Procédé pour isoler des bactéries dans le sang et
instrument pour mettre ce procédé en oeuvre.
La présente invention concerne un procédé pour isoler des bactéries dans le sang et un instrument pour mettre ce procédé en oeuvre.
Des bactéries sont présentes dans le sang
de patients souffrant d'infections systémiques graves comme la septicémie ou la bactériémie. Lors du diagnostic de ces infections systémiques, des analyses du sang concernant l'identification des bactéries et leur sensibilité aux antibiotiques sont effectuées. Pour réaliser ces analyses du sang, il est nécessaire d'isoler les bactéries du sang.
Dans des processus classiques visant à isoler des bactéries du sang, on fait croître une colonie de la manière suivante. On mélange l'échantillon de sang à un milieu de culture liquide et on procède
à la culture jusqu'à ce que le milieu de culture devienne trouble sous l'effet des bactéries qui s'y propagent. On recueille ensuite les bactéries qui sont propagées et on les transfère dans un autre milieu de culture par exemple un milieu de gélose au sang ou au sang chocolat.
Dans ces procédés classiques, il est difficile d'isoler directement les bactéries qui ne sont présentes qu'en petit nombre dans le sang. Ces procédés classiques exigent une phase de traitement préalable assurant la propagation des bactéries avant leur isolement sur un milieu de gélose, ce qui donne des procédures compliquées et longues. La propagation des bactéries ou leur multiplication dans un milieu tel que décrit plus haut exige en général un temps de propagation de 1 à 10 jours et la croissance en colonie exige 1 ou 2 jours supplémentaires.
Lorsque les bactéries qui se sont propagées sont tranférées dans un milieu d'isolement, les bactéries examinées peuvent contaminer l'atmosphère environnante ou d'autres bactéries peuvent s'y mélanger.
L'invention a pour but de procurer un procédé pour isoler des bactéries du sang, qui permette d'échantillonner directement les bactéries du sang sans exiger un processus supplémentaire, comme par exemple la propagation des bactéries du sang , qui permette d'isoler les bactéries sans les tranférer dans un autre milieu de culture, et suivant lequel une colonie peut être cultivée en peu de temps.
L'invention a également pour but de procurer un instrument utilisé dans le procédé d'isolement de bactéries dans le sang comme décrit plus haut.
Suivant un aspect de l'invention, il est prévu un procédé pour isoler des bactéries du sang, suivant lequel on mélange le sang d'un patient à un liquide contenant un réactif hémolytique et un anti-coagulant, on filtre le mélange liquide résultant à l'aide d'un filtre présentant des pores d'un calibre tel qu'il ne laisse pas passer les bactéries et on alimente les bactéries restant sur le filtre à l'aide d'agents nutritifs contenus dans le mélange liquide de manière à permettre la culture directe des bactéries sur le filtre sans transfert.
Suivant un autre aspect de l'invention, il est prévu un instrument pour isoler des bactéries du sang comprenant: un corps principal de récipient comportant une extrémité supérieure ouverte, un filtre qui est retenu dans le corps principal du récipient
à un endroit situé en hauteur entre ses extrémités
de manière à diviser l'intérieur du corps principal
du récipient en des espaces supérieur et inférieur
et qui présente des pores calibrés de manière à ne
pas laisser passer les bactéries; un élément absorbantl'eau collé sur toute la surface inférieure du filtre; une ouverture de ventilation ménagée dans une paroi ou le fond du corps principal du récipient de manière à permettre une ventilation entre l'espace inférieur de ce corps et l'atmosphère ambiante;et un couvercle couvrant l'extrémité supérieure ouverte du corps principal du récipient.
Suivant un autre aspect de l'invention, un récipient est prévu pour mélanger un échantillon de sang avec un mélange comprenant un réactif hémolytique
et un anticoagulant, qui comprend un corps cylindrique présentant une ouverture à une extrémité, et un chapeau élastique monté de manière détachable sur l'ouverture, de manière à sceller hermétiquement l'ouverture, le mélange étant présent au préalable dans le récipient.
Dans les dessins annexés:
les Fig. 1 et 2 sont des vues en coupe d'un dispositif servant à mélanger un échantillon de sang avec un liquide de traitement contenant un réactif hémolytique, un anticoagulant et d'autres substances du même genre;
la Fig. 3 est une vue en coupe d'un instrument destiné à isoler des bactéries du sang, selon
une forme d'exécution de l'invention; et
les Fig. 4 et 5 sont chacune une vue en coupe d'un instrument destiné à isoler des bactéries du sang, selon des variantes de l'invention.
Le procédé conforme à l'invention exige une opération visant à mélanger de manière homogène un échantillon de sang avec un liquide contenant une hémolysine et un anticoagulant et, selon les nécessités, un milieu de culture liquide, etc.. Cette opération est de préférence exécutée dans un système étanche de manière à empêcher à la fois la contamination de l'atmosphère ambiante par les bactéries échantillo-nées et l'introduction de bactéries étrangères dans les bactéries séparées.
Les Fig. 1 et 2 illustrent un dispositif destiné à exécuter cette opération.
Le dispositif représenté sur la Fig. 1 comprend un récipient 1 et un bouchon en caoutchouc 3.
Le récipient 1 contient un mélange liquide 2 contenant au moins un réactif hémolytique et un anticoagulant et est maintenu sous dépression. Le bouchon
en caoutchouc 3 peut être monté de manière détachable au niveau de l'orifice supérieur du récipient 1 et peut obturer le récipient 1 d'une manière étanche aux liquides. Pour mélanger l'échantillon de sang avec le mélange 2 au moyen de ce dispositif, on enfonce l'aiguille d'une seringue (non représentée) à travers le bouchon de caoutchouc 3 de manière à introduire du sang dans le récipient 1 en tirant profit de la dépression qui y règne. Après avoir introduit le sang dans le récipient 1, on retire l'aiguille du bouchon en caoutchouc 3 et on retourne le récipient bout pour bout de manière à mélanger le sang et le mélange liquide 2 contenu dans le récipient. Le réactif hémolytique peut être de la saponine; l'anticoagulant peut être de l'amylosulfate de sodium ou du polyanétholesulfonate de sodium.
Un milieu de culture liquide peut aussi être ajouté au mélange liquide 2, si nécessaire. Dans ce dernier cas, il n'est plus nécessaire d'imprégner un élément absorbant l'eau d'un instrument d'isolement au moyen d'un milieu de culture.
Un dispositif représenté sur la Fig. 2 comprend un cyclindre 4 et un organe de compression 5 qui peut coulisser d'une manière étanche aux liquides dans le. cylindre 4. Un bouchon en caoutchouc 3 est fixé
de manière détachable et de manière étanche aux liquides dans l'orifice supérieur du cylindre 4. Un mélan-ge liquide 2 contenant un réactif hémolytique et un anticoagulant tel que décrit plus haut est maintenu dans l'espace délimité par le cylindre 4 et l'organe de compression 5. Le mélange liquide 2 peut aussi contenir un milieu de culture liquide. Lorsqu'il
faut mélanger un échantillon de sang avec le mélange 2 à l'aide de ce dispositif, on enfonce l'aiguille d'une seringue qui a été utilisée pour prélever un échantillon de sang dans le bouchon en caoutchouc 3.
A mesure que le sang est débité de force dans le cylindre 4, l'organe de compression 5 coulisse vers le bas à l'intérieur du cylindre 4. Lorsque le sang a été introduit dans le cylindre 4, on retourne le dispositif bout pour bout de manière à mélanger le sang avec le réactif hémolytique et avec l'anticoagulant.
Pour éviter toute contamination du sang par d'autres bactéries, on stérilise de préférence les dispositifs décrits plus haut par exposition à des rayons gamma ou par un traitement en autoclave.
Le traitement du sang décrit plus haut porte atteinte aux globules rouges et empêche aussi le sang de se coaguler, permettant ainsi une filtration ultérieure du sang et une culture des bactéries du sang efficaces.Lorsqu'un milieu de culture liquide doit être mélangé au mélange liquide tel que décrit plus haut, il peut être simultanément mélangé au sang contenant les bactéries pendant ce traitement.
Après avoir traité le sang au moyen de l'un quelconque des dispositifs décrits plus haut, on enlève le bouchon en caoutchouc et on verse le sang sur
un filtre d'un instrument d'isolement décrit plus loin.
La Fig. 3 illustre une forme d'exécution d'un instrument servant à isoler des bactéries du sang conformément à l'invention. Sur la Fig. 3, le chiffre 11 désigne un récipient cylindrique comportant un fond et une extrémité supérieure ouverte. Un gradin annulaire 12 est formé dans la paroi à un endroit situé
à une hauteur intermédiaire du récipient. La périphérie d'un élément absorbant l'eau 13 est supportée sur la surface supérieure du gradin 12. Un filtre 14 présentant des pores calibrés pour ne pas laisser passer les bactéries à cultiver est placé sur la surface supérieure de l'élément 13 et couvre la totalité de l'extrémité supérieure ouverte du récipient
11. Le filtre 14 qui est d'une pièce avec l'élément absorbant l'eau 13 divise donc l'intérieur du récipient 11 en un espace supérieur 15 et un espace inférieur 16. Pour empêcher des fuites de sang dans l'espace inférieur 16 par un intervalle quelconque entre
la paroi du récipient 11 et la périphérie du filtre 14, un élément d'étanchéité 17 exerce une pression vers
le bas sur la périphérie du filtre 14. En variante,
la périphérie du filtre 14 peut être collée à la paroi du récipient 11 au moyen d'un adhésif.
Un évent 18 livrant passage à l'air entre l'espace inférieur 16 et l'atmosphère extérieure est formé dans le haut de la paroi du récipient 11. La référence 19 désigne un couvercle qui couvre la partie supérieure ouverte du récipient 11.
N'importe quelle matière inerte à l'égard du sang peut être utilisée comme matière pour le filtre 14. Une telle matière inerte peut, par exemple, être de la nitrocellulose, un polycarbonate, un polyamide, un ester de cellulose ou une matière analogue. De telles matières sont commercialisées, par exemple,sous les noms de "Millipore" (produit de la société Millipolar Corp.), "Metricell" (produit de la société German Instrument Company) etc. Le calibre des pores du filtre 14 est déterminé en fonction de l'application. Cependant,
le calibre des pores du filtre 14 est en général de <EMI ID=1.1>
Le filtre 14 est de préférence traité de manière à présenter de bonnes propriétés hydrophiles par un procédé connu garantissant une bonne aptitude au mouillage par le s ang.
L'élément absorbant l'eau 13 absorbe et retient le sang filtré par le filtre 14 et fournit ainsi les matières nutritives aux bactéries retenues sur le filtre 14. L'élément absorbant l'eau 13 a de préférence une capacité lui permettant d'absorber la quantité totale du sang filtré par le filtre 14. La matière de l'élément 13 est de préférence un papier-filtre du type cellulosique, un tissu non tissé ou l'équivalent. L'élément 13 doit être solidement fixé soit directement, soit par l'intermédiaire d'un adhésif,à la surface arrière du filtre 14. Lorsque l'élément 13 n'est pas convenablement fixé au filtre 14, une filtration efficace ne peut pas être obtenue et l'amenée de l'eau
et des matières nutritives aux bactéries présentes sur le filtre 14 devient peu satisfaisante. L'adhésif à appliquer entre le filtre 14 et l'élément 13 est avantageusement un adhésif soudable à chaud en fibres polymères à bas point de fusion qui ne gêne pas la filtration. L'élément 13 peut être imprégné au moyen d'un milieu de culture liquide qui est séché après imprégnation, comme il le faut. Dans ce cas, le milieu séché est dissous dans le sang filtré absorbé et retenu par l'élément absorbant l'eau 13 qui fournit de l'eau et des matières nutritives aux bactéries présentes sur le filtre 14.
L'espace supérieur 15 au-dessus du filtre 14 est destiné à stocker l'échantillon de sang et l'espace inférieur 16 est destiné à stocker la fraction du sang qui n'est pas absorbée et retenue par l'élément 13.
La Fig. 4 illustre une variante d'un instru-ment destiné à isoler des bactéries du sang selon la présente invention. L'instrument de cette variante diffère de celui décrit plus haut avec référence à la Fig. 3 par les aspects suivants. Dans l'instrument représenté sur la Fig. 4, un évent 18' est ménagé dans le fond du récipient 11. Un filtre à bactéries 21
(par exemple un tampon de coton) destiné à empêcher l'entrée des bactéries contaminatrices est monté dans l'évent 18'. Pour empêcher des fuites de sang par l'évent 18', une paroi cylindrique 22 est formée tout autour de l'évent 18'. Des parois intermédiaires ou tampon 23 sont formées concentriquement sur la surface de fond du récipient 11 de manière à permettre au sang de se concentrer uniquement autour de l'évent 18'.
Les mêmes chiffres de référence que ceux utilisés sur la Fig. 3 désignent les mêmes parties sur la Fig. 4 et une description détaillée n'apparaît pas nécessaire.
La Fig. 5 illustre une autre variante d'un instrument servant à isoler des bactéries du sang conformément à l'invention. Cette variante est très semblable à celle représentée sur la Fig. 4 mais elle en diffère par les aspects suivants. La hauteur de l'élément d'étanchéité 17' est supérieure à celle représentée sur la Fig. 4 et une collerette est prévue à son extrémité supérieure. Cela étant, le couvercle 19 est monté sur la collerette de l'élément d'étanchéité 17', assurant ainsi l'étanchéité de l'intérieur de l'espace supérieur 15. De plus, une paroi cylindrique 24 s'étend vers le bas au centre du fond du récipient 11 autour de l'évent 18' et un filtre à bactéries 21 croise la paroi cylindrique 24 de manière à empêcher
le passage des bactéries. D'autres constructions
sont en substance identiques à celles représentées
sur la Fig. 5. Les mêmes chiffres de référence que ceux utilisés sur la Fig. 4 désignent les mêmes par-ties sur la Fig. 5.
L'instrument présentant la construction décrite plus haut est stérilisé par exposition à des rayons gamma ou à de l'oxyde d'éthylène gazeux, ce
qui améliore la fiabilité de l'analyse.
Bien que la forme de l'instrument suivant l'invention ne soit pas particulièrement limitée, cet instrument est de préférence circulaire. La dimension de l'instrument n'est pas non plus limitée. Lorsque
2 ml de sang doivent être analysés, le corps principal du récipient doit avoir un diamètre d'environ
60 mm.
On décrira ci-après un procédé permettant d'isoler des bactéries du sang suivant l'invention au moyen de l'instrument décrit plus haut. On prélève
un échantillon de sang du volume requis et on le mélange ensuite avec un mélange liquide contenant un réactif hémolytique et un anticoagulant et, selon les nécessités , à un milieu de culture liquide. On utilise de préférence de la saponine comme réactif hémolytique. L'anticoagulant utilisé est de l'amylosulfate de sodium
ou du polyanétholesulfonate de sodium. On peut choisir n'importe quel milieu de culture liquide qui est en général utilisé pour la propagation de bactéries.
Le procédé décrit plus haut est un prétraitement qui doit être suivi du processus de filtration et est exécuté pour endommager les globules rouges du sang et empêcher le sang de se coaguler.
Le sang traité de cette façon est versé sur le filtre
14 de l'instrument et le couvercle 19 est fermé. Le sang est filtré sous l'effet de son propre poids; les bactéries restent sur le filtre 14,tandis que le sang traverse
le filtre 14 et est absorbé par l'élément 13 absorbant l'eau. Tout excès de sang qui ne peut pas être absorbé par l'élément.13 s'écoule goutte à goutte dans l'es-pace inférieur 16 du récipient. L'air comprimé par
le sang filtré est évacué par l'évent 18 ou 18', de sorte qu'une filtration efficace du sang est effectuée. Après filtration, l'instrument conforme à l'invention est maintenu à une température constante de manière à cultiver une colonie sur le filtre 14.
Etant donné que le récipient présente un orifice supérieur d'une dimension en substance égale
à celle du filtre, il est aisé de récueillir les bactéries. Après collecte des bactéries, on peut effectuer diverses analyses bactériologiques, par exemple d'identification ou de sensibilité aux antibiotiques. Si l'élément absorbant l'eau 13 est imprégné d'un milieu de culture liquide qui est séché après imprégnation, l'addition d'un milieu de culture liquide au cours du processus de prétraitement peut être omise.
Comme le montre la description qui précède, lorsqu'on utilise le procédé pour isoler des bactéries du sang et l'instrument conforme à l'invention, on peut obtenir de nombreux avantages décrits ci-après.
Dans le cas d'analyses bactériologiques classiques, la propagation et la culture de bactéries du sang sont tout d'abord effectuées avec un milieu de culture liquide. Ce procédé est long. L'instrument conforme à l'invention n'exige pas ce procédé et la durée globale de l'analyse peut par conséquent être raccourcie. De plus, étant donné que l'opération consistant à transférer les bactéries du milieu de propagation au milieu d'isolement n'est pas requise, le processus global est simple. On peut donc éviter la contamination de l'atmosphère ambiante par les bactéries et l'introduction de bactéries étrangères dans le récipient qui pourraient être causées par un transfert de bactéries.
Lorsque l'instrument conforme à l'invention est utilisé, toutes les bactéries du sang peuvent être emprisonnées et directement isolées de sorte que le
taux de détection des bactéries est élevé et que
le nombre de bactéries présentes dans le sang peut être compté, si on le désire.
Exemple
On utilise comme filtre,un filtre à membrane
(fabriqué par Toyo Roshi K.K.) en nitrocellulose comportant des pores d'une dimension de 0,45 fume On utilise un papier-filtre cellulosique "NO-63F" (Toyo Roshi K.K.) comme élément absorbant l'eau. On fait adhérer
le filtre et l'élément absorbant l'eau l'un à l'autre
en plaçant un adhésif en Nylon à bas point de fusion entre le filtre et l'élément,puis en procédant à un soudage à chaud. Le filtre et l'élément absorbant l'eau ont un diamètre de 50 mm et sont assemblés comme le montre la Fig. 3.
Une comparaison entre ce procédé et des procédés classiques a été effectuée. Dans le premier procédé classique, 2,0 ml de sang ont été versés dans un récipient contenant un milieu de culture, un anticoagulant et un réactif hémolytique (quantité totale: 1,0 ml). Le mélange résultant a été versé dans un instrument d'isolement pour la préparation de la culture. Dans le second procédé classique, une culture liquide a été effectuée à l'aide de "Eiken n[deg.] 5" (fabriqué par Eiken K.K.). Dans le troisième procédé classique, on a utilisé un "Vacutainer 50" (fabriqué par BD Company). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 1 ci-après.
Avec N. meningitidis, le procédé classique à milieu de culture liquide ne permet pas de détecter des bactéries. Cependant, le procédé conforme à l'invention permet de détecter et de compter les bactéries en 1 jour. Avec le procédé conforme à l'invention, étant donné que les bactéries sont isolées sous la forme d'une colonie, on peut procéder immédiatement
à des analyses d'identification et de sensibilité aux antibiotiques. Le procédé conforme à l'invention fournit également de meilleurs résultats que les procédés classiques pour d'autres types de bactéries.
Dans le tableau 1 ci-dessous, "+" désigne positif et "-" désigne négatif.
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
<EMI ID=4.1>
REVENDICATIONS
1 - Procédé pour isoler des bactéries du sang, caractérisé en ce que:
on mélange le sang à examiner à un liquide contenant un réactif hémolytique et un anticoagulant;
on filtre le mélange résultant à travers un filtre présentant des pores d'un calibre qui ne laisse pas passer les bactéries à séparer; et
on fournit aux bactéries se trouvant sur le filtre des matières nutritives par le mélange de manière à cultiver immédiatement les bactéries sur le filtre.
Method for isolating bacteria from the blood and
instrument for implementing this process.
The present invention relates to a method for isolating bacteria from the blood and an instrument for carrying out this method.
Bacteria are present in the blood
patients with serious systemic infections like sepsis or bacteremia. When diagnosing these systemic infections, blood tests are performed to identify bacteria and their sensitivity to antibiotics. To perform these blood tests, it is necessary to isolate the bacteria from the blood.
In conventional procedures to isolate bacteria from the blood, a colony is grown in the following manner. Mix the blood sample with a liquid culture medium and proceed
to the culture until the culture medium becomes cloudy under the effect of the bacteria which propagate therein. The propagated bacteria are then collected and transferred to another culture medium, for example a blood agar or chocolate blood agar medium.
In these conventional methods, it is difficult to directly isolate bacteria which are only present in small numbers in the blood. These conventional methods require a prior treatment phase ensuring the propagation of the bacteria before their isolation on an agar medium, which gives complicated and lengthy procedures. The propagation of bacteria or their multiplication in a medium as described above generally requires a propagation time of 1 to 10 days and growth in colony requires 1 or 2 additional days.
When the bacteria that have spread are transferred to an isolation medium, the bacteria examined can contaminate the surrounding atmosphere or other bacteria can mix with it.
The object of the invention is to provide a method for isolating bacteria from the blood, which makes it possible to directly sample the bacteria from the blood without requiring an additional process, such as for example the propagation of bacteria from the blood, which makes it possible to isolate the bacteria. without transferring them to another culture medium, and according to which a colony can be cultivated in a short time.
The invention also aims to provide an instrument used in the method of isolating bacteria from the blood as described above.
According to one aspect of the invention, a method is provided for isolating bacteria from the blood, according to which the blood of a patient is mixed with a liquid containing a hemolytic reagent and an anticoagulant, the resulting liquid mixture is filtered to using a filter having pores of a size such that it does not allow bacteria to pass through and the bacteria remaining on the filter are supplied with nutritive agents contained in the liquid mixture so as to allow direct culture of bacteria on the filter without transfer.
According to another aspect of the invention, there is provided an instrument for isolating bacteria from the blood comprising: a main container body having an open upper end, a filter which is retained in the main body of the container
high up between its ends
so as to divide the interior of the main body
container in upper and lower spaces
and which has pores calibrated so as not to
not let bacteria pass; a water absorbing element bonded over the entire lower surface of the filter; a ventilation opening in a wall or bottom of the main body of the container so as to allow ventilation between the lower space of this body and the ambient atmosphere; and a cover covering the open upper end of the main body of the container .
According to another aspect of the invention, a container is provided for mixing a blood sample with a mixture comprising a hemolytic reagent
and an anticoagulant, which comprises a cylindrical body having an opening at one end, and an elastic cap detachably mounted on the opening, so as to seal the opening hermetically, the mixture being present beforehand in the container.
In the accompanying drawings:
Figs. 1 and 2 are sectional views of a device for mixing a blood sample with a treatment liquid containing a hemolytic reagent, an anticoagulant and the like;
Fig. 3 is a sectional view of an instrument intended to isolate bacteria from the blood, according to
an embodiment of the invention; and
Figs. 4 and 5 are each a sectional view of an instrument intended to isolate bacteria from the blood, according to variants of the invention.
The method according to the invention requires an operation aimed at homogeneously mixing a blood sample with a liquid containing a hemolysin and an anticoagulant and, as necessary, a liquid culture medium, etc. This operation is preferably carried out in a sealed system so as to prevent both the contamination of the ambient atmosphere by the sampled bacteria and the introduction of foreign bacteria into the separated bacteria.
Figs. 1 and 2 illustrate a device intended to carry out this operation.
The device shown in FIG. 1 comprises a container 1 and a rubber stopper 3.
The container 1 contains a liquid mixture 2 containing at least one hemolytic reagent and an anticoagulant and is kept under vacuum. Cap
rubber 3 can be detachably mounted at the upper opening of the container 1 and can seal the container 1 in a liquid-tight manner. To mix the blood sample with the mixture 2 by means of this device, the needle of a syringe (not shown) is pushed through the rubber stopper 3 so as to introduce blood into the container 1 while taking advantage of the depression that reigns there. After having introduced the blood into the container 1, the needle is withdrawn from the rubber stopper 3 and the container is turned end to end so as to mix the blood and the liquid mixture 2 contained in the container. The hemolytic reagent can be saponin; the anticoagulant can be sodium amylosulfate or sodium polyanetholesulfonate.
Liquid culture medium can also be added to liquid mixture 2, if necessary. In the latter case, it is no longer necessary to impregnate a water-absorbing element of an isolation instrument by means of a culture medium.
A device shown in FIG. 2 comprises a cylinder 4 and a compression member 5 which can slide in a liquid-tight manner in the. cylinder 4. A rubber stopper 3 is attached
detachably and liquid-tight in the upper orifice of cylinder 4. A liquid mixture 2 containing a hemolytic reagent and an anticoagulant as described above is maintained in the space delimited by cylinder 4 and the compression member 5. The liquid mixture 2 can also contain a liquid culture medium. When
a blood sample must be mixed with mixture 2 using this device, the needle of a syringe which has been used to draw a blood sample is inserted into the rubber stopper 3.
As the blood is forcibly delivered into the cylinder 4, the compression member 5 slides down inside the cylinder 4. When the blood has been introduced into the cylinder 4, the device is turned end to end so as to mix the blood with the hemolytic reagent and with the anticoagulant.
To avoid contamination of the blood with other bacteria, the devices described above are preferably sterilized by exposure to gamma rays or by autoclave treatment.
The blood treatment described above damages the red blood cells and also prevents the blood from clotting, thus allowing subsequent filtration of the blood and an effective culture of blood bacteria. When a liquid culture medium must be mixed with the liquid mixture as described above, it can be simultaneously mixed with the blood containing bacteria during this treatment.
After treating the blood using any of the devices described above, remove the rubber stopper and pour the blood onto
a filter of an isolation instrument described later.
Fig. 3 illustrates an embodiment of an instrument used to isolate bacteria from the blood in accordance with the invention. In Fig. 3, the number 11 designates a cylindrical container having a bottom and an open upper end. An annular step 12 is formed in the wall at a location located
at an intermediate height of the container. The periphery of a water-absorbing element 13 is supported on the upper surface of the step 12. A filter 14 having pores calibrated so as not to allow the bacteria to be cultured to pass is placed on the upper surface of the element 13 and covers the entire open top end of the container
11. The filter 14 which is in one piece with the water absorbing element 13 therefore divides the interior of the container 11 into an upper space 15 and a lower space 16. To prevent blood leakage in the lower space 16 by any interval between
the wall of the container 11 and the periphery of the filter 14, a sealing element 17 exerts pressure towards
the bottom on the periphery of the filter 14. As a variant,
the periphery of the filter 14 can be glued to the wall of the container 11 by means of an adhesive.
A vent 18 providing passage to the air between the lower space 16 and the external atmosphere is formed at the top of the wall of the container 11. The reference 19 designates a cover which covers the open upper part of the container 11.
Any material inert to blood may be used as the material for filter 14. Such inert material may, for example, be nitrocellulose, polycarbonate, polyamide, cellulose ester or the like. . Such materials are sold, for example, under the names of "Millipore" (product of the company Millipolar Corp.), "Metricell" (product of the company German Instrument Company) etc. The size of the pores of the filter 14 is determined according to the application. However,
the pore size of the filter 14 is generally <EMI ID = 1.1>
The filter 14 is preferably treated so as to have good hydrophilic properties by a known method guaranteeing good wettability by s ang.
The water absorbing element 13 absorbs and retains the blood filtered by the filter 14 and thus provides the nutrients to the bacteria retained on the filter 14. The water absorbing element 13 preferably has a capacity enabling it to absorb the total amount of blood filtered by the filter 14. The material of the element 13 is preferably a cellulose-type filter paper, a non-woven fabric or the equivalent. Element 13 must be securely attached, either directly or through an adhesive, to the rear surface of filter 14. When element 13 is not properly attached to filter 14, effective filtration cannot be obtained and the water supplied
and nutrients to bacteria present on the filter 14 becomes unsatisfactory. The adhesive to be applied between the filter 14 and the element 13 is advantageously a heat-weldable adhesive made of low-melting polymer fibers which does not hinder filtration. The element 13 can be impregnated by means of a liquid culture medium which is dried after impregnation, as necessary. In this case, the dried medium is dissolved in the absorbed filtered blood and retained by the water-absorbing element 13 which supplies water and nutrients to the bacteria present on the filter 14.
The upper space 15 above the filter 14 is intended to store the blood sample and the lower space 16 is intended to store the fraction of the blood which is not absorbed and retained by the element 13.
Fig. 4 illustrates a variant of an instrument intended to isolate bacteria from the blood according to the present invention. The instrument of this variant differs from that described above with reference to FIG. 3 by the following aspects. In the instrument shown in FIG. 4, a vent 18 'is formed in the bottom of the container 11. A bacteria filter 21
(for example a cotton pad) intended to prevent the entry of contaminating bacteria is mounted in the 18 'vent. To prevent blood from leaking through the vent 18 ', a cylindrical wall 22 is formed all around the vent 18'. Intermediate walls or buffer 23 are formed concentrically on the bottom surface of the container 11 so as to allow the blood to concentrate only around the vent 18 '.
The same reference numbers as those used in FIG. 3 denote the same parts in FIG. 4 and a detailed description does not appear necessary.
Fig. 5 illustrates another variant of an instrument used to isolate bacteria from the blood in accordance with the invention. This variant is very similar to that shown in FIG. 4 but it differs in the following aspects. The height of the sealing element 17 'is greater than that shown in FIG. 4 and a flange is provided at its upper end. However, the cover 19 is mounted on the collar of the sealing element 17 ′, thus ensuring the sealing of the interior of the upper space 15. In addition, a cylindrical wall 24 extends downwards in the center of the bottom of the container 11 around the vent 18 'and a bacteria filter 21 crosses the cylindrical wall 24 so as to prevent
the passage of bacteria. Other constructions
are substantially identical to those shown
in Fig. 5. The same reference numbers as those used in FIG. 4 denote the same parts in FIG. 5.
The instrument having the construction described above is sterilized by exposure to gamma rays or to ethylene oxide gas, this
which improves the reliability of the analysis.
Although the shape of the instrument according to the invention is not particularly limited, this instrument is preferably circular. The size of the instrument is also not limited. When
2 ml of blood should be analyzed, the main body of the container should have a diameter of about
60 mm.
A method will be described below for isolating bacteria from the blood according to the invention by means of the instrument described above. We take
a blood sample of the required volume and then mixed with a liquid mixture containing a hemolytic reagent and an anticoagulant and, if necessary, to a liquid culture medium. Preferably, saponin is used as the hemolytic reagent. The anticoagulant used is sodium amylosulfate
or sodium polyanetholesulfonate. One can choose any liquid culture medium which is generally used for the propagation of bacteria.
The method described above is a pretreatment which must be followed by the filtration process and is carried out to damage the red blood cells and prevent the blood from clotting.
Blood treated this way is poured over the filter
14 of the instrument and the cover 19 is closed. The blood is filtered under the effect of its own weight; bacteria remain on filter 14 while blood flows through
the filter 14 and is absorbed by the element 13 absorbing the water. Any excess blood that cannot be absorbed by the element. 13 drips into the lower space 16 of the container. Compressed air by
the filtered blood is discharged through the vent 18 or 18 ', so that effective filtration of the blood is carried out. After filtration, the instrument according to the invention is maintained at a constant temperature so as to cultivate a colony on the filter 14.
Since the container has an upper opening of substantially equal size
with that of the filter, it is easy to collect bacteria. After collecting the bacteria, various bacteriological analyzes can be carried out, for example identification or sensitivity to antibiotics. If the water absorbing member 13 is impregnated with a liquid culture medium which is dried after impregnation, the addition of a liquid culture medium during the pretreatment process can be omitted.
As the above description shows, when the method for isolating bacteria from the blood and the instrument according to the invention are used, numerous advantages described below can be obtained.
In the case of conventional bacteriological analyzes, the propagation and the culture of blood bacteria are first carried out with a liquid culture medium. This process is long. The instrument according to the invention does not require this process and the overall duration of the analysis can therefore be shortened. In addition, since the operation of transferring bacteria from the propagation medium to the isolation medium is not required, the overall process is simple. It is therefore possible to avoid contamination of the ambient atmosphere by bacteria and the introduction of foreign bacteria into the container which could be caused by a transfer of bacteria.
When the instrument according to the invention is used, all the bacteria in the blood can be trapped and directly isolated so that the
detection rate of bacteria is high and that
the number of bacteria present in the blood can be counted, if desired.
Example
As a filter, a membrane filter is used
(manufactured by Toyo Roshi K.K.) made of nitrocellulose having pores with a dimension of 0.45 smokes. A cellulose filter paper "NO-63F" (Toyo Roshi K.K.) is used as water-absorbing element. We make adhere
filter and water absorbing element to each other
by placing a low-melting Nylon adhesive between the filter and the element, then by hot welding. The filter and the water absorbing element have a diameter of 50 mm and are assembled as shown in Fig. 3.
A comparison between this method and conventional methods was carried out. In the first conventional method, 2.0 ml of blood was poured into a container containing a culture medium, an anticoagulant and a hemolytic reagent (total amount: 1.0 ml). The resulting mixture was poured into an isolation instrument for culture preparation. In the second conventional method, a liquid culture was carried out using "Eiken n [deg.] 5" (manufactured by Eiken K.K.). In the third conventional method, a "Vacutainer 50" was used (manufactured by BD Company). The results obtained are shown in Table 1 below.
With N. meningitidis, the conventional liquid culture medium method does not allow bacteria to be detected. However, the method according to the invention makes it possible to detect and count the bacteria in 1 day. With the process according to the invention, since the bacteria are isolated in the form of a colony, it is possible to proceed immediately
identification and antibiotic sensitivity analyzes. The method according to the invention also provides better results than conventional methods for other types of bacteria.
In Table 1 below, "+" denotes positive and "-" denotes negative.
<EMI ID = 2.1>
<EMI ID = 3.1>
<EMI ID = 4.1>
CLAIMS
1 - Process for isolating bacteria from the blood, characterized in that:
the blood to be examined is mixed with a liquid containing a hemolytic reagent and an anticoagulant;
the resulting mixture is filtered through a filter having pores of a size which does not allow the bacteria to be separated to pass; and
the bacteria on the filter are supplied with nutrients by the mixture so as to immediately grow the bacteria on the filter.