CN103459608A

CN103459608A - 重组多肽的制造方法

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Publication number: CN103459608A
Application number: CN2012800155942A
Authority: CN
Inventors: 田渊久大; 杉山朋也
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-03-30
Also published as: JP2018161146A; CN103459608B; MX2013011355A; EP2695947B1; AU2012239382B2; CN106995831A; KR101958033B1; BR112013024781A2; SG194014A1; MX352229B; CA2830013A1; JP6626160B2; CA2830013C; US20210246193A1; TWI647309B; CN108546295A; RU2013148804A; TW201303019A; AU2012239382A1; US11028149B2

Abstract

本发明提供可使用动物培养细胞以高生产量制造蛋白质的方法，其包括培养表达APES（抗体产生增强序列），并且导入编码希望得到的多肽的DNA的细胞，产生希望得到的多肽。APES含与NfkBia关联的碱基序列，有降低细胞内的NfkBia的表达的功能。

Description

重组多肽的制造方法

【技术领域】

本发明涉及重组多肽的制造方法，更具体而言，使用核因子κB抑制物α（NfkBia）的表达降低的动物细胞有效制造多肽的方法。

【背景技术】

使用基因重组技术，生产作为医药有用的蛋白质之时，使用动物细胞，则由于原核细胞无法进行的复杂的翻译后修饰或折叠变得可能，动物细胞多用作用于重组蛋白质生产的宿主细胞。

近年、抗体或生理活性蛋白质等的多种生物药品辈出，在动物细胞中有效生产重组蛋白质的技术关系到生物药品的低成本化，从而约束向患者的稳定的供给。

从而，期望生产效率更高的蛋白质的制造方法。

NfkBia（IKBα、核因子κB抑制物α）是B-细胞抑制物中κ多肽基因增强子的核因子，α的简称，与作为涉及细胞内的信号传递的转录因子的NF-κB的活化相关。NfkBia是NF-κB的失活因子之一。新生物合成的NfkBia通过在核内诱导表达，负调节NF-κB的DNA结合和转录活性（非专利文献1）。另外，如NfkBia一样抑制细胞增殖的一部分的基因表达在几乎全部的小鼠或人肿瘤细胞中被抑制（非专利文献2）。NF-κB通常与如NfkBia一样的失活因子结合着存在，但由各种刺激从失活因子游离活化，迁移到核内，与在细胞因子、生长因子、粘接分子、细胞死亡控制因子其他各种各样的目标基因的启动子/增强子区域的特异性DNA序列（5’-GGGACTTTCC-3’、称为NFκB结合序列、kB基序、NFkB应答元件等（SEQ ID NO:35））结合，与转录活性的调节相关（非专利文献3）。

另一方面，作为在动物培养细胞内的NfkBia的行为，不知与重组蛋白质的产生能力的关系。

【现有技术文献】

【非专利文献】

非专利文献1:Inducible nuclear expression of newly synthesizedI kappa B alpha negatively regulates DNA-binding andtranscriptional activities of NF-kappa BMol.Cell.Biol.,051995,2689-2696,Vol15,No.5

非专利文献2:From mice to humans:Identification of commonlyderegulated genes in mammary cancer via comparative SAGE studiesHu Y.,Sun H.,Drake J.,Kittrell F.,Abba M.C.,Deng L.,Gaddis S.,Sahin A.,Baggerly K.,Medina D.and Aldaz C.M.Cancer Research200464:21(7748-7755)

非专利文献3:″New insights into the Role of Nuclear Factor-kappa B in Cell Growth Regulation″American Journal of Pathology,2001,Vol.159,No.2:387-397

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明旨在提供能以高的生产量制造天然型蛋白质或重组蛋白质的方法。

【解决课题的技术方案】

本发明人为了解决上述课题进行锐意努力，以有高的产生重组抗体的能力的培养细胞株（CHO细胞株）作为材料，对于在所述细胞株中表达显著的基因进行检查的结果，鉴定一种mRNA型非编码RNA，其通过使用特定的小鼠序列作为探针而被识别。此转录产物相当于NfkBia的mRNA的非翻译区域的互补链。又发现，通过在重组培养细胞中表达由此转录产物中的一部分的序列组成的核酸分子，显著地升高所述培养细胞的重组多肽的产生能力。另外，本发明人发现，在所述非编码RNA的表达上调的高产生抗体的细胞中NfkBia的表达被抑制。再者，本发明人发现，有高的重组抗体产生能力的培养细胞在细胞内NfkBia的表达被抑制。从而认为，通过高表达控制培养细胞内的NfkBia的表达的转录产物，可增加希望得到的多肽的生产量，从而完成本发明。

在本说明书中，将这样的通过在培养细胞内表达量增加，有升高重组抗体等的蛋白质的产生能力的功能的RNA或DNA或它们的序列总称而命名为APES（抗体产生增强序列）（根据情况，称为PPES（多肽产生增强序列））。

本发明人推定，APES（或者PPES）通过控制培养细胞内的NfkBia的表达，增强Nf-κB的活性，由此升高重组多肽产生能力。推定活性增强的NF-κB迁移到核内，使免疫、炎症、抗凋亡关联基因（Bcl-2,Bcl-xL，IAPs（凋亡蛋白抑制物）等）的表达亢进，恭献于细胞的增殖或生存率维持等。

还有，在通常的抗体等的重组蛋白质或肽的表达基因的用质粒的启动子/增强子区域存在多个的NF-κB结合序列推定，迁移到核内的NF-κB增强表达质粒的启动子活性，恭献于进一步的抗体的高产生化。这样的序列是，例如，在MCMV启动子的情况，小鼠巨细胞病毒来源序列（DD434486）中存在8个位置、人巨细胞病毒来源序列（DI097553）中存在3个位置的NF-κB结合序列。

本发明的要旨如下。

（1）多肽的制造方法，其包括培养表达APES、并且导入编码希望得到的多肽的DNA的细胞，以及产生希望得到的多肽。

（1-1）（1）的方法，其中细胞是强表达APES的细胞。

（2）（1）的方法，其中APES是含通过碱基对形成结合于人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的NfkBia的基因的DNA或mRNA，可抑制NfkBia的基因的表达的碱基序列的核酸分子。

（3）（2）的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的至30碱基长的低分子RNA。

（4-1）（2）的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的至561碱基长的mRNA型非编码RNA。

（4）（2）的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的至500碱基长的mRNA型非编码RNA。

（5-1）（2）的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的561～1579碱基长的mRNA型非编码RNA。

（5）（2）的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的500～1000碱基长的mRNA型非编码RNA。

（6）（3）～（5）之任一项的方法，其中19～25碱基长的连续的序列是SEQ ID NO:2所示的碱基序列中任一个的部分序列。

(7-1）（6）的方法，其中APES选自含以下的碱基序列的核酸分子：

（a）由SEQ ID NO:1～16及29之任一个的碱基序列组成的DNA；

（b）含上述（a）的序列，是NfkBia基因的3’侧非翻译区域的部分序列的DNA；

（c）由与上述（a）或（b）的序列除1个或数个碱基外相同的碱基序列组成的DNA；

（d）是上述（a）、（b）或（c）的转录产物的RNA；

（e）由可通过碱基对形成结合于上述（a）的序列的序列组成的DNA或RNA。

（7）（6）的方法，其中APES选自含以下的碱基序列的核酸分子：

（a）由SEQ ID NO:4～16的碱基序列组成的DNA

（b）是上述（a）的转录产物的RNA

（c）由与上述（a）的序列除1个碱基相同的碱基序列组成的DNA

（d）是上述（c）的转录产物的RNA

（8）（1）的方法，其中向细胞导入编码希望得到的多肽的外来的DNA，并且人为地导入APES。

（9）（8）的方法，其中人为地导入APES的细胞是转染APES的细胞。

（10）（8）的方法，其中人为地导入APES的细胞是内源性APES的转录活化的细胞。

（11）（8）的方法，其中向细胞再导入编码牛磺酸转运蛋白的DNA。

（12）（8）的方法，其中向细胞再导入编码半胱氨酸亚磺酸脱羧酶的DNA。

（13）（8）的方法，其中向细胞再导入编码丙氨酸转移酶的DNA。

（14）（1）的方法，其中多肽是抗体。

（15）（1）的方法，其中细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

（16）制造含有用上述之任一项所述的方法制造的多肽的药品的方法。

（17）含以下的碱基序列，有APES活性的核酸分子（APES或PPES）（但是除SEQ ID NO:1的核酸分子之外）：

（a）由SEQ ID NO:2～16及29之任一个的碱基序列组成的DNA；

（c）由与SEQ ID NO:1～16及29或（b）的序列除1个或数个碱基外相同的碱基序列组成的DNA；

（d）是上述（a）、（b）或（b）的转录产物的RNA；

（18）含上述（17）所述的核酸分子的载体。

（19）人为地导入上述（17）所述的核酸分子或（18）所述的载体的细胞。

【发明效果】

由本发明可有效生产重组蛋白质。

【附图说明】

【图1】示鉴定的AI462015转录产物的在序列及小鼠基因组的位置。

【图2】示在CHO-DG44细胞中高表达Mab1（抗IL-6受体抗体）的产生抗体的细胞的在继代培养第3天的AI462015转录产物的表达强度。

【图3】示在CHO-DXB11s细胞中高表达Mab2（抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体）的产生抗体的细胞的在继代培养第3天的AI462015转录产物的表达强度。

【图4】示Mab2（抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体）产生细胞的在1L罐流加培养第3天的AI462015转录产物的表达强度。

【图5】示产生Mab2的细胞的在1L罐的流加培养后期第13天的AI462015转录产物的表达强度的上调。

【图6】示Mab1（抗IL-6受体抗体）产生潜力低的细胞的在1L罐流加培养第3天的AI462015转录产物的表达强度。

【图7】是转录产物AI462015（437p）之一部分序列434bp的表达质粒。

【图8】是转录产物AI462015（437p）之一部分序列165bp的表达质粒。

【图9】是作为对照仅表达潮霉素抗性基因的质粒。

【图10】示由转录产物AI462015（437p）之一部分序列的强表达产生Mab1的量增加。

【图11】示在高产生抗体的细胞的转录产物AI462015的强表达和表达NfkBia的抑制。

【图12】示表达NfkBia的定量中使用的探针组。

【图13】示在高产生抗体的细胞的表达NfkBia的抑制的定量结果。

【图14】示小鼠MCMV IE2启动子上（SEQ ID NO:23）的8个的NfkB结合部位（加下划线部）。

【图15】是microRNA表达的解析法的概略。

【图16】示在高产生抗体的细胞高表达的microRNA来源的PCR产物。

【图17】是在表达pHyg-TAUT的细胞中共表达转录产物AI642048（437p）之一部分序列165bp的质粒pPur-APES165及共表达ALT1的pPur-ALT1。

【图18】是示由APES强表达的细胞高增殖、高产生抗体的效果的摇床流加培养的结果。

【图19】是示由APES强表达的细胞高增殖、高产生抗体的效果的L-Jar流加培养的结果。

【图20】示强表达APES165的宿主候选细胞（9株）的APES表达量与活细胞密度的相关。

【图21】示由转录产物AI462015（437p）之一部分序列APES165的更部分序列的强表达产生Mab1的量增加。

【图22】示在图21有高产生抗体的效果的APES165的再部分序列含Nfkbia互补序列。

【图23】示AI462015是小鼠Nfkbia mRNA的互补链。（实施例8）

【图24】示AI462015的相同序列在CHO-K1细胞基因组中存在。（实施例8）

【图25a】示AI462015之一部分序列（自5′末端第7～91）跨种而保守。

【图25b】示AI462015之一部分序列（自5′末端第7～91）跨种而保守。

【图25c】示AI462015之一部分序列（自5′末端第7～91）跨种而保守。

【图25d】示AI462015之一部分序列（自5′末端第7～91）跨种而保守。

【图25e】示AI462015之一部分序列（自5′末端第7～91）跨种而保守。

【实施方式】

以下，对于本发明的实施方式进行更详细地说明。

（1）APES(抗体产生增强序列）

本发明提供包括培养表达APES、并且导入编码希望得到的多肽的DNA的细胞，以及产生希望得到的多肽的，多肽的制造方法。

如在后述的实施例中详细地说明，本发明人发现，在培养CHO细胞与产生抗体的能相关而表达量升高的mRNA型非编码RNA，鉴定为小鼠基因组中的437碱基（图1、GenBank登录ID:AI462015、SEQ ID NO:1）的转录产物。在AI462015的序列及小鼠基因组上的位置示于图1。AI462015的序列在小鼠基因组中NfkBia（核因子κB抑制物α）mRNA3’侧的非翻译区域近傍的互补链上存在。（注释：由其后的GeneBank的信息更新明晰，作为AI462015的转录产物的437碱基相当于小鼠NfkBia mRNA3’侧非翻译区域（513碱基）的互补链。（图23））

再者，本发明人发现，通过将有AI462015来源的一部分的序列的核酸分子导入宿主细胞表达，可增加希望得到的多肽的生产量。

本发明人推定，这些的核酸分子通过控制培养细胞内的NfkBia的表达，增强Nf-κB的活性，由此升高重组多肽产生能力。具体而言推定，活性增强的NF-κB迁移到核内，亢进免疫、炎症、抗凋亡关联基因（Bcl-2,Bcl-xL，IAPs（凋亡蛋白抑制物）等）的表达，恭献于细胞的增殖或生存率维持等。

从而本发明人将有通过在培养细胞内表达，或通过表达量增加，控制培养细胞内的NfkBia的表达，由此增强Nf-κB的活性，升高重组抗体等的希望得到的重组多肽的产生能力的功能，优选不编码蛋白质的，RNA或DNA或它们的序列总称而命名为APES（抗体产生增强序列）（根据情况，也称为PPES（多肽产生增强序列））。

上述的AI462015来源的序列或其一部分的序列被认为是，不仅在小鼠、仓鼠等的啮齿类，在人中也保守，在其他哺乳动物或鱼类、昆虫等的动物中保守性高的序列。从而，对应于AI462015来源的序列或其一部分的序列的各种动物细胞的来源的NfkBia mRNA3’侧非翻译区域的部分序列或其互补序列也可作为本发明的APES的序列使用。

在一实施方式中，APES在序列之一部分含Nfkbia互补序列，或者是Nfkbia互补序列，由此在表达APES的细胞中Nfkbia表达被抑制，所以此抑制效果促进抗体等的高产生功能。

在一实施方式中，APES是对NfkBia mRNA进行RNA干涉的核酸分子，有在细胞内与NfkBia的mRNA结合而负控制表达的功能，通过在细胞内其表达量增加，抑制NfkBia的功能表达而增加抗体基因表达量、进一步高产生抗体等的重组多肽。

从而，APES可为含可通过碱基对形成结合于NfkBia的基因DNA或mRNA的序列的，作为双链RNA（dsRNA）、或者短的dsRNA的siRNA、或者解离为单链的siRNA、或者shRNA、反义DNA或RNA、microRNA（miRNA）或mRNA型非编码RNA。

例如，作为APES的序列可为由含与作为靶标的NfkBia mRNA互补的一部分序列的序列组成的寡核苷酸。作为那样的寡核苷酸的例，可举出相当于NfkBia mRNA互补链的19～25碱基的序列、或者具有与所述序列除一碱基外相同序列，并且有抑制NfkBia的表达的效果的miRNA。或者，APES是长链的mRNA型非编码RNA也可，例如可为由含可通过碱基对形成结合于NfkBia的基因DNA或mRNA的序列的至长度561核苷酸长（561mer）或500核苷酸长（500mer）的序列组成，并且有抑制NfkBia的表达的效果。或者，APES是更长链（数百～数十万核苷酸）的mRNA型非编码RNA也可。例如，APES可为200-10万核苷酸长、或者，300～30万核苷酸长的核酸分子或序列。

可通过碱基对形成结合的序列是指，不限于完全地对合（即100%互补的），在不对功能造成障碍的范围内也容许不对合碱基的存在。或者，根据APES的形态，部分互补性或许优选的。从而，例如，与含NfkBia的非翻译区域的基因DNA或mRNA至少70%、更优选为80%、再优选为90%、最优选是95%相同的序列或其互补序列也包括在“可通过碱基对形成结合的序列”内。例如，在对于561mer或500mer的mRNA型非编码RNA至少90%相同的序列包含是含由碱基的插入、缺失、或者点突变的1～50个（或者561mer的情况是1～56个）的错配碱基的变异序列，伴随在其宿主细胞中的表达，抗体等的重组多肽的产生能力增大，或者，有抑制NfkBia的表达的功能。从而，例如有如70%以上的相同性一样的，某程度的序列相似性，与宿主细胞不同的生物种来源的NfkBia直系同原物（异种间相同基因)来源的序列也能作为APES利用。

或者，可通过碱基对形成结合的序列包含可在如细胞内一样的条件下与NfkBia的mRNA结合的序列。那样的序列含，例如，在作为高度严格的条件而本领域技术人员公知的条件下杂交，并且有希望得到的功能的序列。高度严格的条件之一例是，将多核苷酸和其他多核苷酸在含6×SSPE或SSC、50%甲酰胺、5×Denhardt试剂、0.5%SDS、100μg/ml的片段化的变性鲑鱼精子DNA的杂交缓冲液中，于42℃的杂交温度温育12～16小时（其中一方的多核苷酸附着于如膜一样的固体表面也可），继而，使用含1×SSC、0.5%SDS的清洗缓冲液于42℃以上的最适温度清洗数次。对于其他具体性的条件，可参照Sambrook等“Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版”Cold SpringHarbor Laboratory Pr；及，Ausubel等“分子生物学实验流程”丸善等多数的本领域技术人员公知的实验手册。

有作为APES的活性的新颖的核酸分子或有与其互补的序列的核酸分子是本发明的重要的特征。

在一实施方式中，APES是有NfkBia的表达抑制或重组多肽的产生增大功能的核酸分子，是可通过碱基对形成结合于人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的NfkBia的基因的DNA或mRNA的RNA或DNA。认为那样的核酸分子含与编码NfkBia的mRNA相同或互补的序列，可结合于NfkBia基因或mRNA抑制其表达。

在一实施方式中，APES是，含与NfkBia的mRNA之一部分互补的序列的19～25碱基长的低分子RNA、或者具有与所述序列除一碱基外相同的序列，有NfkBia的表达抑制或重组多肽的产生增大功能的低分子RNA。其中，低分子RNA是指小非编码RNA（snRNA），在snRNA中包括miRNA。

在一实施方式中，APES是含与NfkBia的mRNA之一部分互补的序列（例如，上述的低分子非编码RNA序列）的至561碱基长，或者至500碱基长的mRNA型非编码RNA。

在一实施方式中，APES是含与NfkBia的mRNA之一部分互补的序列（例如，上述的低分子非编码RNA序列）的，561～1579碱基长、或者500～1000碱基长的mRNA型非编码RNA。

在CHO细胞转录产物中发现的，APES之一的具体例有在小鼠AI462015来源之一部分的序列、或者那样的部分序列中1～数个的碱基被取代、缺损或附加的序列。特别是，可举出含由5’侧第4的G～第168的C的碱基序列组成的165碱基的DNA序列（SEQ ID NO:2、APES165）、或者其互补（反义）DNA序列或由这些的DNA转录的RNA序列的序列、或者此序列中之任意的长度的部分序列。或者，可举出含由5’侧第4的G～3’末端的T的碱基序列组成的434碱基的DNA序列（SEQ ID NO:3、APES434）、或者其互补（反义）DNA序列或由这些的DNA转录的RNA序列的序列、或者来源于此序列的任意的长度的部分序列。在含对应于小鼠AI462015的序列的人、仓鼠、大鼠等的哺乳类来源的序列的序列或它们的部分序列、或者那样的部分序列中含1～数个的碱基被取代、缺损或附加的碱基序列。

在一实施方式中，APES有AI462015中的5’侧第4～第133碱基序列（SEQ ID NO:4、APES130）或此序列来源之一部分的序列。例如，可举出5’侧第4～第68（SEQ ID NO:5、APES4-68）、或者第69～第133（SEQ ID NO:6、APES69-133）的DNA序列或其互补DNA序列或从这些的DNA转录的序列。

在一实施方式中，APES有AI462015中的5’侧第40～第9152碱基（SEQ ID NO:7）的序列、或者该52碱基在任意的位置被切断之一部分序列来源的序列。例如，可举出前半部分（APES40-68的29碱基、或者APES40-63的24碱基、或者APES40-61的22碱基）或后半部分（APES69-91的23碱基）的DNA序列或其互补DNA序列（各自相当于SEQ ID NO:8～11）或从这些的DNA转录的序列。

上述的52碱基是除一碱基外与大鼠NfkBia基因的3’侧非翻译区域的互补链相同的序列。另外，其5’侧的24碱基（APES40-63、SEQID NO:9）是与人NfkBia基因的3’侧非翻译区域相同的序列。另外，5’侧的22碱基（APES40-61、SEQ ID NO:10：AAGTACCAAAATAATTACCAAC）是与跨大鼠、恒河猴、狗、马等种的NfkBia mRNA的3’侧非翻译区域的互补链相同的序列。将与NfkBia基因的3’侧非翻译区域互补的一部分的序列在宿主细胞中表达而期待RNAi效果。例如，有与上述52碱基中的19～25碱基互补的序列的RNA有通过作为microRNA（miRNA）作用于NfkBia的mRNA的非翻译区域，翻译被抑制的可能性。

或者，APES有AI462015中的5’侧第7～第9185碱基（SEQ ID NO:29）的序列、或者该85碱基在任意的位置被切断之一部分序列来源的序列。有与上述85碱基中的19～25碱基互补的序列的RNA有通过作为microRNA（miRNA）作用于NfkBia的mRNA的非翻译区域，翻译被抑制的可能性。

在一实施方式中，APES有用21碱基的siRNA检索发现的序列。例如是含与AI462015中的第84～第104（SEQ ID NO:12、APES84-104）、第99～第119（SEQ ID NO:13、APES99-119）、第101～第121（SEQ ID NO:14、APES101-121）的DNA序列互补的序列的miRNA序列。在基因芯片上定量上述的APES69-133中的第71～第112序列（SEQ ID NO:16），其实际上是高表达的区域，所以认为APES84-104作为miRNA发挥功能的可能性高。

另外，基于APES的结构的或功能性特征，能新化学合成或从生物源单离有作为APES的活性的核酸分子。APES的结构的特征是含与作为靶标的NfkBia mRNA之一部分互补的序列的核酸分子。核酸分子的形态是何形态均可，是DNA、DNA的转录产物、mRNA、cDNA，或是外来体RNA，或是化学合成单链RNA，或是化学合成双链RNA等均可。功能的特征是，伴随在其宿主细胞中的表达，抗体等的重组多肽的产生能力增大，或者，NfkBia的表达被抑制。

在从生物源单离APES时，何生物来源均可，不特别限定。具体而言，可举出人、黑猩猩等的灵长类、小鼠、大鼠、仓鼠等的啮齿类、牛、猪、山羊、等的家畜类、鸡等的鸟类、斑马鱼等的鱼类、苍蝇等的昆虫类、线虫类等的动物来源的APES，优选人、啮齿类或与宿主细胞相同的种来源的APES，例如，在使强表达APES细胞是中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）时，人、小鼠或仓鼠来源的APES是优选的。

这样的核酸分子可由本领域技术人员公知的方法制备。例如，由高产生抗体等的重组多肽的培养细胞制备全RNA，基于本发明的核酸序列（例如，SEQ ID NO:2的APES165）合成寡核苷酸，将其作为引物使用进行PCR反应，通过扩增有作为APES的特征的cDNA制备即可。另外，由高产生抗体等的重组多肽的培养细胞制备低分子RNA后，制备cDNA库，基于克隆的cDNA的碱基序列，可得到含与NfkBia mRNA互补的部分序列的低分子RNA。cDNA库也能在制备microRNA（miRNA）等的低分子RNA后，由例如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）所述的方法构建。

另外，通过确定得到的cDNA的碱基序列，通过将得到的cDNA作为探针筛选基因组DNA库，可单离APES表达的基因组DNA。

具体而言，如以下一样即可。首先，从有表达本发明的APES的可能性的细胞、组织等，单离全RNA。mRNA的单离由公知的方法、例如，胍超离心法（Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry（1979）18,5294-5299）、AGPC法（Chomczynski，P.及Sacchi，N.，Anal.Biochem.（1987）162,156-159）等制备全RNA之后，使用RNeasy MiniKit（QIAGEN）等再纯化全RNA。

从得到的全RNA使用逆转录酶合成cDNA。cDNA的合成也可使用SuperScript^TM II逆转录酶（Invitrogen）等进行。另外，使用引物等，根据使用5′-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech制）及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction；PCR）的5′-RACE法（Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（1988）85,8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.（1989）17,2919-2932），可进行cDNA的合成及扩增。

从得到的PCR产物制备作为目的的DNA片段，与载体DNA连结。再者，由此制备重组载体，导入到大肠杆菌等而选择集落制备希望得到的重组载体。作为目的的DNA的碱基序列可由公知的方法、例如，二脱氧核苷酸链终止法确认。

另外，得到的DNA可由市售的试剂盒或公知的方法改变。作为改变，可举出例如，由定点诱变法的一碱基变异导入等。如此改变的序列，只要是有APES活性，也包括在本发明的范围内。

在本说明书中，“有APES活性的”是指，通过抑制培养的宿主细胞内的NfkBia的表达，活化Nf-κB，由此有升高重组多肽产生能力的作用。另外，一般而言是指，通过在细胞内表达有抑制NfkBia的表达的功能。

在本说明书中，有APES活性的核酸分子有时称为本发明的核酸分子。

（2）APES的表达

在本发明中发现，通过使用表达APES的细胞、优选为APES强表达的细胞，增加由所述细胞的多肽的产生量。

强表达APES是指，由载体等将APES人为地导入细胞的细胞、或者相比抗体基因导入前的原本的细胞而APES的表达量增加。原本的细胞不特别限定，可举出例如制造CHO细胞等重组蛋白质之时作为宿主使用的细胞。作为具体例，根据后述的实施例说明，在使用AFFYMETRIX公司的寡核苷酸阵列（Affymetrix MOUSE430_2）的基因芯片实验中，抗体基因导入前的原本的细胞是AI462015的信号值是2000以下的，与此比较APES的表达量增加是指，例如，AI462015的信号值到2倍以上。

强表达APES的细胞是在细胞内含内源性或外来的APES。作为强表达APES的细胞，可举出例如，人为地导入APES的细胞。

人为地导入APES的细胞由本领域技术人员公知的方法制备是可能的，例如，通过将编码APES的DNA序列整合入载体，将该载体转化进细胞来制备是可能的。

再者，在本说明书中，由基因活化技术（参照例如，国际公开第WO94/12650号单行本）内源性APES被活化，结果，APES强表达的细胞也包括人为地导入APES的细胞。

内源性APES的典型例是作为在宿主细胞的基因组上编码的DNA序列的APES。另外，在本发明中也能利用，不由基因活化技术，抗体基因导入后因何种要因而内源性APES的转录活化，强表达的细胞。

插入编码APES的DNA序列的载体也在本发明的范围内。本发明的载体对于在宿主细胞内或细胞外的本发明的核酸分子的保持，或表达本发明的核酸分子有用。另外，对于在宿主细胞中强表达APES有用。通过在宿主细胞中强表达APES，可增加由宿主细胞的希望得到的多肽的生产量。

作为载体，例如在将大肠杆菌作为宿主时，为了将载体在大肠杆菌（例如，JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）等大量地扩增而大量制备，具有用于用大肠杆菌扩增的“ori”，再有转化的大肠杆菌的挑选基因（例如，可由任何的药剂（氨苄西林或四环素、卡那霉素、氯霉素）判别的药剂抗性基因）是优选的。作为载体的例，可举出M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，以cDNA的亚克隆、切出作为目的时，上述载体之外，可举出例如，pGEM-T、pDIRECT、pT7等。

（3）表达载体

在本发明中，在以APES的强表达、及/或，生产多肽的目的使用载体时，特别是，表达载体是有用的。作为能在本发明中使用的表达载体，可举出例如，哺乳动物来源的表达载体（例如，pcDNA3(Invitrogen公司制）或，pEGF-BOS（Nucleic Acids.Res.1990，18（17）,p5322）、pEF、pCDM8）、昆虫细胞来源的表达载体（例如“Bac-to-BAC表达杆状病毒的系统统”（GIBCO BRL公司制）、pBacPAK8）、植物来源的表达载体（例如pMH1、pMH2）、动物病毒来源的表达载体（例如，pHSV、pMV、pAdexLcw）、逆病毒来源的表达载体（例如，pZIpneo）、酵母来源的表达载体（例如，“PichiaExpression Kit”（Invitrogen公司制）、pNV11、SP-Q01）、枯草芽孢杆菌来源的表达载体（例如，pPL608、pKTH50）等。

用于表达外来的多肽的表达载体含能推进编码该多肽的DNA及所述DNA的表达的表达控制序列。同样地，用于表达APES的表达载体含能推进编码APES的DNA及所述DNA的表达的表达控制序列。单一的载体构建成表达多肽及APES的两方也可。使用基因活化技术，例如将作为宿主基因组之一部分的APES或多肽基因活化时，导入有促进那样的宿主细胞来源的DNA的表达的表达控制序列也可。

作为表达控制序列的例，有含适当的启动子、增强子、转录终止子、编码蛋白质的基因中的起始密码子（即ATG）的Kozak序列、用于内含子的剪接信号、聚乙酰化部位、及终止密码子等，载体的构建可由本领域技术人员适宜进行。

表达控制序列含能在使用的动物细胞中增大基因的转录量的启动子/增强子区域是优选的。与编码希望得到的多肽的基因的表达相关的启动子/增强子区域含NF-κB结合序列也可。

在将CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等的在哺乳动物细胞的表达作为目的时，具有用于在细胞内表达而言必要的启动子、例如SV40启动子（Mulligan等，Nature（1979）277，108）、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子（Mizushima等，Nucleic Acids Res.（1990）18，5322）、CMV启动子等是优选的。另外，有用于挑选向细胞的转化的基因（例如，可由药剂（新霉素、G418等）判别的药剂抗性基因）是再优选的。作为有这样的特性的载体，可举出例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

再者，在以稳定地表达基因，并且，在细胞内的基因的拷贝数的扩增作为目的时，可举出向缺损核酸合成途径的CHO细胞导入有与其互补的DHFR基因的载体（例如，pCHOI等），由甲氨蝶呤（MTX）扩增的方法，另外，在以基因的临时的表达作为目的时，可举出使用在染色体上具有表达SV40T抗原的基因的COS细胞用具有SV40的复制起点的载体（pcD等）转化的方法。作为复制起始点，另外，使用多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒（BPV）等的来源的也可。再者，为了在宿主细胞株中基因拷贝数扩增，表达载体，作为选择标志物，可含氨基糖苷转移酶（APH）基因、胸腺嘧啶激酶（TK）基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（Ecogpt）基因、二氢叶酸还原酶（dhfr）基因等。

（4）宿主细胞

在本发明中使用的细胞是可产生希望得到的多肽的天然的细胞也可，是导入编码希望得到的多肽的DNA的细胞也可，导入编码希望得到的多肽的DNA的转化细胞是优选的。

导入编码希望得到的多肽的DNA的转化细胞之一例是，转染有含至少编码希望得到的多肽的DNA的表达载体，再强表达内源性或外来的APES的宿主细胞。

再者，在本发明中，导入“DNA（或者基因）的”细胞包含转染了外来性DNA的细胞之外、由基因活化技术（参照例如，国际公开第WO94/12650号单行本）活化内源性DNA，结果，对应于所述DNA的蛋白质的表达或所述DNA的转录开始或增加的细胞。

使用人为地导入APES的细胞制造希望得到的多肽时，APES和编码希望得到的多肽的基因的导入的顺序不特别限制，导入APES之后，导入编码希望得到的多肽的基因也可，导入编码希望得到的多肽的基因之后，导入APES也可。又、同时导入APES和编码希望得到的多肽的基因也可。

使用载体时，APES及编码希望得到的多肽的基因的导入由单一的载体同时导入也可，使用多个载体分别导入也可。

在本发明中使用的细胞不特别限定，是动物细胞、植物细胞、酵母等的真核细胞、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等的原核细胞等何的细胞也可，优选为，昆虫、鱼、两生类、爬虫类、哺乳类来源的动物细胞，特别是哺乳动物细胞是优选的。作为哺乳动物细胞的来源，可举出人、黑猩猩等的灵长类、小鼠、大鼠、仓鼠等的啮齿类、另外，人、啮齿类是优选的。再者，作为本发明的细胞，通常多肽的表达中常使用的，CHO细胞、COS细胞、3T3细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Vero细胞等的哺乳动物培养细胞是优选的。在将希望得到的多肽的大量表达作为目的时，CHO细胞是特别优选的。作为CHO细胞，特别是，可适宜地使用作为缺损DHFR基因的CHO细胞的dhfr-CHO（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1980）77,4216-4220）或CHO K-1（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1968）60，1275）。

作为上述的CHO细胞，特别是DG44株、DXB-11株、K-1、CHO-S是优选的，特别是DG44株及DXB-11株是优选的。

本发明的宿主细胞可作为例如，用于希望得到的多肽的制造或表达的产生系统使用。向强表达APES的宿主细胞导入编码希望得到的多肽的DNA，则可高生产希望得到的多肽。在本发明的宿主细胞中再导入编码牛磺酸转运蛋白（TauT）或阴离子交换剂（AE1）的DNA（整合进载体也可）也可。在本发明的宿主细胞中再导入编码半胱氨酸亚磺酸脱羧酶（Cystein Sulfinic Acid Decarboxylase：CSAD）或丙氨酸转移酶（Alanine Transferase:ALT1）的DNA也可。详细参照，WO2007/119774、WO2008/114673、WO2009/020144以及WO2009/054433。

向宿主细胞导入外来性DNA（整合进载体也可），能用例如，磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子核糖体DOTAP（BoehringerMannheim公司制）的方法、电穿孔法、Nucleofection法（amaxa公司）、脂转染等的方法进行。

（5）希望得到的多肽

用本发明的方法产生的多肽不特别限定，可为抗体（例如，抗IL-6受体抗体、抗IL-6抗体、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体等）或生理活性蛋白质（粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素、干扰素、IL-1或IL-6等的白细胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、PTH等）等任何的多肽，特别优选为抗体。抗体是天然抗体、Fab、scFv、sc（Fv）2等的低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体等的任何的抗体也可。

（6）多肽的制造

通过培养上述的宿主细胞，产生希望得到的多肽，收集该多肽，可得到多肽。

在细胞的培养中，可使用通常的细胞（优选为，动物细胞）培养中使用的培养基。在这些中通常、含氨基酸、维生素类、脂质因子、能源、渗透压调节剂、铁源、pH缓冲剂。这些成分的含量是，通常、氨基酸是0.05-1500mg/L、维生素类是0.001-10mg/L、脂质因子是0-200mg/L、能源是1-20g/L、渗透压调节剂是0.1-10000mg/L、铁源是0.1-500mg/L、pH缓冲剂是1-10000mg/L、微量金属元素是0.00001-200mg/L、表面活性剂是0-5000mg/L、增殖辅助因子是0.05-10000μg/L及核苷是0.001-50mg/L的范围是适当的，但不限于这些，可由培养的细胞的种类、希望得到的多肽的种类等适宜决定。

除上述成分之外，添加例如，微量金属元素、表面活性剂、增殖辅助因子、核苷等也可。

具体而言，可例示含例如，L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等、优选为L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等的氨基酸类；i-肌醇、生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、烟酸、p-氨基安息香酸、泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆素、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等、优选为生物素、叶酸、硫辛酸、烟酸酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等的维生素类；氯化胆碱、酒石酸胆碱、亚油酸、油酸、胆甾醇等、优选为氯化胆碱等的脂质因子；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等、优选为葡萄糖等的能源；氯化钠、氯化钾、硝酸钾等、优选为氯化钠等的渗透压调节剂；EDTA铁、柠檬酸铁、氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、硝酸铁等、优选为氯化铁、EDTA铁、柠檬酸铁等的铁源类；碳酸氢钠、氯化钙、磷酸二氢钠、HEPES、MOPS等、优选为碳酸氢钠等的pH缓冲剂的培养基。

除上述成分之外，添加例如，硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化镍、氯化锡、氯化镁、亚硅酸钠等、优选为硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁等的微量金属元素；吐温80、普流尼克F68等的表面活性剂；及重组型胰岛素、重组型IGF-1、重组型EGF、重组型FGF、重组型PDGF、重组型TGF-α、盐酸乙醇胺、亚硒酸钠、视黄酸、盐酸腐胺等、优选为亚硒酸钠、盐酸乙醇胺、重组型IGF-1、盐酸腐胺等的增殖辅助因子；脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷等的核苷等也可。再有，在上述培养基的适宜例中，含链霉素、青霉素G钾及庆大霉素等的抗生物质或，酚红等的pH指示剂也可。

培养基的pH根据培养的细胞不同，但一般而言pH6.8～7.6、多种情况pH7.0～7.4是适当的。

培养基也可使用市售的动物细胞培养用培养基、例如，D-MEM（Dulbecco′s改良的Eagle培养基）、D-MEM/F-121:1Mixture（Dulbecco′s改良的Eagle培养基:营养混合物F-12）、RPMI1640、CHO-S-SFM II（Invitrogen公司）、CHO-SF（Sigma-Aldrich公司）、EX-CELL301（JRH biosciences公司）、CD-CHO（Invitrogen公司）、IS CHO-V（Irvine Scientific公司）、PF-ACF-CHO（Sigma-Aldrich公司）等的培养基。

而且，培养基是无血清培养基也可。

宿主细胞是CHO细胞时，CHO细胞的培养可使用本领域技术人员公知的方法进行。例如，通常、能在气相的CO₂浓度是0-40%、优选为，2-10%的气氛下、30-39℃、优选为37℃左右培养。

为了产生希望得到的多肽而适当的培养期间通常是1天～3个月，优选为1天～2个月、再优选为1天～1个月。

另外，作为动物细胞培养用的各种的培养装置，可使用例如发酵槽型箱培养装置、气升式型培养装置、培养瓶型培养装置、旋转瓶型培养装置、微载体型培养装置、流动层型培养装置、空心纤维型培养装置、滚瓶型培养装置、填充槽型培养装置等进行培养。

培养可使用分批培养（batch culture）、流加培养（fed-batchculture）、连续培养（continuous culture）等之任一项的方法，流加培养或连续培养是优选的，流加培养是更优选的。

产生的多肽可从宿主细胞内或细胞外（培养基等）单离，纯化为实质上纯粹且均一的多肽。多肽的分离、纯化使用通常的多肽的纯化中使用的分离、纯化方法即可，无任何限定。例如，适宜选择层析柱、滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酸类树脂酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、再结晶等、组合则可分离、纯化多肽。

作为层析，可举出例如亲和性层析、离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤、逆相层析、吸附层析等（Strategies for Protein Purification及Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996）。这些的层析可使用液相层析、例如HPLC、FPLC等的液相层析进行。本发明也包含使用这些的纯化方法，高度纯化的多肽。

再有，通过将多肽纯化前或纯化后，向其作用适当的多肽修饰酶，加任意地修饰，或部分除去肽也可。作为多肽修饰酶，使用例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰端肽酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。

（7）药品

在由本发明的方法制造的多肽有作为医药利用可能的生物学活性时，通过将此多肽与药学容许的载体或添加剂混合而制剂化，可制造药品。

作为药学容许的载体及添加剂的例，可举出水、药学容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂基醇、硬脂酸、人血清白蛋白（HSA）、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作为医药添加物容许的表面活性剂等。

实际的添加物根据本发明治疗剂的剂型从上述之中单独或适宜组合选择，当然不限于这些。例如，作为注射用制剂使用时，可使用将纯化的多肽溶解于溶剂、例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等，向其加吸附防止剂、例如吐温80、吐温20、明胶、人血清白蛋白等的。或者，为了作为使用前溶解再构成的剂形而冷冻干燥的也可，作为用于冷冻干燥的赋形剂，可使用例如，甘露糖醇、葡萄糖等的糖醇或糖类。

多肽的有效施用量根据多肽的种类、作为治疗或预防的对象的疾病的种类、患者的年龄、疾病的重度度等适宜选择。例如，多肽是抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体的时，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体的有效施用量是，第一次可选每1kg体重0.001mg～1000mg的范围。或者，可选每患者当0.01～100000mg/身体的施用量。但是，不限于这些施用量。

多肽的施用方法可为经口、非经口施用之任何，优选为非经口施用，具体而言，可举出注射（例如，由静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等的全身或局部施用）、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等。

（8）NfkBia的表达的抑制

根据本发明，在培养导入编码希望得到的多肽的DNA的动物细胞制造所述多肽的方法中，通过降低宿主细胞中核因子κB抑制物α（NfkBia）的表达量，可增加所述希望得到的多肽的产生量。NfkBia基因是必须基因，抑制完全地表达，则至细胞死。从而，适度抑制所述NfkBia基因的表达在本发明的方法中被认为重要。

从而，在培养导入编码希望得到的多肽的DNA的动物细胞制造所述多肽的方法中包括将所述细胞的NfkBia的表达量相比抗体基因导入前的亲本细胞的表达量更降低的步骤，多肽的制造方法包括在本发明的范围内。

作为降低NfkBia的表达的方法，由从NfkBia基因的转录的抑制、mRNA的分解、从mRNA的翻译的抑制、或者翻译产物的功能（结合）抑制，抑制NfkBia的表达是可能的。相比如此不实施降低NfkBia的表达的方法的情况，通过使NfkBia的表达量成为70%以下，优选为60%以下，再优选为50%以下，希望得到的多肽的产生量增大。换言之，作为对于不使细胞死必要的NfkBia基因的表达量，例如，20%以上、优选为30%以上的表达量是必要的。

作为抑制NfkBia的表达的具体手段，考虑利用反义寡核苷酸、核酶、或者dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA等的引起RNA干涉（RNAi）的核酸分子。另外，也能利用被称为大基因间（或插入）长非编码RNA（lincRNAs）的mRNA型的非编码RNA、其其他mRNA型非编码RNA、诱饵寡体、适体。这些的核酸分子含与编码NfkBia的mRNA相同或互补的序列，可结合于NfkBia基因或mRNA抑制其表达。APES（或者PPES）是这样的核酸分子。

为了抑制NfkBia的表达利用可能的核酸分子的例是含与NfkBia的mRNA之一部分互补的序列的19～25碱基长的低分子RNA、或者具有与所述序列除一碱基外相同序列，有NfkBia的表达抑制功能的低分子RNA。

通过将抑制这样的NfkBia的表达的低分子RNA在宿主细胞中表达，可降低核因子κB抑制物α（NfkBia）的表达量。作为用于将抑制NfkBia的表达的低分子RNA在宿主细胞中表达的典型方法，可将含编码那样的低分子RNA的DNA的载体导入细胞而实施。

另外，通过将使对NfkBia mRNA或其部分序列的正义RNA和反义RNA互相结合而形成的dsRNA导入细胞内，能抑制NfkBia的表达。

测定NfkBia表达量时，不得不确定能用成为对象的细胞表达的NfkBia mRNA的TaqMan法定量的序列。例如，本检查中使用的NfkBia部分序列（SEQ ID NO:19、28）和TaqMan探针组(SEQ ID NO:20-22）可示于图12，此TaqMan探针的设计可由引物表达（^注册商标）软件（Applied Biosystems）等进行。上述的NfkBia部分序列（SEQ ID NO:28）在CHO K1细胞中也被确认为NF-κ-B抑制物α-样序列，与我们的PCR克隆序列一致。其中终始密码子TGA（907-909）的64碱基上游～132碱基上游的区域的表达定量是可能的。

作为典型测定机器，有Applied Biosystems（ABI）公司制的7900HISequence Detection System等，由于全部的试剂盒及试剂是购入可能的，可根据ABI公司推荐的流程定量。

【实施例】

以下，根据实施例具体说明本发明。再有，这些的实施例仅用于说明本发明，不限定本发明的范围。

〔实施例1〕各种基因导入CHO细胞的基因芯片解析实验

基因芯片实验使用AFFYMETRIX公司的寡核苷酸阵列（Affymetrix MOUSE430_2）根据通常的顺序。但是，仓鼠阵列由于未被商品化，使用小鼠基因组430 2.0阵列。由杂交条件的优化，试验3阵列上的小鼠基因16种的探针中，成用8种的探针得到Present Call，在与小鼠的碱基序列相同性为约90%以上的情况中，仓鼠转录产物的表达定量成为可能。

从强表达各种基因的细胞制备高纯度总RNA之后，使用总RNA和含T7启动子序列的寡dT引物（T7-(T)24）合成cDNA。接下来，由使用Bio-11CTP，Bio-16UTP和Megascript T7Kit（Ambion）的转录反应，从cDNA合成生物素标记cRNA。cRNA在柱纯化后，将在电泳上确认相当于18s～28s rRNA的分子量的高品质cRNA片段化，作为具有均一的尺寸的基因芯片样品。至使用的基因芯片样品加杂交样品溶液而于-80℃冷冻保存。样品溶液在使用前热处理、离心、应用于小鼠基因组4302.0阵列，旋转着阵列在45℃的杂交专用烘箱中温育16小时。回收样品、重复洗阵列而用链霉亲和素R-藻红蛋白染色后，扫描。

通过比较阵列上的转录物（约45,000）的基因芯片信号值，在1L罐流加培养第10天产生900mg/L以上的MAb1（抗IL-6R抗体；托珠单抗、商品名Actemra）的MAb1（抗IL-6R抗体）强表达TAUT强表达CSAD强表达DG44细胞的继代培养细胞中，作为表达强度高并且表达上调显著的转录产物鉴定小鼠基因组上的mRNA型非编码RNA UG_GENE=AI462015（Affymetrix MOUSE430_2，1420088_AT）（图1：AI462015转录产物的序列）。

AI462015是437碱基的mRNA型非编码RNA，其序列在小鼠基因组12的NfkBia mRNA3’侧的非翻译区域近傍（56590831-56590397）的互补链上存在。考虑了AI462015转录产物直接作用于NfkBiamRNA的非翻译区域而抑制翻译的可能性、或者437碱基之一部分的序列作为低分子RNA发挥功能而分解NfkBia mRNA的可能性。

例如，含AI462015序列中的5’侧第40A～第91A的52碱基的序列

（AAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA：SEQ ID NO:7）与大鼠NfkBia mRNA3‘侧的非翻译区域（1478-1529,GENE ID：25493NfkBia）的互补链除一碱基（AI462015中的5’侧第61A）外一致，还有含AI462015的第40A～第63A的24碱基的序列（AAGTACCAAAATAATTACCAACAA：SEQ ID NO:9）也是人NfkBia mRNA3‘侧的非翻译区域之一部分序列（TTGTTGGTAATTATTTTGGTACTT，1490-1513：SEQ ID NO:24)的互补链，所以预测作为52碱基之一部分的19-25碱基作为microRNA，或者一部分序列作为反义RNA作用于CHO细胞的NfkBia mRNA的可能性。

另外，根据更新信息（实施例8），例如，含AI462015序列中的5’侧第7T～第91A的85碱基的序列（图23和24之下线部、SEQ IDNO:29）（TGTAAAAATCTGTTTAATAAATATACATCTTAGAAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA）与大鼠NfkBia mRNA3‘侧的非翻译区域（1478-1562,GENE ID：25493NfkBia、SEQ ID NO:31）的互补链除一碱基（AI462015中的5’侧第70A）外一致（匹配=84/85、图25b）、同样地，在人（匹配=75/85、图25a、SEQ ID NO:30）、黑猩猩（匹配=75/85、图25c、SEQ ID NO:32）、恒河猴（匹配=74/85、图25d、SEQ ID NO:33）、牛（匹配=76/85、图25e、SEQ ID NO:34）中也确认相同性。从而认为，作为此85碱基（保守序列7～91）之一部分的19-25碱基作为microRNA，或者一部分序列作为反义RNA跨种作用于动物细胞、或者哺乳动物细胞。从而预测，也作用于如动物培养细胞、优选为CHO细胞一样的哺乳动物细胞的NfkBia mRNA。

〔实施例2〕在高产生抗体的细胞中表达上调的转录产物的鉴定

在实施例1中，在高产生MAb1（抗IL-6R抗体；托珠单抗、商品名Actemra）的DG44细胞中转录产物AI462015的表达量上调（图2），在不同的宿主细胞（CHO-DXB11s）中高产生不同的抗体（MAb2：抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体；GC33（参照WO2006/006693））时也同样地AI462015转录产物的表达上调（图3）。

如图2所示，在CHO-DG44细胞中强表达牛磺酸转运蛋白（TauT）基因时，强表达半胱氨酸亚磺酸脱羧酶（CSAD）基因时（数据未显示）、一同强表达TauT和CSAD时，转录产物AI462015的表达量均是同程度，在一同强表达TauT和CSAD的细胞中再强表达Mab1（抗IL-6受体抗体）时，见到AI462015的异常的上调（宿主细胞的7倍），表达量也示异常高的基因芯片信号值（10,000以上）。对照的GAPDH表达强度在细胞间同水平，所以转录产物AI462015的表达上调特异于高产生Mab1抗体的细胞。图3也同样，在CHO-DXB11s细胞中强表达MAb2（抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体）基因时，AI462015序列的表达上调（TauT，CSAD，表达AE1强的细胞的平均值的13倍）特异于高产生MAb2抗体的细胞。

以上的结果示，在摇床继代培养第3天稳定增殖的高产生抗体的细胞异常高表达AI462015序列。

另外，在1L罐培养第3天的生产培养条件下也见AI462015序列的异常的表达上调。如图4所示，在1L罐流加培养的第10天产生约1200-1400mg/L的MAb1（抗IL-6R抗体）的2种的高产生抗体的细胞示5,000以上高的基因芯片信号值。从培养条件的不同，1L罐流加培养第3天的信号值是摇床培养的50%左右，在培养后期第13天，AI462015序列的表达强度上调至与摇床继代培养同程度，示异常高的信号值（图5）。另一方面，抗体产生量低的强表达MAb1的DXB11s细胞（在水解物未添加的摇床培养第7天是300mg/L以下，在水解物添加也是500mg/L以下），在添加恭献于高产生化的水解物（Hy-Fish、猪源裂解扬）的条件下，也未见到1L罐培养第3天的AI462015序列的表达上调（图6）。

基于在图2示高的信号值的MAb1强表达TauT强表达CSAD强表达DG44细胞的抗体产生量高（在水解物未添加的摇床培养第7天是640mg/L）、在图3示高的信号值的强表达MAb2的DXB11s细胞的抗体产生量高（在水解物未添加的摇床培养第7天是640mg/L）、在加图6中恭献于抗体高产生化的水解物时信号值也不上调的实验结果，考虑“AI462015序列的表达量高的细胞产生抗体的潜力高的”。

〔实施例3〕由APES强表达的产生抗体的细胞的高产生化例

由于AI462015序列表达量的高度与产生抗体的潜力的高度示相关，向在图6中产生抗体的潜力低的强表达MAb1的DXB11s细胞导入表达AI462015序列之一部分的质粒，强表达而比较产生抗体的潜力。

将小鼠基因组来源的转录产物AI462015（图1、437碱基）序列之一部分（含Affymetrix基因芯片的AI462015探针序列）5’侧第4G～3’末端的T命名为APES434、5’侧第4G～第168C命名为APES165，制成2种表达单位（APES是指抗体产生增强序列的简称）。通过合成加Kozak序列的表达单位，构建在CMV启动子下高表达的pHyg-APES434（图7）、pHyg-APES165（图8）、pHyg-空值（图9）。

由Amaxa公司（现、LONZA公司）基因导入系统Nucleofector，向图6的产生抗体低的株的强表达MAb1的DXB11s细胞导入表达质粒，在96孔板上挑选在含潮霉素（200μg/ml）的选择培养基存在下高增殖的全细胞系统，24孔板扩大后，比较抗体产生量。挑选的株数分别是pHyg-APES434（N=38），pHyg-APES165（N=60）、pHyg-空值（N=11），它们的株数期待由强表达APES的质粒导入的阳性效果。在含1mL继代培养基的24孔板的静置培养是，在培养第13天见不到细胞增殖，所以测定抗体产生量及细胞数。抗体产生量的平均值是pHyg-APES434（44.3mg/L）、pHyg-APES165（41.2mg/L）、pHyg-空值（21.9mg/L）、细胞数（平均值）是pHyg-APES434（9.27×10⁵细胞/mL）、pHyg-APES165（11.39×10⁵细胞/mL）、pHyg-空值（7.76×10⁵细胞/mL），pHyg-APES434、pHyg-APES165导入细胞一同对于对照的pHyg-空值统计学显著（t检验P<0.001，图10）。

以上的结果示，强表达含AI462015转录产物的5’侧165bp的核酸序列（例如作为SEQ ID NO:2的DNA的转录产物的APES165、或者作为SEQ ID NO:3的DNA的转录产物的APES434），则细胞的产生抗体的潜力升高。

〔实施例4〕高产生抗体的CHO细胞中的NfkBia的表达抑制

如在实施例1所述，AI462015序列存在于小鼠基因组12的NfkBia基因的3’侧的非翻译区域近傍（3’侧78bp）的互补链上，AI462015序列中含的22碱基（AAGTACCAAAATAATTACCAAC：SEQ ID NO:10）是与人NfkBia基因的3’侧非翻译区域（1492-1513）的互补链相同的序列，再者跨大鼠、恒河猴、狗、马等种保守，从而有作为microRNA进行RNA干涉而分解NfkBia mRNA的可能性，或者从相当于可定量AI462015表达的AFFYMETRIX公司的寡核苷酸阵列（Affymetrix MOUSE430_2）上的特异性探针序列区域（CATATACAACATTTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG：SEQ ID NO:16）42bp之前半部分的5’侧第71C的21碱基（CATATACAACATTTACAAGAA：SEQ ID NO:15）是大鼠NfkBiamRNA的1478～1498碱基目的互补序列，从而考虑AI462015序列来源的核酸分子通过对于NfkBia mRNA进行RNA干涉，抑制表达来维持高产生抗体的CHO细胞的稳态的可能性（敲除小鼠的致死率是出生后）。（注释：其后判明，AI462015的转录产物相当于小鼠NfkBia基因的3’侧513碱基的非翻译区域的互补链。参照实施例8。另外，在小鼠基因芯片上定量的AI462015的第71～第112序列（SEQ ID NO:16）作为在CHO细胞的转录产物确认。）

从而，定量在产生抗体的潜力高的高表达AI462015的细胞中的NfkBia表达mRNA的量，确认其表达被抑制。

由于CHO细胞的NfkBia mRNA序列未知，从在小鼠和大鼠的氨基酸编码区域（共942碱基：314氨基酸）保守的序列设计探针（5’ACTTGGTGACTTTGGGTGCT、5’GCCTCCAAACACACAGTCAT）（SEQ ID NO:17、18）而得到325bp的PCR产物。PCR克隆的325bp从其序列相同性被认为是CHO细胞来源NfkBia mRNA之一部分序列（图11）。

在小鼠基因组4302.0阵列（实施例1）中，其探针序列用于相当于CHO细胞的种特异性序列，或无法定量NfkBia mRNA表达，但相比325bp PCR产物量，对于不产生抗体的表达基因强的细胞（泳道1，2），在AI462015序列的表达上调的高产生抗体的细胞（泳道3，4）中NfkBia mRNA表达被抑制。再者，设计能定量325bp之一部分的序列的TaqMan探针组（图12），用RT-PCR法定量，则在高产生抗体的细胞中，NfkBia mRNA表达被抑制至不产生抗体的细胞的约50%（图13）。

从以上认为，在高产生抗体的细胞中NfkBia mRNA的表达被抑制，结果，产生抗体的潜力升高。实际、我们从在抗体基因表达中使用的表达质粒的启动子/增强子区域中存在多个以上的NfkB结合部位（图14：小鼠MCMV IE2启动子上的NfkB结合部位）、它们的增强子区域是对于抗体基因的高表达必须的区域认为，由NfkBia表达抑制活化的NfkB迁移到核内，启动子活性增强是抗体高产生之一原因。

〔实施例5〕用高产生抗体的CHO细胞亢进的microRNA的解析

为了解析microRNA，如图15所示使用Mir-X^TM miRNAFirst-Strand Sythesis Kit（Clontech），继代培养中的高产生MAb1（抗IL-6R抗体）的DXB11s细胞和强表达高产生MAb1（抗IL-6R抗体）的TAUT的DXB11s细胞，再向从抗体基因导入前的DXB11s宿主细胞制备的小RNA的3’侧附加多聚（A）标签之后，引发在3’侧具有寡dT、在5’侧具有PCR引物序列（mRQ3’引物）的适配体而合成第一次锁cDNA。将得到的cDNA作为模板，使用mRQ3’引物和预计的APES序列来源的microRNA-特异性引物（APES40-61 5’引物，或者APES71-91 5’引物）、再者阳性对照的U6snRNA5’引物进行qPCR反应（95℃5sec，60℃20sec，30个循环）。PCR反应液，在纯化后，用3%琼脂糖凝胶电泳。如图16所示，用由APES40-61 5’引物和U6snRNA5’引物的PCR反应见到目的的大小的条带。如泳道1,2,3所示，APES40-61（AAGTACCAAAATAATTACCAAC：SEQ ID NO:10）22碱基在高产生MAb1（抗IL-6R抗体）的细胞中高表达。从阳性对照的U6snRNA（泳道4）的表达量在任何的细胞中也是同水平，另外确认不到APES71-91（CATATACAACATTTACAAGAA：SEQ ID NO:15）的存在（数据未显示），考虑跨种序列保守的APES40-61（22碱基）作为microRNA恭献于抗体高产生化。

〔实施例6〕由APES强表达的抗体产生用宿主细胞的高增殖化例

从抗体产生用宿主细胞DXB11/TAUT，在1L罐流加培养第14天得到产生3.9g/L的MAb1（抗IL-6R抗体）的高产生抗体的细胞（DXB11/TAUT/MAb1），由TAUT的生存率维持能力在培养第31天产生8.1g/L，但考虑实生产而为了在培养第14天高产生，有必要增加细胞最高到达密度（4.1x10e6细胞/mL）。如果由APES强表达的Nfkbia mRNA的表达抑制（实施例4）促进Nfkb的活化，由于增殖关联基因的表达被亢进，细胞最高到达密度有升高的可能性。将与APES同样地恭献于抗体高产生化的ALT1的共表达用质粒各自（pPur-APES165，pPur-ALT1，图17）导入上述高产生抗体的细胞DXB11/TAUT/MAb1（亲本株）挑选高增殖的最好的各3株，进行摇床流加培养，则强表达APES165的细胞的细胞最高到达密度的平均值是（11.5±1.7）x10e6细胞/mL，得到高增殖至强表达ALT1的细胞的（8.9±1.8）x10e6细胞/mL以上的细胞。再者摇床流加培养第14天的抗体产生量的平均值是，强表达APES的细胞：4.4±0.6g/L，强表达ALT1的细胞：4.0±0.6g/L，升高至导入前的DXB11/TAUT/MAb1细胞：3.4g/L以上，所以示强表达APES的效果独立于强表达TAUT的效果而阳性地发挥作用（图18）。由APES强表达的正的效果在1L-Jar流加培养中显著，比较各自在摇床流加培养的高增殖细胞，则强表达APES的株最高增殖，在培养第12天是5.3g/L，相对于亲本株的3.2g/L，强表达ALT1的株4.4g/L示短期间培养高产生的长处（图19）。基于以上的结果，将抗体产生用宿主细胞DXB11/TAUT改变为更高增殖的宿主细胞，制成强表达APES165的宿主DXB11/TAUT/APES。将pPur-APES165用电穿孔法基因导入DXB11/TAUT宿主，对于药剂挑选后生存率、增殖均良好的宿主候选的9株，将继代培养时的APESsnRNA（小非编码RNA）表达量定量。APES表达量高的DXB11/TAUT/APES宿主候选株培养时的活细胞密度高，示相关（R²=0.70）（图20）。

〔实施例7〕由APES强表达的产生抗体的细胞的高产生化例2

与实施例3同样，向强表达MAb1的DXB11s细胞导入表达AI462015转录产物的5’侧的部分序列的质粒，比较产生抗体的潜力。

APES4-168（APES165）之外，再制成由其一部分序列组成的APES4-68（SEQ ID NO:5）及APES69-133（SEQ ID NO:6）的表达单位，检查细胞的产生抗体的潜力。相对于空载体强表达（空值）成APES4-68以p<0.05，APES69-133以p<0.01的显著差异抗体高产生（t检验P<0.001、图21）。

图22示是否在实施例3及本实施例中鉴定的，有APES活性的部分序列分别相当于小鼠AI462015转录产物的何区域。示APES活性的部分序列含23碱基以上Nfkbia互补序列。

〔实施例8〕关于APES的基因解析

在实施例1中，基于申请时的基因信息，记述为“AI462015是437碱基的mRNA型非编码RNA，但其序列存在于小鼠基因组12的NfkBia基因的3’侧的非翻译区域近傍（56590831-56590397）的互补链上”，但是，由其后的GeneBank的信息更新，作为AI462015的转录产物的437碱基明显相当于小鼠NfkBia基因的3’侧非翻译区域（513碱基）的互补链（图23）。如图24所示，申请后，在公开的CHO-K1细胞的基因组序列上存在AI462015的相同序列（SEQ ID NO:25：AI462015；SEQ ID NO:26-27：CHO-K1基因组）、再者，从在抗体高产生的CHO细胞中见到Nfkbia的表达抑制（实施例4）认为，在CHO细胞中AI462015的相同序列高表达而发挥功能。

本发明能应用于所有的抗体等的产生重组多肽的细胞。

直接参考本说明书中引用的全部的刊行物、专利及专利申请并入本说明书。