BR112013003062A2 - processo de fabricação de uma cápsula em gel mole estável contendo bactéria probiótica, microencapsulada - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE UMA CÁPSULA EM GEL MOLE ESTÁVEL CONTENDO BACTÉRIA PROBIÓTICA, MICROENCAPSULADA. Uma cápsula de gelatina mole contendo bactérias probióticas microencapsuladas é fabricada, de modo que a cápsula de gelatina mole seja estável durante pelo menos cerca de 24 meses em temperatura ambiente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO Ú DE FABRICAÇÃO DE UMA CÁPSULA EM GEL MOLE ESTÁVEL CON- : TENDO BACTÉRIA PROBIÓTICA, MICROENCAPSULADA". O presente Pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos Nº 61/372.350, depositado 10 de agosto de 2010, a divulgação completa do qual é aqui incorporada por referência.

CAMPO TÉCNICO A invenção refere-se a um processo de fabricação de uma cáp- sula em gel mole contendo bactérias probióticas microencapsuladas e ao produto fabricado de acordo com este processo. Mais especificamente, o ? produto da presente invenção é estável em temperatura ambiente durante pelo menos 24 meses. ' ANTECEDENTES Probióticos são adjuvantes dietéticos com base em micro-orga- nismos que afetam beneficamente a fisiologia do hospedeiro ao modular a imunidade mucosal e sistêmica, bem como melhorar a função intestinal e equilíbrio microbiano no trato intestinal (Naidu, A.S. et a/. (1999), Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB). Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 39: 3-126). Vários efeitos nutricionais e terapêuticos têm sido atribuídos a estes probióti- cos, incluindo: modulação de resposta imune, diminuição das concentrações de colesterol no soro, melhora dos sintomas de intolerância à lactose, au- mento da resistência à doenças intestinais infecciosas, diminuição de dura- ção da diarreia, redução da pressão sanguínea e auxílio na prevenção de câncer de cólon. No entanto, a fim de exercer estes efeitos benéficos sobre o hospedeiro, os probióticos deve reter sua viabilidade e atingir o intestino grosso em grandes quantidades (Favaro-Trindade, C. S. et a/. (2002), J Mi- croencapsulation 19(4): 485-494)). Bactérias probióticas eficazes devem ser capazes de sobreviver às condições gástricas e colonizar o intestino, pelo menos temporariamente, mediante adesão ao epitélio intestinal (Conway, P. (1996), Selection criteria for probiotic microorganisms. Asia Pacific J. Clin. Nutr 5: 10-14).

Bactérias produtoras de ácido láctico ou Lactobacilos são os probióticos mais comumente usados para incorporação em produtos lácteos, : tais como iogurtes, leites fermentados e kefirs, e seu uso vem se tornando cada vez mais difundido.

Por exemplo, eles são agora adicionados na forma de suplementos dietéticos, tais como pós, cápsulas e comprimidos.

Bifido- bactérias e Estreptococos são também micro-organismos probióticos comu- mente usados.

Bacilos de ácido láctico geralmente requerem um sistema de distribuição eficiente que retém atividades probio-funcionais (isto é, ade- são/retenção no intestino, produção de bacteriocinas/enzimas) após a sua renovação (Salminen, S., et al. (1996), Clinical uses of probiotics for stabiliz- ” ing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges.

Antonie Van Leeuwenhoek 70: 347-3581). Além disso, além de aumentar a viabilida- " de in vivo e expectativa de vida no trato gastrintestinal, a vida útil prolonga- da em temperatura ambiente continua a ser um desafio para a fabricação de produtos comerciais eficazes.

Embora tenha sido mostrado que liofilização de bactérias probióticas é um processo eficaz para preservação e distribui- ção de probióticos, vários fatores físico-químicos, tais como umidade, aera- ção (disponibilidade de oxigênio), processamento (isto é, agitação) e tempe- ratura, poderiam comprometer a viabilidade celular e, consequentemente, a vidaútil A estabilidade, viabilidade (isto é, teor microbiano viável) e qua- lidade de produtos contendo bactérias probióticas têm sido problemáticos, conforme evidenciado pela literatura científica.

Em um estudo sobre iogurtes, os experimentos produziram evidências de que três dos seis produtos testa- dos continham vestígios de micro-organismos vivos e dois continham ape- nas baixas concentrações (Shah (2000) Journal of Dairy Science, 83 (4): 894-907). Relatórios similares têm questionado produtos contendo bactérias probióticas distribuídos em formas de dosagem sólidas, tais como pós, cáp- sulas e comprimidos.

Os desafios predominantes à estabilidade de bactérias probióticas são atividade de água, estresse físico de processamento e tem- peratura.

Também tem sido um desafio aplicar medidas de proteção, tais como revestimentos, que libertarão as bactérias probióticas no local de dis-

tribuição apropriado no corpo e permitir que o probiótico colonize. A distribui- " ção e colonização apropriadas das bactérias probióticas revestidas foram : recentemente confirmadas por um estudo recentemente publicado (Del Pia- no, M., et al. (2010), Evaluation of the intestinal colonization by microencap- sulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains, Jour- nal of Clinical Gastroenterology, 44 Sup. 1: S42-6).

Suspensões oleosas têm sido usadas para aumentar a viabilida- de e vida útil de probióticos. Por exemplo, a Publicação de Pedido de Paten- te dos Estados Unidos Nº 2004/0223956 descreve uma composição conten- do bactérias probióticas em suspensão em um óleo comestível e, opcional- . mente, encapsulada em uma cápsula com envoltório duro em duas partes. Além disso, aqueles versados no campo têm tentado usar mi- À croesferas de probiótico para aumentar a viabilidade e vida útil. Por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº 2005/0266069 descreve formulações probióticas contendo microesferas de probiótico que têm um núcleo de uma bactéria probiótica e um excipiente celulósico reves- tido com agentes de revestimento e plastificantes.

A experiência tem mostrado que produtos farmacêuticos ou ou- tros itens para consumo humano ou animal podem ser segura e convenien- temente embalados em um envoltório duro ou mole (cápsula em gel mole).

Cápsulas moles ou de gel mole cheias em uma parte são am- plamente conhecidas e usadas durante muitos anos e para uma variedade de finalidades e são capazes de reter um material de enchimento líquido. Mais frequentemente, cápsulas de gel mole são usadas para encerrar ou —contermateriais de consumo, tais como vitaminas, minerais, frutas e extratos botânicos e farmacêuticos, em um veículo ou carreador líquido.

A encapsulação dentro de uma cápsula mole de uma solução ou dispersão de um agente nutricional ou farmacêutico em um veículo líquido oferece diversas vantagens com relação à outras formas de dosagem, tais como comprimidos, comprimidos sólidos revestidos ou não revestidos ou preparados líquidos a granel. Encapsulação de uma solução ou dispersão permite distribuição precisa de uma dose unitária. Cápsulas moles constitu-

em uma forma de dosagem que é fácil de engolir e não precisam ser aroma- 1 tizadas, uma boa barreira ao oxigênio (isto é, baixa permeabilidade ao oxi- ' gênio através do envoltório da cápsula) e proteção contra violação. Cápsulas moles são também mais facilmente transportadas do que produtos alimentí- cioselíquidos, tais como iogurte e leite.

Probióticos estão comercialmente disponíveis em cápsulas de gel mole ou sem costura. Bifa-15"" (Eden Foods, Inc., Clinton, Michigan) é um sistema de distribuição por microencapsulação sem costura para Bifido- bactérias, alegando conter três bilhões de bactérias. As cápsulas são mistu- radas com oligossacarídeos, edulcorantes e aromatizantes e apresentadas . em tubos de alumínio com dose única, individualmente embalados. Os con- teúdos são vertidos na boca, contanto que as cápsulas sejam engolidas in- : teiras e não mastigadas. Ultra-Dophilus'” (Plus Nature, Melville, NY) é uma cápsula em gel mole de tamanho convencional contendo dois bilhões de L. —acidophilus viáveis liofilizados. Probiotocs12Plus"“M são cápsulas de gel mole contendo 12 cepas de bactérias do ácido láctico com o objetivo de uma po- tência de 900 unidades de formação de colônia no momento de fabricação e nenhuma refrigeração necessária. Embora cada produto declare uma viabili- dade no momento de fabricação, não há garantia de que a reivindicação do rótulo será satisfeita após armazenamento em temperatura ambiente, por exemplo, 22-25ºC, no futuro. Problemas similares na manutenção de viabili- dade em probióticos contidos em cápsulas de gel são também evidentes a partir da literatura de patentes. As cápsulas de gel mole na técnica contendo bactérias probióti- cas têm falhado grandemente. Formulações de cápsula em gel mole não têm mantido a viabilidade desejada, frequentemente medida em unidades de formação de colônia (Colony Forming Units - CFU), durante a vida útil pre- tendida do produto desenvolvido (tipicamente 2 anos), especialmente em temperatura ambiente. A vitalidade das bactérias probióticas tende a diminuir muito rapidamente para que se obtenha sucesso. Acredita-se que isto seja em virtude, em parte, da alta atividade de água Aw (isenta de água) no am- biente da cápsula em gel mole. Este gradiente Aw está relacionado ao pro-

cesso de produção da cápsula em gel mole em si (particularmente a fase de | encapsulação). Durante esta fase, um pouco da água presente no envoltório .: da cápsula migra para a formulação dentro do envoltório, onde ela é retida em uma forma livre. No caso de uma formulação contendo bactérias probió- ticas, a água livre ativa as bactérias probióticas, fazendo com que as mes- mas venham a perecer pouco tempo depois.

Além disso, o processo de fabricação de uma cápsula gel mole desafia a estabilidade de uma bactéria probiótica no interior da cápsula em gel mole, uma vez que ela pode causar alterações nas bactérias probióticas, mesmo se revestida, deste modo, diminuindo a viabilidade e estabilidade. . Portanto, há uma necessidade de conferir estabilidade e viabili- dade aumentadas de bactérias probióticas no produto quando de armaze- : namento prolongado em temperatura ambiente, uma vez que isto continua a desafiar a indústria. Em particular, há uma necessidade por uma cápsula em gel mole estável contendo bactérias probióticas que possuem viabilidade e vida útil intensificadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a um processo de fabricação de uma cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microencapsuladas compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de bactérias probióticas mi- croencapsuladas com pelo menos um revestimento que compreende pelo menos um lipídio vegetal tendo um ponto de fusão entre 35ºC e 75ºC; (b) suspensão das bactérias probióticas microencapsuladas em uma formulação de suspensão para fazer um enchimento; (c) mistura do enchimento em bai- xaintensidade e baixa temperatura para fazer um enchimento misturado; (d) redução de aglomerados de bactérias probióticas microencapsuladas no en- chimento misturado para fazer um enchimento desaglomerado; e (e) encap- sulação do enchimento desaglomerado em uma cápsula em gel mole, em que a integridade do revestimento das bactérias probióticas microencapsu- ladas é mantida. Em uma modalidade preferida, o processo é realizado en- quanto se controla a exposição ao oxigênio e, em uma outra modalidade preferida, a cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microen-

capsuladas é estável durante pelo menos cerca de 24 meses em temperatu- ' ra ambiente. Em uma determinada modalidade, os aglomerados de bactérias : probióticas microencapsuladas são reduzidos por meio de trituração do en- chimento misturado em uma temperatura abaixo de cerca de 33ºC. Em outra modalidade preferida, as bactérias probióticas microencapsuladas, após en- capsulação, mantêm um tamanho de diâmetro médio de partícula de entre cerca de 150 a cerca de 250 mícrons e, mais preferivelmente, cerca de 200 miícrons e cada bactéria probiótica microencapsulada tem um tamanho de diâmetro de partícula de menos de cerca de 500 mícrons. Em uma modalidade preferida da invenção, o revestimento das - bactérias probióticas microencapsuladas contém pelo menos um lipídio ve- getal selecionado de éster de poliglicerol, gordura de palma hidrogenada, ' dipalmito-estearato de glicerol, di-estearato de poliglicerila-8 e combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades preferidas, a formulação de suspensão compreende pelo menos um óleo, uma gordura em suspensão ou um emulsificante ou pelo menos um óleo e pelo menos um material sele- cionado de gorduras de suspensão, emulsificantes e combinações dos mesmos.

Mistura no processo da presente invenção é, de preferência, realizada em uma temperatura entre cerca de 15ºC e cerca de 32ºC e com uma intensidade menor do que cerca de 3000 rpm.

A presente invenção é também dirigida a uma cápsula em gel mole com probiótico feita de acordo com o processo de: (a) fornecimento de bactérias probióticas microencapsuladas com pelo menos um revestimento que compreende pelo menos um lipídio vegetal tendo um ponto de fusão entre cerca de 35ºC e cerca de 75ºC; (b) suspensão das bactérias probióti- cas microencapsuladas em uma formulação de suspensão para fazer um enchimento; (c) mistura do enchimento em baixa intensidade e baixa tempe- ratura para fazer um enchimento misturado; (d) redução dos aglomerados de bactérias probióticas microencapsuladas no enchimento misturado para fa- zer um enchimento desaglomerado; e (e) encapsulação do enchimento de- saglomerado em uma cápsula em gel mole, em que a integridade do reves-

timento de bactérias probióticas microencapsuladas é mantida. : Em determinadas modalidades, a cápsula em gel mole com pro- . biótico é feita de acordo com o processo conduzido enquanto se controla a exposição ao oxigênio e é estável durante pelo menos cerca de 24 meses emtemperatura ambiente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção tenta resolver um problema na técnica me- diante desenvolvimento de um processo de fabricação de uma cápsula em gel mole estável contendo bactérias probióticas microencapsuladas, o qual intensifica a viabilidade das bactérias probióticas. Os inventores descobriram " Oo processo da presente invenção para fabricação de uma cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microencapsuladas, a qual mantém ' uma melhor estabilidade em temperatura ambiente e um tamanho de diâme- tro médio de partícula de cerca de 200 mícrons, cada bactéria probiótica mi- croencapsulada tendo um tamanho de diâmetro de partícula de menos de cerca de 500 mícrons.

A primeira modalidade é dirigida a um processo de fabricação de uma cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microencapsuladas compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de bactérias probióticas mi- croencapsuladas com pelo menos um revestimento que compreende pelo menos um lipídio vegetal tendo um ponto de fusão entre cerca de 35ºC e cerca de 75ºC; (b) suspensão das bactérias probióticas microencapsuladas em uma formulação de suspensão para fazer um enchimento; (c) a mistura do enchimento em baixa intensidade e baixa temperatura para fazer um en- chimento misturado; (d) redução dos aglomerados de bactérias probióticas microencapsuladas no enchimento misturado para fazer um enchimento de- saglomerado; e (e) encapsulação do enchimento desaglomerada em uma cápsula em gel mole, em que a integridade do revestimento de bactérias probióticas microencapsuladas é mantida.

O processo da primeira modalidade da presente invenção com- preende a etapa de fornecimento de bactérias probióticas microencapsula- das com pelo menos um revestimento que compreende pelo menos um lipí-

dio vegetal tendo um ponto de fusão entre cerca de 35ºC e cerca de 75ºC. À Í finalidade do revestimento das bactérias probióticas é eliminar o contato en- .: tre as bactérias probióticas e a água livre, a qual migra do envoltório da cáp- sula em gel mole para a formulação de enchimento interna. As bactérias probióticas podem ser revestidas usando qualquer técnica conhecida inclu- indo, porém sem limitações, uma técnica de leito fluidizado tendo uma pulve- rização superior e/ou inferior ou outras técnicas de revestimento com base em floculação induzida por pH. O termo microencapsulado, conforme usado aqui, significa revestido com uma composição. Em geral, microencapsulação deve ser entendido como incluindo o revestimento de partículas com um ta- " manho inicial de menos de cerca de um mícron a cerca de cerca de 200 míi- crons. No entanto, um revestimento de qualquer espessura razoável, de pre- É ferência entre cerca de 20 a cerca de 25 mícrons por camada, é adequado, contanto que o revestimento seja homogêneo e uniforme, sem quaisquer aberturas ou orifícios e forme uma camada de barreira adequada. Para fins da presente invenção, fornecimento de bactérias probióticas microencapsu- ladas pode ser realizado obtendo-se bactérias probióticas microencapsula- das comercialmente disponíveis ou por meio de revestimento das bactérias probióticas com o revestimento descrito.

Quaisquer bactérias probióticas podem ser usadas na presente invenção. As bactérias probióticas podem ser adquiridas de fontes comerci- ais ou cultivadas (crescidas) de acordo com métodos conhecidos. Probióti- cos pertencem, tipicamente, aos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium, S- treptococcus, Lactococcus, Pediococcus, Propionibacterium, Leuconostoc e Saccharomyces. No gênero Lactobacillus, as seguintes espécies possuem atividade probiótica: L. acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, L. delbrueckii group, L. salivarius, L. casei, L. paracasei, L. plantarum group, L. rhamnosus, L. reuteri, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, L. fructivorans, L. ruminis, L. sakei and L. vaginalisó. Em modalidades preferidas da presente invenção, as bactérias probióticas são selecionadas das seguintes espécies: L. acidophi- lus, L. crispatus, L. gasseri, L. delbrueckii group, L. salivarius, L. casei, L. paracasei, L. plantarum group, L. rhamnosus, L. reuteri, L. brevis, L. buchne-

ri, L. fermentum, B.adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, B. cate- : nulatum, B. infantis, B. animalis, B lactis, B. longum, B. pseudocatenulatum, : S. thermophilus, Sacch. cerevisiae e combinações das mesmas.

Em modalidades preferidas, as bactérias probióticas usadas na presente invenção são compreendidas de entre um e doze cepas, de prefe- rência duas a seis cepas e, mais preferivelmente, três cepas. As bactérias probióticas podem estar em qualquer forma sólida. De preferência, elas es- tão sob a forma de um pó desidratado fabricado por meio de liofilização ou secagem por pulverização. O revestimento compreende pelo menos um lipídio vegetal, o r qual tem um ponto de fusão entre cerca de 35ºC e cerca de 75ºC, de tal modo que o revestimento não derrete, amolece ou tem a integridade degra- õ dada durante o processo de fabricação da cápsula em gel mole contendo bactérias microencapsuladas , durante armazenamento do produto ou en- quanto transita através do trato gastro-duodenal (estômago e duodeno) ou no baixo pH do estômago. Em teoria, a cápsula em gel mole liberará o en- chimento contendo as bactérias probióticas microencapsuladas no corpo humano no estômago e, então, seus conteúdos são distribuídos ao trato in- testinal; as bactérias probióticas só serão ativadas quando distribuídas ao intestino, o qual tem o pH apropriado para liberar o probiótico do revestimen- to e, então, colonizarão para benefício ótimo para o hospedeiro. Em uma modalidade preferida, o lipídio vegetal tem um ponto de fusão entre cerca de 45ºC e cerca de 65ºC, mais preferivelmente entre cerca de 50ºC e cerca de 60ºC. Em modalidades preferidas, o lipídio vegetal é di-estearato de poligli- cerila (tal como Plurol Stearique WL 1009), palmito-estearato de glicerila (tal como Precirol Ato 5), ácidos graxos saturados (por exemplo, Revel C), gor- duras vegetais hidrogenadas de origem não láurica e gorduras de palma hi- drogenadas, estearina e combinações dos mesmos. Mais preferivelmente, o lipídio vegetal é éster de poliglicerol, gordura de palma hidrogenada, dipalmi- to-estearato de glicerol ou di-estearato de poliglicerila-56 CAS 61725-93-7, também conhecido como Plurol Stearique WL1009 ou uma combinação dos mesmos.

Opcionalmente, as bactérias probióticas podem ser revestidas com mais de uma camada, isto é, dupla, tripla, etc., cada camada sendo um À revestimento distinto e diferente sobre as bactérias probióticas, com pelo menos uma das camadas sendo um ou uma combinação dos lipídios lista- dos acima. Nesta modalidade, cada revestimento é aplicado sobre as bacté- rias probióticas sucessivamente. Por exemplo, um revestimento duplo pode ser aplicado às bactérias probióticas. Múltiplos revestimentos podem au- mentar a proteção das bactérias probióticas contra a água livre presente no interior da cápsula em gel mole. Um revestimento duplo é ainda explicado no Pedidode Patente Italiana co-pendente Nº RM2009A000104, depositado em * 9 de Março de 2009, o qual é aqui incorporado por referência. O processo da primeira modalidade da presente invenção com- É preende a etapa de suspensão das bactérias probióticas microencapsuladas em uma formulação de suspensão para fazer um enchimento. A formulação de suspensão da presente invenção pode ser preparada de acordo com qualquer técnica conhecida no campo. Sem estar limitado a uma teoria, a- credita-se que a formulação de suspensão limita efetivamente o contato en- tre as bactérias microencapsulados e a água livre que entra a partir do en- voltório da cápsula em gel mole no ambiente interno, deste modo, levando à viabilidade e estabilidade intensificadas das bactérias probióticas . A formu- lação de suspensão pode ser ajustada para uma espessura adequada a fim de manter a suspensão do pó e assegurar uma mistura homogênea. Aque- les versados no campo entenderão prontamente a espessura necessária e como ajustar a espessura da suspensão.

Em uma modalidade da presente invenção, a formulação de suspensão compreende pelo menos um óleo, uma gordura de suspensão ou um agente emulsificante. Em uma outra modalidade, a formulação de sus- pensão compreende pelo menos um óleo e pelo menos um material selecio- nado do grupo que consiste em gorduras de suspensão, emulsificantes e combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida, a formulação de suspensão é composta por pelo menos um óleo e pelo menos uma gordura de suspensão; em outra modalidade preferida, a formulação de suspensão é composta por pelo menos um óleo e pelo menos um emulsificante; em ainda É outra modalidade preferida, a formulação de suspensão compreende pelo ã menos um de cada um de um óleo, uma gordura de suspensão e um emulsi- ficante. Em determinadas modalidades, a gordura de suspensão é usada como um espessante do óleo e para assegurar homogeneidade da formula- ção de suspensão.

Óleos adequados para uso na presente invenção incluem, sem limitação, óleo de soja, óleo de canola, óleo de girassol, óleo de macadâmia, óleo de amendoim, óleo de semente de uva, óleo de semente de abóbora, óleode linhaça, óleo de linhaça, azeite, óleo de milho, óteo de cártamo, óleo r de gergelim, óleo de semente de pinheiro, ácido linoleico conjugado, óleo de amêndoa, óleo de caroço de pêssego, óleo de semente de damasco, óleo de : noz, óleo de colza, óleo de semente de framboesa, óleo de semente de mirti- lo, óleo de semente de oxicoco, óleo de semente de romã e outros óleos de sementes de fruta, óleo de espinheiro amarelo, óleo de chia, óleo de perilla, óleo de diaglicerol (DAG), fontes de ômega 3 derivadas de vegetal, fontes fermentadas de ácido eicosapentaenoico (EPA), fontes fermentadas de áci- do docosa-hexaenoico (DHA), fontes fermentadas de uma combinação de EPA, DHA e outros ômegas 3, incluindo óleo de peixe e óleo de krill, fontes de ácidogama-linolênico (GLA) e/ou ácido estearidônico (SA), óleo de coco fracionado e combinações dos mesmos. Fontes de DHA, EPA e ALA inclu- em, porém sem limitações, óleos de peixe, leveduras ou outros micro- organismos ou fontes monocelulares e óleos vegetais, principalmente linha- ça, soja e canola. Fontes de GLA incluem, porém sem limitações, óleo de —prímula, óleo de semente de cassis, óleo de borragem e óleo de Echium.

Gorduras de suspensão adequadas para uso na presente inven- ção incluem, sem limitação, monoglicerídeos de ácidos graxos, diglicerídeos de ácidos graxos, cera de abelhas, monoestearato de glicerila, mono diolea- to de glicerila, derivados de óleo de palma fracionados, gordura de palma —hidrogenada, derivados de óleo de soja hidrogenado, manteigas vegetais, triglicerídeos de cadeia média (Medium Chain Triglyceride - MCT) e combi- nações dos mesmos.

Emulsificantes adequados para uso na presente invenção inclu- É em, sem limitação, lecitina, polissorbatos, mono-oleatos de sorbitan e com- : binações dos mesmos. Em determinadas modalidades, o enchimento contém, de prefe- rência, cerca de 0,5% a cerca de 50% em peso de bactérias probióticas mi- croencapsuladas e cerca de 50% a cerca de 99,5% em peso de formulação de suspensão.

O processo da primeira modalidade da presente invenção com- preende a etapa de mistura do enchimento em baixa intensidade e baixa temperatura para fazer um enchimento misturado. A mistura é realizada em . uma baixa intensidade e baixa temperatura de modo a não comprometer a integridade, isto é, danificar, o revestimento das bactérias probióticas e tam- ' bém a integridade celular das bactérias probióticas. Manutenção da integri- dade do revestimento e tamanho de partícula das bactérias probióticas mi- —croencapsuladas é um aspecto chave da viabilidade e estabilidade intensifi- cadas das bactérias probióticas obtidas pela presente invenção.

A integridade das estruturas celulares das bactérias probióticas e do revestimento das bactérias probióticas pode ser analisada por meio de análise microscópica para determinar se elas permanecem intactas e sem danos. A combinação de estrutura celular e revestimento intactos leva à bac- térias probióticas viáveis que são capazes de colonização. Esta capacidade de colonização pode ser medida pela contagem total viável em cfu/g e pode- ria ser verificada através de análise da composição bacteriana fecal após tratamento.

"Baixa intensidade", conforme usado aqui, refere-se à mistura em uma velocidade de menos de cerca de 3000 rpm (cerca de 50 Hz). Baixa intensidade refere-se também à seleção do tipo de pá, misturador e peneira de mistura. De preferência, o tipo de pá, misturador e peneira de mistura são selecionados para minimizar a tensão de cisalhamento sobre a suspensão, mas também para obter uma suspensão homogênea e estável e reduzir a aglomeração de tamanho de partícula sem causar danos ao revestimento sobre as bactérias probióticas. Aqueles versados no campo serão facilmente capazes de selecionar um tipo de pá, misturador e peneira de mistura ade- É quados para baixa intensidade e baixo cisalhamento. A intensidade da mis- . tura e cisalhamento pode ser controlada por uma combinação de fatores fa- cilmente entendidos por aqueles versados no campo. O equipamento de mistura adequado para uso na presente invenção inclui, sem limitação, por exemplo, agitadores de ancoragem ou agitadores de mistura contra estáticos com ou sem adição de equipamento de emulsificação/homogeneização e recipientes de mistura, incluindo recipientes de mistura Becomixer e Sker- mann e misturadores Ross e Silverson adaptados com pás ou peneiras de mistura adequadas. "Baixa temperatura", conforme usado aqui, refere-se a * uma temperatura de menos de cerca de 33ºC. A temperatura é mantida a- baixo de cerca de 33ºC a fim de que as bactérias probióticas sejam mantidas ' inativas, de modo que a expectativa de vida não seja iniciada até que as cápsulas sejam engolidas e a temperatura corporal ative as bactérias probió- ticas quando distribuídas ao destino pretendido. Manutenção de uma baixa temperatura mantém a viabilidade e estabilidade das bactérias probióticas e seu revestimento. De preferência, a baixa temperatura da mistura é mantida entre cerca de 15ºC e cerca de 32ºC, mais preferivelmente entre cerca de 20ºC e cerca de 30ºC e, ainda mais preferivelmente, cerca de 25ºC.

O processo da primeira modalidade da presente invenção com- preende a etapa de redução de aglomerados de bactérias probióticas micro- encapsuladas no enchimento misturado para fazer um enchimento desaglo- merado. "Redução de aglomerados" significa, em parte, a redução do tama- nho de partículas e separação de partículas as quais estavam ligadas entre si. O enchimento desaglomerado é, de preferência, desaglomerado de modo que as bactérias probióticas microencapsuladas sejam predominantemente separadas umas das outras. Da mesma forma, este enchimento desaglome- rado é, mais preferivelmente, uma formulação de enchimento homogênea e uniforme formada com um tamanho de partícula controlado, o qual permite a encapsulação e distribuição eficazes de cápsulas de ge! mole de boa quali- dade. As partículas de bactérias probióticas microencapsuladas devem ser desaglomeradas e reduzidas para um tamanho adequado para encapsula-

ção. Desaglomeração pode ser realizada através de quaisquer meios co- : nhecidos, mas deve ser realizada de modo a que a integridade do revesti- . mento sobre as bactérias probióticas seja mantida, a fim de que as bactérias probióticas permaneçam protegidas contra a água livre que tenha migrado paraa cápsula em gel mole e distribuía bactérias probióticas viáveis ao local pretendido no corpo humano. O processo de desaglomeração é, de prefe- rência, realizado de forma a manter a integridade da estrutura celular das bactérias probióticas para que elas permaneçam viáveis durante o processo de fabricação, armazenamento e ingestão e sejam liberados e devidamente ativadas no estômago.

. Em determinadas modalidades, redução de aglomerados é feita por meio de trituração. Em modalidades preferidas, a redução de aglomera- : dos, de preferência trituração, é realizada em temperaturas abaixo de 33ºC e, de preferência, cerca de 25ºC. Além disso, esta etapa é, de preferência, realizada em um ambiente de baixa umidade o qual, de preferência, significa uma umidade de menos de cerca de 20% e, mais preferivelmente, uma umi- dade de menos de cerca de 18%. Em modalidades preferidas, a redução de aglomerados, de preferência trituração, separa partículas as quais podem ter aglomerado nas etapas precedentes, deste modo, criando um enchimento substancialmente homogêneo.

Em uma determinada modalidade, trituração é realizada usando uma máquina de trituração com três rolos com o ajuste de abertura e veloci- dade controlados para gerenciar o calor introduzido no enchimento. Qual- quer outro equipamento, de trituração ou similar, conhecido na técnica pode ser usado para a redução de aglomerados, contanto que a temperatura, e- nergia, oxigênio e entrada de água também sejam controlados para gerenci- ar o calor introduzido no enchimento. De preferência, a entrada de água e oxigênio é totalmente evitada durante trituração. Em uma determinada mo- dalidade, redução de aglomerados é um processo com múltiplas partes de trituração e desaeração. Desaeração pode ser realizada sob vácuo, o qual extrai bolhas de ar ou gás e o vácuo será rompido sob nitrogênio ou qual- quer gás adequado, para reduzir a exposição ao oxigênio. Em todas as eta-

pas de processamento aqui descritas, podem ser tomadas medidas para í reduzir a aeração e umidade do enchimento a fim de produzir um enchimen- . to encapsulado com alta homogeneidade e estabilidade. Se ar é retido no enchimento, isto pode causar problemas de oxidação, estabilidade reduzida eproblemas de encapsulação.

Redução de aglomerados refere-se à padronização do diâmetro médio de partícula das bactérias probióticas microencapsuladas e/ou desa- glomeração de aglomerados de partículas formados durante o processo de fabricação. O tamanho médio de diâmetro de partícula após a desaglomera- ção pode estar entre cerca de 150 mícrons e cerca de 250 mícrons, de pre- ' ferência de cerca de 200 mícrons, com cada bactéria probiótica microencap- sulada tendo, de preferência, um tamanho de diâmetro de partícula de me- | nos de cerca de 550 mícrons, mais preferivelmente menos de cerca de 500 mícrons, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 400 mícrons e, ain- damais preferivelmente, com pelo menos cerca de 90% das partículas tendo um tamanho de diâmetro entre cerca de 350 mícrons e 50 mícrons.

O processo da primeira modalidade da presente invenção com- preende a etapa de encapsulação do enchimento desaglomerado em uma cápsula em gel mole. Encapsulação do enchimento desaglomerado em uma cápsula em gel mole pode ser realizada usando qualquer método ou equi- pamento de fabricação conhecido na técnica. Por exemplo, as cápsulas de gel mole podem ser fabricadas usando uma máquina de encapsulação de matriz rotativa. Além disso, a cápsula em gel mole pode ser feita de qualquer material conhecido na técnica. Como um exemplo não limitativo, a cápsula em gel mole pode ser feita usando tecnologia de encapsulação por matriz rotativa padrão e incorporando materiais de envoltório para fins de compri- midos mastigáveis ou passíveis de serem engolidos escolhidos de uma mis- tura de materiais incluindo, porém sem limitações, gel, glicerina, amidos na- turais ou modificados, fontes de sorbitol, água, a tecnologia VEGICAPS” SOFT usando uma seleção de carrageenana, amido modificado, glicerina e/ou fontes de sorbitol, água e fosfatos de sódio.

Em uma modalidade preferida da primeira modalidade da pre-

sente invenção, o processo é realizado enquanto se controla a exposição ao É oxigênio. Isto é feito para proteger as bactérias probióticas microencapsula- . das contra oxidação e aumentar a estabilidade das bactérias probióticas. Controle de exposição ao oxigênio pode significar tomar medidas para não introduzir oxigênio adicional, tomar medidas para reduzir a quantidade de oxigênio presente e tomar medidas para evitar completamente o oxigênio nas mesmas. As etapas para controlar a exposição ao oxigênio podem ser diferente para cada uma das etapas do processo da invenção ou as mesmas para as etapas em massa. Controle de exposição ao oxigênio é facilmente entendido e pode ser realizado através de quaisquer meios conhecidos por - aqueles versados no campo. Em uma determinada modalidade preferida, cada uma das etapas do processo é realizada sob nitrogênio, isto é, uma ] manta contínua de nitrogênio.

Opcionalmente, o processo da primeira modalidade da invenção compreende a etapa de secagem dupla da cápsula em gel mole enchida. Um processo de secagem dupla é usado para controlar o processo de seca- gem, de modo que a cápsula em gel mole não seja excessivamente aqueci- da e as bactérias probióticas ativadas. Em uma modalidade preferida, a se- cagem dupla é realizada tendo uma primeira etapa de colocação das cápsu- lasde gelmoleem um secador de tambor rotativo com ventilação forçada. Em modalidades mais preferidas, o secador de tambor é mantido em uma temperatura de cerca de 20ºC e com uma umidade em torno de cerca de 18% a cerca de 30% e, de preferência, cerca de 20%. Em uma modalidade preferida, a secagem dupla é realizada tendouma segunda etapa de secagem das cápsulas de gel mole sobre ban- dejas, salas ou fornos em uma temperatura de cerca de 18ºC a cerca de 25ºC, de preferência a cerca de 20ºC e uma umidade relativa controlada, tipicamente, entre cerca de 8% e cerca de 20%.

Em geral, aqueles versados no campo sabem que cápsulas de gel mole são secas até a dureza e teor de água no envoltório desejados, especificamente adaptada para o tamanho da cápsula e densidade do en- chimento. A dureza pode ser determinada usando um testador de dureza

Bareiss e o teor de água do envoltório pode ser determinado medindo-se a umidade usando métodos de titulação de Karl Fisher. : Na primeira modalidade da invenção, a integridade do revesti- mento de bactérias probióticas microencapsuladas é mantida. Em modalida- des preferidas, a aglomeração de partículas de bactérias probióticas micro- encapsuladas no enchimento misturado é reduzida sem comprometer a inte- gridade do revestimento ou da estrutura celular das bactérias probióticas dentro do revestimento. É importante manter a integridade do revestimento de forma a impedir que as bactérias probióticas contatem a água livre dentro da cápsula em gel mole, o qual leva à viabilidade diminuída. Manutenção da à integridade do revestimento refere-se a um revestimento o qual não tenha sido substancialmente desgastado, quebrado ou reduzido em qualquer local : sobre o mesmo de tal forma que as bactérias probióticas entrariam em con- tato direto com a formulação de suspensão dentro da cápsula. Comprometi- mento da integridade do revestimento, por outro lado, refere-se a um reves- timento que tenha sido diluído, desgastado, rachado ou afetado de forma tal que as bactérias probióticas entrariam em contato direto com a formulação de suspensão dentro da cápsula. Manutenção da integridade da estrutura celular das bactérias probióticas refere-se à estrutura celular a qual não te- nha sido deformada ou rompida. Em contraste, comprometimento da integri- dade da estrutura celular das bactérias probióticas no revestimento refere-se à deformação, dilaceramento, raspagem ou torção da estrutura celular, de modo que ela seja enfraquecida. A estrutura celular comprometida pode le- var à células as quais não têm a capacidade de colonizar o intestino quando distribuídas.

Em uma modalidade preferida, a cápsula em gel mole microen- capsulada é estável durante pelo menos cerca de 24 meses em temperatura ambiente. Estabilidade da cápsula refere-se à manutenção de unidades de formação de colônia (Colony Forming Units - CFU) de bactérias probióticas —dentroda cápsula após um determinado período de tempo. Ela também po- de referir-se a ir de encontro a uma atividade probiótica (cfu/g) indicada so- bre a etiqueta do produto ao final de sua vida útil. Cápsulas gel mole está-

veis mantêm uma contagem de células viáveis total de pelo menos cerca de ' 10% ou mais do valor de entrada inicial por cápsula e, mais preferivelmente, . pelo menos cerca de 20% da entrada inicial por cápsula após cerca de 24 meses em temperatura ambiente. Em uma outra modalidade, cápsulas de —gelmole estáveis mantêm uma contagem de células viáveis total entre cerca de 10% e cerca de 95% do valor de entrada inicial por cápsula e, mais prefe- rivelmente, entre cerca de 20% e cerca de 85% da entrada inicial por cápsu- la após cerca 24 meses em temperatura ambiente. O valor de entrada inicial por cápsula está, de preferência, entre cerca de 1 bilhão a cerca de 3000 bilhõesdeCFU «e, mais preferivelmente, cerca de 2000 bilhões de CFU. Aqui, "temperatura ambiente" refere-se, de preferência, a uma temperatura entre cerca de 15ºC a cerca de 30ºC, mais preferivelmente cer- ! ca de 20ºC a cerca de 25ºC e uma umidade entre cerca de 20% e cerca de 75% e, mais preferivelmente, cerca de 50 % a cerca de 60%. Estabilidade em temperatura ambiente é importante para os consumidores e, em geral, não considerada na técnica, uma vez que a maioria dos produtos deve ser mantido refrigerado de forma a manter a viabilidade das bactérias probióti- cas.

Em determinadas modalidades preferidas, a embalagem das cápsulas de gel mole com probiótico fornece maior proteção contra a água (umidade), oxigênio, luz e outras influências tóxicas. Esta embalagem supor- ta e protege a estabilidade das cepas probióticas microencapsuladas e ou- tros ingredientes no enchimento das cápsulas de gel mole. Embalagens pre- feridas incluem, porém sem limitações, embalagens de blister com proprie- dades de barreira adequadas, recipientes de plástico ou metal com ou sem um agente de secagem e frascos de vidro, de preferência usando uma tam- pa de vedação por indução com ou sem um agente de secagem. Embala- gens de blister preferidas podem incluir um filme de blister de diferentes ti- pos, tais como filmes de alta capacidade de barreira e padrões incluindo, por exemplo, Triplex Flexafarm Sbc (por exemplo, PVC 250my + PE 25my + PVDC 150g/mq grau sbc) e Aquaba-PVC (por exemplo, PVC 250my + A- QUABA 160 g/maq), Aclar, formatos Alu - Alu, folha de blister de camada tri-

pla (OPA) com alumínio temperado macio em posição central, outras cama- : das de PVC e poliamida e materiais de blister com múltiplas camadas com- . binadas de nova geração. Recipientes de plástico preferidos podem ser fei- tos de qualquer material plástico adequado, por exemplo, HDPE (polietileno dealtadensidade), PP (polipropileno) e PET (tereftalato de polietileno) e po- dem também incluir um agente de secagem integrado ou separado e/ou mi- nipacks ou filmes absorventes de oxigênio. Frascos de vidro preferidos po- dem ser de vidro colorido, vedados por indução, ter uma tampa de plástico ou metal e um agente de secagem ou de absorção de oxigênio. Recipientes de metal preferidos podem incluir frascos, tubos ou garrafas de alumínio, os fr quais podem ser vedados por indução, ter uma tampa de plástico ou metal e/ou ter um agente de secagem ou de absorção de oxigênio.

: Na segunda modalidade da invenção, uma cápsula em gel mole com probiótico é feita de acordo com o processo de: (a) fornecimento de bactérias probióticas microencapsuladas com pelo menos um revestimento que compreende pelo menos um lipídio vegetal tendo um ponto de fusão entre cerca de 35ºC e cerca 75ºC; (b) suspensão das bactérias probióticas microencapsuladas em uma formulação de suspensão para fazer um enchi- mento; (c) mistura do enchimento em baixa temperatura e baixa pressão parafazer um enchimento misturado; (d) redução dos aglomerados de bac- térias probióticas microencapsuladas no enchimento misturado para fazer um enchimento desaglomerado; e (e) encapsulação do enchimento desa- glomerado em uma cápsula em gel mole, em que a integridade do revesti- mento de bactérias probióticas microencapsuladas é mantida.

Os detalhes mencionados acima em relação às etapas de pro- cessamento, isto é, revestimento, suspensão, mistura, redução de agiome- rados, etc., são os mesmos para a segunda modalidade da descrição con- forme para a primeira modalidade da descrição. Do mesmo modo, os deta- lhes mencionados acima em relação à exposição ao oxigênio e controle da — estabilidade da cápsula em gel mole da primeira modalidade são os mesmos conforme para a segunda modalidade.

A presente invenção não está limitada à quaisquer bactérias probióticas ou formulação de suspensão específicas, mas resolve o proble- í ma de estabilidade e viabilidade mantidas de bactérias probióticas em produ- . tos e, em particular, em temperatura ambiente.

Os exemplos a seguir ilus- tram o processo da presente invenção em algumas das modalidades preferi- das.

Outras modalidades dentro do âmbito das reivindicações serão eviden- tes para aqueles versados no campo.

EXEMPLO 1 A cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microen- capsuladas foi fabricada de acordo com a presente invenção.

Lactobacillus plantarum LPO1 e Bifidobacterium breve BRO3 foram mono-revestidas com : diestearato de poliglicerila (Plurol Stearique WL1009) de acordo com o pro- cesso descrito no Pedido de Patente Italiana Nº RM2009A000104. Para a ' formulação de suspensão, cera de abelhas foi fundida em óleo de soja a cerca de 65ºC.

Lecitina de soja foi, então, adicionada à mistura e a formula- ção combinada esfriada para menos de ou cerca de 25ºC.

As bactérias pro- bióticas microencapsuladas foram suspensas na formulação de suspensão de óleo de soja, cera de abelhas e lecitina de soja esfriada e misturadas a menos de 30ºC durante 10 minutos.

A Tabela 1 abaixo apresenta a quanti- dade de cada componente presente no enchimento.

O enchimento mistura- dofoi, então, triturado usando uma fresadora com três pás a menos de 30ºC durante 10 minutos e o enchimento triturado passado através de uma penei- ra tendo espaçamento de 600 mícrons enquanto sob vácuo e sob nitrogênio para evitar oxidação da formulação.

O enchimento triturado foi, então, encapsulado em uma cápsula em gel mole usando uma máquina de encapsulação de matriz rotativa pa- drão como segue: o enchimento triturado e o material de envoltório foram carregados em receptores distintos conectados à máquina.

A máquina pre- parou, a partir do material de revestimento fundido, duas faixas de fitas sóli- das, as quais foram esfriadas e lubrificadas com uma mistura de MCT e leci- tinade soja.

As faixas foram dirigidas para a posição de rotação de duas matrizes rotativas tendo bolsas específicas de tamanho e formato requeridos para formação da cápsula.

A contra-rotação contínua das matrizes opostas,

então, formou uma vedação entre as duas fitas contatando as matrizes en- ' quanto o material de enchimento era simultaneamente injetado no corpo da cápsula assim formada. Por fim, a rotação contínua das matrizes corta a cápsula recém formada da fita.

As cápsulas de gel mole foram subsequentemente divididas em dois lotes e cada lote foi seco em duas etapas. Primeiro, um lote de cápsulas de gel mole foi seco por meio de um processo padrão, isto é, colocado em um secador de tambor com ventilação forçada, com ar retirado do ambiente externo a aproximadamente 20% de RH e 20ºC durante 48 minutos. O se- gundo lote de cápsulas de gel mole foi seco por meio de um processo mais ' lento, isto é, colocado em um secador de tambor com ventilação forçada, com ar retirado do ambiente externo a aproximadamente 20% de RH e 20ºC durante 122,5 minutos. Na segunda etapa, a cápsula em gel mole de cada lote foi colocada em bandejas e empilhadas em câmaras de secagem tendo ventilação especial com ar seco e condicionado. As cápsulas de gel mole foram secas até uma dureza estabilizada de 9 N, medida usando o aparelho de testagem de dureza Bareiss. Cada lote de cápsulas de ge! mole preparado foi dividido em três grupos, com um grupo armazenado em garrafas de vidro escuro com tam- pas de alumínio, o segundo grupo armazenado em blister triplo e o terceiro grupo armazenado a "granel", o que significa que as cápsulas de gel moles foram armazenadas em saches de celofane com camada tripla impermeá- veis. Os três grupos de cápsulas de gel mole foram armazenados a 25ºC e parâmetros avaliados, os quais prevêem confiavelmente a subsequente es- tabilidade das cepas durante a vida útil, após 6 meses e após 18 meses de armazenamento. A integridade da estrutura celular das bactérias probióticas e do revestimento foi analisada por meio de análise microscópica. Se a es- trutura celular e revestimento das bactérias probióticas permanecem intac- tos, bactérias probióticas viáveis são capazes de colonizar. Esta capacidade é medida pela contagem total de cfu/g e pode ser verificada por meio de análise de composição bacteriana fecal após tratamento. A cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microencapsuladas foi fabricada para proporcionar o objetivo de 2 bilhões de CFU por cápsula (como a soma das duas cepas) a 24 meses de vida útil em temperatura ambiente.

A Tabela 3 abaixo mostra os lotes de cápsulas de gel mole que foram preparados e as Tabelas 4 e 5 mostram os resultados de avaliação da estabilidade.

Tabela1 Ingrediente ea Quantidade/cápsula (mg/cápsula) Lactobacillus plantarum LPO1 (LMG P-21021) 5 x 10" CFU/cps* mono-revestida Bifidobacterium breve BRO3 (DSM 16604) (mono-revestida 5 x 107 CFU/cps* Cera de abelhas » * —Esta quantidade era a potência medida do lote específico. ** Esta quantidade forneceu a espessura apropriada da suspensão para encap- sulação.

EXEMPLO 2 Um enchimento triturado contendo bactérias probióticas micro- encapsuladas foi fabricado de acordo com a presente invenção.

Lactobacil- lus plantarum LPO1 e Bifidobacterium breve BRO3 foram mono-revestidas com diestearato de poliglicerila (Plurol Stearique WL1009) de acordo com o processo descrito no Pedido de Patente Italiana Nº RM2009A000104. Para a formulação de suspensão, óleo de soja foi aquecido para cerca de 65ºC.

Lecitina de soja e mono-estearato de glicerila foram, então, adicionados à mistura e a formulação combinada esfriada para menos de ou cerca de 25ºC.

As bactérias probióticas microencapsuladas foram suspensas na for- mulação de suspensão de óleo de soja, monoestearato de glicerila e lecitina de soja esfriada e misturadas a menos de 30ºC durante 10 minutos.

A Tabe- la 2 abaixo apresenta a quantidade de cada componente presente no en- chimento.

O enchimento misturado foi, então, triturado usando uma fresado- racomtrês pás a menos de 30ºC durante 10 minutos e o enchimento tritura- do passado através de uma peneira tendo espaçamento de 600 mícrons en- quanto sob vácuo e sob nitrogênio.

Estabilidade inicial das bactérias probióticas microencapsuladas dentro do enchimento triturado foi testada por meio de análise microscópica para verificar a integridade da estrutura celular e do revestimento de bacté-

rias probióticas. O número de bactérias probióticas revestidas foi calculado É como a diferença entre o número total de bactérias probióticas e as bactérias ' probióticas não revestidas. Estes resultados de teste mostraram uma estabi- lidade inicial similar aos resultados iniciais de estabilidade para o enchimento triturado do Exemplo 1, por exemplo, sem dano significativo à estrutura celu- lar das bactérias probióticas ou revestimento. Por isso, presumiu-se que o enchimento encapsulado triturado do Exemplo 2 teria resultados similares àqueles do Exemplo 1. Portanto, o Exemplo 2 não foi encapsulado ou a es- tabilidade de uma cápsula em gel mole contendo tal enchimento mais estu- dada. Tabela 2 Ingrediente Quantidade/cápsula - (mg/cápsula; Lactobacillus plantarum LPO1 (LMG P-21021) (mono- 5 x 10" CFU/cps* revestida Bifidobacterium breve BRO3 (DSM 16604) (mono-revestida)| 5 x 10” CFU/cps* 429,0" Monoestearato de glicerila (GMS * —Esta quantidade era a medida de potência do lote específico. ** Esta quantidade forneceu a espessura apropriada da suspensão para encapsulação. EXEMPLO COMPARATIVO 1 Uma cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas micro- encapsuladas foi fabricada de acordo com o processo do Exemplo 1, exceto quea mistura de enchimento foi encapsulada sem sofrer a etapa de tritura- ção (redução de aglomerados). Sem trituração, as cápsulas de gel mole pro- duzidas são de qualidade inferior e o vazamento aumenta. Etapas de pro- cessamento adicionais podem ser adicionadas para reduzir vazamento de outras maneiras, mas estas etapas aumentariam os custos em uma quanti- dade potencialmente inaceitável do ponto de vista comercial.

As cápsulas de gel mole foram subsequentemente divididas em dois lotes e cada parte foi seca em duas etapas. Primeiro, um lote de cápsu- las de gel mole foi seco por meio de um processo padrão, isto é, colocado em um secador de tambor com ventilação forçada, com ar retirado do ambi- ente externo a aproximadamente 20% de RH e 20ºC durante 48 minutos. O segundo lote de cápsulas de gel mole foi seco por meio de um processo mais lento, isto é, colocado em um secador de tambor com ventilação força- x da, com ar retirado do ambiente externo a aproximadamente 20% de RH e 20ºC durante 122,5 minutos. Na segunda etapa, a cápsula em gel mole de cada lotefoicolocadaem bandejas e empilhadas em câmaras de secagem tendo ventilação especial com ar seco e condicionado. As cápsulas de gel mole foram secas até uma dureza estabilizada de 9 N, medida usando o a- parelho de testagem de dureza Bareiss.

Cada lote de cápsulas de gel mole preparado foi dividido em três grupos, com um grupo armazenado em garrafas de vidro escuro com tam- * pas de alumínio, o segundo grupo armazenado em blister triplo e o terceiro grupo armazenado a "granel". Os três grupos de cápsulas de gel mole foram armazenados a 25ºC e parâmetros avaliados, os quais prevêem confiavel- mente a subsequente estabilidade das cepas através da vida útil, após 6 meses e 18 meses de armazenamento. A integridade da estrutura celular das bactérias probióticas e do revestimento foi testada por meio de análise microscópica. O número de bactérias probióticas revestidas foi calculado como a diferença entre o número total de bactérias probióticas e as bactérias probióticas não revestidas. Se a estrutura celular e revestimento das bacté- rias probióticas permanecem intactos, bactérias probióticas viáveis são ca- pazes de colonizar.

A cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microen- capsuladas foi fabricada para proporcionar o objetivo de 2 bilhões de CFU por cápsula (como a soma das duas cepas) a 24 meses de útil em tempera- tura ambiente. A Tabela 3 abaixo mostra os lotes de cápsulas de gel mole que foram preparados e as Tabelas 4 e 5 mostram os resultados de avalia- ção da estabilidade após 6 e 18 meses, respectivamente.

o 8 S ” . 3 8 e 8 => E 8 8 3 3 & E s 3 3 (Sold! fede! Jes/el lelola > s -) o 8 $ s ese Sss sss] ss E 8 Si la js o ses es sss 22 - E >|. > 9/2 | S SÇ-—. E 8) 685) lee |g8 8 ui | lis) jasie) 9/8 [98 =

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Os dados de estabilidade após 6 meses mostrados na Tabela 4 e após 18 meses na Tabela 5 mostram que a estabilidade de bactérias pro- S bióticas em cápsulas de gel mole após trituração é, em geral, mais elevada do que as bactérias probióticas em amostras que não foram trituradas e tritu- ração tem maior influência sobre a estabilidade do que o tipo de secagem.

Cada um dos tipos de embalagens selecionados conferiu uma proteção a- dequada contra oxidação e outros efeitos negativos potenciais sobre a esta- bilidade.

A Tabela 4 também mostra que uma elevada percentagem de célu- las com revestimento (> 90%) permanecem a 6 meses.

Do mesmo modo, a Tabela5S5 mostra que uma elevada percentagem de células com revestimento (> 88%) permanecem em cada tipo de embalagem testado a 18 meses.

Isto * sugere que células viáveis presentes mesmo após 18 meses eram muito : robustas.

Ainda, os resultados acima mostram que trituração de acordo coma presente invenção não causa mais danos ao revestimento sobre as bactérias probióticas do que preparo para o processo sem trituração (Exem- plo Comparativo 1). Uma vez que trituração é uma etapa importante no pro- cesso de fabricação de uma cápsula em gel mole que seja comercialmente aceitável, por exemplo, para manter custos razoáveis, para reduzir vazamen- to, etc, trituração sem danificar o revestimento sobre as bactérias probióti- cas é uma vantagem importante da presente invenção.

EXEMPLO 3 Uma cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas micro- encapsuladas foi fabricada de acordo com o processo do Exemplo 1, mas em um escalonamento de loto total.

As cápsulas de gel mole foram mistura- das usando equipamento de mistura em escala total.

O material de enchi- mento foi desaerado sob vácuo e o vácuo foi rompido sob nitrogênio.

Este processo facilita a prevenção de gás retido (principalmente de oxigênio) no produto final o qual, por sua vez, corresponde à oxidação reduzida de qual- quer oxigênio restante potencial após encapsulação.

Além disso, este pro- cesso ajuda a assegurar uniformidade de conteúdo de dose entre as cápsu- las.

Este material de enchimento foi, então, encapsulado e seco usando um processo padrão, por exemplo, colocando as cápsulas de gel mole em um : secador de tambor com ventilação forçada, com o ar retirado do ambiente & externo, a aproximadamente 20% de RH e 20ºC durante 135 minutos. Na segunda etapa de secagem, as cápsulas de gel mole de cada lote foram co- —locadas em bandejas e empilhadas em câmaras de secagem tendo ventila- ção especial com ar seco e condicionado. As cápsulas de gel mole foram secas até uma dureza estabilizada de 9 N, medida usando o aparelho de testagem de dureza Bareiss e ERH (Equilibrium Relative Humidity - Umidade Relativa em Equilíbrio) de menos de 20%. As cápsulas de gel mole secas foram divididas em três grupos, ? com um grupo armazenado em garrafas de vidro escuro com tampas de a- lumínio, o segundo grupo armazenado em blister triplo e o terceiro grupo E: armazenado em garrafas de plástico Duma. Os três grupos de cápsulas de gel mole foram armazenados a 25ºC durante 3 meses e os parâmetros en- saiados para avaliar sua robustez. A integridade da estrutura celular das bactérias probióticas e do revestimento foi testada por meio de análise mi- croscópica. O número de bactérias probióticas revestidas foi calculado como a diferença entre o número total de bactérias probióticas e as bactérias pro- bióticas não revestidas. Se a estrutura celular e revestimento das bactérias —probióticas permanecem intactos, bactérias probióticas viáveis são capazes de colonizar. A cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microen- capsuladas foi fabricada para proporcionar o objetivo de 2 mil bilhões de CFU por cápsula (como a soma das duas cepas) a 24 meses de vida útil em temperatura ambiente.

A Tabela 6 mostra o processamento, secagem e embalagem do Exemplo 3. Para testar a robustez do lote do Exemplo 3, foram retiradas amostras durante todo o processo de fabricação de um lote em larga escala e também após 1 mês e 3 meses de armazenamento para mostrar a estabi- lidade aumentada obtida através de um processamento cuidadoso (Tabela 7)epormeiode empacotamento seletivo (Tabela 8). As velocidades de mis- tura e temperatura foram cuidadosamente controladas e monitoradas.

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A Tabela 8 ilustra que, após 1 mês e após 3 meses de armaze- : namento após escalonamento de todo o lote, mais de 80% das células per- 7 manecem revestidas.

Em comparação, a percentagem de células revestidas restantes após armazenamento do Exemplo 1, mostrado nas Tabelas 4 e 5, coma percentagem de células revestidas restantes após armazenamento do Exemplo 3, alguma redução na percentagem é sempre admitida quando o processo é escalonado.

Os resultados obtidos aqui foram positivos, uma vez que mais de 80% ainda restaram após 3 meses de armazenamento (Tabela 8). Consequentemente, o escalonamento de todo o lote não afeta significati- vamente de modo negativo a viabilidade das bactérias probióticas. r EXEMPLO 4 , Uma cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas micro- & encapsuladas foi fabricada de acordo com o processo do Exemplo 3, exceto que os três grupos com um grupo armazenado em frascos de vidro escuro com tampas de alumínio, o segundo grupo armazenado em bolsas de blister triplas e o terceiro grupo armazenado em recipientes de plástico foram, cada um deles, divididos em três subgrupos, com um sub-grupo armazenado a 25ºC durante 3 meses, segundo subgrupo armazenado a 30ºC durante 3 meses, o terceiro subgrupo armazenado a 33ºC durante 3 meses.

Tabela9 Identificação de amostra — | Contagem de células | Dados de estabilidade a 3 mês** viáveis no T zero 25ºC 30ºC 33ºC [10º CFU/g pasto OO OO OO Célutas totais Br | 165 | 150 | 34 | Células totais revestidas Ex. 4 (garrafa de vidro) O Células totais.

Células totais revestidas 15 80,2 885 | 927 Ex. 4 (garrafa de plástico) FPA Células totais 19 15,6 14,0 31 Células totais revestidas 13,6 124 28 87,2 88,6 ** A duração real de armazenamento foi de 87 dias.

Tabela 10 r Identificação de amostra Dias de arma- | Contagem de células | Dados de estabilidade . zenamento viáveis no T zero a 1 mês (10º CFU/g) 25ºC [30ºC |33ºCT37C à. — RES Células totais O OS ER E 19,3 | 18,2 Células totais revestidas” St EFA E guga cc aa DA [DA 19h, Ex. 4 (garrafa de vidro) e Eos E ale Festas totais CLORO CCC Par ARE EE [Perevestdo o Is BN | Ras so ssa 525) Ex: 4 (garrafa de pláshco) O O 1 1 = Células totais Eos dd às "vei os) Células totais revestidas” Ea LiAl e Lo se) Ereeio ECO 84,7 - As Tabelas 9 e 10 mostram que a temperatura durante o arma- + zenamento afeta a viabilidade das cepas probióticas, por exemplo, tempera- : turas de 33ºC e acima têm um impacto claro sobre a viabilidade das cepas probióticas, mesmo embora a eficiência de revestimento (%) não seja afeta- da.

Consequentemente, a temperatura e parâmetros de energia durante ar- mazenamento precisam ser cuidadosamente controlados.

Pode ser entendi- do, então, que a temperatura durante outras etapas de processamento, por exemplo, trituração, também afeta a viabilidade das cepas e deve ser cuida- dosamente controlada para permanecer abaixo de 33ºC.

Por exemplo, a Ta- bela 7 mostra que, durante escalonamento de todo o lote, a temperatura do enchimento não deve exceder a 25ºC e este parâmetro controlado contribui para a estabilidade a longo prazo das cepas probióticas.

Com base nos dados coletados, os resultados de escalonamen- todetodo o lote (Exemplo 3) confirmam a robustez superior do processo de fabricação de cápsula em gel mole da presente descrição.

Em conclusão, a estabilidade das cepas probióticas está claramente relacionada com a inte- gridade do revestimento, conforme demonstrado pelo estudo da influência da temperatura sobre a estabilidade das cepas (Exemplo 4). Em temperatu- ras elevadas, as células não revestidas degradam e, após 1 mês a 37ºC, as cepas vivas restantes são quase todos revestidas (> 90%). O revestimento é concebido para distribuir a cepa probiótica no intestino e permitir coloniza- ção no intestino em temperatura corporal.

Temperatura e umidade aumenta-

das podem ativar prematuramente a cepa probiótica antes que ela atinja o É local de colonização a que se destina, o qual pode resultar em falha de colo- L nização no local alvo e, por sua vez, incapacidade de conferir o benefício pretendido ao corpo.

Em conclusão, a partir de uma análise global dos dados obtidos, parece que uma quantidade satisfatória das bactérias probióticas processa- das de acordo com a presente descrição permanecerá viável durante a vida útil. Pode-se supor, a partir destes dados, que uma contagem de células viá- veis total de pelo menos 2 bilhões de CFU/cápsula restaria no tempo de ex- piração (1 bilhão de cada cepa). Uma concentração de bactérias probióticas - microencapsuladas cinco vezes menor do que a quantidade de bactérias h não revestidas é capaz de colonizar o intestino humano com a mesma eficá- : cia. Além disso, quando as bactérias probióticas microencapsuladas são dis- tribuídas ao local pretendido de colonização no intestino, elas têm uma pro- babilidade de colonização de mais de 5 vezes do que bactérias probióticas não revestidas. Vide Del Piano, M. et a/. (2010), Evaluation of the intestinal colonization by microencapsulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains, Journal of Clinical Gastroenterology, 44 Sup. 1: S42-

6. Assim, existem numerosas vantagens para o processo da pre- sente invenção. A cápsula em gel mole resultante contendo bactérias probió- ticas microencapsuladas tem estabilidade inesperada, por exemplo, CFU e número de bactérias probióticas revestidas para uma melhor distribuição de bactérias probióticas ao sistema digestivo humano. Inúmeras alterações, modificações e variações das modalidades preferidas descritas aqui serão aparentes para aqueles versados no campo e todas elas são previstas e consideradas como estando dentro do espírito e âmbito da invenção reivindicada. Por exemplo, embora modalidades especí- ficas tenham sido descritas em detalhe, aqueles versados no campo enten- derão que as modalidades precedentes e variações podem ser modificadas para incorporar vários tipos de materiais substitutos, adicionais ou alternati- vos. Consequentemente, mesmo embora umas poucas variações da presen-

te invenção sejam descritas na presente invenção deve ser entendido que a E prática de tais modificações e variações adicionais e os equivalentes das ” mesmas estão dentro do espírito e âmbito da invenção, conforme definido nas reivindicações que seguem.

Todos os pedidos de patente, patentes e outras publicações citadas aqui são incorporadas por referência na íntegra. h

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES Í 1. Processo de fabricação de uma cápsula em gel mole conten- do bactérias probióticas microencapsuladas compreendendo as etapas de: (A) fornecimento de bactérias probióticas microencapsuladas com pelomenos um revestimento que compreende pelo menos um lipídio vegetal tendo um ponto de fusão entre cerca de 35ºC e cerca de 75ºC; (B) suspensão das bactérias probióticas microencapsuladas em uma formulação de suspensão para fazer um enchimento; (C) mistura do enchimento em baixa intensidade e baixa tempe- ratura para fazer um enchimento misturado; r. (D) redução de aglomerados de bactérias probióticas microen- h capsuladas no enchimento misturado para fazer um enchimento desaglome- ' rado; e (E) encapsulamento do enchimento desaglomerado em uma cápsula em gel mole, em que a integridade do revestimento das bactérias probióticas microencapsuladas é mantida.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o proces- so é realizado enquanto se controla a exposição ao oxigênio.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a cápsula em gel mole contendo bactérias probióticas microencapsuladas é estável durante pelo menos cerca de 24 meses em temperatura ambiente.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que os aglo- merados de bactérias probióticas microencapsuladas são reduzidos por —meiode trituração do enchimento misturado em uma temperatura abaixo de cerca de 33ºC.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as bacté- rias probióticas microencapsuladas, após encapsulação, mantêm um tama- nho de diâmetro médio de partícula de entre cerca de 150 a cerca de 250 —miícronse menos do que cerca de 550 mícrons.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que as bacté- rias probióticas microencapsuladas, após encapsulação, mantêm um tama-

   nho de diâmetro médio de partícula de cerca de 200 mícrons e cada uma 7 das bactérias probióticas microencapsuladas tem um tamanho de diâmetro É de partícula de menos de cerca de 500 mícrons.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um lipídio vegetal é selecionado do grupo que consiste em poliglice- rol éster, gordura de palma hidrogenada, dipalmito-estearato glicerol, poligli- ceril-6-diestearato e combinações dos mesmos.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a formula- ção de suspensão compreende pelo menos um óleo, uma gordura de sus- pensão ou um emulsificante.
9. . 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a formula- bh ção de suspensão compreende pelo menos um óleo e pelo menos um mate- rial selecionado do grupo que consiste em gorduras de suspensão, emulsifi- cantes e combinações dos mesmos.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que o óleo de pelo menos um é selecionado do grupo que consiste em óleo de soja, óleo de canola, óleo de girassol, óleo de macadâmia, óleo de amendoim, óleo de semente de uva, óleo de sementes de abóbora, óleo de linhaça, óleo de oli- va, óleo de milho, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de semente de pinheiro, ácido linoleico conjugado, óleo de amêndoa, óleo de caroço de pêssego, óleo de semente de damasco, óleo de noz, óleo de colza, óleo de semente de framboesa, óleo de semente de mirtilo, óleo de semente de oxi- coco, óleo de sementes de romã e outros óleos de sementes de outras fru- tas, óleo de alga marinha, óleo de chia, óleo de perila, óleo de diaglicerol, fontes de ômega 3 derivadas de vegetais, fontes fermentadas de ácido eico- sapentaenoico, fontes fermentadas de ácido docosa-hexaenoico, fontes fer- mentadas de uma combinação de ácido eicosapentaenoico, ácido docosa- hexaenoico e outros ômegas 3, fontes de ácido gama-linolênico e/ou ácido estearidônico, óleo de coco fracionado e combinações dos mesmos.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que as gordu- ras de suspensão são selecionadas do grupo que consiste em monoglicéri- deos de ácidos graxos, diglicerídeos de ácidos graxos, cera de abelhas, mo-

    noestearato de glicerila, monodioleato de glicerila, derivados de óleo de pal- . ma fracionado, gordura de palma hidrogenada, derivados de óleo de soja hidrogenado, manteiga vegetal, triglicerídeos de cadeia média e combina- ções dos mesmos.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que os emul- sificantes são selecionados do grupo que consiste em lecitina, polissorbatos, mono oleato de sorbitan e combinações dos mesmos.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a mistura é realizada em uma temperatura entre cerca de 15ºC e cerca de 32ºC e com uma intensidade menor do que cerca de 3000 rpm. -
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a redu- h ção de aglomerados é realizada com o enchimento desaglomerado manten- ' do uma temperatura abaixo de cerca de 33ºC e em um ambiente de baixa umidade.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente a etapa de: (F) secagem dupla da cápsula em gel mole enchida.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que a seca- gem dupla é compreendida de secagem das cápsulas em um secador de tambor em ventilação forçada, seguido por secagem da cápsula em bande- jas empilhadas dentro de câmaras de secagem, em que a temperatura é de cerca de 18ºC a cerca de 25ºC e a umidade relativa é de cerca de 8% a cer- ca de 20%.
17. 17. Cápsula em gel mole de probiótico feita de acordo com o processo como definido na reivindicação 1
18. 18. Cápsula em gel mole de probiótico de acordo com a reivindi- cação 17, em que o processo é realizado enquanto se controla a exposição ao oxigênio.
19. 19. Cápsula em gel mole de probiótico de acordo com a reivindi- cação 18,em que a cápsula é estável durante pelo menos cerca de 24 me- ses em temperatura ambiente.