KR20090042026A

KR20090042026A - 괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환의예방 및 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20090042026A
Application number: KR1020070107882A
Authority: KR
Inventors: 최완수; 이준호; 김영미; 권석형
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2007-10-25
Filing date: 2007-10-25
Publication date: 2009-04-29
Also published as: KR100908212B1

Abstract

본 발명은 항-알레르기 효과를 갖는 괴화(Sophorae flos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명의 괴화 추출물은 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 억제함과 동시에 알레르기성 반응에 관여하는 종양괴사인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨-4(IL-4)의 생성을 억제하는 효과를 나타내므로, 본 발명의 괴화 추출물을 포함하는 조성물은 독성 또는 부작용 없이 비만세포를 매개로 하여 발생되는 알레르기성 질환의 근본적인 예방 및 치료를 위한 의약품 으로 유용하게 이용될 수 있다.

괴화 추출물, 알레르기, 비만세포, 약학 조성물

Description

괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing and treating of allergic diseases comprising extract of Sophorae Flos}

본 발명은 항-알레르기 효과를 갖는 괴화 (Sophorae flos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 억제함과 동시에 알레르기성 반응에 관여하는 종양괴사인자 알파 (TNF-α) 및 인터루킨-4 (IL-4)의 생성을 억제함으로써, 독성 또는 부작용 없이 비만세포를 매개로 하여 발생되는 알레르기성 질환의 근본적인 예방 및 치료를 위해 사용되는 괴화 추출물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

알레르기성 질환은 일반적으로 기도 또는 기관지 등의 조직에 알레르기성 염증반응이 진행됨으로써 유발되는 것으로 알려져 있다. 알레르기성 질환이 일어나는 과정을 구체적으로 살펴보면, 알레르기를 유발하는 물질(알러젠 또는 항원)이 호흡기, 소화기, 피부를 통해 체내로 들어오면 조직 속의 비만세포(mast cell) 표면에 부착되어 있는 IgE 항체에 결합하게 되고, 이에 따라 비만세포는 히스타 민(histamine)이라는 물질을 분비한다. 히스타민은 비점막에서 알레르기성 반응을 일으키는 가장 중요한 화학매체로서, 혈관의 투과성을 증가시켜 비점막의 부종을 일으키고, 감각신경 말단을 자극하여 눈물, 콧물, 가려움증과 같은 다양한 알레르기 초기반응을 유발한다. 이어서 히스타민 이외에 호산구 화학주성 인자(eosinophilic chemotactic factor), 류코트리엔(leukotriene) 등과 같은 화학주성능을 가진 화학매체가 조직 속의 비만세포로부터 분비된다. 이러한 화학주성 물질에 의해 호산구(eosinophile)가 알레르기 발생부위로 이동(주화성; chemotaxis)하게 되어, 조직손상, 염증반응, 과민반응과 같은 알레르기 후기반응을 유발한다.

알레르기성 질환에는 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 등이 있으며, 매연과 같은 공해가 심해지면서 그 수가 점차 늘어나고 있음에도 아직 그 원인을 완전히 없앨 수 있는 치료제가 없는 실정이다.

현재 개발된 알레르기성 질환 치료제로는 알러젠에 의해 비만세포 등에서 분비된 히스타민이나 류코트리엔 등의 수용체에 대한 길항제들이 주를 이루고 있다. 그러나 이러한 약물은 환자에게서 투여 후 단기간 내에 내성을 보이기 때문에 환자들의 증상호전을 위한 경우가 대부분인 것으로 질병의 원인을 원천적으로 차단하기에는 미비할 뿐만 아니라, 약제들에 의한 부작용도 심각한 상황이다 (Rabe KF, et al., Eur Respir J Suppl., 34:34s-40s, 2001).

또한, 알레르기성 질환의 치료를 위한 치료법으로서, 알레르기 환자가 앓고 있는 알레르기에 대한 알러젠 (allergen)을 규명한 후 이를 소량씩 수년간 투여하여 그 알레르기를 점차 감소시키는 방법이 있다. 그러나, 이러한 치료법은 치료기 간이 수년이 걸린다는 단점이 있으며, 아나필락틱 쇼크 등을 유발시킬 수 있다는 문제점이 있다. 이 외에 DNA 백신을 이용하는 방법, IgE가 비만세포의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 치료법 및 알레르기를 유발하는 사이토카인인 IL-4에 대한 항체 치료법 등이 있으나 이러한 치료법들은 비용이 많이 들거나 아직 완전히 그 치료 효과가 규명되지 않았다는 단점이 있다.

한편, 괴화 (Sophorae flos)는 회화나무 (Sophora japonica L.)의 꽃봉오리를 말린 것으로 중국이 원산지이고, 콩과에 속한다. 그 약리작용으로 폐(肺), 대장(大腸), 간(肝), 방광경맥(膀胱經脈)의 귀경약물(歸經藥物)로 치창종통(痔瘡腫痛), 뉵혈붕루(뉵血崩漏), 항염작용, 해경(解痙), 항궤양작용, 옹저창독(癰疽瘡毒), 음창습양(陰瘡濕痒), 정창종독(정瘡腫毒), 창양(瘡瘍), 장풍장독(腸風臟毒), 피부창(皮膚瘡), 심통(心痛) 등의 여러 질병에 널리 사용되고 있다 (김창민 외, 중약대사전 제1권, 도서출판 정담, 496∼509, 1998). 최근에는 항문암, 직장암, 식관암, 자궁암, 대장암, 유선암, 폐암, 간암, 위암 등에 경구투여의 임상적 효능 등이 보고된 바 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-380865호에는 식물 에스트로겐을 포함하는 괴화 추출물의 골다공증 예방 및 치료 효과가 개시된 바 있다.

그러나, 괴화 추출물에 대한 항-알레르기 효과에 대해서는 어떠한 개시나 교시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 다양한 알레르기 질환을 근원적인 방법으로 부작용 없이 치료할 수 있는 물질을 확보하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명의 괴화 추출물이 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 근본적으로 억제함을 확인하고, 상 기 괴화 추출물의 알레르기성 질환의 치료제로서의 용도를 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 목적은 항-알레르기 효과를 갖는 괴화 (Sophorae flos) 추출물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 괴화 (Sophorae flos) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 괴화 (Sophorae flos) 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 알레르기성 질환은 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식 또는 알레르기성 피부염인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 의한 괴화 추출물은 천연물 유래의 물질로써 독성 및 부작용이 없이, 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 억제함과 동시에 알레르기성 반응 에 관여하는 종양괴사인자 알파 (TNF-α) 및 인터루킨-4 (IL-4)의 생성을 억제함으로써, 근원적인 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 가능하게 하므로, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 및 알레르기성 피부염과 같은 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 효과적이고 안전한 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 항-알레르기성 효과를 갖는 괴화 추출물 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 괴화 추출물은 추출방법에 따라 열수 추출물과 유기용매 추출물로 구분할 수 있으며, 괴화 열수 추출물의 제조방법은,

(1) 괴화 꽃봉오리를 증류수로 세척하여 잘게 분쇄한 후, 100 ~ 120℃의 열탕에서 2 ~ 3 시간 동안 가열하여 추출물을 수득하는 단계;

(2) 상기 추출물을 여과 및 농축하여 농축액을 얻는 단계; 및

(3) 상기 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 괴화 열수 추출물 분말을 수득하는 단계;를 포함한다.

본 발명에 있어서, 열수 추출시 괴화와 물의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 괴화 분말에 물을 3 ∼ 20배 (중량기준)로 첨가할 수 있으며, 바람직하게는, 추출효율을 증가시키기 위해서 괴화 분말에 대하여 물을 5 ∼ 10배 (중량기준)로, 더욱 바람직하게는 괴화 분말 100g 당 1ℓ를 첨가할 수 있다. 또한, 일정한 온도를 유지하고 증기로의 손실을 막기 위하여 냉각기를 설치하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 괴화 유기용매 추출물의 제조방법은,

(1) 괴화 꽃봉오리를 저급 알코올에 침지시켜 초음파 추출기로 2 ~ 3주 처리하여 알코올 추출물을 얻는 단계;

(2) 상기 알코올 추출물을 농축하여 농축액을 얻는 단계; 및

(3) 상기 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 괴화 유기용매 추출물 분말을 수득하는 단계;를 포함한다.

본 발명에 있어서, 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 등으로 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 95% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 괴화 열수 추출물 및 유기용매 추출물을 제공한다.

본 발명의 괴화 추출물은 알레르기성 질환을 치료 및 예방하는 효과를 가지고 있다. 상기 알레르기성 질환은 비만세포를 매개로 하여 발생되는 질환으로 구체적으로 예를 들면, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식 및 알레르기성 피부염을 포함할 수 있다.

본 발명의 괴화 추출물의 항-알레르기 효과는 비만세포에 대한 알레르기 유발물질 분비의 억제효과, 알레르기 동물 모델에서 항-알레르기 효과, 비만세포에 대한 사이토카인 생성 억제효과 및 비만세포 내 알레르기 유발의 원인이 되는 다양한 신호전달경로의 활성화 억제효과 등을 조사함으로써 확인하였다.

본 발명의 괴화 추출물은 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 저농 도에서 유의적으로 억제하였으며, 고농도에서는 거의 90% 이상 탁월하게 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 비만세포에서 분비되는 사이토카인으로 잘 알려진 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 인터루킨-4(IL-4)의 생성을 유의적이며 농도-의존적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 체내에서 알레르기를 유발하는 비만세포 내 알레르기 유발의 원인이 되는 다양한 신호전달경로 중 Syk-LAT의 인산화를 억제하였으며, 체내 사이토카인 생성의 중요한 역할을 하는 MAP 키나아제 또한 유의적이고 농도-의존적으로 억제하는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명의 괴화 추출물은 종래의 증상 회복 위주의 알레르기성 질환의 치료제와는 달리, 비만세포에서의 알레르기 유발 물질의 분비를 근원적으로 차단함으로써 알레르기성 질환의 치료 및 예방 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

본 발명의 괴화 추출물은 천연물 유래의 물질로서 독성 및 부작용이 거의 없다.

본 발명은 상기 괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 생약 추출물 그 자체만으로 포함할 수 있지만, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형, 예를 들면, 분말, 정제, 과립, 캅셀 또는 주사제 등의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다. 또한 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 괴화 추출물을 통상적인 방법에 의해 정제로 제형화할 경우, 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 상기 괴화 추출물을 1 : 1의 비율로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 괴화 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없으며, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 괴화 추출물은 체중 1 ㎏당 1일 0.001 ~ 50 ㎎으로, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎎으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 괴화 추출물은 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시 예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 괴화 열수 추출물의 제조

괴화 꽃봉오리의 열수 추출물을 제조하기 위하여, 괴화 꽃봉오리를 증류수로 세척하여 분쇄기로 잘게 분쇄한 후, 잘게 분쇄된 괴화를 열탕에서 가열하여 괴화 추출물을 얻었다. 이때, 괴화 꽃봉오리 원료 각 100 g에 대하여 물 1.0 ℓ를 첨가한 다음 100 ~ 120℃의 열탕에서 2 ~ 3 시간 동안 가열하여 추출하였으며 일정한 온도를 유지하고 증기로의 손실을 막기 위하여 냉각기를 설치하였다. 상기와 같이 수득된 괴화 추출물을 여과 및 농축한 후, 농축액을 냉동시키고 -80℃에서 동결건조하여 괴화 열수 추출물의 엑기스 분말을 제조하였다.

실시예 2. 괴화 유기용매 추출물의 제조

괴화 꽃봉오리의 유기용매 추출물을 제조하기 위하여, 괴화 꽃봉오리를 저급 알코올에 침지시켜 초음파 추출기로 2 ~ 3주 동안 추출하여 알코올 추출물을 얻은 후 상층액만을 분리하여 이를 거즈에 걸러 이물질을 제거하였다. 알코올로는 95% 에탄올을 사용하였으며, 상기와 같이 수득된 괴화 알코올 추출물을 농축기 를 이용하여 농축한 후 냉동시키고 -80℃에서 동결건조하여 괴화 유기용매 추출물의 엑기스 분말을 제조하였다.

실험예 1. 괴화 추출물의 비만세포에 대한 알레르기 유발물질 분비 억제 효과 조사

상기 실시예 1로부터 얻은 괴화 추출물의 체내에서 알레르기를 유발하는 비만세포로부터 알레르기 유발 물질의 분비 억제 효과를 검색하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

RBL-2H3 세포는 글루타민, 항생제와 15% 우혈청이 보충된 최소배지에서 배양하였으며, 분비실험을 위한 세포는 트립신에 의해 수거 후 24-웰 배양기에 웰당 200,000개의 세포를 25 ng/㎖ DNP-특이적 IgE와 같이 배양하였다. 다음날 세포는 PIPES 완충액 (25 mM PIPES, pH 7.2, 159 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 5.6 mM 글루코오스 및 0.1% BSA)으로 세척한 후, 항원이 가해지기 전에 30분 동안 전배양하였다. 전 배양 후 항원이 최종농도 25 ng/㎖로 자극하였으며, 알레르기 유도물질의 분비정도는 배지 중에 분비된 탈과립의 표식자인 헥소스아미니다제 (hexosaminidase)의 활성을 p-니트로페닐-아세틸-β-D-글루코사미니드 (p-nitrophenyl- acetyl-β-D-glucosaminide)의 p-니트로페닐의 양으로 결정하였다. 골수유래의 비만세포 (BMMC)는 4 ㎖ 둥근바닥 튜브 (round bottom tube)에 세포를 각각 2.0 × 10⁶ 씩 분주한 다음, 50 ng/㎖ DNP-특이적 IgE가 포함되어 있는 배지와 함께 4시간 동안 배양하여 세포를 감작시킨 후 1,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 Tyrode 완충용액 (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM HEPES, 5.6 mM 글루코오스, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.05% BSA, pH7.4)으로 세포를 1회 세척한 다음 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 10분 동안 37℃ 항온조에서 배양하였다. 그런 다음으로 25 ng/㎖ DNP-BSA (항원)로 15분 동안 세포를 자극시킨 후에 5분간 얼음에 두어 반응을 정지시키고 1,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 E-튜브에 옮긴 다음, 튜브에 남아있는 세포는 0.1% 트립톤 X-100로 용해시켰다. 상층액과 용해된 세포는 96웰 플레이트에 1 mM P-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드 (P-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide)와 각각 30 ㎕씩 섞은 다음 37℃ 항온수조 위에서 1시간 동안 배양시킨 후, 0.1 M 탄산염 완충액(Carbonate buffer)을 넣어, 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었으며, 도 1에 나타낸 바와 같이 항원에 의한 골수 비만세포 및 RBL-2H3 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비가 괴화 추출물에 의해 저농도(IC₅₀: 약 30 ㎍/㎖)에서도 유의하게 억제됨을 알 수 있었으며, 괴화 추출물 100 ㎍/㎖에서는 알레르기 유발물질의 분비가 90% 이상 억제됨을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 알레르기 동물 모델에서 항-알레르기 효과 조사

본 발명의 괴화 추출물의 알레르기 동물 모델에서의 항-알레르기 효과를 조 사하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

ICR계 마우스의 한쪽 귀에 면역글로블린 E를 0.5 ㎍씩 피내주사 한 후, 12 시간 동안 감작시킨 다음, 5% 아라비아검 (arabic gum)에 현탁시킨 괴화 추출물을 용량별로 경구 투여하고 1시간 후 항원 용액 250 ㎕ (1 ㎎ 항원 + 5 ㎎ 에반스블루/㎖ PBS 용액)를 꼬리정맥을 통해 주입하였다. 주입 30분 후 마우스의 귀를 떼어내어 63℃ 700 ㎕의 포름아마이드 용액에서 24시간 동안 추출시키고, 추출된 에반스블루를 620 ㎚에서 흡광도를 측정하여 항-알레르기 효과를 확인하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었으며, 도 2에 나타낸 바와 같이 본 발명의 괴화 추출물은 항원에 의한 알레르기 반응을 ㎏당 300 ㎎ 투여군에서 57.4 %를 억제하였고, ㎏당 1,000 ㎎ 투여군에서는 85.1 %를 억제하였다. 이는 대조군으로 사용된 디페닐하이드라민 (DPH)과 유사한 약효를 나타냄을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 괴화 추출물이 항원에 의해 유도된 알레르기 동물 모델에서도 탁월한 항-알레르기 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 괴화 추출물의 비만세포에 대한 사이토카인 생성 억제효과 조사

본 발명의 괴화 추출물의 비만세포에 대한 사이토카인 생성 억제효과를 알아보기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

알레르기에 관계된 비만세포에서 분비되는 사이토카인으로 잘 알려진 종양괴사인자-α(TNF-α)와 인터루킨-4(IL-4)에 대한 괴화 추출물의 억제효과를 알아보기 위하여 각각의 사이토카인에 특이적인 프라이머 (primer)를 이용하여 RT-PCR을 실 시하였다. 우선 6웰 플레이트에서 자극시킨 RBL-2H3 세포를 trizol reagent (Invitrogen)로 용해시킨 후, 용해된 시료를 1.5 ㎖ E-튜브에 옮긴 다음, 클로로포름 200 ㎕ 넣어 섞고, 12,000 g 에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 상층액과 이소프로판올 (isopropanol)을 1:1로 섞은 후 -20℃에서 RNA를 한 시간 이상 침전시킨 후, 12,000 g에서 20 분간 원심분리하여 RNA를 완전히 침전시킨 다음 에탄올로 1회 세척하고 0.1% DEPC-water 50 ㎕에 녹여서 전체 RNA를 얻었다. PCR (polymerase chain reaction)은 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 60초를 30회 반복하였으며, 프라이머는 랫트 TNF-α는 forward 5'-CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA C-3', reverse는 5'-CCG GAC TCC GTG ATG TCT AAG TAC T-3', IL-4는 forward 5'-CCG ATT ATG GTG TAA TTT CCT ATG CTG-3', reverse는 5'-GGC CAA TCA GCA CCT CTC TTC CAG-3'이고 랫트 GAPDH forward는 5'-GTG GAG TCT ACT GGC GTC TTC-3', reverse는 5'-CCA AGG CTG TGG GCA AGG TCA-3'이었다.

그 결과를 도 3에 나타내었으며, 도 3에 나타낸 바와 같이 괴화추출물 30 ㎍/㎖에서 종양괴사인자 (TNF-α) 및 인터루킨-4 (IL-4)의 생성이 감소하기 시작하여 100 ㎍/㎖ 이하에서 거의 억제됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 괴화 추출물에 의해 사이토카인 생성이 유의적이며 농도-의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 괴화 추출물의 비만세포에 대한 작용기전 조사

상기 실시예 1로부터 얻은 괴화 추출물이 체내에서 알레르기를 유발하는 비 만세포 내 알레르기 유발의 원인이 되는 다양한 신호전달경로 중 Syk-LAT에 대한 활성화 억제 효과를 조사하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

RBL-2H3 세포를 6웰 플레이트에 웰당 1.0 × 10⁶ 씩 분주한 후, 20 ng/㎖ DNP 특이적 면역글로블린 E가 포함되어 있는 MEM 배지에서 12시간 동안 배양하여 세포를 감작시켰다. 상기 세포를 괴화 추출물로 30분 동안 전처리하고 항원으로 자극시킨 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후, 용해 완충액 (Lysis buffer; 20 mM HEES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet p-40, 10% 글리세롤, 60 mM 옥틸-β-글루코사이드, 10 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 2.5 mM nitrophenylphosphate, 0.7 ㎍/㎖ 펩스타틴 및 단백질 저해 정제)으로 용해시켰다. 다음으로, 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 2× 램니 시료 완충액 (laemmli sample buffer)과 섞어 100℃에서 5분간 단백질 변성과정을 진행하였다. 이렇게 얻은 단백질시료를 10% 또는 12%의 폴리아크릴아미드 겔 (poly acrylamide gel; polyacrylamide:bis acrylamide = 29:1)을 사용하여 120 V에서 1시간 30분 동안 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 진행시킨 후, 300 mA로 1시간 30분 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane, Schleicher & Schuell, BA85)으로 전이시켰다. TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)로 5% 탈지분유 (skim milk) 또는 5% BSA을 만들어 한 시간 동안 블로킹시킨 다음, 각각의 특이적인 항체와 한 시간 동안 반응시켰다. 그리고 HRP (horseradish peroxidase)가 붙은 단일클론 항체 또는 다클론 항체로 한 시간 동안 반응시킨 다음, 비특이적으로 남아있는 항체를 TBS-T로 씻어 제거해주고 ECL 검출 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다.

그 결과를 도 4에 나타내었으며, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 괴화 추출물 10 ㎍/㎖에서 Syk과 LAT의 인산화 정도가 감소하기 시작하여 30 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖에서는 단백질의 인산화가 거의 억제됨을 알 수 있었다. 또한 체내 사이토카인 생성에 중요한 역할을 하는 MAP 키나아제도 괴화 추출물에 의해 유의적이며 농도-의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.

도 1 은 본 발명의 괴화 추출물의 비만세포에 대한 농도-의존적 억제 효과를 나타낸 사진으로, 도 1a 는 RBL-2H3 비만세포에 대한 괴화 추출물의 탈과립 억제 효과를 나타낸 것이며, 도 1b 는 골수유래 비만세포에 대한 괴화 추출물의 탈과립 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 2 는 국소성 알레르기 동물모델에 대한 본 발명의 괴화 추출물의 알레르기 억제 효과를 나타낸 사진이다.

도 3 은 활성화된 비만세포에서 염증성 사이토카인인 종양괴사인자 (TNF-α) 및 인터루킨-4 (IL-4)의 생성에 대한 본 발명의 괴화 추출물의 억제 효과를 나타낸 사진이다.

도 4 는 본 발명의 괴화 추출물의 약효기전에 대한 웨스턴 블럿팅 (Western Blotting)의 결과를 나타낸 사진이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Pharmaceutical composition for preventing and treating of allergic diseases comprising extract of Sophorae Flos <130> P07-E399 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caccacgctc ttctgtctac tgaac 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccggactccg tgatgtctaa gtact 25 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccgattatgg tgtaatttcc tatgctg 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggccaatcag cacctctctt ccag 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtggagtcta ctggcgtctt c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccaaggctgt gggcaaggtc a 21

Claims

괴화 (Sophorae flos) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
제1항에 있어서, 괴화 열수 추출물은

(1) 괴화 꽃봉오리를 증류수로 세척하여 잘게 분쇄한 후, 100 ~ 120℃의 열탕에서 2 ~ 3 시간 동안 가열하여 추출물을 수득하는 단계;

(2) 상기 추출물을 여과 및 농축하여 농축액을 얻는 단계; 및

(3) 상기 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 괴화 열수 추출물 분말을 수득하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
제2항에 있어서, 단계 (1)에서 물은 괴화 꽃봉오리 분말 100g 당 1ℓ를 첨가하는 것을 특징으로 하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
괴화 (Sophorae flos) 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
제4항에 있어서, 괴화 유기용매 추출물은

(1) 괴화 꽃봉오리를 저급 알코올에 침지시켜 초음파 추출기로 2 ~ 3주 처리하여 알코올 추출물을 얻는 단계;

(2) 상기 알코올 추출물을 농축하여 농축액을 얻는 단계; 및

(3) 상기 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 괴화 유기용매 추출물 분말을 수득하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
제5항에 있어서, 저급 알코올은 95% 에탄올인 것을 특징으로 하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기성 질환은 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식 또는 알레르기성 피부염인 것을 특징으 로 하는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.