KR20150074260A

KR20150074260A - 갈매나무 추출물을 포함하는 항알레르기제

Info

Publication number: KR20150074260A
Application number: KR1020130161242A
Authority: KR
Inventors: 최완수; 김지형
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2015-07-02

Abstract

본 발명은 항알레르기제 및 이를 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 부작용이 전혀 없는 천연소재인 갈매나무 추출물을 유효성분으로 하는 항알러지제 및 상기 항알러지제를 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물과 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공함으로써, 독성 및 부작용 없이 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 억제함과 동시에 비만세포에서 분비되는 사이토카인 생성을 억제하고, 비만세포 내 알레르기 유발의 원인이 되는 다양한 신호전달 경로의 활성화를 억제하므로 근원적인 알레르기성 질환의 예방 또는 치료가 가능할 수 있고, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 알레르기성 결막염, 알레르기성 피부염 등과 같은 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품, 기능성 식품 및 화장품 등에 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다.

Description

갈매나무 추출물을 포함하는 항알레르기제{ANTIALLERGIC AGENTS COMPRISING EXTRACTS FROM RHAMNUS DAVURICA}

본 발명은 항알레르기제 및 이를 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 비만세포의 탈과립을 억제함으로써 알레르기 유발물질의 분비를 억제하고 알레르기성 반응에 관여하는 종양괴사인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨-4(IL-4)의 생성을 억제하여 비만세포를 매개로 하여 발생되는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 항알러지제 및 약학조성물 등에 관한 것이다.

인체외부에서 이물질들이 체내로 들어오면 우리 몸에서는 이들로부터 우리 몸을 보호하는 면역반응이 일어나는데 이를 정상 면역반응이라고 한다. 그러나 이러한 면역반응이 지나치면 신체 이상이 초래되는 과민반응이 유발되고, 과민반응 중에서 특수한 기전으로 우리 몸에 이상이 생기는 경우를 알레르기 반응이라고 한다.

알레르기 반응의 원인은 알레르기 항원인 알러젠(allergen)으로 작용하는 외부 물질에 반응하는 인체의 면역체계에 의해 유발된다. 알러젠은 항원제시세포에 의해 세포 표면에 제시되고, 이렇게 제시된 항원은 B림프구에 의해 인식되어 형질세포(plasma cells)로 전환되며, 항원을 특정하게 인식하는 항체(IgE)를 분비하게 된다.

알레르기 질환은 알러젠에 반복적으로 접촉되어 기억세포(memory cell)에 의환 과도한 면역반응으로 발생하며, 항원과 결합하는 IgE는 조직의 비만세포(mast cells)의 수용체(FcεRI)에 결합하여 비만세포의 탈과립을 유도한다. 비만세포의 탈과립은 히스타민(histamine), 헤파린(heparin), 류코트리엔(leukotrienes), 프로스타글란딘(prostaglandine) 및 다른 과민증인자(anaphylatic agents) 등을 분비하게 된다. 이렇게 분비된 면역활성 인자들이 면역체계를 활성화시키며 염증(inflammation) 및 알레르기 반응(allergic reactions)을 발생시키는 원인이다.

과민반응은 크게 4가지 유형으로 나눌 수 있다. 일반적으로 알레르기 반응이라고 일컫는 제1형 과민반응은 특정한 항원에 대하여 나타나는 반응으로, 그 항원에 대해 특이적인 IgE 항체가 비만세포나 호염구(basophil)에 결합되어 유도되는 반응이다.

알러젠에 대하여 특이적인 IgE 항체가 많이 만들어지면 이들 항체는 비만세포나 호염구 표면에 있는 FcεRI 수용체와 결합하게 되며, 여기에 알러젠이 결합하여 이들 세포가 활성화되고, 여러 가지의 생리활성 물질이 분비되어 혈관확장, 혈관의 침투성 증가, 평활근 수축, 염증반응 등과 같은 변화가 유도된다.

이러한 반응은 이들 세포가 만들어내는 매개물질의 종류와 양에 따라 국소적으로 또는 전신적으로 나타날 수 있다.

또한, 상기 반응은 항원이 들어온 후 한 시간 이내에 나타나기 때문에 급성과민반응(immediate hypersensitivity)이라고도 부른다. 이러한 급성과민반응이 강하게 전신적으로 나타나는 경우, 아나필락시스(anaphylaxis)라고 하며, 심하면 질식과 순환계 이상으로 사망할 수도 있다. 급성과민반응은 IgE에 의해 매개되므로 그 반응이 항원 특이적으로 나타난다.

더욱이 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 비염, 류마티스 관절염 등 다양한 알레르기 질환에 있어서 비만세포는 매우 중요하다. 비만세포는 다른 세포와 달리 크고 굵은 이염색성의 과립을 함유하고 있으며, IgE가 비만세포가 가지고 있는 FcεRI(high-affinity receptor for IgE)에 결합된 상태에서 항원에 의해 자극을 받게 되면 여러 면역반응과 염증반응에 관여한다.

따라서 비만세포는 알레르기 반응 중에서 일어나는 다양한 생리학적, 면역학적, 병리학적 과정, 즉 창상치유, 혈관생성, 기생충과 신생물에 대한 숙주의 반응, 급만성 염증반응과 IgE 매개의 즉각적인 알레르기 반응에 중심적인 역할을 하게 된다.

알레르기 반응에서 비만세포 활성시 분비되는 매개물질로 혈관의 확장 및 통증의 원인이 되는 생체아민(biogenic amine)인 히스타민과 5-HT(세로토닌)이 있으며, 그 외에도 IL-1, 4, 6, 10, 13, MIF, TNF 등의 사이토카인(cytokine)을 분비하여 염증 및 백혈구(leukocyte)의 이동(migration), 증식(proliferation)을 유도한다.

또한, 인지질 대사물(phospholipid metabolites)인 류코트리엔 B4(leukotrien B4, LTB4), 류코트리엔 C4(leukotrien C4, LTC4), 혈소판활성인자(platelet activating factor, PAF), 프로스타글란딘 D2(prostaglandin D2, PGD2)를 분비함으로써 백혈구 화학주성(leukocyte chemotaxis), 기도수축 및 통증을 유발한다.

그 외에도 조직손상, 통증, 안지오텐신 Ⅱ 합성(angiotensin Ⅱ synthesis)을 유도하는 카이메스(chymase), 트립타아제(tryptase) 등의 효소와 코르티코트로핀분비효소(corticotropin-releasing hormone, CRH), 엔돌핀(endolphins), 엔도텔린(endothelin), 키닌(kinins), 소마토스타틴 물질 P(somatostatin substance P, SP), 혈관작용 소장펩타이드(vasoactive intestinal peptide, VIP), 우로코르틴(urocortin), 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 등의 펩타이드를 분비하여 염증, 소양, 통증, 혈관확장 및 기도수축 등의 일련의 알레르기 반응을 유도한다.

현재까지 개발된 알레르기성 질환 치료제는 알러젠에 의해 비만세포 등에서 분비된 히스타민이나 류코트리엔 등의 수용체에 대한 길항제들이 주를 이루고 있다. 그러나 이러한 약물들은 환자에게서 투여 후 단기간 내에 내성을 보이기 때문에 환자들의 증상호전을 위한 경우가 대부분으로, 질병의 원인을 원천적으로 차단하기에는 미비할 뿐만 아니라 약제들에 의한 부작용도 심각한 상황이다(Rabe KF, et al., Eur Respir J Suppl., 34:34s-40s, 2001).

또한, 알레르기성 질환의 치료를 위한 치료법으로서, 알레르기 환자가 앓고 있는 알레르기에 대한 알러젠을 규명한 후 이를 소량씩 수년간 투여하여 그 알레르기를 점차 감소시키는 방법이 있다. 그러나 이러한 치료법은 치료기간이 수년이 걸린다는 단점이 있으며, 아나필락틱 쇼크 등을 유발시킬 수 있다.

이 외에 DNA 백신을 이용하는 방법, IgE가 비만세포의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 치료법, 알레르기를 유발하는 사이토카인인 IL-4에 대한 항체 치료법 등이 있으나 치료비용이 많이 들어가 아직 완전한 치료 효과가 규명되지 않았다.

상기와 같은 문제를 해결하고자 약용식물 또는 자생식물에 대한 연구가 활발하게 진행 중이다. 특히 비만세포의 활성화 신호기전과 관련하여 연구된 것으로는 동백나무, 괴화, 구절초, 고련피 추출물이 있다.

비만세포는 활성화에 따라 여러 매개물질의 분비를 유도하는데 이러한 신호전달계는 알러젠이 FcεRI와 응집체를 형성한 후 일어나게 되고, 응집이 일어난 후 수용체의 β-소단위(subunit)에 결합되어 있던 Src-family kinase에 의해 수용체가 인산화 되면서 상기 세포의 신호전달이 시작된다. Src-family kinase를 억제하면 Syk/LAT와 그 하위단계에 해당하는 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 Akt를 억제할 수 있고, 결국에는 사이토카인의 생성과 탈과립을 억제하는 효과가 있는 것이 밝혀졌다. 또한, 천초근, 호장근 추출물도 알레르기 반응 관련 세포내 신호전달을 억제하는 물질로 확인되었으며, 동백나무 추출물은 Syk 특이 억제제(Syk specific inhibitor)로서 세포내 신호전달을 억제하는 것이 보고된 바 있다.

한편, 갈매나무(Rhamnus davurica)는 한자로 서리(鼠李)라고도 한다. 한국ㅇ중국 동북부, 아무르, 우수리 등지에 분포한다. 줄기의 끝이 침 모양이고, 잎의 길이 3~16cm, 나비 2~5cm이며 양면이 거의 같은 색이고 뒷면의 중륵(中肋)이 뚜렷하며 잎자루의 길이가 10~25cm인 것을 참갈매나무(var. nipponica)라 한다. 골짜기와 냇가에서 자라고 높이는 5m 정도이며, 가지 끝이 변하여 된 가시가 있다. 잎은 마주나고 거꾸로 선 달걀 모양 또는 긴 타원형으로 끝이 뾰족하며 잎맥에 털이 있다. 잎 뒷면은 회록색이고 가장자리에 톱니가 있다. 잎자루는 6∼25mm이고 떡잎은 가늘며 빨리 떨어진다. 꽃은 단성화(單性花)로 가지 밑쪽의 잎겨드랑이에 1∼2개씩 달리고, 수술에 퇴화된 암술이 있으며, 암꽃에는 꽃밥이 없는 수술이 있다. 꽃받침은 달걀 모양이다. 5∼6월에 청록색의 꽃이 핀다. 열매는 둥글고 9~10월에 검은색으로 익으며 지름이 7mm 정도의 원형이며 2개의 씨가 들어 있다. 가을에 열매를 채취하여 밖에 묻어두었다가 봄에 파종한다.

갈매나무의 재목은 공예재로 쓰이고, 한방에서 열매를 서리자(鼠李子), 나무 껍질과 뿌리를 각각 서리피, 서리근이라 하여 해열, 이뇨, 소종(消腫)의 효능이 있어 이뇨제(利尿劑), 완하제(緩下劑)로 사용한다. 민간요법으로는 설사와 변비에도 효과가 있다. 열매와 나무 껍질은 황색염료로 쓰였다. 그러나 갈매나무 추출물의 항알러지성 효과에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.

한편, 갈매나무 추출물과 관련된 선행기술로는 한국등록특허 제10-1300846호(갈매나무 추출물을 유효성분으로 하는 골 질환 예방 및 치료용 조성물), 중국공개특허 CN10281351호 등이 있다.

본 발명자는 부작용이 전혀 없는 천연소재인 갈매나무 추출물이 비만세포의 탈과립을 억제하여 알레르기 유발물질의 분비를 억제할 뿐만 아니라 알레르기성 반응에 관하여는 종양괴사인자 알파(TNF-α)와 인터루킨-4(IL-4)의 생성을 억제함으로써 비만세포를 매개로 하는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 알레르기 유발물질의 분비를 억제하는 효과를 갖는 갈매나무 추출물을 유효성분으로 하는 항알르기제를 제공하는데 있으며, 상기 항할레르기제를 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물과 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알레르기 유발물질의 분비를 억제하는 효과를 갖는 갈매나무(Rhamnus davurica) 추출물을 유효성분으로 하는 항알레르기제를 제공한다. 상기 갈매나무 추출물은 갈매나무의 어느 부분을 사용하여도 무방하나 갈매나무 잎을 이용하여 추출물을 제조하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 갈매나무 추출물을 유효성분으로 하는 항알레르기제를 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

한편, 상기 갈매나무 추출물은 열수추출법과 용매추출법을 사용하여 제조할 수 있고, 열수추출법에 의할 경우 (1) 갈매나무를 분쇄하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 갈매나무를 열탕에서 가열하여 갈매나무 추출물을 수득하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 수득된 갈매나무 추출물을 여과 및 농축하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에 의한 갈매나무 추출물을 농축액을 동결건조하여 엑기스 분말을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 (2)단계에서 100 내지 120℃의 열탕에서 2 내지 3시간 동안 가열하여 갈매나무 추출물을 수득하는 것이 바람직하고, 상기 (4)단계에서 -60 내지 -90℃에서 동결건조시킬 수 있다.

또한, 용매추출법에 의할 경우에는 (1) 갈매나무를 분쇄하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 갈매나무를 유기용매에 침지시킨 후 초음파 추출기로 추출하여 유기용매 추출물을 수득하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 수득된 유기용매 추출물을 농축하여 갈매나무 추출물 농축액을 제조하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에 의해 제조된 갈매나무 추출물 농축액을 동결건조하여 엑기스 분말을 제조하는 단계;를 포함할 수 있고, 상기 (2)단계에서 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들 중 2 이상을 혼합한 극성용매를 사용할 수 있고, 알코올 수용액을 사용하는 것이 바람직하여 더욱 바람직하게는 95% 에탄올을 사용하는 것이다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 부작용이 전혀 없는 천연소재인 갈매나무 추출물을 유효성분으로 하는 항알레르기제 및 상기 항알레르기제를 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물과 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공함으로써, 독성 및 부작용 없이 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 억제함과 동시에 비만세포에서 분비되는 사이토카인 생성을 억제하고, 비만세포 내 알레르기 유발의 원인이 되는 다양한 신호전달 경로의 활성화를 억제하므로 근원적인 알레르기성 질환의 예방 또는 치료가 가능할 수 있고, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 알레르기성 결막염, 알레르기성 피부염 등과 같은 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품, 기능성 식품 및 화장품 등에 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 본 발명의 갈매나무 잎 추출물의 비만세포에 대한 농도-의존적 억제 효과를 나타낸 것으로, (A)는 RBL-2H3 비만세포에 대한 갈매나무 잎 추출물의 탈과립 억제 효과를 나타낸 것, (B)는 골수유래 비만세포에 대한 갈매나무 잎 추출물의 탈과립 억제 효과를 나타낸 것, (C)는 이러한 갈매나무 잎 추출물의 효과가 가역적이라는 것을 보여준 것이다.
도 2 는 본 발명의 갈매나무 잎 추출물의 국소성 알레르기 동물모델에 대한 알레르기 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3 은 본 발명의 갈매나무 잎 추출물의 활성화된 비만세포에서 염증성 사이토카인인 종양괴사인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨-4(IL-4)의 생성에 대한 억제효과를 나타낸 것이다.
도 4 는 본 발명의 갈매나무 잎 추출물의 작용기전에 대한 웨스턴 블럿팅(Western Blotting) 결과를 나타낸 것이다.
도 5 는 본 발명의 갈매나무 잎 추출물이 Fyn 특이적으로 kinase를 활성화 시키는 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 알레르기 유발물질의 분비를 억제하는 효과를 갖는 갈매나무(Rhamnus davurica) 추출물을 유효성분으로 하는 항알레르기제를 제공한다. 상기 갈매나무 추출물은 갈매나무의 어느 부분을 사용하여도 무방하나 갈매나무 잎을 이용하여 추출물을 제조하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 갈매나무 추출물을 유효성분으로 하는 항알레르기제를 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하며, 상기 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 갈매나무 열수추출물 또는 유기용매 추출물을 0.1 내지 50중량%로 포함할 수 있다.

한편, 상기 갈매나무 추출물은 열수추출법과 용매추출법을 사용하여 제조할 수 있고, 열수추출법에 의할 경우 (1) 갈매나무를 분쇄하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 갈매나무를 열탕에서 가열하여 갈매나무 추출물을 수득하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 수득된 갈매나무 추출물을 여과 및 농축하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에 의한 갈매나무 추출물을 농축액을 동결건조하여 엑기스 분말을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 (2)단계에서 100 내지 120℃의 열탕에서 2 내지 3시간 동안 가열하여 갈매나무 추출물을 수득하는 것이 바람직하고, 상기 (4)단계에서 -60 내지 -90℃에서 동결건조시킬 수 있다. 또한, 열수추출시 갈매나무와 물의 비율을 특별히 한정하지 아니하나, 바람직하게는 갈매나무 시료 중량의 약 3 내지 20배, 더욱 바람직하게 5배 내지 10배에 달하는 부피의 물, 가장 바람직하게는 갈매나무 분말 100g당 1ℓ의 물을 첨가할 수 있다. 또한, 일정한 온도를 유지하고 증기로의 손실을 막기 위하여 냉각기를 설치하는 것이 바람직하다.

용매추출법에 의할 경우에는 (1) 갈매나무를 분쇄하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 갈매나무를 유기용매에 침지시킨 후 초음파 추출기로 추출하여 유기용매 추출물을 수득하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 수득된 유기용매 추출물을 농축하여 갈매나무 추출물 농축액을 제조하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에 의해 제조된 갈매나무 추출물 농축액을 동결건조하여 엑기스 분말을 제조하는 단계;를 포함할 수 있고, 상기 (2)단계에서 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들 중 2 이상을 혼합한 극성용매를 사용할 수 있고, 알코올 수용액을 사용하는 것이 바람직하여 더욱 바람직하게는 95% 에탄올을 사용하는 것이다.

한편, 상기 알레르기성 질환은 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식 또는 알레르기성 피부염 등으로부터 선택되는 하나 이상의 질환을 포함한다.

본 발명의 약학조성물은 생약 추출물 그 자체만을 포함할 수도 있지만, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형, 예를 들면, 분말, 정제, 과립, 캅셀 또는 주사제 등의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘 카보네이트, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다. 또한 조성물을 약제화 하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 갈매나무 추출물을 통상적인 방법에 의해 정제로 제형화할 경우, 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 상기 갈매나무 추출물을 동일한 비율로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 갈매나무 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없으며, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 갈매나무 잎 추출물은 체중 1㎏당 1일 0.001~50㎎으로, 바람직하게는 0.1~10㎎으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면이로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 갈매나무 추출물은 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어지는 갈매나무 열수추출물 또는 유기용매 추출물과 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함유하고, 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 갈매나무 추출물을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다. 또한, 알레르기성 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강기능식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 첨가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100㎖를 기준하여 0.02 내지 5g, 바람직하게 0.3 내지 1g의 비율로 첨가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함하고, 본 발명의 건강음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 갈매나무 추출물을 함유하는 외에 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 솔비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것에 더하여 향미제로서 천연 향미제, 타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등 및 합성 향미제, 사카린, 아스파르탐 등을 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물 100중량부에 대해 0 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 갈매나무 열수추출물 제조

갈매나무의 잎을 증류수로 세척하여 분쇄기로 잘게 분쇄한 후, 갈매나무 시료 100g당 물 1ℓ를 첨가하여 100 내 120℃의 열탕에서 2 내지 3시간 동안 가열하여 추출하였고, 이때 일정한 온도를 유지하고 증기로의 손실을 막기 위하여 냉각기를 설치하였다.

상기 추출액을 여과하여 얻은 여과액은 농축기를 이용해 농축한 다음 냉동시켜 -80℃에서 동결건조하여 갈매나무 열수 추출물 분말을 제조하였다.

실시예 2. 갈매나무 유기용매 추출물 제조

갈매나무의 잎을 95% 에탄올에 침지시켜 초음파 추출기로 2 내지 3주 동안 추출한 후 상층액만을 분리하고 이를 거즈에 걸러 이물질을 제거하였다.

상기와 같이 여과하여 얻은 여과액은 농축기를 이용해 농축한 다음 냉동시켜 -80℃에서 동결건조하여 갈매나무 유기용매 추출물 분말을 제조하였다.

실험예 1. 갈매나무 잎 추출물의 비만세포에 대한 알레르기 유발물질 분비 억제 효과 및 가역성의 확인

상기 실시예 2.에서 수득한 갈매나무 잎 추출물의 체내에서 알레르기를 유발하는 비만세포로부터 알레르기 유발 물질의 분비 억제 효과를 확인하기 위하여, RBL-2H3 비만세포는 글루타민, 항생제와 15% 우혈청이 보충된 최소배지에서 배양하였으며, 분비실험을 위한 세포는 트립신에 의해 수거 후 24-웰 배양기에서 웰 당 180,000개의 세포를 25ng/㎖ DNP-특이적 IgE와 같이 배양하였다.

다음 날 세포를 PIPES 완충액(25 mM PIPES, pH 7.2, 159 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 5.6 mM 글루코오스 및 0.1% BSA)으로 세척한 후 항원이 가해지기 전에 30분 동안, 갈매나무 잎 추출물로 전처리하였다. 전처리 후 항원을 최종농도 25 ng/㎖로 첨가하여 자극을 유도하였다.

알레르기 유도물질의 분비정도는 배지 중에 분비된 탈과립의 표식자인 헥소스아미니다제(hexosaminidase)의 활성을 p-니트로페닐-아세틸-β-D-글루코사미니드(p-nitrophenyl-acetyl-β-D-glucosaminide)의 p-니트로페닐의 양으로 결정하였다.

한편, 생쥐 골수유래의 비만세포(BMMC)는 4 ㎖ 둥근바닥 튜브(round bottom tube)에 세포를 각각 2.5 × 10⁵씩 분주하여 500ng/㎖ DNP-특이적 IgE가 포함되어 있는 배지와 함께 4시간 동안 배양하여 세포를 감작시킨 후 1,200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 티로드(Tyrode) 완충액(135 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM HEPES, 5.6 mM 글루코오스, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.05 BSA, pH 7.4)으로 세포를 1회 세척하고, 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 10분 동안 37℃ 항온조에서 배양하였다.

배양이 완료되면 25 ng/㎖ DNP-BSA(항원)로 10분 동안 세포를 자극시킨 후 5분간 얼음에 두어 반응을 정지시킨 다음 1,200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 E-튜브에 옮기고, 튜브에 남아있는 세포는 0.1% 트립톤 X-100로 용해시켰다. 상층액과 용해된 세포는 96웰 플레이트에 1 mM p-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드(p-nitrophenyl-acetyl-β-D-glucosaminide)와 각각 30 ㎕씩 혼합하여 37℃ 이산화탄소 배양기에서 1시간 동안 배양시킨 후, 0.1 M 탄산염 완충액(Carbonate buffer)을 첨가하여 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 나타낸 도 1.에서 보는 바와 같이, 항원에 의한 골수 비만세포 및 RBL-2H3 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비가 갈매나무 잎 추출물에 의해 저농도(IC₅₀: 약 30 ㎍/㎖)에서 유의하게 억제됨을 확인할 수 있었으며, 갈매나무 잎 추출물 100 ㎍/㎖에서는 알레르기 유발물질의 분비가 약 90% 이상 억제되었다.

또한, RBL-2H3 비만세포는 25ng/ml의 DNP-특이적 IgE로 감작된 이후, 30분간의 갈매나무 잎 추출물로 전처리되었다. 그리고 PIPES 완충액으로 두차례 세척된 이후에, 항원으로 처리가 되었을 때, 가지고 있던 알레르기 유발물질의 분비 억제효과가 가역적으로 일어난다는 사실을 도 1.에서 보여주었다.

실험예 2. 갈매나무 잎 추출물의 알레르기 동물 모델에서의 항 알레르기 효과 확인

상기 실시예 2.에서 수득한 갈매나무 잎 추출물의 알레르기 동물 모델에서의 항 알레르기 효과를 확인하기 위하여, 마우스의 한쪽 귀에 면역글로불린 E를 0.5 ㎍씩 피내주사 한 후, 12시간 동안 감작시킨 다음 5% 아라비아검(arabic gum)에 현탁시킨 갈매나무 잎 추출물을 용량별로 경구 투여하고, 1시간이 경과하면 항원 용액 250 ㎕(1 ㎎ 항원 + 5 ㎎ 에반스 블루/㎖ PBS 용액)을 꼬리정맥을 통해 주입하였다.

주입 30분 후 마우스의 귀를 떼어내어 63℃, 700 ㎕ 포름아마이드 용액에서 12시간 이상 추출시키고, 추출된 에반스 블루를 620 ㎚에서 흡광도를 측정하여 항 알레르기 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 2.에 나타낸 바와 같이 본 발명의 갈매나무 잎 추출물은 항원에 의한 알레르기 반응을 ㎏당 300 ㎎ 투여군에서 46.9%를 억제하였고, ㎏당 1,000 ㎎ 투여군에서는 69.4%를 억제하였다.

이로부터 본 발명의 갈매나무 잎 추출물은 항원에 의해 유도된 알레르기 동물 모델에서도 탁월한 항 알레르기 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 갈매나무 잎 추출물의 비만세포에 대한 사이토카인 생성 억제효과 확인

상기 실시예 2.에서 수득한 갈매나무 잎 추출물의 비만세포에 대한 사이토카인 생성 억제효과를 확인하기 위하여, 알레르기에 관계된 비만세포에서 분비되는 사이토카인으로 잘 알려진 종양괴사인자 알파(TNF-α)와 인터루킨-4(IL-4)에 특이적인 프라이머(primer)를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다.

우선, 6웰 플레이트에서 자극시킨 RBL-2H3 세포를 트리졸 시약(trizol reagent, Invitrogen사)으로 용해시킨 후, 용해된 시료를 1.5 ㎖ E-튜브에 옮겨 클로로포름 200 ㎕를 첨가하여 혼합하였다. 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 상층액과 이소프로판올(IPA)을 1 : 1로 혼합한 후 -20℃에서 RNA를 한 시간 이상 침전시킨 뒤 다시 12,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 RNA를 완전히 침전시켜 에탄올로 1회 세척하고, 0.1% DEPC-water 50 ㎕에 녹여서 전체 RNA(total RNA)를 얻었다.

PCR(polymerase chain reaction)은 94℃에서 20초, 62℃에서 10초, 72℃에서 20초를 30회 반복하였으며, 이때 사용한 프라이머는 랫트 TNF-α forward 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA C-3′(서열번호 1), reverse 5′-CCG GAC TCC GTG ATG TCT AAG TAC T-3′(서열번호 2), IL-4는 forward ′-CCG ATT ATG GTGTAA TTT CCT ATG CTG-′(서열번호 3), reverse 5′-GGC CAA TCA GCA CCT CTC TTC CAG-3′(서열번호 4)이고, 랫트 GAPDH는 forward 5′-GTG GAG TCT ACT GGCGTC TTC-3′(서열번호 5), reverse는 5′-CCA AGG CTG TGG GCA AGG TCA-3′(서열번호 6)이다.

그 결과, 도 3.에 나타낸 바와 같이 갈매나무 잎 추출물 30 ㎍/㎖에서 종양괴사인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨-4(IL-4)의 생성이 감소하기 시작하여 100 ㎍/㎖ 이하에서는 거의 억제되었으며, 본 발명의 갈매나무 잎 추출물에 의해 사이토카인의 생성이 유의적이고 농도-의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 갈매나무 잎 추출물의 비만세포에 대한 작용기전 확인

상기 실시예 2.에서 수득한 갈매나무 잎 추출물의 비만세포에 대한 작용기전을 확인하기 위하여, 체내에서 알레르기를 유발하는 비만세포 내 알레르기 유발의 원이 되는 다양한 신호전달경로 중 Syk(Spleen tyrosine kinase)-LAT에 대한 활성화 억제 효과를 확인하였다.

구체적으로, RBL-2H3 세포를 6웰 플레이트에 웰당 8.0 × 10⁵씩 분주한 후, 20 ng/㎖ DNP-특이적 면역글로불린 E가 포함되어 있는 MEM 배지에서 12시간 동안 배양하여 세포를 감작시켰다.

상기 세포를 갈매나무 잎 추출물로 30분 동안 전처리하고 항원으로 자극시킨 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 용해 완충액(Lysis buffer: 20 mM HEES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet p-40, 10% 글리세롤, 60 mM 옥틸-β-글루코사이드, 10 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 2.5 mM 니트로페닐포스페이트, 0.7 ㎍/㎖ 펩스타틴 및 단백질 저해 정제)으로 용해시켰다.

다음으로, 13,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 3× 램니 시료 완충액(laemmi sample buffer)과 혼합하여 100℃에서 10분 동안 단백질 변성과정을 진행하였다.

이렇게 얻은 단백질 시료를 10% 또는 12%의 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel; polyacrylamide : acrylamide - 29 : 1)을 사용하여, 80 V에서 30분, 120 V에서 1시간동안 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 진행시킨 후, 300 ㎃로 1시간 30분 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane, Schleicher & Schuell, BA85)으로 전이시켰다. TBS-T(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20)로 5% 탈지분유(skim milk) 또는 5% BSA를 만들어 1시간 동안 블로킹 시켜서 각각의 특이적인 항체로 4℃ 냉장실에서 12시간 반응시켰다. 그리고, HRP(horseadish peroxidase)가 붙은 단일클론 항체 또는 다클론 항체로 1시간 동안 반응시킨 다음, 비특이적으로 남아있는 항체를 TBS-T로 씻어 제거하고, ECL 검출 키트(Amercham Pharmacia Biotech사)를 사용하여 화학발광시켜 확인하였다.

그 결과, 도 4.에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 갈매나무 잎 추출물 10 ㎍/㎖에서 Syk의 인산화 정도가 감소하기 시작하여 30 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖에서는 단백질의 인산화가 거의 억제되었고, 체내 사이토카인 생성에 중요한 역할을 하는 MAP(Mitogen-activated protein) 키나아제 또한 갈매나무 잎 추출물에 의해 유의적이고 농도-의존적으로 억제되는 것을 확인하였다.

실험예 5. Fyn에 특이적인 갈매나무 잎 추출물의 작용효과

상기 실시예 2.에서 수득한 갈매나무 잎 추출물의 효과가 비만세포에 존재하는 상위 중개자 단백질 분자인 Src-family kinase 중, 어떠한 단백질에 특이적으로 효과를 가지는지 알기 위하여, 갈매나무 잎 추출물이 처리 되었을 때 항원에 대한 tyrosine kinase의 활성정도를 확인하였다.

RBL-2H3 비만세포는 1.0 × 10⁷ 씩 분주된 후에, 25ng/ml DNP-특이적 면역글로불린 E가 포함되어 있는 MEM 배지에서 12시간 동안 배양하여 세포를 감작시켰다. 이후, 갈매나무 잎 추출물로 30분간 전처리 된 다음, DNP-BSA (항원)으로 자극되었다. 이렇게 얻어진 단백질은 같은 양으로 정량된 이후에, 확인하고자 하는 항체가 처리된 다음, 3시간동안 4℃ 냉장실에서 반응되었다. 반응이 끝난 후에, 각각의 항체에 맞는 beads가 50ul/ml로 첨가되었고, 4℃ 냉장실에서 12시간 반응되었다. 반응된 샘플은 beads만 남기고 lysis 완충액이 제거된 후에, 세척액으로 4차례 세척되었다. 그리고, beads만 남기고 세척액이 완전하게 제거된 이후, Universal Tyrosine Kinase Assay Kit (GenWay)를 사용하여 tyrosine kinase의 활성정도를 측정하였다.

그 결과, 도 5.에서 보이듯이, 갈매나무 잎 추출물은 Src-family kinases중에서도 Fyn에 특이적으로 작용하여, 결과적으로 그 다음에 오는 중개자 단백질들의 인산화를 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과를 종합해 보면, 본 발명의 갈매나무 잎 추출물은 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 가역적으로, 저농도에서부터 유의적으로 억제하고, 고농도에서는 거의 90% 이상 탁월하게 억제할 뿐만 아니라, 비만세포에서 분비되는 사이토카인으로 잘 알려진 종양괴사인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨-4(IL-4)의 생성을 유의적이고, 농도-의존적으로 억제하는 것으로 나타났다.

게다가, 체내에서 알레르기를 유발하는 비만세포 내 알레르기의 유발원인이 되는 다양한 신호전달경로 중 인산화에 의해 신호를 전달하는 Syk의 인산화를 억제하였으며, 체내 사이토카인 생성의 중요한 역할을 하는 MAP 키나아제도 유의적이고 농도-의존적으로 억제하는 것으로 나타났다. 그리고 이러한 효과는, 비만세포의 상위 신호 전달과정에서 존재하는 Src-family kinases중, Fyn의 활성을 특이적으로 억제함으로써 효과를 가지는 것으로 보여졌다. 본 발명의 갈매나무 잎 추출물은 종래 증상 회복 위주의 알레르기성 질환의 치료제와는 달리 비만세포에서의 알레르기 유발물질의 분비를 근원적으로 차단함으로써 알레르기성 질환의 치료 및 예방 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

알레르기 유발물질의 분비를 억제하는 효과를 갖는 갈매나무(Rhamnus davurica) 추출물을 유효성분으로 하는 항알레르기제.
제 1 항에 있어서,
상기 갈매나무 추출물은 갈매나무 잎을 이용하여 추출한 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
제 1 항에 있어서,
상기 갈매나무 추출물은 열수추출법 또는 용매추출법에 의해 추출한 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항알르기제를 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항알르기제를 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 3 항에 있어서, 상기 열수추출법은
(1) 갈매나무를 분쇄하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 갈매나무를 열탕에서 가열하여 갈매나무 추출물을 수득하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에 의해 수득된 갈매나무 추출물을 여과 및 농축하는 단계;
(4) 상기 (3)단계에 의한 갈매나무 추출물을 농축액을 동결건조하여 엑기스 분말을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
제 6 항에 있어서,
상기 (2)단계에서 100 내지 120℃의 열탕에서 2 내지 3시간 동안 가열하여 갈매나무 추출물을 수득하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
제 3 항에 있어서, 상기 용매추출법은
(1) 갈매나무를 분쇄하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 갈매나무를 유기용매에 침지시킨 후 초음파 추출기로 추출하여 유기용매 추출물을 수득하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에 의해 수득된 유기용매 추출물을 농축하여 갈매나무 추출물 농축액을 제조하는 단계; 및
(4) 상기 (3)단계에 의해 제조된 갈매나무 추출물 농축액을 동결건조하여 엑기스 분말을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
제 8 항에 있어서,
상기 (1)단계에서 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들 중 2 이상을 혼합한 극성용매인 것을 특징으로 하는 항알레르기제.