CN112798373B - 一种血液本周氏蛋白的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血液本周氏蛋白检测的样本处理方法，包括以下步骤：(1)采集静脉血样本，分离得到血清；(2)向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖0.5‑5w/v％；海藻糖0.1‑3.5w/v％；氯化钾0.05‑0.15g/L。上述样本处理方法处理后首次实现了血液样本中本周氏蛋白的快速检测，且检测结果更加直观易于判断，具有检测时间短和准确率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种血液本周氏蛋白的检测方法。
背景技术
本周氏蛋白（Bence-Jones protein, BJP）是一种免疫球蛋白的游离轻链（freelight chain，FLC)，能自由通过肾小球滤过膜，当浓度增高超过近曲小管重吸收的极限时，可自尿中排出，即本周蛋白尿。酸性尿加热至40～60℃时发生凝固，90～100℃时可再溶解，当温度降低至56℃左右，又可重新凝固，故又称凝溶蛋白。所有的单克隆B淋巴细胞增殖病变均可能与本周氏蛋白的出现有关，但检出率往往取决于分析技术的敏感性和是否运用预先浓缩的尿液进行检测。
热沉淀法、甲苯磺酸法定性检测尿液本周氏蛋白的阳性率均较低，免疫散射比浊法可提高检测的灵敏度，尿免疫固定电泳法展现的结果非常直观，可与免疫法检测互补，临床应用普遍，通常可在分析前将尿样浓缩200倍左右，以避免浓度低于检测限所致的假阴性。尿免疫固定电泳技术是检测本-周蛋白常用的检测手段。
FLC的平均分子量大约为25000，由210-220个氨基酸组成，分为两大类，即κ型、λ型。游离轻链可以以二聚体的形式出现，分子量大约为50000。循环中及尿中游离轻链并不是来源于血清中完整的单克隆免疫球蛋白的降解，而是由于淋巴细胞克隆过度产生的游离轻链。轻链的单体、二聚体经肾小球滤过，在近曲小管内通过胞饮作用而被重吸收，经溶酶体酶水解后氨基酸进入血液循环。人体中产生的κ链大约是λ链的2倍，且κ型FLC常为单体，而λ型FLC易形成二聚体，与二聚体λ链FLC分子相比，单体κ型FLC分子更易从肾小球滤过。因此，κ型FLC增多的患者尿检多出现阳性。尿中出现FLC的主要原因通常是超负荷蛋白尿，即过量小分子蛋白的滤过，触发胞饮机制的饱和：由于原发性肾小管缺陷或继发于免疫球蛋白FLC毒性所致的蛋白尿，后者在临床上更常见。FLC是肾脏损害的直接原因，FLC的肾毒性可引起：①近端小管上皮细胞中炎症介质的激活；②近端小管坏死；③FLC晶体沉积导致范可尼综合征（肾小管性酸中毒）；④肾病管型；⑤原发性系统性淀粉样变性；⑥轻链沉积性疾病。多数情况下，尿液中FLC检出常与血清中伴有FLC有关，后者伴随相关的肾小球肾害。极少数情况下，尿液中检出FLC但不伴有血清单克隆免疫球蛋白异常，仍需考虑轻链型骨髓瘤或非分泌型骨髓瘤。检测尿中FLC具有极其重要的诊断意义及预后价值，根据Durie Salmon的分类方法，可以借此来评价骨髓瘤的肿瘤负荷。FLC阳性的患者往往预后较差，约40% FLC阳性的患者最终发展成肾衰。
尿免疫固定电泳技术是检测本周氏蛋白常用的检测手段，但是游离轻链结构易形成二聚体及多聚体，分布浓度从1-100000mg/L不等，容易出现抗原过量的情况，从而造成漏检。由于血液中的本周氏蛋白半衰期较短，不容易捕捉，因此其检测存在一定的难度，目前还未有关于检测血液样本中本周氏蛋白方法的报道。
发明内容
基于此，本发明提供一种血液本周氏蛋白检测的样本处理方法，所述方法处理后获得的样品进行免疫固定电泳检测可快速准确地检测出血液样本中是否存在本周氏蛋白，且通过直接图谱可以更直观地观察检测结果。
具体技术方案为：
一种血液本周氏蛋白检测的样本处理方法，包括以下步骤：
（1）采集静脉血样本，分离得到血清；
（2）向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖0.5-5w/v%；海藻糖0.1-3.5 w/v %；氯化钾0.05-0.15g/L。
在其中一些实施例中，所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖0.7-3w/v%；海藻糖0.5-2.5 w/v %；氯化钾0. 08-0.12g/L。
在其中一些实施例中，优选所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖1.5w/v%；海藻糖1 w/v %；氯化钾0.1g/L。发明人经过研究发现，利用上述配方的处理液处理血清样本，可以使条带更加清晰，取得更好的检测效果。
在其中一些实施例中，所述血清与处理液的体积比为1：（0.5-3）。
在其中一些实施例中，所述血清与处理液的体积比为1：（0.5-2）。
在其中一些实施例中，优选所述血清与处理液的体积比为1：1。
在其中一些实施例中，所述血液本周氏蛋白检测的样本处理方法还包括以下步骤：将所述步骤（2）中获得的待检测样品加入琼脂糖胶片中，点样次数为1次。目前利用尿液样本检测本周氏蛋白时，点样次数一般需要达到13次才能实现检测，使得整个检测过程耗时长。而本发明利用血液样本进行检测，血液样本经过本发明处理液处理后，只需要点样1次即可实现检测，缩短了检测时间。
在其中一些实施例中，所述血液本周氏蛋白检测的样本处理方法还包括以下步骤：待点样的琼脂糖胶片完成电泳和本周氏蛋白抗血清孵育后，对琼脂糖胶片进行染色。
在其中一些实施例中，所述染色为使用氨基黑10B染色液进行染色。
在其中一些实施例中，所述氨基黑10B染色液的浓度为5~6.5w/v%。
在其中一些实施例中，优选所述氨基黑10B染色液的浓度为5.5~6w/v%。
本发明还提供了一种血液本周氏蛋白的检测方法。
具体技术方案为：
一种血液本周氏蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（1）采集静脉血样本，分离得到血清；
（2）向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖0.5-5w/v%；海藻糖0.1-3.5 w/v %；氯化钾0.05-0.15g/L；
（3）利用免疫固定电泳法对步骤（2）获得的待检测样品进行检测。
在其中一些实施例中，步骤（3）进行免疫固定电泳检测时本周氏抗血清的孵育温度为18-25℃，时间为10-15min。
在其中一些实施例中，优选所述本周氏抗血清的孵育温度为20℃，时间为10min。
上述样本处理方法仅用于批量化的样本前处理步骤，不涉及具体的疾病诊断。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种适用于血液样本中本周氏蛋白检测的样本处理方法，所述方法处理后可成功实现对血液样本κ型游离轻链和λ型游离轻链的检测，且具有很高的检出率。本发明方法使用优化的处理液对血清进行处理，有效解决了血液样本中本周氏蛋白由于半衰期短而难以检测的问题。所述处理液处理后的血清样本不需要像尿液样本一样进行浓缩和多次点样，有效地简化了操作步骤，缩短了检测时间。此外，发明人还发现使用本发明处理液处理后的血清样本在进行后续的免疫固定电泳检测时，使用氨基黑染色液代替常用的酸紫染色液进行染色能取得更好的检测效果（背景更干净，目的条带更清晰），使得检测结果更加直观和易于判断，进一步地提高检测的准确率。
本发明首次实现了血液样本中本周氏蛋白的检测具有快速和准确率高等优点。在某些情况下，当待检测者体内血液中的本周氏蛋白还未滤过到尿液中时，尿免疫固定电泳检测会出现假阴性的结果，因此，同时利用本发明检测方法和尿免疫固定电泳法检测血液和尿液中的本周氏蛋白可以更好地避免免疫球蛋白游离轻链的漏检，从而可以更全面地对待检测者的身体情况进行评估。
附图说明
图1为实施例1-3和对比例1-3所述方法对1号血液样本中本周氏蛋白的检测结果，其中，κf 代表游离的κ型游离轻链；λf代表游离的λ型游离轻链。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
检测仪器：INTERLAB G26琼脂糖凝胶电泳仪；
检测试剂：SRE640k 免疫固定本周氏蛋白电泳6N ；SCE280M 本周氏抗血清试剂盒。
实施例1
本实施例一种血液本周氏蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（1）采集静脉血样本，3000rpm/min条件下离心3min，分离得到血清；
（2）按血清与处理液的体积比为1：1向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖2.5w/v%；海藻糖0.5 w/v %；氯化钾0.1g/L；
（3）利用免疫固定电泳法对步骤（2）获得的待检测样品进行检测，点样次数为1次；本周氏抗血清试剂盒中抗体的孵育温度为25℃，时间为10min；具体如下：将加样板推回点样卡槽，将琼脂糖胶片在胶片架上卡好，在电极槽上放上电极条，将SCE280M 本周氏抗血清试剂盒里面的抗血清分别放在仪器抗血清架上，然后选中电泳程序（除了点样次数为1次外，其他参数与尿液样本中本周氏蛋白检测参数一致）开始全自动分析。
仪器按照设定的程序自动进行点样后开始电泳，在电泳结束后仪器将抗血清板放在琼脂糖胶片上，并按设定程序在对应的泳道上加入SCE280M 本周氏抗血清试剂盒里面的相应抗体（此时温度均为25℃）；经过10分钟的孵育后，仪器将厚纸板压在已经加完抗血清的琼脂糖胶片上面（此时温度均为25℃），吸除多余抗血清，8分钟后取下厚纸板；开始干燥5分钟（此时温度均为56℃）；干燥结束后，仪器将胶片架转移到清洗槽内，清洗胶片；待清洗胶片结束转移到染色槽，胶片在浓度为5w/v%的氨基黑10B染色液中染色，6分钟后胶片转移到清洗槽位开始进行脱色；待脱色完成后转移到烘干槽，开始烘干胶片；烘干结束后，胶片架归位。检测试验结束，从胶片架上取出胶片，分析结果。
实施例2
本实施例一种血液本周氏蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（1）采集静脉血样本，3000rpm/min条件下离心3min，分离得到血清；
（2）按血清与处理液的体积比为1：3向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖3.5w/v%；海藻糖0.1w/v %；氯化钾0.075g/L；
（3）利用免疫固定电泳法对步骤（2）获得的待检测样品进行检测，点样次数为1次；本周氏抗血清试剂盒中抗体的孵育温度为20℃，时间为10min；具体如下：将加样板推回点样卡槽，将琼脂糖胶片在胶片架上卡好，在电极槽上放上电极条，将SCE280M 本周氏抗血清试剂盒里面的抗血清分别放在仪器抗血清架上，然后选中电泳程序（除了点样次数为1次外，其他参数与尿液样本中本周氏蛋白检测参数一致）开始全自动分析。
仪器按照设定的程序自动进行点样后开始电泳，在电泳结束后仪器将抗血清板放在琼脂糖胶片上，并按设定程序在对应的泳道上加入SCE280M 本周氏抗血清试剂盒里面的相应抗体（此时温度均为20℃）；经过10分钟的孵育后，仪器将厚纸板压在已经加完抗血清的琼脂糖胶片上面（此时温度均为25℃），吸除多余抗血清，8分钟后取下厚纸板；开始干燥5分钟（此时温度均为56℃）；干燥结束后，仪器将胶片架转移到清洗槽内，清洗胶片；待清洗胶片结束转移到染色槽，胶片在浓度为6.5w/v%的氨基黑10B染色液中染色，6分钟后胶片转移到清洗槽位开始进行脱色；待脱色完成后转移到烘干槽，开始烘干胶片；烘干结束后，胶片架归位。检测试验结束，从胶片架上取出胶片，分析结果。
实施例3
本实施例一种血液本周氏蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（1）采集静脉血样本，3000rpm/min条件下离心3min，分离得到血清；
（2）按血清与处理液的体积比为1：1向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖1.5w/v%；海藻糖1 w/v %；氯化钾0.1g/L；
（3）利用免疫固定电泳法对步骤（2）获得的待检测样品进行检测，点样次数为1次；本周氏抗血清试剂盒中抗体的孵育温度为20℃，时间为10min；具体如下：将加样板推回点样卡槽，将琼脂糖胶片在胶片架上卡好，在电极槽上放上电极条，将SCE280M 本周氏抗血清试剂盒里面的抗血清分别放在仪器抗血清架上，然后选中电泳程序（除了点样次数为1次外，其他参数与尿液样本中本周氏蛋白检测参数一致）开始全自动分析。
仪器按照设定的程序自动进行点样后开始电泳，在电泳结束后仪器将抗血清板放在琼脂糖胶片上，并按设定程序在对应的泳道上加入SCE280M 本周氏抗血清试剂盒里面的相应抗体（此时温度均为20℃）；经过10分钟的孵育后，仪器将厚纸板压在已经加完抗血清的琼脂糖胶片上面（此时温度均为25℃），吸除多余抗血清，8分钟后取下厚纸板；开始干燥5分钟（此时温度均为56℃）；干燥结束后，仪器将胶片架转移到清洗槽内，清洗胶片；待清洗胶片结束转移到染色槽，胶片在浓度为5.8w/v%的氨基黑10B染色液中染色，6分钟后胶片转移到清洗槽位开始进行脱色；待脱色完成后转移到烘干槽，开始烘干胶片；烘干结束后，胶片架归位。检测试验结束，从胶片架上取出胶片，分析结果。
对比例1
本对比例一种血液本周氏蛋白的检测方法，除了所述处理液中不含麦芽糖外，其他均与实施例3相同，具体如下：
（1）采集静脉血样本，3000rpm/min条件下离心3min，分离得到血清；
（2）按血清与处理液的体积比为1：1向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：海藻糖1 w/v %；氯化钾0.1g/L；
（3）利用免疫固定电泳法对步骤（2）获得的待检测样品进行检测，点样次数为1次；本周氏抗血清试剂盒中抗体的孵育温度为20℃，时间为10min。
对比例2
本对比例一种血液本周氏蛋白的检测方法，除了所述处理液中不含海藻糖外，其他均与实施例3相同，具体如下：
（1）采集静脉血样本，3000rpm/min条件下离心3min，分离得到血清；
（2）按血清与处理液的体积比为1：1向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖1.5w/v%；氯化钾0.1g/L；
（3）利用免疫固定电泳法对步骤（2）获得的待检测样品进行检测，点样次数为1次；本周氏抗血清试剂盒中抗体的孵育温度为20℃，时间为10min。
对比例3
本对比例一种血液本周氏蛋白的检测方法，除了血清不使用所述处理液进行处理外，其他均与实施例3相同，具体如下：
（1）采集静脉血样本，3000rpm/min条件下离心3min，分离得到血清，即为待检测样品；
（2）利用免疫固定电泳法对步骤（1）获得的待检测样品进行检测，点样次数为1次；本周氏抗血清试剂盒中抗体的孵育温度为20℃，时间为10min。
对比例4
本对比例一种血液本周氏蛋白的检测方法，除了步骤（3）中胶片在酸紫染色液中染色外，其他均与实施例3相同。
利用上述实施例1-3和对比例1-3中的检测方法对20例血液样本进行检测，结果如表1所示：
表1 检测结果
由表1可知，实施例1-3中的方法均能实现血液样本中本周氏蛋白的检测，其中实施例3所述方法检测效果更优，目标条带更清晰（图1）（以1号样本的检测结果为例）。说明使用本发明样本处理方法对血液样本进行处理后可成功实现血液样本中本周氏蛋白的检测，其中实施例3中使用的处理液处理后可取得更好的检测效果。
与实施例3相比，对比例1中的处理液中不含麦芽糖，对比例2中的处理液中不含海藻糖，对比例3不使用本发明处理液对血清样本进行处理。从表1的结果可知，对比例1-3中所述的方法对血液样本中本周氏蛋白的检测结果很不稳定，且检测条带较模糊（图1）（以1号样本的检测结果为例）。说明不使用本发明处理液对血清样本进行处理，或者使用改变组分的处理液对血清样本进行处理，均不能很好地实现血液样本中本周氏蛋白的检测。
利用上述实施例3和对比例4中的检测方法对10例血液样本进行检测，结果表明，利用氨基黑10B染色液进行染色（实施例3）可以使结果的背景更加干净，目的条带更加清晰，让一些经验不足的检测人员也能准确进行结果判断。说明使用氨基黑10B染色液代替常用的酸紫染色液进行染色能取得更好的检测效果，使结果判断更加容易和准确。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种血液本周氏蛋白检测的样本处理方法，为非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集静脉血样本，分离得到血清；
(2)向血清中加入处理液，得到待检测样品；所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖0.7-3w/v％；海藻糖0.5-2.5w/v％；氯化钾0.08-0.12g/L；
所述血清与处理液的体积比为1：(0.5-3)；
将所述步骤(2)中获得的待检测样品加入琼脂糖胶片中，点样次数为1次；
待点样的琼脂糖胶片完成电泳和本周氏蛋白抗血清孵育后，对琼脂糖胶片进行染色；
所述染色为使用氨基黑10B染色液进行染色；
所述氨基黑10B染色液的浓度为5-6.5w/v％。
2.根据权利要求1所述的血液本周氏蛋白检测的样本处理方法，其特征在于，所述处理液包含生理盐水和以下浓度的组分：麦芽糖1.5w/v％；海藻糖1w/v％；氯化钾0.1g/L。
3.根据权利要求1所述的血液本周氏蛋白检测的样本处理方法，其特征在于，所述血清与处理液的体积比为1：(0.5-2)。
4.根据权利要求3所述的血液本周氏蛋白检测的样本处理方法，其特征在于，所述血清与处理液的体积比为1：1。
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