BR102022013225A2 - Proteína recombinante multiepítopo, kit e método para diagnóstico da covid-19 e usos - Google Patents
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Abstract
proteína recombinante multiepítopo, kit e método para diagnóstico da covid-19 e usos. a presente tecnologia trata de uma proteína recombinante multiepítopo formada por epítopos lineares das proteínas spike (s) e da proteína do nucleocapsídeo (n) do vírus sars-cov-2, um kit de diagnóstico contendo a proteína, além de um método para diagnóstico da covid-19. a tecnologia trata também do uso da proteína para a produção de soros específicos contra o sars-cov-2.
Description
[01] A presente tecnologia trata de uma proteína recombinante multiepítopo formada por epítopos lineares das proteínas Spike (S) e da proteína do Nucleocapsídeo (N) do vírus SARS-CoV-2, um kit de diagnóstico contendo a proteína, além de um método para diagnóstico da COVID-19. A tecnologia trata também do uso da proteína para a produção de soros específicos contra o SARS-CoV-2.
[02] As disseminações de novos patógenos associados ao risco de epidemias representam ameaças constantes à saúde humana e de outros vertebrados. Os vírus são importantes agentes etiológicos responsáveis por surtos e epidemias recentes, destacando-se os vírus responsáveis por agravos no sistema respiratório. Os vírus da família Coronaviridae geralmente acarretam problemas respiratórios, gastrointestinais, no sistema hepático e nervoso.
[03] Recentemente, um novo coronavírus foi identificado apresentando características semelhantes ao SARS-CoV. Este também foi caracterizado como um novo membro do gênero betacoronavírus. Tanto da proteína S spike do 2019-nCoV (SARS-CoV 2) e a proteína S de SARS-CoV compartilham o mesmo receptor hospedeiro, angiotensinconverting enzyme 2 (ACE2), esta alta afinidade do SARS-CoV-2 ao receptor humano ACE2 facilita o contágio de pessoa-a-pessoa.
[04] O espectro deste novo vírus, chamado SARS-CoV2, varia de doença leve e autolimitada do trato respiratório superior a pneumonia progressiva grave, além de falência de diversos órgãos e até mesmo evoluindo a morte. O SARS-CoV2 é o responsável pela doença do novo coronavirus (COVID-19). Dados da OMS mostram que mais de 200 milhões de pessoas foram infectadas pelo COVID-19 e mais de 4 milhões morreram em função da doença. O SARS-CoV2 foi identificado na província chinesa de Wuhan em 1 de dezembro de 2019 e o primeiro caso da COVID-19 foi registrado no dia 31 do mesmo mês. O crescimento do número de casos aumentou de forma significativa nos primeiros meses de 2020, levando a OMS a decretar pandemia da doença no dia 11 de março.
[05] Neste contexto, faz-se necessária a busca de estratégias capazes de melhorar o diagnóstico da doença COVID-19, tornando-a mais viável economicamente e tecnicamente, além do investimento em pesquisas clínicas e tratamentos medicamentosos e sorológicos, evitando assim a transmissão e o desenvolvimento de sintomas mais graves aos pacientes e a supressão do sistema de saúde, e consequentemente preparar de forma mais adequada os sistemas de saúde e ações emergenciais.
[06] Os ensaios sorológicos poderiam contribuir para a detecção de anticorpos na fase aguda da infecção, pela detecção de IgA e IgM, além de determinar os pacientes assintomáticos e recuperados pela detecção de IgG persistente. Para o sorodiagnóstico COVID-19, as proteínas S e N são potenciais antígenos de revestimento. Muitos métodos de diagnóstico desenvolvidos para diagnosticar SARS-CoV e MERS-CoV foram baseados em proteínas S e/ou N, conforme comentado a seguir.
[07] O documento de patente BR1020210100800, de 25 de maio de 2021, intitulado “Proteína quimérica recombinante, kit, método para diagnóstico da covid-19 e usos”, trata de uma sequência quimérica originada de epítopos da proteína do nucleocapsídeo do SARS-CoV-2. A quimera é composta por 256 aminoácidos, sendo que os últimos 6 são histidinas contidas na cauda e os restantes provenientes de epítopos entre ligantes flexíveis de glicina e serina (GSGSG).
[08] O documento de patente BR1020210067594, de 08 de abril de 2021, intitulado “Proteína quimérica, kit e método para diagnóstico da covid-19, e usos”, trata de uma quimera recombinante originada de epítopos da proteína do nucleocapsídeo do SARS-CoV-2. A proteína é composta por 254 aminoácidos, sendo que os últimos 6 são histidinas contidas na cauda e os restantes provenientes de epítopos entre ligantes flexíveis de glicina e serina (GSGSG).
[09] O documento de patente BR1020200243802, de 2020, intitulado “Peptídeo sintético p.sc2.s.129 para imunodetecção de anticorpos IgM, IgA e IgG contra COVID-19”, trata de um peptídeo sintético desenhado a partir da proteína S do SARS-CoV-2 para diagnóstico da COVID-19.
[10] O documento de patente CN112964884, de 15 de maio de 2020, intitulado “Diagnostic marker and application thereof in COVID-19 diagnosis and coronavirus past infection detection”, trata de um peptídeo derivado da proteína Spike utilizado como marcador para diagnóstico da doença.
[11] O documento de patente BR1020220007330, cuja data de prioridade é 17 de maio de 2021, intitulado “Composição imunogênica contra SARS-CoV-2, vetores vacinais, proteína quimérica, processo de produção e usos”, trata de uma proteína quimérica originada das proteínas Spike e Nucleocapsídeo e seu uso para preparar uma vacina contra SARS-CoV2. A quimera do referido documento é composta de 623 aminoácidos, sendo 419 aminoácidos referentes à proteína do nucleocapsídeo de SARS-CoV2, 199 aminoácidos referentes ao domínio RBD da proteína Spike de SARS-CoV2, e 5 aminoácidos referentes a um espaçador, de glicinas.
[12] No estado da técnica não foi encontrada tecnologia compreendendo a sequência multiepítopo, de 157 resíduos de aminoácidos, compreendendo 2 epítopos da proteína nucleocapsídeo de SARS-CoV2 (38 resíduos de aminoácidos), e 6 epítopos da proteína Spike de SARS-CoV2 (119 resíduos de aminoácidos), descrita na presente tecnologia para o diagnóstico da COVID-19 e/ou uso como antígeno. O que diferencia a presente tecnologia do estado da técnica é a sequência única apresentada na presente tecnologia para detecção de anticorpos contra o SARS-CoV-2 e estimulação imunogênica.
[13] A figura 1 representa a reatividade dos soros ensaiados frente à proteína rMEPSpi-Nuc (SEQ ID No 1) por ensaio de ELISA, observando um forte reconhecimento por parte de cada uns dos soros testados.
[14] A Figura 2 apresenta dados sobre teste para produção de soros um grupo de 5 camundongos foram imunizados subcutaneamente, receberam 5 doses de rMEPSpi-Nuc (25 μg/animal). Cada ciclo de imunizações foi realizado no intervalo de 14 dias. Freud’s foi utilizado como adjuvante, a uma taxa de 1:1 (adjuvante: rMEPSpi-Nuc).
[15] A Figura 3 mostra a reatividade do antígeno a 17 amostras sorológicas entre positivas e negativas para SARS-CoV-2 de animais imunizados, humanos vacinados, humanos positivos para COVID-19. (1) Amostra+NC01LT, (2) soro humano positivo 57, (3) amostra positiva 190630, (4) amostra positiva 74, (5) amostra humana vacinado 2da, (6) amostra humana vacinado 2da, (7) amostra humana vacinado 1 er, (8) soro humano positivo, (9) soro de coelho anti-spike , (10) soro de cavalo anti-spike, (11) soro de camundongo anti-spike, (12) soro de camundongo anti-Pep-spike, (13) camundongo pré-imune, (14) coelho pré-imune,(15) cavalo pré-imune, (16) soro humano negativo, (17) amostra negativa 82.
[16] A presente tecnologia trata de uma proteína recombinante multiepitopo formada por epítopos lineares das proteínas Spike (S) e da proteína do Nucleocapsídeo (N) do vírus SARS-CoV-2, um kit de diagnóstico contendo a proteína, além de um método para diagnóstico da COVID-19. A tecnologia trata também do uso da proteína para a produção de soros específicos contra o SARS-CoV-2.
[17] Mais especificamente, a proteína recombinante multiepítopo é definida pela SEQ ID No 1 e pode ser preferencialmente codificada pela sequência de DNA definida pela SEQ ID No2.
[18] O Kit para diagnóstico da COVID-19 compreende: a. A proteína recombinante multiepítopo definida pela SEQ ID N° 1; b. Um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador; c. Um reagente para detectar a enzima ou o marcador.
[19] No item “a”, a proteína pode estar ligada a um suporte sólido, selecionado do grupo de material compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno; ou a um carreador, preferencialmente partículas de ouro.
[20] No item “b”, o anticorpo pode ser IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses; a proteína é preferencialmente proteína A e/ou proteína G; o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes; e a enzima pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.
[21] O método proposto na presente tecnologia compreende as seguintes etapas: a. Exposição de uma amostra a proteína recombinante multiepítopo definida pela SEQs ID N°1, estando tal antígeno ligado a um suporte sólido ou a um carreador; b. Adição de um anticorpo ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a); c. Detecção dos anticorpos específicos para a COVID-19 na amostra citada na etapa (a) utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citado na etapa (b).
[22] Na etapa “a”, a amostra pode ser selecionada do grupo compreendendo sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal, sem a necessidade de grandes quantidades desta.
[23] Na etapa “b”, anticorpo secundário pode ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses; a proteína pode ser Proteína A e/ou Proteína G; a enzima pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, betagalactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase; e o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
[24] Na etapa “c”, a detecção pode ser realizada por fluorescência, imunofluorescência, imunoluminescência, absorbância ou pelo uso de radioisótopos.
[25] A proteína recombinante definida pela SEQ ID No 1 pode ser utilizada para produção de soros para profilaxia da COVID-19.
[26] A proteína e o kit também podem ser utilizados para o diagnóstico da COVID-19.
[27] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida pelos exemplos que se seguem, não limitantes.
[28] Utilizando a técnica de SPOT-Synthese como descrito Laune et al., 2002, foi sintetizada uma membrana de spot contendo as sequência da proteína Spike e a proteína Nucleocapsídeo do SARS-CoV-2, utilizando um robô ResPep (Intavis), o rearranjo dos spot na membrana.
[29] Uma membrana com um conjunto de 560 pentadecapeptídeos deslocado a direita por 3 resíduos cobrindo a sequência primária da Spike (UNIPROT P0DTC2) e da Nucleocapsídeo (UNIPROT P0DTC9), foram sintetizadas em uma membrana de celulose, usando a técnica de SPOT-synthese como descrito anteriormente (Laune et al., 2002).
[30] Para os ensaios de mapeamento de epítopos em membrana de spot foram realizadas segue as seguintes etapas: (1) Bloqueio Overnight; (2) Lavagem de 10 min com solução de lavagem, 3 vezes; (3) Incubação com soro diluído em solução de bloqueio por 1 hora a temperatura ambiente; (4) Lavagem de 10 min com solução de lavagem, 3 vezes; (5) Incubação com o conjugado diluído em solução de bloqueio por 1 hora a temperatura ambiente; (6) Lavagem de 10 min com solução de lavagem, 3 vezes; (7) Incubação da membrana na solução de substrato (MTT; BICP; MgCl2); (8) Registro do resultado por fotografia o scanner; (9) Regeneração da membrana.
[31] Nos ensaios de imunodetecção, a membrana foi bloqueada durante a noite [PBS-albumina de soro bovino (3%), sacarose (5%)], se utilizou TBS-T 0,05% como solução de lavagem. Em seguida, a membrana foi sondada de jeito individual com diferentes soros; soro de cavalo anti - SARS-CoV-2, soro de coelho anti - Spike, soro de coelho anti - Nucleocapsídeo na diluição de 1:1000.
[32] A ligação do anticorpo foi detectada utilizando um conjugado específico para cada tipo de soro utilizado, IgG de coelho anti-cavalo conjugado com fosfatase alcalina (Sigma, 1:10000) durante 90 min, a 37°C, IgG de cabra anti-coelho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma, 1:10000) durante 90 min, a 37°C.
[33] Após a lavagem das membranas, 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (Sigma) e 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio bromide (Sigma) foram adicionados como substrato e um precipitado azul foi formado em peptídeos reativos. Após fotografar as membranas sondadas, estas foram regeneradas usando dimetilformamida, em seguida 1% SDS, 0,1% β-mercaptoetanol em 8 M ureia, seguido por etanol/água/ácido acético (50:40:10 vol/vol/vol) e etanol. Como controle negativo, foram testados de jeito individual soro de cavalo pré-imune e soro de coelho pré-imune ambos na diluição de 1:1000.
[34] Com base nos resultados da análise do ensaio dos peptídeos ligados à celulose da membrana de spot correspondente a sequência da proteína Spike (UNIPROT P0DTC2) e da Nucleocapsídeo (UNIPROT P0DTC9), as seguintes sequências foram identificadas com epítopos putativos, e foram escolhidas para serem sintetizadas na forma solúvel (Tabela 1). Tabela 1 - Peptídeos selecionados como epítopos putativos.
[35] Com base nos resultados do imunoensaio peptídico, 8 epítopos contínuos dos quais 6 correspondem à proteína Spike e 2 à proteína Nucleocapsídeo foram utilizados para a produção de uma proteína multiepitópica recombinante Spike - Nucleocapsídeo (rMEPSpi-Nuc), Um fragmento de DNA (SEQ ID No 2) foi sintetizado com a sequência nucleotídica correspondente aos oito epítopos, usando dois codões de glicina como espaçadores entre cada sequência de epítopo (IDT - Integrated DNA Technologies), constituindo uma proteína multiepitópica recombinante Spike - Nucleocapsídeo (rMEPSpi-Nuc). Locais para enzimas de restrição, NdeI e XhoI foram adicionados às 5 e às 3 do DNA sintético, respectivamente. O DNA foi clonado no vetor de expressão pET 28a (+) - TEV da GenScript ™ (http://www.genscript.com/). O vetor pET 28a-TEV permitiu que um marcador de histidina de 6 resíduos fosse ligado na proteína.
[36] O vetor pET 28a (+) - TEV contendo o fragmento de ADN de rMEPSpi-Nuc foi quimicamente transformado em bactérias BL21 de E. coli para expressão. Após o plaqueamento em meio 2x YT (1,6% de Bactotriptona, 1% de extrato de levedura, 0,5% de NaCl), uma colônia positiva foi detectada e cultivada em 10 mL de meio 2x YT contendo canamicina (50 mg/mL) durante a noite a 37°C, que foi então utilizado para inocular 1 L de meio fresco 2x YT. Quando a cultura atingiu uma densidade de A600 = 0,6 o vetor recombinante foi induzido pela adição de 0,6 mM de IPTG (isopropil-d-tiogalactopiranósido). As células foram crescidas durante mais 4 h a 37°C, colhidas por centrifugação e suspensas em tampão de lise (solução salina tamponada com fosfato 50 mM com 30 mM de imidazol) contendo 50 mg/mL de lisozima; e incubou- se durante 15 min a 37°C. As células foram submetidas a choque térmico (gelo seco/banho de água a 37°C por 3 vezes), em seguida foram sonicadas em pulsos curtos (3 pulsos de 15 seg com 15 seg, pausa entre eles, amplitude 40%) e submetidas a centrifugação a 8000 x g.
[37] A presença de expressão de rMEPSpi-Nuc na fração solúvel ou insolúvel foi avaliada por SDS-PAGE e Western Blot (SDS-PAGE 12% em condições redutoras). A proteína foi transferida para uma membrana de nitrocelulose e incubada com soro de coelho anti - Spike (1:1000) por 1 h em temperatura ambiente. O anticorpo de cabra anti - coelho acoplado à peroxidase da Millipore (1:10000) detectou as proteínas reagentes. Os blots foram desenvolvidos usando DAB/cloronaftol, de acordo com as instruções do fabricante.
[38] A rMEPSpi-Nuc expressa foi purificada utilizando uma coluna HIS- Trap de 5 mL (GE Healthcare Life Science) ligada a um sistema de cromatografia ÃKTA Prime (GE Healthcare Life Science). O sistema foi equilibrado com Imidazol 0,03 M [fosfato de sódio 20 mM; NaCl 0,5 M; 0,03 M imidazol] e a proteína foi eluída com 0,5 M de imidazol [fosfato de sódio 20 mM; NaCl 0,5 M; 0,5 M imidazol] e armazenados neste tampão.
[39] O reconhecimento da rMEPSpi-Nuc por diferentes soros de animais imunizados com proteína Spike ou com soro SARS-CoV-2 atenuado, foi avaliado por ensaio de ELISA utilizando 0,3 μg/well de rMEPSpi-Nuc, os soros utilizados são descritos na Tabela 2 e Figura 1. Tabela 2 - Soros avaliados frente à proteína rMEPSpi-Nuc.
[40] Um grupo de 5 camundongos foram imunizados subcutaneamente, receberam 5 doses de rMEPSpi-Nuc (25 μg/animal); cada ciclo de imunizações foi realizado no intervalo de 14 dias. Freud’s foi utilizado como adjuvante, a uma taxa de 1:1 (adjuvante: rMEPSpi-Nuc).
[41] Os anticorpos produzidos em camundongos (anticorpos IgG anti - rMEPSpi-Nuc), foram avaliados por ELISA. As placas foram revestidas com proteína recombinante Spike (1 μg/mL), proteína recombinante Nucleocapsídeo (1 μg/mL) e rMEPSpi-Nuc (5 μg/mL). O soro Anti - rMEPSpi-Nuc em diferentes concentrações foi incubado com os antígenos. Utilizou-se anticorpo IgG de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase (1:10000) (Sigma) e substrato de peroxidase OPD (SIGMAFAST da Sigma-Aldrich) para detectar a reação (Figura 2).
[42] A Figura 3 mostra a reatividade da proteína recombinante com soros de diferentes amostras (descritas na Tabela 3), confirmando a reatividade da proteína recombinante. Os soros negativos e pre-imunes apresentaram uma baixa reatividade como esperado, os soros de cavalo anti-Spike apresentou a maior reatividade dentre os soros positivos, o soro humano 2da dose de vacinação também apresentaram uma reatividade alta, o que mostra uma clara diferenciação entre amostra positiva e soros negativos. Tabela 3 - Soros avaliados na reatividade da proteína recombinante.
Claims (10)
1. PROTEÍNA RECOMBINANTE MULTIEPITOPO, caracterizada por ser definida pela SEQ ID No 1.
2. PROTEÍNA RECOMBINANTE MULTIEPITOPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser codificada pela sequência de DNA definida pela SEQ ID No 2.
3. KIT PARA DIAGNÓSTICO DA COVID-19 compreendendo a proteína definida na reivindicação 1, caracterizado por compreender: a. A proteína recombinante multiepitopo definida pela SEQ ID N° 1; b. Um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador; c. Um reagente para detectar a enzima ou o marcador.
4. KIT PARA DIAGNÓSTICO DA COVID-19, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela proteína estar ligada a um suporte sólido, selecionado do grupo de material compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno, ou a um carreador, como partículas de ouro.
5. KIT PARA DIAGNÓSTICO DA COVID-19, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo anticorpo secundário ser IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses, a proteína ser proteína A e/ou proteína G, o marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes, e a enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.
6. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DA COVID-19 utilizando a proteína definida na reivindicação 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a. Exposição de uma amostra, selecionada do grupo compreendendo sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal, a proteína recombinante multiepitopo definida pela SEQ ID N°1, estando tal antígeno ligado a um suporte sólido ou a um carreador; b. Adição de um anticorpo ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a); c. Detecção dos anticorpos específicos para a COVID-19 na amostra citada na etapa (a) utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citado na etapa (b).
7. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DA COVID-19, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por, na etapa “b”, o anticorpo secundário ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses, a proteína ser proteína A e/ou proteína G, a enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase, e o marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
8. USO da proteína definida na reivindicação 1, caracterizado por ser na produção composições imunogênicas ou soros para profilaxia ou tratamento da COVID-19.
9. USO da proteína definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para o diagnóstico da COVID-19.
10. USO do kit definido na reivindicação 3, caracterizado por ser para o diagnóstico da COVID-19.
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