BR112012027055B1

BR112012027055B1 - Método para estabilizar uma proteína do plasma de sangue humano, composição, e uso da melezitose

Info

Publication number: BR112012027055B1
Application number: BR112012027055-9A
Authority: BR
Inventors: Elsa Ivarsson; Josefin Österberg; Brita Rippner; Ulrika Nilsson; Irène Agerkvist
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2010-04-20
Filing date: 2011-04-20
Publication date: 2019-09-17
Also published as: BR112012027055A8; IL243264B; EP2947148B1; EP2947148A1; WO2011131720A1; ZA201207796B; JP2017014245A; CN103003422B; CA2796729A1; US20160256555A1; JP6457445B2; DK2947148T3; EP2561070A1; JP2013527843A; KR102049254B1; IL222358A0; CA3078259A1; KR20180075681A; KR101872203B1; AU2011244348B2

Abstract

agente estabilizante para proteínas farmacêuticas. a presente invenção refere-se a um método para estabilizar uma proteína de sangue humano ou uma proteína do plasma de sangue humano com peso molecular > 10 kda pela adição de melezitose e uma solução compreendendo a proteína de sangue humano ou a proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular de > 10 kda.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um método para estabilizar uma proteína de sangue humano ou uma proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular de >10 KDa, a uma composição no estado sólido ou líquido da proteína de sangue humano ou uma proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular de >10 KDa, e ao uso de melezitose para a estabilização de uma proteína de sangue humano ou uma proteína do plasma de sangue humano.

[002] A estabilização de proteínas terapêuticas é um grande desafio para os cientistas da formulação na indústria farmacêutica atualmente. Há muitos tipos de tensões que podem causar mudanças reversíveis e irreversíveis nas proteínas, tais como a agregação, a precipitação ou a desnaturação. Essas dificuldades clamam pela necessidade de agentes que estabilizem essas proteínas delicadas. O desenvolvimento da formulação é uma etapa crítica, requerendo a seleção cuidadosa dos excipientes para obter um rendimento elevado da atividade da proteína durante o processo de purificação, assim como durante o processo farmacêutico e como um produto final. Em particular, isto é verdadeiro para as proteínas de sangue humano e as proteínas do plasma de sangue humano.

[003] Um dos estabilizantes mais amplamente usados para formulações de proteínas são os carboidratos, também chamados sacarídeos. Os carboidratos são construídos de componentes de carboidratos básicos ligados chamados monossacarídeos, e podem ser de comprimento diferente e podem desse modo ter características diferentes.

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A sacarose e a trehalose, os dois estabilizantes mais comumente usados, são ambos dissacarídeos, desse modo compostos por dois monossacarídeos.

005]

Em comparação a dois dos estabilizantes de carboidratos mais comumente usados, a sacarose e a trehalose, que são dissacarídeos, a melezitose é um trissacarídeo. É geralmente indicado [Wang

W, Lyophilisation and

203, development of solid protein pharmaceuticals, Int J Farm

1-60, 2000; Carpenter J.F., Chang B.S., Garzon-Rodriguez

W.,

Randolf T.W.,

Rational design of stable lyophilized protein formulations: Theory and practice, chapter 5, ed

Carpenter and Manning, Kluiwer

Academic / Plenum Publishers,

New York, 2002] em que esses dissacarídeos são a primeira escolha para a estabilização das proteínas em solução e no estado liofilizado. Alguns dissacarídeos, tais como a lactose ou a maltose, são açúcares redutores que podem degradar proteínas através da reação de Maillard durante a armazenagem no estado sólido. Se sacarídeos maiores forem usados como estabilizantes em preparados liofilizados, a literatura sugere que estes são menos eficientes devido ao impedimento estérico da interação proteína-estabilizante [Carpenter J.F.,

Chang B.S.,

Garzon-Rodriguez W.,

Randolf T.W.,

Rational design of stable lyophilized protein formulations: Theory and practice, chapter 5, ed Carpenter and Manning, Kluiwer

Academic / Plenum Publishers, New York, 2002].

[006] artigo de revisão de Wang, W.,

International Journal of Pharmaceutics, 203 (2000) 1

60,

Lyophilisation and development of solid protein pharmaceuticals, afirma, entre outros, que a maltose, a glicose e a maltotriose poderiam aumentar a recuperação da

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3/25 atividade da catalase a 1 mg ml-1, mas a maltopentose, a maltohexose, e a maltoheptose não foram tão eficazes. A ineficácias de sacarídeos maiores sugere que a estabilização da proteína por açúcares pode depender do comprimento da cadeia do lado do glucosídeo do açúcar que pode interferir na ligação de hidrogênio intermolecular entre açúcares estabilizantes e proteínas. Esse artigo de revisão recomenda dissacarídeos como estabilizantes (páginas 9/10).

[007] O documento de patente WO-A-2003/086443 apresenta o uso de carboidratos incluindo a estaquiose, a melezitose, e vários mono- e dissacarídeos para a preparação de preparados de polipeptídeos administráveis intranasalmente. Os açúcares servem como agentes para reduzir os efeitos da tensão de cisalhamento durante a aspersão.

[008] O documento de patente WO-A-86/04486 apresenta a purificação cromatográfica, entre outros, do fator VIII em que a melezitose é usada como um aditivo de hidratação durante o processo cromatográfico.

[009] O documento de patente WO-A-91/18091 apresenta um método de preservação de substâncias biológicas delicadas ou compostos orgânicos (a) em um estado seco e/ou (b) a temperaturas elevadas e/ou (c) sob irradiação, que compreende a incorporação, em um sistema que contém as ditas substâncias ou compostos, de um açúcar ou um derivado de açúcar selecionado de (i) um glicosídeo não redutor de um composto de poli-hidroxi selecionado de álcoois de açúcar e de outros poliálcoois de cadeia retilínea, ou (ii) um oligossacarídeo não redutor selecionado entre a rafinose, a estaquiose e a melezitose.

[010] Mollmann, S. H. et al relatam em Drug

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Dev. Ind. Pharm. Julho de 2006; (6):765-78 sobre a estabilidade da insulina nas formulações sólidas que contêm melezitose e amido.

[011] A presente invenção apresenta um método para a estabilização de uma proteína de sangue humano ou uma proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular de >10 KDa mediante a adição de melezitose a uma solução que compreende a proteína de sangue humano ou a proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular de >10 KDa [012] De preferência, a proteína de sangue humano ou a proteína do plasma de sangue humano tem um peso molecular de >10 KDa Com mais preferência, o peso molecular fic na faixa de 10 KDa a 300 KDa. Ainda com maior preferência, o peso molecular fica na faixa de 20 KDa a 200 KDa. Pode ser vantajoso que a proteína de sangue humano ou a proteína do plasma de sangue humano tenha uma faixa de peso molecular de 50 KDa a 100 KDa ou uma faixa de peso molecular de 100 KDa a 150 KDa, ou uma faixa de peso molecular de 150 KDa a 200 KDa.

[013] Em particular, a proteína de sangue humano ou a proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular > 10 KDa é uma proteína farmacêutica ou biologicamente relevante. A proteína de sangue humano ou a proteína do plasma de sangue humano farmacêutica ou biologicamente relevante com um peso molecular > 10 KDa que pode ser estabilizada de acordo com a invenção pode ser uma proteína de sangue humano ou uma proteína do plasma de sangue humano produzida de forma recombinante.

[014] O termo proteína inclui proteínas quimicamente sintetizadas, assim como proteínas naturalmente

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5/25 sintetizadas que são codificadas por genes de células cultivadas bem como proteínas recombinantes secretadas por células. As proteínas recombinantes são aquelas que são codificadas pelos transgenes introduzidos nas células por técnicas de biologia molecular. As proteínas podem ser modificadas por métodos químicos ou por enzimas em processos pós-translatoriais.

[015] De acordo com a invenção, proteína inclui proteínas do ser humano, em particular aquelas produzidos por culturas de células, mas também proteínas de outras fontes tais como plantas, insetos, etc., e proteínas mutadas, artificiais, sintéticas, de fusão ou quiméricas.

[016] O termo proteína de sangue humano ou proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular > 10 KDa inclui fatores de coagulação do sangue particularmente humano incluindo o fibrinogênio, monômero de fibrina, a protrombina, a trombina, FV, FVa, FX, FXa, FIX, FIXa, FVII, FVIIa, FVIII, FXI, FXIa, FXII, FXIIa, FXIII, FXIIIa, o fator de von Willebrand, ADAMTS13, etc., proteínas de transporte tais como a albumina, a transferrina, a ceruloplasmina, a haptoglobina, a hemoglobina, a hemopexina, etc., inibidores de protease tais como a β-antitrombina, a αantitrombina, a α-2-macroglobulina, inibidor de Cl, inibidor da via do fator de tecido (TFPI), cofator II de heparina, inibidor da proteína C (PAI-3), a proteína C, a proteína S, a proteína Z, etc., imunoglobulinas tais como anticorpos policlonaisl (IgG), anticorpos monoclonais, etc., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, IgM, IgE, IgD, proteína de Bence Jones, prote[ínas do plasma relacionadas às células tais como a fibronectina, a tromboglobulina, o fator 4 de plaquetas,

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6/25 etc., apolipoproteínas tais como apo A-I, apo A-ii, apo E, fatores de complemento tais como o fator B, o fator D, o fator H, o fator I, inativador de C3b, a properdina, proteína de ligação C4, etc., fatores do crescimento tais como o fator do crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o fator do crescimento epidermal (EGF), o fator alfa do crescimento de transformação (Tgf-α), o fator beta do crescimento de transformação (Tgf-β), o fator do crescimento de fibroblastos (FGF) e o fator do crescimento de hepatócitos, proteínas antiangionéticas tais como a antitrombina latente e a antitrombina pré-latente, etc., proteínas altamente glicosiladas incluindo a glicoproteina de alfa-1-ácido, a antiquimotripsina, o inibidor inter-a-tripsina, a α-2-HS glicoproteína, proteína C-reativa, e outras proteínas de sangue humano ou proteínas do plasma de sangue humano com um peso molecular > 10 KDa tais como a glicoproteína rica em histidina, lecitina de ligação de manana, proteína de ligação C4, fa ibronectina, a GC-globulina, plasminogênio, a a-1microglobulina, a proteína C-reativa, fatores do sangue tais como a eritropoeitina, interferon, fatores de tumor, tPA, gCSF e seus derivados e muteinas. São de particular interesse o fator IX, o fator VIII, G-CSF, vWF, a antitrombina (EM), o fator do crescimento de hepatócitos (HGF), IgG policlonal, a alfa-1 antitripsina, o fator H, o fator I, o inibidor de C1esterase, o fator VII e as combinações destes. No entanto, os polipeptídeos tais como a insulina não são cobertos pelo termo proteína de sangue humano ou proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular > 10 KDa simplesmente porque a insulina tem um peso molecular de cerca de 5.700 Da.

[017] Os termos proteína de sangue humano e

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7/25 proteína do plasma de sangue humano incluem derivados, especialmente as moléculas que foram modificadas para terem uma meia vida prolongada. As modificações para o prolongamento da meia vida incluem, mas sem ficar a elas limitadas, proteínas de fusão, proteínas modificadas pela mutagênese e proteínas ligadas a um conjugado por ligação covalente ou não covalente. De acordo com a invenção, as proteínas do plasma de sangue humano ou as proteínas de sangue humano podem ser ligadas covalentemente às moléculas de hidroxil etil amido (HES), provendo em particular moléculas com um peso molecular de 20 a 200 KDa.

[018] Onde é feita referência ao peso molecular, isto se refere ao peso molecular dos compostos (isto é, incluindo o peso molecular de qualquer composto químico ligado covalentemente à proteína).

[019] A presente invenção apresenta em particular um método em que a solução é transferida para o estado sólido.

[020] A presente invenção refere-se à descoberta de um novo agente estabilizante para uma proteína de sangue humano ou proteína do plasma de sangue humano farmacêutica com um peso molecular de >10 KDa [021] Surpreendentemente, foi verificado que a melezitose pode ser usada como estabilizante para proteínas de sangue humano ou proteínas do plasma de sangue humano com um peso molecular > 10 KDa, tal como o fator recombinante VIII (170 KDa), o fator IX (55 kDa) e G-CSF HESilatado (120 kDa). Espera-se que as proteínas de sangue humano e as proteínas do plasma de sangue humano de peso molecular similar tenham requisitos similares de estabilização. Por

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8/25 exemplo, o fator IX é uma proteína do plasma de sangue humano dependente da vitamina k e tem similaridades bioquímicas com todas as outras proteínas do plasma de sangue humano dependentes da vitamina K.

O domínio de Gla é uma característica estrutural comum em todas essas proteínas dependentes da vitamina K, e imediatamente depois do domínio de Gla cada uma das proteínas (exceto a protrombina) tem um ou mais domínios do tipo EGF. As proteínas dependentes da vitamina K requerem íons de Ca2+ para expressar a sua função fisiológica e os sítios de ligação de cálcio envolvem pelo menos o domínio de Gla e os domínios do tipo EGF. A ligação de cálcio permite que essas proteínas se liguem a fosfolipídios/membranas de células e expressem desse modo as suas atividades biológicas completas. São conhecidas sete proteínas do plasma de sangue humano como dependentes da vitamina K para a sua biossíntese. Elas são a protrombina (fator II, 72 KDa), o fator VII/factor VIIa (50/50 KDa), o fator IX (55 KDa) ou o fator IXa, o fator X (59 KDa) ou o fator Xa, a proteína C (62 KDa), a proteína S (69 KDa) e a proteína Z (62 KDa).

[022] Surpreendentemente, foi verificado que as proteínas de sangue humano e as proteínas do plasma de sangue humano que são ligadas covalentemente com uma molécula de hidroxi etil amido (HES) com um peso molecular na faixa de 20-200 KDa são apropriadas para a estabilização com melezitose.

[023] A melezitose exibiu uma excelente capacidade de manter a atividade da proteína em ambas as formulações liofilizadas e em solução.

[024] De acordo com a invenção, a etapa de

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9/25 transferência da solução no estado sólido é a liofilização com a adição de melezitose. A melezitose também pode ser usada em combinação com outros açúcares, tais como a trehalose, ou a sacarose. A melezitose, também escrita como melicitose, é um açúcar trissacarideo não redutor que é produzido por muitos insetos comedores de plantas, incluindo afídios tais como Cinara pilicornis por uma reação de enzima. 0 nome IUPAC é (2R, 3R, 4S, 5S, 6R)-2-[ [ (2S, 3S, 4R, 5R)-4hidroxi-2,5-bis(hidroximetil)-3-[[(2R, 3R, 4S, 5S, 6R)-3,4,5triidroxi-6-(hidroxil-metil)-2-tetraidropiranil]oxi]-2tetraidrofuranil]oxi]-6-(hidroxil-metil)-tetraidropiran-

3,4,5-triol.	molecular de
[025]	A melezitose	tem um peso
504,44 g/mol.
[026] pela fórmula:	A estrutura	respectiva é	representada

[027] Tipicamente, a melezitose está presente em uma quantidade de até cerca de 1.000 mM. O limite inferior depende da quantidade de melezitose, resultando um efeito estabilizador suficiente na proteína de interesse. A

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10/25 quantidade apropriada pode ser determinada de imediato por um elemento versado na técnica que emprega a metodologia dos exemplos e seu conhecimento geral. Uma faixa praticável é, por exemplo, de 10 mM a cerca de 200 mM ou de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM em relação à formulação final.

[028] De preferência, a quantidade é maior do que 20 mM ou maior do que 30 mM.

[029] De preferência, a quantidade de melezitose por quantidade de proteína de sangue humano ou proteína do plasma de sangue humano fica compreendida na faixa de 10:1 a 5000:1, e de preferência na faixa de 50:1 a 150:1, ou de 1.000:1 a 3.000:1, calculado em um uma base de peso por peso, isto é, a quantidade de melezitose é maior do que a quantidade da proteína.

[030] Em uma modalidade preferida, de 10 a 100 mg de melizitose são incluídos em uma dosagem farmacêutica de uma proteína.

[031] O objeto da presente invenção é uma composição que compreende uma proteína de sangue humano ou uma proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular > 10 KDa e melezitose. A composição pode estar presente no estado líquido ou sólido.

[032] Em uma modalidade da invenção, a composição da invenção também compreende um agente de volumeagente de volume, um agente tensoativo, um agente de tamponamento, um estabilizante adicional e/ou modificador de tonicidade.

[033] Um tensoativo de acordo com a invenção é um composto que adsorve em superfícies e interfaces e neutraliza desse modo a perda da atividade de uma proteína

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11/25 devida à adsorção. Esse tipo de perda da atividade pode ocorrer durante todo o processamento farmacêutico, bem como ao manipular o produto reconstituído antes e durante a administração a um paciente. Os tensoativos geralmente usados são o polisorbato 80, o polisorbato 20 e os poloxâmeros, em particular o Poloxâmero 188. Além disso, proteínas tais como a albumina, em particular a albumina recombinante, podem ser usadas como um agente tensoativo. Além disso, a albumina recombinante pode ser usada de acordo com uma modalidade da invenção.

[034] Um agente de ajuste do pH é indicado como um composto com uma capacidade de tamponamento na faixa ideal do pH da proteína a ser formulada. A presente invenção, quando apropriado, engloba o citrato de sódio, o ácido maleico, a histidine, o ácido 2-(4-(2-hidroxi-etil)-1piperazinil)-etano sulfônico (HEPES), o ácido 3-(Nmorfolino)propano sulfônico (MOPS), o ácido 2-(Nmorfolino)etano sulfônico (MES), o ácido piperazina-N,N'bis(2-etano) sulfônico (PIPES), ou Tris (tris(hidroximetil)aminometano) como um agente de ajuste do pH. O agente de tamponamento está presente em uma quantidade para manter um pH em uma faixa em que a proteína permanece funcional. Isto é diferente de uma proteína a outra. O elemento versado na técnica conhece as faixas preferidas da respectiva proteína, em particular de proteínas de sangue humano ou de proteínas do plasma de sangue humano com um peso molecular de >10 KDa Como um exemplo, o citrato de sódio mantém o pH variando de 6,5 a 7,5. Uma forma apropriada do citrato de sódio é a forma de di-hidrato. Geralmente, as composições de acordo com a invenção podem estar na forma

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12/25 liofilizada, mas também são representadas por soluções tais como uma solução a ser liofilizada e uma solução reconstituída de uma composição liofilizada.

[035] Um modificador de tonicidade é indicado como um composto que está presente na formulação para balancear a tonicidade. A presente invenção, onde apropriado, engloba o cloreto de sódio, a arginina, a glicina, o cloreto de potássio, açúcares ou álcoois de açúcar como modificadores de tonicidade.

[036] Embora a melezitose exiba propriedades de crio- e lioproteção, crio- e lioprotetores adicionais (crio/lioprotetores) também podem estar presentes. Este é um composto presente na formulação para diminuir ou impedir a perda da atividade da proteína durante as etapas de congelamento e secagem de um processo de liofilização e durante a armazenagem subsequente do produto liofilizado. A presente invenção, onde apropriado, engloba dissacarídeos não redutores, tais como a sacarose e a trehalose, e dissacarídeos redutores, tais como a maltose e a lactose, como crio-/lioprotetores adicionais.

[037] Um agente de volumeagente de volume é indicado como um excipiente presente na formulação para prover suporte mecânico ao bolo liofilizado e para aumentar o peso seco. O agente de volumeagente de volume pode estar em um estado cristalino, tal como o cloreto de sódio, ou em um estado amorfo, tal como a arginina. A quantidade do agente de volumeagente de volume pode ser de até 10% com base no peso na formulação final. A presente invenção, onde apropriado, engloba o cloreto de sódio, a glicina, o manitol, a sacarose ou a arginina como agente de volumeagente de volume.

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13/25 [038] Um objeto adicional da presente invenção é o uso da melezitose para a estabilização a longo prazo de uma proteína no estado seco, tal como uma formulação liofilizada por pelo menos 6 meses, em particular por pelo menos 12 meses, mais particularmente por pelo menos 18 meses, e ainda mais particularmente por 24 meses.

[039] A invenção é descrita ainda nos exemplos não limitadores a seguir.

Análise da atividade - Fator VIII [040] A atividade do fator VIII foi medida com um ensaio cromogênico ou com um ensaio de um estágio e a unidade do fator VIII foi expressa em Unidades Internacionais (IU).

[041] O ensaio cromogênico é o método prescrito na European Pharmacopoeia. O método é um método fotométrico de dois estágios que mede a atividade biológica do fator VIII como um cofator. O fator VIII ativa o fator X como fator Xa, que por sua vez é clivado enzimaticamente como um produto que pode ser quantificado espectrofotometricamente.

[042] O ensaio de coagulação de um estágio é baseado na capacidade de uma amostra contendo o fator VIII de corrigir o tempo de coagulação do plasma deficiente do fator VIII na presença de fosfolipídio, do ativador de contato e de íons cálcio. O tempo do surgimento de um coágulo de fibrina é medido em uma etapa.

Análise da atividade - Fator IX [043] A atividade biológica do fator IX foi medida com um ensaio de coágulo de um estágio e/ou um ensaio cromogênico e a unidade do fator IX foi expressa em Unidades

Internacionais (IU) tal como definido pelo padrão de

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14/25 concentrado do fator IX WHO atual.

[044] O ensaio de coagulação de um estágio é o método prescrito na European Pharmacopoeia. O princípio do ensaio é baseado na capacidade de uma amostra contendo o fator IX de corrigir o tempo de coagulação de um plasma deficiente do fator IX na presença de fosfolipídios, do ativador de contato e dos íons cálcio. O temo do surgimento de um coágulo de fibrina é medido em uma etapa. A atividade do fator IX é inversamente proporcional ao tempo de coagulação.

[045] O ensaio cromogênico é um método fotométrico de dois estágios. No primeiro estágio, o fator IX é ativado como fator IXa pelo fator ativado XI (XIa) na presença de trombina, fosfolipídios e cálcio. O fator IXa forma um complexo enzimático com o fator VIII ativado por trombina (VIIIa) que, na presença dos fosfolipídios e do cálcio, ativa o fator X como fator Xa. No estágio dois, o fator Xa hidrolisa um substrato cromogênico específico do fato Xa, liberando desse modo um grupo pNA cromofórico que pode ser quantificado espectrofotometricamentei.A atividade do fator IX é diretamente proporcional à quantidade do fator Xa gerado.

Análise - G-CSF HESilatado Recombinante

Análise Resource S HPLC de HES-G-CSF [046] As amostras são diluídas até 0,1 mg/ml com o eluente A. 20 pg são injetados em uma coluna Resource S de 1 ml (GE Healthcare, Munique, Alemanha).

[047] Eluente A: 20 mM de acetato de Na, pH 4,0 [048] Eluente B: 20 mM de acetato de Na, NaCl

0,5 M, pH 4,0

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	[049] [050]	Vazão: 1 ml/min Gradiente: 0% - 8%	1,8 - 2,0
minutos
	[051]	8% - 52% 2,0 - 13,0	minutos
	[052]	52% - 100% 13,0 -	13,6 minutos
	[053]	A largura de pico do	pico de HES-G-CSF é

tomada como critério de qualidade, uma vez que foi mostrado que o HES-G-CSF agregado tem uma largura de pico maior. O ganho da largura de pico é definido como a diferença da largura de pico de HES-G-CSF antes e depois da tensão térmica ou de cisalhamento.

EXEMPLOS

Fator VIII Recombinante [054] O fator VIII usado nas experiências é uma proteína do fator VIII deletada do domínio B humana recombinante, produzida na linhagem de células humanas HEK293F de acordo com o processo descrito no documento de patente EP-A-1 739 179 (Schroder et al.). O processo de purificação consistiu em cinco etapas de cromatografia e gerou um preparado altamente puro de proteína do fator VIII (Winge et al, WO-A-2009/156430) com uma glicosilação humana como padrão (Sandberg et al., PCT/EP2009/060829).

Fator IX derivado do plasma [055] O material usado nestes experimentos é originário do produto comercialmente disponível Nanotiv®, que é um concentrado do fator IX tratado com SD e nanofiltrado de elevada pureza. Antes do uso nesses experimentos, o material foi ainda mais purificado em uma coluna de filtração de gel onde o pico de monômero do fator IX foi usado para outros experimentos.

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G-CSF HESilatado Recombinante [056] A linhagem de células usada é um derivada de célula renal embriônica humana 293 (HEK 293), que foi adaptada ao crescimento sem soro. Esse hospedeiro, HEK 293F, foi transfectado estavelmente com um cassete de expressão contendo a sequência de codificação do DNA para G-CSF. O promotor forte foi usado para o cassete. O processo geral também é descrito no documento de patente EP 1739179 (Schroder et al.).

[057] O processo de purificação consistiu em quatro etapas de cromatografia e gerou um preparado de proteína G-SCF altamente pura. A proteína G-CSF foi acoplada a um derivado de hidroxi etil amido (HES) com um peso molecular de cerca de 100 KDa. Finalmente, o HES-G-CSF foi purificado a partir do derivado de HES e G-CSF não reagidos por uma etapa de cromatografia, resultando uma molécula com um peso molecular total de cerca de 120 KDa.

Exemplo 1: Estabilização de rFVIII pela melezitose em solução

Preparação [058] O fator VIII recombinante (rFVIII) foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento comparou o efeito estabilizador da melezitose no rFVIII em solução com aquele da trehalose geralmente usada como estabilizante. A concentração do rFVIII era de 100 IU/ml. As composições das formulações investigadas neste experimento são indicadas na Tabela 1.

Tabela 1. Composições da formulação.

1A

1B

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Melezitose, mM	_-	48
Trehalose di-hidratada, mM	63	_-
NaCl, mg/ml	30	30
Cloreto de cálcio di-hidratado, mg/ml	0,5	0,5
Poloxâmero 188, mg/ml	2	2
Histidina, mg/ml	3	3

[059] As formulações foram armazenadas por até dias a +25°C para avaliar a atividade da proteína em relação ao tempo. As amostras foram tomadas a intervalos regulares e analisadas com o ensaio cromogênico, tal como descrito na seção experimental acima. Os resultados são resumidos na Tabela 2, como porcentagem do valor inicial.

Tabela 2. Resultados.

	Atividade do fator VIII em relação ao tempo (dias) (% do valor inicial)
0	1	7
1A	+ 25°C	100	86	85
1B	+ 25°C	100	82	86

[060] Conclusões do Exemplo 1: Este experimento mostra que, surpreendentemente, a melezitose, a despeito de sua concentração molar mais baixa, tem um efeito estabilizador no rFVIII em solução igual àquele da trehalose.

Exemplo 2: Estabilização do rFVIII pela melezitose na forma liofilizada

Preparação [061] O fator VIII recombinante (rFVIII) foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento comparou o efeito estabilizador da melezitose com aquele da trehalose geralmente usada como

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18/25 estabilizante, em relação ao processo de secagem por congelamento e em formulações liofilizadas. A concentração do rFVIII era de 100 IU/ml. As composições das formulações investigadas nesta experiência são indicadas na tabela 3.

Tabela 3. Composições das formulações.

	2A	2B
Trehalose, mM	63	_-
Melezitose, mM	_-	48
NaCl, mg/ml	30	30
Cloreto de cálcio di-hidratado, mg/ml	0,5	0,5
Poloxâmero 188, mg/ml	2	2
Histidina, mg/ml	3	3

[062] Alíquotas de 1.5 ml das soluções foram liofilizadas em um secador por congelamento em escala de laboratório. A recuperação de proteína em relação à etapa de liofilização foi de 93% para a formulação 2B e de 86% para a formulação 2A. As amostras liofilizadas foram armazenadas por até 4 semanas a +25°C e +40°C para avaliar a atividade da proteína em relação ao tempo. As amostras foram reconstituídas em 1,5 ml de água para injeções e foram analisadas com o ensaio cromogênico, descrito na seção experimental acima. Os resultados são resumidos na tabela 4.

Tabela 4. Resultados

	Atividade do fator VIII em relação ao tempo (semanas) (% do valor inicial)
0	1	2	4
2A	+ 25°C	100	97	89	*
	+ 40°C	100	98	90	93
2B	+ 25°C	100	117	95	*

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19/25

+ 40°C

100

104

97

99

* nenhuma mudança significativa [063] Conclusões do Exemplo 2:

Surpreendentemente, este experimento mostra que a melezitose pode proteger o rFVIII a uma concentração molar mais baixa do que a trehalose em relação à etapa de liofilização, e que estabiliza melhor o rFVIII do que a trehalose durante a armazenagem.

Exemplo 3: Estabilização do rFVIII pela melezitose na forma liofilizada

Preparação [064] O fator VIII recombinante (rFVIII) foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento comparou o efeito estabilizador da melezitose a concentrações diferentes em relação ao processo de secagem por congelamento e em formulações liofilizadas, e também comparou o efeito estabilizador com o tetrassacarídeo estaquiose. A concentração do rFVIII era de 170 IU/ml. As composições das formulações investigadas nesta experiência são indicadas na Tabela 5.

Tabela 5. Composições das formulações.

	3A	3B	3C	3D
Melezitose, mM	48	36	24	-
Estaquiose, mM	-	-	-	30
NaCl, mg/ml	30	30	30	30
Cloreto de cálcio di- hidratado, mg/ml	0,5	0,5	0,5	0,5

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20/25

Poloxâmero 188, mg/ml	2	2	2	2
Citrato de sódio, mg/ml	2	2	2	2

[065] Alíquotas de 1,5 ml das soluções foram liofilizadas em um secador por congelamento de escala de laboratório. A recuperação de proteína em relação à etapa de liofilização foi de 91 a 100% para as formulações que contêm a melezitose, ao passo que a recuperação foi de 84% para a formulação 3D que contém a estaquiose como estabilizante. As amostras liofilizadas foram armazenadas por até 12 meses a +25°C e +40°C para avaliar a atividade da proteína em relação ao tempo.

[066] As amostras foram reconstituídas em 1,5 ml de água para injeções e foram analisadas com o ensaio cromogênico, descrito na seção experimental acima. Os resultados são resumidos na tabela 6.

Tabela 6. Resultados.

	Atividade do fator VIII em relação ao tempo
(dias)	(% do valor inicial)
0	1	2	3	6	12
3A
	25°C	100	*	n.a.	*	*	91
	40°C	100	96	93	93	n.a.	n.a.
3B
	25°C	100	92	n.a.	96	95	78
	40°C	100	90	79	73	n.a.	n.a.
3C
	25°C	100	91	n.a.	86	86	67
	40°C	100	70	58	48	n.a.	n.a.

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21/25

3D
	25°C	100	95	n.a.	79	65	n.a.
	40°C	100	74	n.a.	51	n.a.	n.a.

[067] n.a. = não analisado; * nenhuma mudança significativa [068] Conclusões do Exemplo 3: Este experimento mostra que a melezitose funciona excepcionalmente bem como um estabilizante para o rFVIII em relação à etapa de lifilização e na forma liofilizada. Além disso, mostra que a estaquiose não é um estabilizante preferível para formulações liofilizadas, uma vez que mostra resultados muito insatisfatórios durante a armazenagem a ambos 25°C e 40°C, em comparação às formulações que contêm melezitose.

Exemplo 4: Estabilização do fator IX do plasma pela melezitose na forma liofilizada

Preparação [069] O fator IX derivado do plasma (pFIX) foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento investiga o efeito estabilizador da melezitose no pFIX. A concentração do pFIX era de 100 IU/ml. A composição da formulação investigada neste experimento é indicada na tabela 7.

Tabela 7. Composição da formulação.

	4A
Melezitose, mM	42
NaCl, mg/ml	30
Polisorbato 80, mg/ml	0,1
Citrato de sódio,	2,35

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22/25

mg/ml

[070] Alíquotas de 1.5 ml das soluções foram liofilizadas em um secador por congelamento de escala de laboratório. As amostras liofilizadas foram armazenadas por até 6 meses a +5°C, +25°C e +40°C para avaliar a atividade da proteína em relação ao tempo. As amostras foram reconstituídas em 1,5 ml de água para injeções e foram analisadas com o ensaio cromogênico, descrito na seção experimental acima.

Resultados [071] A recuperação de proteína em relação à etapa de liofilização foi de cerca de 100%. Os resultados do estudo da estabilidade são mostrados na tabela 8.

Tabela 8. Resultados.

	Atividade do fator IX em relação ao tempo
(meses	(% do valor inicial)
0	1	3	6
4A	5°C	100	88	87	85
	25°C	100	94	89	86
	40°C	100	93	92	n.a.

[072] n.a. = não analisado; * nenhuma mudança significativa [073] Conclusões do Exemplo 4: Este experimento mostra que, surpreendentemente, a melezitose funciona bem como um estabilizante para o fator IX na forma liofilizada.

Exemplo 5: Estabilização de G-CSF HESilatado recombinante pela melezitose na forma liofilizada.

Preparação [074] G-CSF HESilatado recombinante (rHES-G

CSF) foi preparado de acordo com a descrição na seção

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23/25 experimental acima. O experimento comparou o efeito estabilizador da melezitose em rHES-G-CSF na forma liofilizada com aquele da trehalose geralmente usada como estabilizante. A concentração de rHES-G-CSF era de 0,3 mg/ml e as composições das formulações investigadas são indicadas na tabela 9.

Tabela 9. Composições da formulação.

	5A	5B
Melezitose, mM	70	_-
Trehalose, mM	_-	70
NaCl, mg/ml	30	30
Polisorbato 20, mg/ml	0,2	0,2
Histidina, mg/ml	3	3

[075] Alíquotas de 1.5 ml das soluções foram liofilizadas em um secador por congelamento de escala de laboratório. A recuperação de proteína foi medida depois de uma armazenagem de 4 semanas a +40°C pelo método Resource S, descrito na seção experimental acima. Os resultados são resumidos na tabela 10.

Tabela 10. Resultados.

	Ganho de largura de pico (min) após 4 semanas
5A	+ 40°C	0,04
5B	+ 40°C	0,06

[076] Conclusões do Exemplo 5: Este experimento mostra que a melezitose tem um efeito estabilizador melhor em rHES-G-CSF do que aquele da trehalose geralmente usada como estabilizante a uma mesma concentração molar.

Exemplo 6: Estabilização do fator IX do plasma pela

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24/25 melezitose em relação à etapa de secagem por congelamento

Preparação [077] O fator IX derivado do plasma (pFIX) foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento investiga o efeito estabilizador da melezitose no pFIX em relação à etapa de secagem por congelamento em comparação ao tetrassacarídeo estaquiose. A concentração do pFIX era de 100 IU/ml. As composições das formulações investigadas nesta experiência são indicadas na tabela 11.

Tabela 11. Composições das formulações.

	6A	6B
Melezitose, mM	42	_-
Estaquiose, mM	_-	30
NaCl, mg/ml	30	30
Polisorbato 80, mg/ml	0,1	0,1
Citrato de sódio, mg/ml	2,35	2,35

[078] Alíquotas de 1.5 ml das soluções foram liofilizadas em um secador por congelamento de escala de laboratório.

cromogênico,

As amostras foram analisadas com o ensaio descrito na seção experimental acima, antes e depois da etapa de liofilização.

Resultados [079] A recuperação de proteína em relação à etapa de liofilização foi de cerca de 100% para a formulação 6A, ao passo que a recuperação correspondente para a formulação 6B foi de 84%.

080] Conclusões do Exemplo 6: Este experimento

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25/25 mostra que a melezitose funciona bem como um estabilizante para o fator IX em relação etapa de liofilização. No entanto, a estaquiose não é um candidato apropriado como estabilizante, uma vez que uma perda significativa da atividade ocorre em relação à etapa de secagem por congelamento.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA ESTABILIZAR UMA PROTEÍNA DO PLASMA DE SANGUE HUMANO, com um peso molecular >10 KDa, pela adição de melezitose a uma solução, caracterizado pelo fato de compreender a proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular >10 KDa, em que é uma proteína do plasma de sangue humano farmaceuticamente ou biologicamente relevante ou uma proteína do plasma de sangue humano produzida por recombinação selecionada do grupo consistindo fator VII; fator VIIa; fator IX; fator VIII; fator estimulador de colônias de granulócitos conjugados com hidroxietil-amido (HES-G-CSF); e muteínas ou seus derivados
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a solução ser transferida para o estado sólido, opcionalmente, pela liofilização.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a melezitose estar presente em uma quantidade de até 1.000 mM, em particular, de 10 mM a 200 mM, em particular de 10 mM a 100 mM.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de pelo menos um agente tensoativo estar presente, tal como a albumina, o polisorbato 80, o polisorbato 20 ou poloxâmeros recombinantes, em particular, o poloxâmero 188.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de pelo menos um agente de tamponamento estar presente, tal como, histidina, citrato de sódio, HEPES, Tris, MOPS ou PIPES.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das

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2/3 reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de pelo menos um estabilizante adicional estar presente, tais como, açúcares, aminoácidos, polióis, cofatores ou as combinações destes e/ou em que pelo menos um modificador de tonicidade está presente, tal como, cloreto de sódio, arginina, glicina, cloreto de potássio, açúcares ou álcoois de açúcar e/ou em que pelo menos um agente de volume está presente, tal como, glicina, manitol, cloreto de sódio, arginina ou sacarose.
7. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular >10 KDa e melezitose, em que a proteína humana do plasma do sangue é selecionada do grupo consistindo de: fator VII; fator VIIa; fator IX; fator VIII; fator estimulador de colônias de granulócitos conjugados com hidroxietil-amido (HES-G-CSF); e derivados ou muteínas do mesmo.
8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de estar no estado líquido ou sólido.
9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7 ou

8, caracterizado pelo fato de compreender ainda um agente de volume, um tensoativo, um agente de tamponamento, um estabilizante adicional e/ou um modificador de tonicidade.
10. USO DA MELEZITOSE para a estabilização de uma proteína do plasma de sangue humano com um peso molecular >10 KDa, caracterizado pelo fato de a proteína humana do plasma do sangue ser selecionada do grupo consistindo de: fator VII; fator VIIa; fator IX; fator VIII; fator estimulador de colônias de granulócitos conjugados com hidroxietil-amido (HES-G-CSF); e muteínas ou seus derivados, em particular na estabilização de um processo, em um processo de liofilização, em solução, durante a purificação, e produção em particular