrato piridoxal, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12 e ácido ascórbico (de preferência, biotina, ácido fólico, ácido lipóico, nicotinamida, pantotenato de cálcio, cloridrato de piridoxal, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12 e ácido ascórbico), fatores lipídcos, tais como cloreto de colina, tartarato de colina, ácido linoleico, ácido oleico e colesterol (preferivelmente, cloreto de colina), fontes de energia como glicose, galactose, manose e frutose (de preferência, a glicose); reguladores osmóticos tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio e nitrato de potássio (de preferência, cloreto de sódio), fonte de ferro, como o ferro de EDTA, citrato férrico, cloreto ferroso, cloreto férrico, sulfato ferroso, sulfato férrico e nitrato férrico (de preferência, o cloreto férrico, o EDTA de ferro e citrato férrico), e tampões de pH, tais como hidrogenocarbonato de sódio, cloreto de cálcio, di-hidrogeno fosfato de sódio, HEPES e o MOPS (preferivelmente, hidrogenocarbonato de sódio). Meios contendo qualquer um destes componentes podem ser dados como exemplos.

[000130] Em adição aos componentes acima mencionados, por exemplo, podem ser adicionados os seguintes componentes: traços de elementos metálicos, tais como sulfato de cobre, sulfato de manganês, sulfato de zinco, sulfato de magnésio, cloreto de níquel, cloreto de estanho, cloreto de magnésio e subsilicato de sódio (preferivelmente, sulfato de cobre, sulfato de zinco e sulfato de magnésio), surfactantes, tais como Tween 80 e Pluronic F68; cofatores de crescimento tais como insulina recombinante, IGF-1 recombinante, EGF recombinante, FGF recombinante, o PDGF recombinante, TGF-α recombinante, cloridrato de etanolamina, selenito de sódio, ácido retinóico e cloridrato de putrescina (de preferência, selenito de sódio, cloridrato de etanolamina, IGF-1 e cloridrato de putrescina recombinantes); nucleosídeos tais como desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina, adenosina, citidina, guanosina e uridina, e afins. Deve ser notado que nos exemplos preferidos de meios acima, um antibiótico tal como a estreptomicina, penicilina G de potássio ou gentamicina ou um indicador de pH tal como vermelho de fenol, podem ser contidos.

[000131] O pH do meio varia dependendo da célula a ser cultivada. pH 6,8 -7,6 é geralmente adequado, e pH 7,0 - 7,4 é apropriado em muitos casos.

[000132] Também é possível utilizar um meio comercialmente disponível para cultura de células de animais, tais como D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), Mistura D-MEM/F-12 1:1 (Meio Eaglo modificado da Dulbecco: Mistura de Nutriente F-12), RPMI1640, CHO-S-SFM II (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX-CELL 301 (JRH Biosciences), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific) or PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich).

[000133] O meio pode ser um meio sem soro.

[000134] Quando a célula hospedeira é células CHO, um método conhecido para o versado na técnica pode ser usado para a cultura das células CHO. Por exemplo, as células CHO podem ser geralmente cultivadas em uma atmosfera de fase gasosa, a uma concentração de CO2 de 0 a 40 %, de preferência 2 a 10 %, a 30 até 39 °C, de preferência cerca de 37 °C.

[000135] Um período de cultura adequado para a produção de um polipeptídeo desejado é usualmente de 1 dia a 3 meses, de preferência de um dia a 2 meses, mais preferivelmente de 1 dia a 1 mês.

[000136] Como vários dispositivos de cultura para cultura de células animais, os seguintes dispositivos podem ser usados para a cultura: por exemplo, dispositivos de cultura de tanque tipo fermentador, dispositivos de cultura do tipo elevador de ar, dispositivos de cultura do tipo garrafa de cultura, dispositivos de cultura do tipo frasco giratório, dispositivos de cultura do tipo microcarregador, dispositivos de cultura do tipo de leito fluidizado, dispositivos de cultura do tipo de fibra oca, dispositivos cultura do tipo garrafa russas e dispositivos de cultura do tipo leito embalado.

[000137] A cultura pode ser realizada por qualquer método tal como a cultura em batelada, cultura de batelada alimentada ou cultura contínua. Entre elas, a cultura de batelada alimentada ou cultura contínua é preferida, e a cultura de batelada alimentada é a mais preferida.

[000138] O polipeptídeo obtido pode ser isolado a partir do interior de uma célula hospedeira ou a partir do seu lado de fora (por exemplo, meios) e purificado em um polipeptídeo substancialmente puro e homogêneo. O isolamento e purificação do polipeptídeo pode ser realizado utilizando um método de isolamento e purificação comum em purificação de polipeptídeo, mas não estão limitados de forma alguma. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser isolados e purificados por meio de seleção e combinação apropriadas de colunas de cromatografia, filtros, ultrafiltração, salting-out, precipitação de solvente, extração de solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em gel de SDS- poliacrilamida, focagem isoelétrica, diálise, recristalização, e similares.

[000139] Exemplos de cromatografia incluem cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iônica, cromatografia hidrófoba, filtração em gel, cromatografia de fase inversa, cromatografia de absorção e semelhantes (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estas cromatografias podem ser realizadas utilizando cromatografia em fase líquida, tais como HPLC ou FPLC. A presente invenção também abrange polipeptídeos altamente purificados por estes métodos de purificação.

[000140] Deve ser notado que, antes ou após a purificação de polipeptídeos, é também possível dar modificações opcionais ou remover um peptídeo parcial permitindo que uma enzima de modificação de polipeptídeo apropriada atue sobre os polipeptídeos. Exemplos de enzima de modificação de polipeptídeo incluem tripsina, quimotripsina, lisil endopeptidase, proteína quinase, glucosidase, e semelhantes.

(7)Farmacêuticos

[000141] Quando o polipeptídeo produzido pelo método da presente invenção possui uma atividade biológica que pode ser utilizada como um medicamento, o polipeptídeo pode ser misturado com um veículo ou aditivo farmaceuticamente aceitável e formulado para produzir um produto farmacêutico.

[000142] Exemplos do veículo ou aditivo farmaceuticamente aceitável incluem água, solventes orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, colágeno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polímeros de carboxivinila, carboximetil celulose de sódio, poliacrilato de sódio, alginato de sódio, dextrano hidrossolúvel, carboximetil amido de sódio, pectina, metil celulose, acetato de celulose, goma xantana, goma arábica, caseína, ágar, polietilenoglicol, diglicerina, glicerina, propileno glicol, vaselina, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina de soro humano (HSA), manitol, sorbitol, lactose, surfactantes aceitáveis como aditivos farmacêuticos, e similares.

[000143] O aditivo atual é selecionado a partir dos aditivos anteriores, quer isoladamente ou em combinação adequada, de acordo com a forma de dosagem do agente terapêutico da presente invenção, mas o aditivo real não é definitivamente limitado a estes. Por exemplo, no caso da utilização como uma formulação para injeção, um material que pode ser utilizado é obtido por dissolução do polipeptídeo purificado em um solvente tal como salina fisiológica, uma solução de tampão ou uma solução de glicose e, em seguida, adicionando-se à solução resultante um inibidor de adsorção tal como Tween 80, Tween 20, gelatina ou albumina do soro humano. Alternativamente, um material liofilizado pode ser usado para preparar uma forma de dosagem que é dissolvida e reconstituída antes da utilização, e um excipiente que pode ser utilizado para a liofilização é, por exemplo, um álcool de açúcar ou açúcar, tal como manitol ou glicose.

[000144] A quantidade eficaz de administração do polipeptídeo é adequadamente selecionada de acordo com o tipo de polipeptídeo, o tipo de doenças a serem tratadas ou prevenidas, a idade dos doentes, a gravidade da doenças e similares. Por exemplo, quando o polipeptídeo é um anticorpo anti- glipican, a quantidade eficaz de administração é selecionada a partir da faixa de 0,001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por administração. Em alternativa, uma quantidade de administração de 0,01 a 100.000 mg / corpo pode ser selecionada por paciente. No entanto, a quantidade eficaz não está limitada a estas faixas.

[000145] O polipeptídeo pode ser administrado por via oral ou parentérica, mas é preferida a administração parentérica. Os exemplos específicos incluem a injeção (por exemplo, administração local ou sistêmica por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou semelhantes), administração transnasal, administração transpulmonar, administração percutânea e semelhantes.

(8)Supressão de Expressão de NfkBia

[000146] De acordo com a presente invenção, no método de produção de um polipeptídeo desejado por cultura de uma célula animal em que um DNA que codifica o polipeptídeo foi introduzido, a quantidade de produção do polipeptídeo desejado pode ser aumentada, diminuindo o nível de expressão do fator nuclear de KB inibidor α (NfkBia) na célula hospedeira. O gene NfkBia é um gene essencial, e a supressão completa do gene leva à morte celular. Assim, é concebível que a supressão da expressão do gene NfkBia moderadamente é importante para o método da presente invenção.

[000147] Por estes motivos, o âmbito da presente invenção inclui o método de produção de um polipeptídeo desejado por cultura de uma célula animal em que um DNA que codifica o polipeptídeo foi introduzido, compreendendo a etapa de diminuir o nível de expressão NfkBia na célula para um nível inferior ao de uma célula progenitora em que o gene de anticorpo ainda não foi introduzido.

[000148] Como método de diminuir a expressão de NfkBia, a expressão pode ser inibida pela inibição da transcrição a partir do gene NfkBia, a degradação de mRNA, a inibição da tradução do mRNA, ou a inibição da função (ligação) de tradução de produto. Em comparação com os casos em que este método de diminuir a expressão de NfkBia não é usado, o nível de expressão de NfkBia é controlado a 70 % ou inferior, de preferência 60% ou inferior, mais preferivelmente 50% ou inferior, o que resulta no aumento da quantidade de produção do polipeptídeo desejado. Em outras palavras, o nível da expressão do gene NfkBia necessário para evitar a morte das células é, por exemplo, 20% ou superior, preferivelmente 30% ou superior.

[000149] Uma forma específica para a inibição da expressão de NfkBia é considerada a utilização de um oligonucleotídeo antissentido, uma ribozima ou uma molécula de ácido nucleico que provoca a interferência de RNA (RNAi), tais como dsRNA, siRNA, shRNA ou miRNA. RNAs não codificantes do tipo mRNA, que são chamados "RNAs não codificantes longos intergênicos grandes (ou interveniente) (lincRNAs)", outro RNAs não codificantes do tipo mRNA, oligos de engodo ou aptâmeros podem também ser usados. Estas moléculas de ácido nucleico compreendem cada um uma sequência homóloga ou complementam o mRNA que codifica NfkBia e podem se ligar ao gene NfkBia ou mRNA e inibir a sua expressão. APES (ou PPES) é tal molécula de ácido nucleico.

[000150] A molécula de ácido nucleico que pode ser utilizada para inibir a expressão de NfkBia é, por exemplo, um RNA pequeno de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento, compreendendo a sequência complementar de uma parte de NfkBia mRNA, ou um RNA pequeno que possui uma sequência idêntica à sequência exceto para um nucleotídeo, e tem a função de inibir a expressão de NfkBia.

[000151] Ao expressar em uma célula hospedeira tal RNA pequeno que inibe a expressão de NfkBia, o nível de expressão do fator nuclear de KB inibidor α (NfkBia) pode ser reduzido. Um método típico para a expressão e uma célula hospedeira de RNA pequeno que inibe a expressão de NfkBia pode ser a introdução de um vetor compreendendo um DNA que codifica para tal RNA pequeno dentro da célula.

[000152] É possível inibir a expressão de NfkBia introduzindo na célula um dsRNA formado por ligação de um RNA sentido e um RNA antissentindo contra NfkBia mRNA ou uma sequência parcial do mesmo um ao outro.

[000153] Antes de medir o nível de expressão de NfkBia, a sequência de mRNA NfkBia que foi expressa em uma célula alvo e pode ser quantificada por um método TaqMan tem de ser determinada. Por exemplo, as sequências parciais de NfkBia (SEQ ID NOs: 19 e 28) e conjunto de sonda TaqMan (SEQ ID NOs: 20-22), que foram utilizados neste estudo, podem ser mostrados pela Figura 12. Estas sondas TaqMan podem ser concebidas utilizando Software Primer Express (R) (Applied Biosystems) ou semelhante. A sequência parcial NfkBia acima (SEQ ID NO: 28), também foi confirmada como uma sequência tipo NF- kappa B - inibidor alpha em CHO K1 e combinada com a nossa sequência na clonagem por PCR. Na sequência, a expressão da região entre os 64 nucleotídeos a montante e 132 nucleotídeos a montante do códon de paragem TGA (907-909) pode ser quantificada.

[000154] O instrumento de medição típico é, por exemplo, o Sistema de Detecção de Sequência 7900HI produzido pela Applied Biosystems (ABI), e todos os kits e reagentes podem ser adquiridos. Assim, a quantificação pode ser realizada de acordo com um protocolo recomendado pela ABI.

EXEMPLOS

[000155] A presente invenção é concretamente descrita abaixo com referência aos exemplos mostrados abaixo. Deve ser notado que estes exemplos são fornecidos para ilustrar a presente invenção, e não para limitar o escopo da presente invenção.

[Exemplo 1] Experimento GeneChip para analisar várias células CHO introduzidas em genes

[000156] Um experimento GeneChip foi conduzido de acordo com um processo comum, utilizando uma matriz de oligonucleotídeos produzida por Affymetrix, Inc. (Affymetrix MOUSE430_2), contanto que uma vez que qualquer matriz de hamster não foi comercializada, Matriz de Genoma 430 2.0 de camundongo foi utilizada. Otimização de condições de hibridação resultou na detecção de ligações presentes em 8 de 16 sondas de genes de camundongo sobre a matriz de teste 3, que se tornou possível quantificar a expressão da transcrição em hamsters quando a homologia da sequência de nucleotídeo com as sequências de camundongo era de cerca de 90% ou superior.

[000157] A partir de células que exibem uma forte expressão de vários genes, o RNA total de alta pureza foi preparado e, em seguida, cDNA foi sintetizado utilizando o RNA total e um iniciador oligo dT contendo uma sequência de promotor T7 (T7 -(T) 24). Em seguida, uma cRNA marcado com biotina foi sintetizado a partir do cDNA através de uma reação de transcrição utilizando os Kits Bio-CTP 11, Bio -16 e Megascript UTP e T7 (Ambion). Após o cRNA ter sido submetido a purificação de coluna, o cRNA de alta qualidade resultante cujo peso molecular foi confirmado em eletroforese para corresponder a 18s a 28s rRNA foi fragmentado para preparar amostras GeneChip de um tamanho uniforme. Ás amostras GeneChip antes de usar, uma amostra de solução de hibridação foi adicionada, seguida por criopreservação a -80°C. A solução da amostra foi tratada termicamente imediatamente antes da utilização, centrifugada e aplicada à matriz de genoma do camundongo 430 2,0. A incubação foi realizada a 45 °C durante 16 horas em um forno de hibridação especializado, durante a rotação das matrizes. As amostras foram recolhidas, e as matrizes foram lavadas repetidamente, coradas com estreptavidina - ficoeritrina e R, em seguida, verificada.

[000158] Os valores de sinal GeneChip das transcrições nas matrizes (cerca de 45.000) foram comparados, e, como resultado, um RNA não codificante do tipo mRNA UG_GENE =AI462015 (Affymetrix MOUSE430_2, 1420088_AT) foi identificado como uma transcrição cuja expressão foi de alta intensidade e aumentou acentuadamente em genoma do camundongo em uma célula DG44 subcultivada que produziu pelo menos 900 mg/L de MAb1 (anticorpo anti-IL- 6R, tocilizumabe, nome do produto: Actemra) no dia 10 de uma cultura de batelada alimentada em uma jarra de 1l e que fortemente expressou MAb1 (anticorpo anti-IL- 6R), TAUT e CSAD (Figura 1: a sequência da transcrição de AI462015).

[000159] AI462015 é um RNA não codificante do tipo mRNA de 437 nucleotídeos e a sua sequência existe no filamento complementar próximo da região 3' não traduzida (56.590.831-56.590.397) de NfkBia mRNA no genoma do camundongo 12. Havia possibilidades que a transcrição AI462015 atuaria diretamente na região não traduzida de NfkBia mRNA e inibiria a tradução ou que uma parte da sequência de 437 nucleotídeos funcionaria como um RNA pequeno e degradaria NfkBia mRNA.

[000160] Por exemplo, a sequência de 52 nucleotídeos, que é a sequência entre A no nucleotídeo 40 e A no nucleotídeo 91 a partir da extremidade 5' (AAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATA- TACAACATTTACA AGAA: SEQ ID NO: 7), na sequência de AI462015 correspondeu ao filamento complementar da região 3' não traduzida de NfkBia mRNA de rato (1478-1529, Gene ID: 25493 NfkBia), exceto para um nucleotídeo (A no nucleotídeo 61 da extremidade 5' em AI462015). Além disso, a sequência de 24 nucleotídeos que compreende a sequência entre A no nucleotídeo 40 e A no nucleotídeo 63 (AAGTACCAAAATAATT- ACCAACAA : SEQ ID NO: 9), em AI462015 é o filamento complementar da sequência parcial da região 3' não traduzida de NfkBia mRNA humano (TTGTTGGTAATTATTTTGGTACTT, 1490-1513 : SEQ ID NO: 24). À luz destes pontos, a previsão era de que 19 a 25 nucleotídeos que são uma parte dos 52 nucleotídeos iriam agir sobre o NfkBia mRNA de células CHO, que serve como um microRNA, ou sequências parciais que atuariam no NfkBia mRNA de células CHO, que servem como RNA antissentido.

[000161] Além disso, de acordo com a informação atualizada (Exemplo 8), por exemplo, a sequência de 85 nucleotídeos, que é a sequência entre T no nucleotídeo 7 e A no nucleotídeo 91 a partir da extremidade 5' (a parte sublinhada representada nas Figuras 23 e 24, SEQ ID NO: 29) (TGTAAAAATCTGTTTAATAAATATACATCTTAGAAGTACCAAAA- TAATTACCAACAAAA TACA ACATATACAACATTTACAAGAA) na sequência AI462015 correspondeu ao filamento complementar da região 3' não traduzida do mRNA de NfkBia de rato (1478-1562, Gene ID: 25493 NfkBia, SEQ ID NO: 31), exceto para um nucleotídeo (A no nucleotídeo 70 a partir da extremidade 5' em AI462015) (Correspondência = 84/85, Figura 25b). Da mesma forma, a sequência foi confirmada como sendo homóloga às sequências de humano (Correspondência = 75/85, Figura 25a, SEQ ID NO: 30), chimpanzé (Correspondência = 75/85, Figura 25c, SEQ ID NO: 32), macaco rhesus (Correspondência = 74/85 Figura 25d, SEQ ID NO: 33) e gado (Correspondência = 76 /85 Figura 25e, SEQ ID NO: 34). Assim, considera-se que 19 a 25 nucleotídeos que são uma parte dos 85 nucleotídeos (sequência conservada 7-91) atuam sobre as células animais ou células de mamíferos, independentemente da espécie, que servem como um microRNA, ou que sequências parciais atuam sobre as células animais ou células de mamíferos, independentemente da espécie, servindo como RNAs antissentido. Assim, a previsão era de que eles também atuariam no NfkBia mRNA de células animais cultivadas, preferivelmente, as células de mamífero tais como células CHO.

[Exemplo 2] Identificação de transcrição expressa em um nível aumentado em células altamente produtoras de anticorpos

[000162] No Exemplo 1, o nível de expressão da transcrição AI462015 foi aumentado nas células DG44 produzindo MAb1 (anticorpo anti-IL- 6R; tocilizumab, nome do produto: Actemra) a um nível elevado (Figura 2). Da mesma forma, quando um anticorpo diferente (Mab2: anticorpo anti-glipican 3; GC33 (consultar WO 2006/ 006693)) foi produzido a um nível elevado em uma célula hospedeira diferente (CHO-DXB11s), o aumento da expressão da transcrição de AI462015 foi observado (Figura 3).

[000163] Como mostrado na figura 2, quando o gene de transportador de taurina (TauT) foi fortemente expresso, o gene da cisteína descarboxilase de ácido sulfínico (CSAD) foi fortemente expresso (dados não mostrados), e TauT e CSAD foram fortemente coexpressos, em uma célula CHO - DG44, em cada caso, os níveis de expressão da transcrição AI462015 foram todos comparáveis. Em contraste, em uma célula na qual TauT e CSAD foram fortemente coexpressos e, adicionalmente Mab1 (anticorpo de receptor anti-IL-6) foi fortemente expresso, aumento anormal de AI462015 (7 vezes maior do que a célula hospedeira) foi observado, e o nível de expressão foi também demonstrado por um valor de sinal GeneChip aberrantemente alto (10.000 ou superior). Considerando-se que as intensidades de expressão de GAPDH como um controle eram comparáveis entre as células, o aumento da expressão da transcrição AI462015 foi encontrada para ser mais específico na célula produtora de anticorpo Mab1 a um nível elevado. O mesmo se aplica para o caso mostrado na Figura 3, quando o gene de Mab2 (anticorpo anti-glipican 3) foi fortemente expresso em uma célula CHO-DXB11s, o aumento da expressão da sequência de AI462015 (13 vezes mais elevado do que o valor médio entre células cada uma expressando fortemente TauT, CSAD ou AE1) foi encontrado para ser mais específico na célula produtora de anticorpo Mab2 a um nível elevado.

[000164] Os resultados acima mostram que células altamente produtoras de anticorpos que cresceram de forma estável no 3° dia de subcultura em agitador expressaram a sequência AI462015 em níveis anormalmente elevados.

[000165] Sob as condições de cultura de produção no terceiro dia de uma cultura de uma jarra de 1L, foi também observado um aumento aberrante da expressão da sequência AI462015. Como mostrado na Figura 4, dois tipos de células altamente produtoras de anticorpos que produzem cerca de 1200 a 1400 mg/L de MAb1 (anticorpo anti-IL-6R) no 10° dia de uma cultura de batelada alimentada em uma jarra de 1L exibiram valores de sinal GeneChip alta de 5000 ou superior. Por causa das diferenças nas condições de cultura, os valores do sinal GeneChip medidos no terceiro dia da cultura de batelada alimentada em uma jarra de 1L foram cerca de 50 % do valor na cultura de agitador. No entanto, no dia 13, na fase final da cultura de batelada alimentada no frasco de 1L, verificou-se que a intensidade da expressão da sequência de AI462015 tinha sido aumentada para um nível comparável àquela na subcultura de agitador, mostrando valores de sinal anormalmente elevados (Figura 5). Por outro lado, uma célula DXB11s de baixa produção de anticorpos e que fortemente expressa MAb1 (300 mg/L ou menos no sétimo dia de cultura de agitador hidrolisado livre; 500 mg/L ou menos, mesmo em cultura adicionada em hidrolisada) não exibe aumento da expressão da sequência de AI462015 no terceiro dia de uma cultura de jarra de 1L, mesmo sob condições em que um hidrolisado que contribui para aumentar a produção (Lisado de Hy-peixe ou Procino) foi adicionado (Figura 6).

[000166] Os resultados experimentais mostram a alta quantidade de anticorpos produzidos na célula DG44 fortemente expressando Mab-1, TauT e CSAD que apresentou um valor de sinal alto na Figura 2 (a quantidade foi de 640 mg/L no 7° dia de hidrolisado sem cultura de agitador), a alta quantidade de anticorpos produzidos na célula DXB11s fortemente expressando Mab2 que mostrou um alto valor de sinal na Figura 3 (a quantidade foi de 640 mg/L no 7° dia de cultura de agitador livre de hidrolisado), e nenhum aumento do valor do sinal observado mesmo quando um hidrolisado, que contribui para a produção de anticorpos mais elevados foi adicionado, como mostrado na Figura 6. À luz destes resultados experimentais, foi considerado que "uma célula que expressa um nível elevado da sequência AI462015 tem um elevado potencial de produção de anticorpo".

[Exemplo 3] Exemplo de maior produção resultante da forte expressão de APES em células produtoras de anticorpos

[000167] Para demonstrar que o nível de expressão da sequência de AI462015 correlaciona-se com o nível de produção de anticorpos potencial, os plasmídeos que expressam uma parte da sequência de AI462015 foram cada um introduzidos na célula DXB11s que exibiu baixo potencial de produção de anticorpos e uma forte expressão de MAb1 na Figura 6 e, em seguida, expressão forte foi induzida e os potenciais de produção de anticorpo foram comparados.

[000168] Da sequência da transcrição derivada de genoma de camundongo AI462015 (Figura 1; 437 nucleotídeos), as sequências parciais (contendo uma sequência de sonda de AI462015 Affymetrix GeneChip): a sequência entre G no nucleotídeo 4 a partir da extremidade 5' e T na extremidade 3' foi nomeada como APES434 e a sequência entre G no nucleotídeo 4 e C no nucleotídeo 168 a partir da extremidade 5' foi nomeada como APES165. Dois tipos de unidades de expressão foram assim preparados (APES é curto para a Sequência Intensificadora de Produção de Anticorpos). Unidades de expressão adicionadas à sequência Kozak foram sintetizadas para construir pHyg- APES434 (Figura 7) e pHyg- APES165 (Figura 8), cada um dos quais foi expresso a níveis elevados sob um promotor de CMV, e pHyg -nulo (Figura 9).

[000169] Nucleofector, que é um sistema para introdução de gene produzido por Amaxa (actualmente, LONZA), foi utilizado para introduzir os plasmídeos de expressão nas células DXB11s que fortemente expressam MAb1, que eram as cepas produtoras de anticorpos baixos na Figura 6. Depois de selecionar todas as cepas de células que altamente cresceram em uma placa de 96 poços na presença de um meio de seleção contendo higromicina (200 μg / ml), elas foram expandidas para placas de 24 poços, e as quantidades de produção de anticorpos foram comparadas. Os números das cepas selecionadas são como se segue : pHyg - APES434 (N = 38), pHyg - APES165 (N = 60) e pHyg nulo (n = 11) e esperava-se a partir destes números de cepa que um efeito positivo fosse ser produzido pela introdução de plasmídeos que expressam fortemente APES. Uma vez que não há crescimento celular observado no 13° dia de uma cultura estática na placa de 24 poços contendo 1 mL de meio de subcultura, foram medidas as quantidades de produção de anticorpos e o número de células. Os valores médios dos valores de produção de anticorpos foram pHyg - APES434 (44.3 mg/L), pHyg - APES165 (41.2 mg/L) e pHyg - nulo (21,9 mg/L), e os números de células (valores médios) foram pHyg - APES434 (9,27 x 105 células / mL), pHyg - APES165 (11,39 x 105 células / ml) e pHyg nulo (7,76 x 105 células / mL). A célula introduzida por pHyg - APES434 e a célula introduzida por pHyg - APES165 foram estatisticamente superiores ao pHyg - nulo como um controle (teste t, P < 0,001, Figura 10).

[000170] Os resultados acima mostram que a forte expressão da sequência de ácido nucleico que compreende a 5' de 165 pb da transcrição AI462015 (por exemplo, APES165, que é a transcrição do DNA da SEQ ID NO: 2, ou APES434, que é o transcrição do DNA de SEQ ID NO: 3) aumentou o potencial de produção de anticorpos das células.

[Exemplo 4] Supressão da expressão de NfkBia em células CHO altamente produtoras de anticorpos

[000171] Como descrito no Exemplo 1, a sequência de AI462015 existe no filamento complementar próximo da região 3' não traduzida (3' 78 pb) do gene NfkBia no genoma do camundongo 12, os 22 nucleotídeos (AAGTACC AAAATAATTACCAAC; SEQ ID NO: 10), contida na sequência AI462015 são uma sequência idêntica à do filamento complementar da região 3' não traduzida (1492-1513) do gene NfkBia humano e são conservadas, independentemente das espécies, tais como camundongo, macaco rhesus, cães e cavalos, e, portanto, é possível que os 22 nucleotídeos causariam interferência de RNA e degradariam NfkBia mRNA, servindo como um microRNA, ou os 21 nucleotídeos (CATATACAACATTTACAAGAA; SEQ ID NO: 15) de C no nucleotídeo 71 a partir da extremidade 5', que correspondem à parte formadora da região de sequência de sonda específica (42 pb)(CATATACAACATTTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG;SEQ ID NO: 16) em uma matriz de oligonucleotídeos AFFYMETRIX (Affymetrix MOUSE430_2) que é capaz de quantificar a expressão AI462015, são a sequência complementar à sequência entre os nucleotídeos 1478 e 1498 de NfkBia mRNA de rato. Em face do exposto, havia a possibilidade de que a molécula de ácido nucleico derivada da sequência AI462015 iria interferir com NfkBia mRNA (interferência de RNA), suprimir a sua expressão e, assim, manter a homeostase CHO das células altamente produtoras de anticorpos (letalidade de camundongos knockout: pós-natal) (Nota: foi encontrado mais tarde que a transcrição de AI462015 corresponde ao filamento complementar de 513 nucleotídeos na região 3' não traduzida do gene de NfkBia de camundongo. Consultar o Exemplo 8 além disso foi confirmado que a sequência entre os nucleotídeos 71 e. 112 (SEQ ID NO: 16) de AI462015, que foi quantificada com um GeneChip de camundongo foi transcrito em células CHO).

[000172] Em relação a estes casos, os presentes inventores tentaram um processo para quantificar o nível de expressão de NfkBia mRNA nas células que expressam altamente AI462015 que tiveram maior potencial para a produção de anticorpos, para confirmar a supressão da expressão de NfkBia mRNA.

[000173] Uma vez que a sequência de NfkBia mRNA em células CHO era desconhecida, sondas (5' ACTTGGTGACTTTGGGTGCT e 5' GCCTCCAAA CACACAGTCAT) (SEQ ID NO:17 e 18, respectivamente) foram projetadas usando sequências conservadas nas regiões de codificação de aminoácido de camundongo e rato (para as duas regiões, 942 nucleotídeos: 314 aminoácidos) para produzir produtos de PCR de 325 pb. Considera-se que os 325 pb submetidos a clonagem de PCR são uma sequência parcial de NfkBia mRNA derivada de células CHO, à luz da homologia de sequência (Figura 11).

[000174] A expressão de NfkBia mRNA não pôde ser quantificada com Matriz de Genoma 430 2,0 de camundongo (Exemplo 1),possivelmente, porque a sequência de sonda corresponde a uma sequência específica de espécies de células CHO. Por outro lado, a comparação dos produtos de de PCR de 325bp mostrou que a expressão de NfkBia mRNA foi reprimida nas células altamente produtoras de anticorpos que exibiram uma expressão aumentada da sequência AI462015 (pistas 3 e 4), em comparação com as células que expressam fortemente o gene que não produziram anticorpo (pistas 1 e 2). Além disso, uma sonda TaqMan definida capaz de quantificar uma sequência parcial de 325 bp foi concebida (Figura 12) e a quantificação foi realizada por RT-PCR. Como resultado, verificou-se que a expressão de NfkBia mRNA nas células altamente produtoras de anticorpos foi suprimida até cerca de 50% do nível nas células que não tinham produzido anticorpos (Figura 13).

[000175] À luz destes resultados, considera-se que a expressão de NfkBia mRNA foi reprimida nas células altamente produtoras de anticorpos e, consequentemente, o potencial para a produção de anticorpos foi aumentado. Nas regiões promotoras / intensificadoras de plasmídeos de expressão utilizados pelos presentes inventores para a expressão de genes de anticorpos, pelo menos, uma pluralidade de sítios de ligação de NFkB, na verdade, existem (Figura 14, os sítios de ligação de NFKBno em promotor de CMV IE2 de camundongo). Estas regiões intensificadoras são essenciais para a expressão elevada de genes de anticorpos. Assim, considera-se que um fator da maior produção de anticorpos é que o NFKB ativado pela supressão da expressão de NfkBia é translocada para o núcleo, seguida pelo aumento da atividade do promotor.

[Exemplo 5] Análise de microRNA aumentado em células CHO altamente produtoras de anticorpos

[000176] Tal como ilustrado pela Figura 15, um Kit de Primeira Síntese de Filamento miRNA Mir-XTM (Clontech) foi usado para analisar o microRNA. As extremidades 3' dos RNAs preparados a partir de células eram as seguintes poli(A)-caudal: uma célula DXB11s altamente produtora de MAb1 (anticorpo anti-IL-6R) e célula altamente produtora de MAb1 (anticorpo anti-IL-6R) e DXB11s fortemente espressando TAUT, ambos os quais tinham estado em subcultura, e uma célula hospedeira DXB11s na qual gene de anticorpo ainda não tinha sido introduzido. Depois disso, um adaptador com um oligo dT na extremidade 3' e uma sequência de iniciador de PCR (iniciador MRQ 3') com as extremidades 5' foram submetidos a condicionamento para sintetizar cDNA de primeiro filamento. qPCR foi realizado utilizando os cDNAs resultantes como modelos, o iniciador MRQ 3' e um iniciador específico de microRNA derivado de sequência APES (iniciador APES 40-61 5' ou iniciador APES 71-91 5'), e, ainda, iniciador U6 snRNA 5' como um controle positivo (30 ciclos de 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 20 s). Os líquidos de reação de PCR obtidos foram purificados e, em seguida, foi realizada eletroforese em gel de agarose a 3%. Tal como ilustrado pela Figura 16, as faixas de tamanho pretendido foram detectadas por PCR usando a iniciador APES 40-61 5' e o iniciador U6 snRNA 5'. Como mostrado pelas pistas 1, 2 e 3, os 22 nucleotídeos de APES (40-61 AAGTACCAAAATAATTACCAAC ; SEQ ID NO: 10) foram expressos em níveis elevados nas células altamente produtoras de MAb1 (anticorpo anti-IL-6R). O nível de expressão de U6 snRNA (pista 4) como um controle positivo foi comparável em todas as células, e a presença de APES 71-91 (CATATACAACATTTACAAGAA; SEQ ID NO: 15) não foi confirmada (dados não mostrados). Com base nestes resultados, considerou-se que a sequência de APES 40-61 (22nucleotídeos) conservada independentemente da espécie contribuiria como um microRNA para a produção de anticorpos superior.

[000177] [Exemplo 6] Exemplo de crescimento elevado resultante de uma forte expressão de APES numa célula hospedeira para a produção de anticorpos

[000178] A partir de uma célula hospedeira para a produção de anticorpos DXB11/TAUT, uma célula altamente produtora de anticorpos (DXB11/TAUT/ MAb1) que produziu 3,9 g/L de MAb1 (anticorpo anti-IL- 6R) no dia 14 de uma cultura de batelada alimentada em frasco de 1L foi obtida. A capacidade do TAUT para manter a taxa de sobrevivência ajudou a produção de 8,1 g/L no dia 31 da cultura, mas era necessário aumentar a densidade mais elevada de células (4,1 x 10E6 células / mL) para alcançar elevada produção no dia 14 da cultura, considerando-se a produção real. Se a expressão de supressão de NfkBia mRNA resultante da forte expressão de APES (Exemplo 4), promove a ativação de NFkB, a expressão do gene relacionado com crescimento poderia ser aumentada, e portanto, a densidade de células mais elevada seria, possivelmente, aumentada. Um plasmídeo para coexpressão de APES e um plasmídeo para coexpressão de ALT1 que contribuíram para a produção de anticorpos mais elevado, como é o caso com APES (pPur- APES165, pPur-ALT1, respectivamente; Figura 17) foram cada um introduzidos na referida célula altamente produtora de anticorpo DXB11/TAUT/ MAb1 (cepa progenitora). Os três principais filamentos mais altamente crescidos para cada um dos dois tipos foram selecionados e submetidos a uma cultura de batelada alimentada por agitador. Como resultado, o valor médio da densidade de células foi maior (11,5 ± 1,7) x 10e6 células/ml, para a célula que expressa fortemente APES165, mostrando que muito mais do que o crescimento celular de células que expressam fortemente ALT1 ((8,9 ± 1,8) x 10e6 células / mL) foi obtido. Além disso, os valores médios das quantidades de produção de anticorpos no dia 14 da cultura de batelada alimentada por agitador foram de 4,4 ± 0,6 g/L para a célula que expressa fortemente APES e 4,0 ± 0,6 g/L para a célula expressando fortemente ALT1, que foram superiores a 3,4 g/L para a célula DXB11/TAUT/MAb1 na qual um plasmídeo ainda não tinha sido introduzido. Este resultado mostra que o efeito de que expressa fortemente APES foi produzido positivamente independentemente do efeito que expressa fortemente TAUT (Figura 18). O efeito positivo resultante da forte expressão de APES foi marcadamente observado em uma cultura alimentada em bateladas de 1L-frasco. A comparação das células altamente crescidas na cultura de batelada alimentada por agitador revelou o maior crescimento da cepa que expressa fortemente APES, que mostrou a sua vantagem de maior produtibilidade em uma cultura de curto prazo, com o valor de 5,3 g/L no dia 12 dia da cultura, em comparação com 3,2 g/L para a cepa progenitora e 4,4 g/L para a cepa fortemente expressando ALT1 (Figura 19). Com base nos resultados acima, os presentes inventores decidiram modificar a célula hospedeira para a produção de anticorpos DXB11/TAUT em uma célula hospedeira que apresenta um crescimento mais elevado, e preparou uma célula hospedeira que fortemente expressa APES165 DXB11/TAUT/APES. Introdução do gene foi realizada através da introdução de pPur - APES165 no hospedeiro DXB11/TAUT por meio de eletroporação. Para as nove cepas hospedeiras candidatas que eram boas, em ambas a taxa de sobrevivência e de crescimento após a seleção de fármacos, os seus níveis de APES snRNA (RNA não codificante pequeno) na subcultura de expressão foram quantificados. A cepa hospedeira candidata DXB11/ TAUT/APES que expressou APES a um nível elevado teve uma alta densidade celular viável durante a cultura e mostrou uma correlação (R2 = 0,70) (Figura 20).

[000179] [Exemplo 7] Exemplo 2 de produção elevada resultante da forte expressão de APES em células produtoras de anticorpos

[000180] Como é o caso com o Exemplo 3, os plasmídeos que expressam sequências 5' parciais de extremidade da transcrição de AI462015 foram introduzidos em células DXB11s que expressam fortemente MAb1, e os seus potenciais de produção de anticorpo foram comparados.

[000181] Além de APES4 -168 (APES165), unidades de expressão de APES4 -68 (SEQ ID NO: 5) e APES69 -133 (SEQ ID NO: 6), cada uma das quais consistiram em uma sequência parcial de APES4 -168, foram preparadas para estudar os potenciais de produção de anticorpo das células. Comparado com forte expressão de vetor nulo (nulo), APES4- 68 e APES69-133 apresentaram produção de anticorpos elevada com diferenças significativas de p < 0,05 e p <0,01, respectivamente (teste t, P <0,001, Figura 21).

[000182] A figura 22 mostra quais regiões as respectivas sequências parciais tendo atividade APES que foram identificadas nos Exemplos 3 e 7 correspondem a na transcrição de AI462015 de camundongo. As sequências parciais que exibem atividade APES compreendem pelo menos 23 nucleotídeos da sequência complementar NfkBia.

[Exemplo 8] Análise de gene relacionado com APES

[000183] Com base na informação genética no momento da apresentação deste pedido, indica-se no Exemplo 1 que "AI462015 é um RNA não codificante do tipo mRNA de 437 nucleotídeos e a sua sequência existe no filamento complementar próximo da região 3' não traduzida (56590831- 56590397) do gene NfkBia no genoma do camundongo 12". No entanto, a atualização de informação subsequente pelo GeneBank revelou que os 437 nucleotídeos, que são a transcrição de AI462015, correspondendo ao filamento complementar da região 3' não traduzida (513 nucleotídeos) do gene NfkBia de camundongo (Figura 23). Como mostrado na Figura 24, existe sequência homóloga AI462015 no genoma de células CHO-K1 que foi publicado após o depósito deste pedido (SEQ ID NO: 25: AI462015, ID SEQ NOs: 26-27: genoma CHO-K1). Além disso, a supressão da expressão foi observada em células CHO altamente produtoras de anticorpos NfkBia (Exemplo 4). Assim, é concebível que sequência homóloga AI462015 seja expressa a um nível elevado em células CHO e funções nas mesmas. [000184] A presente invenção pode ser aplicada a todas as células produtoras de um polipeptídeo recombinante, tal como um anticorpo. [000185] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Claims (8)

1.Método de produção de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula na qual um DNA exógeno que codifica um anticorpo desejado foi introduzido, produzindo assim o anticorpo desejado, em que a célula expressa uma sequência intensificadora da produção de anticorpos (APES) que foi artificialmente introduzida na célula e em que a APES é uma molécula de ácido nucleico consistindo em uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, 3, 5 ou 6.

2.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula na qual a APES foi artificialmente introduzida é uma célula transfectada com a APES.

3.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula na qual a APES foi artificialmente introduzida é uma célula na qual a transcrição de APES endógena foi ativada.

4.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um DNA que codifica um transportador de taurina foi ainda introduzido na célula.

5.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um DNA que codifica ácido sulfínico de cisteína descarboxilase foi ainda introduzido na célula.

6.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um DNA que codifica alanina transferase foi ainda introduzido na célula.

7.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de ovário de hamster chinês.

8.Método de produção de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de produção de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e formulação do referido anticorpo em uma composição farmacêutica.

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