BR112013021780A2 - processo para a conjugação de um antígeno - Google Patents

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Abstract

PROCESSO PARA A CONJUGAÇÃO DE UM ANTÍGENO A presente invenção fornece um processo para a conjugação de um antígeno que compreende as etapas de a) ativar o antígeno para formar um antígeno ativado; b) reagir o antígeno ativado e uma proteína carreadora ou um ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora ou o ligante e c) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetóxi-boroidreto para formar um antígeno conjugado ou um ligante de antígeno e opcionalmente d) reagir o ligante de antígeno com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado; opcionalmente em que o antígeno se origina de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Salmonella Vi ou Staphylococcus epidermidis, opcionalmente ainda compreendendo uma etapa a') de liofilizar o antígeno ativado e uma proteína carreadora seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF.

Description

“PROCESSO PARA A CONJUGAÇÃO DE UM ANTÍGENO”
DESCRIÇÃO A presente invenção se refere a um processo de conjugação, em particular pela aminação redutiva usando a redução do agente — triacetoxiboroidreto de sódio. A presente invenção também fornece um processo para fabricar uma composição farmacêutica que compreende um conjugado da invenção.
FUNDAMENTOS Crianças menores de 2 anos de idade não preparar uma resposta imune à maioria das vacinas de polissacarídeos, de modo que foi necessários to render os polissacarídeos imunogênicos pela conjugação química a um carregador de proteína. A ligação do polissacarídeo, um antígeno independente de T, a uma proteína, um antígeno dependente de T, confere nos polissacarídeos as propriedades de dependência de T incluindo mudança de isotipo, maturação por afinidade e indução de memória.
Streptococcus pneumoniae é uma bactéria de Gram-positivo responsável por morbidez e mortalidade consideráveis (particularmente nos jovens e idosos), causando doenças invasivas, tais como pneumonia, bacteremia e meningite e doenças associadas com a colonização, tais como Otite média aguda. A taxa de pneumonia pneumocócica nos EUA para pessoas com mais de 60 anos de idade é estimado ser de 3 a 8 por 100.000. Em 20 % dos casos, isto leva à bacteremia e outras manifestações, tais como meningite, com uma taxa de mortalidade próxima a 30 % mesmo com tratamento antibiótico.
O Pneumococco é encapsulado com um polissacarídeo quimicamente ligado que confere especificidade de sorotipo. Existem 90 sorotipos conhecidos de pneumococos e a cápsula é o determinante de virulência principal para pneumococos, quando a cápsula não apenas protege a superfície interna das bactérias a partir do complemento, mas é, por si só,
deficientemente — imunogênico. — Os —polissacarídeos são antígenos independentes de T e não podem ser processados ou apresentados em moléculas de MHC para interagir com as células T. Estes podem, entretanto, estimular o sistema imune através de um mecanismo alternativo que envolve —areticulação de receptores de superfície em células B.
Foi mostrado em diversos experimentos que a proteção contra a doença pneumocócica invasiva está correlacionada mais fortemente com o anticorpo específico para a cápsula e a proteção é específica de sorotipo.
O Streptococcus pneumoniae é a causa mais comum de doença — bacteriana invasiva e otite média em crianças. Da mesma maneira, a idade avançada aumenta as respostas deficientes às vacinas pneumocócicas [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], em consequência, a incidência aumentada de pneumonia bacteriana nesta população [Verghese and Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].
A conjugação de sacarídeos de Streptococcus pneumoniae usando fons de cianoboroidreto é conhecida, por exemplo, WO87/06838. Entretanto, os fons de cianoboroidreto têm desvantagens centrais incluindo um tempo de reação relativamente lento e a contaminação possível do produto com cianeto (Ahmed F. et al J.Org.Chem., 1996, 61:3849-3862). O tempo de reação lenta usando este reagente foi indicado no EPI035137 que descreve uma tentativa para melhorar o tempo de reação deste processo de conjugação através do uso de radiação de micro-ondas.
Ahmed et al descreveram a aminação redutiva de aldeídos e cetonas com triacetoxiboroidreto de sódio (NaBH(OAc)3) (J. Org. Chem., 1996, 61:3849-3862). Similarmente, a aminação redutiva de carboidratos usando NaBH(OAc); foi descrita por Dalpathado et al (Anal. Bioanal. Chem (2005) 281:130-1137).
Consequentemente, a presente invenção fornece um processo melhorado para a conjugação de um antígeno pela aminação redutiva usando ânions de triacetoxiboroidreto (BH(OA)3) no agente redutor. Os inventores descobriram que estes agente redutor é adequado para o uso de sacarídeos bacterianos conjugados para as proteínas carreadoras; em particular, este é mais rápido do que a reação equivalente usando íons de cianoboroidreto e não — produz subprodutos tóxicos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Em um primeiro aspecto da invenção é fornecido um processo para a conjugação de um antígeno que compreende as etapas de a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b) reagiro antígeno ativado e uma proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado; ou a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b) reagir o antígeno ativado e um ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado ao ligante; c) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno-ligante e d) reagiro antígeno-ligante com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado; em que o antígeno se origina de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Salmonella Vi ou Staphylococcus epidermidis. Em um segundo aspecto da invenção é fornecido um processo para a conjugação de um antígeno que compreende as etapas de a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; a') liofilisar o antígeno ativado e uma proteína carreadora seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF; b) reagiro antígeno ativado e a proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado; ou a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; a") liofilisar o antígeno ativado e um ligante seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF; b)) reagir o antígeno ativado e o ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno- ligante; d) reagir o antígeno-ligante com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado.
Em um terceiro aspecto da invenção é fornecido uma composição imunogênica que compreende o antígeno conjugado misturado com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em um quarto aspecto da invenção é fornecido uma composição imunogênica obtenível pelo processo da invenção.
Em um quinto aspecto da invenção é fornecido uma composição imunogênica obtido pelo processo da invenção.
Em um sexto aspecto da invenção é fornecido uma vacina que compreende a composição imunogênica da invenção. Em um sétimo aspecto da invenção é fornecido um uso da composição imunogênica ou a vacina da invenção na prevenção ou tratamento de doença, por exemplo, doença bacteriana.
Em um oitavo aspecto da invenção é fornecido um uso da composição imunogênica ou a vacina da invenção na prevenção ou tratamento 5 — da doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócica, doença estafilocócica, doença enterocócica e Salmonella.
Em um nono aspecto da invenção é fornecido um uso da composição imunogênica da invenção ou a vacina da invenção na preparação deum medicamento para a prevenção ou tratamento de doença, por exemplo, doença bacteriana.
Em um décimo aspecto da invenção é fornecido um uso da composição imunogênica da invenção ou a vacina da invenção na preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento da doença selecionada da doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócica, doença estafilocócica, doença enterocócica e Salmonella.
Em um décimo primeiro aspecto da invenção é fornecido um método para prevenir ou tratar infecção, por exemplo, infecção bacteriana que — compreende administrar a composição imunogênica da invenção ou a vacina da invenção a um paciente.
Em um décimo segundo aspecto da invenção é fornecido um método para prevenir ou tratar uma doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócicay doença estafilocócica,y doença enterocócica e Salmonella que compreende administrar a composição imunogênica da invenção ou a vacina da invenção a um paciente.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. O tamanho de polissacarídeos 23F e 6B seguindo o tratamento com periodato. A linha marcada com triângulos mostra o tamanho de 6B em tampão de fosfato 10 mM, a linha marcada com diamantes mostra o tamanho de 23F em tampão de fosfato 10 mM e a linha marcada com quadrados mostra o tamanho de 23F em 100 mM de tampão de fosfato.
Figura 2. Comparação da imunogenicidade de conjugados de 23F usando CDAP ou conjugação de aminação redutiva. O gráfico a) descreve os resultados de um ensaio de ELISA. Gráfico b) descreve os resultados de um ensaio de opsonofagocitose.
Figura 3. Avaliação da imunogenicidade de PSO6B-CRM — conjugado usando os métodos de conjugação descritos no exemplo 4 em um modelo de camundongo Balb/c.
Figura 4. Avaliação da imunogenicidade de PSO6B-CRM conjugado usando os métodos de conjugação descritos no exemplo 4 em um modelo de porquinho da índia.
15º DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção se refere a um processo melhorado para conjugar um antígeno a uma proteína carreadora. Em particular, a invenção fornece um processo para conjugar um antígeno que compreende as etapas de a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b) reagiro antígeno ativado e uma proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado; ou a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b) reagir o antígeno ativado e um ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado ao ligante; c) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno-ligante e d) reagiro antígeno-ligante com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado; em que o antígeno se origina de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Salmonella Vi ou Staphylococcus epidermidis. Em uma forma de realização, o processo da invenção compreende as etapas a), b) ec).
A invenção ainda fornece um processo para a conjugação de um antígeno que compreende as etapas de a) ativar o antígeno para formar um antígeno ativado; a”) liofilisar o antígeno ativado e uma proteína carreadora seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF; b) reagiro antígeno ativado e a proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado; ou a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; a) liofilisar o antígeno ativado e um ligante seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF; b) reagir o antígeno ativado e o ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno- ligante;
d) reagiro antígeno-ligante com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado.
Em uma forma de realização adicional, o processo da invenção compreende as etapas a), a), bj ec).
Para os propósitos da invenção, o termo “ativar o antígeno se refere a qualquer processo que introduz grupos carbonila no antígeno, este processo pode incluir a oxidação, por exemplo, oxidação com periodato, hidrólise ácida ou tratamento químico. Para os propósitos da invenção, o termo “antígeno ativado se refere a um antígeno que foi alterado pelo — processo de “ativar o antígeno”.
A Etapa b) ou b”) podem ocorrer por intermédio do seguinte esquema de reação: R-CHO +H/N-R' — R-CH=NH-R' em que R-CHO é o antígeno e HN-R' é uma proteína carreadora.
A Etapa c) ou c') pode ocorrer por intermédio do seguinte esquema de reação: R-CH=NH-R' — R-CH;-NH-R'.
Um agente redutor é um agente que é capaz de reduzir um grupo imina, preferivelmente, o agente redutor reduz os grupos iminas em preferência aos grupos aldeído. Os agentes redutores da invenção compreende a porção de triacetoxiboroidreto (BH(OAc)3), por exemplo, agentes redutores da invenção pode compreender triacetoxiboroidreto de sódio (NaBH(OAc);3) ou triacetoxiboroidreto de potássio (KBH(OAc);3,. Preferivelmente, o agente redutor não contém uma porção de cianoboroidreto, preferivelmente o agente redutor não compreende cianoboroidreto de sódio.
Para os propósitos da invenção, o termo “antígeno conjugado” indica um antígeno covalentemente ligado a uma proteína carreadora.
A liofilização do antígeno ativado e a proteína carreadora pode se referir à coliofilização, isto é, misturando-se o antígeno ativado e a proteína carreadora junto e liofilização destes no mesmo recipiente ou este pode se referir à liofilização do antígeno ativado e a proteína carreadora separadamente e combinando-os juntos após a liofilização.
Em uma forma de realização, o antígeno é um sacarídeo bacteriano. Em uma forma de realização adicional o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano.
O termo “sacarídeo” por todo este relatório descritivo pode indicar polissacarídeo, oligossacarídeo ou ácido tecóico e inclui todos os três.
Este pode indicar lipopolissacarídeo (LPS) ou lipooligossacarídeo (LOS).
Antes do uso, os polissacarídeos podem ser isolados de uma cepa fonte ou isolado da cepa fonte e dimensionado a algum grau por métodos conhecidos (ver, por exemplo, EP497524 e EP497525; Shousun Chen Szu et al. - Carbohydrate Research Vol 152 p7-20 (1986)) por exemplo, por microfluidização. Os oligossacarídeos têm um número baixo de unidades de repetição (tipicamente de 5 a 30 unidades de repetição).
Em uma forma de realização, o sacarídeo bacteriano se origina de S. pneumoniae, H. influenzae, N, meningitidis, S. aureus, E. faecalis, E.
faecium, Salmonella Vi ou S. epidermidis. Em uma forma de realização — adicional, o sacarídeo bacteriano se origina de S. pneumoniae, H. Influenzae ou N. meningitidis. Em uma forma de realização adicional, o sacarídeo bacteriano se origina de S. pneumoniae. Em uma forma de realização adicional o sacarídeo bacteriano se origina de H. influenzae. Em uma forma de realização adicional o sacarídeo bacteriano é a sacarídeo capsular — bacteriano selecionado de uma lista que consiste de: N. meningitidis sorogrupo A (MenA), B (MenB), C (MenC), W135 (MenW) ou Y (MenY), Estreptococos grupo B grupo Ia, Ib, II, II, IV, V, VI ou VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (Vi sacarídeo), Vibrio cholerae, H. influenzae tipo b e de Streptococcus pneumoniae sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F ou 33F.
Em uma forma de realização adicional, o sacarídeo capsular bacteriano é de um sorotipo de S. pneumoniae selecionado do grupo que consiste de 5, 6B, 6A, 7F, 9V, 14, 19F e 23F. Em uma forma de realização, o sacarídeo capsular bacteriano é sacarídeo capsular de S. pneumoniae 23F. Em uma forma de realização o sacarídeo capsular bacteriano é sacarídeo capsular de S. pneumoniae 6B. Em uma forma de realização o sacarídeo capsular bacteriano é sacarídeo capsular de S. pneumoniae 6A.
Em uma forma de realização adicional, o sacarídeo bacteriano é polissacarídeo ou oligossacarídeo de Haemophilus influenzae b (Hib).
Em uma forma de realização o antígeno é um proteína ou um fragmento de uma proteína. Em uma forma de realização a proteína ou fragmento da proteína se origina de S. pneumoniae, H. influenzae, N, meningitidis, S. aureus, E. faecalis, E. faecium, Salmonella Vi ou S. epidermidis. Em uma forma de realização adicional, a proteína ou fragmento de uma proteína se origina de S. pneumoniae, H. Influenzae ou N. meningitidis.
O termo “proteína carreadora” é pretendido abranger tanto os — peptídeos pequenos quanto os polipeptídeos grandes (>10 kDa). A proteína carreadora pode ser qualquer peptídeo ou proteína. Este pode compreender um ou mais epítopos auxiliadores T. A proteína carreadora pode ser toxóide do tétano (TT), toxóide do tétano fragmento C, mutantes não tóxicos de toxina de tétano [observe que todas as tais variantes de TT são consideradas serem o mesmo tipo de proteína carreadora para os propósitos desta invenção], toxóide da difteria (DT), CRM197, outros mutantes não tóxicos de toxina de difteria [tals como CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973), CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls and
Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; anulação ou mutação de Glu-148 a Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações descritos em US 4709017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos de Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outrasmutações descritos em US 5917017 ou US 6455673 ou fragmentos descritos em US 5843711] (observe que todas as tais variantes de DT são consideradas serem do mesmo tipo de proteína carreadora para os propósitos desta invenção), pneumolisina pneumocócica (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), OMPC (proteína da membrana externa meningocócica — usualmente extraída de N. meningitidis sorogrupo B - EP0372501), peptídeos sintéticos (EP0378881, EP0427347), proteínas de choque por calor (WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas da coqueluche (WO 98/58668, EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores de desenvolvimento ou hormônios (WO 91/01146), proteínas artificiais que compreendem epítopos de célula CD4+T humana múltipla de vários patógenos derivados de antígenos (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) tais como proteína N19 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7) proteína de superfície pneumocócica PspA (WO 02/091998), proteínas de absorção de ferro (WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (WO 00/61761), proteína D de H. influenzae —(EPS594610e WO 00/56360), PhtA pneumocócico (WO 98/18930, também referido a Sp36), PhtD pneumocócico (descritos em WO 00/37105, e também é referido ao Sp036D), pneumocócico PhtB (descritos em WO 00/37105, e também é referido a Sp036B) ou PhtE (descritos em WO 00/30299 e é referido como BVH-3).
Em uma forma de realização da invenção, a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste de: toxóide do tétano (TT), fragmento C de toxóide do tétano, toxóide da difteria (DT), CRM197, Pneumolisina (Ply), proteína D, PhtD, PhtDE e NI9. Em uma forma de realização adicional a proteína carreadora é CRM197. Ainda, em uma forma de realização adicional a proteína carreadora é toxóide do tétano.
Em uma forma de realização, o antígeno é conjugado diretamente à proteína carreadora.
Em uma forma de realização adicional o antígeno é conjugado à proteína carreadora por intermédio da adição de um ligante hetero- ou homo-bifuncional usando a química da invenção.
Uma extremidade do ligante reagirá com o antígeno ativado por aminação redutiva, entretanto, a outra extremidade do ligante pode reagir com a proteína carreadora usando qualquer tipo de química.
Por esta razão, o ligante conterá pelo menos um grupo amino reativo, se o ligante for homo-bifuncional este conterá dois grupos amino reativos, se o ligante for hetero-bifuncional este conterá um grupo amino reativo e um grupo reativo diferente, em uma forma de realização este segundo grupo reativo é um grupo carbonila reativo.
Em uma forma de realização, o ligante está entre 1 e 20 Angstroms de comprimento.
Em uma forma de realização adicional o ligante tem entre 4 e 20,4e120u5el10 átomos de carbono.
Um ligante possível é di-hidrazida de ácido adípico (ADH). Outros ligantes incluem B-propionamido (WO 00/10599), nitrofenil-etilamina (Gever et al (1979) Med.
Microbiol.
Immunol. 165; 171-288), haletos de haloalquila (US4057685), ligações glicosídicas (US4673574, US4808700), hexano diamina e ácido 6-aminocapróico —(US4459286). Em geral, os seguintes tipos de grupos químicos em uma proteína carreadora podem ser usados para a ligação/conjugação como o segundo grupo reativo: A) Carboxila (por exemplo, por intermédio de ácido aspártico —ouácido glutâmico). Em uma forma de realização, este grupo é ligado a um grupo amino em um ligante com química de carbodiimida, por exemplo, com EDAC (1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida)). Nota: em vez do EDAC acima, qualquer carbodiimida adequada pode ser usada.
B) Grupo amino (por exemplo, por intermédio de lisina). Em uma forma de realização, este grupo é ligado a um grupo carboxila em um ligante com química de carbodiimida, por exemplo, com EDAC. Em uma outra forma de realização, este grupo é ligado aos ligantes tendo grupos — hidroxilaclivados com CDAP ou CNBr ou um grupo carbonila ou um grupo de éster succinimídico.
OC) Sulfidrila (por exemplo, por intermédio de cisteína). Em uma forma de realização, este grupo é ligado a um ligante de bromo ou cloro acetilado ou a um ligante tendo grupos maleimida.
D) A proteína pode ser modificada para conter um grupo azida ou alquinila, esta pode ser conjugada ao ligante usando o a química “clique (descrito em Tetrahedron letters (Junho de 2005) 46:4479-4482).
Em uma forma de realização, as etapas b) e c) ou ') e c”) ocorrem de maneira simultânea.
Em uma forma de realização adicional, a etapa c) e/ou a etapa c”) e/ou a etapa b) e/ou a etapa b') é realizada na presença de um solvente não aquoso. Em uma forma de realização adicional, a etapa c) e/ou a etapa c”) e/ou a etapa b) e/ou a etapa b) é realizada em solvente que é essencialmente isento de água. Por exemplo, a reação pode acontecer na presença de sulfóxido de dimetila (DMSO) ou dimetilformamida (DMF). Em uma forma de realização, a etapa c) e/ou a etapa c”) e/ou a etapa b) e/ou a etapa b”) acontecem em uma solução que consiste essencialmente de DMSO ou DMF. Se a proteína carreadora e o antígeno ativado forem liofilizados, DMSO ou DMF podem ser usados para reconstituir a proteína carreadora e o antígeno ativado.
Em uma forma de realização, a etapa c) e/ou a etapa c”) acontece em menos do que 30 horas, menos do que 25 horas, menos do que 20 horas, menos do que 19 horas, menos do que 18 horas ou menos do que 17 horas.
Em uma forma de realização, a etapa c) e/ou a etapa e c”) acontece entre 15 minutos e 30 horas, entre 10 horas e 25 horas, entre 8 horas e 20 horas, entre 10 horas e 20 horas ou entre 14 horas e 19 horas. Em uma forma de realização adicional, a etapa c) e/ou a etapa c”) acontece em torno de 16 horas.
Em uma forma de realização, a etapa c) e/ou c) não resulta na produção de fons de cianeto. Por exemplo, aminação redutiva usando um agente redutor que compreende um cianoboroidreto na produção de íons de cianeto; estes podem ser tóxicos se usados na vacinação.
Em uma forma de realização, o antígeno e a proteína carreadora são misturados juntos antes da etapa b). Este pode ocorrer durante a etapa a), em geral, entretanto, a proteína carreadora e o antígeno serão misturados juntos após a etapa a).
Em uma forma de realização, o antígeno e a proteína —carreadora são liofilizados antes da etapa b), preferivelmente isto ocorre após a etapa a). Em uma forma de realização, o antígeno ativado é liofilizado após a etapa a), a proteína carreadora também é liofilizada e o antígeno ativado e a proteína carreadora são reconstituídos na mesma solução, este atua como mistura do antígeno e da proteína carreadora juntos.
Em uma forma de realização, a liofilização acontece na presença de um açúcar não redutor, os açúcares não redutores possíveis incluem sacarose, lactose, trealose, rafinose, estaquiose, melezitose, dextrano, manitol, lactitol e palatinit. Em uma forma de realização, o açúcar é selecionado do grupo que consiste de sacarose, trealose e manitol.
Em uma forma de realização entre 0,2 e 5, entre 0,5 e 3 ou entre 0,9 e 2,6, entre 0,5 e 0,8, entre 0,2 e 1,0, entre 2 e 3 ou entre 1 e 4 equivalentes molares do agente de redução é usado na etapa c) ou c). Para os propósitos da invenção usando um 1 equivalente molar de agente de redução corresponde ao uso de um mol de agente de redução por um mol de unidades de repetição de sacarídeo. Em uma forma de realização adicional em torno de 2,5 equivalentes molares ou entre 1 e 3 equivalentes molares de agente de reação é usado na etapa c) ou etapa c”). Em uma forma de realização, a razão de proteína carreadora: antígeno antes da etapa c) e/ou c”) está entre 0,4:1 e 2:1. Em uma forma de realização, a razão de proteína carreadora: antígeno antes da etapa c) ou c”) está entre 1:1 e 2:1. Em uma forma de realização adicional a razão de proteína carreadora: antígeno antes da etapa c) e/ou c) para PS23F ou PS6B está entre 1:1 e 2:1, entre 0,4/1 e 2,5/1, entre 2,0/1 e 2,5/1 ou entre 0,2/1 e 1,5/1. Em uma forma de realização a razão de proteína carreadora: antígeno após a etapa c) e/ou c') está entre 0,8:1 e 3,5:1. Em uma forma de realização adicional a razão de proteína carreadora: antígeno após a etapa c) e/ou c”) está entre 1,3:1 e 27:1. Em uma forma de realização adicional, a razão de proteína carreadora: antígeno após a etapa c) e/ou c”) está entre 1:1 e 1,5:1.
No final da etapa c) ou c”) estes podem ser grupos carbonila não reagidas que permanecem no antígeno conjugados, estes podem ser cobertos com um agente de cobertura adequado. Em uma forma de realização, este agente de cobertura é boroidreto de sódio (NaBHy), por exemplo, o produto da etapa c) ou c) podem ser reagidos com boroidreto de sódio por 15 minutos-15 horas, 15 minutos-45 minutos, 2 a 10 horas ou 3,5 horas, em torno de 30 minutos ou em torno de 4 horas. Em uma forma de realização adicional, a cobertura é atingida pela mistura do produto da etapa c) com 1 a 10 equivalentes molares, entre 1 e 5, entre 1,5 e 2,5 ou em torno de 2 equivalentes molares de NaBH,.
Em uma forma de realização, a etapa a) compreende reagir o antígeno com periodato. O termo “periodato' inclui tanto periodato quanto ácido periódico. Este termo também inclui tanto metaperiodato (IO) quanto ortoperiodato (105”), entretanto em uma forma de realização particular, o periodato usado no método da invenção é metaperiodato. O termo “periodato”
também inclui os vários sais de periodato incluindo periodato de sódio e periodato de potássio.
Em uma forma de realização, o periodato usado é metaperiodato de sódio.
Quando um antígeno reage com periodato, o periodato oxida os grupos hidroxila vicinais para formar grupos carbonila ou —aldeídoe causa a clivagem de uma ligação C-C.
Por esta razão, o termo “reagir um antígeno com periodato' inclui a oxidação de grupos hidroxila vicinais por periodato.
Em uma forma de realização, a etapa a) compreende reagir o antígeno com 0,001 a 0,7, 0,005 a 0,5, 0,01 a 0,5, 0,1 a 1,2, 0,1 a 0,5, 0,1 a 0,2, 0,5 a 0,8, 0,1 a 0,8, 0,3 a 1,0 ou 0,4 a 0,9 equivalentes molares de periodato, em uma forma de realização adicional, a etapa a) compreende reagir o antígeno com 0,0001 a 0,8 equivalentes molares de periodato.
Em uma forma de realização, o tampão usado na etapa a) é um tampão que não contém um grupo amina.
Em uma forma de realização, o tampão é selecionado da lista que consiste de tampão de fosfato, tampão de borato, tampão de acetato, tampão de carbonato, tampão de maleato e tampão de citrato.
Em uma segunda forma de realização, o tampão é um tampão inorgânico.
O termo tampão inorgânico inclui qualquer solução de tampão em que a capacidade de tamponação é devida à presença de um composto que não contém carbono.
Os tampões inorgânicos da invenção incluem tampão de fosfato e tampão de borato.
Em uma forma de realização, o tampão é tampão de fosfato.
Em uma forma de realização, o tampão tem uma concentração entre 1 e 100 mM, 5 e 80 mM, 1 e 50 MM, 1 e 25 mM, 10 e 4/0 MM, 1 e 10 mM,5el5mM,8el2mM,10e20mM,5 e 20 mM, 10 e 50 mM, em torno de 10 mM ou em torno de 20 mM.
Em uma forma de realização adicional o PH na etapa a) é pH 3,0 a 8,0, pH 5,0 a 7,0, pH 5,5 a 6,5, pH 5,8 a 6,3 ou em torno de pH 6,0. Em uma forma de realização, a etapa a) é realizada no escuro,
por exemplo, o recipiente contendo a mistura de reação pode ser coberto com um material capaz de refletir luz, por exemplo, folha de alumínio.
O antígeno pode ser um sacarídeo bacteriano natural ou pode ser um sacarídeo bacteriano que foi reduzido em tamanho por um fator de não maisdo que x2,x4,x6,x8,x10 ou x20 (por exemplo, por microfluidização [por exemplo, por mecanismo Emulsiflex C-50] ou outra técnica conhecida [por exemplo, métodos de calor, produto químico, oxidação, sonicação]). Em uma forma de realização, o antígeno é um sacarídeo bacteriano que é microfluidizado antes da etapa a). Os oligossacarídeos podem ser reduzidos em tamanho substancialmente adicional [por exemplo, por métodos de calor, produto químico, ou oxidação conhecidos]. Para os propósitos da invenção, “sacarídeo bacteriano natural” se refere a um sacarídeo bacteriano que não foi submetido a um propósito que é reduzir o tamanho do sacarídeo.
Um sacarídeo bacteriano pode se tornar levemente reduzido em tamanho durante os procedimentos de purificação normais.
Um tal sacarídeo ainda é natural.
Apenas se o sacarídeo bacteriano for submetido às técnicas que reduzem um sacarídeo em tamanho seria o polissacarídeo a não ser considerado natural.
O peso molecular médio ponderado de um sacarídeo — bacteriano adequado para a conjugação pelo processo da invenção pode estar entre 20 kDa e 2000 kDa, entre 30 kDa e 1000 kDa, entre 40 kDa e 500 kDa, entre 50 kDa e 400 kDa, entre 75 kDa e 300 kDa ou entre 1000 kDa e 2000 kDa.
No caso do sacarídeo capsular 3F natural de S. pneumoniae, o peso molecular médio do polissacarídeo natural está entre 750 e 1500 kDa ou 1200 e 1300 kDa.
No caso de sacarídeo Hib natural, o peso molecular médio do polissacarídeo natural está entre 100 e 250 kDa.
O peso molecular ou peso molecular médio de um sacarídeo neste se refere ao peso molecular médio ponderado (Mw) do sacarídeo bacteriano medido antes da conjugação e é medido por MALLS.
A técnica MALLS é bem conhecida na técnica.
As análises MALLS podem ser realizadas usando um TSKGMPwxI e 50 mM Na/K PO4, 200 mM de NaCl pH 7,0 como tampão de eluição com 0,75 ml/min usando o detector RIDAWN-EOS. Em uma forma de realização, a polidispersidade de um sacarídeo bacteriano é de 1 a 1,5, 1a 1,3, 1a 1,2, 1 a 1,1 ou 1 a 1,05 e após a conjugação de uma proteína carreadora, a polidispersidade do sacarídeo bacteriano conjugado é 1,0 a 2,5, 1,0 a 2,0. 1,0 a 1,5, 1,0 a 1,2, 1,5 a 2,5, 1,7 a 2,2 ou 1,5 a 2,0. Todas as medições da polidispersidade são geradas por MALLS.
O tratamento com periodato pode levar a uma redução no tamanho do sacarídeo bacteriano (tamanho do efeito). Em uma forma de realização o processo da invenção reduz este tamanho do efeito. Este é visto pelo sacarídeo bacteriano 23F a partir de Streptococcus pneumoniae (como no exemplo 1). Por esta razão, em uma forma de realização o peso molecular médio de um sacarídeo bacteriano da invenção está entre 1 e 1100 kDa, 100 e 470 kDa, 200 e 300 kDa, 600 e 1100 kDa ou 800 e 1000 kDa após a etapa a) (medido por MALLS como descrito acima). Em uma forma de realização o peso molecular médio do sacarídeo 23F está entre 100 e 470 kDa ou 200 e 300 kDa após a etapa a). Em uma forma de realização o peso molecular médio do sacarídeo bacteriano Hib está entre 1 e 50 kDa ou entre 5 e 10 kDa apósactapaa).
A invenção também fornece uma etapa adicional e) de purificar o antígeno conjugado, etapa e) pode compreender a diafiltração, por exemplo, diafiltração com um corte de 100 kDa. Além disso ou alternativamente a etapa e) pode compreender a cromatografia de troca de fon.
Em uma forma de realização adicional, a etapa e) pode compreender a cromatografia de exclusão por tamanho. Em uma forma de realização adicional, a etapa e) pode compreender a purificação do antígeno conjugado usando a permeação em gel. Em uma forma de realização o processo compreende uma etapa adicional f), em que o conjugado é filtrado estéril.
O antígeno conjugado também pode ser misturado com antígenos adicionais.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem pelo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 sacarídeos de S. pneumoniae selecionados do grupo que consiste de 1,2, 3,4, 5,6A,6B,7F,8,9N,9V,10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 194, 19F, 20, 22F, 23F e 33F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18C e 19F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 4, 9V, 14, 18C, 19F e 23F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 1, 4,5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 1, 4,5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, e 19F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 1, 4,5,7F,9V, 14, 18C, 19F e 23F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 194, 19F e 23F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os — sacarídeos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A e 19F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 1, 3,4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 194, 19F e 23F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 1, 4,5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A e 19F.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos de S. pneumoniae 1,4,5,6A,7F, 9V, 14, 18C, 194, 19F e 23F.
Qualquer um dos sacarídeos listados como “antígenos adicionais' são opcionalmente conjugados a uma proteína carreadora pelo processo da invenção ou por um processo diferente.
Opcionalmente estes antígenos adicionais são conjugados à proteína carreadora listada acima.
Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae | conjugados a proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 3 conjugados a proteína D, CRM197, pneumolisina ou PhtD ou fragmento ou proteína de fusão deste.
Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 4 conjugados a proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 5 conjugados a proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 6B conjugados a proteína DouCRMI197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 7F conjugado a proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 9V conjugados a proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 14 conjugados a proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 23F conjugados a proteína D ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 18C conjugados ao —toxóide do tétano ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 19A conjugados a pneumolisina ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 22F conjugados ao CRM197 ou PhtD ou fragmento da proteína de fusão deste. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 6A conjugados a pneumolisina ou uma proteína H. influenzae, opcionalmente proteína D ou PhtD ou proteína de fusão deste ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 6C conjugados a pneumolisina ou uma proteína H. influenzae, opcionalmente proteína D ou PhtD ou proteína de fusão deste ou CRM197. Em uma forma de realização, os antígenos adicionais compreendem os sacarídeos capsulares S. pneumoniae 19F conjugados ao Toxóide da difteria (DT).
Os antígenos adicionais também podem compreender Streptococcus pneumoniae proteínas. Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem pelo menos 1 proteína selecionada do grupo que consiste da família da tríade da Poli Histidina (PhtX), família da proteína de ligação de colina (CEbpX), truncados de CbpX, família de LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas truncadas de CbpX - truncadas de LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Spl125 e Spl133. Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem o PhtD e/ou Ply.
Os antígenos adicionais também podem compreender antígenos de outras espécies bacterianas. Em uma forma de realização, a vacina ou a composição imunogênica compreendem antígenos que se originam de S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, E. coli, M. cattarhalis, tétano, difteria, coqueluche, S. epidermidis, enterococos, Pseudomonas ou S. aureus.
Em uma forma de realização os antígenos adicionais compreendem os antígenos de M.cattarhalis, os antígenos de M.cattarhalis preferidos são: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA & LbpB [WO 98/55606 (PMO)]; TbpA & TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMOC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993)
Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspAl/2 [WO 93/0376] (University of Texas)] e OMpCD. Os exemplos de antígenos Haemophilus influenzae não tipificáveis que podem estar incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção de otite média) incluem: proteína de Fimbrina [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] e fusões que compreendem peptídeos destes [por exemplo, fusões de peptídeo LBI(D; US 5843464 (OSU) ou WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (Universidade do Estado de Nova Iorque)]; TDpA and TbpB; Hia; Hmw!1,2; Hap e D15.
Em uma forma de realização adicional, os antígenos adicionais compreendem os toxóide da difteria (DT), toxóide do tétano (TT) e componentes da coqueluche [tipicamente, toxóide de coqueluche desentoxicados (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) com pertactina convencional (PRN) e/ou aglutinina 1+2 e/ou aglutinogênio 1+2]), por exemplo, a vacina comercializada INFANRIX-DTPaTM (SmithKlineBeecham Biologicals) que contêm os antígenos de DT, TT, PT, FHA e PRN ou com um componente de coqueluche de célula total, por exemplo, como comercializado por SmithKlineBeecham Biologicals s.a., como TritanrixTM. Em uma forma de realização adicional, os antígenos — adicionais compreendem o antígeno de superfície da Hepatite B (HepB).
Em uma forma de realização adicional, os antígenos adicionais compreendem o sacarídeo capsular de PRP de H. influenzae (Hib).
Em uma forma de realização adicional, os antígenos adicionais compreendem pelo menos um sacarídeo capsular de N. meningitidis A, C, W ou7Y. Em uma forma de realização adicional, os antígenos adicionais compreendem pelo menos um conjugado de um sacarídeo capsular de N. meningitidis A, C, W, Y ou B.
O antígeno conjugado também pode ser misturado com um adjuvante. Os adjuvantes adequados incluem, mas não são limitados a, sais de alumínio (fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio), monofosforil lipídeo A (por exemplo, 3D-MPL), saponinas (por exemplo, QS21), emulsões de óleo em água, bolhas ou outras preparações de vesícula de membrana externa de cepas bacterianas de Gram negativo (tais como aquelas explicadas pelo WO 02/09746), lipídeo A ou derivados destes, fosfatos de alquil glicosamida ou combinações de dois ou mais destes adjuvantes.
Em uma forma de realização adicional, o antígeno conjugado da invenção é misturado com um excipiente farmaceuticamente aceitável para formar uma composição imunogênica.
A invenção ainda fornece uma composição imunogênica obtenível pelo processo da invenção. A invenção também fornece uma composição imunogênica obtida pelo processo da invenção. Em uma forma de realização o excipiente farmacêutico aceitável não contém cloreto de sódio. Em uma forma de realização o excipiente farmacêutico compreende um tampão selecionado do grupo que consiste de fosfato, maleato, tris, ou citrato. Ainda em uma forma de realização o tampão é tampão de maleato.
A composição imunogênica da invenção ainda pode compreender antígenos, em particular aqueles descritos como “antígenos adicionais"! acima. A composição imunogênica da invenção pode — compreender um adjuvante. Em uma forma de realização o adjuvante é um sal de alumínio.
A invenção também fornece uma vacina que compreende a composição imunogênica da invenção.
As preparações de vacina contendo composições —imunogênicos da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível à infecção, por meios de administrar a dita vacina por intermédio da via mucosal ou sistêmica. Estas administrações podem incluir a injeção por intermédio das vias intramusculares, intraperitoneais, intradérmicas ou subcutâneas; ou por intermédio da administração mucosal aos tratos orais/alimentares, respiratórios, genitourinários. A administração intranasal de vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é possível (como carregamento nasofaringeal de pneumococos pode ser mais efetivamente evitado, deste modo atenuar a infecção em seu estágio mais precoce). Embora a vacina da invenção pode ser administrada como uma dosagem simples, componentes destes também podem ser coadministrados juntos no mesmo período ou nos tempos diferentes (por exemplo conjugados de sacarídeo pneumococal deve ser administrado separadamente, no mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina pela coordenação ótima das respostas imunes com relação a cada outro). Além da uma via simples de administração, 2 vias diferentes de administração podem ser usadas. Por exemplo, sacarídeos ou conjugados de sacarídeos podem ser administrados IM (ou ID) e proteínas bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Além disso, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para iniciar dosagens e IN para intensificar as dosagens.
O conteúdo dos antígenos de proteína na vacina tipicamente serão na faixa 1 a 100 ug, opcionalmente 5 a 50 ug, mais tipicamente na faixa 5 a 25 ug. Seguindo uma vacinação inicial, pacientes podem receber uma ou — diversas imunizações intensificadoras adequadamente espaçadas.
A preparação de vacina é geralmente descrito no projeto de vacina (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque). À encapsulação dentro dos lipossomos é descrita por Fullerton, Patente U.S. 4.235.877.
Embora as vacinas da presente invenção podem ser administradas por qualquer via, administração das vacinas descritas nas formas da pele (ID) uma forma de realização da presente invenção. a pele humana compreende uma cutícula “córnea” externa, denominada estrato córneo, que sobrepõe epiderme. Embaixo da epiderme é uma camada denominada a derme, que por sua vez sobrepõe o tecido subcutâneo. Os pesqueis adores mostram que a injeção de uma vacina na pele e em particular a derme, estimula uma resposta imune, que também pode ser associada com um número de vantagens adicionais. A vacinação intradérmica com as vacinas descritas neste forma uma característica opcional da presente invenção.
A técnica convencional da injeção intradérmica, oO “procedimento mantoux”, compreende as etapas de limpeza da pele e então estiramento com uma mão e como o chanfro de um revestimento da agulha de medida estreita (26-31 medida) acima da agulha é inserida em um ângulo entre 10-15º. Uma vez que o chanfro da agulha é inserida, o cilindro da agulha é diminuído e ainda avançado enquanto fornece uma pressão fraca para elevar sob a pele. O líquido é então injetado mais lentamente portanto formando uma bolha ou inchaço na superfície da pele, seguida pela remoção lentada agulha.
Mais recentemente, os dispositivos que são especificamente projetados para administrar os agentes líquidos em ou cruzada a pele foi descrito, por exemplo, os dispositivos descritos no WO 99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção a jato descritos por exemplo no WO 01/13977; U.S. 5.480.381, U.S. 5.599.302, U.S. 5.334.144, UJS.
5.993.412, U.S. 5.649.912, U.S. 5.569.189, U.S. 5.704.911, US.
5.383.851, U.S. 5.893.397, U.S. 5.466.220, U.S. 5.339.163, US.
5.312.335, U.S. 5.503.627, US. 5.064.413, U.S. 5.520.639, US.
4.596.556, U.S. 4.790.824, U.S. 4.941.880, U.S. 4.940.460, WO 97/37705 eWoO97/13537. Os métodos alternativos de administração intradérmica das preparações de vacina podem incluir as seringas e agulhas convencionais, ou dispositivos projetados pela liberação balística das vacinas sólidas (WO 99/27961), ou emplastros transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); ou aplicados na superfície da pele (liberação transdérmica ou transcutânea WO 98/20734 ; WO 98/28037).
Quando as vacinas da presente invenção serão administradas a pele, ou mais especificamente em uma derme, a vacina está em um volume líquido inferior, particularmente um volume entre cerca de 0,05 ml e 0,2 ml.
O conteúdo dos antígenos na pele ou vacinas intradérmicas da presente invenção pode ser similar as dosagens convencionais como observado nas vacinas intramusculares (ver acima). Entretanto, é uma característica da pele ou vacinas intradérmicas que as formulações podem ser “dosagem baixa”. Consequentemente os antígenos de proteína nas vacinas de “dosagem baixa” são opcionalmente presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10 ug ou 0,1 a 5 ug por dosagem; e os antígenos sacarídeos (opcionalmente conjugado) podem estar presentes na faixa de 0,01-1 ug, ou entre 0,01 a 0,5 ug do sacarídeo por dosagem.
Como usado neste, o termo “liberação intradérmica” significa a liberação da vacina à região da derme na pele. Entretanto, a vacina será necessariamente localizado exclusivamente na derme. A derme é a última camada na pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm a partir da superfície na pele humana, mas existe uma certa quantidade de variação entre indivíduos e em partes diferentes do corpo. Em geral, este pode ser esperado atingira derme indo 1,5 mm abaixo da superfície da pele. A derme é localizada entre o estrato córneo e a epiderme na superfície e a camada subcutânea abaixo. Dependendo do modo de liberação, a vacina pode ser ultimamente localizada unicamente ou principalmente dentro da derme, ou pode ser ultimamente distribuída dentro da epiderme e uma derme.
Em um aspecto da invenção é fornecido um Kkit de vacina, que compreende um frasco contendo uma composição imunogênica da invenção, opcionalmente na forma liofilizada e ainda que compreende um frasco contendo um adjuvante como descrito neste. É abrangido que neste aspecto da invenção, o adjuvante será usado para reconstituir a composição imunogênica liofilizada.
Ainda um aspecto adicional da invenção é um método para prevenir ou tratar infecção por exemplo infecção bacteriana que compreende administrar ao hospedeiro uma dosagem imunoprotetora da composição —imunogênica ou vacina ou kit da invenção. Ainda o aspecto adicional da invenção é um método de evitar ou tratar uma doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócica, doença estafilocócica, doença enterocócica e Salmonella que compreende administrar ao hospedeiro uma dosagem imunoprotetora da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção.
Ainda um aspecto da invenção é uma composição imunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevenção da doença, por exemplo, doença bacteriana. Ainda um aspecto da invenção é uma composição imunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevenção da doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, Doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócica, doença estafilocócica, doença enterocócica e Salmonella.
Ainda um aspecto da invenção é o uso da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da doença, por exemplo, doença bacteriana. Ainda um aspecto da invenção é o uso da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento da doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, Doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócica, doença estafilocócica,y doença enterocócica e Salmonella.
“Em torno de” ou “aproximadamente” são definidos como dentro de 10 % mais ou menos da dada figura para os propósitos da invenção.
Os termos “compreendendo”, “que compreende” e “compreende” neste são pretendidos pelos inventores a ser opcionalmente substituídos com os termos “consistindo de”, “que consiste de” e “consiste —de”,respectivamente, em cada exemplo.
As formas de realização neste relacionando as “composições de vacina” da invenção também são aplicáveis as formas de realização relacionando as “composições imunogênicas” da invenção e vice versa. Todas as referências ou Pedidos de Patente citados dentro desta especificação são incorporados por referência neste.
A fim de esta invenção possa ser mais entendido, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos são para os propósitos da ilustração apenas e não são construídos como limitantes do escopo da invenção em qualquer maneira.
As formas de realização da invenção ainda são descritos nos parágrafos numerados subsequentes.
Parágrafo 1. Um processo para a conjugação de um antígeno que compreende as etapas de a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b) reagiro antígeno ativado e uma proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado; ou a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b”) reagir o antígeno ativado e um ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado ao ligante; c”) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno- ligante; e d) reagiro antígeno-ligante com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado; em que o antígeno se origina de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis,, Salmonella Vi, ou Staphylococcus epidermidis.
Parágrafo 2. O processo de acordo com o parágrafo 1 que — compreende as etapas de a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b) reagiro antígeno ativado e uma proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado; em que o antígeno se origina de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Salmonella Vi, ou Staphylococcus epidermidis.
Parágrafo 3. Um processo para a conjugação de um antígeno que compreende as etapas de a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; a”) liofilisar o antígeno ativado e uma proteína carreadora seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF; b) reagiro antígeno ativado e a proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado; ou a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; a”) liofilisar o antígeno ativado e um ligante seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF; b') reagir o antígeno ativado e o ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c') reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno- ligante; d) reagiro antígeno-ligante com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado.
Parágrafo 4. O processo de acordo com o parágrafo 3 que compreende as etapas de: a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; a”) liofilisar o antígeno ativado e uma proteína carreadora seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF; b) reagiro antígeno ativado e a proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado.
Parágrafo 5. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o agente de redução não contém uma porção — decianoboroidreto.
Parágrafo 6. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o antígeno é um sacarídeo bacteriano.
Parágrafo 7. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano.
Parágrafo 8. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 7 em que o antígeno é um sacarídeo bacteriano que se origina de S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, S. aureus, E. faecalis, E. faecium, Salmonella Vi ou S.epidermidis.
Parágrafo 9. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 7 ou 8 em que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano de um sorotipo S. pneumoniae selecionado do grupo que consiste de 1, 2,3,4,5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 104, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F.
Parágrafo 10. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 7 a 9 em que o sacarídeo capsular bacteriano é de um sorotipo S. pneumoniae selecionado do grupo que consiste de 5, 6B, 6A, 7F, 9V, 14, 19F e 23F.
Parágrafo 11. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 7 a 10 em que o sacarídeo capsular bacteriano é sacarídeo capsular de S. pneumoniae 23F.
Parágrafo 12. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 7 a 11 em que o sacarídeo capsular bacteriano é sacarídeo capsular de S. pneumoniae 6B.
Parágrafo 13. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 7 a 12 em que o sacarídeo capsular bacteriano é sacarídeo capsular de S. pneumoniae 6A.
Parágrafo 14. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 7 a 8 em que o sacarídeo bacteriano é polissacarídeo ou oligossacarídeo de Haemophilus influenzae b (Nib).
Parágrafo 15. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 em que o antígeno é uma proteína ou um fragmento da proteína.
Parágrafo 16. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que a proteína carreadora é uma proteína selecionada do grupo que consiste de toxóide do tétano (TT), fragmento C de TT, toxóide da difteria, CRM197, Pneumolisina, proteína D, PhtD, PhtDE e N19. Parágrafo 17. O processo de acordo com o parágrafo 16 em que a proteína carreadora é CRM197.
Parágrafo 18. O processo de acordo com o parágrafo 16 em que a proteína carreadora é toxóide do tétano.
Parágrafo 19. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o antígeno é diretamente conjugado à proteína carreadora.
Parágrafo 20. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18 em que o antígeno é conjugado à proteína carreadora por intermédio de um ligante.
Parágrafo 21. O processo de acordo com o parágrafo 20 em que o ligante está entre 1 e 20 Angstroms em comprimento.
Parágrafo 22. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 20 e 21 em que o ligante compreende um ligante ADH.
Parágrafo 23. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que as etapas b) e oc), ou etapas b') e c) ocorrem simultaneamente.
Parágrafo 24. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que a etapa c) e/ou c') é realizada na presença de DMSO.
Parágrafo 25. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de | a 23 em que a etapa c) e/ou c') é realizado na presença de DMF.
Parágrafo 26. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que as etapas c) e/ou c') acontece em menos do que 30 horas ou menos do que 20 horas.
Parágrafo 27. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que as etapas c) e/ou c') acontece entre 15 minutos e 30 horas, ou entre 10 horas e 20 horas.
Parágrafo 28. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que a etapa c) e/ou c') não resulta na produção de fons de cianeto.
Parágrafo 29. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o antígeno e a proteína carreadora são misturados juntos antes da etapa b) e/ou antes da etapa a”).
Parágrafo 30. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o antígeno e a proteína carreadora são liofilizados antes da etapa b).
Parágrafo 31. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o antígeno e a proteína carreadora são liofilizadas após a etapa a).
Parágrafo 32. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 30 ou 31 em que o antígeno e a proteína carreadora são liofilizados na presença de um açúcar não redutor.
Parágrafo 33. O processo de acordo com o parágrafo 32 em que o açúcar não redutor é selecionado do grupo que consiste de sacarose, lactose, trealose, rafinose, estaquiose, melezitose, dextrano, manitol, lactitol e palatinit.
Parágrafo 34. O processo de acordo com qualquer um dos — parágrafos precedentes em que entre 0,5 e 3, entre 0,5 e 10 ou entre 8 e 12 equivalente molar do agente redutor é usado na etapa c) e/ou c”).
Parágrafo 35. O processo de acordo com o parágrafo 34 em que entre 0,5 e 0,8 equivalente molar do agente redutor é usado na etapa c) e/ou c').
Parágrafo 36. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 34 ou 35 em que entre 2 e 3 equivalente molar do agente redutor é usado na etapa c) e/ou c"). Parágrafo 37. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que a razão da proteína carreadora: antígeno antes da etapa c) e/ou c') está entre 0,4:1 e 2:1 ou entre 0,4/1 e 2,5/1. Parágrafo 38. O processo de acordo com o parágrafo 37 em que a razão da proteína carreadora: antígeno antes da etapa c) e/ou c') está entre 1:1 e 2:1. Parágrafo 39. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que a razão da proteína carreadora: antígeno após etapa c) e/ou c') está entre 0,8:1 e 3,5:1. Parágrafo 40. O processo de acordo com o parágrafo 39 em que a razão da proteína carreadora: antígeno após etapa c) e/ou c') está entre 1,3:162/7:1. Parágrafo 41. O processo de acordo com o parágrafo 39 em que a razão da proteína carreadora: antígeno após etapa c) e/ou c”) está entre 1:1e 1,5:1. Parágrafo 42. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que quaisquer grupos de carbonila não reagidos são cobertos pela reação com boroidreto de sódio (NaBH,). Parágrafo 43. O processo de acordo com o parágrafo 42 em que entre | e 10 equivalentes molares de boroidreto de sódio são usados.
Parágrafo 44. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 42 e 43 em que o produto da etapa c) ou c') é reagido com boroidreto de sódio por 15 minutos a 15 horas.
Parágrafo 45. O processo de acordo com o parágrafo 44 em que a etapa a) compreende reagir o antígeno com periodato.
Parágrafo 46. O processo de acordo com o parágrafo 45 em que a etapa a) compreende reagir o antígeno com 0,001 a 0,7 equivalentes molares de periodato.
Parágrafo 47. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que a etapa a) ocorre em um tampão que não contémum grupo amina.
Parágrafo 48. O processo de acordo com o parágrafo 47 em que o tampão é selecionado do grupo que consiste de tampão de fosfato, tampão de maleato, tampão de borato, tampão de acetato, tampão de carbonato e tampão de citrato.
Parágrafo 49. O processo de acordo com o parágrafo 48 em que o tampão é tampão de fosfato.
Parágrafo 50. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 47 a 49 em que o tampão tem uma concentração entre 1 e 50 mM, 1 e 25 MM, 1 e IO MM, 5e 15 mM, 8 e 12 mM, ou 10 e 50 MM ou em tornode 10 MM.
Parágrafo 51. O processo de qualquer um de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o pH durante a etapa a) é pH 3,0 a 8,0, pH 5,0 a 7,0, ou pH 5,5 a 6,5 ou em torno de pH 6,0.
Parágrafo 52. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que a etapa a) é realizado no escuro.
Parágrafo 53. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 6 a 14 ou de 16 a 52 em que o antígeno é um sacarídeo bacteriano natural ou é um sacarídeo bacteriano que foi reduzido no tamanho pelo fator não mais do que x20 (por exemplo pela microfluidização).
Parágrafo 54. O processo de acordo com o parágrafo 53 em que o antígeno é microfluidizada antes da etapa a).
Parágrafo 55. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o peso molecular médio do antígeno está entre 1 e 1100 kDa, 100 e 470 kDa, 200 e 300 kDa, 600 e 1100 kDa ou 800 e 1000 kDa após a etapa a).
Parágrafo 56. O processo de acordo com o parágrafo 55 em que o peso molecular médio do antígeno está entre 100 e 470 kDa ou 200 e 300 kDa após a etapa a).
Parágrafo 57. O processo de acordo com o parágrafo 55 em que o peso molecular médio do antígeno está entre 1 e 50 kDa ou entre 5 e 10kDa após a etapa a).
Parágrafo 58. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes que compreende uma etapa adicional e) de purificar o antígeno conjugado.
Parágrafo 59. O processo de acordo com o parágrafo 58 em que a etapa e) compreende a purificação do antígeno conjugado usando diafiltração.
Parágrafo 60. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 58 e 59 em que a etapa e) compreende a purificação do antígeno conjugado usando cromatografia de troca de fon.
Parágrafo 61. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 58 a 60 em que a etapa e) ainda compreende cromatografia de permeação em gel.
Parágrafo 62. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes que compreende uma etapa adicional f) em que o antígeno conjugado é filtrado estéril.
Parágrafo 63. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes contendo a etapa adicional de misturar o antígeno — conjugado com antígenos adicionais.
Parágrafo 64. O processo de acordo com o parágrafo 63 em que os antígenos adicionais compreende pelo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 sacarídeos de S. pneumoniae selecionados do grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14,
15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F.
Parágrafo 65. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 64 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeos de S. pneumoniae 4, 9V, 14, 18C e 19F.
Parágrafo 66. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 65 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo de S. pneumoniae 19A.
Parágrafo 67. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 66 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S pneumoniae 6A.
Parágrafo 68. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 67 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S. pneumoniae |.
Parágrafo 69. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 68 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S. pneumoniae 5.
Parágrafo 70. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 69 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S. pneumoniae TF.
Parágrafo 71. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 70 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S. pneumoniae 3.
Parágrafo 72. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 71 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S&S pneumoniae23F.
Parágrafo 73. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 72 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S. pneumoniae OB.
Parágrafo 74. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 73 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S. pneumoniae 6A.
Parágrafo 75. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 74 em que os antígenos adicionais compreendem sacarídeo S&S pneumoniae33F.
Parágrafo 76. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 75 em que os antígenos adicionais compreendem uma ou mais proteínas de S. pneumoniae selecionadas do grupo que consiste da família da tríade de poli histidina (PhtX), família de proteína de ligação de colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, truncado de CbpX-proteínas quiméricas de truncado LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 e Sp133.
Parágrafo 77. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 76 em que os antígenos adicionais compreendem Toxóide da difteria (DT), Toxóide do tétano (TT) e célula total morta Bordetella pertussis (Pw), ou dois ou mais componentes de coqueluche acelulares (Pa).
Parágrafo 78. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 77 em que os antígenos adicionais compreendem antígeno de superfície de hepatite B (HepB) Parágrafo 79. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 63 a 78 em que os antígenos adicionais compreendem um ou mais conjugados de uma proteína carreadora e um polissacarídeo capsular de uma bactéria selecionada do grupo que consiste de N. meningitidis tipo À —(MenA),N. meningitidis tipo C (MenC), N. meningitidis ipo W (MenW) e N. meningitidis tipo Y (MenY).
Parágrafo 80. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos precedentes em que o antígeno conjugado é misturado com um adjuvante.
Parágrafo 81. O processo de acordo com o parágrafo 80 em que o adjuvante é um sal de alumínio.
Parágrafo 82. Uma composição imunogênica que compreende o antígeno conjugado misturado com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Parágrafo 83. Uma composição imunogênica obtenível pelo processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 82.
Parágrafo 84. Uma composição imunogênica obtida pelo processo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 82.
Parágrafo 85. A composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 84 em que o excipiente farmacêutico não compreende cloreto de sódio.
Parágrafo 86. A composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 85 em que a composição imunogênica compreende tampão de maleato.
Parágrafo 87. A composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 86 ainda compreende um adjuvante.
Parágrafo 88. A composição imunogênica do parágrafo 87 em que o adjuvante é um sal de alumínio.
Parágrafo 89. Uma vacina que compreende a composição imunogênica do parágrafos de 82 a 88.
Parágrafo 90. A composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 88 ou a vacina do parágrafo 89 para o uso no tratamento ou prevenção da doença, por exemplo, doença bacteriana.
Parágrafo 91. A composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 88 ou a vacina do parágrafo 89 para o uso no tratamento ou prevenção da doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócicay doença estafilocócica,y doença enterocócica e Salmonella.
Parágrafo 92. Um uso da composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 88 ou a vacina do parágrafo 89 na prevenção ou tratamento de doença, por exemplo, doença bacteriana.
Parágrafo 93. Um uso da composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 88 ou a vacina do parágrafo 89 na prevenção ou tratamento da doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócica,y doença estafilocócica, doença —enterocócica e Salmonella.
Parágrafo 94. Um uso da composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 88 ou a vacina do parágrafo 89 na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de doença, por exemplo, doença bacteriana.
Parágrafo 95. Um uso da composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos de 82 a 88 ou a vacina do parágrafo 89 na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento da doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócica, — doença estafilocócica, doença enterocócica e Salmonella.
Parágrafo 96. Um método para prevenir ou tratar infecção por exemplo infecção bacteriana que compreende administrar a composição imunogênica do parágrafos de 82 a 88 ou a vacina do parágrafo 89 a um paciente.
Parágrafo 97. Um método de evitar ou tratar uma doença selecionada do grupo que consiste de meningite bacteriana, doença pneumocócica, doença de Haemophilus influenzae, doença meningocócica, doença estafilocócica, doença enterocócica e Salmonella que compreende administrar a composição imunogênica do parágrafos de 82 a 88 ou a vacina do parágrafo 89 a um paciente.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Oxidação de 23F e 6B usando periodato Polissacarídeos (PS) 23F ou 6B foram dissolvidos em 100 mM —deKH3/PO.s (pH7,4), IOMM de KH;PO, ou WFI, para formar soluções de 2 mg de PS/ml. A solução foi incubada por 2 horas sob agitação em temperatura ambiente. Após este tempo o pH foi ajustado ao pH 6,0 com IN de HCI. Periodato foi adicionado como um pó ou na forma líquida (10 mg/ml em WFI) em várias quantidades para atingir uma faixa de razões molares (tabela 1) As soluções foram incubadas por 17 horas em temperatura ambiente (20- 25ºC), após aquele período as amostras foram submetidas à diálise ou diafiltrado contra WFI. A cromatografia de filtração em gel de desempenho alto ligada com índice refrativo e detectores da dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo (MALLS-) foi usado para medir o peso molecular. Meio de exclusão do tamanho (TSK5000PWXL-Tosoh) foi usado para moldar a distribuição do tamanho molecular do polissacarídeo (eluição 0,5 ml/min em NaCl 0,2M- NaN3 0,02 %). Tabela 1 e figura 1 descreve os resultados destes experimentos. Tabela | se refere as amostras rotuladas 23F e 23FATCC. As amostras rotuladas 23F foram 23F amostras produzidas em GSK, considerando as amostras rotuladas 23FATCC foram realizadas usando uma linha celular obtida de ATCC (American Type Culture Collection). Estes resultados demonstram que o tamanho substancial de sacarídeo 23F ocorre na oxidação usando equivalentes molares altos de periodato em tampão de fosfato de 100 mM. Este tamanho do efeito pode ser reduzido para reduzir a concentração do tampão de fosfato ou os equivalentes molares de periodato usados.
Tabela 1: Equivalente Ex lente periodato (KDa) periodato (KDa) 7 10mM 10mM | | jog | se | e | o | gm | ss | 100mM 10mM [Lose | fee | se | e | oa | am | so | a 100mM . 10mM [araree | o | as | es | eo | os | am | se | 100mM 10mM Lose pa fem da | | os | nã | es | a a 100mM [8 Ta TETI TAI E 100mM |asraee Pao es a 100mM e Dos PET TA 7 10mM [ar fa ds sa ; 10mM FR e TT o TA A ; 10mM Fe TB TT E A 10mM E ER RR o Exemplo 2 - Conjugação de 23F a CRM197 usando aminação redutiva e aminação redutiva de química CDAP Aminação Redutiva 1 g de PS23F foi dissolvido em 500 ml de 10 mM de KH;PO;,, pH 7,15. Esta solução foi incubada em temperatura ambiente por duas horas.
O pH foi ajustado a 6,0 com IM de HCl. 111 mg de periodato (NalO,, 0,4 equivalentes molares de periodato) foi adicionado à solução de PS23F e a solução foi incubada por 17 horas no escuro em temperatura ambiente para oxidar PS23F.
A solução foi então diafiltrada contra WFI (corte 100 kDa). O PS23F ativado foi liofilizado com a proteína CRM197 (em uma razão CRM/PS (p/p): 0,625) na presença de um agente de estabilização. 900 mg da mistura PS23F/CRM197 liofilizada foi solubilizada pela adição de 350 ml do solvente de DMSO e incubando por 2 horas em 15º temperatura ambiente.
Para reduzir a mistura PS23F/CRM197 | equivalente molar de NABH;CN foi adicionado (735 ul da solução de 100 mg/ml em WFD).
A solução foi incubada por 40 horas adicionais em temperatura ambiente (15ºC- 25ºC) sob agitação. Após este período 2 equivalentes molares de NaBH, (100 mg/ml em WFI) foram adicionados e a solução incubada por 4 horas em temperatura ambiente. 2200 ml de 150 mM de NaCl foram adicionados antes da diafiltrtação (corte 100kDa) e purificação por DEAE. As frações de interesse foram unidas e filtradas através de um filtro 0,22 um.
CDAP 200 mg de PS23F microfluidizado foram dissolvidos em WFI até uma concentração de 10 mg/ml foi obtido. NaCl foi adicionado a esta — solução em uma concentração final de 2M.
A solução CDAP suficiente (100 mg/ml frescamente preparada em 5/50 v/v acetonitrila/WFI) foi adicionado para atingir uma razão CDAPY/PS de 0,75/1 (p/p) Após 90 segundos, o pH foi elevado ao pH 9,5 pela adição de Ol Nde NaOH.
3 minutos após CRM197 suficiente (10 mg/ml em 0,15 M de NaCl) foi adicionado para atingir uma razão de 1,5 (CRM197:PS (p/p)), o pH foi mantido no pH 9,5. Esta solução foi incubada por 1 hora no pH 9,5.
Após esta etapa de ligação, 10 ml de 2 M de solução de glicina —foiadicionado a mistura e o pH foi ajustado ao pH 9,0 (a extinção do pH). À solução foi agitada por 30 minutos em temperatura ambiente. O conjugado foi purificado usando um filtro de 5 um seguido por Sephacryl S400HR que remove moléculas menores e polissacarídeos não conjugados e proteína. Eluição foi atingida usando 150 mM de NaCl. As frações de interesse foram unidas e filtradas na membrana 0,22 um. O conjugado resultante tem uma razão CRM197/PS final (p/p) de 1,35/1.
Exemplo 3 - Imunogenicidade de conjugados 23F-CRM197 feitos pela aminação redutiva e química CDAP Os conjugados foram feitos usando os métodos descritos no exemplo 2. Porquinhos da índia fêmeas foram imunizados intramuscularmente três vezes (nos dias O, 14 e 28) com 0,25 ug dos conjugados PS 23F-CRM197. Os animais foram sangrados no dia 42 e a resposta de anticorpo direcionada contra PS23F foi medida por ELISA e OPA.
ELISA As microplacas foram revestidas com polissacarídeo pneumocócico purificado no tampão PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com 0,9 % de NaCl e 0,05 % de Tween 20. Os soros foram incubados —porl horaem37ºC com CPS (V/V) em PBS 0,05 % de Tween 20. Os soros foram adicionados aos microrreservatórios e seriamente diluídos (etapa de diluição dupla) em PBS- 0,05 % de Tween. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos em temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de peroxidase de anticorpos anti-IgG de porquinho da índia foi adicionado, as placas foram então incubadas por 30 minutos em RT. Após lavagem, o substrato (4 mg de OPDA em 10 ml de citrato 0,1 M pH 4,5 e 5 ul de H2O;) foi adicionado em cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HCl de IN. Absorbância foi lida a 490-620 nm usando um espectrofotômetro. A cor — desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade do anticorpo presente no soro. O nível de anti-PS IgG presente no soro é determinado pela comparação ao soro de curva de referência adicionada em cada placa e expressada em pg/ml. Os resultados foram analisados estatisticamente após assumir a — homogeneidade da diferença (checado pelo teste C Cochrans) e normalidade (checado usando o teste Shapiro-Wilk). Todas as estatísticas foram realizadas usando Anova (Tukey-HSD) no IgG de concentração de transformação log. Opsonofagocitose As amostras de soro foram aquecidas por 45 min a 56ºC para inativar qualquer complemento endógeno remanescente. Vinte de cinco alíquotas de microlitro de cada 1:2 amostra de soro diluído foram seriamente diluídos (duas vezes) em 25 ul do tampão OPA (HBSS-14,4 % de FBS inativado) por reservatório de uma placa microtituladora de fundo redondo de 96 reservatórios. Subsequentemente, 25 ul da mistura de células HL-60 ativadas (1 x 107 células/ml), frescamente descongelado semente de trabalho pneumocócica e complemento de coelho filhote frescamente descongelado por exemplo em uma razão 4/2/1 (v/v/v) foi adicionado ao soro diluído para produzir um volume final de 50 ul. A placa de ensaio foi incubada por 2ha 37ºC com agitação orbital (210 rpm) para promover o processo fagocítico. À reação foi interrompida pela colocação da microplaca em gelo por pelo menos 1 min. Uma alíquota de 20 ul de cada reservatório da placa foi então transferido no reservatório correspondente de uma microplaca de fundo plano de 96 reservatórios de 50 ul de Caldo Todd-Hewitt -0,9 % de ágar foi adicionado em cada reservatório. Após incubação durante a noite a 37ºCe5 % de CO2, colônias pneumocócicas aparecendo no ágar foram contados usando um sistema de análise de imagem automática (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Oito reservatórios sem a amostra de soro foram usados como controles bacterianos para determinar o número de —pneumocócico por reservatório. O número médio de CFU dos reservatórios controle foi determinado e usado pelo cálculo da amostra morta para cada amostra de soro. O titulador OPA pelas amostras de soro foi determinada pela diluição recíproca de soro capaz de facilitar 50 % de morte de pneumocócico. O titulador opsonofagocítico foi calculado pelo uso de uma análise de ajuste — decurvade 4-parâmetros.
Os resultados foram analisados estatisticamente após assumir a homogeneidade da diferença (checado pelo teste C Cochrans) e normalidade (checado usando o teste Shapiro-Wilk). Todas as estatísticas foram realizadas por Anova (Tukey-HSD) no IgG de concentração de transformação log por
ELISA e Kruskal-Wallis na diluição log por OPA.
Uma resposta de anticorpo significantemente maior foi induzida nos porquinhos da índia após imunização com PS23F-CRM197 conjugado pela aminação redutiva do que PS23F-CRM197 conjugado pela — química CDAP como visto na figura 2. Tabela 2 Exemplo 4 — Um exemplo adicional de aminação redutiva de 23F 23F-CRM-RA-116 150 mg de PS23F natural (PS23FP114) foram dissolvidos em uma concentração de 2 mg/ml em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,2) por 4 horas. Após dissolução, pH foi ajustado ao pH 6,0 com IN de HCl. Então 0,4 equivalente molar de periodato (NabO,4) foi adicionado à solução de PS e incubada por 17 horas no escuro a 25ºC. A solução foi então diafiltrada (corte 30 kDa) contra WFI e o PS oxidado foi filtrado na membrana 155 a022 um.
50 mg de PS oxidado e 75 mg de CRM197 foram liofilizados juntos (razão CRM/PS (p/p): 1,5/1) com um agente de estabilização. PS + CRM 197 liofilizado foram solubilizados com 20 ml de DMSO por 2 horas em temperatura ambiente (15-25ºC). 1 equivalente molar de Triacetoxiboroidreto de sódio foi então adicionado (13,7 mg) e após 17 horas sob agitação, 2 equivalente molar de NaBH, (100 mg/ml em 0,1 M de NaOH) foram adicionados seguido por uma incubação em temperatura ambiente por 30 minutos. A solução foi diluída 5x pela adição de WFI seguido pela diafiltração (corte 30 kDa) contra 10 mM de tampão de fosfato, 150 mM de —NaClpH7,.0O conjugado foi então carregado na resina DEAE e eluída em 10 mM do tampão de fosfato, S00 mM de NaCl pH 7,2. O conjugado foi finalmente filtrado em 0,22 um. O conjugado resultante tem uma razão
CRM/PS final (p/p) de 2,3/1.
Para os conjugados adicionais, uma etapa de diafiltração foi adicionado após coluna DEAE a fim de mudar o tampão (150 mM de NaCl como tampão final).
—Exemplo5 - Conjugação de 6B a CRMI197 usando aminação redutiva (com proteína diferente:razões de sacarídeos e sacarídeos 6B microfluidizados de tamanhos diferentes) e química CDAP. 6B-CRM-RA- 1 22 200 mg de PS6B microfluidizado (84 kDa, 11,7 mg/ml) foram —diluídosa2 mg/mlem 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,2). pH foi ajustado ao pH 6,0 com 1 N de HCI. Então 0,1 equivalente molar de periodato (Na 104) foi adicionado à solução de PS e incubada por 17 horas no escuro em temperatura ambiente. A solução é então diafiltrada (corte 30 kDa) contra WFI. 50 mg de PS e 30 mg de CRM197 foram liofilizados juntos (razão CRM/PS (p/p): 0,6/1) com um agente de estabilização. PS + CRM197 liofilizado foram solubilizados com 20 ml de DMSO por 3 horas em temperatura ambiente. Então 2,5 equivalentes molares de triacetoxiboroidreto de sódio foram adicionados (38,7 mg) e após 16 horas sob agitação, 2 equivalentes molares de NaBH, (100 mg/ml em 0,1 M de NaOH) foram — adicionados seguido por uma incubação em temperatura ambiente por 30 minutos. A solução foi diluída 4x pela adição de WFI seguido pela diafiltração (corte 100 kDa). O conjugado foi então filtrado 0,22 um. O conjugado resultante tem uma razão CRM/PS final (p/p) de 1,1/1. 6B-CRM-RA- 123: PS6B microfluidizado (84 kDa) foi conjugado a CRM197 como descrito por 6B-CRM-RA-122 exceto que a etapa de secagem por congelamento foi realizada usando uma razão CRM197/PS inicial (p/p) de 2/1 e 33 ml de DMSO foi usado pela dissolução na etapa DMSO (em vez de 20 ml). O conjugado resultante tem uma razão CRMY/PS final (p/p) de 3,0/1.
6B-CRM-RA- 124: 200 mg de PS6B microfluidizado (350 kDa, ) foram diluídos a 2 mg/ml em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,2). pH foi ajustado ao pH 6,0 com 1 N de HCl.
Então 0,1 equivalente molar de periodato (NalO4s) foi — adicionado à solução PS e incubada por 17 horas no escuro em temperatura ambiente.
A solução foi então diafiltrada (corte 100 kDa) contra WFI. 50 mg de PS e 60 mg de CRM197 foram liofilizados juntos (razão CRM/PS (p/p): 1,2/1) com um agente de estabilização.
PS + CRM197 liofilizado foram solubilizados com 20 ml de DMSO por 5 horas em temperatura ambiente. 2,5 equivalentes molares de triacetoxiboroidreto de sódio foram então adicionados (38,7 mg) e após 16 horas sob agitação, 2 equivalentes molares de NaBH, (100 mg/ml em 0,1 M de NaOH) foram adicionados seguido pela incubação por 30 min em temperatura ambiente.
A solução foi diluída 4x pela adição de WFI seguido pela diafiltração (corte 100 kDa). O conjugado foi então filtrado 0,22 um.
O conjugado resultante tem uma razão CRMY/PS final (p/p) de 1,6/1. 6B-CRM-RA- 125: PS6B microfluidizado (350 kDa) foi conjugado a CRM197 como descrito por 6B-CRM-RA-124 exceto que a etapa de secagem por — congelamento foi realizada usando uma razão CRM197/PS inicial (p/p) de 2/1 e a dissolução em DMSO foi realizada usando 33 ml (em vez de 20 ml). O conjugado resultante tem uma razão CRM/PS final (p/p) de 2,9/1. 6B-CRM-003: 50 mg de PS6B microfluidizado foram diluídos a 10 mg/ml em —WFI.
NaCl na forma sólida foi adicionada para atingir uma concentração final de 2M. solução CDAP (100 mg/ml frescamente preparado em 50/50 v/v acetonitrila/WFI) foi adicionado para atingir a razão CDAP/PS apropriada (1,5 mg/mg de PS). Após 1,5 minutos, o pH foi elevado à ativação de pH 9,5 pela adição de 0,1 N de NaOH e foi estabilizado neste pH até adição de
CRM197. Após 3 minutos, CRM197 (10 mg/ml em 0,15 M de NaCl) foi adicionado para atingir a razão CRM197/PS (p/p) de 2; o pH foi mantido na ligação de pH 9,5. A solução foi deixada por 2 horas sob regulação de pH.
Após a etapa de ligação, 2,5 ml de 2M solução de glicina — foram adicionados a mistura.
O pH foi ajustado à extinção do pH (pH 9,0). À solução foi agitada por 30 min em temperatura ambiente.
Então o conjugado foi filtrado usando um filtro de 5 um e injetado na coluna Sephacryl S400HR.
A eluição foi realizada em 150 mM de NaCl.
O interesse das frações foram unidas e filtradas na membrana de 0,22 um.
O conjugado resultante tem uma razão CRM197/PS final (p/p) de 1,5/1. 6B-CRM-RA-144 1 g de PS6B microfluidizado (245 kDa,) foi diluída a 2 mg/ml em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,2). O pH foi ajustado ao pH 6,0 com 1 N de HCl. 0,1 equivalente molar de periodato (NalO4) foi então adicionado à solução PS e incubada por 18 horas no escuro em temperatura ambiente.
À solução foi então diafiltrada contra WFI (Corte 100kDa). 200 mg de PS oxidado e 240 mg de CRM197 foram liofilizados juntos (razão CRM/PS (p/p): 1,2/1) com um agente de estabilização.
PS + CRM197 liofilizado foram solubilizados com 80 ml de DMSO por 6 horas a 25ºC.
Então 2,5 equivalentes molares de triacetoxiboroidreto de sódio) foram adicionados (154,9 mg) e após 16 horas sob agitação a 25ºC, 2 equivalentes molares de NaBH, (100 mg/ml em 0,1 M de NaOH) foram adicionados e incubada por 30 min.
A solução foi diluída 5x em WFI e após 30 min foi diafiltrado 10x com 150 mM de NaCl e então 5x com PO, (K/K») 10 mM de pH7,2/150 mM de —NaCl (CortelOO kDa). Então o retido foi carregado na coluna DEAE.
A coluna foi lavada com PO, (K/K>) 10 mM pH7,2/NaCl tampão 150 mM.
O conjugado foi eluído com PO, (K/K>) 10 mM pH7,2/NaCl tampão 500 mM.
O eluído foi concentrado e diafiltrado com 5 volumes de 150 mM de NaCl e então filtrado no filtro 0,22 um.
O conjugado resultante tem uma razão
CRM/PS final (p/p) de 1,6/1.
Exemplo 6 - Imunogenicidade de conjugados 6B-CRM197 feitos pela aminação redutiva e química CDAP Os grupos de 40 camundongos Balb/c fêmeas (4 semanas de idade) foram imunizados intramuscularmente três vezes nos dias O, 14 e 28 com 0,1 ug de conjugados PS6B produzidos pela aminação redutiva ou química CDAP formulada em AIPO,.. PS6B-PD foi usado como marca de referência. Os camundongos foram sangrados no dia 42 e a resposta de anticorpo direcionada contra cada antígeno foi medida por ELISA e OPA.
Os grupos de 20 porquinhos de índia fêmeas (150 g de Hartley) foram imunizados intramuscularmente três vezes nos dias 0, 14 e 28 com 0,25 ug de conjugados PS6B produzidos pela aminação redutiva ou química CDAP adjuvantada com AIPO,. PS6B-PD foi usado como marca de referência. Os porquinhos da índia foram sangrados no dia 42 e a resposta de anticorpo direcionada contra cada antígeno foi medida por ELISA e OPA. Camundongo e porquinho da índia OPA As amostras de soro foram aquecidas por 45 min a 56ºC para inativar qualquer complemento endógeno remanescente. Vinte de cinco alíquotas de microlitro de cada 1:2 amostra de soro diluídas seriamente duas — vezes diluídas em 25 ul de tampão OPA (HBSS-14,4 % de FBS inativado) por reservatório de uma placa microtituladora de fundo redondo de 96 reservatórios. Subsequentemente, 25 ul da mistura de células HL-60 ativadas A x 10º células/ml), frescamente descongelado semente de trabalho pneumocócica e complemento de coelho filhote frescamente descongelado — por exemplo em uma razão 4/2/1 (v/v/v) foram adicionados ao soro diluído para produzir um volume final de 50 ul. A placa de ensaio foi incubada por 2 h a 37ºC com agitação orbital (210 rpm) para promover o processo fagocítico. A reação foi interrompida pela colocação da microplaca em gelo por pelo menos | min. A alíquota 20 ul de cada reservatório da placa foi então transferido no reservatório correspondente de uma microplaca de fundo plano de 96 reservatórios de 50 ul de Caldo Todd-Hewitt -0,9 % de ágar foi adicionado em cada reservatório.
Após incubação durante a noite a 37ºCe5 % de CO;, colônias pneumocócicas aparecendo no ágar foram contados usando um sistema de análise de imagem automática (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Oito reservatórios sem a amostra de soro foram usados como controles bacterianos para determinar o número de pneumocócico por reservatório.
O número médio de CFU dos reservatórios controle foi determinado e usado pelo cálculo da amostra morta para cada amostra de soro.
O titulador OPA pelas amostras de soro foi determinada pela diluição recíproca de soro capaz de facilitar 50 % da morte de pneumocócico.
O titulador opsonofagocítico foi calculado pelo uso de uma análise de ajuste de curva de 4 parâmetros.
Tabela 3 descreve os níveis de GMC obtidos pela imunização de camundongos balb/c com os conjugados feitos usando os métodos do exemplo 4. Steam o IR4APS04 | (MSL CO B4HDA) |(N:1S1.FS 200 kDa) IMZ 911 CS 260100 coa E Tabela 3 A imunogenicidade destes conjugados nos camundongos balb/c é descrita na figura 3. Juntos a figura 3 e tabela 3 demonstram que no — modelo de camundongo os conjugados produzidos pela aminação redutiva foram comparáveis com aqueles produzidos usando a química CDAP.
Em particular a figura 3 demonstra que as imunogenicidades dos conjugados produzidos usando aminação redutiva foi maior do que a imunogenicidade do conjugado feito usando a química CDAP.
Tabela 4 descreve os níveis GMC obtidos pela imunização dos porquinhos da índia com os conjugados feitos usando os métodos do exemplo 4.
Pç egg rt — ee ee O a O a O rag CO a ss FRepondedares(] amo aero ao eo mo zoo | Tabela 4 A imunogenicidade destes conjugados nos porquinhos da índia é descrita na figura 4. Similar aos experimentos realizados no modelo de camundongo, os resultados na tabela 4 e figura 4 mostram que os conjugados produzidos pela aminação redutiva foram comparáveis com aqueles produzidos usando a química CDAP, em particular PSO6B-CRM125 demonstrada significantemente maior nos níveis GMC e imunogenicidades do que o conjugado produzido usando CDAP.
Exemplo 7 Conjugação de Hib ao toxóide do tétano usando aminação —redutiva Hib-104-LS080 2,9 g de PS (dosagem de orcinol, lote AHIBCPA007) foram dissolvidos em 260 ml de 10 mM do tampão de fosfato (Na/K») pH 6,2 por 4h30 em temperatura ambiente e então durante a noite a +4ºC . Após 4 horas 155 de dissolução, PS foi diluído a 10 mg/ml com tampão de fosfato e então oxidado no escuro com 0,07 equivalente molar de NalO, durante 60 minutos.
PS oxidado foi diafiltrado (Corte de 2 kDa) contra 3,5 volumes do tampão de fosfato e então filtrado em um filtro 0,22 um.
O número de unidades de repetição obtido após oxidação foi estimado por 'H-NMR e foi observado —estaremtorno de 21. Hib-TT-LS210,212 e 213 200 mg de PS oxidado (14,56 mg/ml) foram misturados com 300 mg de TT (31,18 mg/ml, razão TT/PS (p/p): 1.5/1) e diluído a 4 mg/ml com 36,64 ml de 10 mM tampão de fosfato (Na/K») pH 6,2. A solução foi —liofilizada com um agente de estabilização.
PS + TT liofilizado foi solubilizado com 20 ml de DMSO por 6 horas a 25ºC.
Então 10 equivalentes molares de triacetoxiboroidreto de sódio foram adicionados (38,7 mg) e após
16 horas sob agitação, 2 equivalentes molares de NaBH, (100 mg/ml em O0,1M de NaOH) foram adicionados seguido por uma incubação de 30 min em temperatura ambiente.
A solução foi diluída 3x pela adição de WFI seguido pela etapa de diafiltração (5 volumes de WFI seguido por 5 volumes de 10 mM de tampão de acetato 150 mM de NaCl pH 6,2, 100 kKDa MWCO). À amostra foi então carregada na resina Sephacryl S300HR.
A eluição foi realizada em 10 mM de tampão de acetato usando 150 mM de NaCl (pH 6,2). As frações interessantes foram unidas e filtradas em um filtro 0,22 um.
Os conjugados resultantes tem uma razão TT/PS final (p/p) de 2,1/1.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Processo para a conjugação de um antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b) reagiro antígeno ativado e uma proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado ou a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; b)) reagir o antígeno ativado e um ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado ao ligante; c) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno-ligante e d) reagiro antígeno-ligante com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado; em que o antígeno se origina de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Salmonella Vi ou Staphylococcus epidermidis, em que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano e que a etapa a) compreende reagir o antígeno com periodato.
2. Processo para a conjugação de um antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; a”) liofilisar o antígeno ativado e uma proteína carreadora seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF;
b) reagiro antígeno ativado e a proteína carreadora para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduziro grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno conjugado; ou a) ativaro antígeno para formar um antígeno ativado; a) liofilisar o antígeno ativado e um ligante seguido pela reconstituição em DMSO ou DMF; b)) reagir o antígeno ativado e o ligante para formar um grupo imina que liga o antígeno ativado à proteína carreadora e c) reduzir o grupo imina usando um agente redutor que compreende uma porção de triacetoxiboroidreto para formar um antígeno- ligante; d) reagiro antígeno-ligante com uma proteína carreadora para formar um antígeno conjugado, em que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano e que a etapa a) compreende reagir o antígeno com periodato.
3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a2, caracterizado pelo fato de que o agente de redução não contém uma porção cianoboroidreto.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um sacarídeo bacteriano que se origina de S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, S. aureus, E.
faecalis, E. faecium, Salmonella Vi ou S. epidermidis.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um sacarídeo capsular bacteriano de um sorotipo de S. pneumoniae selecionado do grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, TF, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 194, 19F, 20, 22F, 23F e
33F.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular bacteriano é sacarídeo capsular de S. pneumoniae 23F.
7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular bacteriano é sacarídeo capsular de S. pneumoniae OB.
8. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo bacteriano é polissacarídeo ou oligossacarídeo de Haemophilus influenzae b (Nib).
9. Processo de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é uma proteína selecionada do grupo que consiste de toxóide do tétano (TT), fragmento C de TT, toxóide da difteria, CRM197, Pneumolisina, proteína D, PhtD, PhtDE e NI19.
10. Processo de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o antígeno e a proteína carreadora são liofilizadas após a etapa a).
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o antígeno e a proteína carreadora são liofilizados na presença de um açúcar não redutor.
12. Processo de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende reagir o antígeno com periodato, opcionalmente com 0,0001 a 0,7 equivalentes molares de —periodato.
13. Processo de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa adicional e) de purificar o antígeno conjugado e/ou que compreende uma etapa adicional f) em que o antígeno conjugado é filtrado estéril e/ou uma etapa adicional de misturar o antígeno conjugado com antígenos adicionais.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os antígenos adicionais compreendem pelo menos 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 sacarídeos de S. pneumoniae selecionados do grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 194, 19F, 20, 22F, 23F e 33F.
15. Processo de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o antígeno conjugado é misturado com um adjuvante opcionalmente em que o adjuvante é um sal de alumínio.
1/4 i ; TIO om nerera noso e aa acac rece eee rear nno Err rrrrrrrrrrrrrrrrrmTremrcecanao ' 7 Foo asa, . à Â Dra. GO derme
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E UG) [O 0.2 04 0.6 o8 1 12 Equivalentes molares de periodato Figura 1
350 Ts o E La oO DIIIEçO resultados de ELISA 200 : Ra go : Do . Db o 5100 SOS ” RSA Ss ERES STA :z DESA : : so - IA o o EE e SSRS ADA PSZBRCRMCDAR PS23F-CRM RA conjugado 10000 e OPA ERES É o m Sm DO E 500 RREO É 4000 => ASAS $ som LE s 2000 = o E o a ERAS CO a AGENTES RAR ARNO o o.
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Avaliação de imunogenicidade de PSO06B-CRM conjugado ta em modelo de camundongo Balb/c - E . > 118. = sx + EE Da E CE.
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T “RS = ss Es E is o 1 o io EEE tias] o = Es - e E E FE ES ES 156 j o ER ESSA ao Es FERE NESSE : PSESB-CRHS22 PSOBB-CRMIZI PESSB-CRITIA PSIGB-CRIA25 PStEB-CAMINITODAR) PSISB.PD i (RIM PSEIKDS) ARSH,PSSS EDS) (RESH PSCISORDA) — (RIZSH,PSÍSONOA)
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Figura 4
BR112013021780-4A 2011-03-07 2012-03-05 Processo para a conjugação de um antígeno BR112013021780B1 (pt)

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