PL198626B1 - Szczep Lactobacillus paracasei, zastosowanie tego szczepu i żywnościowa lub farmaceutyczna kompozycja zawierająca bakterie należące do rodzaju Lactobacillus - Google Patents

Szczep Lactobacillus paracasei, zastosowanie tego szczepu i żywnościowa lub farmaceutyczna kompozycja zawierająca bakterie należące do rodzaju Lactobacillus

Info

Publication number
PL198626B1
PL198626B1 PL350768A PL35076800A PL198626B1 PL 198626 B1 PL198626 B1 PL 198626B1 PL 350768 A PL350768 A PL 350768A PL 35076800 A PL35076800 A PL 35076800A PL 198626 B1 PL198626 B1 PL 198626B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
strain
milk
bacteria
lactobacillus
Prior art date
Application number
PL350768A
Other languages
English (en)
Other versions
PL350768A1 (en
Inventor
Roberto Reniero
Harald Bruessow
Florence Rochat
Der Weid Thierry Von
Stéphanie Blum-Sperisen
Original Assignee
Nestle Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nestle Sa filed Critical Nestle Sa
Publication of PL350768A1 publication Critical patent/PL350768A1/xx
Publication of PL198626B1 publication Critical patent/PL198626B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G9/00—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor
    • A23G9/32—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G9/36—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing microorganisms or enzymes; containing paramedical or dietetical agents, e.g. vitamins
    • A23G9/363—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing microorganisms or enzymes; containing paramedical or dietetical agents, e.g. vitamins containing microorganisms, enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/06—Treating cheese curd after whey separation; Products obtained thereby
    • A23C19/061—Addition of, or treatment with, microorganisms
    • A23C19/062—Addition of, or treatment with, microorganisms using only lactic acid bacteria, e.g. pediococcus, leconostoc or bifidus sp., or propionic acid bacteria; Treatment with non-specified acidifying bacterial cultures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1232—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt in powdered, granulated or dried solid form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/104—Fermentation of farinaceous cereal or cereal material; Addition of enzymes or microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C2270/00—Aspects relating to packaging
    • A23C2270/05—Gelled or liquid milk product, e.g. yoghurt, cottage cheese or pudding being one of the separate layers of a multilayered soft or liquid food product
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/175—Rhamnosus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/853—Lactobacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

1. Szczep Lactobacillus paracasei, znamienny tym, ze jest szczepem Lactobacillus paracasei CNCM I-2116. 2. Zastosowanie szczepu Lactobacillus paracasei okre slonego w zastrz. 1 do przygotowania doustnego materia lu no snikowego, który jest kompozycj a zywno sciow a wybran a z grupy obejmuj acej mleko, jogurt, twaróg, ser, mleko kwa sne, produkty fermentowane oparte na mleku, lody, produkty fermentowane oparte na zbo zu, mleko w proszku, mieszanki dla niemowl at. 5. Zywno sciowa lub farmaceutyczna kompozycja zawieraj aca bakterie nale zace do rodzaju Lactobacillus, znamienna tym, ze zawiera szczep bakterii okre slony w zastrz. 1. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest szczep Lactobacillus paracasei, zastosowanie tego szczepu i żywnościowa lub farmaceutyczna kompozycja zawierająca bakterie należące do rodzaju Lactobacillus.
Wynalazek niniejszy dotyczy nowych mikroorganizmów z rodziny Lactobacillaceae, szczególnie z rodzaju Lactobacillus, przydatnych do zapobiegania i leczenia biegunki. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy użycia wymienionych mikroorganizmów do sporządzania doustnego materiału nośnikowego i kompozycji je zawierających.
Organizmy, które wytwarzają kwas mlekowy jako główny produkt przemiany materii, są znane od dawna. Bakterie te można znaleźć w mleku lub w zakładach przetwórstwa mleczarskiego, w żywych lub rozkładających się roślinach ale także w ludzkich i zwierzęcych jelitach. Mikroorganizmy te, określane mianem „bakterie kwasu mlekowego” tworzą raczej niejednorodną grupę i zawierają na przykład bakterie z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus itp.
Bakterie kwasu mlekowego są wykorzystywane jako czynniki fermentacyjne w procesie konserwowania żywności gdzie do hamowania rozwoju bakterii powodujących jej psucie wykorzystane jest niskie pH i działanie produktów fermentacji powstających podczas fermentacji wywołanej przez bakterie kwasu mlekowego. W tym celu bakterie kwasu mlekowego używane są do wytwarzania wielu różnych produktów żywnościowych, takich jak ser, jogurt i inne produkty mleczarskie.
Całkiem ostatnio zwrócono większą uwagę na pewne szczepy bakterii kwasu mlekowego, które spożyte, wykazują cenne własności dla ludzi i zwierząt. W szczególności stwierdzono że pewne szczepy Lactobacillus i Bifidobacterium mogą zasiedlać śluzówkę jelita i pomagają w utrzymaniu dobrego stanu zdrowia ludzi i zwierząt.
Nawiązując do tego w patencie EP 0 768 375 ujawniono swoiste szczepy bakterii z rodzaju Bifidobacterium, które są zdolne do zasiedlania jelita i mogą przylegać do komórek jelitowych. Doniesiono, że Bifidobakterie opisane w tym patencie mają zdolność do kompetycyjnego zakłócania przywierania bakterii patogennych do komórek jelita uczestnicząc w ten sposób w immunomodulacji, a przez to utrzymując dobry stan zdrowia osobnika.
W ciągu ostatnich kilku lat badania skupione były na potencjalnym zastosowaniu bakterii kwasu mlekowego jako czynnika probiotycznego. Za probiotyki uważa się preparaty żywotnych bakterii, które wspomagają zdrowie osobnika przez zachowanie naturalnej mikroflory jelitowej. Preparat bakteryjny może być powszechnie akceptowany jako probiotyk w przypadku, gdy bakterie w nim zastosowane są skuteczne, a sposób ich działania jest znany. Uważa się, że probiotyki posiadają zdolność do przylegania do śluzówki jelita oraz zasiedlania dróg jelitowych zapobiegają także przyleganiu szkodliwych mikroorganizmów w jelitach. Warunek wstępny decydujący dla ich działania polega na tym, że muszą dotrzeć do śluzówki jelit w odpowiedniej, zdolnej do życia formie, niezniszczone w górnym odcinku dróg pokarmowych, a w szczególności przez wpływ niskiego pH panującego w żołądku.
Nawiązując do tego, w patencie WO 97/00078 ujawniono jako probiotyczny konkretny szczep, określony jako Lactobacillus GG (ATCC 53103). Mikroorganizm ten jest w szczególności wykorzystany w sposobie zapobiegania lub leczenia reakcji nadwrażliwości wywołanych pożywieniem, przez podawanie go biorcy razem z pokarmem poddanym procesowi hydrolizy z udziałem pepsyny i/lub trypsyny. Opisano, że ten wyselekcjonowany szczep bakterii Lactobacillus wykazuje zdolności adhezyjne i kolonizacyjne, a także ma układ enzymów proteazowych, z udziałem których materiał białkowy zawarty w podawanym pożywieniu jest dalej hydrolizowany przy udziale proteaz wydzielanych przez konkretny szczep Lactobacillus. Sposób omówiony w tym dokumencie powinien w końcu spowodować wychwyt materiału białkowego przez jelito, które nie wykazuje już więcej istotnych ilości materiału alergennego.
W patencie EP 0 577 903 wspomniano o użyciu takich bakterii kwasu mlekowego, które mają zdolność do wypierania Helicobacter pylori, uznanej przyczyny rozwoju wrzodów, do przygotowania materiału nośnikowego przeznaczonego do leczenia lub profilaktyki owrzodzenia związanego z działaniem Helicobacter pylori.
Wiedza o cennych właściwościach konkretnych szczepów bakterii kwasu mlekowego może zapewnić zapotrzebowanie na dodatkowe szczepy bakterii kwasu mlekowego, które są korzystne dla zachowania dobrego stanu zdrowia ludzi i/lub zwierząt.
Zatem celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie dodatkowych szczepów bakterii wykazujących nowe, korzystne dla ludzi i zwierząt własności.
PL 198 626 B1
Powyższy problem został rozwiązany przez dostarczenie nowych mikroorganizmów, mianowicie bakterii kwasu mlekowego, należących do rodzaju Lactobacillus o cechach zdolności do przylegania i kolonizowania śluzówki jelita i zapobiegania infekcji komórek nabłonka jelit przez rotawirusy.
Szczepem według wynalazku jest szczep Lactobacillus paracasei CNCM I-2116.
Wykazano, że mikroorganizm według wynalazku wykazuje następujące własności: jest gramdodatni, katalazo-ujemny, nie wytwarza NH3 z argininy, i nie wytwarza CO2. Wytwarza natomiast L(+) kwas mlekowy, jest zdolny do wzrostu w obecności soli żółciowych w stężeniu do około 0,4% i może zasadniczo zapobiegać infekcji komórek nabłonka przez rotawirusy.
W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie szczepu Lactobacillus paracasei według wynalazku do przygotowania doustnego materiału nośnikowego, który jest kompozycją żywnościową wybraną z grupy obejmującej mleko, jogurt, twaróg, ser, kwaśne mleko, produkty fermentowane oparte na mleku, lody, produkty fermentowane oparte na zbożu, mleko w proszku, mieszanki dla niemowląt.
Korzystnie szczep Lactobacillus według wynalazku jest zawarty w materiale nośnikowym w ilości od około 105 cfu/g do około 1012 cfu/g materiału nośnikowego.
Dla celów niniejszego wynalazku skrót cfu ma oznaczać „jednostkę tworzącą kolonię”, którą określa się jako liczbę komórek bakteryjnych ujawnionych na płytkach agarowych przez zliczanie mikrobiologiczne.
W korzystnym zastosowaniu wytwarzany materiał nośnikowy przeznaczony jest do leczenia i/lub profilaktyki zaburzeń związanych z biegunką.
Ponadto wynalazek dotyczy żywnościowej lub farmaceutycznej kompozycji zawierającej szczep bakterii według wynalazku.
Korzystnie kompozycja jest wybrana z grupy obejmującej mleko, jogurt, twaróg, ser twaróg, ser, kwaśne mleko, produkty fermentowane oparte na mleku, lody, produkty fermentowane oparte na zbożu, mleko w proszku, mieszanki dla niemowląt, tabletki, ciekłe zawiesiny bakteryjne, suche dodatki doustne, mokre dodatki doustne, suche lub mokre pokarmy w tubkach.
Dla przygotowania kompozycji pokarmowej według niniejszego wynalazku do odpowiedniego materiału nośnikowego włączony jest co najmniej jeden szczep bakterii Lactobacillus według wynalazku, w ilości od około 105 cfu/g do około 1011 cfu/g, korzystnie od około 106 cfu/g do około 1010 cfu/g, bardziej korzystnie od około 107 cfu/g do około 109 cfu/g.
W przypadku produktu farmaceutycznego, można go wytworzyć w postaci tabletek, ciekłej zawiesiny bakteryjnej, suchych doustnych dodatków żywnościowych, mokrych doustnych dodatków żywnościowych, mokrych i suchych dodatków żywnościowych w tubkach itp., z bakteriami szczepu Lactobacillus włączonymi do preparatu w zakresie do 1012 cfu/g korzystnie od około 107 cfu/g do około 1011 cfu/g, jeszcze korzystniej od około 107 cfu/g do około 1010 cfu/g.
Aktywność tego nowego mikroorganizmu w jelicie osobnika jest zależna od dawki. Tak, że im więcej nowego mikroorganizmu jest włączone do powyższego spożywanego materiału pokarmowego lub kompozycji farmaceutycznej, tym wyższa aktywność ochronna i/lub lecznicza aktywność mikroorganizmu. Ponieważ nowe mikroorganizmy nie są szkodliwe dla ludzi i zwierząt, a zostały wyizolowane z kału niemowląt, zasadniczo duża część jelit danego osobnika zostanie zasiedlona przez ten nowy mikroorganizm.
Opis figur:
Na Figurze 1 przedstawiono schemat ilustrujący badanie przesiewowe hodowli komórkowej określające właściwości ochronne szczepów bakteryjnych chroniących przed rotawirusem.
Na Figurze 2 przedstawiono zakwaszenie szczepu Lactobacillus casei CNCM I-2116 (określonego jako ST11) w różnych pożywkach wzrostowych.
Na Figurze 3 przedstawiono wskaźnik przeżycia szczepu Lactobacillus casei ST11 w temperaturze 10°C mierzony w ciągu 30 dni.
Na Figurze 4 przedstawiono wzorzec mRNA interleukiny IL-12 i IL-10 w mysich komórkach przylegających pochodzących ze szpiku kostnego po inkubacji komórek z serią kolejnych rozcieńczeń ST11.
Na Figurze 5 przedstawiono wynik różnicowania Th2 jako wynik malejącego wytwarzania IL-4.
W obszernych opracowaniach prowadzących do niniejszego wynalazku zgłaszający badali niemowlęce kały i wyizolowali z nich różnorodne szczepy bakterii. Następnie badano zdolność tych szczepów bakterii do zapobiegania infekcji komórek nabłonka przez rotawirusy, o których wiadomo, że wywołują biegunkę.
Badano przesiewowo własności hamujące rozwój rotawirusa u kilku rodzajów bakterii obejmujących Lactobacilus, Lactococcus i Streptococcus. Testy właściwości hamowania prowadzono zasad4
PL 198 626 B1 niczo na trzech serotypach rotawirusa (serotypy G1, G3 i G4) reprezentujących główne czynniki etiologiczne biegunek wirusowych u ludzi.
Różne bakterie kwasu mlekowego hodowano w odpowiedniej pożywce, takiej jak MRS, HugoJago lub M17, w temperaturach od około 30 do 40°C, co odpowiada temperaturze optymalnej dla wzrostu bakterii. Po osiągnięciu stacjonarnej fazy wzrostu bakterie odwirowywano i zawieszano w fizjologicznym roztworze NaCl. W okresie między poszczególnymi testami przechowywano bakterie w stanie zamrożonym (-20°C).
Przygotowano różne roztwory podstawowe rotawirusów przez zakażenie zlewnych jednowarstwowych komórek. Rotawirusy inkubowano przed infekcją. Komórki infekowano 20 dawkami zakaźnej hodowli tkankowej.
Właściwości antyrotawirusowe oceniano na podstawie stosowania dwóch różnych protokołów. Zgodnie z pierwszym protokołem badano różne szczepy bakteryjne pod względem ich bezpośrednich interakcji z rotawirusem, podczas gdy w trakcie drugiego protokołu przeprowadzono badanie przesiewowe bakterii na szczepy, które oddziaływują z komórkowymi receptorami rotawirusa.
Protokół pierwszy obejmował kontaktowanie odpowiedniej zawiesiny bakteryjnej z różnymi szczepami rotawirusa i inkubowanie jej w odpowiedniej pożywce. Następnie wirusowo-bakteryjną mieszaninę dodawano do jednowarstwowych niezróżnicowanych komórek ludzkiego gruczolaka okrężnicy HT-29 i kontynuowano inkubację. Później oceniano replikację wirusa.
Protokół drugi obejmował inkubowanie odpowiedniej zawiesiny bakterii najpierw z jednowarstwowymi niezróżnicowanymi komórkami ludzkiego gruczolaka okrężnicy HT-29, a następnie dodanie wirusa. Po nieprzerwanej inkubacji oznaczono replikację wirusa.
Replikację wirusa można z łatwością ocenić przez barwienie histoimmunologiczne białek rotawirusa w zainfekowanych komórkach.
Działanie hamujące wobec rotawirusa przypisywano danej bakterii, gdy liczba zainfekowanych komórek w hodowli komórkowej inokulowanej rotawirusem i wskazaną bakterią była zmniejszona o 90% w porównaniu z komórkami inokulowanymi jedynie rotawirusem.
Spośród 260 pierwotnie izolowanych różnych szczepów bakterii zaledwie w 9 przypadkach można było wykazać zasadniczo zahamowaną replikację rotawirusa. Stwierdzono, że bakterie te należą do rodzaju Lactobacillus podgatunek rhamnosus lub paracasei. Jeden szczep określony jako Lactobacillus casei ST11, zdeponowany zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim pod numerem depozytu NCC 2461 (I-2116), wykazał szczególną skuteczność w zapobieganiu zakażeniu komórek ludzkich przez rotawirusy. Ponadto, ten konkretny szczep wykazuje znakomite właściwości wzrostowe, jak to można przedstawić przez zakwaszenie w różnych pożywkach. Wykazuje on również wysoki wskaźnik przeżycia w czasie przechowywania w niskich temperaturach około 10°C, co sprawia, że może być doskonałym kandydatem do włączenia do żywności lub kompozycji farmaceutycznych, które należy przechowywać w warunkach lodówki.
Dodatkowo do powyższych wyników badań wykazano, że szczepy te nieoczekiwanie wykazują właściwości anty-alergiczne, co przejawia się tym, że szczepy te mają wpływ na syntezę różnych mediatorów immunologicznych.
Przyjmuje się na ogół, że w humoralnej odpowiedzi immunologicznej oraz reakcji alergicznej pośredniczą limfocyty T CD4+ niosące fenotyp typu 2 (Th2). Limfocyty Th2 charakteryzują się zwiększoną produkcją wysokich poziomów interleukiny 4 (IL-4), cytokiny wymaganej do sekrecji IgE, klasy przeciwciał odgrywającej główną rolę w reakcjach alergicznych.
Różnicowanie limfocytów Th2 jest zaburzane przez IFN-γ, szczególną cytokinę, która powstaje z wzajemnie wykluczającego się podzbioru limfocytów T CD4+ typu Th1. Limfocyty Th1 są z kolei silnie indukowane przez interleukinę 12 (IL-12). W przeciwieństwie do tej interleukiny, wykazano, że inna cytokina IL-10 ma silny wpływ supresyjny na proliferację limfocytów Th1, i dlatego też uważa się, że pełni ona ważną rolę w mechanizmach immunosupresyjnych.
Podsumowując, zarówno IL-12 jak i IL-10 mają silny wpływ regulacyjny na rozwój limfocytów T CD4+, przez wpływ na rozwój podgrupy Th1. IL-12 jest kluczową cytokiną regulatorową w procesie indukcji różnicowania się Th1, a zatem hamującą wytwarzanie odpowiedzi Th2. Dlatego główny szlak hamowania limfocytów Th2 jest upatrywany w stymulacji syntezy IL-12 przez komórki pomocnicze.
Jest dobrze znanym faktem, iż niektóre składniki bakterii gram-ujemnych, takie jak LPS, wywołują wysoki poziom IL-12 w komórkach przylegających, takich jak makrofagi i komórki dendrytyczne. Zgodnie z tym, wykazano, że bakterie gram-ujemne mogą silnie stymulować rozwój limfocytów T CD4+ w kierunku fenotypu Th1.
PL 198 626 B1
Mikroorganizm ST11, jako przykład szczepu Lactobacillus według niniejszego wynalazku, był testowany pod względem potencjalnej roli w indukowaniu cytokin związanych z regulowaniem procesu różnicowania się limfocytów T CD4+. W szczególności, badano wpływ ST11 na fenotyp komórek T CD4+ przechodzących różnicowanie w kierunku Th2.
W odniesieniu do powyższego, zdolność ST11 do indukowania syntezy mRNA, kodującego te dwie cytokiny regulatorowe, w mysich komórkach przylegających pochodzących ze szpiku kostnego, porównano z czterema innymi szczepami Lactobacillus oraz gram-ujemną bakterią (E. coli K12) użytą w charakterze kontroli. Poziom mRNA mierzono przy pomocy półilościowej techniki RT-PCR po sześciogodzinnej inkubacji komórek z seryjnymi rozcieńczeniami bakterii w zakresie od 109 do 107cfu/ml.
Choć wszystkie szczepy Lactobacillus mogą indukować do pewnego stopnia transkrypcję mRNA IL-12, szczep ST11 okazał się mieć najsilniejsze właściwości indukcyjne, ponieważ silny sygnał PCR mógł być wykrywany nawet przy najmniejszej dawce bakterii. Rzeczywiście, zdolność ST11 do indukowania transkrypcji mRNA IL-12 była tak silna, jak wykazywana przez E. coli. Indukcja mRNA interleukiny IL-10 była generalnie słabsza niż w przypadku mRNA IL-12, ponieważ sygnał wykrywano jedynie przy wyższych dawkach bakterii. W porównaniu z innymi szczepami Lactobacillus oraz kontrolą E. coli, szczep ST11 najsilniej indukował transkrypcję mRNA IL-10.
Zatem można uznać, że szczep ST11 efektywnie indukuje cytokiny immunoregulacyjne związane z procesem różnicowania limfocytów T CD4+. Jego silne zdolności do indukowania IL-12 czynią go odpowiednim kandydatem do hamowania odpowiedzi Th2, a jego wymierna zdolność indukowania IL-10 może zapobiegać odpowiedziom zapalnym.
W dodatku do powyższych wniosków, oceniano również, czy ST11 ma wpływ hamujący na limfocyty T CD4+ ulegające różnicowaniu w kierunku Th2, oraz pozytywny wpływ na funkcje Th1. Użyto dobrze opracowanego systemu różnicowania komórek w hodowli, w którym komórki prekursorowe T CD4+ były aktywowane poliklonalnie i modulowane do przejścia różnicowania w kierunku Th1 lub Th2, w zależności od rodzaju dostarczonych w pożywce ko-stymulatorów. Różnicowanie Th1/Th2 indukowano podczas siedmiodniowej hodowli pierwotnej, po której komórki ponownie stymulowano przez dwa dni w hodowli wtórnej zawierającej samą pożywkę, a nagromadzenie specyficznego fenotypu (Th1 lub Th2) oceniano na podstawie pomiaru produkowanych cytokin obecnych w supernatancie (IFN-γ wobec IL-4).
Powszechnie wiadomo, że limfocyty prekursorowe T CD4+ od myszy o podłożu myszy BALB/c korzystnie różnicują się w kierunku przeważającego fenotypu Th2 (wysoki poziom IL-4, niski poziom IFN-γ w supernatantach z hodowli wtórnej) po aktywacji w warunkach obojętnych (sama pożywka w hodowli pierwotnej). Ten fenotyp może całkowicie rewertować w kierunku wzoru Th1 (wysoki poziom IFN-γ, niski poziom IL-4) po dodaniu do pierwotnej hodowli blokującego przeciwciała przeciwko IL-4.
W celu zbadania potencjalnej roli ST11 w inhibicji Th2, podczas pierwotnej hodowli aktywowano oczyszczone limfocyty prekursorowe T CD4+ od myszy BALB/c w obecności komórek przylegających ze szpiku kostnego, jako komórek pomocniczych. Komórki te hodowano wspólnie albo w samej pożywce, albo w obecności LPS (1 mg/ml), lub ST11 (108 cfu/ml), lub też innego szczepu Lactobacillus (108 cfu/ml). Następnie płukano komórki i ponownie oczyszczano limfocyty T CD4+, które znów stymulowano w hodowli wtórnej przeprowadzanej w samej pożywce. Poziom cytokin produkowanych przez zróżnicowane limfocyty T CD4+ mierzono po dwóch dniach. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki ulegające różnicowaniu w samej pożywce wykazywały dominujący fenotyp Th2. Dodanie ST11 do hodowli pierwotnej silnie modyfikowało wynik różnicowania Th2, prowadząc do ośmiokrotnego zmniejszenia produkcji IL-4. Ta inhibicja przybierała rozmiary podobne do procesu inhibicji obserwowanego w hodowlach uzyskanych z komórek różnicujących się w obecności LPS. Przeciwnie, inny szczep Lactobacillus nie wykazywał zauważalnego wpływu na poziom IL-4. Co ciekawe, poziom IFN-γ nie ulegał podwyższeniu po dodaniu ST11 do hodowli pierwotnej.
Podsumowując, ST11 specyficznie zaburzał produkcję IL-4 przez limfocyty T CD4+ ulegające różnicowaniu, lecz nie zwiększał w istotny sposób wydzielania IFN-γ. Fakt że ST11 nie zwiększał produkcji IFN-γ może wynikać ze zdolności ST11 do indukowania IL-10, co w konsekwencji prowadzić może do niewielkiego efektu zapalnego pomimo aktywności Th2.
W konsekwencji można wykazać, że ST11 jest szczepem Lactobacillus wykazującym wyraźny charakter anty-Th2, co czyni ten szczep doskonałym kandydatem do roli bakterii o aktywności przeciwalergicznej i probiotycznej. Niniejszy wynalazek zostanie opisany w następujących przykładach.
PL 198 626 B1
Pożywki i roztwory:
MRS (Difco)
Hugo-Jago (Tryptone Difco 30 g/l., ekstrakt drożdżowy Difco 10 g/l., laktoza Difco 5 g/l, KH2PO4 g/l., sekstrakt drożdżowy Difco 2 g/l, agar Difco 2 g/l.)
M17 (Difco)
M199 (Seromed) roztwór Ringera (Oxoid)
PBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na2HPO4 1,15 g/l, K^PO4 0,2 g/l) bulion fosforanu tryptozy (Flow) roztwór trypsyny-EDTA (Seromed)
Rotawirus ludzki Wa (serotyp G1) i rotawirus małpi SA-11 (serotyp G3) otrzymano z P.A. Offit, Children's Hospital of Philadelphia, USA. Mieszany wirus otrzymano od A Kapikian, NIH Bethesda, USA. Ludzki rotawirus Hochi, serotyp 4 otrzymano od P. Bachmann, University of Munich, Niemcy.
P r z y k ł a d 1
Izolacja bakterii mlekowych z kału niemowląt
Świeży kał zbierano z pieluszek 16 zdrowych niemowląt (wiek 15-27 dni). Podczas transportu do laboratorium 1 g świeżego kału umieszczano w warunkach beztlenowych i w ciągu dwóch godzin od pobrania przeprowadzano analizę mikrobiologiczną polegającą na seryjnych rozcieńczeniach próbek w roztworze Ringera i posiewach na podłożach selekcyjnych. Do wyizolowania bakterii mlekowych używano agaru MRS z dodatkiem antybiotyków (fosfomycyna 80 μg/ml, sulfametoksazol 93 μg/ml, trimetoprim 5 μg/ml). Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Kolonie wybierano losowo i oczyszczano. Izolowane bakterie charakteryzowano pod kątem fizjologicznym i genetycznym.
P r z y k ł a d 2
Testowanie szczepów na aktywność przeciw rotawirusom w hodowli komórkowej
Wyselekcjonowano kilka rodzajów bakterii (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus) i zbadano je pod względem działania antyrotawirusowego za pomocą testów inhibicyjnych. Rodzaj Lactococcus był reprezentowany przez pojedynczy gatunek (Lc. lactis) zawierający dwa podgatunki (Lc. lactis supsp. lactis i cremoris). Przebadano ogólną liczbę 30 szczepów. Szczep Streptococcus był reprezentowany przez pojedynczy gatunek (S. thermophilus) o 45 szczepach. Rodzaje Leuconostoc i Propionibacterium były reprezentowane tylko przez jeden gatunek, (6 szczepów), podczas gdy każdy z rodzajów Enterococcus i Staphylococcus był reprezentowany przez 2 gatunki, a całkowita liczba szczepów wynosiła 17.
W sumie przebadano 260 szczepów bakterii na aktywność hamowania rozwoju rotawirusów.
Protokół 1:
Zmieszano 30 μl zawiesiny bakterii (zawierającej średnio 3x106 bakterii) z 70 μl pożywki M199 wzbogaconej 10% bulionu fosforanu tryptozy (Flow) i 5% roztworem trypsyny EDTA (Seromed) (rozcieńczonej w stosunku 1:4 w przypadku komórek HT-29) oraz 100 μl zawiesiny wirusa w pożywce wzbogaconej M199. Mieszaninę wirusowo-bakteryjną inkubowano najpierw przez 1 godzinę w temperaturze 4°C, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Niezróżnicowane komórki ludzkiego gruczolaka okrężnicy HT-29, hodowane jako konfluentne jednowarstwy w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania, płukano trzykrotnie w PBS, pH 7,2. Mieszaninę wirusowo-bakteryjną dodano do komórek i płytki do mikromiareczkowania inkubowano przez 18 godzin w inkubatorze Heraeus w obecności CO2. Replikację wirusa oznaczono w opisany poniżej sposób.
Protokół 2
Zmieszano 30 μl zawiesiny bakteryjnej (Supra) z 70 μl pożywki M199 wzbogaconej 10% bulionu fosforanu tryptozy (Flow) i 5% roztworem trypsyny-EDTA (Seromed), (rozcieńczonej w stosunku 1:4 w przypadku komórek HT-29) i naniesiono bezpośrednio na komórki w płytkach do mikromiareczkowania. Po godzinnej inkubacji w 37°C do komórek w płytkach do mikromiareczkowania dodano 100 μl wirusa we wzbogaconej pożywce M199. Inkubację kontynuowano przez 18 godzin w inkubatorze (Heraeus). Ocenę replikacji wirusa opisano poniżej.
Replikację wirusa oceniono przez barwienie histoimmunologiczne białek rotawirusa w zainfekowanych bakteriach, co zostało opisane.
Jeden dzień po infekcji pożywkę usunięto z płytek, a komórki utrwalano etanolem absolutnym przez okres 10 minut. Etanol usunięto, a płytki trzykrotnie przemyto buforem PBS. Następnie do każdej studzienki dodano 50 μl surowicy antyrotawirusowej (otrzymanej z ISREC University of Lausanne)
PL 198 626 B1 wytworzonej przez króliki (skierowanej głównie przeciwko białku VP6), rozpuszczonej w PBS w stosunku 1:2000 i inkubowano przez 1 godzinę, w temperaturze 37°C, pod przykryciem, w celu uniknięcia wysychania studzienek. Następnie surowicę odpornościową usunięto a płytki trzykrotnie przemyto PBS. Kolejnym etapem było dodanie do każdej studzienki 50 ąl przeciwciała z surowicy odpornościowej wytworzonej przez kozy przeciw króliczej immunoglobulinie G (IgG), sprzężonego z peroksydazą (GAR-IgG-PO; Nordic), rozcieńczonego w PBS w stosunku 1:500 i inkubowanie przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
Surowicę usunięto, a płytki po raz kolejny trzykrotnie przemyto PBS. Następnie dodano do każdej studzienki 100 ąl mieszaniny podłoża o następującym składzie: 10 ml 0,05 M Tris-chlorowodorku (pH 7,8), 1 ml H2O2 (30% suprapur, rozcieńczonego wodą w stosunku 1:600; Merck) i 200 ąl 3-amino-9-etylokarbazolu (0,1 g/10 ml etanolu przechowywanego w porcjach 200 ąl, w temperaturze -80°C; A-5754; Sigma). Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Następnie podłoże usunięto, a studzienki napełniono 200 ąl wody, aby przerwać reakcję. Ogniska zakażonych komórek liczono przy użyciu mikroskopu odwróconego (Diavert; Leitz).
Jedynie kilka szczepów bakterii wchodziło w interakcję z rotawirusem. Spośród pierwotnie wybranych 260 komórek bakterii zaledwie 9 hamowało replikację rotawirusa w co najmniej jednym protokole. Szczep Lactobacillus paracasei NCC 2461 (ST11) wykazał wyjątkowo dużą aktywność przeciwko rotawirusowi serotyp 1, rotawirusowi SA-11 serotyp 3 i rotawirusowi Hochi serotyp 4.
P r z y k ł a d 3
Właściwości ST11
Szczep ST11 poddano inkubacji w płynie o właściwościach przypominających sok żołądkowy. Płyn przypominający sok żołądkowy przygotowano rozpuszczając pepsynę (3 g/l) w sterylnym roztworze soli (0,5% wagowo/objętościowy) i doprowadzając pH do wartości odpowiednio 2,0 i 3,0 przy użyciu stężonego HCl. Szczep ST11 hodowano w różnych ilościach powyższej pożywki i określono oporność mikroorganizmów.
Wyniki podsumowano w tabeli I, przedstawionej poniżej
T a b e l a I
pH cfu/ml przy T=0 min. cfu/ml przy T=1 min. cfu/ml przy T=15 min. cfu/ml przy T=30 min. cfu/ml przy T=60 min.
2,0 2,0 x 109 1,8 x 109 1,2 x 109 3,7 x 108 7,0 x 103
3,0 2,0 x 109 1,9 x 109 1,7 x 109 1,7 x 109 8,4 x 108
Bakterie szczepu ST11 mają następujące właściwości, zdefiniowane według metod ujawnionych w „The Genera of lactic acid bacteria” wyd. B.J.B. Wood i W.H. Holzapfel, Blackie A&P.
- gram-dodatnie - katalazo-ujemne
- nie wytwarzają NH3 z argininy
- nie wytwarzają CO2
- wytwarzają kwas mlekowy L(+)
- rosną w obecności soli kwasu żółciowego w stężeniu do około 0,4%
P r z y k ł a d 4
Hodowla szczepu ST11 w różnych warunkach
Bakterie szczepu ST11 inkubowano w różnym czasie w temperaturze 37°C w pożywce pomidorowej (4% pomidorowy proszek uwodniony w destylowanej wodzie) uzupełnionej sacharozą (0; 0,5; 1; lub 2%), lub peptonem sojowym (0,5%), lub też glukozą (0,5%). Wyniki przedstawiono na Fig. 2.
Bakterie szczepu ST11 dodawano następnie (w ilości 2,5%) do pożywki składającej się z mąki ryżowej (3%), mąki pszennej (2%) oraz sacharozy (3%), i inkubowano w temperaturze 37°C do czasu osiągnięcia pH 4,4. Po ostudzeniu, produkt ten pakowano z dodatkiem witaminy C (lub bez) i przechowywano w temperaturze 10°C.
P r z y k ł a d 5
Indukcja przez ST11 syntezy mRNA IL-12 i IL-10 w mysich komórkach przylegających
Komórki szpiku kostnego izolowano z kości udowych i kości piszczelowych ośmiotygodniowych myszy C57BL/6, wolnych od specyficznych patogenów, i inkubowano (w stężeniu 2 x 106 komórek/ml) w pożywce RPMI (Gibco) zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą, 1 mM L-glutaminy, 12 mM Hepes, 0,05 mM 2-merkaptoetanolu, penicylinę (100 U/ml) oraz streptomycynę (100 ąg/ml, wszystkie
PL 198 626 B1 odczynniki z Gibco) przez 12 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Nieprzylegające komórki odrzucano przeprowadzając trzy kolejne płukania w ciepłej pożywce hodowlanej, a pozostałe przylegające komórki zbierano i inkubowano w stężeniu 106 komórek/ml przez sześć godzin w obecności bakterii lub bez. Wcześniej ustalono, że sześć godzin reprezentuje optymalny punkt czasowy dla syntezy mRNA cytokiny przez komórki przylegające w odpowiedzi na LPS. Bakterie dodawano w różnych stężeniach w zakresie od 107 do 109 cfu/ml. Bakterie hodowano i przechowywano według powyższego opisu.
Pod koniec sześciogodzinnego okresu hodowli izolowano komórki przez wirowanie i lizowano je używając zestawu odczynników TRIzol (GibcoBRL, Nr kat. 15596-018), zgodnie z zaleceniami producenta. Całkowity RNA izolowano przez precypitację w izopropanolu, po czym uzyskiwano cDNA metodą odwrotnej transkrypcji przez 90 minut w temperaturze 42°C, używając 200 jednostek odwrotnej transkryptazy (Superscrit II, BRL) w objętości reakcyjnej 40 ąl, zawierającej 200 mM Tris (pH 8,3), 25 mM KCl, 1 ąg/ml oligo-d(T)15 (Boehringer Mannheim) 1 mM DTT (Boehringer Mannheim) 4 mM każdego dNTP (Boehringer Mannheim) oraz 40 U/ml Rnasin (Promega). Startery i warunki dla reakcji PCR stosowano zgodnie z opisem w Kopf i in., (Jurnal of Experimental Medicine, 1996, Sep 1, 184 (3):1127-36). Normalizowano ilości cDNA w próbkach używając starterów specyficznych wobec genu β-2-mikroglobuliny (należącego do grupy genów powszechnie wyrażanych). Produkty reakcji PCR rozdzielano na 2% żelu agarozowym i analizowano prążki w świetle UV.
Jak pokazano na Fig. 4, szczep ST11 wykazał najsilniejszą indukcję mRNA IL-12 i IL-10, w zakresie porównywalnym do wartości obserwowanych dla kontroli pozytywnej (E. coli). Różnice są najlepiej widoczne przy małym stężeniu bakterii (107 cfu/ml).
P r z y k ł a d 6
Supresja syntezy IL-4 przez ST11
Limfocyty T CD4+ oczyszczono ze śledziony myszy BALB/c, wolnych od specyficznych patogenów, używając zestawu MiniMACS z firmy Miltenyi Biotec (Nr kat. 492-01). Limfocyty T CD4+ hodowano w stężeniu 2 x 105 komórek/ml w pożywce RPMI zawierającej płodową surowicę bydlęcą (10%), L-glutaminę (1 mM), Hepes (12 mM), 2-merkaptoetanol (0,05 mM), penicylinę (100 U/ml) oraz streptomycynę (100 ąg/ml), i aktywowano w ciągu tygodnia przez sieciowanie ze związanymi na płytce monoklonalnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD3 (klon 2C11) i CD28 (klon 37.51, oba przeciwciała z firmy Pharmingen). Podczas hodowli pierwotnej, limfocyty T CD4+ hodowano wspólnie z komórkami przylegającymi ze szpiku kostnego (izolowanymi jak opisano powyżej), jako komórkami pomocniczymi, oraz z bakteriami ST11 (108 cfu/ml), lub bakteriami La1 (108 cfu/ml), lub 1 mg/ml LPS, lub też z samą pożywką. Po inkubacji, komórki płukano, a następnie znów oczyszczano limfocyty T CD4+ przy użyciu technologii z zestawem MiniMACS, i ponownie stymulowano je we wtórnej hodowli zawierającej samą pożywkę. Poziom cytokin produkowanych przez zróżnicowane limfocyty T CD4+ mierzono w supernatantach po dwóch dniach, używając metody „kanapkowa ELISA” (zestawy z firm Endogen i Pharmingen).
Wyniki przedstawiono na Fig. 5. Komórki zróżnicowane w obecności samej pożywki wykazywały dominację fenotypu Th2, charakteryzującego się wysokimi poziomami IL-4. Dodatek bakterii ST11 do hodowli pierwotnych miał silny modulujący wpływ na wynik różnicowania Th2, co dawało ośmiokrotny spadek produkcji IL-4. Rozmiary tej inhibicji przypominały wartości obserwowane w hodowlach pochodzących od komórek zróżnicowanych w obecności LPS. W przeciwieństwie do tego, drugi szczep Lactobacillus nie miał mierzalnego wpływu na poziomy IL-4. Co ciekawe, poziomy IFN-γ nie wzrastały po dodaniu ST11 do hodowli pierwotnej.
P r z y k ł a d 7
Szczep ST11 poddano testowi klinicznemu przeprowadzonemu w społeczności zamieszkującej obrzeża miasta Gwatemala, w którym sprawdzano zdolność tych bakterii do wpływania na przenoszenie się i doświadczanie ostrej choroby biegunkowej sezonu deszczowego przez większość dzieci z tego obszaru. Ogółem zarejestrowano w tym badaniu 203 dzieci, w wieku od 35 do 70 miesięcy, które otrzymywały porcję 1010 żywych organizmów (ST11) lub nie (placebo), w okresie karmienia przez 29 dni. Dzieci wyselekcjonowane do obu grup, testowej i kontrolnej (placebo), odpowiednio, miały typowe objawy niedowagi i obniżonego wzrostu (względem norm dla poszczególnych grup wiekowych) na skutek niedożywienia.
Przed rozpoczęciem testu karmienia u dzieci w wieku przedszkolnym, przeprowadzono analizę bezpieczeństwa testu w oparciu o badania in vitro oraz in vivo. Badania in vitro wykazały wzór oporności antybiotykowej podobny do tych, które obserwuje się w przypadku innych bakterii Lactobacillus,
PL 198 626 B1 mających zastosowanie spożywcze i nie mających potencjału do tworzenia biogennych amin, degradacji mucyn oraz rozkładu soli kwasu żółciowego. W badaniu klinicznym opartym o grupę kontrolną (placebo), przeprowadzonym na 42 ochotnikach, stwierdzono, że ST11 jest dobrze tolerowany i nie wywołuje żadnych szkodliwych działań wśród potencjalnych objawów monitorowanych, takich jak wzdęcia z oddawaniem wiatrów, liczba stolców w ciągu dnia i ich konsystencja; poziom białek ostrej fazy w surowicy krwi również nie wzbudził żadnych zastrzeżeń co do potencjalnej możliwości wzbudzenia reakcji zapalnej.
Próbki testowe oraz placebo pakowano w saszetki wyprodukowane przez oddział Nestle Product Technology Center w Konolfingen (Szwajcaria), i wysyłano zamrożone do Gwatemali. Każda 10-gramowa saszetka zawierała nośnik o smaku czekoladowym i albo 0,2 g ST11 (1010 cfu), albo w przypadku placebo 0,2 g mleka w proszku. Nośnik o smaku czekoladowym składał się ze sproszkowanego ziarna kakaowego, cukru, lecytyny sojowej, waniliny i cynamonu. Saszetki przechowywano w temperaturze 4-6°C do dwóch godzin przed użyciem. Przed użyciem należało rozpuścić ich zawartość w 100 ml wody (dostarczonej przez Nestlee), wolnej od jakichkolwiek zanieczyszczeń bakteryjnych.
Zgodnie z zastosowanym protokołem, biegunkę zdefiniowano jako wystąpienie trzech lub więcej płynnych lub nieuformowanych wypróżnień w przeciągu 24 godzin. Epizod biegunkowy został zdefiniowany jako zdarzenie obejmujące występowanie objawów biegunki (trzy wypróżnienia biegunkowe w ciągu 24 godzin). Jego całkowitą długość w godzinach obliczano od momentu pierwszego z serii trzech wskaźnikowych stolców do momentu pojawienia się pierwszego uformowanego stolca, lub też okresu 48 godzin bez opróżnień. Określenie „nowego” epizodu u dziecka oznaczało, że od poprzedniego epizodu upłynęło co najmniej 48 godzin. W przeciwnym wypadku, był on traktowany jako kontynuacja tego samego epizodu, którego całkowity okres trwania był później uwzględniany przy ocenach. Jako „przypadek” określano dziecko, które doświadczyło jednego lub więcej udokumentowanych epizodów biegunki w ciągu 29-dniowego okresu obserwacji. Ocena intensywności epizodu biegunkowego oparta była na całkowitej liczbie wytworzonych luźnych stolców. Elementy ostrości przebiegu epizodu obejmowały takie objawy jak obecność krwi, śluzu lub ropy w stolcach, a także objawy gorączki i wymiotów. Intensywność siedmiu stolców w ciągu 24 godzin, lub też konieczność profesjonalnej interwencji medycznej w klinice, szpitalu, lub centrum medycznym, były oznaką pozwalającą zaklasyfikować dany przypadek jako ciężki.
Gdy w ramach systemu obserwacji u pacjentów zdiagnozowano epizod biegunkowy, pobierano próbkę stolca biegunkowego do badań mikroskopowych i do hodowania w celu identyfikacji potencjalnych patogenów odpowiedzialnych za ten epizod. Próbkę diagnozowano pod kątem antygenów rotawirusa, lamblii (Giardia) i E. histolytica, jeśli był to przypadek czerwonkowy, oraz pod kątem obecności patogenów bakteryjnych, takich jak Shigella, Salmonella, Aeromonas, Plesiomonas shigelloides, E. coli oraz możliwej V. cholerae.
Podczas prowadzenia badania pobierano próbki aplikowanego produktu, w celu sprawdzenia przeżywalności mikroorganizmów (w tym także w okresie ich podawania). Wykazano, że mikroorganizmy zachowywały żywotność w saszetkach w przeciągu całego okresu badań. Nawet pod koniec badania saszetki dostarczały 1010 żywych mikroorganizmów po rozpuszczeniu w wodzie.
Badanie ujawniło, że próbka zawierająca probiotyczny mikroorganizm zmniejsza występowanie biegunki o 30% w porównaniu z grupą kontrolną (placebo). Także kontrolna grupa wykazywała zmniejszoną liczbę biegunek w porównaniu z normalną populacją nie otrzymującą ani badanej próbki, ani placebo. Ten ostatni wynik można częściowo wyjaśnić faktem otrzymywania przez dzieci dodatkowego wartościowego pożywienia i wolnej od zanieczyszczeń wody. Jednakże, ponieważ badanie przeprowadzono w terenie, można z niego jasno wywnioskować, że ST11 może z pewnością zmniejszyć występowanie biegunki in vivo.

Claims (6)

1. Szczep Lactobacillus paracasei, znamienny tym, że jest szczepem Lactobacillus paracasei CNCM I-2116.
2. Zastosowanie szczepu Lactobacillus paracasei określonego w zastrz. 1 do przygotowania doustnego materiału nośnikowego, który jest kompozycją żywnościową wybraną z grupy obejmującej
PL 198 626 B1 mleko, jogurt, twaróg, ser, mleko kwaśne, produkty fermentowane oparte na mleku, lody, produkty fermentowane oparte na zbożu, mleko w proszku, mieszanki dla niemowląt.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że szczep Lactobacillus jest zawarty w materiale nośnikowym w ilości od 105 cfu/g do 1012 cfu/g materiału nośnikowego.
4. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3, znamienne tym, że wytwarzany materiał nośnikowy przeznaczony jest do leczenia i/lub profilaktyki zaburzeń związanych z biegunką.
5. Żywnościowa lub farmaceutyczna kompozycja zawierająca bakterie należące do rodzaju Lactobacillus, znamienna tym, że zawiera szczep bakterii określony w zastrz. 1.
6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej mleko, jogurt, twaróg, ser, mleko kwaśne, produkty fermentowane oparte na mleku, lody, produkty fermentowane oparte na zbożu, mleko w proszku, mieszanki dla niemowląt, tabletki, ciekłe zawiesiny bakteryjne, suche dodatki doustne, mokre dodatki doustne, suche lub mokre pokarmy w tubkach.
PL350768A 1999-03-11 2000-03-02 Szczep Lactobacillus paracasei, zastosowanie tego szczepu i żywnościowa lub farmaceutyczna kompozycja zawierająca bakterie należące do rodzaju Lactobacillus PL198626B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99104924A EP1034788A1 (en) 1999-03-11 1999-03-11 Lactic acid bacteria strains capable of preventing diarrhea

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL350768A1 PL350768A1 (en) 2003-01-27
PL198626B1 true PL198626B1 (pl) 2008-07-31

Family

ID=8237748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL350768A PL198626B1 (pl) 1999-03-11 2000-03-02 Szczep Lactobacillus paracasei, zastosowanie tego szczepu i żywnościowa lub farmaceutyczna kompozycja zawierająca bakterie należące do rodzaju Lactobacillus

Country Status (27)

Country Link
US (1) US7029669B1 (pl)
EP (3) EP1034788A1 (pl)
JP (1) JP2002537866A (pl)
CN (1) CN1195530C (pl)
AR (1) AR022913A1 (pl)
AT (1) ATE267605T1 (pl)
AU (1) AU779804B2 (pl)
BR (1) BR0008912B1 (pl)
CA (1) CA2364436C (pl)
CO (1) CO5210969A1 (pl)
CZ (1) CZ300862B6 (pl)
DE (1) DE60011061T2 (pl)
DK (1) DK1165104T3 (pl)
ES (1) ES2220420T3 (pl)
HU (1) HUP0200206A3 (pl)
ID (1) ID30510A (pl)
IL (1) IL145078A0 (pl)
MY (1) MY127895A (pl)
NO (1) NO327205B1 (pl)
NZ (1) NZ513805A (pl)
PE (1) PE20001540A1 (pl)
PL (1) PL198626B1 (pl)
PT (1) PT1165104E (pl)
RO (1) RO121699B1 (pl)
RU (1) RU2246956C2 (pl)
WO (1) WO2000053201A1 (pl)
ZA (1) ZA200107294B (pl)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0114400B8 (pt) 2000-10-06 2021-05-25 Nestle Sa uso de bactéria de ácido lático probiótica para equilibrar o sistema imunológico da pele
KR100419132B1 (ko) * 2000-12-29 2004-02-18 조성근 위·장 점막 부착성과 증식성, 내산성, 내담즙성 및헬리코박터 파일로리, 대장균 0157:ｈ7에 대한 항균성이우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이ｃｓｋ 01
ATE409220T1 (de) 2002-03-21 2008-10-15 Bifodan As Lactobacillus-stämme
EP1384483A1 (en) * 2002-07-23 2004-01-28 Nestec S.A. Probiotics for treatment of irritable bowel disease (IBS) through improvement of gut neuromuscular function
JP2005139160A (ja) * 2003-03-13 2005-06-02 Kirin Brewery Co Ltd 抗アレルギー用組成物
US20050158294A1 (en) 2003-12-19 2005-07-21 The Procter & Gamble Company Canine probiotic Bifidobacteria pseudolongum
US8877178B2 (en) 2003-12-19 2014-11-04 The Iams Company Methods of use of probiotic bifidobacteria for companion animals
KR100686557B1 (ko) * 2004-08-16 2007-02-23 씨제이 주식회사 체지방 저하 기능성 락토바실러스 람노서스와 이를 함유한 식품
US7858073B2 (en) * 2004-08-17 2010-12-28 Hunter Technology Limited Oral killed vaccines and method for providing same
EP1683425A1 (en) * 2005-01-21 2006-07-26 Compagnie Gervais Danone Use of a fermented milk containing L. Casei for the manufacture of a composition for the prevention or treatment of a delayed-type hypersensitivity reaction
JP4847038B2 (ja) * 2005-04-11 2011-12-28 ゲンモント バイオテック インコーポレイティド ラクトバチルス・パラカゼイの新規微生物株ｇｍ−０８０及びアレルギー関連疾患を処置するためのその使用
AU2006253007B2 (en) 2005-05-31 2012-12-20 Alimentary Health Ltd Feline probiotic Bifidobacteria
EP2270131A1 (en) 2005-05-31 2011-01-05 The Iams Company Feline probiotic lactobacilli
JP2007028920A (ja) * 2005-07-22 2007-02-08 Japan Research & Development Association For New Functional Foods 発酵乳およびその製造方法
US7374924B2 (en) 2006-06-05 2008-05-20 Biogaia Ab Use of selected lactic acid bacteria for reducing infantile colic
CN101273738B (zh) * 2007-03-28 2011-06-01 哈尔滨正方科技有限公司 在常温下保持高活菌数的调配型酸性乳饮料的制备方法
US9771199B2 (en) 2008-07-07 2017-09-26 Mars, Incorporated Probiotic supplement, process for making, and packaging
RU2509478C2 (ru) * 2008-12-05 2014-03-20 Нестек С.А. Пробиотическая композиция, предназначенная для младенцев с низкой массой тела при рождении
WO2010103132A1 (es) * 2009-03-10 2010-09-16 Hero España, S.A. Aislamiento, identificación y caracterización de cepas con actividad probiótica a partir de heces de lactantes alimentados exclusivamente con leche materna
MX338680B (es) * 2009-05-11 2016-04-27 Nestec Sa Bifidobacterium longum ncc2705 (cncm i-2618) y padecimientos inmunes.
US10104903B2 (en) 2009-07-31 2018-10-23 Mars, Incorporated Animal food and its appearance
JP2013507394A (ja) * 2009-10-09 2013-03-04 プロセラ インコーポレイテッド 自閉症スペクトル障害と診断されたヒトにおいて自閉症スペクトル障害に関連する少なくとも一つの症状を低減するための、ペディオコッカス属を含む組成物及び方法
JP5261617B2 (ja) * 2011-03-31 2013-08-14 森永乳業株式会社 新規乳酸菌、並びに新規乳酸菌を含有する医薬、飲食品、及び飼料
EP3366143A1 (en) 2011-06-20 2018-08-29 H.J. Heinz Company Brands LLC Probiotic compositions and methods
JP6765370B2 (ja) * 2014-10-21 2020-10-07 アキロン セイエレ エセ．エレ． プロバイオティクス組成物及びプレバイオティクス組成物
WO2016118730A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of short chain fatty acids in cancer prevention
KR101885863B1 (ko) * 2015-11-18 2018-08-06 서울대학교산학협력단 항 노로바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주 및 이를 포함하는 항바이러스 조성물
JP7466166B2 (ja) * 2018-08-08 2024-04-12 有限会社バイオ研 乳酸菌含有ウイルス感染防御剤及びその製造方法
CN111034795A (zh) * 2018-10-11 2020-04-21 杭州贝谷生物科技有限公司 高含谷胱甘肽和s-腺苷-l-蛋氨酸酸奶的生产方法
US20210346434A1 (en) 2019-01-16 2021-11-11 N.V. Nutricia Fermented formula with non-digestible oligosaccharides for use in rotavirus induced infection

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE161181T1 (de) * 1992-07-06 1998-01-15 Nestle Sa Lactobacillus acidophilus enthaltende antigastritis-mittel
HU220190B (hu) * 1994-05-26 2001-11-28 Bracco S.P.A. Humán eredetű Lactobacillus törzsek, ilyen törzseket tartalmazó gyógyászati készítmények és alkalmazásuk
US5837238A (en) * 1996-06-05 1998-11-17 Biogaia Biologics Ab Treatment of diarrhea
IT1284877B1 (it) * 1996-08-09 1998-05-22 Dicofarm Spa Trattamento delle diarree acute del bambino e prevenzione della sensibilizzazione allergica verso alimenti introdotti nella fase
IT1289984B1 (it) * 1997-02-27 1998-10-19 Proge Farm Srl Ceppi di lattobacilli utili nel trattamento di disfunzioni del sistema gastrointestinale
SK283008B6 (sk) * 1997-08-21 2003-01-09 New Zealand Dairy Board Biologicky čistá kultúra Lactobacillus rhamnosus, kompozícia s jej obsahom a jej použitie
SE510813C2 (sv) * 1997-12-08 1999-06-28 Arla Ekonomisk Foerening Bakteriestam av arten Lactobacillus Paracasei subsp. paracasei, sammansättning därav för användning i livsmedel, samt produkt innehållande stammen
HUP0200374A2 (en) * 1999-03-11 2002-06-29 Nestle Sa Lactobacillus strains capable of preventing diarrhoea caused by pathogenic bacteria and rotaviruses

Also Published As

Publication number Publication date
ES2220420T3 (es) 2004-12-16
WO2000053201A1 (en) 2000-09-14
CA2364436A1 (en) 2000-09-14
HUP0200206A2 (hu) 2002-05-29
DK1165104T3 (da) 2004-08-16
AR022913A1 (es) 2002-09-04
EP1034788A1 (en) 2000-09-13
PT1165104E (pt) 2004-09-30
AU3162800A (en) 2000-09-28
US7029669B1 (en) 2006-04-18
NO20014296L (no) 2001-11-05
ZA200107294B (en) 2003-02-26
CO5210969A1 (es) 2002-10-30
DE60011061T2 (de) 2005-05-25
AU779804B2 (en) 2005-02-10
PL350768A1 (en) 2003-01-27
IL145078A0 (en) 2002-06-30
BR0008912A (pt) 2002-01-15
NO327205B1 (no) 2009-05-11
NZ513805A (en) 2001-09-28
ID30510A (id) 2001-12-13
ATE267605T1 (de) 2004-06-15
RU2246956C2 (ru) 2005-02-27
CN1350460A (zh) 2002-05-22
RO121699B1 (ro) 2008-02-28
PE20001540A1 (es) 2001-01-31
CA2364436C (en) 2011-01-11
EP1165104B1 (en) 2004-05-26
JP2002537866A (ja) 2002-11-12
DE60011061D1 (de) 2004-07-01
BR0008912B1 (pt) 2011-08-23
CZ20013265A3 (cs) 2002-02-13
HUP0200206A3 (en) 2002-06-28
EP1165104A1 (en) 2002-01-02
CZ300862B6 (cs) 2009-08-26
MY127895A (en) 2006-12-29
NO20014296D0 (no) 2001-09-04
CN1195530C (zh) 2005-04-06
EP1415656A1 (en) 2004-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1165104B1 (en) Lactobacillus parcasei strain capable of preventing diarrhoea
RU2243779C2 (ru) Штамм молочно-кислых бактерий lactobacillus paracasei cncm i - 2116 (ncc 2461), обладающий способностью предотвращать колонизацию кишечника патогенными бактериями, вызывающими диарею, супернатант его культуры и принимаемое внутрь средство для профилактики и/или лечения нарушений, ассоциируемых с диареей
CA2313245C (en) Strain of bacteria of the species lactobacillus paracasei subsp. paracasei, composition thereof for use in food and product containing said strain
US6887465B1 (en) Lactobacillus strains capable of preventing diarrhoea caused by pathogenic bacteria and rotaviruses
MXPA01008927A (en) Lactic acid bacteria strains capable of preventing diarrhoea
MXPA01008976A (en) Lactobacillus strains preventing diarrhoea pathogenic bacteria