BR112013015627B1 - Cepa de saccharomyces cerevisiae - Google Patents
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Abstract
cepa de s. cerevisiae e cepa de levedura trata-se de um problema recentemente constatado e solução para a modificação de s. cerevisiae para fermentar xilose para produzir etanol que utiliza xilose isomerase para converter xilose em xilulose para entrada, por meio de xiluloquinase, na trajetória de fosfato de pentose. quando proliferada em um meio que contém xilose, xilitol tende a acumular na célula apesar da ausência de atividade de xilose redutase em s. cerevisiae. o xilitol inibe a atividade de xiloses isomerases. uma solução descrita é expressar simultaneamente uma xilitol desidrogenase exógena juntamente com a xilose isomerase exógena, enquanto que também sobre-expressa opcionalmente xiluloquinase na ausência de expressão de uma xilose redutase. outra solução é uma xilose isomerase de bacteroides fragilis, que é menos inibida por xilitol do que outras xiloses isomerases, exemplificada por xilose isomerase de e.coli. a expressão da xilose isomerase de bacteroides fragilis pode ser usada sozinha, ou em combinação com a expressão de uma xilitol desidrogenase e, opcionalmente, sobre-expressão de xiluloquinase para aprimorar a produção de etanol a partir de xilose.
Description
[001] A capacidade de produzir etanol a partir de matérias-primas celulósicas por fermentação em uma escala comercial é um objetivo há muito buscado. Para ser econômica, a quantidade de etanol produzida deve ser suficiente para vale a pena pelo custo de preparação da matéria-prima e processamento do produto final. Para produzir quantidades suficientes de etanol é exigido um organismo de fermentação que é biologicamente eficaz na produção de etanol em comparação à produção de outros produtos metabólicos. A eficácia é determinada por rendimento e produtividade, sendo que o rendimento é expresso como uma porcentagem em peso de matéria-prima de açúcar (tipicamente sacarose ou glicose) convertida em etanol, e sendo que a produtividade é expressa como a quantidade máxima de etanol que pode ser produzida como uma porcentagem de volume/volume do meio de fermentação antes que a fermentação se encerre devido à toxicidade do etanol. Nesse aspecto, de longe, o micro-organismo de produção de etanol mais eficaz é a levedura de panificação S. cerevisiae.
[002] As cepas de produção eficaz de etanol de S. cerevisiae são capazes de converter 90 a 93% de uma fonte de carbono com base em açúcar em etanol em base p/p e o etanol pode tipicamente acumular até 16 a 17% do volume do meio de fermentação. O açúcar para produção em escala comercial de etanol é convencionalmente obtido através da extração de sacarose da beterraba sacarina ou cana-de-açúcar, ou através da hidrólise de amido de milho para produzir glicose. A sacarose e amido de milho, entretanto, representam apenas uma pequena fração dos açúcares totais no material de planta, cuja maior parte é contida na celulose de hemicelulose de polímeros de β glicosídeo, sendo que o último é um polímero ramificado dos açúcares C6 glicose e manose e dos açúcares C5 xilose e arabinose.
[003] Há diversos métodos na técnica para produzir hidrolisados de celulose e hemiceluloses para produzir matérias-primas que contém glicose, manose, xilose e arabinose. Para hidrolisados típicos de palha de milho, a glicose representa 14,4%, a manose 0,9%, a xilose 66,1% e a arabinose 11,8% dos açúcares. Para os hidrolisados típicos de fibra de milho, a glicose representa 48,6%, a xilose 25,2% e a arabinose 17,6% dos açúcares. A Glicose e manose são eficazmente convertidas em etanol durante o metabolismo anaeróbico natural, entretanto, S. cerevisiae carece do maquinário enzimático para converter o açúcar dominante, xilose, em etanol. Para realizar o mesmo exige engenharia genética de S. cerevisiae para expressar enzimas metabólicas que podem converter xilose em fosfato de xilulose - um metabólito C5 que é parte da trajetória de fosfato de pentose, que essencialmente produz intermediários que podem entrar na trajetória glicolítica e serem convertidos em etanol durante a fermentação anaeróbica. Normalmente, dentro da trajetória de fosfato de pentose, o fosfato de xilulose é derivado de fosfato de ribulose pela ação de um epimerase, mas em adição, S. cerevisiae contém a enzima xiluloquinase, que pode diretamente fosforilar xilulose. A xilulose, entretanto, é um metabólito raro, e o nível de expressão de xiluloquinase em S. cerevisiae é baixo. Mas, mais importante, a xiluloquinase não fosforila xilose, e S. cerevisiae carece das enzimas necessárias para converter xilose em xilulose, portanto é incapaz de utilizar a xilose como uma fonte de carbono sem engenharia metabólica.
[004] Há duas abordagens para modificar S. cerevisiae para produzir xilulose a partir de xilose. A primeira é representada pela Patente n° U.S. 5.789.210 de Ho et al, é a rota de três genes XR-XD-XK, que sobre-expressa xiluloquinase (XK) simultaneamente com uma xilose redutase exógena (XR) que reduz xilose em xilitol, e uma xilitol desidrogenase (XD), que oxida xilitol em xilulose. Essa abordagem, entretanto, cria um desequilíbrio redox em S. cerevisiae, visto que a xilose redutase utiliza NAD(H) como o cofator de redução, enquanto que xilitol desidrogenase usa NADP+ como o cofator de oxidação. Esse desequilíbrio afeta negativamente a proliferação e produtividade de S. cerevisiae, encerrando a produção eficaz de etanol a partir de xilose. Uma opção para superar esse problema é usar uma xilose redutase mutante que tem um km inferior para NAD+ do que NADP+, restaurando, assim, o equilíbrio redox conforme foi descrito, por exemplo, por Petschacher B, et. al. (Biochem J2005, 385:75 a 83).
[005] A segunda abordagem é a rota de dois genes XI- XK, que é sobre-expressa xiluloquinase juntamente com uma xilose isomerase exógena (XI), que converte diretamente xilose em xilulose sem redução e subsequente oxidação. Essa abordagem é representada por: Patente n° U.S. 7.622.284 e Publicação de Patente n° US20060216804, US20080261287. Genes de uma variedade de fontes bacterianas e fúngicas de xilose isomerase compartilham o nome comum xylA. Diversas espécies de genes xylA foram identificadas das fontes bacterianas e fúngicas e algumas, mas não todas, demonstraram ser úteis na produção de etanol a partir de xilose simultaneamente sobre- expressa com xiluloquinase. Fontes bacterianas propostas para tais genes xylA incluem Thermits thermophilic (Patente n° U.S. 7.622.284), Bacteroides thetaiotaomnicron (US20060216804, US20080261287) e Xanthamonus. Diversas fontes fúngicas de genes xylA também foram propostas, incluindo de Neocallimastix, Caecomyces, Piromyces, Orpinomyces, ou Rumnomyces (US20080261287). Consulte também Curr Op Biotech 17:320 (2006). Desses, apenas os genes xylA de Piromyces (20080014620) Orpinomyces (Madhavan A, Tamalampudi S, Ushida K, Kanai D, Katahira S, Srivastava A, Fukuda H, Bisaria VS, Kondo A. Appl Microbiol Biotechnol. 2009 82(6): 1067 a 78.) e Bacteroides thetaiotaomnicron (US20080261287) mostraram produção de etanol aprimorada em S. cerevisiae quando cossobre-expressa com xiluloquinase. Consulte também FEMS Yeast Res 4:69, FEMS Yeast Res 5:399, FEMS Yeast Res 4:655, FEMS Yeast Res 5:925.
[006] Embora a produção de etanol da abordagem de três genes e da abordagem de dois genes tenha sido demonstrada, o rendimento de etanol da xilose permanece menor do que o esperado para cepas que contém apenas aqueles recursos. Para aprimorar a produtividade, exige-se manipulação genética adicional, seja através de mutação, seleção evolucionária ou através de engenharia genética adicional. Por exemplo, US20070082386 propõe que a produção de etanol a partir de xilitol por qualquer uma da rota de dois genes ou três genes poderia ser aprimorada ao aumentar a expressão de uma enzima de transporte de xilose e/ou ao sobre-expressar os genes que codificam enzimas da trajetória de fosfato de pentose. US20060234364 divulga que mutantes que tem uma deleção em um gene gre3 endógeno que codifica uma aldol redutase não específica poderia aprimorar a produção de etanol a partir de xilitol com o uso da abordagem de dois genes. US20070155000, a partir de uma perspectiva diferente, ensina que a produção de etanol a partir de xilose que contém hidrolisados que utilizam a rota de dois genes poderia ser aprimorada através de seleção adicional para resistência contra inibidores de proliferação, como furfural e hidroximetilfurfural que são tipicamente encontrados em hidrolisados de biomassa lignocelulósica.
[007] Há ainda a necessidade na técnica de encontrar outros genes de xilose isomerase e outras combinações de múltiplos genes para aprimorar a eficácia de utilização de xilose em S. cerevisiae para a produção de etanol. A descrição que segue apresenta tais alternativas na forma de um gene xylA de xilose isomerase particular de Bacteroides fragilis e rota de três genes alternativa que inclui sobre- expressão simultânea de uma atividade de xilose isomerase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase, sem a necessidade de sobre-expressar xilose redutase.
[008] São descritas no presente documento cepas de levedura recombinantes e métodos de produção de etanol a partir das mesmas, em que xilose é uma fonte de carbono para a proliferação e produção de etanol. Um amplo aspecto inclui cepas de S. cerevisiae que tem um ácido nucleico recombinante que compreende uma sequência que codifica uma xilose isomerase exógena e uma xilitol desidrogenase exógena, em que cada uma é ligada de modo operacional a um promotor para sobre-expressar os genes exógenos; com a condição de que a cepa também não sobre-expresse uma atividade de xilose redutase exógena na cepa de S. cerevisiae. Um recurso de uma xilose isomerase exógena exemplificativa é que a mesma é menos inibida por xilitol do que é uma xilose isomerase homóloga de E. coli. Um exemplo particular é uma xilose isomerase derivada de um gene xylA de uma cepa de Bacteroides fragilis. Sequências e vetores exemplificativos que codificam tais genes também são descritos. Esses aspectos podem ser opcionalmente incluídos com cepas de levedura que também sobre-expressam uma atividade de xiluloquinase.
[009] Outro aspecto são cepas de levedura obtidas pela seleção evolucionária dos tipos antecedentes de cepas parentais. A seleção evolucionária inclui expressar em uma cepa parental de levedura um ácido nucleico que codifica uma xilose isomerase exógena ligada de modo operacional a um promotor para expressar a xilose isomerase exógena na cepa parental de levedura. É executada uma primeira proliferação da cepa parental de levedura em um meio líquido que contém xilose como uma fonte de carbono principal para produzir uma população de cepas de levedura descendentes, é executada uma segunda proliferação da população das cepas de levedura descendentes em um meio sólido que contém xilose como uma fonte de carbono principal. A seleção é feita para obter uma cepa derivada de proliferação rápida a partir das cepas de levedura descendentes, caracterizada em que as cepas derivadas de proliferação rápida de levedura se proliferam mais rápido do que outras leveduras na população de cepas de levedura descendentes no meio sólido. As etapas de primeira e segunda proliferação e seleção são repetidas para finalmente obter uma cepa de levedura final selecionada que produz mais etanol a partir de xilose do que a cepa parental de levedura. O método é exemplificado com uma cepa de levedura em que a xilose isomerase é codificada por um gene xylA de B. fragilis. O método pode ser adicionalmente implantado quando a cepa parental expressa ainda um ácido nucleico que codifica uma xilitol desidrogenase exógena ligada de modo operacional a um promotor para expressar a xilitol desidrogenase exógena na cepa parental de levedura. Uma cepa exemplificativa produzida por tal processo é descrita nas Figuras como Y500+bsd+XIbf"e" e depositada como cepa número NRRL Y-50424.
[010] A Figura 1 ilustra a proliferação (OD600) de culturas de frasco de S. cerevisiae que proliferam em meio YEP + 2% xilose ao longo do tempo (horas). Todas as cepas foram derivadas de cepa Y500 que produz etanol parental e cada uma dessas porta um marcador de resistência a blasticidina (bsd). 421i é um transformante que porta o XI (xylA) de Bacteroides fragilis acionado pelo promotor HXT7 de S. cerevisiae e foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste nos Laboratórios de Pesquisa Regional do Norte de Serviços de Pesquisa Agrícola (Agricultural Research Services Northern Regional Research Laboratories) como número de depósito NRRL Y-50423 em 12 de outubro de 2010. 437i porta os mesmos XI e XD (xyl2) de Pichia stipitis acionados pelo promotor XD de P. stipitis, também depositado com o número NRRL Y-50424. 437:xks porta os mesmos XI e XD e porta uma cópia extra de XKS (xks) de S. cerevisiae, também depositado com número NRRL Y-50425.
[011] A Figura 2 mostra uma comparação de atividade de xilose isomerase de E. coli e xilose isomerase de B. fragilis na presença de concentrações variadas de xilitol. A atividade é relatada como a porcentagem de atividade obtida na ausência de xilitol.
[012] A Figura 3 retrata um mapa de plasmídeo de bsdYEMhxt-XIbf-cycl, que é um plasmídeo que replica levedura que porta xylA de B. fragilis sob controle do promotor hxt7 de S. cereiviase.
[013] A Figura 4 retrata um mapa de plasmídeo de bsdYIMrDNA Pxd-XD Phxt-XIbf, que é um vetor integrativo usado para cruzar xylA de B. fragilis sob controle do promotor hxt7 de S. cerevisae e XD de Pichia stipitis (consulte Patente n° U.S. 5.789.210) sob o controle do promotor xd de P. stipitis no cromossomo de S. cerevisiae.
[014] A Figura 5 retrata um mapa de plasmídeo do plasmídeo 421, que é um vetor integrativo de levedura usado para cruzar xylA de B. fragilis sob controle do promotor hxt7 de levedura e resistência à blasticidina para o cromossomo de S. cerevisiae.
[015] A Figura 6 retrata um mapa de plasmídeo do plasmídeo 426, um vetor integrativo de levedura usado para cruzar xylA de B. fragilis sob controle do promotor hxt7 de levedura para o cromossomo de S. cerevisiae.
[016] A Figura 7 mostra a sequência de proteína de tipo selvagem para XI do gene xylA de B. fragilis (SEQ. ID NO: 2).
[017] A Figura 8 mostra a sequência de proteína mutante para XI do gene xylA de B. fragilis, em que a mudança na sequência de nucleotídeo para acentuar a transcrição resulta em uma proteína mutante em que uma serina substitui a alanina na posição 2 (SEQ. ID NO: 4).
[018] A Figura 9 mostra a sequência de nucleotídeo de tipo selvagem para xylA de B. fragilis. (SEQ. ID NO: 1)
[019] A Figura 10 mostra a sequência de nucleotídeo mutante (SEQ. ID NO: 3) que codifica o xylA mutante de acordo com SEQ. ID NO: 4.
[020] A Figura 11 mostra outra sequência de nucleotídeo mutante (SEQ. ID NO: 5) que também codifica o xylA mutante de acordo com SEQ. ID NO: 4 aperfeiçoado para a expressão em S. cerevisiae.
[021] A seguinte descrição e Antecedentes acima fazem citações a certas referências que podem ajudar uma pessoa de habilidade comum na técnica a entender a presente invenção e que podem fornecer materiais, informações, técnicas, proteínas, vetores e sequências de nucleotídeos que podem auxiliar uma pessoa de habilidade comum na técnica a realizar e usar aspectos da presente invenção em seu escopo mais amplo. Consequentemente, cada referência citada é incorporada nesse pedido de patente como se tivesse sido originalmente depositada a partir da mesma ao ponto em que os ensinamentos das referências citadas não entram em conflito com os ensinamentos do presente pedido de patente, em cujo caso os ensinamentos desse pedido de patente devem ser considerados por ter controle sobre os ensinamentos conflitantes da técnica incorporada no presente documento a título de referência.
[022] Um aspecto da invenção é a constatação de que a xilose isomerase de Bacteroides fragilis é menos sensível à inibição de xilitol do que são as outras xiloses isomerases. Exemplos de outras xiloses isomerases incluem, mas não se limitam a, aquelas dos fungos Piromyces ou Orpinomyces ou das isomerases bacterianas fraternais de E. coli, L. lactis e Bacteroides thetaiotaonmicron que foram previamente descritas na técnica. Duas xiloses isomerases de B. fragilis da presente invenção com sensibilidade reduzida à inibição de xilitol têm as sequências de peptídeo de acordo com SEQ. ID NOS:2 e 4 mostradas nas Figuras 7 e 8, respectivamente. A SEQ. ID NO: 2 é uma sequência de tipo selvagem para o gene xylA de B. fragilis que foi isolada pelos presentes inventores e que é codificada pela sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ. ID NO: 1 mostrada na Figura 9. A SEQ. ID NO: 4 é um xylA mutante produzido pelos presentes inventores para acentuar a transcrição em S. cerevisiae e que é codificada pela sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ. ID NO: 3 mostrada na Figura 10. As proteínas XI, de acordo com SEQ. ID NO: 2 e 4, são idênticas, exceto que a mutação para acentuar a transcrição também resulta em uma mudança de uma alanina para uma serina na posição 2 da proteína, de acordo com SEQ ID NO:4. A SEQ. ID NO: 4 é também codificada por SEQ. ID NO: 5 mostrada na Figura 11, que preserva a mudança na sequência de nucleotídeo para a acentuação da transcrição, mas que também tem mudanças no uso de códon para aperfeiçoar a síntese de proteína em S. cerevisiae. As proteínas XI de B. fragilis, de acordo com SEQ. ID NO: 2 e 4, são apenas 78,5% idênticas às sequências de proteína para XI de Piromyces, 77,9% idênticas à sequência de Orpinomyces, 46,2% idênticas à sequência de L. lactic, 52,5% idênticas à sequência de C. difficile, 47,3% idênticas à sequência de E. coli, e 90% idênticas à sequência de Bacteroides thetaiotaomnicron. Consequentemente, um XI de B. fragilis útil para a presente invenção tem mais do que 90%, mais do que 92,5%, mais do que 95%, ou mais do que 98% de identidade de sequência de aminoácido em relação à SEQ.ID NO: 2 ou SEQ.ID NO: 4.
[023] Um recurso distintivo das isomerases de B. fragilis descritas no presente documento é que as enzimas são menos inibidas por xilitol do que as sequências de XI ortólogas de outro organismo. A Figura 3 mostra uma comparação da inibição de xilitol de XI de B. fragilis de acordo com SEQ. ID NO: 4 em comparação a seu ortólogo de E. coli. Em 12,5 mM de xilitol, a atividade de XI de E. coli é >97% inibida, em contraste com XI de B. fragilis, que retém pelo menos 30% de sua atividade com a mesma concentração de xilitol.
[024] Embora as diferenças precisas na estrutura de proteína que representam a menor inibição por xilitol para a enzima de B. fragilis não serem conhecidas no momento, a relação entre as diferenças estruturais e funcionais mais importantes podem ser caracterizadas de vários modos. Uma caracterização do escopo de XI de B. fragilis fornecido no presente documento é que a mesma é uma proteína que codifica uma atividade de xilose isomerase para converter xilose em xilulose, e que tem pelo menos 90% de identidade para SEQ. ID NO: 2 ou 4. Outra é que a mesma é uma proteína que codifica uma atividade de xilose isomerase para converter xilose em xilulose, e que é mais idêntica a SEQ. ID NO: 2 ou 4 do que a uma sequência de proteína XI de Piromyces, Orpinomyces, E. coli, ou Bacteroides thetaiotaomnicron. Ainda outra caracterização é que é uma proteína que codifica uma atividade de xilose isomerase para converter xilose em xilulose que é menos inibida por xilitol do que uma sequência de proteína XI de Piromyces, Orpinomyces, E. coli, ou B. thetaiotaomnicron. Os polinucleotídeos fornecidos no presente documento acompanham as mesmas definições funcionais que são sequências de nucleotídeos que codificam tais proteínas funcionais, conforme caracterizado acima, e/ou que hibridizariam em SEQ. ID NO: 1, 3 ou 5 em condições de hibridação rigorosas sob as quais as mesmas não hibridizariam em sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína com atividade de XI de Piromyces, Orpinomyces ou Bacteroides thetaiotaomnicron.
[025] Outro aspecto dos presentes ensinamentos é o uso dos genes XI de B. fragilis acima e proteínas expressas para, desse modo, modificar S. cerevisiae para a produção de etanol a partir de xilose. Em uma primeira modalidade, um polinucleotídeo de xylA de acordo com SEQ. ID NO: 5 que codifica a proteína XI de acordo com SEQ. ID NO:4 foi ligado de modo operacional ao promotor hxt7 de S. cerevisiae e terminador cyc no plasmídeo de levedura de múltiplas cópias que se replica de forma autônoma bsdYEMhxt-XIbf-cycl mostrado na Figura 3. Em outras modalidades, a mesma unidade transcricional para a expressão da proteína XI de B. fragils foi também modificada em plasmídeos de integração bsd rDNA Phxt-Xibf 421 (o construto 421) e rDNA Phxt-XIbf 423 (o construto 423) mostrados na Figura 5 e 6, respectivamente. Cada um desses plasmídeos integrativos contém sequências de nucleotídeos para genes de RNA ribossômico de levedura para a recombinação direcionada no cromossomo em uma região que codifica um RNA ribossômico, que são genes de múltiplas cópias em S. cerevisiae. O plasmídeo 423 porta o gene marcador para a resistência à canomicina, enquanto que o plasmídeo 421 porta adicionalmente o gene marcador bsd, que confere resistência ao fungicida blasticidina.
[026] O construto 421 foi integrado ao cromossomo de uma cepa parental de S. cerevisiae Y500, que é uma cepa de levedura produtora de etanol comercial exemplificativa. Essa cepa comercial tem características típicas de outras cepas comercialmente disponíveis, como Etanol Red™, disponível junto ao Lesaffre Group (Cedar Rapids Iowa) em termos de produtividade de etanol. Os transformantes que contém o construto 421 foram selecionados para resistência à blasticidina. Um transformante inicial referido na Figura 1 como 42li foi testado para sua capacidade de se proliferar em frascos em meio que contém extrato de levedura e peptona (YEP) com 2% em p/v de xilose como a única fonte de carbono em comparação a um controle que contém o mesmo vetor bsd, mas que carece da região de codificação XI de B. fragilis (Y500 +bsd). Conforme mostrado na Figura 1, a cepa de controle encerrou a proliferação no meio YEP dentro das primeiras horas, presumidamente após a exaustão das fontes de carbono residual do meio YEP. Em contraste, a cepa que porta o construto 421 que expressa XI de B. fragilis continuou a proliferação em xilose por um período de pelo menos 150 horas.
[027] Outro aspecto da presente invenção é reconhecer que um dos problemas com a rota de dois genes de xilose isomerase / xiluloquinase para a produção etanol a partir de xilose é o acúmulo inesperado de xilitol dentro da célula. Isso é uma constatação surpreendente, visto que S. cerevisiae não contém naturalmente uma atividade de xilose redutase. Sem querer se ater à teoria, observa-se que a atividade de uma ou mais aldol redutases não específicas, como aquelas codificadas pelo gene gre3 de S. cerevisiae podem estar convertendo uma porção significativa dos açúcares de aldol, incluindo xilose, em xilitol. Devido ao que foi mencionado acima, xilitol é um inibidor de xiloses isomerases, o acúmulo intracelular de xilitol pode inibir a isomerização de xilose em xilulose, retardando a produção de etanol a partir de xilitol. A Publicação de Patente n° U.S. 20080261287 pode tratar pelo menos parcialmente esse problema em outro sistema por deleção do gene gre3 enquanto que sobre-expressa simultaneamente um gene xylA de xilose isomerase de Piromyces em S. cerevisiae. Entretanto, apesar de relatar que tais cepas dificilmente acumulam xilitol, os rendimentos de etanol a partir de xilose permanecem baixos, o que os presentes inventores afirmam ser devido a outros fatores que pode causar o acúmulo de xilitol.
[028] Para compensar por isso, uma modalidade da invenção é realizada para expressar simultaneamente uma xilitol desidrogenase exógena juntamente com a xilose isomerase exógena. Isso representa uma solução de 2 genes inovadora na qual, embora a xilose seja indiretamente acionada para xilulose por XI, simultaneamente, o agrupamento não especificamente acumulado de xilitol também é purgado para xilulose por XD que evita a inibição de conversão de XI de xilose em xilulose por xilitol.
[029] Y500 foi modificada com o vetor de integração cromossômica, plasmídeo bsdYIMrDNA.Pxd-XD Phxt-Xibf (437), mostrado na Figura 4. Esse plasmídeo porta o bsd, gene de resistência, o gene xylA que codifica XI de B. fragilis ligado de modo operacional sob o controle do promotor hxt7 de levedura, como nos construtos 421 e 423 mencionados acima, mas ainda porta o gene xyl2 de P. stipitis (consulte o documento no U.S. 5.789.210), que codifica XD ligado de modo operacional sob controle do promotor XD de P. stipitis. Cepas resistentes à blasticidina que tem seu vetor integrado ao cromossomo Y500 foram selecionadas e testadas para a capacidade de utilizar xilose para proliferação e para fermentar xilose para produzir etanol.
[030] A Figura 1 mostra a proliferação do construto 437 de XI / XD em frascos de agitação no meio que contém 2% de xilose como a única fonte de carbono adicionada em comparação às cepas de controle Y500, Y500 que expressam XD sozinhas, e Y500 que expressa XIbf sozinha. A taxa de proliferação da cepa que expressa ambos XI e XD foi acentuada em cada uma das cepas de controle.A solução de simultaneamente expressar XI e XD pode também ser vantajosamente implantada com uma solução de três genes, que inclui ainda sobre-expressar xiluloquinase (XK). Diferentemente da rota de três genes com o uso da combinação de xilose redutase e xilitol desidrogenase e sobre- expressão de xiluloquinase, a presente invenção não exige, e de fato, preferencialmente omite a expressão de uma atividade de xilose redutase. A sobre-expressão de XK poderia aprimorar a produção de etanol a partir de xilose nos casos em que o sobreacúmulo de xilulose limita a taxa. Tal condição pode ser o caso em que uma ou mais das atividades de XI ou XD são também sobre-expressas, ou quando aquelas atividades são modificadas para produzir um número maior de rotatividade ou inibição alostérica reduzida.
Claims (9)
1. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, que tem um ácido nucleico recombinante, caracterizada por consistir na sequência que codifica uma xilose isomerase exógena de acordo com qualquer uma dentre SEQ. ID NO: 1, SEQ. ID NO: 3 ou SEQ. ID NO: 5 e uma xilitol desidrogenase exógena codificada por um gene xyl2 de Pichia stipitis, em que cada uma é ligada de modo operacional a um promotor para sobre-expressar a xilose isomerase exógena e xilitol desidrogenase exógena; sem que a cepa sobre-expresse uma atividade de xilose redutase exógena na cepa de Saccharomyces cerevisiae.
2. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela xilose isomerase exógena ser menos inibida por xilitol do que é uma xilose isomerase homóloga de Escherichia coli.
3. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela xilose isomerase exógena ser derivada de um gene xylA de uma cepa de Bacteroides fragilis que tem uma sequência de proteína de acordo com SEQ. ID NO: 2.
4. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo ácido nucleico que codifica a xilose isomerase exógena consistir na sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID NO: 3 e SEQ. ID NO: 5.
5. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita cepa incluir ainda um ácido nucleico ligado de modo operacional a um promotor de levedura para sobre-expressar uma atividade de xiluloquinase na cepa, em que a atividade de xiluloquinase é fornecida pelo gene xks de Saccharomyces cerevisiae.
6. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita cepa produzir mais etanol por fermentação de xilose do que uma cepa idêntica que sobre-expressa xilose isomerase e xiluloquinase, mas não sobre-expressa a xilitol desidrogenase exógena.
7. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por pelo menos um dos ácidos nucleicos recombinantes que codificam a xilose isomerase exógena e a xilitol desidrogenase exógena ser integrado ao genoma da cepa de Saccharomyces cerevisiae.
8. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por pelo menos dois dos ácidos nucleicos recombinantes que codificam a xilose isomerase exógena e a xilitol desidrogenase exógena serem integrados ao genoma da cepa de Saccharomyces cerevisiae; e a cepa incluir um ácido nucleico que codifica uma enzima de xiluloquinase ligada de modo operacional a um promotor para sobre-expressar a xiluloquinase também integrada ao genoma.
9. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser a cepa Y500+bsd+XIbf"e" depositada como NRRL Y 50424.
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