BR102022000733A2 - Processo de produção de proteína quimérica, proteína quimérica, gene, composição imunogênica, e usos - Google Patents
Processo de produção de proteína quimérica, proteína quimérica, gene, composição imunogênica, e usos Download PDFInfo
- Publication number
- BR102022000733A2 BR102022000733A2 BR102022000733-0A BR102022000733A BR102022000733A2 BR 102022000733 A2 BR102022000733 A2 BR 102022000733A2 BR 102022000733 A BR102022000733 A BR 102022000733A BR 102022000733 A2 BR102022000733 A2 BR 102022000733A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- protein
- spin
- seq
- urea
- rbd
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000014616 translation Effects 0.000 title claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 109
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 34
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 34
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 20
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 20
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940037003 alum Drugs 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims description 8
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 7
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 6
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 5
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 4
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 44
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 34
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 28
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 26
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 25
- YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N squalene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N 0.000 description 25
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 9
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 6
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 5
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 241000579188 Callithrix penicillata Species 0.000 description 3
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 3
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 2
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 2
- 101001024637 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 2
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 208000018299 prostration Diseases 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000004175 Coronavirinae Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 241001459693 Dipterocarpus zeylanicus Species 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 102100034523 Histone H4 Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 description 1
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 108091005609 SARS-CoV-2 Spike Subunit S1 Proteins 0.000 description 1
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
A presente tecnologia revela o processo de produção de uma proteína quimérica de SEQ ID N° 1, utilizando a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No 2. Revela também a proteína quimérica definida pela SEQ ID N° 1, o gene de SEQ ID No 2 utilizado para sua produção, composições imunogênicas contendo tal proteína e seu uso para preparar vacinas para a profilaxia e prevenção da infecção e formas moderadas e grave de COVID-19. A presente tecnologia está inclusa no campo da saúde humana, especificamente no campo das medidas de prevenção contra infecção com SARS-CoV2. Trata da produção de uma composição vacinal compreendendo uma proteína quimérica que previne altas cargas virais e formas clínicas moderadas e graves da doença através do estímulo ao sistema imunológico.
Description
[01] A presente invenção está inclusa no campo da saúde humana, especificamente no campo das medidas de prevenção contra infecção por SARS-CoV-2. Trata de um processo de produção de proteína quimérica, da proteína quimérica, do gene utilizado para sua produção e de uma composição vacinal compreendendo uma proteína quimérica que previne altas cargas virais e formas clínicas moderadas e graves da doença através do estímulo ao sistema imunológico. Trata também dos usos da proteína quimérica e da composição imunogênica para a produção de vacinas para a profilaxia e prevenção da infecção e formas moderadas e grave de COVID-19.
[02] Coronavírus são espécies de vírus pertencentes à subfamília Coronavirinae na família Coronavidae. São vírus de RNA que infectam humanos e animais e causam doença respiratória, gastrointestinal ou neurológica. Esses vírus podem emergir de reservatórios animais e causar epidemias significativas em humanos, como a Síndrome Respiratória Aguda Severa (SARS-CoV), ocorrida entre 2002 e 2003, e a Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV), que surgiu em 2012 na Arábia Saudita.
[03] A pandemia da doença causada pelo novo coronavírus 2019, COVID-19, tem impactado de sobremaneira o cenário mundial, agravando as taxas de morbidade e mortalidade e causando uma das maiores crises econômicas dos últimos cem anos. Diante desse cenário, emergem esforços globais para o desenvolvimento de vacinas eficientes em prevenir a infecção pelo patógeno.
[04] Vacinas podem ser baseadas em vírus vivo, vírus inativado ou componentes virais, como antígenos de superfície purificados.
[05] A grande maioria das vacinas desenvolvidas contra o vírus SARS-CoV-2 (causador da COVID-19) e todas as vacinas contra SARS-CoV-2 que já estão no mercado utilizam a proteína Spike ou o RNA mensageiro codificador dessa proteína ou ainda vírus inativados, almejando a indução dos anticorpos neutralizantes. Notadamente, os níveis de anticorpos contra a proteína Spike nas vacinas distribuídas no Brasil, após primeira dose, são baixos. Além disso, as variantes mais agressivas, com alta transmissibilidade e possivelmente mais patogênicas, possuem mutações na proteína Spike, que é o antígeno alvo dos anticorpos neutralizantes, o que torna as vacinas atualmente disponíveis mais vulneráveis a essas variações.
[06] Existem hoje evidências significativas que indicam um papel importante dos linfócitos T na proteção contra a infecção pelo SARS-CoV-2. Para identificar os alvos reconhecidos por estes linfócitos T, a presente tecnologia apresenta uma análise virtual que permitiu identificar os principais peptídeos que interagem com diferentes HLAs (moléculas apresentadoras de antígenos), identificando uma alta concentração destes peptídeos na proteína nucleocapsídeo (N) e na região RBD (do inglês “Receptor Binding Domain”) da proteína Spike (S).
[07] Para obtenção de uma combinação de antígenos eficiente e mais eficaz contra as variantes do vírus, a presente tecnologia utiliza uma proteína alternativa, chamada nucleocapsídeo (N), que é a proteína mais abundante do SARS-CoV-2 e altamente imunogênica, como parte da proteína quimérica desenvolvida na presente tecnologia. Esta proteína quimérica induz altos níveis de anticorpos e produção de IFNg pelos linfócitos T, quando inoculada em animais, e é também reconhecida por anticorpos e células T de indivíduos convalescentes. A proteína quimérica é composta pela proteína N ligada ao segmento RBD da proteína Spike e, por conter epítopos derivados das duas proteínas virais, a sua administração resulta na produção de anticorpos contra o segmento RBD da proteína S e contra a proteína N.
[08] A proteína quimérica da presente tecnologia é a associação da porção RBD da proteína Spike com a proteína do nucleocapsídeo (N), sendo, portanto, denominada SpiN. A região RBD se liga diretamente à Enzima Conversora de Angiotensina (ECA-2) expressa na superfície da célula hospedeira, sendo assim composição principal da maioria das vacinas que já estão sendo aplicadas na população mundial, na forma de RNA, vetores virais não replicantes ou proteína.
[09] Em um trabalho recente, Matchett et al (2021) descrevem uma vacina baseada na proteína N de SARS-CoV-2 expressa em vetor de Adenovirus Humano (Ad5), a qual confere imunidade protetora contra a infecção em modelo animal de COVID-19. (William E. Matchett et al. Nucleocapsid vaccine elicits spike-independent SARS-CoV-2 protective immunity. bioRxiv 2021. 04. 26. 441518; doi: https: //doi. org/10.1101/2021.04.26.44 1518).
[010] Em outro estudo, Class et al (2021) demonstraram que a vacinação baseada na proteína Spike protege o pulmão na doença, porém somente protege animais de danos agudos no pulmão e cérebro em conjunto com vacina baseada na proteína do Nucleocapsídeo (Jacob Class, Tanushree Dangi, Justin M. Richner, Pablo Penaloza-MacMaster. A SARS CoV-2 nucleocapsid vaccine protects against distal viral dissemination. bioRxiv 2021. 04. 26. 440920; doi: https: //doi. org/10.1101/2021.04.26.440920).
[011] O documento de patente CN111607003, intitulado “SARS-CoV-2 N/S1 (RBD) recombinant protein and preparation method and application thereof”, cuja data de prioridade é 21 de maio de 2020, trata de uma proteína recombinante que compreende o fragmento gênico para expressão da proteína nucleocapsídeo (N) do vírus SARS-CoV-2 e o fragmento gênico para expressão do domínio RBD da proteína de superfície Spike (S1) do vírus SARS-CoV-2, além de vetor de expressão e o processo de obtenção da proteína para uso potencial como vacina para COVID-19. A proteína obtida no documento CN111607003 possui uma cauda de histidina na porção N-terminal, normalmente introduzida para facilitar a purificação de proteínas recombinantes por meio de técnica que requer a utilização de agentes quelantes. Agentes quelantes utilizados em cromatografia de afinidade para purificação de proteínas contendo caudas de aminoácidos como a histidina podem apresentar desvantagens importantes. O níquel utilizado como quelante para ligação com a histidina para purificação da proteína em CN111607003 é descrito na literatura como carcinogênico (Bal W, Kozlowski H, Kasprzak KS. Molecular models in nickel carcinogenesis. J Inorg Biochem 2000; 79: 213-8), sendo que pode ocorrer contaminação com esse metal em processos de purificação de proteínas produzidas por E. coli (Oswald T, Hornbostel G, Rinas U, Anspach FB. Purification of ZHis. 6EcoRV recombinant restriction endonuclease EcoRV fused to a ZHis. 6 affinity domain by metal-chelate affinity chromatography. Biotechnol Appl Biochem 1997; 25ZPt 2.: 109-15). Além do mais, é demonstrado que a histidina pode agir como sítio de ligação ao níquel em proteínas histonas, causando dano ao DNA (Zoroddu MA, Kowalik-Jankowska T, Kozlowski H, Molinari H, Salnikow K, Broday L, et al. Interaction of NiZII. and CuZII. with a metal binding sequence of histone H4: AKRHRK, a model of the H4 tail. Bba Gen Subj 2000; 1475: 163-8). Vale destacar que a sequência de nucleotídeos revelada em CN111607003 difere da sequência da SpiN. Com base nesses dados, foi produzida uma sequência para a proteína SpiN que não contem as sequencias adicionais de histidinas e, por esse motivo, o processo de purificação precisou ser desenvolvido por meio de metodologias que envolvem características intrínsecas da proteína quimérica como carga, massa molecular e solubilidade.
[012] Existem diversas cepas de E. coli para expressão de proteínas heterólogas. A cepa E. coli BL21 (DE3) ΔSlyD pRARE (daqui em diante denominada E. coli pRARE), codifica a maioria dos tRNAs pouco expressos em E. coli. Já a cepa E. coli SHuffle possui capacidade aprimorada de proporcionar um melhor enovelamento a proteínas que contém múltiplas pontes dissulfeto em sua estrutura, como é o caso da porção RBD da proteína SpiN.
[013] O sistema de expressão da presente invenção utiliza as cepas de E. coli pRARE ou SHuffle e o vetor pET-24a contendo uma sequência nucleotídica otimizada para obtenção da proteína quimérica da presente tecnologia. Tal sistema procarioto possui muitas vantagens em relação a sistemas eucariotos, como sua simplicidade e baixo custo, alto nível de expressão e rendimento em curto espaço de tempo. O processo de expressão da presente invenção foi otimizado para obtenção da proteína com maior rendimento e grau de pureza a partir do lisado de E. coli pRARE e SHuffle. A proteína não possui aminoácidos adicionais aos da própria sequência quimérica, sendo assim purificada através de duas etapas de cromatografia. A estratégia de unir as sequências em uma única molécula otimiza, simplifica, reduz tempo e custo do processo, quando comparado à produção individual de cada sequência separadamente.
[014] Figura 1: Análise por SDS-PAGE do resultado da purificação de SpiN por cromatografia aniônica (Canaletas A a E) seguida por cromatografia catiônica (canaletas 1 a 60), a partir da fração solúvel do extrato proteico de E. coli (cepa pRARE) (metodologia 1). Da esquerda para direita: (A) amostra pré-coluna aniônica contendo a SpiN; (B, C, D) amostra não ligada à coluna aniônica de três passagens (não-ligado 1 a 3, respectivamente, pré-coluna catiônica), (E) amostra não ligada à coluna catiônica, mostrando a grande perda da proteína SpiN (68 kDa), e (1 a 60) frações eluídas da coluna catiônica contendo a proteína SpiN. PM corresponde ao padrão de peso molecular.
[015] Figura 2: SDS-PAGE comparativo dos testes de expressão da proteína SpiN nas cepas de (A) E. coli pRARE e (B) SHuffle. As canaletas 1 compreendem o padrão de peso molecular; as canaletas 2 compreendem amostra das cepas não induzidas; as canaletas 3 compreendem amostra das cepas induzidas por 3 h a 37oC; as canaletas 4 compreendem amostra das cepas induzidas por 18 h a 20oC.
[016] Figura 3: SDS-PAGE comparativo dos testes de solubilidade da proteína SpiN realizado após expressão nas cepas de E. coli pRARE (A) e SHuffle (B). As canaletas 1 compreendem o padrão de peso molecular; a canaleta 2 compreende amostra da cepa induzida por 3 h a 37oC fração insolúvel, a canaleta 3 compreende amostra da cepa induzida por 3 h a 37oC fração solúvel; as canaletas 4 compreendem amostra das cepas induzidas por 18 h a 20oC fração insolúvel, as canaletas 5 compreendem amostra das cepas induzidas por 18 h a 20oC fração solúvel.
[017] Figura 4: (A) SDS-PAGE comparativo do teste de indução da expressão da proteína SpiN a 37°C por 15h, realizado nas cepas de E. coli pRARE e SHuffle; (B) SDS-PAGE do teste de solubilidade da SpiN expressa na cepa SHuffle. As canaletas 1 compreendem o padrão de peso molecular; a canaleta 2 compreende amostra da cepa E. coli pRARE não induzida; a canaleta 3 compreende amostra da cepa E. coli pRARE induzida por 15 h a 37oC; a canaleta 4 compreende amostra da cepa SHuffle não induzida; a canaleta 5 compreende amostra da cepa SHuffle induzida por 15 h a 37oC; a canaleta 6 compreende amostra da cepa SHuffle induzida por 15 h a 37oC fração insolúvel; a canaleta 7 compreende amostra da cepa SHuffle induzida por 15 h a 37oC fração solúvel.
[018] Figura 5: Avaliação da precipitação da SpiN após redução da concentração de ureia nas cepas E. coli pRARE e Shuffle.
[019] Figura 6: Análise por SDS-PAGE da purificação de SpiN da fração insolúvel por cromatografia aniônica seguida por cromatografia catiônica, conforme a metodologia 2. As canaletas 1 correspondem ao padrão de peso molecular; (A) amostra da proteína SpiN obtida após solubilização (pré-coluna aniônica); (B) amostra eluída da coluna aniônica (eluição aniônica); (C) não-ligado da coluna aniônica contendo a proteína SpiN (pré-coluna catiônica); (D) não-ligado da coluna catiônica; (3 a 51) frações eluídas da coluna catiônica.
[020] Figura 7: Análise por SDS-PAGE do resultado final da purificação da proteína SpiN seguindo a metodologia 2. O gel (A) compreende, na canaleta 1 o padrão de peso molecular e, na canaleta 2, a proteína SpiN após as duas etapas de purificação (“a” indica os agregados da SpiN, “b” indica a proteína SpiN e “c” indica produtos de clivagem da SpiN). As bandas observadas no gel (“a”, “b”, “c”) foram sequenciadas por espectrometria de massas confirmando a identidade da SpiN (“b”), a presença de agregados da mesma (“a”) e produtos de clivagem (“c”). O gel (B) compreende o padrão de peso molecular (1), a proteína N purificada (N), a porção RBD da proteína spike (RBD), e a proteína SpiN composta por N e RBD (SpiN).
[021] Figura 8: SDS-PAGE mostrando a proteína SpiN purificada (A e D) e seu reconhecimento em Western blot feito com anticorpo anti-N (B e E) e anti-RBD (C e F). A proteína N purificada (N), a porção RBD da proteína spike (RBD), e a proteína Spike (S) foram adicionadas como controle. Nos painéis superiores (A, B, C) a SpiN foi purificada seguindo a metodologia 1. Nos painéis inferiores (D, E, F) foi utilizada a metodologia 2.
[022] Figura 9: Níveis de anticorpos anti-RBD (A), anti-Spike (S) (B), e anti-nucleocapsídeo (N) (C) no soro de indivíduos controles não vacinados e não infectados (HC, círculos pretos), vacinados com CoronaVac (círculos verdes), e convalescentes da infecção com SARS-CoV-2 (círculo vermelho). Asteriscos indicam que a diferença é estatisticamente significativa (**,p<0,01; ***,p<0,001; DO=densidade óptica).
[023] Figura 10: Níveis de IFN-g produzidos por células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) estimuladas pelas proteínas RBD (A), Spike (S) (B), e nucleocapsídeo (N) (C). Os PBMCs foram purificados no sangue de indivíduos controles não vacinados e não infectados (linhas pretas), vacinados com CoronaVac (linhas verdes), e convalescentes da infecção com SARS-CoV-2 (linhas vermelhas). Asteriscos indicam que a diferença é estatisticamente significativa (**,p<0.01; ***,p<0.001). CN = controle negativo (PBMCs cultivadas na ausência de qualquer estímulo com antígenos do SARS-CoV2).
[024] Figura 11: Camundongos C57BL/6 imunizados com N, RBD ou N + RBD + Poly (I: C) foram eutanasiados 21 dias após a última dose vacinal e a presença de anticorpos IgG totais anti-RBD e anti-N foi avaliada no BALF (A e B, respectivamente) e no soro (C e D, respectivamente) através do ensaio de ELISA. A resposta celular foi avaliada através da detecção de IFN-g no sobrenadante de cultura de esplenócitos estimulados com RBD ou N. Concanavalina A (ConA) foi utilizada como controle positivo (E).
[025] Figura 12: Resposta humoral de camundongos imunizados com a quimera SpiN + Poly (I: C). Os anticorpos murinos IgG totais (A, D e G), IgG1 (B, E e H) e IgG2c (C, F e I) anti-N (A, B, C), anti-RBD (D, E, F), e anti-SARS-CoV-2 (G, H e I) foram dosados no soro através do ensaio de ELISA. A diluição do soro está especificada no eixo x.
[026] Figura 13: Esplenócitos de camundongos imunizados com SpiN + Poly (I: C) foram estimulados com RBD ou N por 48h. As citocinas IFN-g (A) e IL-10 (B) foram dosadas no sobrenadante de cultura através do ensaio de ELISA. ConA foi utilizado como controle positivo.
[027] Figura 14: Camundongos hECA2 Tg imunizados com Quimera SpiN + Poly (I: C) foram desafiados com 5 x 104 PFU de SARS-CoV-2. O peso (A) e a mortalidade (B) foram acompanhados por 11 dias. A carga viral no cérebro e no pulmão foi avaliada por RT-PCR (C). DPI=dias após a infecção.
[028] Figura 15: Camundongos hECA2 Tg não imunizados que receberam só o adjuvante imunológico (Poly (I: C)) (A, B) ou imunizados com Quimera SpiN + Poly (I: C) (C, D) foram desafiados com 5 x 104 PFU de SARS-CoV-2 e o processo inflamatório no pulmão avaliado por histopatologia. Os quadrantes inferiores e superiores ilustram, respectivamente, o tecido pulmonar de um animal vacinado ou de um animal não vacinado que recebeu apenas Poly (I: C). As colorações com hematoxilina e eosina (quadrantes da esquerda) e Tricrômico de Masson (quadrantes da direita) ilustram a intensidade do processo inflamatório e formação de trombos no pulmão dos animais desafiados com SARS-CoV-2, respectivamente.
[029] Figura 16: Níveis de Anticorpos IgG (a), IgG1 e IgG2c anti-RBD (b) e anti-N (c) em camundongos imunizados com SpiN associada ao adjuvante esqualeno (emulsão comercial MF59). A diluição do soro está especificada no eixo x. Os níveis de IFN-γ (d) ou IL-10 (e) produzidos por esplenócitos de camundongos vacinados cultivados na ausência (RPMI) ou na presença de RBD, N ou Concanavalina A (ConA, controle positivo).
[030] Figura 17: Níveis de anticorpos IgG total (a), IgG1 e IgG2c anti-RBD (b) e anti-N (c) em hamsters imunizados com SpiN associada a MF59. A diluição do soro está especificada no eixo x.
[031] Figura 18: O efeito protetor da imunização de camundongos hACE2 com SpiN associada ao adjuvante MF59 como indicado pela perda de peso (a), mortalidade (b) e carga viral no pulmão (c) e cérebro (d) 5 e 11 dias depois da infecção (DPI).
[032] Figura 19: Seções histopatológicas de pulmões de camundongos hACE-2 não vacinados (A, B, C) e camundongos vacinados com SpiN + MF59 (D, E, F) no 5° dia após a infecção (DPI) com SARS-CoV-2. As sessões de tecidos foram coradas com hematoxilina e eosina e analisadas para congestão, infiltrados inflamatórios, focos de hemorragia, exsudato intra-alveolar e colapso alveolar. Aumentos de 2, 5 x (A e D); 4 x (B e E) e 20 x (C e F).
[033] Figura 20: Ensaio de soro-neutralização com SARS-CoV-2 (cepa Wuhan). Soros foram coletados de animais infectados com SARS-CoV-2, grupos controle não vacinados e vacinados com SpiN + Poly (I: C) ou SpiN +MF59, como indicado. A diluição sérica indica o título de anticorpos neutralizantes em cada amostra.
[034] Figura 21: Variação de temperatura (a) e peso (b) dos animais ao longo do tempo, após administração da SpiN + MF59. Seta em vermelho indica 1a dose, em azul representa 2a dose e verde o fim do experimento.
[035] Figura 22: IgG total Anti-N (a) e Anti-RBD (b) avaliados 30 dias após administração da SpiN associada a MF59. A diluição do soro está especificada no eixo x.
[036] Figura 23: Titulação da proteína SpiN para ensaio de potência. Três lotes da proteína SpiN, produzida em pRARE (Lote 1 e Lote 2) e SHuffle foram utilizados como antígeno em ensaio de ELISA do tipo indireto, sendo testada com anticorpos policlonais específicos: (A) anti N, e (B) anti-S/RBD, produzidos em coelhos. A diluição do soro está especificada no eixo x.
[037] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular são bem conhecidas de um técnico no assunto, podendo ser encontradas, por exemplo, em Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. N. Y. (1987-2008), incluindo todos os suplementos; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.
[038] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se ao processo de produção de uma proteína quimérica, definida pela SEQ ID N° 1. Para tanto, o processo envolve a utilização de uma sequência de nucleotídeos definida pela SEQ ID No 2.
[039] O processo de produção da proteína quimérica compreende as seguintes etapas:
- a. Clonar o DNA, definido pela SEQ ID N°2, codificador da proteína definida pela SEQ ID N°1, em vetor de expressão;
- b. Transformar bactérias E. coli (sendo preferencialmente da cepa E. coli SHuffle) com a construção obtida em “a” e cultivar em meio apropriado, como o meio LB com 25 a 100 μg/mL de canamicina, a 36, 5 a 37, 5 °C sob agitação a 180 a 200 rpm, por 3 a 4 horas;
- c. Induzir a expressão da proteína definida pela SEQ ID N°1 pela adição de IPTG ao meio, preferencialmente para uma concentração final de 0, 1 a 1 mM, quando a densidade óptica a 600 nm atingir o valor de 0, 3 a 0, 6 e manter o cultivo sob agitação por um período de 15 h a 24 h, a 36, 5 a 37, 5 °C;
- d. Realizar a lise do precipitado celular do cultivo obtido em “c”, preferencialmente utilizando tampão de lise, que compreende um agente tamponante de pH entre 7 e 8, um coquetel de inibidores de protease e agentes redutores, através de passagens da amostra em equipamento homogeneizador por pressão mantendo 15. 00020. 000 psi por 5 a 20 min;
- e. Submeter o lisado obtido em “d” à centrifugação a 35. 000 g a 45. 000 g por 20 a 40 min;
- f. Realizar 2 etapas de lavagens da fração insolúvel obtida em "e" utilizando preferencialmente o tampão Tris 80 a 100 mM, ureia 0, 5 a 1 M, EDTA 5 a a10 mM, glicerol 5 a 10 %, triton x-100 1 a 2 %, pH 7 a 8, através de ressuspensão e centrifugação a 35. 000 g a 45. 000 g por 20 a 40 min;
- g. Realizar etapa de ressuspensão do precipitado contendo a fração insolúvel lavada e obtida em "f" preferencialmente em tampão fosfato 25 a 100 mM, 5 a 10 % glicerol, 6 a 8 M uréia, 0, 05 a 0, 1 % triton x-100, DTT 1 a 10 mM, benzamidina 1 a 10 mM, PMSF 1 a 5 mM e coquetel de inibidores de proteases através de agitação a 4 a 6 °C por aproximadamente 18 a 24 h;
- h. Submeter a ressuspensão obtida em "g" à centrifugação a 35. 000 g a 45. 000 g por 20 a 40 min;
- i. Submeter a amostra solubilizada obtida em “h” a duas etapas de cromatografia de troca iônica, sendo a primeira, em uma coluna aniônica e em seguida, o material não ligado na coluna aniônica é aplicado em uma coluna catiônica, em pH 7 a 8, na presença de 6 a 8 M de ureia;
- j. Submeter as frações de maior concentração da proteína SpiN obtidas em “i” a uma cromatografia de dessalinização, para remoção da ureia, e substituição preferencial para tampão fosfato 25 a 100 mM, 5 a 10 % glicerol, 50 a 150 mM uréia, 15 a 35 mM NaOH, 100 a 200 mM NaCl, pH 10, 5 a 11, 5.
[040] Em uma outra forma de concretização, o cassete de expressão pode ser inserido em uma variedade de vetores adequados, tais como, por exemplo, plasmídeos, fagos, vetores virais ou retrovirais. O técnico no assunto saberá o vetor mais adequado. Ilustrativamente, no caso do microrganismo a ser modificado ser Escherichia coli, pode-se, por exemplo, utilizar qualquer plasmídeo comercial adequado para este hospedeiro, como por exemplo, o plasmídeo comercial pET2a.
[041] O vetor ou cassete compreendendo a sequência de interesse da presente invenção é usado para introduzir estas sequências no hospedeiro, por métodos bem conhecidos na arte, como eletroporação ou choque térmico.
[042] Os polinucleotídeos da invenção podem ser inseridos em um vetor que contenha marcadores de seleção de transformação, tais como genes de resistência a antibióticos.
[043] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se também a proteína quimérica definida pela SEQ ID N° 1.
[044] A proteína quimérica obtida pelo processo aqui descrito é caracterizada por compreender ou consistir na sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID No1.
[045] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se também ao gene definida pela SEQ ID N° 2.
[046] O gene aqui descrito é caracterizado por compreender ou consistir na sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID N°2.
[047] Em um quarto aspecto, a invenção se refere a uma composição imunogênica contendo tal proteína e adjuvantes e seu uso para preparar uma vacina para a profilaxia e prevenção da infecção e formas moderadas e grave da COVID-19.
[048] Os adjuvantes da composição imunogênica são selecionados do grupo compreendendo ácido poliinosínico: policitidílico (Poly (I: C)) e derivados, emulsão água e óleo ou alumen com oligonucleotídeo CpG não metilado, emulsão água e óleo ou alumen com lipídeo A, esqualeno e derivados (como as emulsões comerciais de esqualeno denominadas MF59 e AddaVax), agonista sintético de TLR4, lipossomas associados com TLR CpG não metilado ou agonista de TLR4, Montanide e Monophosporyl Lipid A, ou um outro adjuvante que induza resposta imune do tipo Th1.
[049] A composição imunogênica, em uma forma preferencial, pode compreender 1 μg a 1 mg da proteína definida pela SEQ ID N°1 e 1 μg a 10 mg do adjuvante ácido poliinosínico: policitidílico, ou 1 μg a 10 mg de CpG e 10 % a 90 % m/v de Alúmen, por dose.
[050] Em uma outra forma preferencial, a composição pode compreender 10 μg a 200 μg da proteína definida pela SEQ ID N°1 por dose, e 5 μg a 5 mg do adjuvante ácido poliinosínico: policitidílico por dose, ou 18 μg de CpG e 30 % m/v de Alúmen, por dose.
[051] Em uma outra forma preferencial, a composição imunogênica pode compreender 10 μg a 500 μg da proteína definida pela SEQ ID N°1, e 1 mg a 20 mg do adjuvante esqualeno, por dose.
[052] A proteína quimérica da presente tecnologia pode ser utilizada para produção de vacina para a profilaxia e prevenção da infecção e formas moderadas e grave de COVID-19.
[053] A composição imunogênica da presente tecnologia pode ser utilizada para produção de vacina para a profilaxia e prevenção da infecção e formas moderadas e grave de COVID-19.
[054] A presente invenção é descrita pelos exemplos não limitantes abaixo, que são meramente ilustrativas. Várias modificações e variações das concretizações são evidentes ao técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.
[055] O DNA codificador da proteína N+RBD (SpiN), definido pela SEQ ID No 2, que foi otimizada para expressão em E. coli, foi clonado no vetor de expressão bacteriano pET-14b (Genscript) e estrategicamente subclonado no vetor pET24a para permitir expressão da proteína de interesse sem cauda de histidina, e dessa forma, sem aminoácidos adicionais aos da própria sequência quimérica. O vetor de expressão pET24a confere resistência a canamicina e contém o promotor do fago T7 (pT7).
[056] Inicialmente, foram utilizadas bactérias E. coli BL21 (DE3) ΔSlyD pRARE (pRARE), que foram transformadas com a construção pET-24a_SpiN e cultivadas em meio LB com 50 μg/mL de canamicina e 34 μg/mL de cloranfenicol a 37°C sob agitação a 200 rpm. A expressão da proteína foi induzida pela adição de IPTG ao meio para uma concentração final de 0, 5 mM quando a D.O. 0.6 a 600 nm foi atingida. Para análise e comparação do nível de expressão de colônias (clones) diferentes, testes de expressão foram realizados em duas condições de cultivo; a 37°C por 3h e a 20°C por 18h. Os clones que apresentaram melhor nível de expressão foram cultivados e estocados na fase exponencial do crescimento, com 25% de glicerol em volume de 1 mL (criotubos) e acondicionados a -80°C.
[057] Para realização de teste de solubilidade da proteína SpiN produzida em E. coli pRARE, foi realizada a diluição de 1 mL do conteúdo de um criotubo estoque do cultivo em 4 mL de meio LB com 50 μg/mL de canamicina e 34 μg/mL de cloranfenicol. O cultivo foi mantido a 37°C sob agitação a 200 rpm por 18h. Em seguida, foi feita uma diluição 1: 100 deste em 250 mL de meio LB com os respectivos antibióticos em Erlenmeyer de 1L. O crescimento seguiu a 37°C sob agitação até a D.O. 0,6 a 600 nm ser atingida. Nesse momento, a expressão da proteína foi induzida pela adição de IPTG para uma concentração final de 0,5 mM. A temperatura do cultivo foi reduzida para 20°C e assim seguiu por 18h. Concluído o tempo de indução, o cultivo foi centrifugado a 8000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante (meio) descartado. O precipitado de células foi então ressuspendido em 25 mL do tampão de lise (Fosfato 50 mM, pH 7.7, DTT 5 mM, benzamidina 5 mM e PMSF 1 mM, os últimos três componentes foram adicionados no momento de uso) e a lise das células feita no homogeneizador Emulsiflex-C3. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 40. 000 g por 30 min. Amostras da fração insolúvel e da fração solúvel foram analisadas. A proteína foi observada em proporções semelhantes em ambas as frações do lisado celular.
[058] A estratégia de purificação aqui desenvolvida leva em consideração o fato que, devido ao seu elevado ponto isoelétrico (9, 6), a SpiN se encontra protonada e com carga positiva em tampão com pH abaixo de 9, 6. De forma resumida, a metodologia de purificação da proteína SpiN da fração solúvel consiste em uma cromatografia aniônica (para eliminação de contaminantes negativamente carregados) seguida por uma cromatografia catiônica (para ligação e purificação da SpiN).
[059] Para estabelecimento do protocolo de purificação da SpiN a partir de E. coli pRARE, testes com diferentes soluções tampões nas etapas de lise das células e de purificação foram realizados buscando principalmente manter a estabilidade da proteína na fração solúvel e otimizar sua ligação à coluna catiônica na segunda etapa de purificação. Testes adicionais, passando a amostra em uma única coluna iônica (catiônica e aniônica) e em diferentes volumes, foram realizados com o objetivo de otimizar o rendimento e pureza do processo em cada coluna. Por último, foram realizados testes adicionando steps e gradientes de eluição na cromatografia catiônica com intuito de otimizar a eliminação de contaminantes. As etapas de purificação foram realizadas seguindo o manual do fabricante das colunas utilizadas em sistema Akta prime (GE). O processo estabelecido ao final das etapas de otimização é descrito a seguir.
[060] Na primeira cromatografia, três colunas aniônicas - HiTrap Q XL (GE) - de 5 mL foram utilizadas. Inicialmente as colunas foram equilibradas com 75 mL do tampão Fosfato 50 mM pH 7. 7 e, em seguida, a amostra foi aplicada na coluna em um fluxo de 1 mL por minuto e a fração não ligada contendo a proteína SpiN (N+RBD) foi coletada. A corrida foi finalizada nessa etapa e os contaminantes ligados foram eliminados nas etapas de limpeza da coluna recomendadas pelo fabricante.
[061] Na cromatografia seguinte, duas colunas catiônicas - HiTrap SP HP (GE) - de 5 mL foram conectadas. Inicialmente, as colunas foram equilibradas com 50 mL de tampão de ligação (Tampão Fosfato 50 mM pH 7.7) em um fluxo de 5 mL por minuto. Em seguida, a amostra contendo a proteína de interesse com maior grau de pureza obtida da etapa anterior foi aplicada em fluxo de 1 mL por minuto. Após passagem da amostra, as colunas foram lavadas com 50 mL de tampão de ligação. A etapa de eluição foi realizada inicialmente em um passo, passando pela coluna 50 mL de tampão de ligação com 20% de tampão de eluição (Tampão Fosfato 50 mM pH 7. 7, 1 M NaCl) e, em seguida, foi feito um gradiente linear de 20% a 100% de tampão de eluição em 50 mL. A amostra eluída da coluna foi coletada em frações de 1, 5 mL e analisada em gel SDS- PAGE 10 %. Após análise da purificação, as frações contendo a proteína de interesse foram reunidas.
[062] Pelo método de Bradford o rendimento da proteína SpiN no extrato proteico solúvel antes das etapas de purificação foi de aproximadamente 15 mg por 0, 25 L de cultivo e o ao final do processo de aproximadamente 4 mg por 0, 25 L de cultivo. Esses rendimentos foram calculados para diferentes lotes produzidos após estabelecimento do protocolo final. Entretanto, mesmo com todas as tentativas de otimizar o rendimento e pureza da proteína, observava-se uma perda muito grande da SpiN na fração não ligada da cromatografia catiônica (segunda etapa de purificação), assim como a presença de bandas de proteínas de tamanhos menores que a SpiN, em torno de 30 kDa, em frações da eluição (Figura 1). Inicialmente acreditava-se que essas bandas eram produtos de degradação da proteína SpiN. Entretanto, o sequenciamento por espectrometria de massas realizado posteriormente mostrou que eram proteínas ribossomais de E. coli com ponto isoelétrico muito próximo ao da SpiN e que, portanto, apresentavam o mesmo perfil de eluição da coluna catiônica.
[063] Além da presença dos contaminantes acima descritos, notou-se visualmente uma precipitação muito rápida na amostra durante as etapas de purificação. O precipitado foi identificado por SDS-PAGE como sendo a proteína SpiN. Esse fato levou à conclusão de que a perda da proteína SpiN na fração que não se liga à coluna catiônica estava ocorrendo devido à precipitação da mesma, acarretando a perda da capacidade de interação com a coluna. A partir de então começou uma busca grande por reagentes estabilizantes que pudessem prevenir essa instabilidade da SpiN na fração solúvel do lisado bacteriano que levava à agregação e precipitação. Apesar de dezenas de estabilizantes terem sido testados (Tabela 1), resultados promissores foram obtidos com apenas dois destes: ureia e hidróxido de sódio. A ureia, tradicionalmente usada para solubilizar proteínas recombinantes expressas em corpos de inclusão de E. coli, mostrou bons resultados em diferentes concentrações (8 M a 2 M). O hidróxido de sódio (em concentrações variando de 10 mM a 30 mM) foi capaz de desfazer agregados da proteína SpiN e também mantê-la estável em sua forma solúvel.
[064] Em paralelo aos testes com estabilizantes, optou-se por avaliar expressão e estabilidade da proteína SpiN em outra cepa de E. coli, a SHuffle. Essa cepa foi selecionada por possuir capacidade aprimorada de proporcionar um melhor enovelamento a proteínas que contém múltiplas pontes dissulfeto em sua estrutura, como é o caso da porção RBD da proteína SpiN. Os testes de expressão e solubilidade na SHuffle foram conduzidos exatamente da mesma forma que os realizados para a cepa pRARE, tendo como única diferença o uso do antibiótico Canamicina no meio de cultivo da cepa SHuffle (sem cloranfenicol).
[065] A expressão em diferentes clones foi avaliada para ambas as cepas. O resultado comparativo do teste de expressão com indução da expressão a 37°C por 3h e a 20°C por 18h mostra uma melhora significativa do nível de expressão da SpiN na cepa SHuffle nas duas condições (Figura 2, painel da direita). Outra vantagem da cepa SHuffle é a ausência do escape de expressão da SpiN antes da indução. Na cepa pRARE há expressão da SpiN mesmo antes da adição de IPTG ao meio, o que dificulta a visualização da indução da expressão e pode prejudicar a multiplicação das células e crescimento do cultivo (Figura 2, painel da esquerda).
[066] Os testes de solubilidades das duas cepas mostraram presença da proteína SpiN tanto na fração solúvel como na fração insolúvel da indução realizada a 20°C por 18h. Para a SHuffle, a indução também foi feita por 3h a 37°C e a solubilidade avaliada, novamente demonstrando a presença da Spin em ambas as frações (Figura 3).
[067] Com o objetivo de aumentar o rendimento celular ao final do cultivo e indução e consequentemente o rendimento ao final do processo de purificação da SpiN uma terceira condição de indução foi avaliada nas duas cepas. Optou-se em realizar a indução a 37°C porém aumentando o tempo de 3h para 15h. Após realização do teste o nível de expressão da SpiN foi avaliado. Os resultados mostraram que o aumento do tempo de cultivo a 37°C resultou em um aumento de aproximadamente três vezes do rendimento celular quando comparada as condições de cultivos anteriores. Além disso, demonstrou-se que o nível de expressão da SpiN não foi prejudicado pelo longo tempo de indução (que em alguns casos pode resultar em degradação da proteína de interesse) (Figura 4, painel da esquerda). Apesar dos resultados promissores, o teste de solubilidade realizado com a cepa SHuffle indicou que a proteína SpiN foi produzida somente na fração insolúvel (Figura 4, painel da direita).
[068] Para definir qual cepa usar no processo de produção da proteína SpiN testes comparativos de estabilidade com a SpiN obtida da fração insolúvel de ambas as cepas foram realizados. Após solubilização da SpiN em tampão com 8M de ureia as mostras foram submetidas a etapas de diluição gradativa da ureia (7M - 6M - 5M - 4M - 3M - 2M - 1M - 0,9M -0,8M - 0,7M - 0,6M -0,5M - 0,4M - 0,3M - 0,2M - 0,1M), reduzindo a concentração de ureia a níveis aceitáveis para uso vacinal. As diluições partiram de amostras da proteína SpiN na mesma concentração. Até a diluição onde a concentração de ureia chegou a 2M não foi observado formação de precipitado da proteína em nenhuma das cepas. Nas diluições onde a concentração de ureia ficou inferior a 1M foi observado precipitado nas amostras de SpiN de ambas as cepas. Nas amostras com concentração de ureia inferior a 1M foi realizada a quantificação da proteína SpiN que permaneceu em solução, sendo constatada maior concentração da SpiN na fração solúvel das amostras da cepa SHuffle e maior precipitação na cepa pRARE (Figura 5). Dessa forma, a cepa SHuffle foi escolhida como a células de expressão para a produção da proteína SpiN.
[069] Como nos testes de estabilidade realizados anteriormente apenas a ureia e o NaOH foram capazes de manter a SpiN solúvel, foi definido que as etapas de purificação seriam feitas em tampão com 8M de ureia e em seguida a amostra purificada seria submetida à troca de tampão para substituição da ureia pelo NaOH, reagente aceito em tampão de formulação de vacina.
[070] Assim, o protocolo de purificação final da SpiN foi estabelecido a partir do pellet celular gerado de um cultivo de 1 L com indução da expressão feita a 37°C por 15h. Os procedimentos da etapa de cultivo foram realizados como já descrito anteriormente. Como nessa condição a proteína foi observada apenas na fração insolúvel, em corpos de inclusão, foram adicionadas etapas de lavagens desta fração e solubilização em tampão com alta concentração de ureia quando comparado com o protocolo descrito anteriormente de purificação da SpiN da fração solúvel. A seguir detalhes do protocolo, exemplificado com a SpiN produzida em E. coli SHuffle.
[071] O pellet celular gerado de um cultivo de 1 L foi ressuspendido em 75 mL de PBS 1X, foi adicionado no momento do uso DTT 5 mM, benzamidina 5 mM, PMSF 1 mM e uma alíquota de coquetel de inibidores de proteases (quantidade indicada pelo fabricante). Para lise das células foi utilizado equipamento homogeneizador por pressão, foram realizadas passagens da amostra por 20 minutos sob pressão variando entre 15. 000 e 20. 000 psi. Em seguida, a amostra foi centrifugada por 30 minutos a 40. 000g para clarificação, o sobrenadante gerado foi descartado e o pellet insolúvel contendo a proteína de interesse submetido a duas etapas de lavagens para remoção de restos celulares e proteínas insolúveis de E. coli. O tampão de lavagem contendo 100 mM de Tris, 1 M de ureia, 10% de glicerol, EDTA 10 mM, triton x-100 2%, pH 7 foi utilizado para lavar o pellet que em seguida foi submetido a centrifugação por 30 minutos a 40. 000g. Após centrifugação o sobrenadante foi descartado e mais uma etapa de lavagem foi realizada da mesma forma. O pellet lavado foi então submetido a etapa de solubilização após ressuspensão em 75 ml de tampão fosfato 50 mM, ureia 8M, 10% de glicerol e 0, 05% triton X-100, pH 7. 7 e incubado a 4°C por 18h sob agitação. Em seguida a mostra foi centrifugada a 40. 000g por 30 minutos e a fração solúvel seguiu para as etapas de purificação.
[072] Como descrito anteriormente, uma cromatografia aniônica seguida por uma catiônica foi estabelecida para obtenção de da proteína SpiN com alto nível de pureza, assim como para remoção de endotoxinas bacterianas, visto que estas podem ser eliminadas por se ligarem a colunas aniônicas. Na primeira etapa de purificação duas colunas aniônicas HiTrap Q XL (GE) de 5 mL foram utilizadas. Inicialmente, a coluna foi equilibrada com 25 mL de tampão de ligação (50 mM Tampão Fosfato, 10% glicerol, 8 M ureia, pH 7.7) em um fluxo de 5 mL por minuto. Em seguida a amostra solúvel contendo a proteína SpiN (obtida conforme descrito acima) foi aplicada na coluna em fluxo de 2 mL por minuto. Como a coluna apresenta a mesma carga da proteína, a amostra de interesse é coletada na fração não ligada, permitindo que contaminantes e endotoxinas se liguem e sejam eliminados nessa etapa. Na segunda etapa, uma coluna catiônica HiTrap SP HP (GE) de 5 ml foi utilizada. Inicialmente, a coluna foi equilibrada com 25 mL de tampão de ligação (50 mM Tampão Fosfato, 10% glicerol, 8 M ureia, pH 7.7) em um fluxo de 5 mL por minuto. Em seguida, a amostra coletada da fração não ligada da cromatografia anterior foi aplicada na coluna em fluxo de 2 mL por minuto. Após passagem da amostra, a coluna foi lavada com 25 mL de tampão de ligação. A etapa de eluição foi realizada com um gradiente de 0 a 20% de tampão de eluição (50 mM Tampão Fosfato, 10% glicerol, 8 M ureia, 1 M NaCl, pH 7.7) fluxo de 2 mL por minuto em 60 volumes de coluna (300 mL) e no final um step foi aplicado com 100% de tampão de eluição em 5 volumes de coluna para eluição do material ligado restante.
[073] A figura 6 mostra amostras obtidas das duas etapas de purificação da metodologia 2. O resultado da cromatografia catiônica mostra não haver mais perda da proteína SpiN na amostra que passa pela coluna sem se ligar, como observado na metodologia 1, indicando total aproveitamento na etapa de ligação. Foi constatada que a perda nessa etapa, observada em todas cromatografias catiônicas descritas na metodologia 1, era devido à agregação da amostra. Esse resultado também indica que uma coluna HiTrap SP HP (GE) de 5 mL é suficiente para ser usada com um cultivo de 1L, não ocorrendo saturação.
[074] Para troca do tampão final da amostra, com o objetivo de reduzir a concentração de ureia, foi utilizada coluna HiTrap desalting. A coluna foi equilibrada com 1, 5 volume de coluna com tampão fosfato 50 mM, 150 mM de NaCl, 30 mM de NaOH, 10% glicerol e 100 mM de ureia, pH 11, 2, e a amostra aplicada em fluxo de 2 ml/min. A amostra contendo a proteína SpiN foi eluída da coluna com o tampão de equilíbrio descrito, definido como tampão final da proteína. Após essa etapa foi realizado um ajuste de pH de 11, 2 para 7,5 com tampão fosfato 1M (5% do volume da amostra). Testes de estabilidade mostraram que em pH neutro a SpiN purificada se mantém mais estável. Em pH 11.2 foi observado que a SpiN é completamente degradada quando armazenada a 37°C, o que não acontece quando o ajuste de pH para 7.5 é realizado.
[075] Após etapa de troca de tampão e ajuste de pH, a SpiN purificada foi quantificada e avaliada em SDS-PAGE. As bandas observadas no gel foram sequenciadas por espectrometria de massas e o resultado mostrou que a banda majoritária corresponde a proteína SpiN, as bandas inferiores a produtos de clivagem da mesma e as superiores a agregados (Figura 7). A análise quantitativa de proteínas da célula hospedeira resultou em valores não detectáveis, mostrando altíssimo grau de pureza da SpiN. Nas análises quantitativas de endotoxinas o resultado observado foi valores muito baixos, aproximadamente 0, 31 EU/mL, mostrando a eficácia da cromatografia aniônica na remoção desse contaminante bacteriano. O rendimento observado ao final das etapas de purificação é de aproximadamente 20 mg de proteína SpiN por litro de cultivo com excelente grau de pureza.
[076] SDS-page da proteína SpiN purificada (Figura 8A e D). Nos painéis superiores, a Spin foi purificada seguindo a metodologia 1. Nos painéis inferiores, foi utilizada a metodologia 2. Western blot com soro policlonal anti-N (B e E) e anticorpo monoclonal anti-RBD (C e F) foram realizados para análise das proteínas purificadas. O soro policlonal anti-N reconhece a quimera SpiN e a proteína N, mas não a proteína RBD. Já o anticorpo monoclonal anti-RBD reconhece a quimera SpiN, as proteínas RBD e S, mas não a proteína N.
[077] Para garantir que as proteínas N ou RBD desencadeiam respostas humorais e celulares, foram utilizadas amostras de pacientes de COVID-19 convalescentes ou de indivíduos que foram imunizados com a vacina de vírus inativado (CoronaVac).
[078] A Figura 9 mostra a resposta de anticorpo de indivíduos não infectados (HC), vacinados com CoronaVac e convalescentes da COVID-19 contra as proteínas RBD (Figura 9A) e N (Figura 9C), separadamente. A proteína S íntegra foi usada como controle positivo (Figura 9B). Anticorpos IgG totais antígeno-específicos foram dosados no soro dos indivíduos através do método de ELISA. Foi observado um aumento discreto, mas significativo, de anticorpos contra as proteínas RBD e um aumento mais significativo de anticorpos contra a proteína N nos pacientes vacinados ou convalescentes. Já o nível de anticorpos contra a proteína S foi bem elevado, tanto nos indivíduos vacinados, quanto nos indivíduos convalescentes.
[079] A produção de IFN-g pelos PBMCs destes mesmos pacientes foi bastante elevada para os três antígenos (Figura 10), indicando que a seleção destas proteínas foi condizente com nossa análise virtual e relevante para resposta imune de pacientes anti-SARS-CoV2. No geral, tanto os indivíduos convalescentes quanto os vacinados, mas não os controles saudáveis soronegativos, mostraram uma resposta robusta de produção de IFN-γ frente às proteínas recombinantes N e RBD que compõem a nossa proteína quimérica.
[080] O potencial vacinal da proteína SpiN foi avaliado em modelo murino. Inicialmente, camundongos C57BL/6 foram imunizados somente com RBD ou N, ou com uma combinação de N + RBD, adjuvantadas com ácido poliinosínico: policitidílico (Poly (I: C)). Foram administradas duas doses com 21 dias de intervalo, contendo 10ug de proteína + 50ug de Poly (I: C). Vinte e um dias após a última dose, foram analisadas as respostas humoral e celular induzidas pela vacinação. No lavado brônquioalveolar (BALF), foram observados altos níveis de anticorpos IgG totais anti-RBD (Figura 11 A) e anti-N (Figura 11 B) nos camundongos administrados com a respectiva proteína e com a associação de N + RBD. O mesmo foi encontrado no soro destes animais, nos quais detectaram-se altas taxas de IgG totais anti-RBD nos grupos que receberam RBD ou N + RBD (Figura 11 C), ao passo que animais imunizados com N ou N + RBD apresentaram níveis exuberantes de anticorpos IgG anti-N (Figura 11 D).
[081] Para avaliação da resposta celular, os esplenócitos dos camundongos foram isolados e colocados em cultura com os antígenos RBD ou N. Após 48h, realizou-se a dosagem de IFN-g no sobrenadante através do ensaio de Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Como demonstrado na (Figura 11 E), camundongos imunizados com RBD + Poly (I: C) foram capazes de produzir IFN-g após estímulo com RBD. Interessantemente, esplenócitos de animais imunizados com N + RBD + Poly (I: C) produziram níveis ainda maiores de IFN-g ao serem estimulados com RBD in vitro. Por outro lado, no estímulo com a proteína N detectou-se uma maior taxa de IFN-g nos camundongos administrados com N + Poly (I: C), quando comparados com N + RBD + Poly (I: C).
[082] Em seguida, foi testada a proteína quimérica SpiN. Após a expressão e purificação, a quimera SpiN foi imunizada em camundongos associada ao adjuvante Poly (I: C), seguindo o mesmo protocolo descrito anteriormente. Trinta após a última dose vacinal, anticorpos IgG foram dosados no soro. Observou-se altos níveis de anticorpos IgG totais anti-N, anti-RBD e anti-SARS-CoV-2 inativado nos camundongos imunizados com SpiN + Poly (I: C) (Figuras 12 A, B, C). Além disso, foi detectada uma produção significativa das subclasses IgG1 e IgG2c anti-N (Figuras 12 B e C, respectivamente), anti-RBD (Figuras E e F) e anti-SARS-CoV-2 inativado (Figuras H e I). Interessantemente, houve uma predominância de anticorpos IgG2c anti-N e RBD em relação a IgG1, sugerindo uma polarização de resposta Th1.
[083] A resposta celular induzida pela vacinação também foi avaliada 30 dias após a última dose vacinal, através da dosagem de IFN-g e IL-10 no sobrenadante de cultura de esplenócitos. Observou-se que os estímulos com os antígenos RBD e N induziram a produção de IFN-g pelas células oriundas de camundongos imunizados com SpiN + Poly (I: C) (Figura 13 A). Ambos os estímulos também induziram a produção de IL-10, porém em níveis mais baixos quando comparados aos de IFN-g (Figura 13 B).
[084] A fim de avaliar se a imunização com SpiN + Poly (I: C) é capaz de conferir proteção contra a infecção por SARS-CoV-2, camundongos hACE2 foram imunizados e desafiados trinta dias após a última dose vacinal. A Figura 14 A mostra que, ao contrário dos animais não vacinados que receberam apenas Poly (I: C), os animais vacinados não perderam peso após o desafio com SARS-CoV-2. Enquanto 100% dos animais vacinados sobreviveram, todos os animais não vacinados morreram até o dia 11 de infecção com o SARS-CoV-2 (Figura 14 B). Além disto, os animais vacinados apresentaram carga viral não detectável no pulmão e no cérebro, 11 dias após o desafio com SARS-CoV-2 (Figura 14 C).
[085] A Figura 15 mostra resultados representativos da lesão pulmonar de animais vacinados e não vacinados desafiados com SARS-CoV-2. Os quadrantes superiores ilustram o tecido pulmonar de um animal que recebeu apenas o adjuvante Poly (I: C). Os quadrantes inferiores ilustram o tecido pulmonar de um animal vacinado com SpiN + Poly (I: C). A coloração com hematoxilina e eosina (quadrantes da esquerda) mostram intenso infiltrado inflamatório nos animais não vacinados, o que não é observado nos animais vacinados. Já a coloração com Tricrômico de Masson ilustra a formação de trombos no pulmão apenas do animal não vacinado e desafiado com SARS-CoV-2.
[086] Podemos concluir que a formulação vacinal SpiN + Poly (I: C) induz resposta imunológica humoral e celular robusta que controla a carga viral e protege de forma significativa o processo inflamatório e lesão pulmonar induzida pela infecção com o SARS-CoV-2.
[087] Posteriormente, foram realizados novos testes de imunogenicidade, desta vez utilizando a emulsão comercial de esqualeno denominada MF59 como adjuvante imunológico, que consiste em uma nanoemulsão O/A que compreende o esqualeno como composto adjuvante. A seleção do adjuvante foi delineada pela capacidade da indução da imunidade eficaz à gripe que também infecta humanos por meio do trato respiratório. O MF59 carece de agonistas para sensores inatos, mas é usado em uma vacina disponível comercialmente e com alto desempenho imunogênico.
[088] Camundongos foram imunizados com 10μg da proteína SpiN + 50μL de MF59. Os dados da Figura 16 demonstram a capacidade da proteína SpiN, associada ao adjuvante testado em induzir resposta robusta de anticorpos anti-N e anti-RBD. Foi também avaliada a resposta celular em camundongos vacinados com SpiN + MF59. Enquanto a resposta ao estímulo com a proteína RBD (Figura 16b) foi maior do que ao estímulo com a proteína N (Figura 16c), ambos os conjuntos de esplenócitos estimulados por proteínas produzem altos níveis de IFN-γ (Figura 16d) e de IL-10 quando estimulados com as proteínas de SARS-CoV-2 (Figura 16e).
[089] Em hamsters, utilizando o mesmo protocolo vacinal, também foram observados altos níveis de anticorpos IgG totais, IgG1 e IgG2c anti-N e anti-RBD (Figura 17a-c).
[090] A Figuras 16 (a-c) e 17 mostram que a associação de SpiN com MF59 induz altos níveis de IgG total anti-N e anti-RBD em camundongos e em hamsters imunizados, respectivamente.
[091] A imunização com SpiN associada a MF59 em camundongos foi avaliada pelo desafio frente ao SARS-CoV-2, medido pela carga viral, evolução do peso corporal e análises histopatológicas.
[092] O efeito protetor da imunização com SpiN associada ao MF59 (Figura 18) foi avaliado em camundongos hACE-2. A imunização com a proteína SpiN associada ao MF59 protegeu 100% dos animais de sinais clínicos da doença, tais como pelos arrepiados, baixa motilidade e coma, assim como contra a perda de peso e mortalidade (Figuras 18a e 18b).
[093] Decorrido o período de 11 dias após o desafio nos camundongos vacinados, detectou-se uma diminuição do RNA viral de SARS-CoV-2, contrastando com níveis extremamente elevados (10E4 PFU / 75 ng total / RNA) de carga viral nos pulmões (Figura 18c) e cérebros (Figura 18d) de camundongos não imunizados após 7-8 dias de infecção.
[094] O exame histopatológico apresentou resultados congruentes com os resultados clínicos. Nos grupos placebos desafiados (painéis superiores), inoculados apenas com o adjuvante MF59, no dia 5 pós infecção, os pulmões apresentaram pneumonia intersticial difusa caracterizada por infiltrado inflamatório misto de células mononucleares e polimorfonucleares, acompanhados de congestão intensa, exsudato intra-alveolar, focos hemorrágicos e áreas de colapso alveolar (Figura 19). Nos animais vacinados e desafiados (painéis inferiores) observa-se arquitetura pulmonar preservada com a presença de infiltrado mononuclear peribroncoalveolar.
[095] Os camundongos vacinados produziram níveis extremamente altos de anticorpos anti-N e anti-RBD, e o papel dos mesmos na mediação da resistência ao SARS-CoV-2 não deve ser descartado. Assim, os anticorpos anti-N podem atuar mediando a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) ou promovendo a internalização de células hospedeiras opsonizadas por macrófagos. Importante mencionar que o SARS-CoV-2 não se replica bem em macrófagos e não há evidências de que os anticorpos anti-N promovam a potencialização dependente de anticorpos (anti body-dependent enhancement, ADE) in vitro ou a replicação in vivo do SARS-CoV-2 em tecidos de camundongos vacinados.
[096] Além disto, foram observados altos níveis de anticorpos neutralizantes circulantes nos animais vacinados após o desafio, o que não ocorreu nos animais não vacinados (Figura 20).
[097] Os nossos resultados são consistentes com a hipótese de que os linfócitos T são um componente importante da resistência ao SARS-CoV-2 induzida por formulações vacinais contendo SpiN. Tanto a proteína N quanto a RBD induziram altos níveis de anticorpos específicos, e promoveram também resposta de células T e resistência ao SARS-CoV-2. Além disto, foram detectados altos níveis de anticorpos neutralizantes em animais vacinados e infectados com SARS-CoV-2.
[098] Em conclusão, a imunização com a proteína quimérica SpiN associada com MF59 ou Poly (I: C) induz imunidade celular e humoral robusta e proteção contra o SARS-CoV-2. Acredita-se que em grande parte esta imunidade protetora é mediada por células T. Uma vez que as respostas das células T não dependem de um único epítopo, é improvável que mutações pontuais não silenciosas prejudiquem gravemente a resistência induzida pela vacinação com a proteína quimérica SpiN. Portanto, a proteína N e a região RBD da proteína S, e mais amplamente o uso de múltiplos epítopos de células T, devem ser considerados no desenvolvimento de vacinas que superam a plasticidade genética do SARS-CoV-2.
[099] Dez animais adultos de Callithrix penicillata compuseram a amostra do estudo, seis fêmeas e quatro machos saudáveis. Os animais foram cedidos pelo Centro de Triagem de Animais Silvestres do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) ao Criadouro Científico com Fins de Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais para a realização do estudo (CEUA/UFMG protocolo 54/2021). Os animais foram submetidos a avaliação clínica antes do experimento por um veterinário que não encontrou nenhuma doença clínica ativa. O acompanhamento foi iniciado 6 dias antes da primeira coleta de amostras e início do protocolo de imunização (dia -6), para estabelecer uma linha de base de 6 dias e avaliar os efeitos adversos da vacina. Uma amostra de sangue de 1,5 mL foi retirada da veia femoral direita nos dias 0 e 60.
[0100] Cada animal recebeu 0,3 mL do imunizante, contendo 10 μg de SpiN diluída 1:1 com MF59, via intramuscular (IM) no músculo vasto medial direito no dia 0 e no dia 30. Foram submetidos a aferição de temperatura na região abdominal com termômetro infravermelho e pesagem durante todo o experimento. Durante todas as intervenções foram submetidos também à avaliação clínica, e observado presença de reações cutâneas, dor, aumento de volume no local de aplicação da injeção e tecidos adjacentes, prostração, falta de apetite.
[0101] Não foram detectados efeitos adversos sistêmicos nos C. penicillata, conforme sugerido pela avaliação comparativa da perda de peso corporal e variação da temperatura. Os animais imunizados com SpiN e MF59 não apresentaram variação na temperatura corporal ou perda de peso significativa (Figura 21). Não foi detectada prostração ou falta de apetite durante o experimento, ou qualquer alteração e reação adversa no local da aplicação.
[0102] Os resultados apresentados na Figura 22 mostram resposta de anticorpos anti-N e anti-RBD nestes primatas não-humanos vacinados com SpiN + MF59 e Spin + Poly (I. C. ) (Figura 22).
[0103] Para produção de anticorpos policlonais, coelhos foram imunizados com as proteínas N e RBD de acordo com o protocolo descrito em LEENAARS e HENDRIKSEN (Critical steps in the production of polyclonal and monoclonal antibodies: evaluation and recommendations. ILAR journal, v. 46, n. 3, p. 269-279, 2005).
[0104] O antígeno SpiN, produzido em duas linhagens bacterianas diferentes (pRARE, dois lotes e SHuffle) foi utilizado para sensibilizar placas de poliestireno (Costar, Ref. 2592), overnight a 4 °C com 100 μL/poço da solução do antígeno diluído (titulação 6, 5 a 800 ng/poço) em tampão carbonato (pH 9,6). A solução foi descartada e os poços foram bloqueados por 2 h a 25 °C, utilizando-se 250 μL da solução de bloqueio (PBS1X + BSA 1%). Após o descarte da solução, foram adicionados aos poços 100 μΙ de anticorpos policlonais produzidos em coelho (anti-N e anti-S/RBD, concentração 3ug/mL e 22ug/mL, respectivamente) diluídos em PBS-T + BSA 1%, foram adicionados e incubados a 37 °C (30 min). Após cinco lavagens, adicionou-se 100μΙ do anticorpo secundário (anti-IgG de coelho, Sigma, Ref: A0545) conjugado à enzima peroxidase diluído em diluente de amostra (1: 50. 000) sendo incubado a 37 °C (30 min). As placas foram lavadas (PBS 1X + 0, 05% de Tween 20) cinco vezes e incubadas com 100μΙ de TMB (3, 3 ', 5, 5; -tetrametilbenzidina) (Scienco, Ref. One step) por poço, ao abrigo de luz, por 15 minutos. A reação foi interrompida com 100 μL de solução de parada (Ácido sulfúrico 0, 5 M) absorbância medida em espectrofotômetro Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific) a uma densidade óptica (O. D. ) de 450 nm.
[0105] Na figura 23, é possível verificar uma alta capacidade de reconhecimento da proteína SpiN pelos anticorpos anti-N (A) e anti-S/RBD (B) produzidos em coelhos. Essa capacidade foi ainda maior para proteína produzida em SHuffle, quando comparada a dois lotes diferentes da mesma proteína produzida na linhagem pRARE.
Claims (16)
- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA QUIMÉRICA, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
- a. Clonar o DNA, definido pela SEQ ID N°2, codificador da proteína definida pela SEQ ID N°1, em vetor de expressão;
- b. Transformar bactérias E. coli com a construção obtida em “a” e cultivar em meio apropriado, a uma temperatura de 36, 5 a 37, 5 °C sob agitação a 180 a 200 rpm, por 3 a 4 horas;
- c. Induzir a expressão da proteína definida pela SEQ ID N°1 pela adição de IPTG ao meio, e manter o cultivo sob agitação por um período de 15 h a 24 h, a 36, 5 a 37, 5 °C;
- d. Realizar a lise do precipitado celular do cultivo obtido em “c”, utilizando tampão de lise, que compreende um agente tamponante de pH entre 7 e 8, um coquetel de inibidores de protease e agentes redutores, através de passagens da amostra em equipamento homogeneizador por pressão mantendo 15. 000-20. 000 psi por 5 a 20 min;
- e. Submeter o lisado obtido em “d” à centrifugação a 35. 000 g a 45. 000 g por 20 a 40 min;
- f. Realizar 2 etapas de lavagens da fração insolúvel obtida em "e" utilizando tampão contendo ureia 0, 5 a 1 M, pH 7 a 8, através de ressuspensão e centrifugação a 35. 000 g a 45. 000 g por 20 a 40 min;
- g. Realizar etapa de ressuspensão do precipitado contendo a fração insolúvel lavada e obtida em "f" em tampão contendo 6 a 8 M uréia e coquetel de inibidores de proteases, através de agitação a 4 a 6 °C por aproximadamente 18 a 24 h;
- h. Submeter a ressuspensão obtida em "g" à centrifugação a 35. 000 g a 45. 000 g por 20 a 40 min;
- i. Submeter a amostra solubilizada obtida em “h” a duas etapas de cromatografia de troca iônica, sendo a primeira, em uma coluna aniônica e em seguida, o material não ligado na coluna aniônica é aplicado em uma coluna catiônica, em pH 7 a 8, na presença de 6 a 8 M de ureia;
- j. Submeter as frações de maior concentração da proteína SpiN obtidas em “i” a uma cromatografia de dessalinização, para remoção da ureia, e substituição para tampão contendo 50 a 150 mM uréia, pH 10, 5 a 11, 5.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “a”, o vetor de expressão ser o vetor procarioto pET24a.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “b”, o meio apropriado ser como o meio LB com 25 a 100 μg/mL de canamicina.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “c”, o IPTG ser adicionado para uma concentração final de 0,1 a 1 mM, quando a densidade óptica a 600 nm atingir o valor de 0, 3 a 0,6.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “f”, a lavagem ser realizada com tampão Tris 80 a 100 mM, ureia 0,5 a 1 M, EDTA 5 a a10 mM, glicerol 5 a 10 %, triton x-100 1 a 2.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “g”, a lavagem ser realizada com tampão fosfato 25 a 100 mM, 5 a 10 % glicerol, 6 a 8 M uréia, 0,05 a 0, 1 % triton x-100, DTT 1 a 10 mM, benzamidina 1 a 10 mM, PMSF 1 a 5 mM e coquetel de inibidores de proteases.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “j”, o tampão de substituição ser tampão fosfato 25 a 100 mM, 5 a 10 % glicerol, 50 a 150 mM uréia, 15 a 35 mM NaOH, 100 a 200 mM NaCl, pH 10, 5 a 11, 5.
- PROTEÍNA QUIMÉRICA obtida pelo processo definido na reivindicação 1, caracterizada por consistir na sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID N° 1.
- GENE PARA A PROTEÍNA QUIMÉRICA definida na reivindicação 2, caracterizado por consistir na sequência de nucleotídeos definida pela SEQ ID N° 2.
- COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA CONTRA SARS-COV2, caracterizada por compreender uma proteína quimérica definida pela SEQ ID N°1 e adjuvantes.
- COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelos adjuvantes serem selecionados do grupo compreendendo ácido poliinosínico: policitidílico e derivados, emulsão água e óleo ou alumen com oligonucleotídeo CpG não metilado, emulsão água e óleo ou alumen com lipídeo A, esqualeno e derivados, agonista sintético de TLR4, lipossomas associados com TLR CpG não metilado ou agonista de TLR4, Montanide e Monophosporyl Lipid A, ou um outro adjuvante que induza resposta imune do tipo Th1.
- COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender 1 μg a 1 mg da proteína definida pela SEQ ID N°1 e 1 μg a 10 mg do adjuvante ácido poliinosínico: policitidílico, ou 1 μg a 10 mg de CpG e 10% a 90% m/v de Alúmen, por dose.
- COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender 10 μg a 200 μg da proteína definida pela SEQ ID N°1 por dose, e 5 μg a 5 mg do adjuvante ácido poliinosínico: policitidílico por dose, ou 18 μg de CpG e 30% m/v de Alúmen, por dose.
- COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender 10 μg a 500 μg da proteína definida pela SEQ ID N°1, e 1 mg a 20 mg do adjuvante esqualeno, por dose.
- USO DA PROTEÍNA QUIMÉRICA definida na reivindicação 8, caracterizado por ser para produção de vacina para a profilaxia e prevenção da infecção e formas moderadas e grave de COVID-19.
- USO DA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA definida na reivindicação 10, caracterizado por ser para produção de vacina para a profilaxia e prevenção da infecção e formas moderadas e grave de COVID-19.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR102022000733A BR102022000733A8 (pt) | 2022-01-14 | 2022-01-14 | Processo de produção de proteína quimérica, proteína quimérica, gene, composição imunogênica, e usos |
| CN202280092551.8A CN118765286A (zh) | 2022-01-14 | 2022-12-28 | 嵌合蛋白质产生方法、嵌合蛋白质、基因、免疫原性组合物和用途 |
| PCT/BR2022/050527 WO2023133617A1 (pt) | 2022-01-14 | 2022-12-28 | Processo de produção de proteína quimérica, proteína quimérica, gene, composição imunogênica, e usos |
| ARP230100068A AR128249A1 (es) | 2022-01-14 | 2023-01-11 | PROCESO DE PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA QUIMÉRICA, LA PROTEÍNA QUIMÉRICA, EL GEN, UNA COMPOSICIÓN INMUNOGÉNICA, Y SUS USOS ASOCIADOS AL SARS-CoV-2 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR102021009573-3 | 2021-05-17 | ||
| BR102022000733A BR102022000733A8 (pt) | 2022-01-14 | 2022-01-14 | Processo de produção de proteína quimérica, proteína quimérica, gene, composição imunogênica, e usos |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR102022000733A2 true BR102022000733A2 (pt) | 2022-11-29 |
| BR102022000733A8 BR102022000733A8 (pt) | 2022-12-27 |
Family
ID=84192040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR102022000733A BR102022000733A8 (pt) | 2022-01-14 | 2022-01-14 | Processo de produção de proteína quimérica, proteína quimérica, gene, composição imunogênica, e usos |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118765286A (pt) |
| AR (1) | AR128249A1 (pt) |
| BR (1) | BR102022000733A8 (pt) |
| WO (1) | WO2023133617A1 (pt) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111499765B (zh) * | 2020-04-08 | 2022-04-08 | 四川携光生物技术有限公司 | 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用 |
| WO2021211691A1 (en) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | Immunitybio, Inc. | Yeast lysate covid-19 vaccine |
| CN111607003B (zh) | 2020-05-21 | 2022-08-23 | 上海百英生物科技有限公司 | 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用 |
| CN112592928B (zh) * | 2020-12-31 | 2021-08-31 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 冠状病毒的融合基因、融合蛋白、重组载体、通用型dc疫苗及其制备方法 |
| CN113092776A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-07-09 | 苏州携创生物技术有限公司 | 一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒 |
-
2022
- 2022-01-14 BR BR102022000733A patent/BR102022000733A8/pt unknown
- 2022-12-28 WO PCT/BR2022/050527 patent/WO2023133617A1/pt active Application Filing
- 2022-12-28 CN CN202280092551.8A patent/CN118765286A/zh active Pending
-
2023
- 2023-01-11 AR ARP230100068A patent/AR128249A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR102022000733A8 (pt) | 2022-12-27 |
| WO2023133617A1 (pt) | 2023-07-20 |
| CN118765286A (zh) | 2024-10-11 |
| AR128249A1 (es) | 2024-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11964010B2 (en) | Prefusion coronavirus spike proteins and their use | |
| KR102505354B1 (ko) | Rsv f 단백질 돌연변이체 | |
| BR112013026175B1 (pt) | Proteína de fusão, composição imunogênica, vacina, e, processo para produzir expressão periplasmática de uma proteína de fusão | |
| Del Campo et al. | OVX836 a recombinant nucleoprotein vaccine inducing cellular responses and protective efficacy against multiple influenza A subtypes | |
| BR112013008624B1 (pt) | Polipeptídeo gb de citomegalovírus (cmv), preparação, composição imunogênica, polinucleotídeo, vetor recombinante, e, microrganismo transgênico | |
| US20230052495A1 (en) | Immunogenic composition comprising staphylococcal antigens | |
| ES2546288T3 (es) | Método de purificación de complejos de proteínas de choque térmico | |
| ES2754238T3 (es) | Vacuna | |
| Pacífico et al. | Immunization with Schistosoma mansoni 22.6 kDa antigen induces partial protection against experimental infection in a recombinant protein form but not as DNA vaccine | |
| US20170037087A1 (en) | Group a streptococcus vaccine | |
| JP6808650B2 (ja) | 短縮型ロタウイルスｖｐ４タンパク質およびその適用 | |
| Guzmán-Brambila et al. | LKTA and PlpE small fragments fusion protein protect against Mannheimia haemolytica challenge | |
| Ponzio et al. | The salivary gland as a target for enhancing immunization response | |
| BR102022000733A2 (pt) | Processo de produção de proteína quimérica, proteína quimérica, gene, composição imunogênica, e usos | |
| WO2019059817A1 (en) | VACCINE BASED ON FUSION PROTEIN AND PLASMIDIC DNA | |
| US20230053555A1 (en) | Mumps and measles virus immunogens and their use | |
| US10525127B2 (en) | P14.7 protein and uses thereof as vaccine adjuvant | |
| Li et al. | CpG 1018 Is an Effective Adjuvant for Influenza Nucleoprotein. Vaccines 2023, 11, 649 | |
| JP2015532594A (ja) | Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓに対する免疫化のための安定化されたタンパク質 | |
| BR112020004003A2 (pt) | vacina recombinante contra enteropatia proliferativa em animais | |
| RU2818278C2 (ru) | Пневмококковые поверхностные белки | |
| WO2023272370A1 (pt) | Composição de vacina veterinária contra helmintos, método para tratamento e prevenção de infecção causada por helmintos e uso | |
| JP2007527707A (ja) | ピロプラスミドワクチン | |
| BR112016012097A2 (pt) | composição vacinal para a prevenção e/ou o tratamento de leishmanioses, peptídeos imunogênicos e processo de obtenção | |
| BR102016016891B1 (pt) | Fosfatase ácida recombinante rcp01850 de corynebacterium pseudotuberculosis e seu uso em vacinas de subunidade para a linfadenite caseosa |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B03H | Publication of an application: rectification [chapter 3.8 patent gazette] |
Free format text: REF. AO CODIGO 3.1 PUBLICADO NA RPI2708 DE 29/11/2022 RELATIVO AO INID (66) PRIORIDADE INTERNA. EXCLUIDAS AS INFORMACOES DO PEDIDO INDICADO COMO PRIORIDADE INTERNA EM ATENDIMENTO AO REQUERIMENTO DO DEPOSITANTE (PET.870220117638 DE 15/12/2022). |
|
| B03H | Publication of an application: rectification [chapter 3.8 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE AO CODIGO 3.1 PUBLICADO NA RPI2708 DE 29/11/2022 RELATIVO AO CAMPO INID (72) INVENTOR. CONSIDEREM-SE OS DADOS ATUAIS. |
|
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS (BR/MG) ; FUNDACAO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DE MINAS GERAIS (BR/MG) ; FUNDACAO OSWALDO CRUZ (BR/RJ) |