KR20150011075A - 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃 추출물 및 이의 제조방법 - Google Patents
항알레르기 효과를 가지는 붓꽃 추출물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 천연물 유래 항알레르기 추출물 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 알레르기 유발물질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia) 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학조성물과 건강기능식품을 제공함으로써, 알레르기 발병을 억제하는 기능성 화장품, 식품 및 의약품으로의 개발에 활용될 수 있고, 기존의 증상 회복 위주의 치료와는 달리 비만세포에서의 알레르기 유발 물질의 분비를 원천적으로 차단함으로써 부작용이 최소화된 화장품, 의약품 뿐 아니라 식품 등의 선택적 기능성 첨가제로서 유용하게 활용될 수 있는 효과가 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 알레르기 유발물질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia) 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학조성물과 건강기능식품을 제공함으로써, 알레르기 발병을 억제하는 기능성 화장품, 식품 및 의약품으로의 개발에 활용될 수 있고, 기존의 증상 회복 위주의 치료와는 달리 비만세포에서의 알레르기 유발 물질의 분비를 원천적으로 차단함으로써 부작용이 최소화된 화장품, 의약품 뿐 아니라 식품 등의 선택적 기능성 첨가제로서 유용하게 활용될 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 천연물 유래 항알레르기 추출물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알레르기 유발물질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia) 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학조성물과 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명은 붓꽃 (Iris netschinskia Lodd. ) 전초 추출물의 항 알레르기 효과에 대한 것으로 자생식물인 붓꽃의 전초 추출물은 알레르기 유발원인 비만세포의 탈과립 (히스타민 분비) 및 염증성 매개체인 종양괴사인자 및 인터루킨-4의 생성을 억제하였으며 그 효능은 가역적 이었다. 국소알레르기 동물모델에서 우수한 알레르기 억제 효능을 보임으로써 추후 이 추출물을 이용한 항 알레르기 기능성 화장품, 식품이나 의약품에 대한 것이다.
비만세포 및 혈중 호염구는 여러 가지 알레르기 질환 즉, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 천식, 음식 알레르기, 그리고 아나필락틱 쇼크 등을 유발하는 체내 세포로 알려져 있다. 이들 세포는 세포표면에 알레르기 원인 항체인 IgE에 대한 수용체 (FcεRI)를 가지고 있고, 그것은 알레르기를 유발하는 물질 (항원 혹은 알레르겐으로 불리워짐)에 의해 자극을 받아 자신이 가지고 있는 히스타민 등 다양한 알레르기를 유발시키는 물질을 세포 바깥으로 분비한다.
현재 시장에 나와 있는 알레르기 치료제는 대부분 알레르기 증상을 완화하는 치료제 이고 제약회사에서의 연구도 그런 방향으로 진행되어지고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 본 발명에서는 비만세포에서 알레르기 유발 물질의 분비를 원천적으로 차단함으로서 환자에게서 일어나는 기존에 사용되어지는 항히스타민제 등의 부작용이 없는 알레르기 치료제를 개발하고자 하였다.
본 발명에 따른 붓꽃은 내한성이 강한 숙근성 다년초로 붓꽃과에 속하며 산기슭과 들의 습기가 많은 곳이나 메마른 땅에서 자란다. 한국, 일본, 중국 북동부, 시베리아 동부에 주로 분포한다. 온대지역에 200종 이상 있으며 한국에는 14종이 남아있다. 전체적인 높이는 60cm 정도이며, 잎은 길이 30∼50cm, 너비 5∼10mm정도이다. 꽃은 주로 5∼6월에 피고 색은 자주색을 띄며 꽃줄기 끝에 2,3개씩 달리며 지름은 5cm정도이다. 열매는 삭과로 양 끝이 뾰족한 원기둥 모양을 가지며 삭과의 끝이 터지면서 종자를 배출한다. 뿌리줄기는 옆으로 뻗으면서 새싹이 나오고 아래 부분에 붉은빛을 띄는 갈색 섬유를 보인다. 붓꽃은 민간에서 주로 인후염, 소화불량 및 폐렴 등에 사용이 되어왔고, 이탈리아의 피렌체 지방에서는 향수의 원료로도 사용이 된다고 알려져 있으나 붓꽃 추출물에 대한 항 알레르기효과에 관한 연구 및 근거는 전혀 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 한국에 자생하는 자생식물 추출물들을 선택하여 실험해 오던 중 그 중 붓꽃 추출물이 저 농도에서 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 억제한다는 것을 발명하였으며 또한 알레르기 동물모델에서도 우수한 항 알레르기 효과가 있음을 발명하여 추후 이 물질을 사람에 적용시키기 위해 본 발명을 완성하였다.
한편, 항알레르기 조성물과 관련된 종래기술로는 한국공개특허 제10-2005-0109958호(항알레르기용 조성물), 한국공개특허 제10-2009-0088151호(항알레르기 또는 항염증 물질로서의 머위 추출물 또는 머위발효물) 등이 있다.
본 발명의 목적은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식 등 인간에게 불편함을 주거나 치명적인 다양한 알레르기를 유발하는 비만세포로부터 분비된 알레르기 유발물질의 분비를 차단함으로서 그 질환을 치료할 수 있는 소재를 자생식물들부터 확보하여 부작용은 극소화하고 효과는 극대화시킨 항 알레르기 소재를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia)의 물 또는 알코올 추출물을 제공한다.
또한, 본원발명은 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia)의 물 또는 알코올 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본원발명은 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia)의 물 또는 알코올 추출물을 함유하는 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본원발명은 (1) 건조한 붓꽃(Iris netschinskia)을 세척하고 분쇄하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 붓꽃을 열탕에서 가열하여 붓꽃 추출물을 얻는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에서 얻은 붓꽃 추출물을 여과하여 상등액을 수득하고 농축하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에 의한 농축액을 냉동시킨 후 동결건조하여 분말을 수득하는 단계;를 포함하는 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia) 추출물 제조방법을 제공한다.
또한, 본원발명은 (1) 건조한 붓꽃(Iris netschinskia)을 저급 암폴에 침시키고, 초음파 추출기로 추출하여 알콜 추출물을 얻는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에서 얻은 붓꽃 추출물을 농축하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에 의한 농축액을 냉동시킨 후 동결건조하여 분말을 수득하는 단계;를 포함하는 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia) 추출물 제조방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 본 발명의 붓꽃 추출물은 알레르기를 유발하는 비만세포의 탈과립 (히스타민 분비)작용 및 알레르기의 동물모델에서 알레르기의 유발을 저농도에서 억제하였으므로 추후에 알레르기 발병을 억제하는 기능성 화장품, 식품 및 의약품으로의 개발이 용이한 천연 추출물이다. 따라서 기존의 증상 회복 위주의 치료와는 달리 비만세포에서의 알레르기 유발 물질의 분비를 원천적으로 차단함으로써 부작용이 최소화된 화장품, 의약품 뿐 아니라 식품 등의 선택적 기능성 첨가제로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 붓꽃추출물이 사람에게 알레르기를 유발 하는 비만세포의 실험 모델인 골수유래의 비만세포 (Bone marrow-derived mast cells)와 RBL-2H3 비만세포에서 알레르기를 유발하는 항원에 의한 탈과립 (히스타민 분비)에 대한 붓꽃추출물의 농도 의존적 억제효과에 대한 도면이다.
도 2 는 항원에 의해 자극된 비만세포에서 염증성 사이토카인인 종양괴사인자 (TNF-α), 인터루킨-4 (IL-4) 발현에 대한 붓꽃추출물의 억제효과를 나타낸 결과이다.
도 3 은 붓꽃추출물 비만세포 억제 효능의 가역성에대한 실험결과이다.
도 4 는 비만세포 매개성 국소성 알레르기 동물모델에 대한 본 발명에 따른 붓꽃추출물의 억제효과를 나타낸 도면이다.
도 5 는 붓꽃추출물의 작용기전에 대한 웨스턴 블롯팅 (Western Blotting)의 결과이다.
도 2 는 항원에 의해 자극된 비만세포에서 염증성 사이토카인인 종양괴사인자 (TNF-α), 인터루킨-4 (IL-4) 발현에 대한 붓꽃추출물의 억제효과를 나타낸 결과이다.
도 3 은 붓꽃추출물 비만세포 억제 효능의 가역성에대한 실험결과이다.
도 4 는 비만세포 매개성 국소성 알레르기 동물모델에 대한 본 발명에 따른 붓꽃추출물의 억제효과를 나타낸 도면이다.
도 5 는 붓꽃추출물의 작용기전에 대한 웨스턴 블롯팅 (Western Blotting)의 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
붓꽃 전초 추출물의 제조
본 발명자들은 우수한 항 알레르기 효과를 나타내는 붓꽃 추출물을 얻기 위하여 열탕 및 유기용매 추출방법을 이용하여 붓꽃 추출물을 제조하였다.
(1) 열탕 추출방법
붓꽃 전초의 열탕 추출물을 제조하기 위하여, 건조된 붓꽃 전초를 증류수로 세척하여 분쇄기로 잘게 분쇄한 후 잘게 분쇄된 붓꽃을 열탕에서 가열하여 붓꽃 추출물들을 얻었다. 이때, 붓꽃 전초 원료 100 g에 대하여 물 1.0 ℓ를 첨가한 후 100 - 120℃의 열탕에서 2 - 3시간 동안 가열하여 추출하였고 일정한 온도를 유지하고 증기로의 손실을 막기 위하여 냉각기를 설치하였다. 이로부터 얻은 붓꽃 추출물을 여과하여 상등액을 얻고 이를 농축기를 이용하여 농축하였다. 상기 붓꽃 농축액을 냉동시켜 -80℃에서 동결건조하여 붓꽃 추출물의 엑기스 분말을 제조하였다.
(2) 유기용매 추출방법
붓꽃 줄기, 열매 혹은 잎의 유기용매 추출물을 제조하기 위하여, 붓꽃을 저급 알코올에 침지시켜 초음파 추출기로 2 - 3주 동안 추출하여 알코올 추출물을 얻은 후 상층액만을 분리하여 이를 거즈에 걸러 이물질을 제거하였다. 알코올로는 95% 에탄올을 사용하였다. 상기공정에 의해 얻은 알코올 추출물을 농축기를 이용하여 농축한 후 냉동시키고 -80℃에서 동결건조하여 붓꽃 전초 추출물의 엑기스 분말을 제조하였다.
실험예 1. 붓꽃 추출물의 비만세포에 대한 알레르기 유발물질 분비 억제 효과
본 발명자들은 상기 실시예 1.로부터 추출한 붓꽃 추출물이 체내에서 알레르기를 유발하는 비만세포로부터 알레르기 유발 물질의 분비 억제 효과를 검색하였다. RBL-2H3 세포는 글루타민, 항생제와 15% 우혈청이 보충된 최소배지에서 배양되었다. 분비실험을 하기위해 세포는 트립신에의해 수거 후 24-well 배양기에 well당 200,000개의 세포를 25 ng/ml DNP-특이성 IgE와 같이 배양하였다. 다음날 세포는 PIPES 완충액 (25 mM PIPES, pH 7.2, 159 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 5.6 mM glucose, 그리고 0.1% BSA) 으로 세척되어지고 항원이 가해지기 전에 30분 동안 전배양을 한다. 전 배양 후 항원이 최종농도 25 ng/ml로 자극한다. 알레르기 유도물질의 분비정도는 배지중에 분비된 탈과립의 표식자인 hexosaminidase의 활성을 p-nitrophenyl- acetyl-β-D-glucosaminidedbfo의 p-nitrophenol의 양 으로 결정한다
실험예 2. 항원에 의한 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비에 대한 붓꽃추출물의 억제효과
도 1a, 1b에 나타낸 바와 같이, 항원에 의한 골수세포 비만세포 혹은 RBL-2H3 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비가 붓꽃 추출물의 의해 저농도 (IC50: 약 21 ㎍/㎖)에서 유의하게 억제되었으며 100 ㎍/㎖에서 분비가 90% 이상 억제 되었다.
실험예 3. 붓꽃 추출물의 비만세포에 대한 사이토카인 생성억제효과
알레르기에 관계된 비만세포에서 분비되는 사이토카인으로 잘 알려진 종양괴사인자-α(TNF-α)와 인터루킨-4(IL-4)에 대한 붓꽃 추출물의 억제효과를 보기위해 각각의 사이토카인에 특이적인 primer를 이용 RT-PCR을 실시하였다. 우선 6 well plate에서 자극시킨 RBL-2H3 세포를 trizol reagent(Invitrogen)로 용해시켰다. 용해된 시료를 1.5 ml E-tube에 옮긴 후, 클로로포름(Chloroform)을 200 ㎕넣어 섞고, 12,000 g 에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 상층액과 이소프로판올(isopropanol)을 1:1로 섞은 후 -20℃에서 RNA를 한 시간 이상 침전시켰다. 그 후 12,000 g에서 20 분간 원심분리하여 RNA를 완전히 침전시킨 뒤, 에탄올로 한번 씻어주고 DEPC-water 50 ㎕에 녹여서 total RNA를 얻었다. PCR (polymerase chain reaction)은 94℃, 45초, 55℃, 45초, 72℃, 60초를 30회 반복하였다. Primer는 Rat TNF-α는 forward 5'-CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA C-3', reverse는 5'-CCG GAC TCC GTG ATG TCT AAG TAC T-3', IL-4는 forward 5'-CCG ATT ATG GTGTAA TTT CCT ATG CTG-3', reverse는 5'-GGC CAA TCA GCA CCT CTC TTC CAG-3'이고 Rat GAPDH forward는 5'-GTG GAG TCT ACT GGCGTC TTC-3', reverse는 5'-CCA AGG CTG TGG GCA AGG TCA-3'이다.
그 결과 도 2.에 나타낸 바와 같이, 붓꽃 추출물 30 ㎍/㎖ 이상 농도에서 종양괴사인자(TNF-α) 및 인터루킨-4(IL-4)의 생성이 거의 억제되어, 붓꽃 추출물에 의한 사이토카인 생산에 대한 억제는 명백함을 알 수 있었다.
실험예 4. 붓꽃의 비만세포 활성화 억제의 가역적 효과
비만세포의 탈 과립에 대한 붓꽃 추출물의 억제효과는 30분 전 배양 후 항원으로 자극하기 전에 배지로 5회 정도 씻어준 후 항원을 처리하였을 때, 도 3.에서 보는바와 같이 붓꽃 추출물에 의한 탈 과립 억제가 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 통해 붓꽃 추출물의 항원에 의한 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비억제가 가역적임을 알 수 있었다. 이러한 가역적 비만세포 탈 과립 억제는 비가역적인 성질로부터 올 수 있는 추출물의 부작용을 예방하는 장점을 가질 가능성을 제시했다.
실험예 5. 국소성 알레르기 동물 모델에서 항 알레르기 효과 검색
ICR mice 한쪽 귀에 면역글로블린 E를 0.5 ㎍씩 피내주사 한 후, 12 시간 감작시킨다. 감작한 후 5% arabic gum에 현탁시킨 붓꽃 추출물을 용량별로 경구 투여하고 1시간 후 항원 용액 250 ㎕ (1 ㎎ 항원 + 5 ㎎ 에반스블루/㎖ PBS 용액)를 꼬리정맥을 통해 주입한다. 주입 30분 후 mice의 귀를 떼어내어 63℃ 700 ㎕의 포름아마이드 용액에서 12시간 동안 추출시켰다. 추출된 에반스블루를 620 ㎚에서 흡광도를 측정하여 항 알레르기 효과를 확인하였고, 그 결과는 도 4.에 정리하였다.
도 4.에 나타난 바와 같이, 붓꽃 추출물은 항원에 의한 알레르기 반응을 ㎏당 300 ㎎ 투여군에서 약 54 %가 억제되었고, ㎏당 1,000 ㎎ 투여군에서 약 82 %가 억제되었으며 대조약으로 사용된 시판 세트리진 약물보다 우수한 효과를 보였다. 이로부터 본 발명의 붓꽃 추출물이 항원에 의해 유도된 알레르기 동물 모델에서도 높은 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 붓꽃 추출물 추출물의 비만세포에 대한 작용기전에 대한 연구
본 발명자들은 상기 실시예 1로부터 추출한 붓꽃 추출물이 체내에서 알레르기를 유발하는 비만세포 내 알레르기 유발의 원인이 되는 다양한 신호전달경로 중 Syk-LAT에 대한 활성화 억제 효과를 검색하였다. RBL-2H3 세포를 6 well-plate에 well당 1.0 x 106 씩 분주한 후, 20 ng/ml DNP 특이적 면역글로블린 E가 포함되어 있는 MEM 배지에서 12시간 동안 배양하여 세포를 감작시켰다. 그 세포를 붓꽃 추출물로 30분 전 처치 후 항원으로 자극시킨 세포를 ice-cold PBS로 두 번 씻어준 후, Lysis buffer (20 mM HEES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet p-40, 10% Glycerol, 60 mM octyl-β-glucoside, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 2.5 mM nitrophenylphosphate, 0.7 ㎍/㎖ pepstatin, and a protease-inhibitor tablet)로 용해시켰다. 다음으로, 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하여, 상층액을 2x laemmli sample buffer 와 섞어 100℃에서 5분간 단백질변성과정을 진행하였다. 이렇게 얻은 단백질시료를 10% 또는 12%의 poly acrylamide gel (polyacrylamide:bis acrylamide = 29:1)을 사용하여 120V에서 1시간 30분 동안 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 진행한 후, 300 mA로 1시간 30분 동안 nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell, BA85)로 Transfer 시켰다. TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)로 5% skim milk나 5% BSA을 만들어 한 시간 동안 Blocking 시킨 다음, 각각의 특이적인 항체와 한 시간 동안 반응시켰다. 그리고, HRP (horseradish peroxidase)가 붙은 단일클론 항체 또는 다클론 항체로 한 시간 동안 반응시킨 다음, 비특이적으로 남아있는 항체를 TBS-T로 씻어 제거해주고 ECL detection kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다. 그 결과 도 5.에서 알 수 있듯이 붓꽃 추출물 10 ㎍/㎖에서 Syk과 LAT의 인산화 정도가 감소하기 시작하여 30과 100 ㎍/㎖에서는 단백질의 인산화가 거의 억제됨을 확인 할 수 있었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (5)
- 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia)의 물 또는 알코올 추출물.
- 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia)의 물 또는 알코올 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia)의 물 또는 알코올 추출물을 함유하는 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- (1) 건조한 붓꽃(Iris netschinskia)을 세척하고 분쇄하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 붓꽃을 열탕에서 가열하여 붓꽃 추출물을 얻는 단계;
(3) 상기 (2)단계에서 얻은 붓꽃 추출물을 여과하여 상등액을 수득하고 농축하는 단계; 및
(4) 상기 (3)단계에 의한 농축액을 냉동시킨 후 동결건조하여 분말을 수득하는 단계;를 포함하는 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia) 추출물 제조방법. - (1) 건조한 붓꽃(Iris netschinskia)을 저급 암폴에 침시키고, 초음파 추출기로 추출하여 알콜 추출물을 얻는 단계;
(2) 상기 (1)단계에서 얻은 붓꽃 추출물을 농축하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계에 의한 농축액을 냉동시킨 후 동결건조하여 분말을 수득하는 단계;를 포함하는 알레르기 유발불질의 분비를 차단하여 항알레르기 효과를 가지는 붓꽃(Iris netschinskia) 추출물 제조방법.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR20230144804A (ko) | 2022-04-08 | 2023-10-17 | 김주호 | 머위와 붓꽃의 혼합 추출 발효물을 포함하는 피부염 예방 또는 피부개선용 화장료 조성물 |
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2013
- 2013-07-22 KR KR1020130085836A patent/KR20150011075A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR20230144804A (ko) | 2022-04-08 | 2023-10-17 | 김주호 | 머위와 붓꽃의 혼합 추출 발효물을 포함하는 피부염 예방 또는 피부개선용 화장료 조성물 |
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