BR102016016891B1 - Fosfatase ácida recombinante rcp01850 de corynebacterium pseudotuberculosis e seu uso em vacinas de subunidade para a linfadenite caseosa - Google Patents

Abstract

FOSFATASE ÁCIDA RECOMBINANTE rCP01850 DE Corynebacterium pseudotuberculosis E SEU USO EM VACINAS DE SUBUNIDADE PARA A LINFADENITE CASEOSA. Poucos antígenos vacinais de Corynebacterium pseudotuberculosis foram expressos em sistemas de expressão heteróloga. E, das poucas vacinas disponíveis no mercado para a linfadenite caseosa, todas apresentam algum grau de reações adversas ou falhas vacinais. Tendo em vista esses problemas, o presente invento aborda o processo de produção e uso em formulações vacinais da fosfatase ácida recombinante rCP01850 de C. pseudotuberculosis, gerada a partir da clonagem parcial ou total do gene cp1002_RS01850. A proteína rCP01850, produzida em cepas de E. coli utilizando o vetor pAE, apresenta aproximadamente 33,5 kDa e foi capaz de induzir níveis elevados de IgG, em especial dos seus isótipos IgG1 e IgG2a, além de taxas de proteção de até 70%. Desta forma, a rCP01850 pode ser utilizada em composições vacinais de forma isolada ou associada a outros antígenos, contendo ainda qualquer adjuvante fisiologicamente aceitável. De forma mais específica solicita-se ainda a proteção sobre as formulações de vacinas recombinantes de subunidade para a linfadenite caseosa compostas pela associação da rCP01850 com a saponina e da rCP01850 associada com o adjuvante de própolis vermelha brasileira.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao processo de produção da fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis, codificada pelo gene cp1002_RS01850 e seu uso em vacinas recombinantes de subunidade. Tal antígeno pode ser utilizado em formulações vacinais para a linfadenite caseosa de forma isolada ou em associação com outros antígenos. As formulações vacinais podem apresentar composições variadas, com o uso de adjuvantes diversos, em veículo excipiente ouestabilizante ou sistema veiculante de vacinafarmaceuticamente aceitáveis a preparações vacinais, com ou sem corretivos edulcorantes e corantes, segundo o fim a quese propõe a formulação.Está enquadrada dentro da classificação internacional de patentes nos campos de invençãoA61K 39/00, A61K 39/02, A61K 39/05.

DESCRIÇÃO DOESTADO DA TÉCNICA

[002] A Linfadenite Caseosa (Lc) É Uma Enfermidade Crônica Que Afeta Ovinos E Caprinos Mundialmente, Tendo Como Agente Etiológico A Bactéria Gram-positiva Intracelular Facultativacorynebacterium Pseudotuberculosis. A Lc Consiste Em Uma Infecção Debilitante, E Pode Manifestar-se Clinicamente Como Lc Externa, Afetando Linfonodos Superficiais, E Lc Interna, Promovendo O Desenvolvimento De Abscessos Nos Linfonodos E Órgãos Internos, Como Fígado, Pulmões E Rins (Dorella, F.A.D., Gustavo, L., Achecoa, C.P. Et Al. Corynebacterium Pseudotuberculosis: Microbiology , Biochemical Properties , Pathogenesis And Molecular Studies Of Virulence. Vet. Res., V. 37, P. 201-218, 2006).

[003] Neste sentido, são observadas perdas econômicas diretas e importantes que podem ocorrer pela depreciação da pele, em decorrência das lesões provocadas pelos abscessos, pela condenação das carcaças, pela redução no ganho de peso, na produção de lã ou na produção leiteira de pequenos ruminantes, deficiênciasnos índices reprodutivos do rebanho, além dosgastos com tratamento e honorários veterinários e morteocasional de animais (GUIMARÃES, A.D.S., BORGES, F., PAULETTI, R.B. et al. Caseous Lymphadenitis: epidemiology, diagnosis and control. The IIOAB Journal, v. 2, n. 2, p. 33-43, 2011).

[004] Uma vez estabelecida a doença nos rebanhos, sua erradicação é difícil, mas pode ser tentada através do descarte de todos os animais com sinais clínicos, bem como dos animais positivos nos testes sorológicos. Contudo,é praticamente imposível estabelecera situação sanitária real do rebanho devido à rápida disseminação do agente e pela dificuldade de identificar animais que apresentam a forma subclínica da doença(O’REILLY, K.M., MEDLEY, G.F., GREEN, L.E. The control of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in sheep flocks: a mathematical model of the impact of vaccination, serological testing, clinical examination and lancing of abscesses. Prev. Vet. Med., v. 95, n. 1-2, p. 115-26, 2010;GUIMARÃES, A.D.S., BORGES, F., PAULETTI, R.B. et al. Caseous Lymphadenitis: epidemiology, diagnosis and control. The IIOAB Journal, v. 2, n. 2, p. 33-43, 2011).

[005] Assim, diante da dificuldade de erradicação, medidas profiláticas são decisivas no controle da doença, taiscomo evitar nos estábulos objetos que possam provocar lesões cutâneas nos animais, realizar a desinfecção de baias e outros equipamentos contaminados com desinfetantes comuns como iodo, amônia quaternária ou hipoclorito, e manter cuidados com a higiene na tosquia e corte da cauda (MOTTA, R.G., CREMASCO, A.C.M., RIBEIRO, M.G. Infecções por Corynebacterium pseudotuberculosis em animais de produção. Vet. e Zootec., v. 17, n. 2, p. 200-213, 2010).

[006] O tratamento convencional da LC consiste na drenagem e cauterização química dos abscessos utilizando solução de iodo. Este tratamento visa diminuira contaminação do ambiente, não sendo todaviasuficiente para erradicar a doença em rebanhos como problema (NOZAKI, C.N., FARIA, M.A.R., MACHADO, T.M.M. Extirpação cirúrgica dos abscessos. Arq. Inst. Biol., v. 67, n. 2, p. 187-189, 2000). Outra abordagem terapêutica para a linfadenite caseosa é a antibioticoterapia, pois o C. pseudotuberculosispossui sensibilidade in vitro a muitos antibióticos, no entanto, este método não apresenta eficiência. Isso se deve provavelmente às barreiras impostas pela espessa cápsula de tecido conjuntivo que reveste os abscessos, ao conteúdo caseoso denso no interior dos piogranulomas, e à formação de biofilmes, que dificultam a entrada dos antibióticos. Assim, a ineficácia e os altos custos do tratamento com antibióticos tornam esta um opção inviável para o produtor (BAIRD, G.J., FONTAINE, M.C. Corynebacterium pseudotuberculosis and its Role in Ovine Caseous Lymphadenitis. Journal of Comparative Pathology. 137. p. 179-210, 2007).

[007] Diante então dos métodos de tratamento geralmente ineficazes e onerosos, a melhor possibilidade de estratégia para controle e prevenção da LC seria a vacinação(GUIMARÃES, A.D.S., BORGES, F., PAULETTI, R.B. et al. Caseous Lymphadenitis: epidemiology, diagnosis and control. The IIOAB Journal, v. 2, n. 2, p. 33-43, 2011).Algumas vacinas comerciais para a LC já estão disponíveis e foram licenciadas em alguns países. A Glanvac®,consiste em uma vacina de toxóide que utiliza a fosfolipase D (PLD) de C. pseudotuberculosis inativada por formalina, combinada com antígenos deClostridium. Essa vacina foi capaz de elevar a proteção, bem como reduzir as lesões da doença. Outra vacina comercial disponível é a Caseous D-T®, que contem toxóides clostridianos e uma combinação de toxóide e bacterina de C. pseudotuberculosis. A Caseous D-T® foi capaz de conferir proteção contra infecção experimental em ovinos e reduzir a incidência de lesões internas e externas (BAIRD, G.J., FONTAINE, M.C. Corynebacterium pseudotuberculosis and its Role in Ovine Caseous Lymphadenitis. Journal of Comparative Pathology. 137. p. 179-210, 2007) .No Brasil, a Linfovac®, foi comercialmente licenciada para uso desde 2000, e já foi capaz de proteger até 83,3% de caprinos infectados experimentalmente. A Linfovac® consiste em uma vacina atenuada de C. pseudotuberculosis, derivada da cepa 1002 e é baseada em uma cepa naturalmente pouco virulenta isolada em 1971(DORELLA, F.A., PACHECO, L.G.C., SEYFFERT, N. et al. Antigens of Corynebacterium pseudotuberculosis and prospects for vaccine development. Expert Rev. Vaccines, v. 8, n. 2, p. 205-213, 2009).

[008] No entanto, o uso das vacinas atualmente disponíveis não elimina a doença, apenas reduzem a incidência e a severidade dos sinais clínicos.Adicionalmente apresentam alguns problemas como: eficiência diferente em ovinos e caprinos, necessidade de revacinação a cada 6 meses, elevado custo, proteção apenas parcial, além dos efeitos colaterais, mais intensos em caprinos como febre, redução na produção de leite e lesões no local da inoculação da vacina(DORELLA, F.A., PACHECO, L.G.C., SEYFFERT, N. et al. Antigens of Corynebacterium pseudotuberculosis and prospects for vaccine development. Expert Ver. Vaccines, v. 8, n. 2, p. 205-213, 2009).

[009] Uma das principais dificuldades que limitam o desenvolvimento de vacinas é aidentificação ou seleção de antígenos protetores (SMITH, D.B., K.M. DAVERN, P.G. BOARD, W.V. et al. The Mr 26,000 antigen of Schistosoma japonicum recognised by resistant WEHI 129/J mice is a parasite glutathione S- transferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA n.83, p.8703-8707, 1986).O advento do sequenciamento e os avanços em bioinformática revolucionaram o estudo de patogênese bacteriana, permitindo selecionar possíveis candidatos vacinais a partir da informação genômica (MORA, M., DONATI, C., MEDINI, D. Microbial genomes and vaccine design: refinements to the classical reverse vaccinology approach. Current Opinion in Microbiology, v. 9, p. 532-536, 2006). Desta forma, surgiu então a Vacinologia Reversa, que utiliza o genoma de um patógeno para analisar a sequência de todos os possíveis genes expressos no seu ciclo de vida. Atualmente, a disponibilidade de vários genomas permite a identificação de diferenças e similaridades genéticas entre genomas da mesma espécie (SANTOS, A.R., CARNEIRO, A., GALA- GARCÍA, A. et al. The Corynebacterium pseudotuberculosis in silico predicted pan-exoproteome. BMC genomics, v. 13, Suppl. 5, p. S6, 2012).

[010] Por meio da Vacinologia Reversa, todas as fases de leitura abertas (ORF’s) do genoma podem ser avaliadas usando um programa de computador para determinar sua habilidade como um candidato vacinal, dando especial atenção a proteínas exportadas, já que essas são essenciais na interação patógeno- hospedeiro (SANTOS, A.R., CARNEIRO, A., GALA-GARCÍA, A. et al. The Corynebacterium pseudotuberculosis in silico predicted pan- exoproteome. BMC genomics, v. 13, Suppl. 5, p. S6, 2012).

[011] Portanto, as vacinas recombinantes de subunidade, produzidas a partir da tecnologia do DNA recombinante, estão sendo uma opção cada vez mais estudadas na busca de novas vacinas. A identificação de antígenos envolvidos na indução de imunidade protetora e o isolamento do gene que codifica para essas proteínas tornaram possível a produção de quantidades de antígenos suficientes para composição de vacinas, inclusive em escala comercial. Através desta tecnologia tornou-se possível transferir um gene que codifica para um antígeno, responsável pela indução de uma resposta imune suficiente para a proteção, para um hospedeiro não patogênico, o que resulta em uma produção de antígeno segura e geralmente mais eficiente. Após esse processo de produção, a proteína de interesse pode ser purificada, reduzindo a quantidade de contaminantes no produto final, tornando o produto ainda mais seguro. Os procedimentos de produção e purificação podem ser cuidadosamente planejados para a obtenção de um alto rendimento, bem como de um produto bem definido, reduzindo os custos de produção (ANDERSSON, C. Production and delivery of recombinant subunit vaccines. Department of Biotechnology, Royal Institute of Technology (KTH), Stockholm, Sweden. 2000. 92p.). Entretanto, a maioria dos antígenos recombinantes apresentam uma imunogenicidade fraca quando administrados sozinhos, sendo necessária a co- administração com adjuvantes para elicitar uma resposta imune protetora e de longa duração (LEITE, L.C.C., NASCIMENTO, I.P. Recombinant vaccines and the development of new vaccine strategies. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 45, n. 12, p. 1102-1111, 2012).

[012] Apenas algumas vacinas recombinantes de subunidade já foram produzidas e testadas contra a LC.Uma vacina formulada com PLD inativada geneticamente através da substituição de um resíduo de serina por histidina dentro do sítio ativo da enzima foi capaz de proteger 44% de ovinos contra o desafio com C. pseudotuberculosis (HODGSON, A.L.M., CARTER, K., TACHEDJIAN, M.Efficacy of an ovine caseous lymphadenitis vaccine formulated using a genetically inactive form of the Corynebacterium pseudotuberculosis phospholipase D. Vaccine, n. 17, p. 802-808, 1999). A imunização de camundongos BALB/c com a proteína recombinante Hsp60 (rHsp60), foi capaz de induzir uma resposta de IgG anti-Hsp60 significativa, com produção maior de IgG1, que IgG2a. No entanto, apesar dos níveis também elevados de interferon gama (IFN-y), todos os animais morreram dentro de duas semanas após o desafio com cepa virulenta de C. pseudotuberculosis. Os animais desenvolveram abscessos e outros sinais da doença (PINHO, J.M.R., DORELLA, F.A., COELHO, K.S. et al.Immunization with recombinant Corynebacterium pseudotuberculosis heat-shock protein (Hsp)-60 is able to induce an immune response in mice, but fails to confer protection against infection. Open Vet. Sci. J., v. 3, p. 22-27, 2009). A serina protease CP40 recombinante (rCP40) de C. pseudotuberculosis, foi testada em camundongos associada ao adjuvante saponina, e demonstrou propriedades imunogênicas, induzindo uma produção significativa de anticorpos IgG2a após o desafio com cepa virulenta, bem como uma taxa de proteção de 90% (SILVA, J.W., DROPPA-ALMEIDA, D., BORSUK, S. et al.Corynebacterium pseudotuberculosis cp09 mutant and cp40 recombinant protein partially protect mice against caseous lymphadenitis. BMC Vet. Res., v. 10, p. 1-8, 2014). A rCP40 também já foi testada com o adjuvante completo de Freund, gerando uma taxa de proteção menor, de 60% (DROPPA-ALMEIDA, D., VIVAS, W.L.P., SILVA, K.K.O. et al. Recombinant CP40 from Corynebacterium pseudotuberculosis confers protection in mice after challenge with a virulent strain. Vaccine, v. 34, p. 10911096, 2016). Entretanto, até o momento, nenhum outro antígeno recombinante de C. pseudotuberculosis foi produzido para constituir outras formulações vacinais.

[013] Estudos de genômica do C. pseudotuberculosis e dos determinantes moleculares de sua virulência tem facilitado a busca por novosantígenos para fins vacinais e diagnóstico e novos alvos antimicrobianos.A partir do sequenciamento de linhagens de C. pseudotuberculosis identificou-se alvos importantes e promissores para o desenvolvimento de vacinas e diagnóstico. Com o resultado do sequenciamento e da análise proteômica complementar foram identificados vários alvos, dentre eles pode-se citar o gene cp1002_0369, que foi identificado inicialmente como um pseudogene (RUIZ, J.C., D’AFONSECA, V., SILVA, A. et al. Evidence for reductive genome evolution and lateral acquisition of virulence functions in two Corynebacterium pseudotuberculosis strains. Plos One, v. 6, n. 4, 2011). Porém, em estudo posterior in silico onde se fez a comparação entre os genomas de cinco cepas de C. pseudotuberculosis (1002, C231, I19, FRC41 e PAT10), o produto do gene cp1002_0369foi identificado através de um estudo de exoproteoma in vitro (SANTOS, A.R., CARNEIRO, A., GALA-GARCÍA, A. et al. The Corynebacterium pseudotuberculosis in silico predicted pan-exoproteome. BMC genomics, v. 13, Suppl. 5, p. S6, 2012). No ano de 2015, o genoma da cepa 1002 de Corynebacterium pseudotuberculosis, depositado no GeneBank sob o número de acesso CP001809.2, foi reanotado e o gene cp1002_0369passou a se chamarcp1002_RS01850, tendo como produto uma fosfatase ácida, que possui 410aa (Sequência de Referência NCBI: WP_014400988.1; GI:504213886). O gene cp1002_RS01850 possui 1232pb e está posicionado no genoma da cepa 1002 entre os nucleotídeos 383874..385105(NCBI Genome. Corynebacterium pseudotuberculosis 1002, complete genome. Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/340539261. Acesso em: 29 de março de 2016).

[014] Apesar do gene da fosfatase ácida cp1002_RS01850 de C. pseudotuberculosis ter sido identificado, o seu produto, a proteína rCP01850 ainda não havia sido expressa utilizando tecnologia de DNA recombinante até a data do depósito desta patente. Somente algumas poucas proteínas recombinantes de C. pseudotuberculosis foram patenteadas.

[015] A patenteWO1990011351A1reivindica um método de purificação da toxina fosfolipase D (PLD) a partir do cultivo de C. pseudotuberculosis, bem o processo de clonagem do gene da toxina PLD e a expressão da PLD recombinante. A patente CA2078801A1 reivindica uma vacina viva atenuada, através da inativação do gene da PLD em uma cepa de C. pseudotuberculosis. O documento BR 1020140119477 reivindica a proteção do processo de produção da serina protease recombinante de 40kDa(rCP40) em cepas de expressão de E. coli. Outra patente, registrada sob o número PI1005625-4A2 refere-se à seleção, caracterização e utilização de 116 peptídeos recombinantes e motivos protéicos que mimetizam regiões antigênicas da bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis, que podem ser utilizados para vacinas ou diagnósticos para a linfadenite caseosa. Entretanto, o método de produção do antígeno rCP01850, sua caracterização e seu uso em composição vacinal ainda não havia sido descrito, nem sua proteção requerida.

[016] Pelo exposto, verifica-se a importância da presenteinvenção, que visa fornecer o antígeno recombinante rCP01850 como uma opção para a composição devacinas de subunidaderecombinante para a linfadenite caseosa. Este antígeno pode ser utilizado de forma isolada ou em associação com outros antígenos em formulaçõesvacinais, que podem conter aindaagentesadjuvantes imunoestimulatórios, em veículo excipiente ouestabilizante ou sistema veiculante de vacinafarmaceuticamente aceitáveis a preparações vacinais, com ou sem corretivos edulcorantes e corantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[017] A presente invenção tem por objetivo apresentar os processos produção e uso da proteína recombinante rCP01850 deCorynebacterium pseudotuberculosis em formulações vacinais. A proteína rCP01850 foi produzidaem E. coli, utilizando o vetor de clonagem e expressão pAE, para fins de utilização enquanto antígeno na composição de vacinas recombinantes de subunidade contra a linfadenite caseosa. Este antígeno pode ser utilizado isoladamente ou associado a outros antígenos, quer sejam provenientes da mesma espécie ou de outras espécies, na forma de vacinas combinadas, com o intuito de elevar os níveis de proteção contra a linfadenite caseosa em vacinas comerciais. São apresentadas ainda duas formulações vacinais utilizando como adjuvante a saponina e o adjuvante de própolis vermelha brasileira (APVB). O antígeno rCP1850 foi capaz de induzir níveis de proteção de até 70%, mas não estando limitado a este valor conforme a formulação vacinal utilizada, bem como de induzir anticorpos específicos anti-rCP01850, com proporções diferenciadas IgG1:IgG2a conforme o adjuvante utilizado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

[018] A presente invenção descreve a produção e uso da fosfatase ácida recombinante rCP01850 de C. pseudotuberculosispara utilização em formulações de vacinas recombinantes, visando conferir efetiva indução de resposta imune e taxa de proteção contra a linfadenite caseosa.

[019] O gene cp1002_RS01850 foi inicialmente anotado como cp1002_0369, tendo sido predito como um pseudogene. Entretanto, estudos posteriores de exoproteoma in vitro identificaram a proteína produto do gene cp1002_0369, descaracterizando o mesmo como um pseudogene. No ano de 2015, o genoma da cepa 1002 de C. pseudotuberculosis foi reanotado (Sequência de referência do NCBI: NC_017300.1) e o gene cp1002_0369passou a se denominarcp1002_RS01850 (tamanho de 1232pb), conforme descrito na SEQ ID NO:3 da listagem de sequências, que codifica para uma fosfatase ácida, com aproximadamente 410aa (Sequência de referência do NCBI: WP_014400988.1).

[020] Apesarda presente invenção basear-se em um gene naturalmente expresso pelo C. pseudotuberculosis, ela aborda a expressão de uma proteína heterólogaem sistema de expressão em E. coli, em sua integridade ou mesmo parcialmente, o que confere à invenção seu caráter patenteável, já que a mesma apresenta características de novidade, atividade inventiva e utilização industrial. Para que haja ainda suficiência descritiva do invento, os detalhes do invento serão descritos a seguir:

Cultivo de Corynebacterium pseudotuberculosis e Escherichia coli

[021] Para a realização deste invento, são utilizadas as cepas de C. pseudotuberculosis 1002 e Escherichia coliquimicamente competentes TOP10 e E. coli BL21 (DE3) Star. As cepas de C. pseudotuberculoissão cultivadas em meio “Brain Heart Infusion” (BHI) suplementado com 0,5% de Tween 80, a 37°C por 72 h sob agitação. Para as culturas em meio sólido, 1,5% de ágar bacteriológico são adicionados ao meio de cultura. As cepas de E. colisão cultivadas em meio Luria Bertani (LB) ou LB suplementado com 1,5% de ágar bacteriológico por 16 h a 37°C. Quando necessário são adicionados ao meio LB 100 μg/mL de ampicilina.

Amplificação do gene cp1002_RS01850 de C. pseudotuberculosis

[022] Para a amplificação do gene cp1002_RS01850são utilizados os primers Forward e Reverse, conforme descrito na SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 da listagem de sequências, respectivamente. Porém outros primers podem ser desenhados para anelar em outras regiões do gene cp1002_RS01850 (SEQ ID NO:3). Ao primer F foi adicionado um sítio da enzimas de restrição BamHI, já ao primer R, adicionou-se um sítio da enzimaHindIII, que foram usadas para a clonagem do fragmento amplificado no vetor pAE. Para a PCR são utilizados 50 ng de DNA genômico da cepa 1002 de C. pseudotuberculois, 10 μM de cada primer e Mastermix (Promega) num volume final de 50 μL. O Produto da PCR é corado com Blue Green (LGC Biotecnologia) e submetido a eletroforese em gel de agarosea 1% para a obtenção de um produto com 900pb, conforme demonstrado na Figura 1.

Clonagem do gene cp1002_RS01850 no vetor pAE

[023] Após a amplificação do genecp1002_RS01850, o mesmo é clonado no vetor de expressão pAE (RAMOS, C.R., ABREU, P.A., NASCIMENTO, A.L., HO, P.L. A high-copy T7 Escherichia coliexpression vector for theproductionofrecombinantproteinswith a minimal N-terminal His-taggedfusionpeptide, Braz. J. Med. Biol. Res., v.37, p.1103-1109, 2004), que possui o promotor induzível da T7 RNA polimerase, marcador de seleção para ampicilina e confere à proteína uma cauda de 6 aminoácidos histidina. Para isso, o gene e o vetor são digeridos com as enzimas de restrição BamHI e HindIII (Fermentas), de acordo com recomendações dos fabricantes. Posteriormente, o gene cp1002_RS01850é ligado ao vetor pAE com o auxílio da enzima T4 DNA ligase (Fermentas), dando origem ao plasmídeo recombinante pAE/cp1002_RS01850 (Figura 2) contendo a CDS da proteína recombinante rCP01850 (SEQ ID NO:2), que é então utilizado para a transformação por eletroporação decélulas de E. coli TOP 10 eletrocompetentes (capacitância de 25μF, resistência de 200 OHMs e voltagem de 2,5 kV). O produto da transformação é cultivado em meio LB com 100 μg/mL de ampilicina por 16 h a 37°C. O plasmídeo pAE/cp1002_RS01850é então extraído dessas células com o auxílio do kit Illustra PlasmidPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare®), e submetido a uma digestão dupla com BamHI e HindIII. As amostras são analisadas em gel de agarose a 1% para confirmar a presença e o tamanho do inserto(Figura 3).

Expressão da fosfatase recombinante rCP01850 em E. coli

[024] Células da linhagem de expressão E. coli BL21 Star são então transformadas por choque térmico com o plasmídeo recombinante pAE/cp1002_RS01850. A indução da expressão se dá pela adição de 1 mM de IPTG e incubação do cultivo em agitador orbital a 37°C por 3 h. A rCP01850 é expressa em corpos de inclusão em E. coli BL21 Star e são solubilizadas em uréia a 8 M. A purificação é realizada por cromatografia de afinidade em coluna de sepharose (HisTrap™), carregada com níquel. A pureza das mesmas é determinada através de um SDS-PAGE 12% (Figura 4) e a concentração determinada pelo kit BCA (Pierce), de acordo com as recomendações do fabricante.O rendimento obtido após a purificação e re-folding da rCP01850 foi de aproximadamente 6.0 mg/mL. A rCP01850 gerada no presente invento (SEQ ID NO:1) é constituída por 307aa e possui tamanho aproximado de 33,5kDa, apresenta ponto isoelétrico de 6,44 e carga de -2,9 no pH 7,0, porém outros parâmetros podem ser obtidos conforme osprimers utilizado na amplificação do gene, e, consequentemente, conforme o fragmento do gene clonado.Um Western blot para determinar a identidade da proteína rCP018509 utilizando anticorpo monoclonal anti-6Xhistag é realizado. Para isso, as amostras contendo rCP01850são misturadas com tampão (100-mM Tris-HCl t pH 6.8, 100-mM 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol) sob condições redutoras e aquecidas a 100°C durante 10 min e, submetidas a eletroforese em gel SDS-PAGE 12%. Posteriormente é realizada transferência para membrana de nitrocelulose (GE Healthcare), que após 2 h, é bloqueada com PBS contendo 5% de leite desnatado durante 1 h a 37°C. Em seguida, adiciona-se anticorpo monoclonal anti-6Xhistag (Sigma-Aldrich) à membrana na diluição de 1:4000 a 37°C durante 1 h. As membranas são lavadas com PBS tween 0,05% (PBS-T), e incubadas com anticorpos anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich) diluído a 1:4000 em PBS-T a 37°C durante 1 h. As bandas reativas são reveladas utilizando 3,3'- diaminobenzidina (DAB) e H2O2. A identidade da fosfatase ácida recombinante rCP01850 pode ser confirmada, conforme visualizado na Figura 5 através de uma banda reativa no tamanho aproximado de 33,5kDa.

Formulações vacinais contendo a rCP01850 e o adjuvante de própolis vermelha brasileira (APVB) ou saponina e seu uso

[025] A própolis vermelha brasleiira (PVB) utilizada na descrição do presente invento foi obtida no município de Brejo Grande, SE (S 10°28'25'' e W 36°26'12''). Para a produção doAPVB, 1 g de própolis vermelha bruta seca são misturadas a 10 mL de etanol 70% (diluído em água destilada, v/v), em uma proporção de 1:10. A mistura é então homogeneizada através de um agitador, por um período de 24h, e filtrada em filtro de papel. O material filtrado é disposto em placa de petri até a completa secagem do material e formação de uma crosta vermelha sobre a placa. Após a evaporação, um pó vermelho fino é obtido através da raspagem da crosta, e um rendimento variável médiode 35,25%é obtido.

[026] Para uso da PVB como adjuvante, esse pó é reconstituído em PBS para produzir solução estoque de própolis na concentração de 40 mg/mL. Então,um homogeneizador ultrassônico (disruptor) portátil, programável, potência de 20Khz é utilizado para homogeneizara solução de própolis através de 4 pulsos de 15s, sob refrigeração a 4°C. Após esse procedimento, o APVB pronto para uso ou para ser armazenado a 4°C até o uso na formulação da vacina. Cada dose de vacina contém 50μg de proteína rCP01850 e 1mg de APVB em um volume final de 300μL, embora não esteja limitado a estes valores, que permanecem sob agitação a 4°C por pelo menos 1h antes da administração.

[027] O adjuvante saponina foi produzido a partir da Saponina de Quillaja saponariapara biologia molecular (Sigma- Aldrich). O adjuvante foi preparado em uma solução estoque de 150 mg/mL de saponina dissolvida em solução salina a 0,9%, seguindo-se à filtração em membrana com poros de 0,22μm. No dia da imunização, a solução estoque de saponina é adicionada em uma quantidade de 7,5μg/dose a 50μg da proteína rCP01850 em um volume final de 300μL, embora não esteja limitado a estes valores. Esta mistura é agitada a 4°C por pelo menos 1h antes da administração.

[028] As vacinas produzidas segundo a presente invenção são preferencialmente administradas por via parenteral (subcutânea ou intramuscular). Outras vias de administração como, mas não limitadas a, intranasal, intravaginal, transdérmica ou oral também podem ser utilizadas, dependendo da substâncias antigênica e também dos co-formulantes.

[029] Os exemplos a seguir demonstrarão que vacinas produzidas a partir da fosfatase ácida recombinante rCP01850 são capazes de induzir elevados níveis de anticorpos específicos, além de taxas de proteção de até 70%, mas não estão limitadas a este valor, conforme combinação de adjuvantes ou de antígenos utilizadas na composição da vacina. Por isso, a rCP01850é considerada um potencial alvo para ser utilizado em formulações vacinais para a linfadenite caseosa.

Breve Descrição das Figuras

[030]Figura 1 - Reação em cadeia da polimerase (PCR) do fragmento do gene cp1002_RS01850 de C. pseudotuberculosis demonstrando uma banda amplificada no tamanho de 900 pb: (1) Marcador Molecular 1Kb Plus DNA Ladder® (Invitrogen); (2) amplificação do genecp1002_RS01850demonstrada pela visualização de fragmento de aproximadamente 900pb.

[031]Figura 2 - Mapa do vetor pAE/cp1002_RS01850 construído.

[032]Figura 3 - Caracterização dos recombinantes por digestão enzimática utilizando as enzimas BamHI e HindIII: (1) Marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen); (2) plasmídeo recombinante pAE/cp1002_RS01850 após digestão. A seta demonstra uma banda com altura de aproximadamente 888 pb, referente à liberação do inserto cp1002_RS01850 clonado.

[033]Figura 4 - SDS-PAGE a 12% da fosfatase ácida recombinante rCP01850 de C. pseudotuberculosisapós a purificação em coluna de afinidade ao níquel:(1) Marcador Pré- corado PageRuler® Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher); (2) fosfatase ácida recombinante rCP01850 de C. pseudotuberculosis com aproximadamente 33,5kDa.Coloração Comassie Blue.

[034]Figura 5 - Western Blot utilizando anticorpo monoclonal anti-6Xhis Tag (Sigma): (1) Marcador Pré-corado PageRuler® Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher); (2) fosfatase ácida recombinante rCP01850 de C. pseudotuberculosis. A banda reativa demonstra a identidade da rCP01850 no tamanho de aproximadamente 33,5 kDa.

[035]Figura 6 - Curva de sobrevivência demonstrando os níveis de proteção imunológica das vacinas recombinantes de subunidade formuladas com a fosfatase ácida recombinante rCP01850 de C. pseudotuberculosisapós o desafio com a cepa virulenta MIC-6.aGrupos com letras diferentes sobrescritasindicam resultado significativamente diferente no teste exato de Fisher (p < 0,05). APVB - Adjuvante de própolis vermelha brasileira

[036]Figura 7 - Avaliação dos níveis de IgG total (A), IgG1 (B) e IgG2a (C) específicas em camundongos imunizados com formulações vacinais contendo a fosfatase ácida recombinante rCP01850 de C. pseudotuberculosis em associação com diferentes adjuvantes. Os resultados estão apresentados como média e desvio padrão (barras) das absorbâncias (nm) encontradas no ensaio de ELISA indireto para cada grupo experimental. O sangue foi coletado e avaliado nos dias 0, 21 e 42 após a 1a imunização. aLetras diferentes dentro de um mesmo dia indica resultado significativamente diferente (p < 0,05). APVB - Adjuvante de própolis vermelha brasileira.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 — EFEITO PROTETOR DA FOSFATASE ÁCIDA RECOMBINANTE rCP01850 EM FORMULAÇÕES DE VACINAS RECOMBINANTES DE SUBUNIDADE CONTRA O DESAFIO COM CEPA VIRULENTA DE C. pseudotuberculosis

[037]Os procedimentos descritos a seguir serão utilizados para a avaliar o potencial protetor do antígeno rCP01850 em vacinas recombinantes de subunidade contra linfadenite caseosa, em associação com dois diferentes adjuvantes. Como antígeno vacinal é utilizada a quantidade de 50μg da rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis por dose de vacina.A produção desta proteína em cepas de expressão de Escherichia colie a formulação vacinal com os adjuvantes APVB e saponina já foram descritas e estão presentes na seção “Descrição detalhada do invento”

[038]A condução do experimento foi aprovada pela comissão de ética em experimentação animal da Universidade Federal de Pelotas (CEEA/UFPel n° 2442). Para avaliação do potencial protetor da rCP01850 como antígeno vacinal foram realizados experimentos de imunização e desafio em camundongos Balb/c, fêmeas, com 6 a 8 semanas de idade, divididos em 4 grupos contendo 10 animais, conforme descritos a seguir.

[039]Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente entre os seguintes grupos: G1, inoculado com solução salina a 0,9%, como controle negativo; G2, inoculado com a bacterina produzida a partir do cultivo da cepa 1002 de C. pseudotuberculosis contendo 106 UFC/mL, como controle positivo; G3, inoculado com a proteína rCP01850 associada a 1mg do APVB; e, G4,inoculado com a rCP01850 associado a 7,5 μg de saponina.Os grupos G1, G3 e G4 foram inoculados com um volume final de 300 μL, por via subcutânea. O grupo G2foi inoculado com um volume de 100 μL, por via intraperitoneal. Os animais foram imunizados com 2 doses da vacina com intervalo de 21 dias.

[040]Vinte e um dias após a última imunização, os animais foram desafiados com 1 mL contendo 104 UFC da cepa MIC-6 por via intraperitoneal. Após a realização do desafio, os animais foram acompanhados durante 30 dias.A cepa patogênica de C. pseudotuberculosis MIC-6 foi cultivada em meio Brain and Heart Infusion Broth(CALDO BHI) ou BHI-Ágar a 37 °C por 48 h sob agitação.

[041]Para a análise estatística, o teste exato de Fisher e o teste log-rank foram usados para determinar diferenças significativas (p < 0,05) na mortalidade e taxa de sobrevivência, respectivamente, entre os grupos experimentais.

[042]Ao final dos 30 dias de acompanhamento, observou-se uma taxa de proteção significativanos grupos em que a rCP01850 foi administrada, onde sua associação com a saponina resultou em uma taxa de 60% de proteção e a associação com o APVB, gerou 70% de proteção contra o desafio com a cepa MIC-6 (Figura 6). Embora o uso da bacterina tenha resultado em 100% de proteção, essa taxa não foi diferente estatisticamente dos grupos G3 e G4, em que se usou a rCP1850 como antígeno vacinal. Esses resultados promissores demonstram o grande potencial do uso da fosfatase ácida recombinante em formulações vacinais contra a linfadenite caseosa.

EXEMPLO 2 — CAPACIDADE DA rCP01850 NA INDUÇÃO DA PRODUÇÃO DE ANTICORPOSIgGTOTAL, IgG1 e IgG2a

[043]Para avaliar se o uso da rCP01850 em formulações vacinais é capaz de aumentar a produção de anticorpos específicos, foram realizados ensaios de ELISA indireto com os soros obtidos dos animais dos grupos G1 a G4 (conforme Exemplo 1), para a mensuração dos níveis de IgG total e também dos isótipos IgG1 e IgG2a.Neste exemplo especificamente, avaliamos a capacidade de produção de anticorpos contra a proteína recombinante rCP01850. As coletas de sangue foram realizadas por meio da punção das veias do plexo retro-orbital nos dias 0 (antes da imunização), 21 e 42 pós-imunização. O sangue foi armazenado em eppendorfs e centrifugado a 3.500 rpm durante 15 minutos. O soro foi então extraído e utilizado para a realização do ELISA.

[044]Placas de 96 cavidades de fundo chato (Maxisorp-Nunc) foram sensibilizadas com 100 μL da solução contendo tampão carbonato bicarbonato pH 9,6 e 0,1 μg/cavidade da proteína recombinante rCP01850. As placas foram então incubadas a 4°C por 18 horas. Após, as placas foram lavadas com PBS-T (PBS 1X pH 7.4; 0,1% de Tween 20) e bloqueadas com 200 μL/ cavidade de PBS- T20 e 5% de leite desnatado por duas horas, a 37°C. Após o bloqueio, a placa foi lavada com PBS-T. Foram adicionados 100 μL/cavidade das amostras dos soros de camundongos, na diluição de 1:50 em duplicatas. Após uma hora de incubação a 37°C e 3 lavagens com PBS-T, foram adicionados 100 μL/ cavidade dos anticorpos anti-IgGTotal de camungondo (Sigma-Aldrich) na diluição 1:5.000. Nas placas para detecção dos isotipos IgG1 ou IgG2a (Sigma-Aldrich), anticorpos anti-IgG1 ou anti-IgG2a de camundongo produzido em cabra foram adicionados nas diluições 1:5.000 e 1:2.000 respectivamente, seguindo-se incubação por 1 hora e após 5 lavagens com PBS-T. Para as placas dos isotipos, uma etapa adicional foi realizada antes da revelação, onde em cada cavidade foi acrescido anticorpo anti-cabra conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich) na diluição de 1:5000. Após uma hora de incubação a 37°C e 5 lavagens com PBS-T, 100 μL/poço de solução reveladora [200pmoles ortofenilenodiamina (OPD, Sigma- Aldric) diluído em 50 mL de tampão citrato-fosfato pH 5 e 0,05% H2O2] foram adicionados. A reação foi interrompida pela adição de 50 μL/poço da solução de parada contendo ácido sulfúrico 4 N. A absorbância foi medida a 492nm utilizando um leitor de placas de ELISA (Mindray).

[045]As análises estatísticas foram feitas usando o software GraphPad Prism versão 6.0 para Windows (GraphPad Software,USA). Diferenças entre a produção de IgG nos diferentes grupos foram calculadas pelo one-way ANOVA, seguido pelo pós-teste de Tukey. Os dados foram considerados estatisticamente significativos quando p < 0.05.

[046]Ao analisar os dados obtidos no ELISA (Figura 7),observou-se uma elevação dos níveis de IgGanti-rCP01850 (Figura 7A, 7B e 7C) demonstraram-se gradualmente crescente ao longo dos dias para os grupos G3 e G4, em que foram administradas formulações contendo a fosfatase ácida recombinante. Ainda, animais dos grupos G3 e G4 apresentaram uma produção de IgG total significativamente maior (p < 0,05) em relação aos controles no dia 42, porém demonstraram-se estatisticamente iguais neste dia.

[047]Em relação aos isótipos IgG1 (Figura 7B) e IgG2a (Figura 7C), observou-se que já no dia 21, em que se administrou a rCP01850 associada a saponina (G3) demonstrou as maiores absorbâncias em relação a todos os outros grupos (p < 0,05), perfil este que continuou a ser observado no dia 42. Entretanto, houve um aumento significativo (p < 0,05) no dia 42 das absorbânias do G4 (administração da rCP1850 associada ao APVB) em relação aos controles, embora tenha ainda ficado abaixo dos níveis alcançados pelo G3. Um dados também observado na Figura 7 é que, para o G3, os níveis de IgG2a foram um pouco maiores que os níveis de IgG1 para todos os grupos experimentais, o que pode indicar uma tendência e polarização da resposta imunológica para Th1, quando o antígeno rCP01850 associado à saponina é utilizado na composição da vacina. Já os níveis de IgG1 e IgG2a para o G4 apresentaram-se bastante similares, o que pode apontar para uma resposta do tipo mista Th1/Th2, ao se formular a vacina utilizando o APVB.

[048]A análise dos níveis de IgG1 e IgG2a em camundongos permite avaliar o perfil imunomodulatório induzido por uma vacina. Imunoglobulinas do tipo IgG1 são importantes na neutralização de patógenos extracelulares, sendo induzidas principalmente por células do tipo Th2. Já o isótipo IgG2a é induzido por citocinas produzidas por células Th1, associadas à uma resposta a patógenos intracelulares por meio da ativação de macrófagos ou linfócitos T citotóxicos (VISCIANO, M.L., TAGLIAMONTE, M., BUONAGURO, F.M. et al. Effects of adjuvants on IgG subclasses elicited by virus-like Particles. J. Transl. Med., v.10, n.4, 2012).

Claims (8)

1. Fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis caracterizada por consistir de proteína recombinante contendo sequência completa de aminoácidos descrita na SEQ ID NO:1 e cauda de polihistidina acoplada na porção N-terminal inserida por engenharia genética a partir da clonagem total ou parcial do gene cp1002_RS01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis em vetor pAE (conforme sequência SEQ ID NO:3).

2. Fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por consistir de proteína recombinante (descrita na sequência SEQ ID NO:1) produzida a partir de um sistema de expressão heterólogo.

3. Fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser produzida a partir da cepa de expressão E. coli (DE3) BL21 Star.

4. Fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis, de acordo com as reivindicação de 1 a 3, caracterizada por possuir 307 aa e tamanho molecular aproximado de 33,5 kDa, conforme apresentado na sequência SEQ ID NO:1.

5. Vacina recombinante de subunidade contendo a fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis, composta por antígeno recombinante definido nas reivindicações de 1 a 5, caracterizada por compreender em sua composição a proteína recombinante rCP01850 (conforme SEQ ID NO:1) associada ou não a outros antígenos recombinantes.

6. Vacina recombinante de subunidade contendo a fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender um adjuvante ou uma combinação de adjuvantes fisiologicamente aceitáveis, e poder conter um sistema de veiculação de vacinas, como veículos estabilizantes, excipientes ou intermediários, além de corretivos e outros aditivos.

7. Vacina recombinante de subunidade contendo a fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis, de acordo com as reivindicações 6 e 7, caracterizada por consistir da quantidade de 50 μg de rCP01850 associada a 7,5 μg de saponina, ou outra quantidade fisiologicamente aceitável.

8. Vacina recombinante de subunidade contendo a fosfatase ácida recombinante rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis, de acordo com as reivindicações 6 e 7, caracterizada por consistir de 50 μg de rCP01850 associada a 1 mg de adjuvante de própolis vermelha brasileira, ou outra quantidade fisiologicamente aceitável.