Procédé pour isoler des bactéries dans le sang et
instrument pour mettre ce procédé en oeuvre.
La présente invention concerne un procédé pour isoler des bactéries dans le sang et un instrument pour mettre ce procédé en oeuvre.
Des bactéries sont présentes dans le sang
de patients souffrant d'infections systémiques graves comme la septicémie ou la bactériémie. Lors du diagnostic de ces infections systémiques, des analyses du sang concernant l'identification des bactéries et leur sensibilité aux antibiotiques sont effectuées. Pour réaliser ces analyses du sang, il est nécessaire d'isoler les bactéries du sang.
Dans des processus classiques visant à isoler des bactéries du sang, on fait croître une colonie de la manière suivante. On mélange l'échantillon de sang à un milieu de culture liquide et on procède
à la culture jusqu'à ce que le milieu de culture devienne trouble sous l'effet des bactéries qui s'y propagent. On recueille ensuite les bactéries qui sont propagées et on les transfère dans un autre milieu de culture par exemple un milieu de gélose au sang ou au sang chocolat.
Dans ces procédés classiques, il est difficile d'isoler directement les bactéries qui ne sont présentes qu'en petit nombre dans le sang. Ces procédés classiques exigent une phase de traitement préalable assurant la propagation des bactéries avant leur isolement sur un milieu de gélose, ce qui donne des procédures compliquées et longues. La propagation des bactéries ou leur multiplication dans un milieu tel que décrit plus haut exige en général un temps de propagation de 1 à 10 jours et la croissance en colonie exige 1 ou 2 jours supplémentaires.
Lorsque les bactéries qui se sont propagées sont tranférées dans un milieu d'isolement, les bactéries examinées peuvent contaminer l'atmosphère environnante ou d'autres bactéries peuvent s'y mélanger.
L'invention a pour but de procurer un procédé pour isoler des bactéries du sang, qui permette d'échantillonner directement les bactéries du sang sans exiger un processus supplémentaire, comme par exemple la propagation des bactéries du sang , qui permette d'isoler les bactéries sans les tranférer dans un autre milieu de culture, et suivant lequel une colonie peut être cultivée en peu de temps.
L'invention a également pour but de procurer un instrument utilisé dans le procédé d'isolement de bactéries dans le sang comme décrit plus haut.
Suivant un aspect de l'invention, il est prévu un procédé pour isoler des bactéries du sang, suivant lequel on mélange le sang d'un patient à un liquide contenant un réactif hémolytique et un anti-coagulant, on filtre le mélange liquide résultant à l'aide d'un filtre présentant des pores d'un calibre tel qu'il ne laisse pas passer les bactéries et on alimente les bactéries restant sur le filtre à l'aide d'agents nutritifs contenus dans le mélange liquide de manière à permettre la culture directe des bactéries sur le filtre sans transfert.
Suivant un autre aspect de l'invention, il est prévu un instrument pour isoler des bactéries du sang comprenant: un corps principal de récipient comportant une extrémité supérieure ouverte, un filtre qui est retenu dans le corps principal du récipient
à un endroit situé en hauteur entre ses extrémités
de manière à diviser l'intérieur du corps principal
du récipient en des espaces supérieur et inférieur
et qui présente des pores calibrés de manière à ne
pas laisser passer les bactéries; un élément absorbantl'eau collé sur toute la surface inférieure du filtre; une ouverture de ventilation ménagée dans une paroi ou le fond du corps principal du récipient de manière à permettre une ventilation entre l'espace inférieur de ce corps et l'atmosphère ambiante;et un couvercle couvrant l'extrémité supérieure ouverte du corps principal du récipient.
Suivant un autre aspect de l'invention, un récipient est prévu pour mélanger un échantillon de sang avec un mélange comprenant un réactif hémolytique
et un anticoagulant, qui comprend un corps cylindrique présentant une ouverture à une extrémité, et un chapeau élastique monté de manière détachable sur l'ouverture, de manière à sceller hermétiquement l'ouverture, le mélange étant présent au préalable dans le récipient.
Dans les dessins annexés:
les Fig. 1 et 2 sont des vues en coupe d'un dispositif servant à mélanger un échantillon de sang avec un liquide de traitement contenant un réactif hémolytique, un anticoagulant et d'autres substances du même genre;
la Fig. 3 est une vue en coupe d'un instrument destiné à isoler des bactéries du sang, selon
une forme d'exécution de l'invention; et
les Fig. 4 et 5 sont chacune une vue en coupe d'un instrument destiné à isoler des bactéries du sang, selon des variantes de l'invention.
Le procédé conforme à l'invention exige une opération visant à mélanger de manière homogène un échantillon de sang avec un liquide contenant une hémolysine et un anticoagulant et, selon les nécessités, un milieu de culture liquide, etc.. Cette opération est de préférence exécutée dans un système étanche de manière à empêcher à la fois la contamination de l'atmosphère ambiante par les bactéries échantillo-nées et l'introduction de bactéries étrangères dans les bactéries séparées.
Les Fig. 1 et 2 illustrent un dispositif destiné à exécuter cette opération.
Le dispositif représenté sur la Fig. 1 comprend un récipient 1 et un bouchon en caoutchouc 3.
Le récipient 1 contient un mélange liquide 2 contenant au moins un réactif hémolytique et un anticoagulant et est maintenu sous dépression. Le bouchon
en caoutchouc 3 peut être monté de manière détachable au niveau de l'orifice supérieur du récipient 1 et peut obturer le récipient 1 d'une manière étanche aux liquides. Pour mélanger l'échantillon de sang avec le mélange 2 au moyen de ce dispositif, on enfonce l'aiguille d'une seringue (non représentée) à travers le bouchon de caoutchouc 3 de manière à introduire du sang dans le récipient 1 en tirant profit de la dépression qui y règne. Après avoir introduit le sang dans le récipient 1, on retire l'aiguille du bouchon en caoutchouc 3 et on retourne le récipient bout pour bout de manière à mélanger le sang et le mélange liquide 2 contenu dans le récipient. Le réactif hémolytique peut être de la saponine; l'anticoagulant peut être de l'amylosulfate de sodium ou du polyanétholesulfonate de sodium.
Un milieu de culture liquide peut aussi être ajouté au mélange liquide 2, si nécessaire. Dans ce dernier cas, il n'est plus nécessaire d'imprégner un élément absorbant l'eau d'un instrument d'isolement au moyen d'un milieu de culture.
Un dispositif représenté sur la Fig. 2 comprend un cyclindre 4 et un organe de compression 5 qui peut coulisser d'une manière étanche aux liquides dans le. cylindre 4. Un bouchon en caoutchouc 3 est fixé
de manière détachable et de manière étanche aux liquides dans l'orifice supérieur du cylindre 4. Un mélan-ge liquide 2 contenant un réactif hémolytique et un anticoagulant tel que décrit plus haut est maintenu dans l'espace délimité par le cylindre 4 et l'organe de compression 5. Le mélange liquide 2 peut aussi contenir un milieu de culture liquide. Lorsqu'il
faut mélanger un échantillon de sang avec le mélange 2 à l'aide de ce dispositif, on enfonce l'aiguille d'une seringue qui a été utilisée pour prélever un échantillon de sang dans le bouchon en caoutchouc 3.
A mesure que le sang est débité de force dans le cylindre 4, l'organe de compression 5 coulisse vers le bas à l'intérieur du cylindre 4. Lorsque le sang a été introduit dans le cylindre 4, on retourne le dispositif bout pour bout de manière à mélanger le sang avec le réactif hémolytique et avec l'anticoagulant.
Pour éviter toute contamination du sang par d'autres bactéries, on stérilise de préférence les dispositifs décrits plus haut par exposition à des rayons gamma ou par un traitement en autoclave.
Le traitement du sang décrit plus haut porte atteinte aux globules rouges et empêche aussi le sang de se coaguler, permettant ainsi une filtration ultérieure du sang et une culture des bactéries du sang efficaces.Lorsqu'un milieu de culture liquide doit être mélangé au mélange liquide tel que décrit plus haut, il peut être simultanément mélangé au sang contenant les bactéries pendant ce traitement.
Après avoir traité le sang au moyen de l'un quelconque des dispositifs décrits plus haut, on enlève le bouchon en caoutchouc et on verse le sang sur
un filtre d'un instrument d'isolement décrit plus loin.
La Fig. 3 illustre une forme d'exécution d'un instrument servant à isoler des bactéries du sang conformément à l'invention. Sur la Fig. 3, le chiffre 11 désigne un récipient cylindrique comportant un fond et une extrémité supérieure ouverte. Un gradin annulaire 12 est formé dans la paroi à un endroit situé
à une hauteur intermédiaire du récipient. La périphérie d'un élément absorbant l'eau 13 est supportée sur la surface supérieure du gradin 12. Un filtre 14 présentant des pores calibrés pour ne pas laisser passer les bactéries à cultiver est placé sur la surface supérieure de l'élément 13 et couvre la totalité de l'extrémité supérieure ouverte du récipient
11. Le filtre 14 qui est d'une pièce avec l'élément absorbant l'eau 13 divise donc l'intérieur du récipient 11 en un espace supérieur 15 et un espace inférieur 16. Pour empêcher des fuites de sang dans l'espace inférieur 16 par un intervalle quelconque entre
la paroi du récipient 11 et la périphérie du filtre 14, un élément d'étanchéité 17 exerce une pression vers
le bas sur la périphérie du filtre 14. En variante,
la périphérie du filtre 14 peut être collée à la paroi du récipient 11 au moyen d'un adhésif.
Un évent 18 livrant passage à l'air entre l'espace inférieur 16 et l'atmosphère extérieure est formé dans le haut de la paroi du récipient 11. La référence 19 désigne un couvercle qui couvre la partie supérieure ouverte du récipient 11.
N'importe quelle matière inerte à l'égard du sang peut être utilisée comme matière pour le filtre 14. Une telle matière inerte peut, par exemple, être de la nitrocellulose, un polycarbonate, un polyamide, un ester de cellulose ou une matière analogue. De telles matières sont commercialisées, par exemple,sous les noms de "Millipore" (produit de la société Millipolar Corp.), "Metricell" (produit de la société German Instrument Company) etc. Le calibre des pores du filtre 14 est déterminé en fonction de l'application. Cependant,
le calibre des pores du filtre 14 est en général de <EMI ID=1.1>
Le filtre 14 est de préférence traité de manière à présenter de bonnes propriétés hydrophiles par un procédé connu garantissant une bonne aptitude au mouillage par le s ang.
L'élément absorbant l'eau 13 absorbe et retient le sang filtré par le filtre 14 et fournit ainsi les matières nutritives aux bactéries retenues sur le filtre 14. L'élément absorbant l'eau 13 a de préférence une capacité lui permettant d'absorber la quantité totale du sang filtré par le filtre 14. La matière de l'élément 13 est de préférence un papier-filtre du type cellulosique, un tissu non tissé ou l'équivalent. L'élément 13 doit être solidement fixé soit directement, soit par l'intermédiaire d'un adhésif,à la surface arrière du filtre 14. Lorsque l'élément 13 n'est pas convenablement fixé au filtre 14, une filtration efficace ne peut pas être obtenue et l'amenée de l'eau
et des matières nutritives aux bactéries présentes sur le filtre 14 devient peu satisfaisante. L'adhésif à appliquer entre le filtre 14 et l'élément 13 est avantageusement un adhésif soudable à chaud en fibres polymères à bas point de fusion qui ne gêne pas la filtration. L'élément 13 peut être imprégné au moyen d'un milieu de culture liquide qui est séché après imprégnation, comme il le faut. Dans ce cas, le milieu séché est dissous dans le sang filtré absorbé et retenu par l'élément absorbant l'eau 13 qui fournit de l'eau et des matières nutritives aux bactéries présentes sur le filtre 14.
L'espace supérieur 15 au-dessus du filtre 14 est destiné à stocker l'échantillon de sang et l'espace inférieur 16 est destiné à stocker la fraction du sang qui n'est pas absorbée et retenue par l'élément 13.
La Fig. 4 illustre une variante d'un instru-ment destiné à isoler des bactéries du sang selon la présente invention. L'instrument de cette variante diffère de celui décrit plus haut avec référence à la Fig. 3 par les aspects suivants. Dans l'instrument représenté sur la Fig. 4, un évent 18' est ménagé dans le fond du récipient 11. Un filtre à bactéries 21
(par exemple un tampon de coton) destiné à empêcher l'entrée des bactéries contaminatrices est monté dans l'évent 18'. Pour empêcher des fuites de sang par l'évent 18', une paroi cylindrique 22 est formée tout autour de l'évent 18'. Des parois intermédiaires ou tampon 23 sont formées concentriquement sur la surface de fond du récipient 11 de manière à permettre au sang de se concentrer uniquement autour de l'évent 18'.
Les mêmes chiffres de référence que ceux utilisés sur la Fig. 3 désignent les mêmes parties sur la Fig. 4 et une description détaillée n'apparaît pas nécessaire.
La Fig. 5 illustre une autre variante d'un instrument servant à isoler des bactéries du sang conformément à l'invention. Cette variante est très semblable à celle représentée sur la Fig. 4 mais elle en diffère par les aspects suivants. La hauteur de l'élément d'étanchéité 17' est supérieure à celle représentée sur la Fig. 4 et une collerette est prévue à son extrémité supérieure. Cela étant, le couvercle 19 est monté sur la collerette de l'élément d'étanchéité 17', assurant ainsi l'étanchéité de l'intérieur de l'espace supérieur 15. De plus, une paroi cylindrique 24 s'étend vers le bas au centre du fond du récipient 11 autour de l'évent 18' et un filtre à bactéries 21 croise la paroi cylindrique 24 de manière à empêcher
le passage des bactéries. D'autres constructions
sont en substance identiques à celles représentées
sur la Fig. 5. Les mêmes chiffres de référence que ceux utilisés sur la Fig. 4 désignent les mêmes par-ties sur la Fig. 5.
L'instrument présentant la construction décrite plus haut est stérilisé par exposition à des rayons gamma ou à de l'oxyde d'éthylène gazeux, ce
qui améliore la fiabilité de l'analyse.
Bien que la forme de l'instrument suivant l'invention ne soit pas particulièrement limitée, cet instrument est de préférence circulaire. La dimension de l'instrument n'est pas non plus limitée. Lorsque
2 ml de sang doivent être analysés, le corps principal du récipient doit avoir un diamètre d'environ
60 mm.
On décrira ci-après un procédé permettant d'isoler des bactéries du sang suivant l'invention au moyen de l'instrument décrit plus haut. On prélève
un échantillon de sang du volume requis et on le mélange ensuite avec un mélange liquide contenant un réactif hémolytique et un anticoagulant et, selon les nécessités , à un milieu de culture liquide. On utilise de préférence de la saponine comme réactif hémolytique. L'anticoagulant utilisé est de l'amylosulfate de sodium
ou du polyanétholesulfonate de sodium. On peut choisir n'importe quel milieu de culture liquide qui est en général utilisé pour la propagation de bactéries.
Le procédé décrit plus haut est un prétraitement qui doit être suivi du processus de filtration et est exécuté pour endommager les globules rouges du sang et empêcher le sang de se coaguler.
Le sang traité de cette façon est versé sur le filtre
14 de l'instrument et le couvercle 19 est fermé. Le sang est filtré sous l'effet de son propre poids; les bactéries restent sur le filtre 14,tandis que le sang traverse
le filtre 14 et est absorbé par l'élément 13 absorbant l'eau. Tout excès de sang qui ne peut pas être absorbé par l'élément.13 s'écoule goutte à goutte dans l'es-pace inférieur 16 du récipient. L'air comprimé par
le sang filtré est évacué par l'évent 18 ou 18', de sorte qu'une filtration efficace du sang est effectuée. Après filtration, l'instrument conforme à l'invention est maintenu à une température constante de manière à cultiver une colonie sur le filtre 14.
Etant donné que le récipient présente un orifice supérieur d'une dimension en substance égale
à celle du filtre, il est aisé de récueillir les bactéries. Après collecte des bactéries, on peut effectuer diverses analyses bactériologiques, par exemple d'identification ou de sensibilité aux antibiotiques. Si l'élément absorbant l'eau 13 est imprégné d'un milieu de culture liquide qui est séché après imprégnation, l'addition d'un milieu de culture liquide au cours du processus de prétraitement peut être omise.
Comme le montre la description qui précède, lorsqu'on utilise le procédé pour isoler des bactéries du sang et l'instrument conforme à l'invention, on peut obtenir de nombreux avantages décrits ci-après.
Dans le cas d'analyses bactériologiques classiques, la propagation et la culture de bactéries du sang sont tout d'abord effectuées avec un milieu de culture liquide. Ce procédé est long. L'instrument conforme à l'invention n'exige pas ce procédé et la durée globale de l'analyse peut par conséquent être raccourcie. De plus, étant donné que l'opération consistant à transférer les bactéries du milieu de propagation au milieu d'isolement n'est pas requise, le processus global est simple. On peut donc éviter la contamination de l'atmosphère ambiante par les bactéries et l'introduction de bactéries étrangères dans le récipient qui pourraient être causées par un transfert de bactéries.
Lorsque l'instrument conforme à l'invention est utilisé, toutes les bactéries du sang peuvent être emprisonnées et directement isolées de sorte que le
taux de détection des bactéries est élevé et que
le nombre de bactéries présentes dans le sang peut être compté, si on le désire.
Exemple
On utilise comme filtre,un filtre à membrane
(fabriqué par Toyo Roshi K.K.) en nitrocellulose comportant des pores d'une dimension de 0,45 fume On utilise un papier-filtre cellulosique "NO-63F" (Toyo Roshi K.K.) comme élément absorbant l'eau. On fait adhérer
le filtre et l'élément absorbant l'eau l'un à l'autre
en plaçant un adhésif en Nylon à bas point de fusion entre le filtre et l'élément,puis en procédant à un soudage à chaud. Le filtre et l'élément absorbant l'eau ont un diamètre de 50 mm et sont assemblés comme le montre la Fig. 3.
Une comparaison entre ce procédé et des procédés classiques a été effectuée. Dans le premier procédé classique, 2,0 ml de sang ont été versés dans un récipient contenant un milieu de culture, un anticoagulant et un réactif hémolytique (quantité totale: 1,0 ml). Le mélange résultant a été versé dans un instrument d'isolement pour la préparation de la culture. Dans le second procédé classique, une culture liquide a été effectuée à l'aide de "Eiken n[deg.] 5" (fabriqué par Eiken K.K.). Dans le troisième procédé classique, on a utilisé un "Vacutainer 50" (fabriqué par BD Company). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 1 ci-après.
Avec N. meningitidis, le procédé classique à milieu de culture liquide ne permet pas de détecter des bactéries. Cependant, le procédé conforme à l'invention permet de détecter et de compter les bactéries en 1 jour. Avec le procédé conforme à l'invention, étant donné que les bactéries sont isolées sous la forme d'une colonie, on peut procéder immédiatement
à des analyses d'identification et de sensibilité aux antibiotiques. Le procédé conforme à l'invention fournit également de meilleurs résultats que les procédés classiques pour d'autres types de bactéries.
Dans le tableau 1 ci-dessous, "+" désigne positif et "-" désigne négatif.
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
<EMI ID=4.1>
REVENDICATIONS
1 - Procédé pour isoler des bactéries du sang, caractérisé en ce que:
on mélange le sang à examiner à un liquide contenant un réactif hémolytique et un anticoagulant;
on filtre le mélange résultant à travers un filtre présentant des pores d'un calibre qui ne laisse pas passer les bactéries à séparer; et
on fournit aux bactéries se trouvant sur le filtre des matières nutritives par le mélange de manière à cultiver immédiatement les bactéries sur le filtre.