BR0008912B1 - uso de cepa cncm i-2116 de lactobacillus paracasei e composição alimentìcia ou farmacêutica compreendendo a mesma. - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE CE-PA CNCM 1-2116 DE LACTOBACILLUS PARACASEI E COMPOSIÇÃOALIMENTÍCIA OU FARMACÊUTICA COMPREENDENDO A MESMA".
A presente invenção se refere a novos microorganismos da fa-mília Lactobacillaceae, especialmente a microorganismos do gênero Lacto-bacillus, que são úteis na prevenção ou no tratamento da diarréia. Em parti-cular, a presente invenção refere-se ao uso dos ditos microorganismos paraa preparação de um suporte que pode ser ingerido e a uma composição quecontém o mesmo.
Os organismos que produzem o ácido láctico com um compo-nente metabólico principal são conhecidos há muito tempo. Estas bactériaspodem ser encontradas no leite ou nas fábricas de processamento do leite,respectivamente, em plantas vivas ou em decomposição mas também nointestino do ser humano e de animais. Estes microorganismos, resumidossob o termo "bactérias do ácido láctico", representam um grupo bastanteheterogêneo e compreendem por exemplo os gêneros Lactococcus, Lacto-bacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcusetc..
As bactérias do ácido láctico têm sido utilizadas como agentesde fermentação para a conservação de alimentos tomando como benefícioum pH baixo e a ação dos produtos de fermentação gerados durante a ativi-dade fermentativa dos mesmos para inibir o crescimento de bactérias dedecomposição. Para este fim, as bactéria do ácido láctico têm sido utilizadaspara preparar uma variedade de diferentes matérias alimentícias tais comoqueijo, iogurte e outros produtos diários fermentados do leite.
Bastante recentemente as bactérias do ácido láctico atraírammuita atenção pelo fato de que foi descoberto que algumas cepas exibempropriedades valiosas para o ser humano e para os animais após a ingestão.Em particular, foi descoberto que cepas específicas de Lactobacillus ou deBifidobacterium são capazes de colonizar a mucosa intestinal e de auxiliar amanter o bem estar do ser humano e do animal.
Neste aspecto, a EP O 768 375 divulga cepas específicas dogênero Bifidobacterium, que são capazes de se tornar implantadas na floraintestinal e podem se aderir às células intestinais, relata-se que estas Bifi-dobactérias auxiliam a imunomodulação, sendo capazes de excluir de formacompetitiva a adesão de bactérias patogênicas às células intestinais, aju-dando assim na manutenção da saúde do indivíduo.
Durante estes últimos anos a pesquisa foi também focalizada nouso potencial das bactérias do ácido láctico como agentes probióticos. Osprobióticos são considerados a ser preparações microbianas viáveis quepromovem a saúde do indivíduo pela conservação da microflora natural nointestino. Um preparação microbiana pode ser comumente aceita como umprobiótica no caso dos micróbios eficientes da mesma e do seu modo deação serem conhecidos. Estima-se que os probióticos atacam a mucosa dointestino, colonizam o trato intestinal e de forma similar previnem a adesãode microorganismos nocivos no mesmo. Um pré-requisito crucial para suaação reside no fato de que alcançam a mucosa do intestino de uma formaapropriada e viável e não são destruídos na parte superior do trato gas-trointestinal, especialmente pela influência do pH baixo prevalecente noestômago.
Neste aspecto, O WO 97/00078 divulga uma cepa específica,denominada Lactobacillus GG (ATCC 53103), como um probiótico. O micro-organismo é particularmente empregado em um método de prevenção ou detratamento de reações de hipersensibilidade induzida por alimentos pelofato de que é administrado a um receptor junto com um material alimentícioque foi submetido a um tratamento de hidrólise com pepsina e/ou tripsina. Acepa de Lactobacillus selecionada é descrita como exibindo propriedadesadesivas e de colonização e mostrando um sistema de enzima protease, deforma que o material protéico contido na matéria alimentícia a ser adminis-trada é adicionalmente hidrolisado através de proteases secretadas pelacepa de Lactobacillus específica. 0 método discutido neste documento deveconseqüentemente resultar na captação de material protéico pelo intestinoque não exibe mais uma quantidade substancial de material alergênico.
Ainda, na EP 0 577 903 faz-se referência ao uso de tais bactéri-as do ácido láctico que possuem a capacidade de substituir Heliobacterpylori, a causa conhecida para o desenvolvimento de úlcera, na preparaçãode um suporte pretendido para o tratamento terapêutico ou profilático deuma úlcera associada com a ação de Heliobacter pylori.
Sabendo-se que as cepas especiais de bactérias de ácido lácti-co podem fornecer propriedades valiosas há um desejo na técnica de cepasbacterianas adicionais do ácido láctico que sejam benéficas ao bem estardos seres humanos e/ou animais.
Conseqüentemente, um problema da presente invenção é for-necer cepas bacterianas adicionais que exibem novas propriedades benéfi-cas para o ser humano e/ou animais.
O problema acima foi resolvido pelo fornecimento de novos mi-croorganismos, a saber as bactérias do ácido láctico, pertencentes ao gêne-ro Lactobacillús que possuem as características de serem capazes de seaderirem a e essencialmente colonizarem a mucosa intestinal e prevenir ainfecção das células epiteliais intestinais por rotavírus.
De acordo com uma modalidade preferida as cepas de Lactoba-cillús são capazes de crescer na presença de até 0,4% de sais biliares, deforma que passam facilmente pelo trato gastrointestinal e permanecem es-sencialmente ativas.
De acordo com uma outra modalidade preferida a bactéria doácido láctico é selecionada do grupo que consiste em Lactobacillús rhamno-sus ou Lactobacillús paracasei, preferencialmente Lactobacillús paracasei eé mais preferencialmente Lactobacillús paracasei CNCM 1-2116.
Foi mostrado que os microorganismos da presente invençãoexibem as propriedades a seguir, são gram-positivas, catalase negativas,arginina na forma de NH3 negativos e negativos à produção de CO2. Produ-zem ácido láctico L(+), são capazes de crescer na presença de sais biliaresem uma concentração de até aproximadamente 0,4% e podem essencial-mente prevenir a infecção de células epiteliais por rotavírus.
Os novos microorganismos podem ser utilizados para a prepa-ração de uma variedade de materiais de suporte que podem ser ingeridos,tais como leite, iogurte, coalhada, leites fermentados, produtos fermentadoscom base em leite, produtos com base em cereais fermentados, pós combase em leite, fórmulas para bebês e podem ser incluídos nos suportes emuma quantidade de aproximadamente 105cfu/g até aproximadamente 1011cfu/g. Para a finalidade da presente invenção a abreviação cfu deve desi-gnar uma "unidade formadora de colônia" que é definida como o númerocélulas de bactéria como revelado pelas contagens microbiológicas nas pla-cas de ágar.
A presente invenção fornece ainda uma composição alimentíciaou farmacêutica contendo pelo menos uma das cepas de Lactobacillus quepossui as características acima.
Para a preparação de uma composição alimentícia de acordocom a presente invenção pelo menos uma das cepas de Lactobacillus deacordo com a presente invenção é incorporada em um suporte adequado,em uma quantidade de aproximadamente 105 cfu/g até aproximadamente1011 cfu/g, preferencialmente de aproximadamente 106 cfu/g até aproxima-damente 1010 cfu/g, mais preferencialmente de aproximadamente 107 cfu/gaté aproximadamente 109 cfu/g.
No caso de uma preparação farmacêutica o produto pode serpreparado na forma de comprimidos, suspensões bacterianas líquidas, su-plementos orais secos, suplementos orais úmidos, alimentação por tuboseco ou alimentação por tubo úmido etc., com a quantidade de cepas deLactobacillus a ser incorporada no mesmo estando na faixa de até 1012cfu/g, preferencialmente de aproximadamente 107 cfu/g até aproximada-mente 1011 cfu/g, mais preferencialmente de aproximadamente 107 cfu/g atéaproximadamente 1010 cfu/g.
A atividade dos novos microorganismos no intestino do indiví-duo é naturalmente dependente da dose. O que significa dizer, quanto maisnovos microorganismos são incorporados através da ingestão do materialalimentício ou da composição farmacêutica acima maior a atividade proteto-ra e/ou de cura dos microorganismos. Uma vez que os novos microorganis-mos não são prejudiciais à humanidade e aos animais e foram eventual-mente isolados de fezes de bebês, uma alta quantidade dos mesmos podeser incorporada de forma que essencialmente uma alta proporção do intes-tino do indivíduo será colonizada pelos novos microorganismos.Nas Figuras,
A Fig. 1 mostra um esquema ilustrando a seleção de cultura decélulas para avaliar as propriedades protetoras retrovirais de cepas bacteri-anas.
A Fig. 2 mostra a acidificação da cepa L. casei CNCM 1-2116(denominada ST11) em diferentes meios de crescimento.
A Fig. 3 mostra a taxa de sobrevivência da cepa L. casei ST11 a10°C medida durante 30 dias.
A Fig. 4 mostra o padrão de mRNA de IL-12 e IL-10 em célulasaderentes de camundongo derivadas da medula óssea após a incubaçãodas células com diluições seriadas de ST11.
A Fig. 5 mostra o resultado da diferenciação de Th2 como re-sultante da produção diminuída de IL-4.
Durante os estudos extensivos que conduzem à presente inven-ção os inventores investigaram fezes de bebês e isolaram uma variedade decepas bactérias diferentes destas. Estas cepas foram subseqüentementeexaminadas em relação a sua capacidade de prevenir infecção de célulasepiteliais por rotavírus que são conhecidos como causadores de diarréia.
Vários gêneros bacterianos compreendendo Lactobacillus,Lactococcus, Streptococcus foram investigados em relação as suas proprie-dades inibitórias aos rotavírus. Os testes para a propriedade inibitória eramessencialmente realizados com três sorotipos de rotavírus representando osagentes etiológicos principais da diarréia viral humana (sorotipos G1, G3 eG4).
As várias bactérias do ácido láctico foram crescidas em um meioadequado, tal como MRS, Hugo-Jago ou meio M17 a temperaturas de apro-ximadamente 30 a 40°C correspondendo a sua temperatura ótima de cres-cimento. Após atingirem o crescimento estacionário as bactérias foram co-letadas por centrifugação e foram ressuspensas em solução fisiológica deNaCl. Entre os diferentes testes as células bacterianas foram armazenadascongeladas (-20°C).
Os vários estoques de rotavírus foram preparados pela infecçãode monocamadas de células confluentes. Os rotavírus foram incubados an-tes da infecção. As células foram infectadas com 20 doses infecciosas decultura de tecido.
Para se avaliar as propriedades anti-rotavirais foram aplicadosdois protocolos diferentes. De acordo com um protocolo as várias cepasbacterianas foram examinadas em relação a sua interação direta com o ro-tavírus enquanto que no segundo protocolo as bactérias foram selecionadasem relação àquelas cepas que interagiam com os receptores celulares dorotavírus.
O primeiro protocolo envolvia o contato de cada uma respectivasuspensão bacteriana com uma cepa de rotavírus diferente e a incubaçãoem meios adequados. Subseqüentemente, a mistura vírus-bactéria foi apli-cada a uma monocamada de células indiferenciadas de adenoma de cólonhumano HT-29 e a incubação foi continuada. A replicação do vírus foi entãoanalisada.
O segundo protocolo envolvia a incubação da suspensão bacte-riana respectiva primeiro junto com uma monocamada de células indiferen-ciadas de adenoma de cólon humano HT-29 e a adição do vírus subse-qüentemente. Após a incubação continuada do vírus a replicação foi anali-sada.
A replicação do rotavírus pode ser facilmente avaliada pela co-loração histoimunológica das proteínas do rotavírus nas células infectadas.
Um efeito inibitório do rotavírus foi atribuído a uma certa bacté-ria quando o número de células infectadas foi reduzido em 90% na culturade células inoculada com o rotavírus junto com as bactérias indicadas emcomparação com as células inoculadas sozinhas com o rotavírus.
De um total de 260 cepas bacterianas diferentes isoladas podeser mostrado que somente 9 inibiam essencialmente a replicação retroviral.Foi confirmado que as diferentes bactérias pertencem ao gênero Lactobaci-llus subespécie rhamnosus ou paracasei. Uma cepa, denominada Lactoba-cillus casei ST11, que foi depositada de acordo com o Tratado de Buda-peste e recebeu o número de depósito NCC 2461 (1-2116), mostrou ser ex-tremamente eficaz na prevenção da infecção de células humanas por rotaví-rus. Além disso, esta cepa particular exibe excelentes propriedades de cres-cimento como pode ser mostrado pela acidificação em diferentes meios. Acepa exibe ainda bom desempenho em relação à taxa de sobrevivência du-rante o armazenamento a baixas temperaturas de aproximadamente 10°C,que a torna um excelente candidato para ser incluída na matéria alimentíciaou nas composições farmacêuticas que serão armazenadas em condiçõesde refrigeração.
Em adição às descobertas acima poderia ser ainda mostradoque as cepas exibem surpreendentemente ainda propriedades antialergêni-cas pelo fato de que as ditas cepas possuem um impacto na síntese de dife-rentes mediadores imunológicos.
Sabe-se geralmente que as respostas imunes humorais e asreações alérgicas são mediadas por células T CD4+ que carregam o fenóti-po do tipo 2 (Th2). As células Th2 são caracterizadas pela produção de al-tos níveis de interleucina 4 (IL-4), uma citocina requerida para a secreçãode IgE1 que é a classe de anticorpo principal envolvida nas reações alérgi-cas.
A diferenciação de células Th2 é impedida por IFN-γ, uma cito-cina particular que é produzida do subgrupo Th 1 mutuamente exclusivo decélulas T CD4+. As ditas células Th1 são por sua vez fortemente induzidaspela interleucina 12 (IL-12). Em contraste a esta foi mostrado que a IL-10,uma outra citocina, possui um forte impacto supressor sobre a proliferaçãode células Th1 e estima-se portanto que desempenhe uma função nos me-canismos imunossupressores.
Em resumo, tanto IL-12 quanto IL-10 possui efeitos modulatóriosfortes sobre o desenvolvimento de células T CD4+ pela influência do desen-volvimento do subgrupo Th1. IL-12 é uma citocina regulatória chave para aindução da diferenciação de Th1 e inibe assim a geração das respostas deTh2. Uma via principal para a inibição de células Th2 é portanto vista naestimulação da síntese de IL-12 por células acessórias.
É bem conhecido que alguns componentes das bactérias gram-negativas, tal como LPS1 induzem altos níveis de IL-12 em células aderen-tes, tais como macrófagos e células dendríticas. De forma coerente, foi des-coberto que as bactérias gram-negativas podem predispor fortemente a dife-renciação de células T CD4+ em direção ao fenótipo Th1.
O microorganismo ST11 como um exemplo das cepas de Lacto-bacillus da presente invenção tem sido testado em relação a uma funçãopotencial na indução de citocinas envolvidas na regulação da diferenciaçãode células T CD4+. Em particular, tem sido estudado o efeito de ST11 sobreo fenótipo de células T CD4+ sofrendo a diferenciação para Th2.
Em relação a isto a capacidade de ST11 de induzir a síntese demRNA que codifica estas duas citocinas regulatórias em células aderentesde camundongos derivadas da medula óssea foi comparada com a de ou-tras cepas de Lactobacilli e com um controle de bactérias gram-negativas(E. coli K12). O mRNA foi medido por RT-PCR semiquantitativo após 6 ho-ras de incubação das células com diluições seriadas de bactérias na faixade 109 a 107 cfu/mL.
Embora todas as cepas de Lactobacillus não pudessem induzira transcrição d$ mRNA de IL-12 até um certo grau, pode ser mostrado queST11 era o indutor mais forte, uma vez que um sinal de PCR forte pode serdetectado mesmo na dose bacteriana mais baixa. Na verdade, a capacidadede ST11 induzir a transcrição do mRNA de IL-12 era tão forte quanto a de E.coli. A indução do mRNA de IL-10 era em geral mais fraca que para o mRNAde IL-12, uma vez que somente em doses bacterianas maiores era possíveldetectar um sinal. Não obstante, ST11 foi o indutor mais forte do mRNA deIL-10, quando comparado aos outros Iactobatilli e ao controle de E. coli.
Assim, considera-se que ST11 seja eficiente na indução de cito-cinas imunorregulatórias envolvidas na diferenciação de células T CD4+.Sua grande capacidade de induzir IL-12 a torna um candidato para inibir asrespostas de Th2 e sua indução mensurável de IL-10 pode prevenir as res-postas inflamatórias.Em adição à descoberta acima foi ainda determinado se ST11possuía um efeito inibitório sobre as células T CD4+ que estavam sofrendodiferenciação de Th2 e um efeito positivo sobre funções de Th1. Foi utiliza-do um sistema de cultura para diferenciação celular bem estabelecido, ondecélulas T CD4+ precursoras foram ativadas policlonalmente e moduladaspara sofrer diferenciação Th1 ou Th2, dependendo do tipo dos co-estímulosfornecidos no meio de cultura. A diferenciação Th1/Th2 foi induzida duranteuma cultura primária de 7 dias, após a qual as células foram então reesti-muladas durante 2 dias em uma cultura secundária contendo meio sozinhoe a aquisição de um fenótipo específico (Th1 ou Th2) foi avaliada pela me-dida dos tipos de citocinas produzidas no sobrenadantes (IFN-γ vs. IL-4).
Sabe-se que as células T CD4+ precursoras de camundongosdo tipo BALB/c se diferenciam preferencialmente para predominar o fenótipoTh2 (IL-4 alto, IFN-γ baixo nos sobrenadantes de cultura secundária) após aativação sob condições neutras (meio sozinho na cultura primária). Este fe-nótipo poderia ser completamente revertido para um padrão de Th1 (IFN-γalto, IL-4 baixo) após a adição de um anticorpo monoclonal de bloqueio paraIL-4 na cultura primária.
Para investigar uma função potencial para ST11 na inibição deTh2, as células T CD4 precursoras purificadas de camundongos BALB/cforam ativadas na presença de células aderentes da medula óssea comocélulas acessórias durante a cultura primária. Estas células foram co-cultivadas seja no meio sozinho ou na presença de 1 mg/mL de LPS ou com108 cfu/mL de ST11 ou 108 cfu/mL de um outro Lactobacillus. Após este pe-ríodo, as células foram lavadas e as células T CD4+ foram purificadas maisuma vez e reestimuladas na cultura secundária no meio sozinho. As citoci-nas produzidas pelas células T CD4+ diferenciadas foram medidas após 2dias. Como esperado, as células diferenciadas na presença de meio sozi-nho exibiam um fenótipo Th2 dominante. A adição de ST11 às culturas pri-márias modulou fortemente o resultado da diferenciação de Th2, uma vezque isto resultou em uma diminuição de 8 vezes na produção de IL-4. Estainibição tinha magnitude similar à observada nas culturas derivadas de cé-lulas diferenciadas na presença de LPS. Em contraste, outras cepas deLactobacillus não possuíam impacto mensurável sobre os níveis de IL-4. Demaneira interessante, os níveis de IFN-γ não foram aumentados após a adi-ção de ST11 nas culturas primárias.
Em resumo, ST11 especificamente impediu a produção de IL-4por células T CD4+ sofrendo diferenciação para Th2, mas não diminuiu si-gnificativamente a secreção de IFN-γ. O fato de que ST11 não aumenta aprodução de IFN-γ pode ser devido a sua capacidade de induzir IL-10 com aconseqüência de que pode manter um baixo impacto inflamatório apesar desua atividade anti-Th2.
Em conseqüência, poderia ser mostrado que ST11 é uma cepade Lactobacillus que possui um bom perfil anti-Th2 que a torna um exce-lente candidato para uso como uma bactéria com atividade probiótica anti-alérgica.
A presente invenção será agora descrita como forma de exemplo.
Meios e soluções:
MRS (Difco),
Hugo-Jago (Tryptone Difco 30 g/L, Yeast Extract Difco 10 g/L, Lactose Difco
5 g/L, KH2PO4 5 g/L, Beef Extract Difco 2 g/L, ágar Difco 2 g/L)
M17 (Difco)
M199 (Seromed)
Solução de Ringer (Oxoid)
PBS (NaCI 8 g/L, KCI 0,2 g/L, Na2HPO41,15 g/L, KH2PO4 0,2 g/L)Caldo triptose fosfato (FIow)Solução de tripsina-EDTA (Seromed)
O rotavírus humano Wa (sorotipo G1) e o rotavírus de símiosSA-11 (sorotipo G3) foram obtidos de P.A. Offit1 Children's Hospital of Phila-delphia, U.S. O vírus DS-1xRRV reclassificado foi obtido de A. Kapikian,NIH Bethesda, U.S. O rotavírus humano Hochi sorotipo 4 foi obtido de P.Bachmann1 Universidade de Munique, Alemanha.Exemplo 1
Isolamento de bactérias do ácido láctico de fezes de bebês
Fezes frescas foram recolhidas de fraldas de 16 bebês saudá-veis de 15 a 27 dias de idade. 1 grama de fezes frescas foi colocado sobcondições anaeróbicas para o transporte para o laboratório e foram condu-zidas análises microbiológicas dentro de 2 horas a partir da amostragematravés de diluições seriadas na solução de Ringer e plaqueamento emmeios seletivos. MRS ágar junto com antibióticos (fosfomicina 80 μg/mL,sulfametoxazol 93 μg/mL, trimetoprima 5 μg/mL) incubado a 37°C durante48 horas foi utilizado para isolar as bactérias do ácido láctico. As colôniasforam colhidas aleatoriamente e foram purificadas. Foi realizada a caracteri-zação fisiológica e genética dos isolados.
Exemplo 2
Teste de cepas na cultura de células para a atividade antirotaviral
Vários gêneros de bactérias que compreendem Lactobacillus,Lactococcus, Streptococcus foram selecionados e testados em relação amembros que exibiram atividade anti-rotavírus no teste de inibição de cultu-ra de células. O gênero Lactococcus foi representado por uma única espé-cie (Lc. Iactis) que consiste em duas subespécies (Lc. Iactis subsp. Iactis ecremoris). Foi testado um total de 30 cepas. O gênero Streptococcus foi re-presentado por uma única espécie (S. thermophilus) com 45 cepas. Os gê-neros Leuconostoc e Propionibacterium foram representados somente poruma única espécie (6 cepas), enquanto que o gênero Enterococcus e Sta-phyloeoeeus foram representados por duas espécies cada um e um total de17 espécies.
No total, foram testadas 260 cepas bacterianas para a atividadeinibitória do rotavírus.10 protocolo:
30 μL de suspensão bacteriana (contendo em média 3x106bactérias) foram misturados com 70 μΙ_ de meio M199 suplementado comcaldo triptose fosfato 10% (FIow) e solução tripsina-EDTA 5% (Seromed)(diluída 1:4 no caso das células HT-29) e 100 μί de vírus em meio M199suplementado. A mistura vírus-bactéria foi incubada durante 1 hora a 4°C edurante 1 hora a 37°C. As células indiferenciadas HT-29 de adenoma decólon humano que crescem na forma de uma monocamada confluente emplacas de microtitulação de 96 cavidades foram lavadas três vezes com so-5 lução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,2). A mistura vírus-bactériafoi aplicada às células e as placas de microtitulação foram incubadas du-rante 18 h em uma incubadora contendo CO2 (Heraeus). A replicação viralfoi avaliada como descrito abaixo.2° protocolo:
30 μL de suspensão bacteriana (supra) foram misturados com
70 μL de meio M199 suplementado com caldo triptose fosfato 10% (FIow) esolução tripsina-EDTA 5% (Seromed) (diluída 1:4 no caso de células HT-29)e aplicados diretamente sobre as células nas placas de microtitulação. Apósuma hora de incubação a 37°C 100 μL de vírus no meio M199 suplementa-do foram adicionados às células nas placas de microtitulação. A incubaçãofoi continuada durante 18 h em uma incubadora contendo CO2 (Heraeus). Areplicação viral foi avaliada como descrito abaixo.
A replicação do rotavírus foi avaliada por coloração histoimuno-lógica das proteínas do rotavírus em células infectadas como descrito poste-riormente aqui.
Um dia após a infecção, o meio de cultura da célula foi descar-tado das placas de microtitulação e as células foram fixadas com etanol ab-soluto durante 10 minutos. O etanol foi descartado e as placas foram lava-das três vezes em tampão PBS. Então 50 μL de um soro anti-rotavírus (prin-cipalmente direcionado contra a proteína VP6), produzido em coelhos (obti-do da ISREC University of Lausanne) e diluído 1:2000 em PBS foram adici-onados a cada cavidade e foram incubados durante 1 hora a 37°C com umatampa de cobertura para prevenir a dessecação das cavidades. O anti-sorofoi descartado depois disso e as placas foram lavadas três vezes com PBS.Então 50 μL de imunoglobulina G anticoelho (IgG) anti-soro produzido emcabras e acoplado a peroxidase (GAR-lgG-PO; Nordic) foram adicionados auma diluição de 1:500 em PBS a cada cavidade e as placas foram incuba-das durante 1 hora a 37°C. O soro foi descartado e as placas foram maisuma vez lavadas três vezes com PBS. Então 100μL da mistura de substratoa seguir foram adicionados a cada cavidade: 10 mL de Tris-cloridrato 0,05M (pH 7,8), 1 mL de H2O2 (30% ultrapuro, diluído 1:600 em H2O); Merck) e200 μL de 3-amino-9-etilcarbazol (0,1 g/10 mL de etanol armazenado emalíquotas de 200 μΙ a -80°C; A-5754; Sigma). As placas foram incubadasdurante pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. O substrato foidescartado e as cavidades foram preenchidas com 200 μί de H2O para in-terromper a reação. Os focos de células infectadas foram contados com ummicroscópio invertido (Diavert; Leitz).
Somente algumas poucas cepas bacterianas interagiram com osrotavírus. Somente 9 de 260 células bacterianas primariamente seleciona-ram replicação inibida de rotavírus em pelo menos um protocolo. O Lacto-bacillus paracasei NCC 2461 (ST11) exibiu uma atividade extremamentealta contra o Rotavírus Sorotipo 1, o rotavírus SA-11 Sorotipo 3 e o rotavírusHochi Sorotipo 4.
Exemplo 3
Propriedades de ST11
A ST11 foi submetida à incubação em suco gástrico estimulado.O suco gástrico estimulado foi preparado pela suspensão da pepsina (3 g/L)em solução salina estéril (0,5% p/v) e ajustando o pH para 2,0 e pH 3,0,respectivamente, com HCI concentrado. A ST11 foi crescida em quantidadevariantes nos meios acima e a resistência dos microorganismos foi determi-nada.
Os resultados são resumidos na tabela I abaixo.
Tabela I
<table>table see original document page 14</column></row><table>
A ST11 possui as propriedades a seguir como definido de acor-do com os métodos divulgados nos gêneros das bactérias do ácido láctico,Ed. B.J.B. Wood eW.H. Holzapfel, Blackie A&P.- gram-positiva,
- catalase negativa,
- arginina na forma NH3 negativa
- negativa para a produção de CO2
- produção de ácido láctico L(+)
- crescimento na presença de sais biliares em uma concentração de atéaproximadamente 0,4%.
Exemplo 4
Crescimento de ST11 sob condições diferentes
A ST11 foi incubada a 37°C em meio com base em tomate (póde tomate a 4% reidratado em água destilada) suplementado com sacarose(0, 0,5, 1 ou 2%) ou peptona de soja (0,5%) ou glicose (0,5%) durante dife-rentes períodos de tempo. Os resultados são mostrados na fig. 2.
A ST11 foi ainda adicionada em uma quantidade de 2,5% a ummeio composto de farinha de arroz (3%), farinha de trigo (2%) e sacarose(3%) e incubada a 37°C até um pH de 4,4 ser atingido. Após o resfriamentoo produto foi empacotado com ou sem a adição de vitamina C e foi armaze-nado a 10 °C.Exemplo 5
Indução da síntese de mRNA de IL-12 e de IL-10 em células aderentes decamundongos por ST11
As células da medula óssea foram isoladas do fêmur e da tíbiade camundongos C57BL/6 livres de patógenos específicos de 8 semanas deidade e foram incubadas a uma concentração de 2x106 células/mL em meioRPMI (Gibco) contendo soro fetal bovino 10%, L-Glutamina 1 mM, Hepes 12mM, 2-mercaptoetanol 0,05 mM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100μg/mL (todos os reagentes da Gibco) durante 12 horas a 37°C em uma at-mosfera de CO2 5%. As células não aderentes foram descartadas por 3 la-vagens consecutivas com meio de cultura morno e as células aderentes re-manescentes foram coletadas e incubadas a uma concentração de 106 cé-lulas/mL durante 6 horas na presença ou na ausência de bactérias. Foi de-terminado anteriormente que 6 horas representam um ponto de tempo ótimopara a síntese de mRNA de citocina pelas células aderentes de camundon-go em resposta a LPS. As bactérias foram adicionadas em concentraçõesdiferentes na faixa de 109 a 107 cfu/mL. As bactérias foram crescendo e ar-mazenadas como indicado acima (página 6).
No final do período de cultura de 6 horas, as células foram iso-ladas pela centrifugação e foram Iisadas utilizando o kit de reagente TRIzoI(GibcoBRL, Cat. N0 15596-018) seguindo as instruções do fabricante. ORNA total foi isolado pela precipitação com isopropanol e transcrito de formainversa em cDNA durante 90 min a 42°C utilizando 200 U de transcriptasereversa (Superscript II, BRL) em um volume de reação de 40 μΙ_ contendo200 mM de Tris pH 8,3, KCI 25 mM, óligo d(T)i5 1 μg/mL (Boehringer Man-nheim), DTT 1 mM (Boehringer Mannheim), 4 mM de cada dNTP (Boehrin-ger Mannheim) e Rnasin 40 U/mL (Promega). Os iniciadores de PCR e ascondições foram utilizados como já descrito anteriormente em Kopf et al.(Journal of Experimental Medicine 1996 Sep 1; 184(3): 1127-36). As quanti-dades de cDNA foram normalizadas dentro das amostras utilizando os inici-adores específicos para um gene doméstico (β-2-microglobulina). Os pro-dutos de PCR foram separados em um gel de agarose 2% e as bandas fo-ram analisadas sob UV.
Como mostrado na Figura 4, a ST11 exibiu a indução mais fortedo mRNA de IL-12 e de IL-10, que era comparável aos níveis observáveiscom o controle positivo (E. coli). As diferenças são melhor observadas nasconcentrações mais baixas de bactérias (107 cfu/mL).
Exemplo 6
Supressão da síntese de IL-4 por ST11
As células T CD4+ foram purificadas do baço de camundongosBALB/c livres de patógenos específicos utilizando o kit MiniMACS da Mil-tenyi Biotec (Cat. N0 492-01). As células T CD4+ foram cultivadas a umaconcentração de 2x105 células/mL em meio RPMI contendo soro fetal bovinoa 10%, L-Glutamina 1 mM, Hepes 12 mM, 2-mercaptoetanol 0,05 mM, peni-cilina 100 U/mL e estreptomicina 100 μg/mL e ativadas durante uma semanapor reticulação com anticorpos monoclonais ligados à placa para CD3 (cio-ne 2C11) e CD28 (clone 37,51, ambos anticorpos da Pharmingen). Duranteesta cultura primária, as células T CD4+ foram co-cultivadas com célulasaderentes da medula óssea (isoladas como descrito acima) como célulasacessórias e com 10® cfu/mL de ST11 ou 108 cfu/mL de La1 ou 1 mg/mL deLPS ou meio sozinho. Após este período, as células foram lavadas e as cé-lulas T CD4+ foram purificadas mais uma vez utilizando a tecnologia do kitMiniMACS e reestimulada em uma cultura secundária contendo meio sozi-nho. As citocinas produzidas pelas células T CD4+ diferenciadas foram me-didas nos sobrenadantes após 2 dias utilizando ELISA em sanduíche (kitsda Endogen e Pharmigen).
Os resultados são mostrados na Fig. 5. As células diferenciadasna presença do meio sozinho exibiam um fenótipo Th2 dominante caracteri-zado por altos níveis de IL-4. A adição de ST11 às culturas primárias mo-dularam fortemente o resultado da diferenciação de Th2, uma vez que istoresultou em uma diminuição de 8 vezes na produção de IL-4. Esta inibiçãofoi de magnitude similar à observada nas culturas derivadas de células dife-renciadas na presença de LPS. Em contraste a estas, a outra cepa de Lac-tobacillus não possuía impacto mensurável nos níveis de IL-4. De forma in-teressante, os níveis de IFN-γ não foram aumentados após a adição deST11 nas culturas primárias.
Como pode ser visto do que foi descrito acima as cepas da pre-sente invenção podem ser bem preparadas para a produção de um veículoalimentício e/ou farmacêutico levando a vantagem das propriedades valio-sas dos microorganismos.
Exemplo 7
A cepa ST11 foi testada em um ensaio clínico em uma comuni-dade nos subúrbios da Cidade da Guatemala em sua capacidade de influ-enciar a transmissão e a experiência da doença diarréica aguda da estaçãochuvosa experimentada pela maioria das crianças nesta área. Um total de203 crianças, de 35 a 70 meses de idade foi envolvido no estudo e recebeuuma dose alvo de 1010 organismos viáveis (ST11) ou nenhum (placebo) du-rante um período de alimentação de 29 dias. As crianças selecionadas tantopara a amostra quanto para o placebo, respectivamente, possuíam os défi-cits típicos em peso-por-idade e altura-por-idade característicos por causada subnutrição.
Antes do início do ensaio de alimentação nas crianças na pré-escola, foi realizada uma avaliação de segurança com base nos estudos invitro e in vivo. Os estudos in vitro exibiram padrão de resistência a antibióti-co similar ao de outros Iactobacilli utilizados em aplicações alimentícias enenhum potencial para formação de aminas biogênicas, para degradaçãode mucina e para desconjugação de sais biliares. Em um estudo clínicocontrolado com placebo envolvendo 42 voluntários adultos, a ST11 foi bemtolerada e não induziu quaisquer efeitos adversos, dentre as manifestaçõespotenciais monitoradas, tais como flatulência, número de fezes por dia econsistência das fezes; os níveis de proteínas na fase aguda no soro nãolevantaram qualquer preocupação em relação a uma reação inflamatória potencial.
As amostras e o placebo foram colocados em sachês na instala-ção de fabricação do Nestlé Product Technology Center em Konolfingen,Suíça e foram transportados refrigerados para Guatemala. Cada sachê de10 g consistia em um veículo aromatizado com chocolate e 0,2 g de ST11(1010 cfu) ou, no caso do placebo, 0,2 g de leite em pó. O veículo aromatiza-do com chocolate consistia em pó de cacau, açúcar, Iecitina de soja, bauni-lha e canela. Os sachês eram armazenados de 4o a 6°C até duas horas an-tes do uso. Antes do uso o sachê tinha que ser dissolvido em 100 ml_ deágua fornecida pela Nestlé, que era livre de qualquer contaminação bacteriana.
De acordo com o protocolo aplicado a diarréia era definida comoa ocorrência de três ou mais evacuações fecais líquidas ou sem forma du-rante um período de 24 horas. Um episódio de diarréia era definido comoum evento que apresentava a evidência de diarréia (3 evacuações diarréi-cas durante 24 horas). Sua duração total em horas era calculada a partir domomento da primeira das três fezes de índice até o surgimento das primei-ras fezes com forma ou um período de 24 h sem qualquer defecação. Parauma criança ter um "novo" episódio, precisavam ter passado 48 horas dotérmino do episódio anterior. Se não, era considerada uma continuação domesmo episódio e a duração total era então utilizada para a avaliação. Eraum caso, uma criança que passava por um ou mais episódios documenta-dos de diarréia durante um período de observação de 29 dias. A intensidadede um episódio diarréico era baseado no número total de fezes soltas pro-duzidas. Os elementos da gravidade do episódio abrangiam a presença desangue, muco, ou pus nas fezes, junto com os sintomas de febre e vômito.Uma intensidade de 7 fezes durante 24 h ou a necessidade de intervençãopor um profissional de saúde em uma clínica, centro de saúde ou hospitaltambém classifica um episódio como grave.
Quando um episódio diarréico era diagnosticado através dosistema de fiscalização, um espécime de fezes diarréicas era coletado paraexame microscópico e para cultura para identificar os patógenos etiológicospotenciais para tal episódio. O espécime era diagnosticado em relação aoantígeno de rotavírus, Giárdia e E. histolytica, no caso da amostra ser dis-entérica e para os patógenos bacterianos incluindo Shigella, Salmonella,Aeromonas, Plesiomonas shigelloides, E. coli e possivelmente V. cholerae.
Durante o período de investigação as amostras do produto eramcoletadas para examinar a viabilidade dos microorganismos incluídos du-rante o período de administração. Poderia ser mostrado que o microorga-nismo permanecia viável nos sachês durante todo o estudo de forma queainda no final do estudo os sachês eram capazes de transportar 1010 micro-organismos viáveis após a reconstituição com água.
O estudo revelou que a amostra contendo o microorganismoprobiótico poderia diminuir a ocorrência de diarréia em contraste com o gru-po controle (placebo) em aproximadamente 30%. Ainda, também o grupocontrole já exibia um número diminuído de ocorrência diarréica em relação apopulação normal que não recebia as amostras ou o placebo, respectiva-mente. Esta última descoberta pode ser em parte explicada com base nofato de que as crianças receberam nutrição valiosa adicional e água livre decontaminação. Entretanto, uma vez que o estudo foi realizado no campopode ser claramente deduzido que ST11 pode com certeza reduzir a ocor-rência da diarréia in vivo.TRAITE DE BUDAPESTINTERNATIONALE DU DEPOT DES MICRO-ORGANISMSAUX FINS DE LA PROCEDURE EN MATIERE DE BREVETS
FORMULE INTERNATIONALE
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1 Em cas d'application de la règle 6.4.d), cette date est la data à laquelle Iestatut d'autorité de dépôt internationale a été acquis.
Claims (6)
1. Uso de cepa CNCM 1-2116 de Lactobacillus paracasei, carac-terizado pelo fato de ser na preparação de um material suporte que pode seringerido.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a cepa de Lactobacillus está contida no material suporte em umaquantidade de aproximadamente 105 UFC/g até 1012 UFC/g de material su-porte.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelofato de que o material suporte é uma composição alimentícia selecionada deleite, iogurte, coalhada, queijo, leites fermentados, produtos fermentados abase de leite, sorvetes, produtos a base de cereais fermentados, pós a basede leite e fórmulas para bebês.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o material suporte é utilizado para o tratamen-to e/ou a profilaxia de distúrbios associados com a diarréia.
5. Composição alimentícia ou farmacêutica, caracterizada pelofato de que compreende pelo menos a cepa CNCM 1-2116 de Lactobacillusparacasei.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de ser selecionada dentre leite, iogurte, coalhada, queijo, leitesfermentados, produtos fermentados a base de leite, sorvetes, produtos abase de cereais fermentados, pós a base de leite, fórmulas para bebês,comprimidos, suspensões bacterianas líquidas, suplementos orais secos,suplementos orais úmidos, tubos de alimentação secos ou tubos de alimen-tação úmidos.
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