BR112013022277B1

BR112013022277B1 - Método para produção de cadeia de açúcar contendo ácido siálico

Info

Publication number: BR112013022277B1
Application number: BR112013022277-8A
Authority: BR
Inventors: Yasunori Chiba; Yoshie Takahashi; Hisashi Narimatsu; Kazuhiro Fukae
Original assignee: Glytech, Inc
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2021-08-03
Also published as: CA2828905A1; EP2682473B1; CN103502462A; JPWO2012121041A1; KR101906623B1; US9376506B2; AU2012225900B2; EP2682473A1; RU2013143650A; US20170240655A1; CN103502462B; JP5975577B2; EP2682473A4; TW201247873A; AU2012225900A1; CA2828905C; KR20140114279A; TWI546385B; SG193021A1; BR112013022277A2

Abstract

método para produção de cadeia de açúcar contendo ácido siálico. problema a ser solucionado. a importância de cadeias de açúcar que possuem ácido siálico ligado em (alfa)2,3 ou em (alfa)2,6 em suas extremidades não redutoras é conhecida. há uma demanda pela produção industrial desses compostos de cadeia de açúcar. particularmente, a produção de fármacos de glicoproteína ou semelhantes inevitavelmente requer a produção em quantidade de cadeias de açúcar que possuem estruturas homogêneas por controle do padrão de ligação (ligação (alfa)2, 6 ou ligação (alfa)2,3) de ácido siálico. particularmente, uma cadeia de açúcar triantenária ou tetra-antenária do tipo n complexa que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras é geralmente considerada difícil de ser sintetizada quimicamente. não havia relatos que revelassem que uma cadeia de açúcar desse tipo fosse sintetizada quimicamente. além disso, essas cadeias de açúcar também são difíceis de se preparar enzimaticamente de forma eficiente. solução. os presentes inventores constataram recentemente a atividade de sialiltransferase de degradação de ácido siálico sobre um produto de reação na presença de cmp, e também constataram que cmp formado pode ser degradado enzimaticamente para, dessa forma, produzir eficientemente uma cadeia de açúcar que contém ácido siálico. os presentes inventores verificaram ainda que até uma cadeia de açúcar tetra-antenária do tipo n que possui quatro moléculas de ácido siálico ligado em (alfa)2,6, era difícil de sintetizar, pode ser rendimentos elevados por síntese em que previamente preparada em uma etapa que compreende a reação de alongamento de uma cadeia de açúcar biantenária usada como um material de partida, sem realização de purificação após cada reação enzimática.

Description

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção está relacionada a um método para a síntese de uma cadeia de açúcar que é aplicável aos fármacos como, por exemplo, glicoproteínas, padrões para instrumentos analíticos, reagentes científicos, arranjos de cadeia de açúcar etc.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Um grande número de estudos prévios revelou que estruturas de cadeia de açúcar ligadas às proteínas têm um papel funcional importante nas atividades biológicas das proteínas. A cadeia de açúcar também é denominada a “face da célula”. A cadeia de açúcar expressa na superfície celular sabidamente participa na interação ou sinalização célula-célula, desenvolvimento ou diferenciação, fertilização, metástase de câncer etc. Como ocorre para modificações de cadeias de açúcar em mamíferos, a glicosilação do tipo proteoglicano, ligada ao Asn, do tipo mucina, e outras, são tipicamente bem conhecidas. Essas modificações formam suas respectivas estruturas únicas de cadeia de açúcar por meio de vias de biossíntese distintas. Açúcares como, por exemplo, fucose ou ácido siálico, sabidamente são adicionados às extremidades não redutoras dessas estruturas de cadeia de açúcar.

O ácido siálico é um nome genérico para compostos substituídos com grupo amino ou com grupo hidróxi de ácido neuramínico, que é uma nonose especial que possui grupos amino e carbóxi. Ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) que possui um grupo amino acetilado na posição 5 é provavelmente a forma mais predominante na natureza. Várias estruturas como, por exemplo, ácido N-glicolilneuramínico, que possui um grupo amino modificado com glicolil na posição 5, ou ácido desamino-neuramínico KDN, também são conhecidas.

De acordo com relatos, a cadeia de açúcar que contém ácido siálico é encontrada não apenas em mamíferos, incluindo humanos e camundongos, mas em vertebrados, equinodermas e até mesmo protistas ou algumas bactérias que possuem patogenicidade gram-negativa. Essa cadeia de açúcar que contém ácido siálico é produzida por meio da sialiltransferase. A sialiltransferase emprega ácido siálico adicionado ao monofosfato de citidina (CMP) como um doador de substrato para transferir o ácido siálico para, por exemplo, a posição 3 ou 6 de galactose, posição 6 de N- acetilgalactosamina ou posição 8 de outro ácido siálico por meio de um grupo aldeído presente na posição 2 do doador de ácido siálico. Por exemplo, a enzima que transfere ácido siálico para a posição 3 de galactose é denominada α-2,3- sialiltransferase; a enzima que transfere ácido siálico para a posição 6 de galactose ou N-acetilgalactosamina é denominada α-2,6-sialiltransferase; e a enzima que transfere ácido siálico para a posição 8 de outro ácido siálico é denominada α-2,8-polisialiltransferase. Dessas enzimas, a α-2,6-sialiltransferase é conhecida como enzimas ST6Gal-I e ST6Gal-II que transferem ácido siálico para a posição 6 de galactose e enzimas ST6GalNAc-I, ST6GalNAc-II, ST6GalNAc-III e ST6GalNAc-IV que transferem ácido siálico para a posição 6 de N-acetilgalactosamina, em humanos. ST6Gal-I reconhece uma estrutura de N-acetil- lactosamina (Galβ1-4GlcNAc), que é N-acetil-glucosamina que possui galactose ligada à posição 4, como um aceitador de substrato e, portanto, modifica as estruturas da extremidade não redutora de alguns glicolipídeos ou cadeias de açúcar ligadas ao N. Sua especificidade para o aceitador de substrato foi analisada usando principalmente cadeias de açúcar ligadas ao N biantenárias ou triantenárias. De acordo com o relato, o ácido siálico tende a ser transferido para lactosamina na antena de manose ligada em α1,3 (veja Literatura não patente 1). Quanto à preparação das cadeias de açúcar ligadas ao N biantenárias ou triantenárias, essas cadeias de açúcar são difíceis de serem produzidas eficientemente em quantidade porque, por exemplo: substratos de glicosiltransferase raramente são extraídos de produtos naturais; e um método de preparação em larga escala para a enzima ainda não foi estabelecido.

Enquanto isso, a reação de transferência de ácido a2,6-siálico para cadeias de açúcar ligadas ao N tetra- antenárias foi estudada usando ST6Gal-I de origem bovina. De quatro estruturas de N-acetil-lactosamina na cadeia de açúcar, a estrutura de N-acetil-lactosamina ligada em α1,2 à manose ligada em α1,3 é a mais suscetível à transferência de ácido siálico, seguida pela estrutura de N-acetil- lactosamina ligada em α1,4 à manose ligada em α1,3 e, além disso, uma de duas estruturas de N-acetil-lactosamina adicionadas à manose ligada em α1,6, embora nenhum produto contendo quatro moléculas de ácido siálico tenha sido encontrado (veja Literatura não patente 2). Foi relatado que ST6Gal-I humana e, além disso, ST6Gal-II, possuem especificidade de substrato (veja Literaturas não patente 3 e 4). No entanto, não foi feito nenhum estudo sobre a sialilação com cadeias de açúcar ligadas ao N tetra- antenárias como substratos aceitadores.

De acordo com os relatos, a inibição do produto de ST6Gal-I por CMP é de 49% de inibição (veja Literatura não patente 5) ou 71% de inibição (veja Literatura não patente 6) por 0,25 mM de CMP.

Enquanto isso, Photobacterium damsela JT0160 (veja Literatura não patente 7), Photobacterium leiognathi JT- SHIZ-145 (veja Literatura não patente 8), e semelhantes foram relatadas como α2,6-sialiltransferase derivada de bactérias. Nenhuma delas, no entanto, foi estudada sobre a sialilação com cadeias de açúcar ligadas ao N tetra- antenárias como substratos aceitadores.

Quanto à reação de transferência de ácido a2,3-siálico para cadeias de açúcar ligadas ao N tetra-antenárias, cadeias de açúcar ligadas ao N tetra-antenárias que contêm quatro moléculas de ácido siálico ligado em α2,3 são adicionadas à glicoproteínas como, por exemplo, eritropoietina (EPO) (veja Literatura não patente 9). De acordo com o relato, essa sialilação contribui para a estabilidade das glicoproteínas no sangue (veja Literatura não patente 10). Embora essas estruturas também ocorram naturalmente, não houve relato de caso de que as cadeias de açúcar ligadas ao N tetra-antenárias que contêm quatro moléculas de ácido siálico ligado em α2,3 tenham realmente sido preparadas em grandes quantidades. Isso ocorre porque: EPO, ou semelhante, usada como um material de partida, é de difícil preparação em grandes quantidades em termos de custos; e as cadeias de açúcar asialo ligadas ao N tetra- antenárias usadas como aceitadores na síntese enzimática também dificilmente são preparadas em baixo custo a partir de outros produtos naturais. Além disso, a glicoproteína EPO sabidamente possui, por exemplo, cadeias de açúcar ligadas ao N tetra-antenárias que contêm ligações α2,3 e α2,6 em conjunto (veja Literatura não patente 11).

Foi relatado, quanto ao padrão de ligação de ácido siálico ligado às cadeias de açúcar do tipo N em fármacos de anticorpo ou fármacos de glicoproteína como, por exemplo, citocinas, que proteínas que possuem ácido siálico ligado em α2,6 desaparecem do sangue mais rápido do que proteínas que possuem ácido siálico ligado em α2,3. Para depuração do sangue, glicoproteínas são incorporadas em células por meio de ligação in vivo às moléculas de lectina e finalmente metabolizadas. Dessa forma, pode ser esperado que as glicoproteínas que possuem ácido siálico ligado em α2,6 sejam incorporadas de forma órgão-específica por meio da ligação a moléculas específicas de lectina e também que sejam exploradas na liberação de fármacos. Além disso, sabe-se que as glicoproteínas são excretadas na urina no rim, dependendo dos tamanhos moleculares. De acordo com relatos, o tamanho molecular aparente da eritropoietina aumenta com aumento no número de antenas em sua cadeia de açúcar, levando à depuração lenta do sangue. Dessa forma, pode ser esperado que a síntese de cadeias de açúcar que possuem ácido siálico ligado em α2,3 e/ou ligado em α2,6, particularmente, cadeias de açúcar tetra-antenárias do tipo N que possuem quatro moléculas de ácidos siálicos ligados em α2,3 e/ou ligados em α2,6, seja aplicável à produção de fármacos de glicoproteínas que diferem na eficiência de captação em um órgão.

O vírus influenza humano reconhece, para sua infecção, ácido siálico ligado em α2,6 em cadeias de açúcar expressas na superfície celular, enquanto o vírus influenza derivado de pássaros reconhece ácido siálico ligado em α2,3 para sua infecção. Muitos vírus, incluindo também o vírus influenza, começa a infectar as células por reconhecimento das estruturas de cadeia de açúcar das células a serem infectadas. A esse respeito, a especificidade de ligação desses vírus deve ser examinada usando várias cadeias de açúcar. Dessa forma, cadeias de açúcar que possuem ácido siálico ligado em α2,3 ou em α2,6 podem servir como um material para estudar a especificidade de ligação desses vírus e serem aplicáveis, por exemplo, à detecção dos vírus.

LISTA DE CITAÇÃO

Literatura não patente Literatura não patente 1: van den Eijnden DH e cols., Biochem. Biophys. Res. Commun., 92 (3), 839-45 (1980). Literatura não patente 2: Joziasse e cols., JBC, 262, 2.025-2.033 (1987). Literatura não patente 3: Takashima e cols., JBC, 277, 45.719-45.728 (2002). Literatura não patente 4: Krzewinski-Recchi e cols., EJB, 270, 950-961 (2003). Literatura não patente 5: Miyazaki T e cols., Glycobiology, 18, 187-194 (2008). Literatura não patente 6: Kleineidam e cols., Glycoconj. J., 14, 57-66 (1997). Literatura não patente 7: Yamamoto T e cols., BBB, 62, 210-214 (1998). Literatura não patente 8: Yamamoto T e cols., Glycobiology, 17, 1.167-1.174 (2007). Literatura não patente 9: Takeuchi e cols., J. Biol. Chem., 263 (8), 3.657-63 (1988). Literatura não patente 10: Tsuda e cols., Eur. J. Biochem., 188 (2), 405-11 (1990). Literatura não patente 11: Takeuchi e cols., J. Biol. Chem., 263 (8), 3.657-63 (1988).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema técnico

A importância de cadeias de açúcar que possuem ácido siálico ligado em α2,3 ou em α2,6 em suas extremidades não redutoras é conhecida. Embora esses compostos de cadeia de açúcar possam ocorrer naturalmente, sua produção industrial tem sido demandada por causa dos problemas de extração a partir de produtos naturais, por exemplo, a escassez, disponibilidade difícil e segurança dos produtos naturais. Particularmente, a produção de fármacos de anticorpo ou fármacos de glicoproteínas como, por exemplo, citocinas, ou o estudo sobre a especificidade de ligação de vírus, ou semelhantes, inevitavelmente exige a produção em quantidade de cadeias de açúcar que possuem estruturas homogêneas por controle do padrão de ligação (ligação α2,6 ou ligação α2,3) de ácido siálico. Particularmente, uma cadeia de açúcar triantenária ou tetra-antenária do tipo N complexa que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras é geralmente considerada difícil de sintetizar quimicamente. Não houve relatos que revelassem que, por exemplo, uma cadeia de açúcar tetra-antenária do tipo N complexa que possui ácido siálico ligado em α2,6 em cada uma das extremidades não redutoras fosse quimicamente sintetizada. Além disso, essas cadeias de açúcar triantenárias ou tetra-antenárias sialiladas são enzimaticamente difícil de preparar eficientemente.

Solução para o problema

Os presentes inventores constataram recentemente a atividade de sialiltransferase de degradação de ácido siálico sobre um produto de reação na presença de CMP e também constataram que CMP formado pode ser degradado enzimaticamente para, dessa forma, produzir eficientemente uma cadeia de açúcar que contém ácido siálico. Os presentes inventores verificaram ainda que até mesmo uma cadeia de açúcar tetra-antenária do tipo N que possui quatro moléculas de ácido siálico ligado em α2,6, que previamente era difícil de sintetizar, pode ser preparada em rendimentos elevados por síntese em uma etapa (one-pot) que compreende a reação de alongamento de uma cadeia de açúcar biantenária usada como um material de partida sem realização de purificação após cada reação enzimática.

Especificamente, a presente invenção está relacionada a um método para produção de uma segunda cadeia de açúcar sialilada, ou um derivado desta, que compreende a reação de uma primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta com ácido CMP-siálico na presença de sialiltransferase e fosfatase para transferir ácido siálico para uma extremidade não redutora da primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta.

Nesse contexto, de acordo com uma modalidade do método para produção de uma segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta é uma cadeia de açúcar triantenária ou tetra-antenária complexa ligada ao N ou um derivado desta.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta é um composto representado pela fórmula seguinte: Fórmula 1

em que Gn representa N-acetil-glucosamina, Man representa manose e Gal representa galactose (o mesmo se aplica à descrição abaixo no presente relatório descritivo; no presente relatório descritivo, N-acetil-glucosamina também é denominada GlcNAc) ou um derivado destas.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a segunda cadeia de açúcar sialilada, ou um derivado desta, é uma cadeia de açúcar triantenária ou tetra-antenária complexa ligada ao N, em que a cadeia de açúcar é um composto que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras, ou um derivado deste.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a segunda cadeia de açúcar sialilada, ou um derivado desta, é um composto representado pela fórmula seguinte: Fórmula 2

em que Gn representa N-acetil-glucosamina, Man representa manose, Gal representa galactose e Sia representa ácido siálico (o mesmo se aplica à descrição abaixo no presente relatório descritivo; no presente relatório descritivo, N-acetil-glucosamina também é denominada GlcNAc) ou um derivado destas.

Um aspecto alternativo da presente invenção está relacionado a um método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada, ou um derivado desta, que compreende as seguintes etapas: (a) reação de uma ou mais vezes de uma etapa de reação de uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte:

ou um derivado desta com UDP-açúcar que serve como um substrato de glicosiltransferase na presença da glicosiltransferase; e (b) reação do produto da etapa (a) com ácido CMP- siálico na presença de sialiltransferase e fosfatase.

Um aspecto alternativo adicional da presente invenção está relacionado a um método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada em sua extremidade não redutora ou um derivado desta, que compreende as seguintes etapas: (a) reação de uma cadeia de açúcar biantenária agalacto complexa ou um derivado desta com UDP-GlcNAc na presença de MGAT4 e MGAT5; (b) reação do produto da etapa (a) com UDP-Gal na presença de β4GalT1; e (c) reação do produto da etapa (b) com ácido CMP- siálico na presença de sialiltransferase e fosfatase.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a sialiltransferase é α2,6- sialiltransferase.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a sialiltransferase é sialiltransferase de origem humana.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a sialiltransferase é ST6Gal-I.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, o ácido CMP-siálico é CMP-Neu5Ac.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a fosfatase é fosfatase alcalina.

De acordo com uma modalidade do método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta da presente invenção, a fosfatase é fosfatase alcalina derivada de E. coli.

Um aspecto alternativo adicional da presente invenção está relacionado a um composto que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras de uma cadeia de açúcar tetra-antenária complexa ligada ao N ou um derivado desta.

Um aspecto alternativo adicional da presente invenção está relacionado a um composto que possui ácido siálico ligado em α2,6 em cada uma das extremidades não redutoras de uma cadeia de açúcar tetra-antenária complexa ligada ao N ou um derivado desta.

Um aspecto alternativo adicional da presente invenção está relacionado a um composto representado pela fórmula seguinte:

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

O método da presente invenção pode produzir mais eficientemente uma cadeia de açúcar que contém ácido siálico usando sialiltransferase do que em qualquer época anterior. Particularmente, o método da presente invenção pode produzir eficientemente até mesmo uma cadeia de açúcar triantenária ou tetra-antenária complexa que contém ácido siálico (incluindo glicoaminoácidos e glicopeptídeos) na qual ácido siálico está ligado a cada uma de todas as extremidades não redutoras das antenas, o que previamente era difícil de produzir. Além disso, o método da presente invenção pode obter produção conveniente em rendimentos elevados por meio da reação de síntese em uma etapa e também pode obter a produção de quantidades dessas cadeias de açúcar, o que previamente era difícil de se obter.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[Figura 1] A Figura 1 mostra um gráfico de HPLC de cada produto de reação obtido por reação a 37°C por 0 hora, 1 hora, 6 horas ou 24 horas (de baixo para cima) após adição de ST6Gal-1 a uma solução contendo NA4-Fmoc como uma cadeia de açúcar tetra-antenária complexa e CMP-NeuAc ou pela adição adicional de CMP-NeuAc e ST6Gal-1 à solução após reação por 24 horas e por 24 horas subseqüentes (mais superior). Os termos “tetrassialo”, “trissialo”, “dissialo” e “monossialo” mostrados na parte superior do gráfico revelam os tempos de retenção (min) de (α2,6)tetrassialo- NA4-Fmoc, (α2,6)trissialo-NA4-Fmoc, (α2,6)dissialo-NA4-Fmoc e (α2,6)monossialo-NA4-Fmoc, respectivamente, no gráfico de HPLC.

[Figura 2] A Figura 2 mostra as proporções de abundância de (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc e (α2,6)trissialo- NA4-Fmoc após reação do (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc a 37°C por 15 horas na presença ou ausência de CMP-Neu5Ac e na presença ou ausência de sialiltransferase. No diagrama, “+Doador” descreve os resultados da reação na presença de 2 mM de CMP-Neu5Ac; “-Doador” descreve os resultados da reação na ausência de CMP-Neu5Ac; “+Doador fervido” descreve os resultados da reação na presença de 2 mM de CMP-Neu5Ac após aquecido até 100°C por 5 minutos; e “Enzima” descreve os resultados da reação na ausência de sialiltransferase.

[Figura 3] O diagrama da esquerda da Figura 3 mostra as proporções de abundância de (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc e (α2,6)trissialo-NA4-Fmoc após reação do tetrassialo-NA4- Fmoc com sialiltransferase ST6Gal1 a 37°C por 15 horas na presença ou ausência de CMP-Neu5Ac ou CMP. O diagrama da direita da Figura 3 mostra as proporções de abundância de (α2,3)tetrassialo-NA4-Fmoc e (α2,3)trissialo-NA4-Fmoc após reação do (α2,3)tetrassialo-NA4-Fmoc com sialiltransferase (ST6Gal-I ou ST3Gal-III) a 37°C por 15 horas na presença ou ausência de CMP-Neu5Ac.

[Figura 4] A Figura 4 mostra a proporção de abundância de CMP após incubação de CMP-Neu5Ac a 37°C, 33°C, 30°C ou 25°C por 2 horas, 8 horas ou 24 horas.

[Figura 5] A Figura 5 mostra as proporções de abundância de (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc, (α2,6)trissialo- NA4-Fmoc, (α2,6)dissialo-NA4-Fmoc e (α2,6)monossialo-NA4- Fmoc após reação de NA4-Fmoc com sialiltransferase ST6Gal1 a 37°C, 30°C, 25°C, 20°C ou 10°C por 2 horas, 8 horas ou 24 horas na presença de CMP-Neu5Ac.

[Figura 6] A Figura 6 mostra as proporções de abundância de (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc e (α2,6)trissialo- NA4-Fmoc após reação do (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc com sialiltransferase ST6Gal1 a 37°C por 3 horas, 6 horas ou 24 horas na ausência de CMP e BAP como um controle, na presença de CMP, ou na presença de CMP e BAP.

[Figura 7] A Figura 7 mostra um gráfico de fluxo da reação de síntese em uma etapa de (α2,6)tetrassialo-NA4- Fmoc descrita no parágrafo (7) dos Exemplos.

[Figura 8] A Figura 8 mostra esquematicamente reação de glicosilação usando uma fórmula estrutural na reação de síntese em uma etapa de (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc descrita no parágrafo (7) dos Exemplos.

[Figura 9] A Figura 9 está relacionada ao método de síntese em uma etapa de (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc descrito no parágrafo (7) dos Exemplos. No diagrama, o gráfico de HPLC superior indicado por “+ST6Gal1” representa um gráfico de HPLC de um produto de reação; e o gráfico de HPLC inferior indicado por “NGA2-Fmoc” representa um gráfico de HPLC de um material de partida para a reação.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES

No presente relatório descritivo, o “ácido siálico” é um nome genérico para a família de derivados de ácido neuramínico substituídos com grupo amino ou com grupo hidróxi. Nesse contexto, o “ácido neuramínico” é uma nonose especial que possui grupos amino e carboxil intramoleculares e é representado pela fórmula seguinte: Fórmula 6

Na estrutura do ácido siálico, a acetilação, glicolilação ou semelhante do grupo amino é conhecida como a substituição do grupo amino no ácido neuramínico descrito acima. Além disso, por exemplo, a desaminação (eliminação do grupo amino) também é conhecida. A acetilação, metilação, fosforilação, lactilação ou semelhante é conhecida como a substituição do grupo hidróxi, embora a substituição da presente invenção não esteja limitada a estas.

No presente relatório descritivo, o ácido siálico a ser transferido é preferivelmente ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), que é o mais abundante na natureza, ou ácido N- glicolilneuramínico (Neu5Gc), que é o segundo mais abundante na natureza, do ponto de vista de produção de glicoproteínas que ocorrem naturalmente ou suas cadeias de açúcar. Ácido N-acetilneuramínico é mais preferido, particularmente do ponto de vista de produção de glicoproteínas que ocorrem naturalmente como glicoproteínas humanas ou suas cadeias de açúcar.

No presente relatório descritivo, o “ácido CMP- siálico” significa ácido citidina-5’-monofosfo-siálico e se refere a um composto que possui uma estrutura na qual o grupo hidróxi na posição 2 de ácido siálico é condensado por desidratação com o grupo fosfato de monofosfato de citidina (CMP). Exemplos do ácido CMP-siálico com ácido siálico mais especificamente definido incluem ácido CMP-N- acetilneuramínico (CMP-Neu5Ac) e ácido CMP-N- glicolilneuramínico (CMP-Neu5Gc). No presente relatório descritivo, o ácido CMP-siálico usado na presente invenção é preferivelmente ácido CMP-N-acetilneuramínico (CMP- Neu5Ac) ou ácido CMP-N-glicolilneuramínico (CMP-Neu5Gc), do ponto de vista de produção de glicoproteínas que ocorrem naturalmente ou suas cadeias de açúcar, mais preferivelmente ácido CMP-N-acetilneuramínico (CMP-Neu5Ac), particularmente do ponto de vista de produção de glicoproteínas que ocorrem naturalmente como glicoproteínas humanas ou suas cadeias de açúcar.

No presente relatório descritivo, a “sialiltransferase” é um tipo de glicosiltransferase e se refere a uma enzima que catalisa uma reação através da qual um resíduo de ácido siálico é transferido de ácido CMP- siálico que serve como um doador de açúcar (também denominado um substrato doador) para uma estrutura de cadeia de açúcar que serve como um aceitador de açúcar (também denominado um substrato aceitador) (daqui por diante, essa reação é denominada “reação de transferência de ácido siálico”). A sialiltransferase é conhecida por transferir ácido siálico para uma extremidade não redutora de uma cadeia de açúcar. A reação de transferência de ácido siálico pode ser representada pela fórmula de reação mostrada abaixo. No caso de utilização de um derivado de cadeia de açúcar ao invés da cadeia de açúcar, a cadeia de açúcar na fórmula pode ser substituída com o derivado de cadeia de açúcar. Expressão 1

[em que ácido siálico-cadeia de açúcar representa um composto que possui ácido siálico ligado por meio de uma ligação glicosídica a uma extremidade não redutora da cadeia de açúcar]

A sialiltransferase é conhecida por transferir ácido siálico para, por exemplo, a posição 3 ou 6 de galactose, posição 6 de N-acetilgalactosamina ou posição 8 de outro ácido siálico em uma extremidade não redutora da cadeia de açúcar. Por exemplo, a enzima que transfere ácido siálico para a posição 3 de galactose é denominada α-2,3- sialiltransferase; a enzima que transfere ácido siálico para a posição 6 de galactose ou N-acetilgalactosamina é denominada α-2,6-sialiltransferase; e a enzima que transfere ácido siálico para a posição 8 de outro ácido siálico é denominada α-2,8-polisialiltransferase.

Por exemplo, sialiltransferases derivadas de bactérias, além de sialiltransferases derivadas de truta arco-íris ou de mamíferos, são conhecidas. Além disso, uma proteína que possui atividade do tipo sialiltransferase foi encontrada em plantas. Sialiltransferase derivada de mamíferos é preferida, particularmente do ponto de vista de produção de glicoproteínas que ocorrem naturalmente como glicoproteínas de mamíferos ou suas cadeias de açúcar. Sialiltransferase de origem humana é mais preferida do ponto de vista de produção de glicoproteínas que ocorrem naturalmente como glicoproteínas humanas ou suas cadeias de açúcar. α-2,6-Sialiltransferase de origem humana é conhecida como, por exemplo, enzimas ST6Gal-I (também denominada ST6Gal1; o mesmo se aplica à descrição abaixo) e ST6Gal-II que transferem ácido siálico para a posição 6 de galactose e enzimas ST6GalNAc-I, ST6GalNAc-II, ST6GalNAc-III e ST6GalNAc-IV que transferem ácido siálico para a posição 6 de N-acetilgalactosamina. α-2,3-Sialiltransferase de origem humana é conhecida como, por exemplo, enzimas ST3Gal-I a ST3Gal-VI, que transferem ácido siálico para a posição 3 de galactose.

A sialiltransferase é preferivelmente ST6Gal-I, ST6Gal-II, ST3Gal-I, ST3Gal-II, ST3Gal-III, ST3Gal-IV, ST3Gal-VI, ST6GalNAc-I, ST6GalNAc-II, ST6GalNAc-III, ST6GalNAc-IV, ST8Sia-II, ST8Sia-III ou ST8Sia-IV, particularmente do ponto de vista de produção de glicoproteínas que ocorrem naturalmente ou suas cadeias de açúcar. Alternativamente, ST6Gal-I, ST6Gal-II, ST3Gal-III, ST3Gal-IV, ST3Gal-VI, ST8Sia-II, ST8Sia-III ou ST8Sia-IV são preferidas do ponto de vista de produção de cadeias de açúcar ligadas ao N.

No presente relatório descritivo, a “cadeia de açúcar” se refere a um composto que possui uma ligação de um ou mais açúcares unitários (monossacarídeo e/ou derivado deste). No caso de uma cadeia de açúcar que possui uma ligação de dois ou mais açúcares unitários, os açúcares unitários são unidos por condensação por desidratação por meio de uma ligação glicosídica entre eles. Exemplos de uma cadeia de açúcar desse tipo incluem, sem limitação, monossacarídeos e polissacarídeos (glicose, galactose, manose, fucose, xilose, N-acetil-glucosamina, N- acetilgalactosamina, ácido siálico, e seus complexos e derivados) contidos in vivo, e uma ampla gama de outras cadeias de açúcar como, por exemplo, polissacarídeos degradados e cadeias de açúcar degradadas ou induzidas por biomoléculas complexas, incluindo glicoproteínas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos e glicolipídeos. A cadeia de açúcar pode ser linear ou ramificada.

No presente relatório descritivo, a “cadeia de açúcar” também inclui um composto que possui um substituinte modificado de uma cadeia de açúcar. Exemplos deste incluem, sem limitação, cadeias de açúcar como, por exemplo, cadeias de açúcar constituídas por açúcares que possuem um grupo carboxil (por exemplo, ácido aldônico (por exemplo, ácido D-glicônico, um produto da oxidação de D-glicose), que é um ácido carboxílico formado por oxidação na posição C-1, e ácido urônico (por exemplo, ácido D-glicurônico, um produto da oxidação de D-glicose), que é um ácido carboxílico formado pela oxidação de um átomo de carbono terminal), açúcares que possuem um grupo amino ou um derivado de grupo amino (por exemplo, um grupo amino acetilado) (por exemplo, N-acetil-D-glucosamina e N-acetil-D-galactosamina), açúcares que possuem tanto grupos amino quanto carboxil (por exemplo, ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) e ácido N-acetilmurâmico), açúcares desoxidados (por exemplo, 2-desóxi-D-ribose), açúcares sulfatados que contêm um grupo sulfato e açúcares fosforilados que contêm um grupo fosfato.

No presente relatório descritivo, a cadeia de açúcar é preferivelmente uma cadeia de açúcar que é encontrada na forma de um glicoconjugado (glicopeptídeo (ou glicoproteína), proteoglicano, glicolipídeo etc.) in vivo, preferivelmente uma cadeia de açúcar ligada a um peptídeo (ou proteína) para formar um glicopeptídeo (ou glicoproteína) in vivo, por exemplo, uma cadeia de açúcar ligada ao N ou uma cadeia de açúcar ligada ao O, do ponto de vista de produção de glicoproteínas que servem como fármacos. A cadeia de açúcar ligada ao N é um nome genérico para cadeias de açúcar cujo padrão de ligação a uma proteína é a ligação entre um grupo hidróxi anomérico em N- acetil-glucosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar e o grupo amino (-NH2) de uma cadeia lateral de asparagina por meio de condensação por desidratação. A cadeia de açúcar ligada ao O é um nome genérico para cadeias de açúcar cujo padrão de ligação a uma proteína é a ligação entre um grupo hidróxi anomérico na extremidade redutora da cadeia de açúcar e o grupo hidróxi (-OH) de uma cadeia lateral de serina ou treonina por meio de condensação por desidratação.

A cadeia de açúcar ligada ao N também é denominada uma cadeia de açúcar ligada à asparagina, uma cadeia de açúcar do tipo N, ou semelhantes. A cadeia de açúcar ligada ao N é um grupo de cadeias de açúcar que possuem Man3-GlcNAc- GlcNAc como um núcleo. Dependendo das estruturas de cadeias de açúcar ligadas à Man no núcleo, a cadeia de açúcar ligada ao N é conhecida por ter uma estrutura de cadeia de açúcar particular denominada um tipo rico em high, complexo ou hibrido. Além disso, uma estrutura multiantenária como, por exemplo, um tipo biantenário, triantenário ou tetra- antenário, é conhecida como a estrutura ramificada da cadeia de açúcar ligada ao N. Essas estruturas de cadeia de açúcar também são descritas, por exemplo, em Seikagaku Jiten (“Encyclopedia of Biochemistry in English”), 3a Edição, emitida por Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd.

No presente relatório descritivo, a primeira cadeia de açúcar ou um derivado, ou seja, a cadeia de açúcar ou um derivado desta que serve como um aceitador de açúcar na presença de sialiltransferase e fosfatase, não é particularmente limitada, desde que a cadeia de açúcar ou um derivado possua, em sua extremidade não redutora, uma estrutura de cadeia de açúcar que serve como um substrato de sialiltransferase. Muitas glicoproteínas que ocorrem naturalmente sabidamente contêm cadeia(s) de açúcar ramificada(s) que possuem estrutura(s) na qual ácido siálico está ligado à extremidade não redutora da cadeia de açúcar ligada ao N do tipo complexa ou híbrida. A primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta é preferivelmente uma cadeia de açúcar complexa ligada ao N ou a cadeia de açúcar híbrida ligada ao N, mais preferivelmente uma cadeia de açúcar complexa ligada ao N capaz de ter ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras, do ponto de vista de produção dessas cadeias de açúcar. A estrutura ramificada é preferivelmente uma cadeia de açúcar ligada ao N triantenária ou tetra-antenária, o que previamente era difícil de produzir. Uma cadeia de açúcar ligada ao N triantenária ou tetra-antenária complexa é mais preferida.

No presente relatório descritivo, a “primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta” se refere a uma cadeia de açúcar ou um derivado desta que é usada como um composto de material de partida (também denominado um composto de partida) em uma reação de transferência de ácido siálico, e também se refere a uma cadeia de açúcar que possui, em pelo menos uma extremidade não redutora, uma estrutura de cadeia de açúcar que serve como um substrato de sialiltransferase. A “primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta” usada na reação de transferência de ácido siálico é também denominada um “aceitador de açúcar” ou um “substrato aceitador”, enquanto o “ácido CMP-siálico” é também denominado um “doador de açúcar” ou um “substrato doador”.

A “primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta” usada é preferivelmente, por exemplo, um composto que possui uma estrutura de substrato de sialiltransferase em cada extremidade não redutora de uma cadeia de açúcar ramificada ou, em outras palavras, um composto que possui uma estrutura completamente deficiente em ácido siálico da “segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” como o composto de interesse. No presente relatório descritivo, uma cadeia de açúcar desse tipo também é denominada uma “cadeia de açúcar asialo”, uma “forma asialo” ou “asialo”.

No presente relatório descritivo, a cadeia de açúcar asialo é preferivelmente, por exemplo, uma cadeia de açúcar tetra-antenária representada pela fórmula mostrada abaixo ou um derivado desta.

No presente relatório descritivo, a cadeia de açúcar asialo tetra-antenária complexa ligada ao N ou um derivado desta é preferivelmente, por exemplo, uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte: Fórmula 7

ou um derivado desta.

No presente relatório descritivo, a cadeia de açúcar triantenária asialo complexa ligada ao N ou um derivado desta é preferivelmente, por exemplo, uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte: Fórmula 8

ou um derivado desta.

No presente relatório descritivo, a cadeia de açúcar biantenária asialo complexa ligada ao N ou um derivado desta é preferivelmente, por exemplo, uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte: Fórmula 9

ou um derivado desta.

Além dessas cadeias de açúcar, uma cadeia de açúcar que possui ácido siálico ligado por meio de uma ligação glicosídica a uma ou mais posições nas extremidades não redutoras de cada uma das cadeias de açúcar, ou um derivado desta, pode ser usada como um aceitador de açúcar na reação de transferência de ácido siálico da presente invenção. Métodos convencionais raramente produzem uma cadeia de açúcar multiantenária que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras da cadeia de açúcar. Até mesmo uma cadeia de açúcar desse tipo obtida pelos métodos convencionais pode ser convertida em uma cadeia de açúcar que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras pela reação de transferência de ácido siálico da presente invenção. Exemplos da cadeia de açúcar obtida pelos métodos convencionais incluem compostos representados pelas fórmulas seguintes Fórmula 10

Esses compostos podem ser obtidos pelos métodos convencionais ou também podem ser produzidos por ajuste do tempo de reação no método da presente invenção.

A cadeia de açúcar que possui ácido siálico ligado por meio de uma ligação glicosídica a uma ou mais posições em suas extremidades não redutoras, ou um derivado desta, pode ser usada como a primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta, enquanto sialiltransferase que forma uma ligação glicosídica diferente daquela do ácido siálico no composto pode ser usada. Em um caso desse tipo, um composto que possui padrões diferentes de ligações glicosídicas de resíduos de ácido siálico pode ser produzido.

No presente relatório descritivo, o “derivado da cadeia de açúcar” também inclui um composto que possui um composto adicional ligado à extremidade redutora da cadeia de açúcar por meio de condensação por desidratação ou semelhantes. O “derivado da cadeia de açúcar” é, por exemplo, um composto que ainda possui R ligado à N-acetil- glucosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar, como representado pela fórmula seguinte: Fórmula 11

Esse derivado de cadeia de açúcar é fornecido meramente para fins ilustrativos, e derivados de outras cadeias de açúcar também podem ser indicados pelas cadeias de açúcar mais -R nas extremidades redutoras das cadeias de açúcar.

O derivado da cadeia de açúcar também inclui uma cadeia de açúcar que contém um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular, um composto radioativo, ou semelhantes, como a porção R na extremidade redutora. O aminoácido inclui não apenas aminoácidos naturais mas aminoácidos não naturais como, por exemplo, variantes de e derivados aminoácidos. O aminoácido, o peptídeo, a proteína, ou semelhantes, podem ser protegidos, em alguns ou todos os grupos funcionais como, por exemplo, grupos hidróxi, amino e carboxil, com grupos de proteção. Exemplos do grupo de proteção para o grupo hidróxi podem incluir grupos metil, benzil, benzoil, acetil, trimetilsilil (TMS), trietilsilil (TES) e terc- butildimetilsilil (TBS ou TBDMS). Exemplos do grupo de proteção para o grupo amino podem incluir grupos de proteção lipossolúveis, incluindo grupos de proteção de carbonato ou amida como, por exemplo, grupos 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc), t-butiloxicarbonil (Boc), benzil, aliloxicarbonil e acetil. No caso de introdução de um grupo de proteção lipossolúvel, por exemplo, um grupo Fmoc, esse grupo pode ser introduzido por meio de reação pela adição de 9-fluorenilmetil-N-succinimidil carbonato e carbonato de sódio.

Exemplos do grupo de proteção para o grupo carboxil podem incluir grupos benzil, alil e difenilmetil. Esses grupos de proteção são fornecidos meramente para fins ilustrativos, e o grupo de proteção da presente invenção não se limita a estes. Como a sialiltransferase atua sobre a extremidade não redutora da cadeia de açúcar, qualquer aduto pode ser usado para a extremidade redutora da cadeia de açúcar, a menos que o aduto influencie grandemente a reação de transferência de açúcar. O vinculador é útil para adesão da cadeia de açúcar produzida a um aminoácido, uma proteína, ou semelhantes. Exemplos destes podem incluir, sem limitação, -NH-(CO)-(CH2)aCH2 (em que a é qualquer número inteiro sem limitações, a menos que o as funções de interesse do vinculador sejam inibidas e, preferivelmente, representa um número inteiro de 0 a 4), C1-10 polimetileno e -CH2-R1- (em que R1 representa um grupo formado pela eliminação de um átomo de hidrogênio de um grupo selecionado do grupo que consiste em alquil, alquil substituído, alquenil, alquenil substituído, alquinil, alquinil substituído, aril, aril substituído um grupo carbocíclico, um grupo carbocíclico substituído, um grupo heterocíclico e um grupo heterocíclico substituído). O grupo fluorescente é útil para uso na purificação da cadeia de açúcar produzida, no teste da cadeia de açúcar etc. Exemplos destes podem incluir grupos dansil, piridilamino (PA), 2-aminobenzamida (2-AB), ácido 2-aminobenzóico (2-AA) e ácido 9-aminopireno-1,4,6-trisasulfônico (APTS).

Alternativamente, o derivado da cadeia de açúcar pode conter, em qualquer ordem, dois ou mais adutos como, por exemplo, uma cadeia de açúcar-aminoácido e um vinculador adicional a ele adicionado ou uma cadeia de açúcar e um aminoácido ligados por meio de um vinculador.

No presente relatório descritivo, o derivado da cadeia de açúcar é preferivelmente uma cadeia de açúcar- aminoácido, um peptídeo glicosilado ou uma proteína glicosilada, mais preferivelmente cadeia de açúcar- asparagina (também indicado por cadeia de açúcar-Asn) do ponto de vista de produção de cadeias de açúcar de glicoproteínas naturais. Um composto que contém um grupo de proteção ligado à cadeia de açúcar-asparagina (também indicado por cadeia de açúcar-Asn-R2, em que R2 representa um grupo de proteção) é preferido do ponto de vista de utilização da cadeia de açúcar produzida-asparagina em síntese de fase sólida. Além dos grupos de proteção lipossolúveis exemplificados acima, um grupo de proteção geralmente conhecido por aqueles habilitados na técnica pode ser usado como o grupo de proteção. Por exemplo, cadeia de açúcar-asparagina-Fmoc (cadeia de açúcar-Asn- Fmoc) ou cadeia de açúcar-asparagina-Boc (cadeia de açúcar- Asn-Boc), que é a cadeia de açúcar-asparagina que possui o grupo de proteção lipossolúvel Fmoc ou Boc, ou semelhantes, é preferida.

No presente relatório descritivo, a “segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” se refere a uma cadeia de açúcar ou um derivado desta que é um produto da reação de transferência de ácido siálico, e se refere a uma cadeia de açúcar que possui ácido siálico em pelo menos uma extremidade não redutora ou um derivado desta. A “segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” é preferivelmente uma cadeia de açúcar que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras que possui uma estrutura de substrato de sialiltransferase entre as extremidades não redutoras, ou um derivado desta. A “segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” é mais preferivelmente uma cadeia de açúcar que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras, ou um derivado desta.

No presente relatório descritivo, a cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta pode ser definida em termos do número de moléculas de ácido siálico ligadas a uma molécula de cadeia de açúcar. A cadeia de açúcar sialilada, ou um derivado desta, é chamada de “tetrassialo” quando 4 moléculas de ácido siálico estão ligadas a 1 molécula de cadeia de açúcar, de “trissialo” quando 3 moléculas de ácido siálico estão ligadas a 1 molécula de cadeia de açúcar, de “dissialo” quando 2 moléculas de ácido siálico estão ligadas a 1 molécula de cadeia de açúcar e de “monossialo” quando 1 molécula de ácido siálico está ligada a 1 molécula de cadeia de açúcar. Alternativamente, uma cadeia de açúcar sialilada desse tipo ou um derivado desta é também denominada uma “cadeia de açúcar tetrassialo”, uma “forma tetrassialo”, ou semelhantes. Por exemplo, um composto que possui 4 moléculas de ácido siálico ligadas a 1 molécula de cadeia de açúcar tetra-antenária pode ser denominado uma cadeia de açúcar “tetra-antenária” “tetrassialo”; um composto que possui 3 moléculas de ácido siálico ligadas a 1 molécula de cadeia de açúcar tetra- antenária pode ser denominado uma cadeia de açúcar “tetra- antenária” “trissialo”; e um composto que possui 3 moléculas de ácido siálico ligadas a 1 cadeia de açúcar triantenária molécula pode ser denominado uma cadeia de açúcar “triantenária” “trissialo”.

No presente relatório descritivo, o termo “tetrassialo” inclui qualquer composto que possui 4 moléculas de ácido siálico ligadas a 1 molécula de cadeia de açúcar, independentemente do tipo da ligação glicosídica entre cada ácido siálico e a cadeia de açúcar, por exemplo, um composto que possui ligações (α2,6) como todas as ligações glicosídicas, um composto que possui ligações (α2,3) como todas as ligações glicosídicas e um composto que possui ligações (α2,6) como algumas ligações glicosídicas e ligações (α2,3) como outras ligações glicosídicas. No entanto, o termo “(α2,6) tetrassialo” descrito simplesmente no presente relatório descritivo, se refere a um composto no qual todas as 4 moléculas de ácido siálico estão ligadas por meio de ligações (α2,6) à cadeia de açúcar. O termo “(α2,3) tetrassialo” descrito simplesmente no presente relatório descritivo, se refere a um composto no qual todas as 4 moléculas de ácido siálico estão ligadas por meio de ligações (α2,3) à cadeia de açúcar. O padrão da ligação glicosídica formada entre o ácido siálico e a extremidade não redutora da “primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta” por sialiltransferase não é particularmente limitado, e é preferivelmente uma ligação α 2,6, α 2,3 ou α2,8. Quando a

“segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” possui diversas moléculas de ácido siálico nas extremidades não redutoras da cadeia de açúcar, as ligações glicosídicas formadas entre as moléculas de ácido siálico e as extremidades não redutoras da “primeira cadeia de açúcar ou um derivado desta” podem ter padrões iguais ou diferentes.

No presente relatório descritivo, a “segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” como um produto da reação de transferência de ácido siálico é, preferivelmente, por exemplo, uma cadeia de açúcar representada pela fórmula mostrada abaixo ou um derivado desta. A cadeia de açúcar tetra-antenária complexa ligada ao N que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras da segunda cadeia de açúcar (no presente relatório descritivo, também denominada uma cadeia de açúcar tetrassialo tetra-antenária complexa ligada ao N) como a “segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” é preferivelmente, por exemplo, uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte: Fórmula 12

ou um derivado desta.

Alternativamente, a cadeia de açúcar triantenária complexa ligada ao N que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras da segunda cadeia de açúcar (no presente relatório descritivo, também denominada uma cadeia de açúcar triantenária trissialo complexa ligada ao N) como a “segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” é preferivelmente, por exemplo, uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte: Fórmula 13

ou um derivado desta.

Alternativamente, a cadeia de açúcar biantenária complexa ligada ao N que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras da segunda cadeia de açúcar (no presente relatório descritivo, também denominada uma cadeia de açúcar biantenária dissialo complexa ligada ao N) como a “segunda cadeia de açúcar sialilada ou um derivado desta” é preferivelmente, por exemplo, uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte: Fórmula 14

ou um derivado desta.

Nesse contexto, a cadeia de açúcar complexa ligada ao N sabidamente também é encontrada na forma de um composto que possui Fuc ou Gn ligado a qualquer uma das cadeias de açúcar descritas acima. Um composto desse tipo também está incluído no escopo da presente invenção. Mais especificamente, é sabido que: Fuc está ligado em α1,6 a Gn em uma extremidade redutora; Gn está ligado em β1,4 à posição 4 de Man ligado a Gn em uma extremidade redutora; e Fuc está ligado em α1,3 ou α1,4 a Gn em uma porção de ramificação. Um composto que possui Gn(β1,4)Man ou Gn(β1,2)Man ao invés de Gn(β1,6)Man como um padrão de ligação na porção de ramificação de qualquer uma das cadeias de açúcar descritas acima, um composto que possui Gn(β1,2)Man ao invés de Gn(β 1,4)Man entre eles, e uma cadeia de açúcar que possui ligações glicosídicas que diferem no padrão de ligação, por exemplo, um composto que possui Sia(α2,3)Gal ao invés de algumas porções

Sia(α2,6)Gal ligadas ao ácido siálico ou um composto que possui Sia(α2,6)Gal ao invés de algumas porções Sia(α2,3)Gal, também estão incluídos no escopo da presente invenção.

No presente relatório descritivo, a “fosfatase” se refere a uma enzima que catalisa uma reação através da qual éster de ácido fosfórico é hidrolisado. A fosfatase não é particularmente limitada, desde que a fosfatase possua a atividade de hidrólise de éster de ácido fosfórico em CMP sob condições de reação para glicosiltransferase. Por exemplo, fosfatase alcalina, que é ativa sob condições alcalinas, ou fosfatase ácida, que é ativa sob condições ácidas, é conhecida como a fosfatase. A fosfatase alcalina sabidamente está amplamente distribuída por todo o corpo, incluindo o fígado, o rim, osteoblastos, a placenta e o intestino delgado. A fosfatase ácida sabidamente é armazenada em lisossomos e também é encontrada em vários órgãos ou plasma. Por exemplo, é conhecida fosfatase derivada de bactérias, derivada de E. coli, derivada de camarão ou derivada de mamíferos. Por exemplo, fosfatase alcalina derivada de E. coli (BAP), fosfatase alcalina derivada de bovinos (CIP, CAP ou CIAP) e fosfatase derivada de camarão alcalina (SAP) são conhecidas.

A reação de transferência de ácido siálico no presente relatório descritivo será descrita. A sialiltransferase usada pode ser um produto disponível comercialmente (α2,3-(N)-Sialiltransferase, Rato, Recombinante, S. frugiperda, α2,3-(O)- Sialiltransferase, Rato, Recombinante, S. frugiperda, α2,6- (N)-Sialiltransferase, Humana, S. frugiperda Recombinante, beta-galactosídeo-alfa-2,3-sialiltransferase Recombinante, beta-galactosídeo-alfa-2,6-sialiltransferase Recombinante etc.), ou pode ser obtida por: obtenção de um gene por amplificação por PCR ou síntese gênica química com base em uma seqüência gênica ou seqüência de aminoácidos publicamente conhecida; inserção do gene obtido em um vetor de expressão como, por exemplo, um plasmídeo; e obtenção da enzima como um recombinante usando um sistema de expressão de E. coli, levedura, células de inseto, células de plantas, células animais, ou semelhantes. Alternativamente, a sialiltransferase pode ser purificada de uma amostra biológica como, por exemplo, tecido de intestino delgado bovino ou células animais cultivadas, e usada na presente invenção. Aqueles habilitados na técnica podem produzir a sialiltransferase por utilização de qualquer um dos métodos descritos no presente relatório descritivo ou modificando adequadamente esses métodos.

A fosfatase usada também pode ser um produto disponível comercialmente, por exemplo, “Fosfatase Alcalina Bacteriana” (E. coli), “Fosfatase Alcalina de Intestino de Bezerro” (CIP) ou “Fosfatase Alcalina de Camarão” (SAP), ou pode ser produzida adequadamente.

O ácido CMP-siálico usado também pode ser um produto disponível comercialmente, por exemplo, ácido citidina-5’- monofosfo-N-acetilneuramínico (dissódico), ou pode ser produzido adequadamente.

O solvente da reação usado na reação de sialiltransferase não é particularmente limitado, desde que o solvente permita condições sob as quais a atividade da sialiltransferase seja mantida. Um estabilizante (por exemplo, albumina sérica bovina), um tensoativo, ou semelhantes, pode ser adicionado ao solvente da reação. Por exemplo, uma solução aquosa contendo 0,1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de MnCl2 e Triton X-100 0,1%, podem ser usados. Aqueles habilitados na técnica podem adequadamente modificar o solvente da reação para uso.

O pH do solvente da reação não é particularmente limitado dentro de uma faixa que mantenha a atividade da sialiltransferase. A faixa de pH ótima para a sialiltransferase está preferivelmente na ordem de 5 a 10, mais preferivelmente na ordem de 7 a 8. O solvente da reação pode ser preparado em um pH ligeiramente alcalino ou em um pH ácido, e não neutro, considerando uma faixa que mantenha a atividade da fosfatase usada.

A temperatura de reação não é particularmente limitada, desde que a temperatura permita condições sob as quais a atividade da sialiltransferase seja mantida. A temperatura ótima para a enzima é preferivelmente em torno de 37°C. A temperatura de reação é preferivelmente 10°C a 40°C, mais preferivelmente 20°C a 37°C, mais preferivelmente ainda 25°C a 37°C. 25°C a 30°C é preferida do ponto de vista de prevenção de que o ácido CMP-siálico seja degradado por sialiltransferase.

O tempo de reação não é particularmente limitado, desde que o tempo seja suficiente para a progressão da reação de transferência de ácido siálico. Aqueles habilitados na técnica podem adequadamente determinar o tempo de reação. Particularmente, no caso de transferência de ácido siálico a cada extremidade não redutora de uma cadeia de açúcar multiantenária, o tempo de reação pode ser ajustado para preferivelmente 8 horas a 48 horas, mais preferivelmente 16 a 24 horas.

Durante a reação, o ácido CMP-siálico doador de açúcar, bem como a fosfatase ou sialiltransferase, podem ainda ser adicionados após a reação por certo tempo e depois reagidos. Eles podem ser adicionados simultaneamente ou podem ser adicionados separadamente em um intervalo de tempo apropriado. Por exemplo, após reação por 24 horas, ácido CMP-siálico e sialiltransferase podem ainda ser adicionados e reagidos por mais 24 horas.

No presente relatório descritivo, a primeira cadeia de açúcar usada, ou um derivado desta, pode ser purificada e processada a partir de um produto natural, purificada de uma glicoproteína sintetizada em um sistema de expressão, sintetizada química ou enzimaticamente, ou semelhantes. Alternativamente, esses produtos podem ainda ser submetidos, por exemplo, à reação de alongamento de cadeia de açúcar, e depois usados na reação da presente invenção. A reação de alongamento de cadeia de açúcar pode envolver, de acordo com o padrão de ligação glicosídica da estrutura de cadeia de açúcar desejada, a seleção de uma enzima que catalisa a formação da ligação glicosídica; e o alongamento da cadeia de açúcar seqüencialmente de acordo com a ordem de ligação de açúcares que constituem a cadeia de açúcar para produzir a cadeia de açúcar de interesse.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a cadeia de açúcar multiantenária complexa ligada ao N usada como uma cadeia de açúcar que serve como um aceitador de açúcar na reação de transferência de ácido siálico, ou um derivado desta, é produzida por meio da reação de alongamento de cadeia de açúcar com uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte (daqui por diante denominada uma cadeia de açúcar biantenária agalacto), ou um derivado desta, como um material de partida: Fórmula 15

Por exemplo, a cadeia de açúcar biantenária agalacto- Asn-Fmoc representada pela fórmula seguinte pode ser usada como um derivado da cadeia de açúcar descrita acima: Fórmula 16

De acordo com um aspecto da presente invenção, a cadeia de açúcar tetra-antenária complexa ligada ao N usada como a primeira cadeia de açúcar, ou um derivado desta, pode ser produzida pelas etapas de: (a) reação da cadeia de açúcar biantenária agalacto representada pela fórmula descrita acima, ou um derivado desta, com UDP-GlcNAc na presença de N- acetilglucosaminiltransferase; e (b) reação do produto da etapa (a) com UDP-Gal na presença de galactosiltransferase.

A N-acetilglucosaminiltransferase pode ser selecionada de acordo com a ligação glicosídica que é formada entre a cadeia de açúcar e o açúcar a ser transferido. Por exemplo, uma enzima que catalisa a formação de uma ligação β1-6 pode ser selecionada quando a ligação glicosídica de interesse é uma ligação β1-6. Alternativamente, uma enzima que catalisa a formação de uma ligação β1-4 pode ser selecionada quando a ligação glicosídica de interesse é uma ligação β1-4. Exemplos da enzima que catalisa a formação de uma ligação β1-6 (β1-6-N-acetilglucosaminiltransferase) podem incluir MGAT5 humana e GnT-V bovina. Exemplos da enzima que catalisa a formação de uma ligação β1-4 (β1,4-N- acetilglucosaminiltransferase) podem incluir MGAT4a humana, MGAT4b humana e GnT-Iva bovina.

A galactosiltransferase pode ser selecionada de acordo com a ligação glicosídica que é formada entre a cadeia de açúcar e o açúcar a ser transferido. Uma enzima que catalisa a formação de uma ligação β1-4 pode ser selecionada quando a ligação glicosídica de interesse é uma ligação β1-4. Exemplos da enzima podem incluir β4GalT1, β4GalT2 e β1,4-galactosiltransferase derivada de Helicobacter pylori.

No caso de produção de uma cadeia de açúcar tetra- antenária representada pela fórmula seguinte: Fórmula 17

ou um derivado desta, a cadeia de açúcar ou um derivado pode ser produzida, por exemplo, usando MGAT4a e MGAT5 como N-acetilglucosaminiltransferase na etapa (a) e β4GalT1 como galactosiltransferase na etapa (b). As enzimas nessa combinação podem ser substituídas com as enzimas exemplificadas acima etc., para produzir a cadeia de açúcar de interesse.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a cadeia de açúcar triantenária complexa ligada ao N usada como a primeira cadeia de açúcar, ou um derivado desta, também pode ser produzida da mesma forma que na cadeia de açúcar tetra-antenária.

No caso de produção de uma cadeia de açúcar triantenária representada pela fórmula seguinte: Fórmula 18

ou um derivado desta, a cadeia de açúcar, ou um derivado, pode ser produzida, por exemplo, usando MGAT4a como N-acetilglucosaminiltransferase na etapa (a) e β4GalT1 como galactosiltransferase na etapa (b).

Alternativamente, no caso de produção de uma cadeia de açúcar triantenária representada pela fórmula seguinte: Fórmula 19

ou um derivado desta, a cadeia de açúcar, ou um derivado, pode ser produzida, por exemplo, usando MGAT5 como N-acetilglucosaminiltransferase na etapa (a) e β4GalT1 como galactosiltransferase na etapa (b). As enzimas nessa combinação podem ser substituídas com as enzimas exemplificadas acima etc., para produzir a cadeia de açúcar de interesse.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a cadeia de açúcar biantenária complexa ligada ao N usada como a primeira cadeia de açúcar, ou um derivado desta, pode ser produzida pela etapa de: (b) reação da cadeia de açúcar biantenária agalacto representada pela fórmula descrita acima com UDP-Gal na presença de galactosiltransferase.

A galactosiltransferase é a mesma que na cadeia de açúcar tetra-antenária complexa ligada ao N.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a primeira cadeia de açúcar, ou um derivado desta, pode ser um composto que contém a cadeia de açúcar tetra-antenária complexa ligada ao N, ou um derivado desta, e que ainda contém fucose ou N-acetil-glucosamina adicionada a ela. Em um caso desse tipo, esse açúcar pode ser adicionado usando fucosiltransferase ou N-acetilglucosaminiltransferase.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a primeira cadeia de açúcar, ou um derivado desta, pode ser produzida por meio da reação de alongamento de cadeia de açúcar com a cadeia de açúcar biantenária agalacto descrita acima como um material de partida, ou também pode ser produzida por reação de alongamento de cadeia de açúcar necessária, por exemplo, com um glicopeptídeo derivado da gema do ovo de galinha que contém uma cadeia de açúcar biantenária agalacto ou cadeia de açúcar biantenária PA- agalacto (vendido por Takara Bio Inc.) como um material de partida.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a primeira cadeia de açúcar, ou um derivado desta, pode ser produzida por meio da reação de alongamento de cadeia de açúcar que envolve o isolamento e purificação de uma cadeia de açúcar, ou um derivado desta, como um produto da reação de alongamento da cadeia de açúcar após cada reação de alongamento de cadeia de açúcar; e depois utilização da cadeia de açúcar resultante, ou derivado desta, na reação de alongamento de cadeia de açúcar seguinte.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a reação de transferência de ácido siálico é realizada como reação de síntese em uma etapa subseqüente à reação de alongamento de cadeia de açúcar para produzir uma cadeia de açúcar sialilada em sua extremidade não redutora, ou um derivado desta.

No presente relatório descritivo, a síntese em uma etapa se refere a um método para a síntese do composto de interesse sem isolamento ou purificação de intermediários durante o processo que leva à síntese do composto de interesse. A reação de síntese em uma etapa para a produção da cadeia de açúcar de interesse pode ser realizada pelas etapas de: (a) reação de uma ou mais vezes de uma etapa de reação de um composto de material de partida com UDP-açúcar que serve como um substrato de glicosiltransferase na presença da glicosiltransferase; e (b) reação do produto da etapa (a) com ácido CMP- siálico na presença de sialiltransferase e fosfatase.

Nesse método, a reação da etapa (a) pode envolver, por exemplo, uma etapa de produção da cadeia de açúcar biantenária para tetra-antenária complexa ligada ao N descrita acima.

Na reação de síntese em uma etapa, antes do início da reação de transferência de açúcar da etapa (a) (ou cada reação de transferência de açúcar, no caso de realização de diversas reações de transferência de açúcar na etapa (a)) ou da reação de transferência de ácido siálico da etapa (b), como para a etapa (a), por exemplo, uma solução concentrada de glicosiltransferase e uma solução concentrada de UDP-açúcar que serve como um substrato desta são preparadas, e pequenas quantidades dessas soluções podem ser realizadas para realizar a reação.

Na reação de síntese em uma etapa, o tratamento térmico pode ser realizado após a reação de transferência de açúcar da etapa (a) (ou após cada reação de transferência de açúcar e antes do início da reação de transferência de açúcar seguinte, no caso de realização de diversas reações de transferência de açúcar na etapa (a)) para, dessa forma, interromper a reação de transferência de açúcar catalisada por glicosiltransferase no sistema de reação. Como resultado, o rendimento do produto de reação pode ser aumentado ainda mais. Além disso, esse tratamento térmico pode ser realizado após o término da etapa (b).

As condições para o tratamento térmico não são particularmente limitadas, desde que a enzima seja inativada sob as condições. O tratamento térmico pode ser realizado, por exemplo, por incubação por certo tempo em uma temperatura igual a ou maior do que 90°C. De preferência, o tratamento térmico pode ser realizado a aproximadamente 90°C a 100°C por aproximadamente 5 a 10 minutos. As condições do tratamento térmico podem ser alteradas adequadamente por aqueles habilitados na técnica.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a cadeia de açúcar assim produzida pode ser purificada por um método bem conhecido (por exemplo, HPLC). As condições da HPLC podem ser ajustadas, por exemplo, para as condições descritas nos Exemplos do presente relatório descritivo, ou podem ser alteradas adequadamente por aqueles habilitados na técnica de acordo com a estrutura da cadeia de açúcar.

Os termos no presente relatório descritivo são usados para ilustração de modalidades particulares, e não visam limitar a invenção.

O termo “que compreende”, usado no presente relatório descritivo, significa que os itens descritos (membros, etapas, fatores, números etc.) estão presentes, e a presença dos outros itens (membros, etapas, fatores, números etc.) não está excluída dele, a menos que o contexto evidentemente exija interpretação diferente.

Todos os termos (incluindo termos técnicos e termos científicos) aqui usados possuem os mesmos significados que aqueles compreendidos em um sentido amplo por aqueles habilitados na técnica à qual a presente invenção pertence, a menos que definido de forma diferente. Os termos aqui usados devem ser interpretados como tendo significados consistentes com os significados no presente relatório descritivo e campos técnicos relacionados, e não devem ser interpretados em um sentido idealizado ou excessivamente formal, a menos que definido de forma diferente.

As modalidades da presente invenção podem ser descritas com referência a um diagrama esquemático. No entanto, esse diagrama esquemático pode ser exagerado com o objetivo de melhor ilustração.

Termos como, por exemplo, “primeiro” ou “segundo”, são usados para expressar vários fatores. No entanto, subentende-se que esses fatores não estão limitados por esses termos. Esses termos são usados simplesmente para diferenciar um fator dos outros fatores. Por exemplo, o primeiro fator pode ser descrito como o segundo fator, e vice-versa, sem se afastar do escopo da presente invenção.

A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, a presente invenção pode ser exemplificada em vários aspectos. Dessa forma, a presente invenção não visa ser limitada aos Exemplos aqui descritos de forma alguma.

Exemplos (1) Expressão de ST6Gal-I

A seqüência de mRNA de ST6Gal-I humana está registrada sob o N° de Acesso X62822 com a base de dados pública GenBank. Sua seqüência de aminoácidos está registrada sob o N° de Acesso P15907 com o GenBank (ID. DE SEQ. N°:2) . Com base nessa seqüência de aminoácidos, o gene inteiro foi sintetizado adequadamente para o uso de códon de Ogataea minuta. O gene foi sintetizado de tal forma que ST6Gal-I humana fosse expressa em uma forma, exceto quanto aos 48 aminoácidos do terminal N, incluindo o domínio citoplasmático e a região transmembrana. O gene sintetizado foi flanqueado por sítios de enzima de restrição BamHI a fim de facilitar a introdução em um vetor de expressão. Sua seqüência é mostrada no ID. DE SEQ. N°: 1. A região que contém essa seqüência foi clivada com BamHI e depois introduzida no sítio de BamHI de um vetor de expressão de levedura de Ogataea minuta que utiliza metanol pOMEA1-10H3F para preparar pOMEA1-10H3F-ST6Gal-I. Esse plasmídeo pOMEA1- 10H3F-ST6Gal-I foi clivado com NotI. A seguir, uma cepa de Ogataea minuta TK-10-1-2 (Δoch1Δpep4Δprb1Δura3Δade1, WO 2003/091431) foi transformada com o fragmento resultante. A transformação foi realizada usando eletroporação. A cepa transformada foi inoculada em um meio SD-Ade (glicose 2%, base nitrogenada de levedura 0,17% sem aminoácidos (fabricada por Difco Laboratories, Inc.), uma mistura (20400 mg/l) de nucleobases, exceto adenina e aminoácidos) e cultivada a 30°C por 2 dias para obter transformantes. A integração cromossômica foi confirmada por PCR simples envolvendo a dissociação dos transformantes da placa e sua suspensão em uma solução de reação de PCR. O transformante obtido foi designado como uma cepa YTY-1.

A seguir, a fim de aumentar ainda mais os níveis de expressão, um gene acompanhante foi introduzido à cepa. Um vetor OnaP11007, que contém genes para a expressão constitutiva de OmPDI1, OmERO1 e OmKAR2 descritos no Pedido de Patente Japonesa N° 2009-539162, foi clivado com NotI, e YTY-1 foi transformada com o fragmento resultante. A transformação foi realizada usando eletroporação. A cepa transformada foi inoculada em um meio SD-Ura (glicose 2%, base nitrogenada de levedura 0,17% sem aminoácidos (fabricada por Difco Laboratories, Inc.), uma mistura (20400 mg/l) de nucleobases exceto uracil e aminoácidos) e cultivada a 30°C por 2 dias para obter transformantes. A integração cromossômica foi confirmada por PCR simples envolvendo a dissociação dos transformantes da placa e sua suspensão em uma solução de reação de PCR. O transformante obtido foi designado como uma cepa YTY-2.

A cepa YTY-2 obtida foi cultivada para expressar ST6Gal-I. Especificamente, a cepa foi inoculada a 5 ml de meio YPAD + KCl (polipeptona 2%, extratos de levedura 1%, glicose 2%, adenina (40 mg/l), 0,3 M de KCl) e pré- cultivada de um dia para o outro a 30°C. A seguir, 1 ml da solução pré-cultivada foi inoculado a 150 ml de meio YPAD + KCl e cultivado a 30°C por 48 horas. A cepa foi coletada, e depois ressuspensa em 100 ml de meio BMMY + casaminoácido 2% (extratos de levedura 1%, polipeptona 2%, base nitrogenada de levedura sem aminoácidos 1,34% (fabricada por Difco Laboratories, Inc.), 0,1 M de KPi (pH 6,0), casaminoácido 2%, metanol 0,5%), e cultivada a 20°C por 96 horas. Para essa cultura, metanol foi adicionado a cada 12 horas para obter a concentração de 0,5%. Após o término da cultura, a cepa foi removida por centrifugação para preparar a solução de enzima bruta.

A solução de enzima bruta foi dialisada contra um tampão SP (25 mM de acetato de sódio (pH 5,5), Triton X-100 0,1%) e depois aplicada a HiTrap SP HP (5 ml) equilibrada com um tampão SP. A coluna foi lavada com um tampão SP, seguido por eluição com um tampão SP contendo 1 M de NaCl. Uma fração que exibia atividade de ST6Gal-I foi coletada e dialisada contra um tampão de reação (25 mM de MOPS, pH 7,3) para preparar uma amostra parcialmente purificada.

A atividade enzimática foi testada da seguinte forma: 2 μl da solução de enzima bruta foram adicionados a 18 μl de uma solução de reação (0,1 M de MOPS (pH 7,3), 5 mM de CMP-Neu5Ac, 50 μM de PA-Lacto-N-neotetraose (LNnT-PA)) para iniciar a reação. A reação foi realizada a 37°C por 30 minutos e depois terminada por ebulição. A amostra foi analisada por HPLC. A coluna usada era Asahipak NH2P-50 (4,6 x 250 mm; Shodex, Showa Denko K.K.). A fase móvel usada foi 0,2 M de ácido trietilamina-acético (pH 7,0) (solução A) e acetonitrila (solução B). A coluna foi equilibrada com solução A:solução B = 30:70. Após injeção da amostra, a proporção de solução A:solução B foi alterada linearmente para 50:50 ao longo de 20 minutos para eluição de gradiente. Um detector de fluorescência (Ex: 315 nm, Em: 380 nm) foi usado para a detecção. O substrato LNnT-PA é eluído em 9 minutos, enquanto o produto de reação 6’- Sialil-LNnT-PA é eluído em 18,5 minutos. O produto de reação obtido foi quantificado pela área de pico para determinar a atividade (U). Nesse contexto, 1 U é definida como a quantidade da enzima que forma 1 μmol do produto de reação por 1 minuto.

(2) Preparação da cadeia de açúcar asialo tetra- antenária complexa

Um composto representado pela fórmula seguinte (daqui por diante denominado NA4-Fmoc) foi produzido como um tipo de cadeia de açúcar asialo tetra-antenária complexa derivada por um método mostrado abaixo: Fórmula 20

Um composto representado pela fórmula seguinte (daqui por diante denominado NGA2-Fmoc): Fórmula 21

ou seja, um composto no qual uma cadeia de açúcar biantenária agalacto complexa foi ligada à cadeia lateral de um resíduo de asparagina e o grupo amino do resíduo de asparagina foi modificado com Fmoc, foi usado como um substrato aceitador para reação de transferência de açúcar. 0,3 mU de MGAT4a e MGAT5 foram adicionados a 0,15 ml de solução de reação A (0,1 M de MOPS (pH 7,3), 40 mM de UDP-

GlcNAc, 6,7 mM de NGA2-Fmoc, 10 mM de MnCl2, 5 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA), 1 mM de PMSF), e a mistura foi reagida a 37°C por 16 horas. A mistura de reação resultante foi tratada por aquecimento a 100°C por 5 minutos para inativar a enzima. A essa solução, um volume equivalente de solução de reação B (0,1 M de MOPS (pH 7,3), 30 mM de UDP-Gal, 10 mM de MnCl2, 10 mg/ml de BSA, 8 mM de AMP), 0,15 ml, foi adicionado, e depois 5 mU de β4GalT1 foram adicionados, e a mistura foi reagida a 37°C por 16 horas. A mistura de reação resultante foi tratada por aquecimento a 100°C por 5 minutos para inativar a enzima.

A cadeia de açúcar (NA4-Fmoc) de interesse foi purificada da solução de reação obtida. A coluna usada foi Kromasil 100-5C18 (4,6 x 250 mm; Eka Chemicals Inc.). A fase móvel usada foi 25 mM de acetato de amônio (solução A) e acetonitrila (solução B). A coluna foi equilibrada com solução A:solução B = 82:18. Após injeção da amostra, a cadeia de açúcar foi coletada em 20 minutos. Um detector de fluorescência (Ex: 265 nm, Em: 315 nm) foi usado para a detecção. O substrato NGA2-Fmoc foi eluído como um pico único em 14 minutos, enquanto o produto de reação NA4-Fmoc foi eluído como um pico único em 8 minutos. A cadeia de açúcar do produto de reação foi coletada e usada como NA4- Fmoc em experimentos subseqüentes.

(3) Preparação de cadeia de açúcar tetra-antenária complexa α2,6-sialilada

Um composto representado pela fórmula seguinte (daqui por diante denominado (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc): Fórmula 22

foi preparado como um tipo de cadeia de açúcar tetra- antenária complexa α2,6-sialilada derivado da seguinte forma: solução de reação C (0,1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de MnCl2, Triton X-100 0,1%, 2 mM de CMP-Neu5Ac) contendo 50 μM NA4-Fmoc como um material de partida foi preparada. 160 μU de ST6Gal-I preparada no parágrafo (1) foram adicionados a 20 μl dessa solução de reação C, e a mistura foi reagida a 37°C por 24 horas. Após reação por 0 hora, 1 hora, 6 horas ou 24 horas, cada solução de reação foi analisada por HPLC. Os resultados são mostrados na Figura 1. A reação não progrediu completamente até mesmo após 24 horas, e uma cadeia de açúcar que possui 3 moléculas de ácido siálico (daqui por diante denominada (α2,6)trissialo-NA4-Fmoc; que é abreviada por “trissialo-” na Figura 1) foi detectada como um pico principal. Dessa forma, 160 μU de ST6Gal-I e 5 μl de CMP-Neu5Ac (concentração final: 2 mM) foram ainda adicionados à solução de reação para efetuar a reação. No entanto, o composto de interesse, ou seja, a cadeia de açúcar que possui 4 moléculas de ácido siálico ((α2,6)tetrassialo-NA4- Fmoc; que é abreviada por “tetrassialo-” na Figura 1) foi recuperado em uma taxa de aproximadamente 40%.

O pico que corresponde à cadeia de açúcar que possui 4 moléculas de ácido siálico foi coletado e usado como (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc em experimentos subseqüentes.

(4) Ensaio da atividade de degradação de ácido siálico de ST6Gal-I

Não foi observado nenhum aumento no rendimento do produto de reação com aumento na quantidade da enzima, o que sugere a possibilidade de degradação do produto de reação. Dessa forma, o experimento seguinte foi realizado a fim de avaliar se o produto de reação foi degradado.

Solução de reação D (0,1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de MnCl2, 0,1% Triton X-100) contendo 50 μmol da cadeia de açúcar (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc foi preparada. Cinco μl de 50 μU de ST6Gal-I foram adicionados a 5 μl da solução de reação D, e a mistura foi incubada a 37°C por 17 horas. Além disso, uma solução de reação suplementada com 50 μU de ST6Gal-I e 5 μl de CMP-Neu5Ac (concentração final: 2 mM) foi similarmente preparada. Além disso, uma solução de reação suplementada com 50 μU de ST6Gal-I e CMP-Neu5Ac (concentração final: 2 mM) tratada por aquecimento a 100°C por 5 minutos foi similarmente preparada. Essas soluções também foram similarmente incubadas a 37°C por 17 horas. Cada produto de reação foi aquecido a 100°C por 5 minutos e depois analisado por HPLC da mesma forma que no método mostrado no parágrafo (2). Os resultados são mostrados na Figura 2. A eliminação de ácido siálico foi observada raramente na ausência do doador de substrato CMP-Neu5Ac. Em contraste, aproximadamente 30% do (α2,6)tetrassialo-NA4- Fmoc foram convertidos em (α2,6)trissialo-NA4-Fmoc na presença de CMP-Neu5Ac, demonstrando a eliminação de ácido siálico. Além disso, a adição de CMP-Neu5Ac aquecido causou 58% de conversão em (α2,6)trissialo-NA4-Fmoc.

Em contraste, a adição de ST6Gal-I, como mostrado na Figura 3, não exibiu atividade de degradação sobre (α2,3)tetrassialo-NA4-Fmoc. A adição de α2,3- sialiltransferase ST3Gal-III não degradou (α2,3)tetrassialo-NA4-Fmoc. Isso sugeria que a eliminação de ácido siálico por ST6Gal-I era específica para ácido siálico ligado em α2,6.

(5) Estabilidade de CMP-Neu5Ac

A fim de confirmar se CMP era formado pela degradação do doador de substrato CMP-Neu5Ac, 5 mM de CMP-Neu5Ac/0,1 M de MOPS (pH 7,3) foram incubados a 25°C, 30°C, 33°C ou 37°C, e a quantidade de CMP formada foi medida. A medição foi realizada por HPLC usando uma coluna TSKgel SuperQ-5PW (7,5 x 75 mm; Tosoh Corp.) e 50 mM de KPi (pH 8,0) como um solvente. Um detector UV (detecção comprimento de onda: 254 nm) foi usado para a detecção. O grau de formação de CMP foi indicado por [Área de pico de CMP] / [Área de pico de CMP + Área de pico de CMP-Neu5Ac] x 100 (%). Os resultados são mostrados na Figura 4. Após 24 horas, 45% de CMP foram formados a 37°C, enquanto 21% de CMP foram formados a 30°C, o que era aproximadamente metade daquele formado a 37°C. Isso sugeria que a reação de ST6Gal-I em uma temperatura menor era capaz de suprimir a atividade de degradação de ácido siálico CMP-dependente.

A seguir, a fim de avaliar a taxa de formação da cadeia de açúcar tetra-antenária complexa α2,6-sialilada, solução de reação E (0,1 M de MOPS (pH 7,3), 5 mM de MnCl2, 5 mg/ml de albumina sérica bovina, 5 mM de CMP-Neu5Ac) contendo 50 μM NA4-Fmoc foi preparada. Cem μU de ST6Gal-I preparada no parágrafo (1) foram adicionados a 10 μl da solução de reação E, e a mistura foi reagida a 10°C, 20°C, 25°C, 30°C ou 37°C por 24 horas. Como mostrado na Figura 5, o rendimento da cadeia de açúcar (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc de interesse era elevado após reação por 24 horas a 25°C e 30°C. Isso sugeria que a reação a 25°C até 30°C que caia fora da temperatura ótima para sialiltransferase era preferida para aumento do rendimento de (α2,6)tetrassialo- NA4-Fmoc.

(6) Estabelecimento do método para supressão da degradação de cadeia de açúcar tetra-antenária complexa α2,6-sialilada ((α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc)

Como CMP é formado não somente pela degradação do doador de substrato CMP-Neu5Ac, mas como um subproduto da reação de síntese, foi feita uma tentativa de degradar esse CMP para, dessa forma, suprimir a reação de eliminação de ácido siálico por sialiltransferase. A solução de reação E (0,1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de MnCl2, Triton X-100 0,1%) contendo 25 μmol de (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc e 2,5 nmol de CMP foi preparada. Vinte e cinco μU de ST6Gal-I foram adicionados a 10 μl dessa solução de reação E, e a mistura foi incubada a 37°C por 17 horas. Além disso, uma solução de reação suplementada com 25 μU de ST6Gal-I e 50 μU de fosfatase alcalina derivada de E. coli (BAP) (Takara Bio Inc.) foi similarmente preparada e incubada da mesma forma que acima. Cada produto de reação foi aquecido a 100°C por 5 minutos e depois analisado pelo método mostrado no parágrafo (3). Os resultados são mostrados na Figura 6.

Após 24 horas, aproximadamente 70% do (α2,6)tetrassialo- NA4-Fmoc foram convertidos em (α2,6)trissialo-NA4-Fmoc na presença de CMP, demonstrando a eliminação de ácido siálico. Em contraste, a degradação de (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc foi raramente observada na presença de fosfatase alcalina derivada de E. coli (BAP). Isso demonstrou que CMP pode ser degradado por fosfatase em ácido 5’-citidílico para, dessa forma, suprimir a atividade de eliminação de ácido siálico de ST6Gal-I sobre a cadeia de açúcar tetrassialo.

(7) Estabelecimento do método para síntese em uma etapa da cadeia de açúcar tetra-antenária complexa α2,6- sialilada

Cento e cinqüenta μl de solução de reação F (0,1 M de MOPS (pH 7,3), 40 mM de UDP-GlcNAc (6 μmol), 6,7 mM de NGA2-Fmoc (1 μmol), 0,3 mU de MGAT4a, 0,3 mU de MGAT5, 5 mg/ml de BSA, 1 mM de PMSF) foram preparados e reagidos a 37°C por 16 horas. A reação foi terminada por incubação a 100°C por 5 minutos. A seguir, 250 μl de solução de reação G (0,1 M de MOPS (pH 7,3), 24 mM de UDP-Gal (6 μmol), 4,8 mU de β4GalT1, 8 mM de MnCl2, 5 mg/ml de BSA, 4 mM de AMP) foram adicionados à solução de reação F, e a mistura foi reagida a 37°C por 16 horas. A reação foi terminada por incubação a 100°C por 5 minutos, seguida por secagem sob pressão reduzida. Duzentos e cinqüenta μl de solução de reação H (40 mM de CMP-Neu5Ac (10 μmol), 3 mU de ST6Gal-I, 15 mU de BAP) foram adicionados a esse tubo e regidos a 30°C por 16 horas. Cinco μl de CMP-Neu5Ac (20 mM de CMP- Neu5Ac) foram ainda adicionados a ela e reagidos a 30°C por 16 horas. A mistura de reação resultante foi tratada por aquecimento a 100°C por 5 minutos para terminar a reação.

Um gráfico de fluxo dessa série de procedimentos de reação de síntese em uma etapa é mostrado na Figura 7. A reação de glicosilação nessa série de procedimentos de reação de síntese em uma etapa é mostrada esquematicamente na Figura 8 usando uma fórmula estrutural.

O material de partida para a reação e o produto de reação foram analisados por HPLC para quantificar (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc. Para as condições de análise por HPLC, a coluna usada foi Amido-80 (3 μm, 4,6 x 150 mm; Tosoh Corp.); a fase móvel usada foi acetonitrila (solução A) e 0,2 M de TEAA (pH 7,0) (solução B); e a coluna foi equilibrada com solução A:solução B = 75:25. Após injeção da amostra, a cadeia de açúcar foi coletada em 35 minutos. Um detector de fluorescência (Ex: 265 nm, Em: 315 nm) foi usado para a detecção. Os resultados são mostrados na Figura 9. O material de partida NGA2-Fmoc para a reação foi eluído como um pico único em aproximadamente 16 minutos, enquanto o produto de reação (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc foi eluído como um pico único em aproximadamente 30 minutos. A área de pico do (α2,6)tetrassialo-NA4-Fmoc obtido foi de 90% com relação à área de pico do material de partida NGA2- Fmoc para a reação, o que demonstra que a cadeia de açúcar de interesse pode ser sintetizada em rendimentos muito elevados por síntese em uma etapa.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

O método da presente invenção pode produzir mais eficientemente uma cadeia de açúcar que contém ácido siálico usando sialiltransferase do que em qualquer época anterior. Particularmente, o método da presente invenção pode produzir eficientemente uma cadeia de açúcar triantenária ou tetra-antenária complexa que contém ácido siálico na qual ácido siálico está ligado a cada uma de todas as extremidades não redutoras das antenas, ou um derivado desta, o que previamente era difícil de produzir. Além disso, o método de produção da presente invenção pode obter produção conveniente em rendimentos elevados por meio da reação de síntese em uma etapa e pode até mesmo obter produção de quantidades dessas cadeias de açúcar (particularmente, cadeias de açúcar tetra-antenárias complexas (α2,6)tetrassialo etc.), o que previamente era difícil de se obter. Essas cadeias de açúcar podem ser usadas como cadeias de açúcar que possuem uma nova função ou como um tipo de cadeia de açúcar em fármacos como, por exemplo, glicoproteínas, padrões para instrumentos analíticos, reagentes científicos e arranjos de cadeia de açúcar.

Claims

1. Método para produção de uma segunda cadeia de açúcar sialilada, ou a referida segunda cadeia de açúcar sialilada contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, caracterizado por compreender: reação de uma primeira cadeia de açúcar ou a referida primeira cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, com ácido CMP-siálico na presença de sialiltransferase e fosfatase a uma temperatura menor do que 37 ° C, por 8 a 48 horas, para transferir ácido siálico para uma extremidade não redutora da primeira cadeia de açúcar, ou a referida primeira cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, em que a referida sialiltransferase apresenta a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira cadeia de açúcar ou a referida primeira cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, é uma cadeia de açúcar triantenária ou tetra- antenária complexa ligada ao N, ou a referida cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira cadeia de açúcar ou a referida primeira cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, é um composto representado pela fórmula seguinte: Fórmula 1

ou o referido composto contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda cadeia de açúcar sialilada, ou uma segunda cadeia de açúcar sialilada contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, é uma cadeia de açúcar triantenária ou tetra-antenária complexa ligada ao N, em que a cadeia de açúcar é um composto que possui ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras, ou o referido composto contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda cadeia de açúcar sialilada, ou uma segunda cadeia de açúcar sialilada contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora é um composto representado pela fórmula seguinte: Fórmula 2

6. Método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada, ou a referida cadeia de açúcar sialilada contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) realização de uma ou mais vezes de uma etapa de reação de uma cadeia de açúcar representada pela fórmula seguinte:

ou a referida cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, com UDP-açúcar que serve como um substrato de glicosiltransferase na presença da glicosiltransferase; e (b) reação do produto da etapa (a) com ácido CMP- siálico na presença de sialiltransferase e fosfatase a uma temperatura menor do que 37 °C, por 8 a 48 horas; em que a referida sialiltransferase apresenta a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

7. Método para produção de uma cadeia de açúcar sialilada em sua extremidade não redutora ou a referida cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) reação de uma cadeia de açúcar biantenária agalacto complexa ou a referida cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora, com UDP-GlcNAc na presença de MGAT4 e MGAT5; (b) reação do produto da etapa (a) com UDP-Gal na presença de β4GalT1; e (c) reação do produto da etapa (b) com ácido CMP- siálico na presença de sialiltransferase e fosfatase a uma temperatura menor do que 37 °C, por 8 a 48 horas; em que a referida sialiltransferase apresenta a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sialiltransferase é α2,6-sialiltransferase.

9. Método, reivindicações 1 de acordo com qualquer pelo fato uma de das a 7, caracterizado que a sialiltransferase é sialiltransferase derivada de humano.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sialiltransferase

11. Método, é ST6Gal-I. de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o ácido CMP-siálico

12. Método, é CMP-Neu5Ac. de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a fosfatase é fosfatase alcalina.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a fosfatase é fosfatase alcalina derivada de E. coli.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser para produzir um composto tendo ácido siálico em cada uma das extremidades não redutoras de uma cadeia de açúcar tetra- antenária complexa ligada ao N, ou a referida cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser para produzir um composto tendo um ácido siálico ligado em α-2,6 em cada uma das extremidades não redutoras de uma cadeia de açúcar tetra-antenária complexa ligada ao N, ou a referida cadeia de açúcar contendo um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um vinculador, um grupo fluorescente, um lipídeo, um composto de baixo peso molecular ou um composto radioativo na extremidade redutora.

16. Método, de acordo com qualquer uma das 5 reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser para produzir um composto representado pela fórmula seguinte: Fórmula 5