BG61191B1 - Методът за получаване на телесно защитно вещество ВРС от човешки или животински стомашен сок, се характеризира със следните етапи на производство: събраният и хомогенизиран животински или човешки стомашен сок се разделя на твърди части и течна супернатанта чрез центрофугиране; течната супернатанта се диализира и лиофилизира; сухият остатък се пречиства през хроматографска колона, напълнена със слабо алкална, модифицирана йонообменна смола или гел; концентратът отново се диализира и лиофилизира; сухият остатък се пречиства чрез гел- хроматография; веществото ВРС се получава накрая от концентрата при използване на диализа и лиофилизация. - Google Patents

Abstract

Методът за получаване на телесно защитно вещество ВРС от човешки или животински стомашен сок, се характеризира със следните етапи на производство: събраният и хомогенизиран животински или човешки стомашен сок се разделя на твърди части и течна супернатанта чрез центрофугиране; течната супернатанта се диализира и лиофилизира; сухият остатък се пречиства през хроматографска колона, напълнена със слабо алкална, модифицирана йонообменна смола или гел; концентратът отново се диализира и лиофилизира; сухият остатък се пречиства чрез гел- хроматография; веществото ВРС се получава накрая от концентрата при използване на диализа и лиофилизация.

Description

Изобретението се отнася до ново вещество ВРС, до метод за неговото получаване от човешки или животински стомашен сок и до терапевтичното му приложение.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Стомашният сок, считан като секреция на париеталните, и на други клетки, съдържа редица електролитни компоненти, солна киселина, редица ензими, по-точно пепсин, други протеинази, ренин, липаза, уреаза и лизозим. В него присъстват много пептиди и пептидни фрагменти, например пептидният хормон гастрин, и много активни стимуланти на стомашната секреция, открити за първи път от Едкинс /I/.

В естествения стомашен сок присъстват гликопротеини, които са описани /2/ и интринсик фактор /ИФ/, който е термонеустойчив мукопротеин с молекулно тегло около 60 000. Този фактор ускорява абсорбацията на витамин В_|2/3/.

В стомашния сок досега не е открито вещество с много силни противостресови въздействия и с други телесно-защитни ефекти.

До момента стомашночревният тракт, по-специално стомахът, се считаше за орган, който е обект на въздействие на стреса. Никога не е обсъждана възможността стомашночревният тракт, за предпочитане стомахът, да е орган, който може да инициира защитния отзив на целия организъм. Този отзив насочен действително срещу стреса, трябва да се осъществява в образуването и освобождаването на ново ендогенно средство. Нашите опити бяха насочени към изолиране на това средство от стомашния сок. Накрая очакваното вещество бе изолирано от стомашния сок на 42-ма пациента, което е означено със съкращението ВРС, означаващо телесно-защитно вещество.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Строежът на веществото ВРС е много сложен и след продължителни проучвания до момента може да се охарактеризира като огънат протеин с частична последователност от N-ния край

H₂N-Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-ProAla-Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val-COOH

То има молекулно тегло около 40 000 ± 5 000 Далтона, определено с помощта на гелхроматография.

Съгласно изобретението средството ВРС се приготвя от човешки или животински стомашен сок, който първоначално се хомогенизира и центрофугира, след което супернатантата се пречиства посредством диализа, йонообменна хроматография, повторно чрез диализа и лиофилизация, като накрая средството ВРС се получава при използване на гел-хроматография, диализа и лиофилизация.

Това вещество не е описано и публикувано никъде и никога не е използвано като лекарствено средство.

Изследването на биологичните въздействия на ВРС при използването на много методики на in vivo u in vitro-анализ показват изненадващо широк спектър на активности, но е известно, че много заболявания и патологични състояния могат да се проявят при стрес или, от друга страна, самата травма или заболяване може да причини стрес. Тези резултати също подсказват, че ВРС се продуцира от стрес, независимо от неговия произход.

Средството ВРС съгласно изобретението е изследвано in vitro u in vivo (плъхове, мишки, зайци и гвинейски свинчета) и са установени следните фармакологични свойства:

1. Остра токсичност

Острата токсичност е определена при мишки /18-25 g телесно тегло/ /умъртвявани след 30-тия ден от опитния период/ от двата пола, на които ВРС е въвеждан интраперитонеално, интра венозно и интрагастренално. Леталната доза не е установена дори при използването на такива високи дози като 100 mg/ kg телесно тегло, които са най-малко 10М0⁵ пъти по-високи от минималната ефективна доза. За дълъг период от време ВРС се инжек2 .-Як тира интраперитонеално, интравенозно и интрагастренално (30 mg/kg) веднъж на ден в продължение на 30 дни. Не са установени патологични изменения (морфологични или физиологични). В допълнение, средните ефективни дози са от порядъка на 0,01 до 50 gg/kg при парентерално въвеждане и Т1 е най-малко 1000.

2. Язви, предизвикани чрез потопяване във вода или чрез умерен стрес

Използват се мъжки плъхове /180-240 g/ от порода Вистар. Животните се потапят в студена вода /26°С/ в продължение на 3 часа или се ограничават в продължение на 48 часа. След края на експерименталния период стомахът се изследва за наличието на увреждания (“стресови язви”). ВРС се инжектира интраперитонеално и интрагастренално (от 0,1 до 10 gg/kg) един час или 24 часа преди предизвикването на уврежданията. Върху гастритните увреждания ВРС показва силно защитно действие.

3. Язви, предизвикани чрез свързване на жлъчния канал и на чернодробната артерия или чрез въвеждане на цистеамин.

Опитите на лигатиране се осъществяват върху мъжки плъхове (160-250 g) от породата Вистар. Осъществява се връзването на жлъчния канал и на чернодробната артерия. Тази процедура предизвиква тежки исхемични некротични увреждания на тъканите на черния дроб и язви на стомаха и дванадесетопръстника в интервали от 6-24 часа.

Аналогично за предизвикване на язви на дванадесетопръстника се прилага цистеамин (400 mg/kg) на женски плъхове в продължение на 24-ри часов период.

ВРС се въвежда интраперитонеално в дози от 0,1 до 10 gg/kg. Големите язви, предизвикани от описаната литература на стомаха и дванадесетопръстника се предотвратяват в голяма степен при третираните с ВРС животни. Аналогично, предизвиканите от цистеамин язви също се предотвратяват при предварително прилагане на ВРС на животните.

4. Влияние върху предизвикан инфаркт върху миокарда

Мъжки плъхове (180-240 g) от порода Вистар се обездвижват в продължение на 24 часа. След това животните се обработват с индометацин (25 mg/kg подкожно) в началния момент на обездвижването и 12 часа след него.

ВРС (50 gg/kg) се прилага един час преди процедурата и на 6-тия и 18-тия час от ограничаването.

Във втората група животните се ограни5 чават в продължение на 48 часа. След тези процедури те се умъртвяват и се определят стойностите на ензима.

Отбелязва се полученото защитно въздействие на ВРС.

При тези опити защитният ефект е много изразителен. Обратно, не се забелязват защитни ефекти при предизвикани с изопреналин увреждания на сърцето. Изопреналинът (30 mg/kg, интраперитонеално) се прилага в на15 чалния момент на опита и 24 часа по-късно.

ВРС (50 gg/kg, интраперитонеално) се прилага един час преди въвеждането на изопреналина. Животните се умъртвяват 24 часа след повторното третиране е изопреналин и се 20 изследват.

5. Въздействие върху артериалното налягане

Използват се мъжки плъхове (180-220 g), анестезирани с уретан. Сънната артерия се ка25 нулира и кръвното налягане се записва с динограф. ВРС се въвежда интравенозно в югуларната вена в дози от 1 Ogg до 5 mg/kg. Резултатите сочат липса на промени в артериалното налягане на животните в групата плъхове, пригот30 вени по описания начин. Кратковременни промени на артериалното налягане се предизвикват чрез интравенозно въвеждане на норадреналин, адреналин, 5-НТ, ацетилхолин или изопреналин. Животните, предварително обработени 35 с ВРС в дози от 10 gg до 5 mg/kg не изменят промяната на кръвното налягане, предизвикана от използваните вазоактивни средства.

6. Въздействие върху увреден черен дроб Експериментът се осъществява с мъжки плъхове (180-250 g) от порода Вистар. Свързват се долната част на жлъчния канал и на чернодробната артерия. Тази интервенция предизвиква сериозни исхемични некротични увреждания на тъканта на черния дроб в интер45 вали от 6 до 24 часа. ВРС се въвежда интраперитонеално в дози от 0,1 до 10 gg/kg. Той предотвратява в голяма степен (например даден 1 час преди свързването) или напълно отстранява увреждането (например, инжектиран вед50 нага след лигатирането). В допълнение се демонстрира защитното действие върху черния дроб на ВРС, въведен интраперитонеално в дози от 10 gg/kg телесно тегло един час преди интоксикация на плъхове с тетрахлорметан, даден в дози от 0,1 до 10 ml/kg интрагастренално или интраперитонеално. ВРС (0,01 до 10gg/kg, интраперитонеално или интрагастренално) предотвратява също мастните промени на черния дроб, предизвикани чрез стрес от ограничаване в продължение на 48 часа.

7. Действие върху увреден панкреас

Използват се мъжки плъхове (170-240 g) от порода Вистар. Увреждането на панкреаса се предизвиква посредством лигатирането на жлъчния канал в точката на вливането му в дванадесетопръстника. Тази процедура причинява отчетлива некроза на панкреаса 24 часа по-късно и около 50 % от плъховете умират по време на този експериментален период. ВРС, въведен в дози от 0,1 до 10gg/kg интрапери-тонеално, проявява силно, зависещо от дозата, защитно действие. Демонстрира се значителен благоприятен ефект върху преживяемостта (82 %).

8. Действие върху увреден бъбрек а/едностранна нефректомия

Експериментите се осъществяват с албиносови плъхове (190-250 g) от порода Вистар от двата пола. Осъществява се едностранна нефректомия. Повишаването на теглото на останалия бъбрек се оценява в контролната и третираната с ВРС (10,0jug/kg живо тегло интраперитонеално един час преди процедурата) групи на 24-тия час след хирургическата интервенция. Установява се, че ВРС силно понижава увеличаването на органното тегло на останалия бъбрек.

Биохимичните параметри са сравними и в двете групи. Затова изглежда, че ВРС наистина подобрява функцията на останалата бъбречна тъкан.

б/ въвеждане на гентамицин

Експериментите се осъществяват с мъжки плъхове от порода Вистар. Увреждането на каналчетата се осъществява чрез въвеждане на гентамицин в доза 40 mg/kg интраперитонеално (един път дневно) в продължение на 30 дни. Всички животни се умъртвяват пет дни след последното третиране. В контролната група на животните, третирани с гентамицин и разсол, се установява увреждане на каналчето. В групата на третираните с ВРС патохистологичните прояви са значително по-малко.

9. Действие върху експериментален диабет

На мъжки плъхове (175-230 g) от порода Вистар се причинява диабетен мелитус със стрептозоцин или олоксан. ВРС в дози от 10 до 100j4g/kg, приложен интраперитонеално, понижава предизвикания със стрептозоцин диабет. Освен това ВРС увеличава значително времето на преживяване на животните.

10. Действие върху температурата

Антипиретичната активност на ВРС се демонстрира при мъжки плъхове (180-220 g) от порода Вистар при използването на инжекции с пивоварни дрожди. Предварителното третиране с ВРС, приложен в единични дози (5-20 gg/kg, интраперитонеално) един час преди инжектирането на дрождите, значително понижава увеличаването на температурата, измервана на 30-минутни интервали в продължение най-малко на три часа.

11. Действие върху причинени с карагенин едеми

Причиняват се експериментални отоци на мишки (18-24 g) от двата пола чрез инжектиране на карагенин в задните лапи. ВРС е ефективен в дози от 10 gg/kg, интраперитонеално, когато се инжектира един час преди опитната процедура, понижавайки обема на отока, причинен от посоченото средство. В допълнение ВРС в същите дози е неактивен при опита с гореща плоча /53,5°С/ върху мишки.

12. Действие върху експериментални ринити

Плъхове от порода Вистар се излагат на действието на пари на 10 %-ен формалдехид в продължение в продължение на един час ежедневно за период от 15 дни. В опитната група ВРС се въвежда в дози от 10 gg/kg, интраперитонеално, всеки ден един час преди излагането на парите. Животните се умъртвяват след 13-15 дни от третирането. При третираните с ВРС животни отоците на назалната лигавица са значително по-малки и епителиума е запазен в сравнение с контролната група. Секрецията е катарална и не е гнойна.

13. Действие върху експериментални фрактури

Влиянието на ВРС (10 gg/kg, интраперитонеално) върху експериментална фрактура се изследва при оздравителния процес на фрактури на пищялната кост на плъхове. По отношение на контролите хистологичното изследване сочи значително повишаване скоростта на оздравителния процес при всички плъ4

Μ sc, «..-τ-· j*W*e.»**r·**· ·- *· · .· ' ·>1Α6ll9l хове, третирани c BPC. В допълнение, при тях има значително по-малки локални хематоми в сравнение с контролата.

14. Действие върху експериментални изгаряния

Експерименталната методика изгаряне на кожата или на назалната мукоза се осъществява при мишки (20-25 g). В сравнение с контролната група (третирана със солев разтвор) не се забелязва гнойна секреция и се отбелязва повишаване скоростта на оздравителния процес при всички предварително третирани с BPC (IO pg/kg, интраперитонеално, един час преди експерименталната процедура) животни.

В допълнение, при животните с назални наранявания има също само много умерени посттравматични подутини на носа. Следователно, назалната респирация е само леко затруднена и преживяемостта не е нарушена. Тези резултати са в очевиден противовес с данните, получени при контролните групи.

15. Действие върху кожни рани

Експерименталната процедура се осъществява с плъхове (170-210 g) от порода Вистар. Кожните рани са причинени от широки резки на кожата. ВРС се въвежда интраперитонеално в единични дози от IO pg/kg преди нараняването. За разлика от контролните групи при третираните животни се отбелязват липса на гноясване и отоци, бедна формация на гранули и повишена скорост на оздравителния процес.

16. Неврофармакологична активност а/ неврофармакологичното изследване в съответствие с методиката на Ирвинг показва, че дори когато ВРС е приложен в дози, хилядократно по-високи от онези, които са доказали своята ефективност (терапевтична) при много различни модели (20,0 и 40,0 pg/kg телесно тегло, интраперитонеално или през устата) , не предизвикват значителна промяна в държането в сравнение с това на контролните мишки.

б/ на изолирано сърце на плъх и заек ВРС приложен в дози 30 pg/ml от Рингер-Лок разтвор, не предизвиква никаква промяна в интензивността и честотата на контракциите (препарат на Лангендорф).

в/ на изолиран илеумен модел (плъх, гвинейско свинче или заек) (препарат съгласно Магнус) ВРС, приложен в същата доза, не проявява никакво действие върху интестиналния тонус и върху контракциите, причинени от ацетилхолин, хистамин и серотонин.

17. Действие на ВРС върху забавен тип 5 реакция на свръхчувствителност (DTH) спрямо DNFB

Използва се модела на DTH реакция спрямо DNFB върху ухо или лапа на мишки от породата NMRI. Животните, които предва10 рително са третирани с две дози DNFB за повишаване на чувствителността, имат значително по-удебелени уши и лапи в сравнение с контролните животни. Мишки, предварително третирани с ВРС интраперитонеално, с доза 15 0,1 pg/10 g телесно тегло един час преди прилагането на опитната доза DNFB, показват значително по-малки различия между третираните и нетретираните уши/лапи.

18. Влияние върху големината на зеницата

При опита с мишки (18-22 g) от двата пола ВРС се капе в лявото око. Размерът на зеницата се измерва с помощта на монокуларни лещи. В допълнение, група животни се обработва с ВРС, въведен интраперитонеално. Резултатите сочат, че ВРС прикапан локално, не предизвиква миозис, а ВРС, инжектиран интраперитонеално, причинява свиване на зеницата с около 20 %. Този ефект трае наймалко 30 минути.

19. Влияние на ВРС върху поражения на колона

Предизвиква се контактна свръхчувствителност на мишка чрез прилагането на DNFB (2,4-динитрофлуорбензол). На мишката се дават две дози за повишаване на чувствителността от по 25 1 от 0,5 %-ен DNFB ( в съотношение 4 към 1 ацетон/маслинено масло) върху предварително обръсната кожа на абдоминалната стена в продължение на два последователни дни. 72 часа след прилагане на последната доза за повишаване на чувствителността на мишката се дава проба от 20 μΐ от 0,2 %-ен DNFB, трансректално в анестезиращ етер. Животните се умъртвяват 24 часа по-късно и колона (дебелото черво) се изследва. Патологичните промени в колона се изразяват в сериозни кръвоизливи и разязвявания. Тези поражения заемат при някои животни всички части на стената на колона, така че могат да се забележат и перфорации.

Прилагането на ВРС (0,1 pg/10 g) един час след пробата DNFB понижава в значителна степен обхвата на пораженията върху колона. Най-честото поражение е петехиален кръвоизлив.

20. Влияние върху туморни клетки а/ Две клетъчни линии 1-924 и меланома В-16 се култивират in vitro при стандартни условия. В PC се изпитва in vitro за активност върху растежа на споменатите клетъчни култури. Два дни след инициирането на клетъчните култури, ВРС се прибавя в 3 %-тна и 0,3 %-тна концентрация (0,1 ml). Три дни след тази процедура броят на клетките във всяка култура се определя с помощта на клетъчен брояч. Резултатите сочат, че ВРС има инхибиращ ефект върху двете клетъчни линии, например 1.924 и меланома В-16.

б/ Асцитният тумор Ерлих /ЕАТ/ е тумор, който се развива във всички породи мишки и може да нараства в асцитна или твърда форма в зависимост от пътя на въвеждането на туморните клетки. Правени са изследвания за определяне на това, дали инкубирането на ЕАТ клетки в разтвор на ВРС би променило времето на приживяемост на мишки след подкожно или интраперитонеално инжектиране на обработените по този начин ЕАТ клетки.

Животните се наблюдават в продължение на 45-дневен период. Контролната група от 15 NMRI мъжки мишки също се инжектира с 0,4 χ 10⁶ ЕАТ клетки. Преди инжектирането им туморните клетки са инкубирани в продължение на един час при температура 4°С в солев разтвор. Обемът на инжекцията е 0,2 ml. Средната преживяемост на тази група животни е 36 дни и само 3/15 от тях доживяват края на опитния 45-дневен период.

Опитна група от 15 NMRI мъжки мишки получават същата доза туморни клетки в същия обем, но клетките предварително са инкубирани в разтвор на ВРС (2 pg/1 ml). Само 2/15 от мишките умират в наблюдавания 45дневен период, а другите преживяват повече от 45 дни. Разликата между контролната и опитната група е значителна (р < 0,01).

Ако същата процедура се повтори и ЕАТ клетки се инжектират интраперитонеално (вместо подкожно) не се наблюдава разлика между групите.

Може да се заключи, че ВРС удължава срока на преживяемост на животните с тумори и че има противотуморна активност.

21. Влияние върху причинени от облъчване увреждания

Опитите се осъществяват с мишки (64) от двата пола порода NMR-Y (22-28 g). Първата контролна група (16 мишки) не се третира и не се облъчва.

Втората контролна група (16 мишки) се третира предварително със солев разтвор (0,2 ml) и се облъчва със свръхлетална доза от 9 Gy /Со-60/.

Двете опитни групи (16 + 16 мишки) се облъчват със същата свръхлетална доза от 9 Gy. Един час след облъчването на първата група се въвежда ВРС в доза от 20 pg/kg телесно тегло. Втората опитна група обаче се третира със същата доза ВРС, но един час преди облъчването.

ВРС, въведен след облъчването, няма влияние върху преживяемостта на мишките, но въведен преди облъчването повишава степента на преживяемост след 12 дни с 68,75 % в сравнение с другата опитна група.

22. Влияние върху хематопоетичната система

На мишки албиноси се прилагат цитостатици (Ендоксан, Винкристин, Адриабластин, Цитозин-арабинозид) в LD_J0 дози, интраперитонеално. В опитната група ВРС се прилага един час преди цитостатиците в доза 10 pg/kg, а на контролната се инжектира само солев разтвор. Групата животни се умъртвяват на 3тия, 5-тия, 7-мия и 11-тия ден от експеримента. Провеждат се изследвания на кръвта /Е, Hb, Htc, L, Tb, абе. брой на неутрофили/, на костния мозък и цитологични и хистологични изследвания на черния дроб и на далака. На 3-тия ден от опита няма различия между опитната и контролната група по отношение на L, Е, ТЬ и стойностите на неутрофилите. Но докато в костния мозък на третираните с ВРС животни кръвотворните клетки са още незасегнати, в контролната група вече се наблюдава аплазия. На петия ден от експеримента значително се повишава броят на неутрофилите и L до нормализирането им на седмия ден от експеримента. В контролната група нормализирането се наблюдава близо до 11-тия ден.

23. ВРС и плодовитостта - влияние върху олигоастеноспермията

Наблюденията са осъществени върху 10 души-мъже, на възраст от 30 до 40 години с диагноза олигоастеноспермия. От тези пациенти се взема сперма след 3 до 4 -дневно въздържание. След втечняване /30 min/, към 0,5 ml от спермата се прибавя слой от 0,5 ml среда. Контролната среда се състои от НАП F10 с 10 %-дезактивиран хордален серум. Опитната среда съдържа допълнително 2 gg/ ml или 4 gg/ml ВРС. След период от 90 min при температура 37°С в атмосфера, съдържаща 5 % въглероден диоксид, в камерата на Horwell Fertility се определя броят на прогресивно подвижните, подвижните на място и неподвижните сперматозоиди в 1 ml сперма. Предварителните резултати сочат, че при пониски концентрации ВРС няма ефект върху подвижността на сперматозоидите. В концентрация от 4 gg ВРС /ml се установява значително по-висок процент подвижност в сравнение с контролната група.

24. Действие на ВРС върху процесите на репродуциране

Действието на ВРС върху репродуктивността се изучава при мишки с предварителна история от три бременности. 20 дни след прекъсване на лактацията животните се подлагат на съвкупление. ВРС се прилага в доза от 10 gg/ kg, интраперитонеално, веднъж дневно в продължение на целия период на бременността (19-21 дни) и на лактацията (следващите три седмици). Контролната група получава едновременно равен обем солев разтвор. Броят на потомството на всяка женска и теглото на новородените се записва ежедневно.

Статистическият анализ потвърждава последователно значително увеличаване броя на новородените от всяка женска и изненадващата липса на различия в техните тегла през целия период на наблюдение.

Всички женски животни се оставят да се възстановят в продължение на 25 дни след спиране на лактацията. Тогава те отново се подлагат на съвкупление за изучаване на ефекта върху петата бременност.

При всички третирани с ВРС животни в сравнение с контролната група се наблюдава повишаване степента на плодовитост и способността за лактация.

Не се забелязват патологични промени в степента на плодовитост при ВРС потомствата (независимо от броя на майчините бременности) .

Затова е вероятно, че ВРС може да по добри степента на плодовитост дори и при доста възрастни мишки. Очевидно е, че получените резултати са в съответствие с общото защитно действие на ВРС и с данните от in vitro анализа, получени при използване на човешка сперма.

25. Защитно действие на ВРС при наранявания на периодонталната тъкан.

Целта на това изследване е да се проучи ефектът на ВРС върху коренната ресорбция на периодонталните меки тъкани, причинена чрез механично нараняване на първия молар при плъхове албиноси.

Тридесет плъха на възраст 4 седмици се разпределят в контролна група, която получава солев разтвор, и в експериментална група, която се третира с ВРС. На всички животни се прилагат следните процедури - за осъществяването на механичното нараняване се използва като инструмент игла (0,6 mm дебела и 1,9 mm дълга), която се вкарва на дълбочина 1 mm в продължение на 1 s от мезиалния венечен маргин в почти успоредна посока към мезиалната повърхност на първата максиларна дясна моларна корона.

След механичното нараняване опитната група се третира с ВРС (0,02 ml/200 g). Плъховете се разделят на 12 групи и се умъртвяват на интервали от 1, 3, 5, 6, 14 и 21 дни след последното третиране.

Дясната максила на всички контролни и опитни животни се отстранява и се фиксира в 10 %-ен неутрален буфериран формалин, деминерализиран с мравчена киселина, след което се обвиват с парафин и се разделят на секции от по 6 gm в мезиодистален план. Секциите се оцветяват с хематоксилин и еозин и се изследват със светлинен микроскоп.

Хистологичните находки в първия молар на плъховете от контролната група са следните-установява се наличие на голям брой възпалени клетки. Малка резорбционна кухина се наблюдава между 1-3 дни в частта на коренната повърхност при нивото на алвеоларния ръб. На петия ден резорбционната кухина се разширява по посока на коронката и съдържа множество одонтокласти. На седмия ден резорбционната кухина с много одонтокласти се разширява по-нататък към коронката. На 14-тия и 21-ия ден, кухината е още по-разширена към коронката, като доближава частта на кухината близо до циментоемайлната връзка.

Опитните плъхове имат същите проме ни между 1-ия -5-ия ден както контролните, но при тях няма прогресиране на коренната резорбция между 14-ия-21-ия ден. В заключение може да се каже, че ВРС проявява защитно действие при механично нараняване на периодонталната тъкан на молара на плъхове.

26. Влияние на ВРС при поражение на основни клетки и на гръбначния мозък

Придобитото слабоумие от типа на Алцхаймер /DAT/ се характеризира с придобито цялостно разстройство на по-висшите функции на мозъчната кора, което влияе върху паметта и познанието. Изследването след смъртта на пациенти с DAT показва, че основните клетъчни /NB/ неврони са претърпяли дълбока селективна дегенерация. Тези неврони са главния източник на външно холинергично стимулиране на мозъчната кора. Целта на изследването е да проучи влиянието на ВРС върху поведението на плъхове с билатерално електролитно увреждане на NB. По-специално, плъхове с поражения на NB могат да служат като опитен модел за DAT.

Изследването се осъществява с плъхове албиноси. Всички групи (със или без поражения върху NB) се подлагат на тест за пасивно въздържане по методиката на Ашфорд и Жонс. Животните с поразени NB получават солев разтвор (контролната група) или разтвор на ВРС 10 pg/kg, интраперитонеално (опитна група).

Изследваните вещества се инжектират: а/ само веднъж, непосредствено, след като са увредени NB или б/ по един път дневно в продължение на четири последователни дни, след като е направено увреждането на NB. ВРС също се въвежда един път на ден в продължение на четирите опитни дни, един час преди започване на теста. След като мине 20 дневният период на следоперативно възстановяване всяко животно се подлага на тест за описване на поведението му. Статистическата значимост се изчислява в съгласие с анализа на вариантите, комбиниран с теста на Дънкан за множество сравнения (р<0,05). Резултатите от проучването показват следното:

-билатералното електролитно увреждане разстройва пасивното въздържание при плъховете;

-ВРС в използваните дози не влияе върху пасивното въздържание при неувредени, незасегнати животни;

-ВРС може да подобри поведението при NB увредените плъхове, значително.

27. Влияние на ВРС върху двигателната активност на зайци с контузии на гръбначния мозък

Целта на това проучване е да изследва дали ВРС може да промени последствията от контузия на гръбначния мозък. В този опит се използват възрастни зайци от двата пола. Под въздействието на фенобарбитална анестезия се осъществява междинна гръбначна Ц-L ламинектомия. При използването на техниката на Албин и колектив се прилага измеримо компактно нараняване на гръбначния мозък. Двигателната активност на задните крайници се контролира в съответствие със системата на Тарлов веднъж дневно в продължение на девет дни. Основните наблюдения са както следва: 1 / пълна параплегия; 2/ минимални движения; 3/ животното е способно да се изправи, но не може да тича; 4/ животното може да тича с известна еластичност и некоординираност и 5/ нормална двигателна активност.

Животните получават солев разтвор в контролната група и ВРС в дози от 10 Hg/kg интравенозно, един път на ден в продължение на девет дни след операцията.

Травма на гръбначния мозък причинява почти пълна параплегия. Средните стойности на пълната (в продължение на девет дни след травмата) изследвана двигателна активност при животните, които са получавали само солев разтвор е 1,3 единици на Тарлов /N=4/, а при животните, получавали ВРС е 2,5 единици на Тарлов /N=7/.

Очевидно е също, че ВРС подобрява двигателната активност на зайци с нараняване на гръбначния мозък.

От получените при този опит резултати, може да се заключи, че ВРС може да бъде обещаващо лекарство при лечение на увредени нервни функции (при травма на главния или гръбначния мозък) и че ВРС би трябвало да бъде даван на пациентите колкото е възможно по-рано след увреждане на невроните.

28. Влияние на ВРС върху подвижността на червата, основната температура и диурезата

Прилагането на ВРС няма никакво влияние върху диурезата, понижава основната температура in vivo и способността на контрактиране на гладкия мускул на червата на .·*«**' » »-.4t rV. - гг.

гвинейско свинче при опити in vitro.

29. Активност срещу Trichinella spiralis

Прилагането на ВРС концентрат на опитни мишки /DI/ в дози от 10 pg/kg /телесно тегло, интраперитонеално/, предварително инфектирани с перорална доза ларви на Trichinella spiralis има значително влияние върху преживяемостта на животните.

30. Отглеждане на животни с търговска цел

1419 здрави прасета (от общо 4306 прасета) получават ВРС 10 pg/kg телесно тегло, интрамускулно, веднага след раждането, други 1440 на 13-тия ден след раждането, един ден преди кастрация, а останалите 1477 получават само обичайната терапия с желязосъдържащи препарати. Контузиите, бракуването, смъртността, телесното тегло, консумация на храна се оценяват след 4 седмици. ВРС, приложен само веднъж значително, понижава степента на бракуването (в групата, третирана с ВРС, веднага след раждането) и степента на контузии (в двете групи, третирани с ВРС). В групите на третираните с ВРС животни се постига същото телесно тегло както при контролите, но с по-ниска консумация на храна. Влияние върху инфекции - 40 отбити прасета, се заразяват с ентероколити, причинени от E.coli, на 28-дневна възраст се изследват. ВРС е приложен на 20 от животните (10 pg/kg телесно тегло, интрамускулно). След един месец се наблюдава значително снижаване на смъртността при третираните с ВРС, животни.

При друг опит се проучва степента на смъртност след първата седмица от живота на общо 1200 здрави прасета. 400 животни получават ВРС веднага след раждането им в допълнение на обичайната Fe-терапия. Значително понижаване на смъртността се наблюдава при ВРС (10 pg/kg телесно тегло, интрамускулно) третираните животни.

31. Антивирусна активност

Антивирусната активност се изследва in vitro u in vivo (мишки). ВРС се използва в доза 10pg/kg телесно тегло, интраперитонеално или T.e.V. Значителна активност се установява срещу ентеро-вирусите (Еко тип-6,9,11 и 16; Коксаки тип-А6,ВЗ и В4), CNS вирусите (Иксод енцефалити, LCM хориоменингити) и ARBO вирусите (Tahyna, Bhanja u Calovo). Удължаване на преживяемостта (72 часа за абсолютно преживели) се отбелязва при ин10 фектирани мишки.

Някои аспекти на изобретението

Технически проблем. Техническият проблем е дали е или не е възможно да се влияе чрез фармакотерапия едновременно.

I. 1. Остри хепатити /вирусен, причинен от лекарства, токсичен, остър, независимо с каква етиология/; 2. Хронични хепатити; 3. Чернодробни цирози; 4. Холестази; 5. Холелелитиази; 6. Холангити; 7. Чернодробни трансплантации - лечение преди и след трансплантацията; 8. Лечение преди и след операции, при други операции на черния дроб /например вродени малформации, доброкачествени или злокачествени стенози на жлъчния канал/;

II. 9. Профилактика на възпаление на панкреаса; 10. Подобрение при лечение на възпалителен процес на панкреаса; 11. Понижаване честотата на следхирургичните панкреатити; 12. Профилактика на усложнения и смъртност от остри панкреатити; 13. Понижаване честотата на хронични панкреатити;

III. 14. Остър кръвоизлив в горния гастроинтестинален тракт; 15. Ерозивни гастрити; 16. Остра язва на стомаха и дванадесетопръстника /’’стресова язва”/; 17. Хронични пептични язви; 18. Непептични язви на стомашно-чревния тракт;

IV. 19. Шок /независимо от неговата етиология/;

V. 20. Профилактика на паренхима на бъбреците от развитието на остри и хронични некрози вследствие на исхемия и кръвоизливи; 21. Остра и хронична бъбречна недостатъчност и всички случаи, които могат да ги предизвикат;

VI. 22. Травми на скелета /фрактури/;

23. Лечебни операции на скелета /остеотомия/;

24. Присаждания на скелета; 25. Псевдоартрози; 26. Артродези; 27. Рани /повишава скоростта на заздравяване/; 28. Изгаряния /на кожата и лигавицата, ускорява процеса на оздравяване/ ;

VII. 29. Анти-туморна активност;

VIII. 30. Противовъзпалителна, противооточна, противоревматична активност; 31. Антипиретична активност; 32. Ревматични артрити; 33. Остеоартрози; 34. Анкилозни спондилити; 35. Урикални артрити; 36. Екстра-ставен ревматизъм /бурсити, тендинити, синовити, хумероскапуларни периартрити/; 37. Възпаление и отоци след хирургично и нехирур9 гично лечение, фрактури и изкълчвания;

IX. 38. Остър инфаркт на миокарда; 39. Миокардити; 40. Отстраняване на исхемични промени в тъканите;

X. 41. Понижена консумация на храна;

XI. 42. Хиперпролактинемии;

XII. 43. Болестта на Паркинсон, паркинсонизъм;

XIII. 44. Глаукома /понижаване на вътреочното налягане-активност, подобна на тази на допамина и пилокарпина/;

XIV. 45. Диабетен мелитус;

XV. 46. Барбитуратна интоксикация;

XVI. 47. Стрес и всички неблагоприятни прояви, развиващи се като последица от стреса.

Състояние на техниката

Все още няма такава всеобща и специфична фармакотерапия и лечението на усложненията е извън нея.

Решение на техническия проблем

Храносмилателният тракт, по-специално стомаха, досега е разглеждан само като орган, понасящ последиците от стреса. Възможността да се предположи, че стомашночревният тракт, по-специално стомахът, може да е орган, от който може да се предизвиква отклик от защитни тела, не е обсъждана. Вещество, което предизвиква, разпространява и контролира възпиращия отклик на тялото, наречено по-късно ВРС, е изолирано от стомашния сок на 542 пациенти и от животински източници с помощта на диализа, йонообменно филтруване и гел-хроматография. Затова веществото ВРС (въпреки, че неговата структура все още не е напълно изяснена) е изпитвано при различни модели на заболявания при хора, с in vivo u in vitro опити. Ha базата на получените резултати може да се очаква успешното му приложение при изключително широк диапазон във фармакотерапията.

Веществото, изолирано и наречено ВРС, не е известно и затова не е прилагано досега във фармакотерапията.

Изучено е полученото вещество ВРС върху различни експериментални видове (например плъхове, мишки, гвинейски свинчета) in vivo, както и в човешки клетки in vitro.

Веществото ВРС е наречено така въз основа на съкращение от израза “Body Protecting Compound”.

Причиняване на увреждания на черния дроб, панкреаса, стомаха и дванадесетопръстника.

Под въздействие на лека етерна упойка се осъществява средна лапаратомия. След това жлъчният канал се свързва периферно от дванадесетопръстника на мястото, където чернодробната артерия (със същата хирургична интервенция едновременно се свързва към жлъчния канал) достига до него откъм лявата страна, малко под порталната вена, която остава незасегната при споменатата лигатура. След това раната се затваря и животното остава без да бъде обезпокоявано до неговата естествена смърт или до умъртвяването му.

Под влиянието на лека етерна упойка се осъществява средна лапаратомия и жлъчният канал се свързва точно преди неговото влизане в дванадесетопръстника. Раната след това се затваря и животните се оставят необезпокоявани до тяхната естествена смърт или до умъртвяването им.

Животните се потопяват във вода с температура 26°С с дълбочина 20 cm в продължение на 3 часа. Веднага след това те се умъртвяват. 24 часа преди потопяването във вода, животните се оставят без храна със свободен достъп до вода.

Под влияние на лека етерна упойка се осъществява средна лапаратомия и пилорът се свързва. Раната се затваря и животните се оставят необезпокоявани до тяхното умъртвяване, само петнадесет минути след лигатирането на пил ора.

Животните се обездвижват в продължение на 24 часа. Едновременно с обездвижт ването и 12 часа по-късно се прилага индометацин. След 24 часа животните се умъртвяват.

Причиняване на фрактури, рани, изгаряния на кожата и лигавицата

Под въздействието на лека етерна упойка се причинява фрактура на пищяла чрез дигитално налягане при използване на хипомохлион. Животните се умъртвяват на 5-тия, 8мия, 9-тия, 12-тия и 30-тия ден след причиняване на фрактурата.

Под въздействието на лека етерна упойка, се причинява широка рана на кожата. Животни се умъртвяват всеки ден през първия петдневен период, след това на три дни в периода до петнадесетия ден, както и след това на пет дни след месечния период от причиняване на раната.

Под влиянието на лека упойка с етер се прави рана от изгаряне върху гърба на жи10 вотното (15 χ 30 mm) с нажежен термокатор в продължение на 15 секунди. Животните се умъртвяват на петия, деветия и тридесетия ден след причиняване на поражението.

Под влияние на лека етерна упойка, носната лигавица се изгаря двустранно с нажежен термокатор в продължение на пет секунди. Животните се умъртвяват на петия, деветия и тридесетия ден след причиняване на увреждането.

Причиняване увреждане на бъбреците

Под въздействие на лека етерна упойка, се осъществява връзване на бъбречното стълбче. 24 часа по-късно животните се умъртвяват. След затваряне на раната, част от животните се оставят необезпокоявани до естествената им смърт.

Причиняване на противовъзпалителен, противооточен и антипиретичен ефект

Като възпалително средство върху лапата се прилага разтвор (1 %-ен) на карагеенин (0,05 ml подкожно); обемът на лапата се измерва три часа по-късно по обичайната методика.

За оценяване на телесната температура се използва сикофермент (2,5 g/kg, интраперитонеално). След това ректално се мери температурата в продължение на три часа.

Причиняване на увреждане на сърцето

Животните се обездвижват в продължение на 24 часа. Прилага се индометацин в началния момент на обездвижване (0 часа) и 12 часа по-късно. След изтичане на 24-ри часовия период животните се умъртвяват.

Прилага се изопреналин (30,0 mg/kg, интраперитонеално) в нулевия час от опита и на 24-тия час. След изтичане на 48-часовия период животните се умъртвяват.

Причиняване на CNS ефекти

-изучава се влиянието върху спонтанното поведение на животните (мишки).

За установяване присъствието на допамин неврони при активността на веществото ВРС и CNS, се използват обичайния допаминов агонист апоморфин (20 mg/kg, подкожно), както и сиротонин (5 mg/kg, интраперитонеално) (сравнителни контроли) или солев разтвор (0,9 % натриев хлорид) (контрола). След приложението на споменатите вещества се изучава поведението на животните. Стереотипичното поведение се оценява по метода на Малик (1983).

Изучаване влиянията върху мускула на ириса

Прилага се изследвания разтвор-локално или интраперитонеално. Измерва се диаметъра на зеницата в подходящи интервали от време (5, 10, 15, 30, 60, 90 и 120 минути) при използване на обичайните методики.

Изучаване влиянието върху депресивната активност на барбитуратите

Причинява се наркоза с прилагане на натриев пентобарбитал (50 mg/kg интравенозно). Продължителността на съня, предизвикан от барбитурата, се оценява чрез наличието или липсата на така наречения “рефлекс за възстановяване на равновесието”.

Предизвикване на ефект върху диабетен мелитус

Причинява се диабетен мелитус чрез прилагането на алоксан (100 mg/kg интраперитонеално), както и на стрептозотоцин (100 mg/ kg, интраперитонеално). Съдържанието на глюкоза в урината и в кръвта се измерва по обичайните методики. Животните се оставят необезпокоявани до естествената им смърт.

Оценка на въздействията

Разпределение

Изследванията с ВРС, белязан с 1-125, показват натрупването на ВРС, което зависи и от дозата и времето, точно в стомаха в повечето случаи, с разпространение из целия организъм след орална или парентерална употреба.

Клинични наблюдения

При изследванията, занимаващи се с увреждания на черния дроб, панкреаса, стомаха и дванадесетопръстника, бъбреците, сърцето, фрактури, рани, изгаряния (на кожата и лигавицата) , диабетен мелитус, общото състояние на третираните с ВРС животни е значително по-добро в сравнение с това на животните от контролната група. За разлика от резултатите при контролните групи при третираните с ВРС групи или няма смъртност или твърдо се наблюдава понижена степен на смъртност.

Макроскопски и патологични наблюдения

При контролните животни с лигатура на жлъчния канал и на чернодробната артерия се развива обширна жълтозеленикава некроза на черния дроб, включваща понякога всички дялове на черния дроб, както и некроза на панкреаса и увреждания от кръвоизливи на стомаха и дванадесетопръстника. Прилагането на

ВРС успешно и в зависимост от дозата предотвратява описаните поражения. При контролните животни тези поражения се появяват около 6 часа след часа след лигатирането, докато при третираните с ВРС животни, те не са видими дори след 48 часа след лигатурата. Патохистологичното изследване поддържа наблюдаваните промени и разлики при макроскопското проучване.

При контролните животни с лигатура на жлъчния канал при мястото на влизането му в дванадесетопръстника се появяват тежки некрози на панкреаса и поражения от кръвоизливи на стомаха и дванадесетопръстника. Въвеждането на ВРС в зависимост от дозата предотвратява развитието на описаните поражения. Патохистологичното изследване поддържа макроскопските наблюдавани промени и различия.

При контролните животни, подложени на въздействието на стрес от потапяне във вода, стрес от обездвижване и прилагане на индометацин, както и на краткотрайна лигатура на пилора (15 минути) се проявяват значителни поражения на стомаха. Въвеждането на ВРС значително понижава (или напълно потиска) развитието на стомашни увреждания, следващи описаните по-горе неблагоприятни процедури.

При контролните животни с лигатура на бъбречното стьлбче (каналче) се установяват сериозни поражения на бъбрека. При третираните с ВРС плъхове се отбелязва значително понижаване на пораженията. Патохистологичните проучвания твърдо потвърждават макроскопски наблюдаваните промени и различия.

В сравнение с контролните животни с фрактура на пищяла при третираните с ВРС животни развитието на следтравмените кръвоизливи е значително по-слабо изразено, животните по-рано използват функционално наранения крак. Качествените патохистологични изследвания, които прилагат обичайните методики, показват повишена и ускорена степен на заздравяване на костта при третираните с ВРС плъхове през целия наблюдаван период.

При контролните животни с рана се наблюдава обширно развитие на гнойно гранулиране по време на първите дни след причиняване на нараняването. При третираните с ВРС плъхове, за разлика от контролните групи, раната е суха, без секретиране и видима гранулация. Патохистологичните анализи поддържат макроскопски наблюдаваните промени и различия през целия период на наблюдение.

При контролните животни, подложени на ограничителен стрес и индометацин, се забелязват увреждания на миокарда с повишени стойности на СРК в серума. Въвеждането на ВРС значително понижава уврежданията на миокарда и намалява стойностите на СРК. Патохистологичните анализи потвърждават макроскопските наблюдения за различия и промени.

При животните с експериментално предизвикан диабетен мелитус ВРС премахва преходната гликозуриа при третираните с алоксан групи. При животните, третирани със стрептозотоцин въвеждането на ВРС почти трикратно повишава преживяемостта. При всички животни, третирани с ВРС, полидипсисът и полифагията са по-слабо изразени.

Противовъзпалителен, противооточен и антипиретичен ефект

При животните, третирани с ВРС, се забелязва отчетливо намаляване на причинените от карагеенин отоци, в сравнение с контролата през всички периоди на наблюдение.

При животните, третирани със сикофермент, въвеждането на ВРС значително понижава повишаването на телесната температура в сравнение с резултатите, отбелязани при контролната група.

Ефекти

Резултати от in vitro анализ

Два дни след началото на култивиране на човешки фибробласт L-929 и меланома В16 клетки се прибавя веществото ВРС. Три дни след това броят на клетките се изчислява с клетъчен броител. Веществото ВРС показва зависещ от дозата, токсичен ефект върху меланомните клетки. Не се проявява ефект върху фибробластите.

При сравняване на контролните животни с изгаряния на кожата с животните, третирани с ВРС, се наблюдава значително по-бързо развитие на коричка при третираните животни. При контролните животни с изгаряния на лигавицата (например лигавицата на носа) през първите два дни се наблюдава тежък оток на увредените тъкани, последван от гнойно секретиране и частично затрудняване на дишането през носа. При третираните с ВРС животни не се забелязва развитие на описаните промени. Патохистологичните анализи потвър12 ждават макроскопските наблюдавани различия и промени.

Ефекти върху CNS

Влиянието на веществото ВРС върху CNS се проучва чрез наблюдение на поведението на животните (мишки)

Пет минути след прилагането се наблюдава повишаване на подвижността на животните. Безпокойството им нараства от минута на минута и достига свой пик след 30 минути. В този момент животните стоят на задните си крака изправени, подобно на свещ, и душат. Строубсфеноменът е очевиден, животните тичат из клетката, също така пилоерекцията е очевидна. След прилагане на апоморфина промяната настъпва след 45 минути и е придружена с частично стоене на задните крака. След прилагане на серотонина се отбелязва само за кратък период стеротипично поведение (засилване на движенията, душене, миене с по-малка интензивност).

Локалното или интраперитонеално прилагане води до миоза (20 % приблизително).

Прилагането на ВРС скъсява причинения от барбитуратите сън, което се установява чрез скъсяване на времето без “ рефлекс за възстановяване на равновесието” (най-малко с 60 %).

Влияние върху кръвното налягане, подвижността на червата, основната температура и диурезата

Прилагането на ВРС няма въздействие върху промените на кръвното налягане, причинени от адреналин, норадреналин, изопреналин, ацетилхолин и серотонин, и върху стойностите на нормалното кръвно налягане.

Прилагането на ВРС не влияе върху гладката мускулатура на червата (гвинейско свинче).

С прилагането на ВРС не се понижава нормалната температура.

С прилагането на ВРС не се повишава диурезата.

Механизъм на действие

Може да се предположи, че действието на ВРС, подобно на другите екзогенни протеини, е следствие на един от механизмите-пряко взаимодействие на протеина или неговите фрагменти с клетъчните рецептори, стимулиране или потискане освобождаването на биологически активни (стимулиращи или инхибиращи) протеини или непротеини чрез ре10 цепторни или нерецепторни свързани механизми, взаимодействие с ензими, които разграждат ендогенни биологично активни пептиди. Многобройните защитни ефекти върху несвързани по друг начин носологични обекти би могло да се обясни, ако те се отнесат към общия термин-стрес (неблагоприятен), който ги причинява в организма. Изглежда вероятно, че веществото ВРС представлява първия възпиращ отлик (започвайки от стомаха) срещу всякакво пълно с напрежение събитие, заплашващо организма. Затова механизмът на действието на ВРС представлява първичните защитни механизми срещу различни неблагоприятни атаки срещу организма.

От изложеното може да се заключи, че е възможно да се въздейства фармакологично благоприятно върху развитието на следните разстройства, като се прилага ВРС: I. 1.Остри хепатити (причинен от вируси, медикаментозен, токсичен, остър, независимо от неговата етиология); 2. Хронични хепатити; 3. Чернодробна цироза; 4. Холестази; 5. Холедохолитиази; 6. Холангити; 7. Трансплантация на черен дроб - лечение преди и след трансплантацията; 8. Предоперативна и следоперативна терапия при други чернодробни операции (например вродени малформации, доброкачествени и злокачествени стенози на холедокуса)

II. 9. Профилактика на панкреатити; 10. Подобряване развитието на панкреатити; 11. Понижаване степента на следхирургическите панкреатити; 12. Профилактика на усложненията и смъртността при остри панкреатити; 13. Понижаване на случаите на хроничните панкреатити;

III. 14. Остри кръвотечения в горната част на храносмилателния тракт; 15. Ерозивни гастрити; 16. Остри язви, стомашни и на дванадесетопръстника (стресови язви); 17. Хронични пептични язви; 18. Непептични язви на стомашно-чревния тракт;

IV. 19. Шокове (с различна етиология);

V. 20. Защита на бъбречния паренхим срещу некроза, причинена от исхемия или кръвоизливи (остра или хронична); 21. Остра и хронична бъбречна недостатъчност, както и всички причини за тях;

VI. 22. Травми на скелета (фрактури); 23. Лечебни процедури върху скелетната система (остеотомия); 24. Присаждания по скелета; 25. Псевдоартрози; 26. Артродези; 27. Рани (по-бързо заздравяване); 28. Изгаряния (върху кожата, лигавиците, по-бързо заздравяване);

VII. 29. Антитуморен ефект

VIII. 30. Противовъзпалителен, противооточен и противоревматичен ефект; 31. Антипиретичен ефект; 32. Ревматични артрити;

33. Артрози; 34. Анкилозиращи спондилити; 35. Подагра; 36. Извънставни ревматични разстройства (бурсити, тендинити, синовити, хумероскапуларни периартрити); 37. Възпаление и оток след хирургични и неврохирургични процедури, придружаващи фрактури и изкълчвания;

IX. 38. Остър инфаркт на миокарда; 39. Миокардити; 40. Отсрочване на исхемични тъканни промени;

X. 41. Понижаване на консумация на храна (анорекзитивен ефект);

XI. 42. Хиперпролактинемия; 43. Заболяване на Паркинсон;

XII. 44. Глаукома (понижаване на вътреочното налягане-ефект на допамин и пилокарпин);

XIII. 45. Диабетен мелитус;

XIV. 46. Барбитуратни интоксикации;

XV. 47. Стрес и всички, причинени от стреса увреждания на организма.

Приложението на веществото ВРС може да се осъществи или през устата, или парентерално, под формата на пилюли, капсули, дражета, таблетки за под езика, супозитории, вагинални препарати; инжекционни разтвори, спрейове за нос; унгвенти, кремове, гелове, спрейове, капки за очи, капки за уши и капки за нос.

Примерно изпълнение на изобретението Примери за получаване

Пример 1. Метод за изолиране на веществото ВРС

Материалът, от който е изолирано веществото ВРС, се получава от стомашния сок на 542 пациенти повторно и репродуктивно и от животински източници.

Той се съхранява при температура от 2 до 8°С и хомогенизира. След това се центрофугира (12000 G/30 мин) и супернатантата се събира. 200 ml от нея се диализира срещу вода (при температура +4°С), при съотношение 1 към 125, докато се достигне проводимост от 100 pS. Полученият диализат се лиофилизира. Сухият остатък се разтваря в 10 ml двойно дестилирана вода и се подлага на хроматография в колона, напълнена с модифицирана DEAE йонообменен гел (от 40 до 80 urn). Колоната е с размери 25 х 250 mm. За разреждане се използва буферен разтвор (натриев ацетат 0,01 M-ен, рН 5,2). Фракцията се открива с помощта на У В (ултравиолетов) детектор в границите на 2800 nm. Събират се фракции от 40120 ml. Полученият елуат първо се концентрира с помощта на AQUACIDE-3 (Calbiochem, USA) и след това се лиофилизира.

Сухото вещество се разтваря в 10 ml 0,2 М-ен разтвор на фосфатен буфер с рН 7,4 и след това се подава към хроматографска колона, напълнена със SPHACRYL-S-200, с размери 2,5 х 450 mm, при скорост на потока 1,2 ml/ min. Събират се фракции от 40 до 120 ml.

Разтворът се диализира срещу дестилирана вода отново, концентрира се с AQUACIDE3 и се лиофилизира. Получава се приблизително 200 mg сухо бяло вещество.

Охарактеризиране

Веществото ВРС се охарактеризира с ултравиолетов (УВ) и инфрачервен (ИЧ) спектър (фиг.1 и 2).

На базата на вписаните фармакологични свойства то може да се използва при лечението на някои болестни разстройства, особено когато естественото образуване на това средство в организма е недостатъчно или дори липсва.

То може да бъде използвано при лечението на а/ всички заболявания и разстройства, причинени от стреса;

б/ циркулаторни разстройства - язви (от различен произход), шокове (с различна етиология), исхемия и инфаркти (на различни органи);

в/ възпаление и отоци от всякаква етиология, хепатити (остри и хронични), цироза на черния дроб, холангити, панкреатити (с различна етиология), гастродуоденити, нефрити и нефропатии, миокардити, перикардити, ендокардити, артрози и артрити (с различна етиология) , ринити, ревматични разстройства-разстройства на връзките с различна етиология, температура, поражения, причинени от свободни радикали;

г/ травми и хирургични интервенции травматизъм (пред- и средтравматично лечение), присаждания, рани, изгаряния, фракту ри, следхирургични усложнения;

д/ злокачествени образувания - някои видове тумори;

е/ диабетен мелитус;

ж/ разстройства с допаминергична или подобна етиология-пълнота, болестта на Паркинсон, хиперпролактинемии, глаукома, сън, причинен от барбитурати (отравяния с барбитурати);

з/ заболявания и разстройства на нервната система - болестта на Алцхаймер, исхемични и травматични увреждания на нервната система и забавяне на умствени дегенеративни промени;

и/ в стоматологията - заболявания и разстройства на лигавицата на устната кухина, хирургично лечение на перидонтални джобове, инхибиране на кореновата резорбция;

й/ хематопоетична система - неутропения, апластична анемия, миелодиспластичен синдром при трансплантация на костен мозък;

к/ поражения, причинени от радиация остър радиационен синдром, защита срещу радиационни поражения;

л/ имунология - реакции на свръхчувствителност , алергии и трансплантации;

м/ плодовитост - повишаване на плодовитостта, лечение на олигоастеноспермия и предизвикване на лактация;

н/ във ветеринарната медицина при промишлено отглеждане на животни за понижаване на смъртността, при осакатявания и контузии, за подобряване усвояване на храната и повишаване на телесното тегло;

о/ във вирусологията - антивирусна терапия;

п/ разни - мастни промени в черния дроб, холехтази, холелитиази, остра и хронична бъбречна недостатъчност, токсични увреждания на бъбреците и черния дроб.

Веществото ВРС ще може да се използва като лекарствено средство за ентерална, локална, ректална или парентерална употреба. Фармацевтичните препарати на база ВРС се получават, като се прибавят неорганични или органични спомагателни вещества. За приготвянето на таблетки и дражета се прибавят, например талк, лактоза, нишесте, стеарати и други, а за разтвори и суспензии се прибавят, например вода, алкохоли, глицерини и други. За супозитории се прибавят, например естествени и втвърдени масла, восъци или поли етилен гликоли. Фармацевтичните препарати могат да съдържат подходящи консервиращи вещества, буфери, стабилизатори, повърхностноактивни вещества, средства, подпомагащи разтварянето, подслаждащи средства и различни багрилни вещества.

Подходящите дневни дози за веществото ВРС са от 5 до 50 pg/kg телесно тегло и могат да се въвеждат под формата на единична доза или разпределени на части.

Пример 1. Приготвяне на ВРС от човешки стомашен сок

Суровият материал се получава възпроизводимо от стомашния сок на 542 пациента. Охладеният материал трябва да се съхранява при температури от 2 до 8°С, като се хомогенизира преди употреба.

Адекватна част от този материал /200 ml/ първо се разделя посредством центрофугиране /12000 G за 30 min/ на твърди части и течна супернатанта. Тази течност се диализира срещу деминерализирана вода (1 към 125) при температура 4°С, докато се постигне проводимост от 100 pS. След това разтворът се лиофилизира. Сухият остатък се разтваря в 10 ml дестилирана вода и се подава към хроматографска колона (25 х 250 mm), напълнена с DEAE-модифициран йонообменен гел (например Trisacryl M-DEAE, ^R IBF). За елуиране се използва натриево-ацетатен буфер (0,01 М, pH 5,2). Фракциите се контролират с ултравиолетов детектор на дължина на вълната 280 nm. Фракциите от 40 до 120 ml от елуата се събират, концентрират се при използване на AQUACID3^R (Calbiochem) и след това се диализират и лиофилизират.

Сухото вещество се разтваря в 10 ml 0,2 М-фосфатен буфер (pH 7,4) и се пречиства отново, като се подава в хроматографска колона (2,5 х 450 mm), напълненас гел SephacrylS-200^R (Pharmacia Fine Chemicals). Потокът е със скорост (1,2 ml/min). Събраните фракции от 80-тия до 200-ния милилитър, се диализират отново срещу дестилирана вода, концентрират се при използване на AQUACID-3 и след това се лиофилизират. Така се получават 2 mg бяло вещество. Полученото вещество ВРС е много разтворимо във вода. То се разлага при температури в интервал от 180 до 200°С. Молекулното му тегло, определено с помощта на гел-хроматография е 40 000 ± 5 000 D. Ултравиолетовият спектър на веществото ВРС (във вода) показва абсорбция в областите, посочени на фиг.1.

Инфрачервеният спектър на ВРС (в калиев бромид) показва абсорбционни ивици, както е посочено на фиг.2.

Веществото ВРС е с нагъната протеинова структура с частична аминокиселинна последователност от N-завършека:

HjN-Gly-GIu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-ProAla-Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val.....СООН

Пример 2. Приготвяне на ВРС от човешки стомашен сок

Хомогенизиран човешки стомашен сок от същия източник като в пример 1 се центрофугира, диализира и лиофилизира по описаните в пример 1 методики.

Сухото вещество (80,4 mg) се разтваря в 0,1 М ацетатен буфер (3 ml, pH 5,22) и се подава към хроматографска колона (10 х 50 шш), напълнена с йонообменна смола FractogelTSK^R (Merck), предварително еквилибрирана с ацетатен буфер (pH 5,2). Потокът е със скорост 0,7 ml/min. Фракциите се контролират с помощта на УВ спектрометър при дължина на вълната 280 пт. Първата фракция със силна УВ абсорбция се събира, диализира се срещу дестилирана вода, след което се лиофилизира (47 mg).

Полученото сухо вещество се разтваря отново в ацетатен буфер (1 ml) и се подава към хроматографска колона (16 х 560 mm), напълнена с гел Sephadex-G-100^R (Pharmacia Fine Chemicals), предварително еквилибрирана с ацетатен буфер. Потокът е със скорост 0,3 ml/ min. Събраните фракции от 66 до 108 ml се диализират отново срещу вода (дестилирана) и се лиофилизират. Получава се бял прах, който съответства на продукта, получен и описан в предшестващия пример.

Пример 3. Приготовляване на веществото ВРС от свински стомашен сок

Хомогенизиран свински стомашен сок (85 ml) се центрофугира, диализира се и се лиофилизира в съответствие с методиките, описани в предишния пример до получаването на 440 mg сух остатък. След това 110 mg от този сух остатък се разтваря в 0,1 М ацетатен буфер (6 ml, pH 5,22), подава се към хроматографската колона (10 х 50 mm), напълнена с йонообменна смола Fractogel-TSK^R, и се обработва по описания в пример 2 начин. Получават се 44 mg жълт концентрат.

Част от този концентрат (24 mg) се разтварят в 1 ml от същия ацетатен буфер и се подава към хроматографска колона (16 х 565 mm), напълнена с гел Sephadex^R-50/80, еквилибриран с ацетатен буфер. Потокът е със скорост 1,35 ml/min. Елуатът между 65 и 108 милилитър се събира, диализира се отново срещу дестилирана вода и се лиофилизира. Полученият бял прах (10 mg) в рамките на точността и възпроизводимостта на използваните аналитични методи е със същото молекулно тегло и другите свойства като на продукта, описан в предшестващите примери.

Пример 4. Таблети

Състав	mg/таблетка
веществото ВРС	0,3
лактоза	37,7
нишесте	6,0
талк	3,0
трагакант	2,5
магнезиев стеарат	0,5
	50,0 mg

Пример 5. Капсули

Състав	mg/капсули
веществото ВРС	0,3
лактоза	99,0
магнезиев стеарат	0,7
	100,0 mg

Пример 6. Лингвалети (таблетки за под езика)

Състав	mg/лингвалета
веществото ВРС	0,3
манитол	100,0
нишесте	5,0
поливинилпиролидон	1,5
талк	3,2
	110,0 mg

Пример 7. Супозитории

Състав	mg/супозитория
веществото ВРС	0,5
полиетиленгликол 300	478,0
полиетиленгликол 1500	529,0
полиетиленгликол 6000	38,0
емулгатор	14,5
	1060,0

Пример 8. Крем

Състав	g/250 g крек
веществото ВРС	0,05
емулгатор	25,0
хидрирано арахидово
масло	50,0
Твин 60	120,0
пропиленгликол	30,0
метилхидроксибензоат	0,16
пропилхидроксибензоат	0,17
	250,0 g

Пример 9. Инжекционен разтвор

Състав	mg/ml
веществото ВРС	0,3
натриев карбоксиметил-
целулоза	1,5
поливинил пиролидон	5,8
лецитин	2,7
бензилалкохол	0,01
буфер	q.s.
двойно дестилирана вода до	1 ml

Пример 10. Разтвор

Състав	g/25 ml
веществото ВРС глицерин бензилалкохол буфер двойно дестилирана вода до	0,05 15,0 0,01 q.s. 25,0 ml

Пример 11. Суха инжекция

Състав	тегло/mg
веществото ВРС	0,3
манитол	10,0
	10,3 mg

Пример 12. Спрей за нос

Състав	mg/всяка доза
веществото ВРС	0,5
бензилалкохол	0,15
UliglyolR-812	14,0
фреон 12/114	60,0
	74,65 mg

Пример 13. Капки за очи, уши, нос

Състав	mg/5 ml
веществото ВРС	45
стабилизатор	5
натриев хидрофосфат	116
натриев дихидрофосфат	33
бензалкониев хлорид	0,5
двойно дестилирана вода до	5 ml

Пример 14. Форми за вагинално приложение (вагиналети)

Състав	mg/вагиналета
веществото ВРС	0,3
полиетиленгликол 300	150,0
полиетиленгликол 1500	1290,0
полиетиленгликол 6000	700,0
пропиленгликол	200,0
твин-40	59,7
лактоза	100,0
	2500 mg

Пример 15. Офталмологичен мехлем

Състав	mg/3,5 g
веществото ВРС	45
парафиново масло	1000
емулгатор	100
бял вазелин	2355
	3500 mg

Claims (6)

1. /Получени от Международното бюро на 12 август 1991 /12.08.91/; оригиналните претенции 1, 4 и 5 са коригирани; другите претенции са непроменени/

   1. Метод за получаване на телесно защитно вещество (ВРС) от човешки или животински стомашен сок, характеризиращ се със следните етапи на производство: а/ събраният и хомогенизиран животински или човешки стомашен сок се разделя на твърди части и течна супернатанта посредством центрофугиране; б/ течната супернатанта се диализира и лиофилизира; в/ сухият остатък се пречиства през хроматографска колона, напълнена със слабо алкална и модифицирана йонообменна смола или гел; г/концентратът отново се диализира и лиофилизира; д/ сухият остатък се пречиства чрез гел хроматография и е/ веществото ВРС се получава накрая от концентрата при из ползването на диализа и лиофилизация.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че в етап в/ се използва модифициран йонообменен гел или смола с DEAE, DMAE, QAE или с друга базична група.
3. 3. Метод съгласно претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че в етап д/ се използва неорганичен или органичен гел с декстран, полистирол, полиакриламид, агароза, поливинил или друга матрица, който има разделителна способност в границите на молекулните тегла от 20000 до 100000 D.
4. 4. Веществото ВРС, получено съгласно метода съгласно претенции 1, 2 или 3, с молекулно тегло 40000 ± 5000 D, определено с помощта на гел-хроматография, ултравиолетов и инфрачервен спектър и частична N-завършваща аминокиселинна последователност H₂NGly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-AspAla-Gly-Leu-Val.....-COOH.
5. 5. Приложение на веществото ВРС, охарактеризирано чрез метода за получаването му съгласно претенции 1, 2 или 3, с молекулно тегло 40000 ± 5000 D, определено посредством гел-хроматография, с ултравиолетов и инфрачервен спектър съгласно фиг.1 и фиг. 2 и частична N-завършваща киселинна последователност H₂N-Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-ProAla- Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val....-COOH, което може да се получи съгласно претенции 1, 2 и 3, за приготвяне на лекарствени средства за:

   а/ всички причинени от стрес, заболявания и разстройства;

   б/ циркулаторни разстройства (язви) с различен произход, шок (с различна етиология), исхемия и инфаркти (на различни органи);

   в/ възпаления и отоци (възпаления и отоци с всякаква етиология), хепатити (остър и хроничен), цироза на черния дроб, холангити, панкреатити (с различна етиология), гастродуоденити, нефрити и нефропатии, миокардити, перикардити, ендокардити, артрози, и артрити (с различна етиология), ринити, ревматични разстройства-разстройства във връзка с различна етиология, температура, поражения, причинени от свободни радикали;

   г/ травми и операции - травматизъм (пред- и следтравматично лечение), присаждания, рани, изгаряния, фрактури, следоперационни усложнения;

   д/ образувания - някои типове тумори;

   е/ диабетен мелитус;

   ж/ разстройства с допаминергична или подобна етиология - пълнота, болест на Паркинсон, хиперпролактинемии, глаукома и причинен от барбитурати сън (отравяния с барбитурати);

   з/ заболявания и разстройства на нервната система - болест на Алцхаймер, исхемични или травматични увреждания на нервната система и забавяне на умствените дегенеративни промени;

   и/ в стоматологията - при заболявания и разстройства на устната лигавица, операционно лечение на перидонтални джобове, инхибиране на кореновата резорбция;

   й/ кръвотворна система - неутропения, апластична анемия, миелодиспластичен синдром при трансплантация на костен мозък;

   к/ поражения, причинени от лъчение остър радиационен синдром и профилактика срещу радиационни поражения;

   л/ имунология - реакции на свръхчувствителност, алергия и трансплантации;

   м/ плодовитост - повишаване на плодовитостта, лечение на олигоастеноспермия и повишаване на лактацията;

   н/ във ветеринарната медицина - при отглеждане на животни с търговска цел за понижаване на смъртността, при осакатяване и контузии, за подобряване усвояването на храната и повишаване на телесното тегло;

   о/ антивирусно лечение;

   п/ разни - мастна промяна на черния дроб, холестази, холелитиази, остра и хронична бъбречна недостатъчност, токсични увреждания на бъбреците и черния дроб.
6. 6. Лекарствено средство за лечение на заболявания и разстройства съгласно претенция 5, характеризиращо се с това, че включва активно количество от веществото ВРС във фармацевтична форма за ентерална, перорална, парентерална, ректална и локална употреба.

   Приложение: 2 фигури

   Литература

   1. Edkins, I.S., Proc.Roy. Soc. L. 76B, 376 (1905).

   2. Hanrowitz, F., Chem. and Biology of Proteins, 1950, p.199.

   3. Castle et al. Am. I. Med. Sci. 178, 748 (1929).